JPWO2016067629A1 - ラミニンによる網膜および神経の新規治療 - Google Patents
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Abstract
Description
<網膜関連の治療>
(1)ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含み、該ラミニンは、γ1鎖を含む、網膜色素上皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤。
(2)前記ラミニンは、α5鎖をさらに含む、項目1に記載の治療または予防剤。
(3)前記ラミニンは、ラミニン511(α5β1γ1)およびラミニン521(α5β2γ1)を含む、項目1または2に記載の治療または予防剤。
(4)前記フラグメントは、網膜色素上皮の細胞の細胞接着能を有する、項目1〜3のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(5)前記因子は、ラミニン511、ラミニン521またはラミニン511−E8フラグメントである、項目1〜4のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(6)前記網膜色素上皮は霊長類のものである、項目1〜5のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(7)前記網膜色素上皮の疾患、障害または状態は、網膜色素上皮疾患、障害または状態は、滲出型および萎縮型加齢黄斑変性、網膜色素変性、網膜色素上皮症(中心性漿液性網脈絡膜症)、その他特に黄斑部などの網膜に障害をきたした視力低下、ならびに視機能低下をきたした疾患からなる群より選択される、項目1〜6のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(8)さらに、網膜色素上皮の細胞を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(9)さらに、ROCK阻害剤を含む、項目1〜8のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(10)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目9に記載の治療または予防剤。
(11)さらに、網膜色素上皮の細胞およびROCK阻害剤を含む、項目1〜10のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(12)前記因子は、網膜下に注入され網膜を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目1〜11のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(13)前記因子は、約21nM以上で存在する、項目1〜12のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(14)さらに網膜色素上皮の細胞が投与されることを特徴とする、項目1〜13のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(15)前記因子は、網膜色素上皮の細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が網膜下に注入され網膜を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目1〜14のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(16)さらに、ROCK阻害剤を含む、項目1〜15のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(17)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目16に記載の治療または予防剤。
(18)細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、項目15〜17のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(19)網膜色素上皮の疾患、障害または状態の治療または予防のための、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子であって、該ラミニンは、γ1鎖を含む、因子。
(20)項目2〜18のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目19に記載の因子。
(21)網膜色素上皮の疾患、障害または状態の治療または予防のための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含し、該ラミニンは、γ1鎖を含む、方法。
(22)項目2〜7のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目21に記載の方法。
(23)さらに、網膜色素上皮の細胞を前記被験体に投与する工程を包含する、項目21または22に記載の方法。
(24)さらに、ROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を包含する、項目21〜23のいずれか1項に記載の方法。
(25)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目24に記載の方法。
(26)さらに、網膜色素上皮の細胞およびROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を包含する、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(27)前記因子は、網膜下に注入され網膜を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目21〜26のいずれか1項に記載の方法。
(28)前記因子は、約21nM以上で存在する、項目21〜27のいずれか1項に記載の方法。
(29)網膜色素上皮の細胞を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目21〜28のいずれか1項に記載の方法。
(30)前記因子は、網膜色素上皮の細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が網膜下に注入され網膜を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目21〜29のいずれか1項に記載の方法。
(31)さらに、ROCK阻害剤を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目21〜30のいずれか1項に記載の方法。
(32)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目31に記載の方法。
(33)細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、項目21〜33のいずれか1項に記載の方法。
(34)ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の、網膜色素上皮の疾患、障害または状態の治療または予防のための医薬の製造における使用であって、該ラミニンは、γ1鎖を含む、使用。
(35)項目2〜18のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目34に記載の使用。
(36)ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の、網膜色素上皮の疾患、障害または状態の治療または予防のための使用であって、該ラミニンは、γ1鎖を含む、使用。
(37)項目2〜18のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目36に記載の使用。
<神経>
(A1)ラミニン511およびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含み、細胞移植を必要とする神経の疾患、障害または状態の治療または予防剤。
(A2)前記フラグメントは、神経の細胞の細胞接着能を有する、項目A1に記載の治療または予防剤。
(A3)前記因子は、ラミニン511またはラミニン511−E8フラグメントである、項目A1〜A2のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A4)前記神経は霊長類のものである、項目A1〜A3のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A5)前記細胞接着を必要とする神経の疾患、障害または状態は、網膜色素変性症、黄斑変性、スタルガルト病、緑内障、視神経症、脊髄損傷、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、および脳障害をきたす疾患からなる群より選択される、項目A1〜A4のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A6)さらに、神経の細胞を含む、項目A1〜A5のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A7)さらに、ROCK阻害剤を含む、項目A1〜A6のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A8)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目A7に記載の治療または予防剤。
(A9)さらに、神経の細胞およびROCK阻害剤を含む、項目A1〜A8のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A10)前記因子は、神経部位に注入され神経を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目A1〜A9のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A11)前記因子は、約21nM以上で存在する、項目A1〜A10のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A12)さらに神経の細胞が投与されることを特徴とする、項目A1〜A11のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A13)前記因子は、神経の細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が神経部位に注入され神経を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目A1〜A12のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A14)さらに、ROCK阻害剤を含む、項目A1〜A13のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A15)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目A14に記載の治療または予防剤。
(A16)細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、項目A1〜A15のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
(A17)細胞移植を必要とする神経の疾患、障害または状態の治療または予防するための、ラミニン511およびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子。
(A18)項目A2〜A16のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目A17に記載の因子。
(A19)細胞移植を必要とする神経の疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、該方法はラミニン511およびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
(A20)項目A2〜A5のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目A19に記載の方法。
(A21)さらに、神経の細胞を前記被験体に投与する工程を含む、項目A19またはA20に記載の方法。
(A22)さらに、ROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を含む、項目A19〜A21のいずれか1項に記載の方法。
(A23)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目A22に記載の方法。
(A24)さらに、神経の細胞およびROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を含む、項目A19〜A23のいずれか1項に記載の方法。
(A25)前記因子は、神経部位に注入され神経を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目A19〜A24のいずれか1項に記載の方法。
(A26)前記因子は、約21nM以上で存在する、項目A19〜A25のいずれか1項に記載の方法。
(A27)さらに神経の細胞が投与されることを特徴とする、項目A19〜A26のいずれか1項に記載の方法。
(A28)前記因子は、神経の細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が神経部位に注入され神経を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、項目A19〜A27のいずれか1項に記載の方法。
(A29)ROCK阻害剤を前記因子とは別に投与する工程をさらに包含する、項目A19〜A28のいずれか1項に記載の方法。
(A30)前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)、およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、項目A29のいずれか1項に記載の方法。
(A31)細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、項目A19〜A30のいずれか1項に記載の方法。
本明細書において「網膜色素上皮細胞」(RPE細胞ともいわれる)とは、眼の網膜と脈絡膜の中間に存在する上皮細胞で、血管網膜関門の形成、視細胞外節の貪食、視物質の再生などの機能を有する。網膜とは、眼球壁の最内層の部分であり、視細胞と視神経をもち、光刺激に感ずる。本発明で使用される網膜色素上皮細胞は、バイオプシーにより本人から採取した細胞、他人から採取した細胞、培養した網膜色素上皮細胞、幹細胞から分化した細胞、例えばiPS細胞、ES細胞等からの誘導分化細胞を用いることができることが理解される。
本明細書において「ラミニン」とは細胞外マトリックスの基底膜を構成するタンパク質であり、多細胞体制・組織構築とその維持、細胞接着、細胞移動、細胞増殖を促進し、がん細胞と関係が深い。胚発生の初期(2細胞期)に発現するとされる。α鎖、β鎖およびγ鎖のそれぞれ1本ずつからなるヘテロ三量体である。ラミニンの命名は、発見順の名称(ラミニン−1、ラミニン−2等)が知られていたが、サブユニットとの対応は考慮されていないため本明細書では、より新たな命名法である、α、β、γのサブクラスの名称(3桁の番号、百の位はα、十の位はβ、一の位はγを示す。)を併記する方法を採用し、α1、β1およびγ1の場合、ラミニン111などと称する。ラミニンはα鎖が5種、β鎖が3種,γ鎖が3種、見出だされている。従って、理論的な組み合わせの最大数は、5×3×3=45で、45種類のラミニン分子が可能であるが、天然にすべての組み合わせが存在しているわけではないとされている。各サブユニットは、例えばα鎖についてはLAMA1、LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5等と称し、β鎖についてはLAMB1、LAMB2、LAMB3と称し、γ鎖についてはLAMC1、LAMC2、LAMC3と称される。本発明で使用されるラミニンタンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性を保持したまま1またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニンタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。したがって、本発明で使用されるラミニンタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えDNAから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。本発明で使用されるラミニンタンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。医療材料を得る目的などでヒト細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるために、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましいがこれに限定されない。
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα5鎖の有する活性をいう。α5鎖については、Doi M et al.,J.Biol.Chem. 277(15),12741−12748,2002;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα5鎖の有する活性をいう。α5鎖については、Doi M et al.,J.Biol.Chem. 277(15),12741−12748,2002;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ1鎖の有する活性をいう。β1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.262(22),10454−10462,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ1鎖の有する活性をいう。β1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.262(22),10454−10462,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号5に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ2鎖の有する活性をいう。β2鎖については、Wewer UM et al.,Genomics. 1994 Nov 15;24(2):243−52.,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号6に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号6に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンβ2鎖の有する活性をいう。β2鎖については、Wewer UM et al.,Genomics. 1994 Nov 15;24(2):243−52.,1987;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号7に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ1鎖の有する活性をいう。γ1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.263(14),6751−6758,1988;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号7に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号8に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンγ1鎖の有する活性をいう。γ1鎖については、Pillarainen et al.,J.Biol.Chem.263(14),6751−6758,1988;米国特許第6,933,273号を参照することができる。
(a)配列番号9に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα4鎖の有する活性をいう。α4鎖については、例えば、代表的にはβ1鎖およびγ1鎖と組み合わせたときの網膜色素上皮細胞の接着促進活性等を挙げることができる。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号10に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号9に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号10に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ラミニンα4鎖の有する活性をいう。α4鎖については、例えば、代表的にはβ1鎖およびγ1鎖と組み合わせたときの網膜色素上皮細胞の接着促進活性等を挙げることができる。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F. M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F. M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。網膜細胞は、特表2013−502234およびそこで引用される技術等を参照することができるがそれらに限定されない。神経細胞については、神経細胞培養法(ニューロサイエンス・ラボマニュアル)単行本-1997、脳・神経研究プロトコール―細胞培養から機能解析へ(バイオマニュアルUPシリーズ)単行本-1995およびそこで引用される技術等を参照することができるがそれらに限定されない。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。また、任意の実施形態が組み合わせ得ることも理解されるべきである。
1つの局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、網膜色素上皮等の網膜および/または神経の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。この局面において本発明はまた、網膜色素上皮等の網膜および/または神経細胞の疾患、障害または状態の治療または予防のための、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子であって、該ラミニンは、γ1鎖を含む、因子を提供する。この局面において、さらにまた、本発明は、網膜色素上皮等の網膜および/または神経細胞の疾患、障害または状態の治療または予防のための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程を包含し、該ラミニンは、γ1鎖を含む、方法を提供する。この局面の本発明の治療または予防の対象となる疾患、障害または状態は、細胞移植を必要とする任意の疾患、障害または状態に対して応用可能である。理論に束縛されることを望まないが、本発明は、細胞移植という再生医療の一形態において有用であるといえる。また、別の実施形態としては臓器の形やシートの形をつくっての移植にも応用することができる。したがって、細胞増殖に対する効果とは全く異質の効果が奏されるということになり、再生医療等での応用が期待される。
別の局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子と、網膜色素上皮細胞等の網膜細胞および/または神経細胞とを用いる、網膜色素上皮等の網膜の眼科および/または神経の疾患、障害または状態の治療または予防剤を提供する。したがって、この局面において、本発明は、網膜色素上皮等の網膜および/または神経細胞の疾患、障害または状態の治療または予防のための方法であって、該方法は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を該治療または予防を必要とする被験体に投与する工程、ならびに網膜色素上皮等の網膜および/または神経細胞の細胞および/またはROCK阻害剤を前記被験体に投与する工程を包含し、該ラミニンは、γ1鎖を含む、方法を提供する。ここで、この局面の本発明の因子と網膜色素上皮細胞等の網膜細胞および/または神経細胞とは、混合物として用いてもよく、別々に投与されてもよい。本発明の方法において用いられる因子(ラミニン、そのフラグメント等)、細胞、ROCK阻害剤等は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。
網膜色素上皮細胞および/または神経細胞はレシピエント自身または適切なドナーの網膜および/または神経組織から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の網膜色素上皮細胞および/または神経細胞を準備すればよい。例えば、網膜組織および/または神経組織を分離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理してもよい。分離した後、本発明の培養液中で網膜色素上皮細胞および/または神経細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:12320等を)にFBS(ウシ胎仔血清)(例えば、BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)、b−FGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加することができる。本発明の因子をコーティングして培養を行うことで網膜色素上皮細胞および/または神経細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われる。また、培養液にラミニンを添加して培養する場合は、培養皿の表面にI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ等の網膜色素上皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をFNC coating mix(登録商標)(50ml(AES−0407)、ATHENA、カタログ番号:0407)等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。網膜色素上皮細胞および/または神経細胞を培養する際の温度条件は、網膜色素上皮細胞および/または神経細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約25℃〜約45℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約30℃〜約40℃、さらに好ましくは約37℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約5〜10%のCO2濃度の環境下で行われる。
培養に供された網膜色素上皮細胞および/または神経細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約1〜2×106個/mLである。尚、ここでの遠心分離処理の条件としては、例えば、約500rpm(30g)〜約1000rpm(70g)、約1〜約10分を挙げることができるがこれらに限定されない。
1つの局面において、本発明は、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含む、網膜色素上皮等の網膜および/または神経の疾患、障害または状態の治療または予防剤であって、該因子は、眼内に注入され眼内の組織および/または神経の組織と接触されることを特徴とする治療または予防剤を提供する。したがって、この局面において、本発明は網膜色素上皮等の網膜および/または神経の疾患、障害または状態の治療または予防するための方法であって、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子の有効量を被験体に投与する工程を包含し、該因子は、眼内に注入され眼内の組織および/または神経の組織と接触されることを特徴とする方法を提供する。この局面の本発明の方法において用いられる因子(ラミニン、そのフラグメント等)は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。ここでは、因子は、眼内に注入され眼内の組織と接触される結果、あるいは神経部位に注入され神経の組織と接触される結果、眼内で、あるいは、神経内でラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子のコーティング(本明細書においてラミニンコーティングともいう)が形成されることにより、眼科、特に網膜等および/または神経の治癒が促進されるものと理解される。
(使用)
(手法)・(培養)
別の目的で安楽死させたカニクイザルより摘出した眼球を購入して(Nissei Bilis Co., Ltd. Otsu, Japan)、網膜色素上皮細胞を機械的に分離して、DMEM/F12、10% FBS、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンにて培養した。
(手法)・(培養)
・N2a(JCRB細胞バンク(独立行政法人医薬基盤研究所)から入手可能。)
・SH−SY5Y(ECACCから入手可能、EC94030304−F0)
神経細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいたPBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTAを添加し、37℃(5%CO2)で3分インキュベートした。その後、DMEM(和光純薬工業、044−29765)+10%FBS+1%P/Sで懸濁し、1200rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。神経細胞の播種密度はN2a、H−SY5Y共に1:10の割合で播種した。
2サンプルの比較の平均値における統計的有意差(P値)は、スチューデントのt検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±SEを表す。
本実施例では、ラミニンコーティングの網膜色素上皮の細胞接着に対する影響を調べた。
・コントロールは非コーティングである。
・ラミニン111(Biolamina、BLA−LN111−02)
・ラミニン211(Biolamina、BLA−LN211−02)
・ラミニン411(Biolamina、BLA−LN411−02)
・ラミニン511(Biolamina、BLA−LN511−02)
・ラミニン521(Biolamina、BLA−LN521−02)
・ラミニン322(ReproCELL、RCHEOT004)
・ラミニン511−E8フラグメント(株式会社ニッピ、382−02413)
・FNC coating mix(登録商標)(50ml(AES−0407)(ATHENA、カタログ番号:0407))
・コラーゲン(I型)(新田ゼラチン株式会社、KP−4020)
ラミニン(全長)は20μg/mlで用い、フラグメントは5μg/mlで用いた。I型コラーゲンは150μg/mlで用いた。
・ラミニン111、ラミニン211、ラミニン411、ラミニン511、ラミニン521、またはラミニン332をPBS(−)で20μg/mlに希釈し、希釈したものを培養皿に添加して37℃(5% CO2)で2時間コーティングした。ラミニン511−E8フラグメントはPBS(−)で5μg/mlに希釈し、希釈したものを培養皿に添加して常温で3時間コーティングした。I型コラーゲンは常温で1時間コーティングした。あらかじめコーティングした培養皿に網膜色素上皮細胞を96well plateに1 well当たり5000個の割合で播種し、37℃(5% CO2)で24時間インキュベートした。24時間後、培地を除去し、PBS(−)で洗浄を2回行った。洗浄後、培地と1:1の割合で添加し、2分間遮光で振盪した後、10分間静置した。その後測定した。測定には、CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega Corporation,Madison,WI)を用いた。
結果を図1に示す。示されるように、ラミニン411、ラミニン511、ラミニン521、ラミニン511−E8フラグメント(およびFNC coating mix(登録商標)(50ml(AES−0407))が有意に網膜色素上皮の細胞接着を促進することが示された。これらのラミニンは、本発明において有用であり得ることが理解される。他方、ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332は網膜色素上皮の有意な細胞接着促進は観察されなかった。
本実施例では、ラミニンを添加した際の網膜色素上皮の挙動を調べた。
・コントロールとしては非添加(コーティング剤を添加していないもの、DMEM/F12+10%FBS+1%P/S)を用いた。
・ラミニン511(Biolamina、BLA−LN511−02)
・ラミニン511−E8フラグメント(株式会社ニッピ、382−02413)
(位相差顕微鏡写真)
網膜色素上皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいたPBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。PBS(−)除去後、0.05% Trypsinを添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。その後、DMEM/F12+10%FBS+1%P/Sで懸濁し、1200rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。播種数は5000個/96well plateの割合でとしてラミニン511またはラミニン511−E8フラグメントを添加した培地にて播種し、37℃(5%CO2)で24時間インキュベートした。播種24時間後の細胞の状態を位相差顕微鏡で撮影した。
96well plateに5000個の割合で網膜色素上皮細胞を播種し、37℃(5%CO2)で24時間インキュベートした。播種24時間後、培地を除去し、PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回行った。洗浄後、培地とCellTiter−Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, WI)を1:1の割合で添加し、2分間遮光で振蕩した。その後10分間遮光の状態で静置し、測定した。添加時期については、細胞を播種する直前に細胞懸濁液にラミニン511、ラミニン511−E8フラグメントを2.1nMになるようにそれぞれ添加した。
結果を図2〜3に示す。図2では、ラミニンを培地に添加した際の網膜色素上皮の位相差顕微鏡写真が示される。図3では、ラミニンを培地に添加した際の網膜色素上皮の細胞接着に対する影響が示される。これらから、ラミニン511−E8フラグメントを培地に添加し、網膜色素上皮細胞を播種することにより、細胞接着を促進することが示された。
ラミニン511−E8フラグメントを併用して、培養網膜色素上皮細胞のウサギ網膜下への移植試験を行い、ラミニン511−E8フラグメントとともに細胞を移植することで移植した細胞の網膜下組織への生着が改善することを確認した。
本実施例では、以下の試薬等を使用した。
・培養サル網膜色素上皮細胞
別の目的で安楽死させたカニクイザルより摘出した眼球を購入して(Nissei Bilis Co., Ltd. Otsu, Japan)、網膜色素上皮細胞を機械的に分離して、DMEM/F12、10%FBS、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンにて培養した。
・ラミニン511−E8フラグメント(株式会社ニッピ、382-02413)
・ウサギ(日本白色家兎、オリエンタルバイオサービス)
(生着の確認法)
培養サル網膜色素上皮細胞をDiI(Vybrant DiI cell-labeling solution, Life Technologies (Carlsbad,CA))にて蛍光ラベルした。この培養サル網膜色素上皮細胞(2.0×105個の細胞)をラミニン511−E8フラグメントが最終濃度2.1nMになるように調整したDMEM100μl中に入れた。この細胞調製物を網膜下注入針を用いてウサギの網膜下に注射した。5日後にDiI陽性細胞を観察して移植した細胞の網膜下組織への生着を蛍光顕微鏡で確認した。
結果を図4に示す。ラミニン511−E8フラグメントともに培養した網膜色素上皮細胞を網膜下に注射することでラミニン511−E8フラグメントなしよりも多くの細胞が生着することが認められた。このことはラミニンは細胞懸濁液とともに注入することで、網膜色素上皮細胞において組織への接着を促進することを示す。
次に、網膜疾患モデルを用いて、培養網膜上皮移植実験を行う。
・遺伝子改変マウスによる黄斑変性モデル(または、サル、ウサギ、ラット、マウスなどのモデル動物において網膜光凝固などによる網膜の機械的障害による黄斑変性モデルを用いることができ、あるいは遺伝子改変したマウスなどによる網膜色素変性症モデルも用いることができる)。
培養網膜色素上皮細胞をDiI(Vybrant DiI cell-labeling solution, Life Technologies (Carlsbad,CA))にて蛍光ラベルする。この培養網膜色素上皮細胞(2.0×105個の細胞)を、ラミニン511−E8フラグメントが最終濃度2.1nMになるように調整したDMEM100μl中に入れる。この細胞調製物を網膜下注入針を用いてウサギの網膜下に注射する。
DiI陽性細胞を観察して移植した細胞の網膜下組織への生着を確認する。RPE65、Na+/K+-ATPaseなどの機能関連マーカーの発現を確認する。
網膜電位の測定などによる機能評価を行う。
本実施例により、網膜疾患モデルでも、細胞をラミニンとともに移植することで、網膜が再生され機能が回復することが理解される。
本実施例では、ラミニンを添加した際の神経細胞(N2a)の挙動を調べた。N2aは分化状態が安定している代表的な神経細胞である。
・神経細胞(N2a):(実験手法:培養網膜上皮細胞の調製)を参照
・コントロールとして非添加の培地(DMEM+10%FBS+1%P/S)を用いた。
・ラミニン511−E8フラグメント(株式会社ニッピ、382−02413)
・コラーゲンタイプIV(新田ゼラチン株式会社、KP−6020)
・フィブロネクチン(和光純薬工業、063−05591)
(位相差顕微鏡写真)
実施例2と同様の条件で位相差顕微鏡写真の撮影を行った。ラミニン添加後3時間の写真を撮影した。細胞は5000細胞/96ウェルプレートで播種し、ラミニン濃度は、2.1nMを用いた。
実施例2と同様の受験で細胞接着に対する影響を調べた本実施例では、ラミニン添加後3時間の生着を調べた。細胞は5000細胞/96ウェルプレートで播種し、ラミニン濃度は、2.1nMを用いた。コラーゲンIVおよびフィブロネクチンは、20μg/mlにてコーティングしたものを用いた。
結果を図5および6に示す。図5では、ラミニンを培地に添加した際の神経細胞(N2a)の位相差顕微鏡写真が示される。図6では、ラミニンを培地に添加した際の神経細胞(N2a)の細胞接着に対する影響が示される。これらから、ラミニン511−E8フラグメントを培地に添加することで、神経系の細胞の細胞基質間接着を促進することが示された。コントロール、コラーゲンIVおよびフィブロネクチンと比較してラミニン511−E8フラグメントは神経系の細胞の細胞基質間接着を促進することが示された。
本実施例では、ラミニンを添加した際の神経細胞(SH−SY5Y)の挙動を調べた。SH−SY5Yは神経芽腫細胞であり、神経の別の代表的な細胞である。
・神経細胞(H−SY5Y):(実験手法:培養網膜上皮細胞の調製)を参照
・コントロールとしては、非添加の培地(DMEM + 10% FBS + 1% P/S)を用いた。
・ラミニン511−E8フラグメント(株式会社ニッピ、382−02413)
・コラーゲンタイプIV(新田ゼラチン株式会社、KP−6020)
・フィブロネクチン(和光純薬工業、063−05591)
(位相差顕微鏡写真)
実施例2、5等と同様の条件で行った。ラミニン添加後3時間の写真を撮影した。細胞は5000細胞/96ウェルプレートで播種し、ラミニン濃度は、2.1nMを用いた。コラーゲンIVおよびフィブロネクチンは、20μg/mlにてコーティングしたものを用いた。
実施例2、5と同様の条件で行った。ラミニン添加後3時間の生着を調べた。細胞は5000細胞/96ウェルプレートで播種し、ラミニン濃度は、2.1nMを用いた。コラーゲンIVおよびフィブロネクチンは、20μg/mlにてコーティングしたものを用いた。
結果を図7および8に示す。図7にラミニンを培地に添加した際の神経細胞(SH−SY5Y)の位相差顕微鏡写真が示され、図8にラミニンを培地に添加した際の神経細胞(SH−SY5Yの細胞接着への影響が示される。これらから、ラミニン511−E8フラグメントを培地に添加し、神経細胞を播種することにより、細胞接着を促進することが示された。コントロール、コラーゲンIVおよびフィブロネクチンと比較してラミニン511−E8フラグメントは神経系の細胞の細胞基質間接着を促進することが示された。
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含有する治療液を以下のようにして製造する。
ラミニン411、ラミニン511、ラミニン521および/またはそれらのフラグメント(0.75μg/cm2)
最終濃度が2.1nM
培養角膜内皮細胞 (実施例1等に準じて調製したものを適量)
適宜の緩衝液 適量
全量 100mL
本実施例では、製剤例として、本発明の因子を含む、コーティング用溶液を以下のように製造する。
ラミニン411、ラミニン511、ラミニン521および/またはそれらのフラグメント(0.75μg/cm2)
最終濃度が21nM
適宜の緩衝液 適量
全量 100mL
各成分は、実施例1〜6に記載のように入手することができる。
配列番号2:ラミニンα5鎖アミノ酸配列(NP_005551)
配列番号3:ラミニンβ1鎖核酸配列(NM_002291)
配列番号4:ラミニンβ1鎖アミノ酸配列(NP_002282)
配列番号5:ラミニンβ2鎖核酸配列(NM_002292)
配列番号6:ラミニンβ2鎖アミノ酸配列(NP_002283)
配列番号7:ラミニンγ1鎖核酸配列(NM_002293)
配列番号8:ラミニンγ1鎖アミノ酸配列(NP_002284)
配列番号9:ラミニンα4鎖核酸配列(NM_001105206)
配列番号10:ラミニンα4アミノ酸配列(NP_001098676)
Claims (20)
- ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含み、該ラミニンは、γ1鎖を含む、網膜色素上皮の疾患、障害または状態の治療または予防剤。
- 前記ラミニンは、α5鎖をさらに含む、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記ラミニンは、ラミニン511(α5β1γ1)およびラミニン521(α5β2γ1)を含む、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記フラグメントは、網膜色素上皮の細胞の細胞接着能を有する、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記因子は、ラミニン511、ラミニン521またはラミニン511−E8フラグメントである、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記網膜色素上皮は霊長類のものである、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記網膜色素上皮の疾患、障害または状態は、網膜色素上皮疾患、障害または状態は、滲出型および萎縮型加齢黄斑変性、網膜色素変性、網膜色素上皮症(中心性漿液性網脈絡膜症)、その他特に黄斑部などの網膜に障害をきたした視力低下、ならびに視機能低下をきたした疾患からなる群より選択される、請求項1に記載の治療または予防剤。
- さらに、網膜色素上皮の細胞を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
- さらに、ROCK阻害剤を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の治療または予防剤。
- 前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項9に記載の治療または予防剤。
- 前記因子は、網膜下に注入され網膜を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記因子は、約21nM以上で存在する、請求項11に記載の治療または予防剤。
- さらに網膜色素上皮の細胞が投与されることを特徴とする、請求項1に記載の治療または予防剤。
- 前記因子は、網膜色素上皮の細胞と混合されて提供され、さらに、ラミニンおよびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子が網膜下に注入され網膜を構成する細胞および/または組織と接触されることを特徴とする、請求項1に記載の治療または予防剤。
- さらに、ROCK阻害剤を含む、請求項14に記載の治療または予防剤。
- 前記ROCK阻害剤は、Y-27632((R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸塩1水和物)およびその薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項15に記載の治療または予防剤。
- 細胞と混合される前記因子は、約2.1nM以上であり、注入される前記因子は約21nM以上である、請求項14に記載の治療または予防剤。
- ラミニン511およびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも1つの因子を含み、細胞移植を必要とする神経の疾患、障害または状態の治療または予防剤。
- さらに、神経の細胞を含む、請求項18に記載の治療または予防剤。
- さらに神経の細胞が投与されることを特徴とする、請求項18に記載の治療または予防剤。
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