CN1966080A - 一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液 - Google Patents
一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1966080A CN1966080A CN 200510123306 CN200510123306A CN1966080A CN 1966080 A CN1966080 A CN 1966080A CN 200510123306 CN200510123306 CN 200510123306 CN 200510123306 A CN200510123306 A CN 200510123306A CN 1966080 A CN1966080 A CN 1966080A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- neural stem
- stem cell
- hrpe
- people
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
本发明涉及一种源于人的视网膜色素上皮细胞、用于治疗帕金森病的神经干细胞注射液，所述神经干细胞注射液中至少包括3×106个源于人hRPE的神经干细胞，其中所述的源于人hRPE的神经干细胞为人视网膜色素上皮细胞分离培养的神经干细胞，该神经干细胞的制备方法，包括如下步骤：1)细胞的分离和原代培养：分离源于人的视网膜色素上皮层的hRPE细胞，匀浆，制成单细胞悬液，对细胞进行原代培养；2)hRPE细胞培养及传代：将上述原代培养液消化、终止消化反应，反复吹打使其进一步分散形成细胞悬液，离心弃上清，加培养基，使其进一步分散形成细胞悬液后过细胞筛，细胞转移到培养瓶，传代至少至第5代，3)按照注射液的制备方法将上述源于人的hRPE神经干细胞加生理盐水定容，制成细胞悬液注射液。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经干细胞注射液，特别是源于人的视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelial cells，hRPE)的、用于治疗帕金森病、老年痴呆症的神经干细胞注射液，属于生物医药领域。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease PD)是一种常见于中老年的中枢神经系统退行性疾病，病变以黑质纹体束多巴胺(DA)能神经元变性为主。目前临床治疗帕金森病的方法以口服DA前体药物左旋多巴为主，但这种药物起初有效，长期服用则会出现疗效下降，并引起一系列运动障碍并发症。外科治疗以苍白球和丘脑的孙会为主要方法，但术后复发率高。上述方法属于对症治疗，不能逆转DA能神经元的变性，而一致细胞替代变性的多巴胺能神经细胞以恢复多巴胺神经递质功能，才是人们期望地针对帕金森疾病因的治疗方法。
自二十世纪八十年代初开展的细胞移植治疗PD以来，人们已尝试过胚胎中脑黑质组织、自体贤上腺髓质，胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、人畸胎瘤神经元等，并取得了一定的疗效，因此细胞移植治疗PD也越来越多的受到关注。但上述细胞来源均受供体(donors)资源匮乏、伦理问题、成瘤风险大、免疫排斥反应、诱导多巴胺能神经元比例低等问题困扰，限制了细胞移植治疗帕金森病的进程。特别是2003年(Ann Ncurol 2003；54：403-414)由CW Olanow博士(1)领导的小组对34例PD病人采用立体定位移植胚胎脑组织黑质细胞，治疗24个月的双盲实验研究报告显示，移植胚胎脑组织黑质细胞组与安慰剂组比较，两组之间无显性差异。结果认为不推荐采用胚胎黑质细胞移植治疗帕金森病。分析原因，移植4个供体胚胎黑质细胞移植治疗组患者移植后6个月和9个月评价与治疗前比较有明显改善，但随后病情恶化与彻除免疫抑制剂环孢霉素(cyclosporine)的时间一致，推测细胞移植治疗疗效的下降与发生免疫反应一致。
目前细胞移植治疗PD的生物学的目的就是替代不能释放多巴胺神经递质的神经细胞以恢复多巴胺的传递。因此，希望移植到纹状体的细胞能分化为功能性多巴胺能神经元。目前可替代的细胞源包括猪的FVM(fetal ventral mesencephalic)以及视网膜色素上皮细胞。
人的视网膜约厚0.1～0.5毫米，在组织学上将其分为10层，其中主要由4层细胞组成。由外向内依次为色素上皮细胞层、视细胞层、双极细胞层及神经节细胞层。其中视网膜色素上皮细胞层紧靠脉络膜，为一层单层上皮细胞，胞体内含有丰富的色素颗粒，并有胞突伸入至视细胞之间的间隙内。已经证明体外培养的视网膜色素上皮细胞能够产生多巴胺。
美国专利申请US2005/0019909公开了一种经修饰的视网膜色素上皮细胞及其在预防和治疗帕金森病上的用途，其中的经修饰的视网膜色素上皮细胞被修饰为采用基因转移技术诱导表达和/或分泌一种治疗分子，该治疗分子可以是蛋白，如多巴胺和/或生长因子如GDNF(glial derived neurotrophic factor)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种神经干细胞注射液，该注射液的具有神经干细胞分子标志和生物学特性、可生化合成多巴胺、免疫原性低，不发生免疫排斥，可以有效预防和治疗帕金森病。
本发明的另一目的在于提供上述神经干细胞注射液的制备方法，该方法采用可靠的供体，经分离、培养、传代得到干细胞产品，制备过程简单、可靠、重现性好。
本发明的再一目的在于
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种神经干细胞注射液，其中至少包括3×106个源于人的hRPE神经干细胞。
本发明的神经干细胞注射液中，至少包括1×105个源于人的hRPE神经干细胞。包括3×106个源于人的hRPE神经干细胞。
其中所述的源于人的hRPE神经干细胞为人视网膜色素上皮细胞分离培养的神经干细胞。该人视网膜色素上皮细胞取材于北京同仁眼库的正常人眼的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelial cells，hRPE)体外连续传代培养至第六代，经生理盐水定容，制成细胞悬液，以手术方式植入患者脑部病变部位，用于帕金森病、老年痴呆症的细胞替代治疗。
本发明所述神经干细胞注射液，可以为神经干细胞的生理盐水溶液或将神经干细胞附载于微载体的溶液，所述微载体包括但不限于脂质体、微胶囊、微球等生物化学制剂常用载体。
所述源于人hRPE的神经干细胞是通过下述方法制备的：
1)细胞的分离和原代培养：分离源于人视网膜色素上皮细胞的神经干细胞，匀浆，制成单细胞悬液，对细胞进行原代培养；
2)hRPE细胞培养及传代：将上述原代培养液消化、终止消化反应，反复吹打使其进一步分散形成细胞悬液，离心弃上清，加培养基，使其进一步分散形成细胞悬液后过细胞筛，细胞转移到培养瓶，传代至少至第5代；
3)按照注射液的制备方法将上述源于人的hRPE神经干细胞的细胞库依据组织配型制备为不同的注射液。
其中分离源于人视网膜色素上皮细胞的神经干细胞的方法为：单细胞悬液的制备：取人眼库正常人视网膜色素上皮层细胞，剪碎、消化、终止消化、吹打，使其进一步分散形成细胞悬液后过细胞筛、离心、弃上清得到单细胞悬液。利用人hRPE的神经干细胞标记，采用荧光细胞分离器分离源于人的hRPE神经干细胞。
原代培养：细胞重悬于培养基，制成单细胞悬液，调节细胞密度，分别接种于细胞培养瓶，细胞培养箱内培养。培养2-7天，弃上层悬浮细胞及培养液，更换新鲜培养基，继续置37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，继续培养约5-7天，更换新鲜培养基，继续培养7天，得到原代培养液。
步骤2中将细胞转移到培养瓶，X2瓶，继续培养为第1代。培养皿置37℃、5％CO2细胞培养箱内继续培养。培养3-4天可根据情况更换1次新鲜hRPE细胞培养基，培养至第7天，培养细胞达70％汇合，消化、终止消化反应，反复吹打，离心弃上清，加培养基，按1∶2接种细胞(P2)，继之，按1∶3培养传代，至第5代，冻存。
其中，所述hRPE细胞培养基为：其中hRPE细胞培养基为：BFGF 20ng/ml，EGF20ng/ml，LIF 10ng/ml，胎牛血清10％。采用该培养基，能够使细胞贴壁生长，培养的细胞状态良好，细胞高密度生长。
人hRPE的神经干细胞标记包括：hRPE细胞表达神经干细胞的分子标志nestin(+)和Pax6(+)。表达增殖核抗原Ki67(+)，流式细胞仪检侧细胞周期S期比例为15％左右，具有较强的细胞增殖能力。hRPE细胞保持正常人二倍体核型，每传5-8世代(G)检测一次染色体核型，经G显带核型分析结果，hRPE细胞保持正常人二倍体核型，X，Y或X，X。
mRNA或蛋白质水平检测表达神经干细胞标志nestin，Pax6，BMI-1，nuclcostemin，与细胞增殖有关的表面标志CD90和CD44阳性，不表达造血干细胞和血管内皮表面标志CD34，CD45和CD14，不表达人类白细胞抗原HLA-DR。
源于人hRPE的神经干细胞的培养传代采用现有技术中公开的方法进行，包括但不限于Brustle法、中国专利或专利申请中公开的方法以及文献中公开的其他方法。
其中，Brustle法通常为：将分离出的干细胞在含有FGF2的培养基中培养，随后加入上皮生长因子(EGF)，最后在FGF2和PDGF的混合培养基中生长增殖。
本发明中分离的人眼库正常人视网膜色素上皮层细胞的形态为单层贴壁生长上皮样细胞。
体外研究表明，本发明的源于人的hRPE神经干细胞，经PACAP，dbCAMP，RA和bFGF诱导，RT-PCR和免疫荧光显示神经元标志，β-tubulin III和少突胶质细胞标志O4阳性，RT-PCR显示GFAP(神经胶质酸性蛋白)阳性，说明hRPE细胞在一定诱导条件下可分化为神经细胞。细胞经诱导可在mRNA和蛋白质水平分化为多巴胺能神经元。本发明的神经干细胞注射液可以以手术方式植入帕金森患者脑部脑部病变部位，细胞植入替代治疗帕金森病，脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。
本发明的神经干细胞注射液，采用源于人hRPE的神经干细胞，该干细胞可以由眼库获得供体以避免伦理问题，经体外实验证明，该细胞具有神经干细胞标志，诱导后可分化为TH阳性的多巴胺能神经元。因此，本发明的干细胞注射液能够替代不能释放多巴胺神经递质的神经细胞以恢复多巴胺的传递，且免疫原性低，不发生免疫排斥；另外RPE细胞位于视网膜，具有易于取材等诸多优势，有望成为新的治疗PD的替代细胞资源。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施方式详细描述本发明，所述的具体实施利用于理解本发明而不是限制本发明。
附图说明：
图1：A体外培养的来源于人的hRPE神经干细胞，胞浆内有黑色素颗粒。
B传代以后细胞形态一致，胞浆内和细胞外还残留黑色素颗粒。
C、D细胞经诱导后形成神经元样突起。
图2流式细胞仪分析细胞周期S期比例为13.04％±0.92％。
图3G显带证明是女性正常2倍体核型。
图4RT-PCR显示表达nestin，SOX2，BMI-1，Neucliostemin，PAX6。
图5流式细胞仪检测RPE表面抗原CD147，CD90，CD10和CD44阳性。
图6移植干细胞前、后在鼠脑内分化为多巴胺细胞的示意图。
图7视网膜色素上皮细胞诱导分化为神经干细胞。
图8免疫荧光染色图。
实施例1
取北京同仁医院眼库供体，供体不限年龄和性别，供体符合国家对眼库供体的要求，以眼库对供体测试的方法及符合条件为依据。乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒和爱滋病病毒等均为阴性。供体无疯牛病疫区接触史。取人眼库中人眼中的视网膜色素上皮层，正常同种异体视网膜色素细胞层。经匀浆，制成单细胞悬液，按照以下方法制备源于人的hRPE神经干细胞注射液：
1.细胞的分离和原代培养：
无菌条件下，提取人眼库中人眼中的视网膜色素上皮层，用DMEM/F12含硫酸庆大霉素(100U/ml)的培养基反复冲洗组织3次后，用眼科剪将组织充分剪碎，1X胰蛋白+EDTA 37℃消化5-10分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化反应，尖吸管反复机械吹打，使其进一步分散形成细胞悬液后过400目细胞筛，1000rpm离心5分钟，弃上清，细胞重悬于10ml hRPE细胞培养基，制成单细胞悬液，调节细胞密度大于5×107个细胞，分别接种于T-25细胞培养瓶，X2瓶(第0代，P0)。参见附图1中的图A，倒置显微镜下观察接种细胞很亮，可见黑色素颗粒，状态良好。培养皿置37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。培养2-7天，倒置显微镜下观察已有三五成群的细胞贴壁，培养细胞状态良好，未发现任何污染发生。弃上层悬浮细胞及培养液，更换新鲜hRPE细胞培养基，继续置37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。继续培养约5-7天，可见细胞克隆约3-10个左右，贴壁生长，贴壁生长细胞胞浆内含黑色素颗粒，细胞培养液中也含黑色素颗粒，仔细辨认是否有污染，参见附图1C。更换新鲜hRPE细胞培养基，继续培养7天。倒置显微镜下观察细胞克隆生长，细胞克隆局部细胞生长密度很高，有接触抑制现象。
2.hRPE细胞培养及传代
继之，用1X胰蛋白+EDTA 37℃消化3-5分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化反应，尖吸管反复机械吹打，使其进一步分散形成细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，加hRPE细胞培养基，使其进一步分散形成细胞悬液后过400目细胞筛，细胞转移到T-25培养瓶，X2瓶，继续培养为第1代(P1)。倒置显微镜下观察，接种细胞很亮，状态良好。参见附图1B，培养皿置37℃、5％CO2细胞培养箱内继续培养。培养3-4天可根据情况更换1次新鲜hRPE细胞培养基，培养至第7天，培养细胞达70％汇合，1X胰蛋白+EDTA 37℃消化5-10分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化反应，尖吸管反复机械吹打，1000rpm离心5分钟，弃上清，加hRPE细胞培养基，按1∶2接种细胞(P2)，继之，按1∶3培养传代，至第5代，冻存。根据临床移植需求，复苏hRPE细胞贴壁去除死细胞，计数细胞3×106个细胞/300μl定容鉴定和使用。
其中hRPE细胞培养基为：BFGF 20ng/ml，EGF 20ng/ml，LIF 10ng/ml，胎牛血清10％，上述产品分别购自Sigma、R&D、Chemicon公司以及杭州四季青生物工程材料有限公司产品。
3.干细胞鉴定
通过以下方法鉴别本发明的源于人的hRPE神经干细胞：
(1)流式细胞仪检测细胞表型：藻红蛋白(PE)标记的抗体抗-CD34，CD44，CD90，CD117，CD10。或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体抗-CD14，CD45，CD71，CD147，HLA-DR。鼠IgG1-PE，IgG2a-PE，IgG1-FITC，IgG2a-FITC，IgG2b-FITC，IgM-FITC作为同型对照。
(2)细胞周期分析：细胞经胰蛋白酶作用成单细胞悬液，70％乙醇固定，冰上放置30min。加入100μg/ml RNAaseA，37℃孵育1h降解RNA。20μg/ml propidium iodine标记DNA。流式细胞技术检测细胞周期。
(3)G显带染色体分析：采取常规吉姆萨染色(Giemsa staining)。染色体核型分析采用专用FISH & CGH系统。镜下观察中期分裂相。
(4)体外诱导分化RPE细胞：细胞垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)预处理3天，经全反维甲酸(RA)，bFGF，双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)，既dbCAMP-RA-bFGF鸡尾酒诱导1天。或经SHH，FGF8，GDNF，RA和dbcAMP诱导向多巴胺能神经元分化7天。逆转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光染色检测。
(5)逆转录PCR(RT-PCR)：全部RNA以TRIZOL试剂提取。用oligo(dT)12-18引物转化为cDNA。PCR扩增反应循环40次。PCR产物分析用含1μg/ml溴化乙锭(EB)的2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统紫外光下观察电泳条带、照相。引物序列及退火温度如表3。
表3RT-PCR引物序列
| Gene | Primer | sequence | Annealing | Product |
| GAPDH(G3) | F：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ | 1 | 55℃ | 452bp |
| R：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ | 2 | |||
| Nestin | F：5’-GCCCTGACCACTCCAGTTTA-3’ | 3 | 55℃ | 210bp |
| R：5’-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC-3’ | 4 | |||
| Nucleostemin(NS) | F：5’-ATAACCAAGCGTGTGAAGGCAAAG-3’； | 5 | 60℃ | 141bp |
| R：5’-GAAACCAATTACTCCAACCCGAATG-3’； | 6 | |||
| PAX6 | F：5’-CAAAAGTCCAAGTGCTGGACAA-3’ | 7 | 55℃ | 301bp |
| R：5’-CCCATCTGTTGCTTTTCGCT-3’ | 8 | |||
| SOX2 | F：5’-CAAGATGGCCCAGGAGAACC-3’ | 9 | 60℃ | 518bp |
| R：5’-GCTGCGAGTAGGACATGCTGTA-3’ | 10 | |||
| BMI-1 | F：5’-CTGGTTGCCCATTGACAGC-3’ | 11 | 55℃ | 385bp |
| R：5’-CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3’ | 12 | |||
| hTERT | F：5’CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’ | 13 | 60℃ | 144bp |
| R：5-GGATGATGCGGAGTCTGGA-3’ | 14 | |||
| Map-2 | F：5’-AATAGACCTAAGCCATGTGACATCC-3’； | 15 | 60℃ | 133bp |
| R：5’-AGAACCAACTTTAGCTTGGGCC-3’； | 16 | |||
| β-tubulinIII | F：5’-CATGGACAGTGTCCGCTCAG-3’； | 17 | 60℃ | 175bp |
| R：5’-CAGGCAGTCGCAGTTTTCAC-3’； | 18 | |||
| GFAP | F：5’-CTGGAGGTTGAGAGGGACAATCT-3’； | 19 | 55℃ | 317bp |
| R：5’-TACTGCGTGCGGATCTCTTTC-3’； | 20 | |||
| Nurrl | F：5’-ACTCCAACCCGGCTATGACC-3’； | 21 | 55℃ | 245bp |
| R：5’-GGACCTGTATGCTAATCGAAGGA-3’； | 22 | |||
| TH | F：5’-TTCGCGCAGTTCTCGCA-3’ | 23 | 63℃ | 206bp |
| R：5’-AAGGCCCGAATCTCAGGCT-3’ | 24 | |||
| D2 receptor | F：5’-CAAGACCATGAGCCGTAGGAAG-3’ | 25 | 58℃ | 201bp |
| R：5’-TTCACGGCGCTGTTGACATAG-3’ | 26 |
(6)免疫荧光染色：细胞在0.1M pH7.4的PBS液中4％多聚甲醛固定。滴加正常羊血清(PBS配置)于标本上，37℃孵育1hr。滴加第一抗体，室温孵育1h。第二抗体室温孵育40min。第一抗体包括鼠抗-nestin，ki67，β-tubulin III和oligophrenin-4(O4)，兔抗神经胶质酸性蛋白(GFAP)，PAX6，TH，D2受体，DAT。荧光显微镜下观察、照相。
4.神经干细胞鉴定结果
来源于人的hRPE神经干细胞来源于人眼库正常人视网膜色素上皮层，是同种异体细胞系。细胞经体外传代、培养、鉴定、液氮冻存。细胞形态为单层贴壁生长上皮样细胞。mRNA或蛋白质水平检测表达神经干细胞标志nestin，Pax6，BMI-1，nuclcostemin。与细胞增殖有关的表面标志CD90和CD44阳性，不表达造血干细胞和血管内皮表面标志CD34，CD45和CD14，不表达人类白细胞抗原HLA-DR。
(a)人视网膜色素上皮细胞(RPE)分化为神经前体细胞过程中形态学检测：原始RPE细胞形态为小圆形，有的细胞胞浆中残留黑色素颗粒(附图1A)。传代后成纺锤形(附图1中B)，经PACAP和dbCAMP-RA-bFGF诱导分化后形成多角形，有的细胞形成轴突，见附图1C、D。
(b)视网膜色素上皮细胞来源的神经前体细胞所具有的神经干细胞特征：RPE来源的干细胞增殖较快，流式细胞仪分析细胞周期S期比例为13.04％±0.92％，显示其具有较高的S期比率(图2)。G显带证明RPE是女性正常2倍体核型(图3)。RT-PCR检测表明RPE表达神经干细胞或前体细胞的分子标志物，Nestin，BMI-1，sox2，nucleostemin，同时也表达人类转端粒酶的催化亚基和Pax6，图4展示了RT-PCR显示表达nestin，SOX2，BMI-1，Neucliostemin，PAX6等。流式细胞仪检测细胞表面抗原表达CD147，CD90，CD10和CD44，但不表达CD34，CD45，CD14，HLA-DR，CD38，CD117和CD104。CD71弱表达(见5)。免疫荧光也证实RPE表达Nestin，Pax6和Ki67蛋白。
上述研究表明，本发明的源于人的hRPE神经干细胞，体外细胞经PACAP，dbCAMP，RA和bFGF诱导，RT-PCR和免疫荧光显示神经元标志，β-tubulin III和少突胶质细胞标志O4阳性，RT-PCR显示GFAP(神经胶质酸性蛋白)阳性，说明hRPE细胞在一定诱导条件下可分化为神经细胞。细胞经诱导可在mRNA和蛋白质水平分化为多巴胺能神经元。
实施例2
参照实施例1的方法，得到计数细胞1×105个细胞/300μl的注射液。
实施例3
参照实施例1的方法，将得到的干细胞涌现由藉述常用的方法制成微胶囊或脂质体的溶液。
实施例4
参照实施例1的方法，传代6代。
图7、8展示了本发明实施例4的RT-PCR和免疫荧光染色图。其进一步说明本发明的视网膜色素上皮细胞诱导分化为神经干细胞，以及干细胞可分化为多巴胺能神经元。
视网膜色素上皮细胞诱导分化为神经干细胞：参见图7，RPE细胞经PACAP，dbCAMP，RA和bFGF诱导神经干细胞分化，RT-PCR和免疫荧光显示早期神经元标志b-tubulin III和少突胶质细胞标志O4阳性，RT-PCR显示GFAP(神经胶质酸性蛋白)阳性，说明RPE细胞在一定诱导条件下可分化为神经元。
视网膜色素上皮细胞可分化为多巴胺能神经元：诱导分化前RPE表达DA神经元分化与成熟的转录因子-Nurrl，但不表达TH、D2受体、DAT等DA神经元特异性标志物。经过7天分化，RT-PCR显示Nurrl增长，而TH、D2受体出现阳性，DAT显示弱阳性。免疫荧光染色方法继续证实。说明RPE来源的神经干细胞可以分化为DA神经元。图8中A-C为RPE表达nestin Pax6和增殖核抗原Ki67阳性，D、E诱导前b-tubulin III阴性，诱导后阳性，F、G诱导前O4阴性，诱导后阳性，H、I诱导前TH阴性，诱导后阳性，J、K诱导前D2受体阴性，诱导后阳性，L-Nb-tubulinIII和TH双阳细胞。
实验例
本实验例涉及源于人的hRPE神经干细胞的体内研究
采用帕金森大鼠模型：6-OHDA毁损术后2周开始，APO(0.25mg/kg)腹腔注射诱导大鼠向健侧(左侧)旋转，旋转圈数平均大于7圈/min(210圈/30min)者为成功的PD大鼠模型。利用立体定位技术将细胞(2×105个细胞/5μl)移植于治疗组PD模型大鼠纹状体相应靶区内；对照组大鼠纹状体内移植相同剂量的生理盐水。根据移植前后大鼠旋转行为发送及脑纹状体酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色改变，正电子成像技术(PET)作为在体可视化监测手段，客观准确地显示神经干细胞移植治疗帕金森病(PD)干细胞分化结果和移植治疗效果。实验中采用的PET在体可视化监测手段，以确定多巴胺D2受体、多巴胺转运蛋白(DAT)为hRPE细胞分化细胞(即多巴胺神经元)的标志物，11C-Raclopride、11C-β-CFT为相应的PET成像放射性示踪剂。进行移植前后的11C-Raclopride、11C-β-CFT PET显像，观测D2受体及DAT变化情况，并运用视觉分析、感兴趣区(ROI)方法分析治疗组、对照组移植前后显像变化，并对结果做统计分析。实验结果证明，hRPE细胞在一定诱导条件下可分化DA神经元；hRPE细胞移植后PD模型大鼠行为学及细胞形态学明显改善；11C-Raclopride、11C-β-CFT PET成像技术能够在体显示RPE细胞分化为DA神经元并具有较好的移植治疗效果，结果参见图6。
临床研究表明，本发明的源于人的hRPE神经干细胞能够有效改善帕金森患者症状，有效率达80％，对于老年痴呆症的治疗，有效率达85％。
采用本发明实施例1的神经干细胞注射液细胞移植治疗6例晚期帕金森病(PD)病人，手术采用立体定位，即通过CT或MRI扫描定位，确定手术靶点，再通过计算机辅助定位系统软件，确定靶点的三维坐标。核对靶点，并观察操作器位置正确后，将活检针经导向器插至靶点；将hRPE细胞悬液300,000细胞/300μl注入帕金森病患者脑内纹状体区靶点(壳核、丘脑腹后外侧核)。所有受试患者均未用免疫抑制药物，治疗前后应用统一帕金森病等级评分(Unified Parkinson’s DiseaseRating Scale，UPDRS)对病人进行评估。结果显示，hRPE细胞移植治疗可持久，显著地改善晚期帕金森病病人的运动功能，其功能改善可持续长达2年。治疗病人对细胞移植过程耐受良好，没有明显副作用。基于以上试验结果，进行随机双盲II期临床实验研究也得到良好效果。实施例2也得到相同的结果。
Claims (10)
1.一种源于人hRPE的神经干细胞注射液，其中包括3×106个源于人的hRPE神经干细胞，其中所述的源于人的hRPE神经干细胞为人视网膜色素上皮层神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞注射液，至少包括1×105个源于人的hRPE神经干细胞，优选包括3×106个源于人的hRPE神经干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的神经干细胞注射液，其中所述人视网膜色素上皮细胞取材于北京同仁眼库的正常人眼的视网膜色素上皮细胞。
4.根据权利要求1或2所述的神经干细胞注射液，其中，所述的注射液为神经干细胞的生理盐水溶液或将神经干细胞附载于微载体的溶液，优选所述微载体为脂质体、微胶囊、微球等载体。
5.权利要求1或2所述的神经干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤：
1)细胞的分离和原代培养：分离源于人视网膜色素上皮细胞的神经干细胞，匀浆，制成单细胞悬液，对细胞进行原代培养；
2)hRPE细胞培养及传代：将上述原代培养液消化、终止消化反应，反复吹打使其进一步分散形成细胞悬液，离心弃上清，加培养基，使其进一步分散形成细胞悬液后过细胞筛，细胞转移到培养瓶，传代至少至第5代；
3)按照注射液的制备方法将上述源于人的hRPE神经干细胞加生理盐水定容，制成细胞悬液注射液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中分离源于人视网膜色素上皮细胞的神经干细胞的方法为：单细胞悬液的制备是取人眼库正常人视网膜色素上皮层细胞，剪碎、消化、终止消化、吹打，使其进一步分散形成细胞悬液后过细胞筛、离心、弃上清得到单细胞悬液。利用人hRPE的神经干细胞标记，采用荧光细胞分离器分离源于人hRPE的神经干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中原代培养为：细胞重悬于培养基，制成单细胞悬液，调节细胞密度，分别接种于细胞培养瓶，细胞培养箱内培养。培养2-7天，弃上层悬浮细胞及培养液，更换新鲜培养基，继续置37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，继续培养约5-7天更换新鲜培养基，继续培养7天，得到原代培养液。
8.根据权利要求6所述的方法，其中传代为：将细胞转移到培养瓶，X2瓶，继续培养为第1代。培养皿置37℃、5％CO2细胞培养箱内继续培养。培养3-4天可根据情况更换1次新鲜hRPE细胞培养基，培养至第7天，培养细胞达70％汇合，消化、终止消化反应，反复吹打，离心弃上清，加培养基，按1∶2接种细胞(P2)，继之，按1∶3培养传代，至第5-7代，冻存。
9.采用权利要求6-8任何一项的方法制备的源于人的hRPE神经干细胞注射液。
10.权利要求1或9所述源于人的hRPE神经干细胞注射液，在制备预防或治疗帕金森病、老年痴呆症方面的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2005101233067A CN1966080B (zh) | 2005-11-17 | 2005-11-17 | 一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2005101233067A CN1966080B (zh) | 2005-11-17 | 2005-11-17 | 一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1966080A true CN1966080A (zh) | 2007-05-23 |
| CN1966080B CN1966080B (zh) | 2011-06-08 |
Family
ID=38075174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2005101233067A Active CN1966080B (zh) | 2005-11-17 | 2005-11-17 | 一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1966080B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101548987B (zh) * | 2009-04-10 | 2012-08-22 | 清华大学 | 一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法和应用 |
| CN103146641A (zh) * | 2013-02-06 | 2013-06-12 | 云南中科灵长类生物医学重点实验室 | 多能干细胞的传代方法及其用途 |
| CN106754668A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-05-31 | 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 | 一种干细胞培养液及注射液 |
| CN106924286A (zh) * | 2017-02-16 | 2017-07-07 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂 |
| WO2018103406A1 (zh) * | 2016-12-05 | 2018-06-14 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液及其制备方法和使用方法 |
| CN115869251A (zh) * | 2021-09-27 | 2023-03-31 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种简单的视网膜色素上皮细胞的配制方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU716811B2 (en) * | 1994-11-14 | 2000-03-09 | Neurospheres Holdings Ltd | Regulation of neural stem cell proliferation |
| US6576464B2 (en) * | 2000-11-27 | 2003-06-10 | Geron Corporation | Methods for providing differentiated stem cells |
| SG10201606441SA (en) * | 2004-01-23 | 2016-09-29 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Improved modalities for the treatment of degenerative diseases of the retina |
-
2005
- 2005-11-17 CN CN2005101233067A patent/CN1966080B/zh active Active
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101548987B (zh) * | 2009-04-10 | 2012-08-22 | 清华大学 | 一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法和应用 |
| CN103146641A (zh) * | 2013-02-06 | 2013-06-12 | 云南中科灵长类生物医学重点实验室 | 多能干细胞的传代方法及其用途 |
| CN103146641B (zh) * | 2013-02-06 | 2015-03-25 | 云南中科灵长类生物医学重点实验室 | 多能干细胞的传代方法及其用途 |
| CN106754668A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-05-31 | 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 | 一种干细胞培养液及注射液 |
| CN106754668B (zh) * | 2016-11-16 | 2020-08-25 | 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 | 一种干细胞培养液及注射液 |
| WO2018103406A1 (zh) * | 2016-12-05 | 2018-06-14 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液及其制备方法和使用方法 |
| CN106924286A (zh) * | 2017-02-16 | 2017-07-07 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂 |
| WO2018149127A1 (zh) * | 2017-02-16 | 2018-08-23 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CN115869251A (zh) * | 2021-09-27 | 2023-03-31 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种简单的视网膜色素上皮细胞的配制方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1966080B (zh) | 2011-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kang et al. | Porous poly (lactic-co-glycolic acid) microsphere as cell culture substrate and cell transplantation vehicle for adipose tissue engineering | |
| Dziewczapolski et al. | Survival and differentiation of adult rat-derived neural progenitor cells transplanted to the striatum of hemiparkinsonian rats | |
| CN1966080B (zh) | 一种治疗老年痴呆症、帕金森病的神经干细胞注射液 | |
| CN101748096A (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| CN109609460B (zh) | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN103881971B (zh) | 一种用于培养和/或扩增间充质干细胞的培养基及其培养方法 | |
| CN109266610B (zh) | 一种促进间充质干细胞分化为神经元的方法 | |
| US20140271616A1 (en) | Compositions And Methods For Mesenchymal And/Or Chondrogenic Differentiation Of Stem Cells | |
| DE2749023C2 (de) | Verfahren zur schnellen Vermehrung von SV3T3 Zellen in vitro | |
| US10968434B2 (en) | Exosome active formulation for inhibiting endothelial cell migration, and preparation method and application | |
| CN1778905B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 | |
| CN108070558B (zh) | 一种临床级神经干细胞的制备方法 | |
| CN102206611B (zh) | 一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法 | |
| CN113106059B (zh) | 一种高迁徙间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN111411082B (zh) | 一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法 | |
| CN111304167B (zh) | 人源脂肪干细胞来源的神经元前体细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110592008A (zh) | 犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法 | |
| WO2010057965A1 (en) | Myometrial-derived mesenchymal stem cells | |
| CN101705205A (zh) | 一种诱导神经干细胞定向分化的方法 | |
| CN117106723A (zh) | 一种脊髓胶质瘤细胞及其培养方法 | |
| CN115094021B (zh) | 来源于母乳的细胞或细胞组合物及其制备方法 | |
| CN115212227B (zh) | 锂藻土作为有效成分用于制备神经损伤修复产品的用途 | |
| Sun et al. | Mesencephalic progenitors can improve rotational behavior and reconstruct nigrostriatal pathway in PD rats | |
| CN102618499B (zh) | 脊索瘤细胞株及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: LI LINGSONG Free format text: FORMER OWNER: KEYU UNION STEM CELL BIOTECHNOLOGY CO., LTD., BEIJING Effective date: 20110329 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100871 NO. 116, ZHONGGUANCUN NORTH STREET, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING TO: 100191 PEKING UNIVERSITY STEM CELLS CENTER, NO.38, XUEYUAN ROAD, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20110329 Address after: 100191 stem cell center, Peking University, Xueyuan Road 38, Beijing, Haidian District Applicant after: Li Lingsong Address before: 100871 No. 116 North Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun Applicant before: Keyu Union Stem Cell Biotechnology Co., Ltd., Beijing |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160303 Address after: 200123 Shanghai city Pudong New Area Yuntai Road No. 1800 22 floor Patentee after: Shanghai United Biotechnology Co., Ltd. Address before: 100191 stem cell center, Peking University, Xueyuan Road 38, Beijing, Haidian District Patentee before: Li Lingsong |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20161212 Address after: 136000 Siping City of Jilin province Tiexi District South Yingbin Street No. 89 Patentee after: Jilin TUO HUA Bio-technology Co., Ltd. Address before: 200123 Shanghai city Pudong New Area Yuntai Road No. 1800 22 floor Patentee before: Shanghai United Biotechnology Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220309 Address after: 100000 room 104, building 6, No. 25, Jinghai 4th Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing Patentee after: Beijing tuohua Weiye Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 136000 No. 89 Yingbin street, Tiexi District, Siping City, Jilin Patentee before: JILIN TUO HUA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |