CN117106723A - 一种脊髓胶质瘤细胞及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脊髓胶质瘤细胞，所述脊髓胶质瘤细胞具有细胞株特性，保藏编号为CGMCC No.23029。该脊髓胶质瘤细胞携带H3K27M突变，能够通过贴壁培养获得，并且可以高表达星形角质细胞标记物GFAP，且ki‑67的染色比例大于10％，可以用于体外研究H3K27M脊髓胶质瘤的生物学功能和对药物治疗的响应等。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体地，涉及一种脊髓胶质瘤细胞及其培养方法。
背景技术
近年来肿瘤干细胞学说备受人们的关注，研究表明，肿瘤的生长是由于肿瘤中极少量的肿瘤干细胞不断增殖的结果，只有消灭这一小群肿瘤干细胞，才能更好地治愈癌症。因此，了解干细胞潜在的生物学功能及其分化增殖情况，对于肿瘤的早期检测、治疗和诊断都有重要的临床意义。但是，目前肿瘤干细胞在肿瘤组织中的占比极低，要找出这群特异的肿瘤干细胞并对其进行深入研究和治疗更是难上加难。
H3K27M突变在脊髓胶质瘤中的弥漫性中线胶质瘤的独特性表达，目前已经成为中枢神经系统肿瘤分类中的一个新的类型。因此，亟需提供一种具有细胞株特性的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，对于脊髓胶质瘤的药物筛选具有重要意义。
发明内容
本公开的目的在于一种分离的脊髓胶质瘤细胞及其培养方法，以进行脊髓胶质瘤的药物筛选。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种分离的脊髓胶质瘤细胞，所述脊髓胶质瘤细胞为永生化的细胞株，且保藏编号为CGMCC No.23029。
根据本公开，其中，所述脊髓胶质瘤细胞为H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，能够通过贴壁培养获得。
本公开第二方面还提供了第一方面所述脊髓胶质瘤细胞的培养方法，其中，所述方法包括如下步骤：
将第一方面所述脊髓胶质瘤细胞接种于含有5-20体积％血清的DMEM培养基中进行贴壁培养，进行酶解消化后重悬，得到单细胞悬液。
根据本公开，其中，所述贴壁培养的条件包括：培养时间为5-10天，培养温度为35-40℃。
根据本公开，其中，接种于含有5-20体积％血清的DMEM培养基中的细胞密度为1×104～5×104个/mL。
本公开第二方面还提供了第一方面所述脊髓胶质瘤细胞在筛选治疗脊髓胶质瘤药物中的用途。
通过上述技术方案，本公开提供了一种脊髓胶质瘤细胞及其培养方法，该脊髓胶质瘤细胞具有细胞株特性，且为H3K27M突变型脊髓胶质瘤，并且可以高表达星形角质细胞标记物GFAP，且ki-67的染色比例大于10％，可以用于体外研究H3K27M脊髓胶质瘤的生物学功能和对药物治疗的响应等。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏信息
本公开涉及到的生物保藏信息包括：分类命名为：人源细胞；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2021-09-17；保藏编号为：CGMCC No.23029。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞的形态图。
图2是对比例1的脑胶质瘤n33细胞的形态图。
图3是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞免疫荧光染色测试图。
图4是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞在小鼠脊柱内成瘤效果图。
图5是本公开培养的H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞在不同浓度TMZ下的响应情况。
图6是对比例2的脑胶质瘤n33细胞在不同浓度TMZ下的响应情况。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供了一种分离的脊髓胶质瘤细胞，所述脊髓胶质瘤细胞为永生化的细胞株，且保藏编号为CGMCC No.23029。
根据本公开，其中，所述脊髓胶质瘤细胞为H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，能够通过贴壁培养获得。
H3K27M突变是以星形细胞分化为主并伴有H3K27M突变的浸润中线的高级别胶质瘤，其中H3组蛋白中的27位的赖氨基酸突变为蛋氨基酸。
本公开第二方面提供了第一方面所述脊髓胶质瘤细胞的培养方法，其中，所述方法包括如下步骤：
将第一方面所述脊髓胶质瘤细胞接种于含有5-20体积％血清的DMEM培养基中进行贴壁培养，进行酶解消化后重悬，得到单细胞悬液。
根据本公开，其中，所述贴壁培养的条件包括：培养时间为5-10天，培养温度为35-40℃。
根据本公开，其中，接种于含有5-20体积％血清的DMEM培养基中的细胞密度为1×104～5×104个/mL。
本公开第二方面还提供了第一方面所述的脊髓胶质瘤细胞在筛选治疗脊髓胶质瘤药物中的用途。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
细胞贴壁培养过程
把脑胶质瘤组织块(在天坛医院按照符合医学伦理的操作流程手术摘取的脑胶质瘤组织)置于烧杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；然后置于含有青链霉素的混合液中60分钟；用眼科剪把组织切成2-3毫米大小的块，以便于消化；加入相当于组织块总量50倍体积的胰蛋白酶液，分散成单个细胞；将单个细胞加入预热至37℃的含有10体积％血清的DMEM培养基(购自于普诺赛)，混匀后以电子细胞技术枪进行细胞计数，按照5×104个/mL的浓度接种于75cm2培养瓶中，每瓶培养体系为10mL，共培养3瓶；将培养瓶置于37℃下，5％CO2培养箱中进行培养。
原代培养5天后，观察到大量细胞死亡现象，逐步有形态均一化细胞贴壁生长，培养至第7天时，贴壁细胞密度达到70-85％时，使用胰蛋白酶进行消化传代。
使用PBS清洗细胞2次，加入1mL 0.25％的胰蛋白酶在37摄氏度消化细胞3分钟，加入1mL含血清培养基停止消化。将细胞球悬液移入15mL离心管，以1000rpm离心5min，吸弃上清液；用PBS重悬细胞球以洗去培养基，以1000rpm离心5min，吸弃上清液；加入含有10％的血清的DMEM培养基传代培养重悬细胞，并按照2×104/mL的浓度传代，放入37℃、5％CO2培养箱内；连续传代50次以上，获得仍可持续传代，因此具有永生性，由此得到了具有细胞株特性且携带H3K27M突变的脊髓胶质瘤细胞。
在符合筛选期望的细胞中，进行MTT实验和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力，选取增殖和迁移能力最强的一个细胞株进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.23029，即为本公开培养的脊髓胶质瘤细胞，其细胞形态图片如图1所示，标尺为100微米。
通过免疫荧光染色测定建立的脊髓细胞携带H3K27M突变，且该脊髓胶质瘤细胞高表达星形角质细胞标记物GFAP，且ki-67的染色比例大于10％，结果如图3所示。
将脊髓胶质瘤细胞注射至免疫缺陷小鼠(NPG小鼠，购自北京维通达生物技术有限公司)的脊柱内，2周后，根据小鼠核磁成像，可以在脊柱内明显看到肿瘤形成，结果如图4所示。
对比例1
将实验室培养的贴壁脑胶质瘤n33细胞作为对比例细胞，细胞形态如图2所示，标尺为100微米。
测试实施例
已知替莫唑胺药物对部分脑胶质瘤患者有效，对脊髓胶质瘤患者无效。本测试实施例分别测定本公开所述脊髓胶质瘤细胞和对比例1所述的脑胶质瘤n33细胞对替莫唑胺的药物反应性。
测定本公开的脊髓胶质瘤细胞对不同浓度的TMZ处理下细胞的抑制情况和TMZIC50值，药物终浓度为0、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600μM，药物作用72小时后，用CCK-8(购自于默克公司)检测细胞活力，结果图5。对比例1所述脑胶质瘤n33细胞对替莫唑胺的药物反应性如图6所示。
可见，本公开建立的细胞具有脊髓胶质瘤特征，且为H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，该细胞以贴壁的方式生长，与脊髓胶质瘤一样天然对TMZ耐药，在免疫缺陷小鼠脊柱内可以成瘤，可以用于体外研究H3K27M脊髓胶质瘤的生物学功能和对药物治疗的响应等。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (6)
1.一种分离的脊髓胶质瘤细胞，其特征在于，所述脊髓胶质瘤细胞为永生化的细胞株，且保藏编号为CGMCC No.23029。
2.根据权利要求1所述的脊髓胶质瘤细胞，其中，该脊髓胶质瘤细胞为H3K27M突变型脊髓胶质瘤细胞，能够通过贴壁培养获得。
3.权利要求1或2所述脊髓胶质瘤细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将权利要求1或2所述脊髓胶质瘤细胞接种于含有5-20体积％血清的DMEM培养基中进行贴壁培养，进行酶解消化后重悬，得到单细胞悬液。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其中，所述贴壁培养的条件包括：培养时间为5-10天，培养温度为35-40℃。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其中，接种于含有5-20体积％血清的DMEM培养基中的细胞密度为1×104～5×104个/mL。
6.权利要求1或2所述的脊髓胶质瘤细胞在筛选治疗脊髓胶质瘤药物中的用途。
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2022
- 2022-05-16 CN CN202210530190.2A patent/CN117106723A/zh active Pending
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