CN101215546A - 利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法，所述方法是将分离提纯的骨髓间充质干细胞经传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞转入诱导分化培养基，诱导培养7～20天，获得内耳毛细胞前体；所述的诱导分化培养基为添加有生长因子的基础培养基，所述生长因子主要包括表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子－1(IGF－1)，添加量为：EGF 10～30ng/ml基础培养基，IGF－1 40～60ng/ml基础培养基。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法，为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供了坚实的基础，具有重大临床意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法。
(二)背景技术
感音性神经性耳聋(sensorineural hearing loss)在临床上很常见，最新报道达数十亿人，占人口总数的10％左右。在欧美就超过9亿人。主要是因为内耳毛细胞数量有限，只有大约1500个；易受衰老、噪声、耳毒性药物、外伤、感染、肿瘤、遗传性疾病、免疫性疾病等体内外因素的影响而损伤或破坏；且哺乳动物耳蜗毛细胞破坏后再生能力有限，常可引起永久性的听力下降，治疗非常困难。随着干细胞研究的深入，通过干细胞移植或再生补偿毛细胞的损失，是迄今研究最活跃的领域之一。
干细胞按其细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞通常是指源自囊胚内细胞团的细胞，在一定条件下可向内、中、外三个胚层的组织和细胞分化，同时具有无限扩增的能力。成体干细胞是指存在于成年动物许多组织和器官，具有修复和再生能力的细胞。目前发现有成体干细胞的组织类型有10多种，如心脏、骨髓、脑、肝、视网膜等。
胚胎干细胞在体内外均可以分化为内耳毛细胞。Li等将胚胎干细胞进行体外诱导分化培养，发现培养至第八天，细胞表达神经前体细胞特异性蛋白nestin和毛细胞前体细胞特异性蛋白Pax2；继续培养10～14天，这些细胞表达内耳成熟毛细胞的标志物。将体外培养的毛细胞前体细胞注入到胚胎的听泡中，几天后细胞迁移到内耳毛细胞区，并分化为成熟的毛细胞。
神经干细胞是成体干细胞的一种，可以在体内外分化为毛细胞。Kojima等最先报道神经干细胞在体外培养，可以诱导分化为毛细胞。Ito等将神经干细胞经蜗壁、园窗或卵园窗注入耳蜗发现神经干细胞迁移至柯替氏器毛细胞的表面，并具有内毛或外毛细胞的形态。
胚胎干细胞和神经干细胞在体内外诱导分化为内耳毛细胞的成功，为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供了坚实的基础。但是，胚胎干细胞和神经干细胞取材困难，受到医学伦理学和法律的制约，很难在临床推广应用。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)是骨髓中除了造血干细胞以外的另一类成体干细胞，这类细胞具有高度自我更新和多向分化的潜能。在不同条件下骨髓间充质干细胞可以定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、心肌细胞、肝细胞。MSC是自体组织，来源广泛，分离培养容易，免疫源性弱，是用于体内相关疾病的细胞替代治疗的理想靶细胞。
2000年Li等将MSC直接注入大脑中动脉闭塞的大鼠纹状体内，28d后观察到MSC不仅在脑内成活，而且向缺血区迁移，部分细胞表达神经细胞的特异性蛋白。2001年Lu等将MSC从静脉植入大鼠脑外伤模型内，发现MSC植入能够使脑外伤后的各种神经功能障碍得到改善。2000年Brazelton和Mezey以不同的方式证实，外源性的MSC注入小鼠脑内可以转化为神经元。2003年张杰等对Wistar大鼠骨髓间充质干细胞视网膜下移植的研究发现，MSC能够在视网膜下存活，并能与原视网膜结构相融合。可以认为MSC是神经移植的理想供体。尤其是骨髓间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞、神经元和神经胶质细胞的实验引起了我们的兴趣。Kopen等首先报道小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后，MSCs迁徙经过前脑、小脑，在纹状体、海马中分化为成熟的神经胶质细胞，在脑干的网状结构中分化为神经元。Woodbury等以β2巯基乙醇、二甲基亚砜和叔丁基羟基茴香醚诱导骨髓MSCs，结果约50％～80％分化为神经元。骨髓间充质干细胞能诱导分化为神经细胞，而神经干细胞又能在一定条件下分化为毛细胞，那么骨髓间充质细胞向内耳毛细胞的诱导分化就很值得研究。
但目前仍需解决以下问题：(1)再生的骨髓MSC是否有成熟细胞的功能；(2)再生的骨髓MSC是否有效地与周围组织细胞结构相融合并加入到神经环路中；(3)如何提高骨髓MSC在体内的成活率和诱导定向分化能力；(4)骨髓MSC移植的安全性等。通过国内外文献检索，尚未有关于骨髓间充质干细胞移植在耳蜗损伤中应用的相关研究报道。目前尚未见体外培养骨髓MSC定向诱导分化为耳蜗感觉上皮细胞的报道，其关键是要找到合适的诱导因子。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法，所述方法是将分离提纯的骨髓间充质干细胞经传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞转入诱导分化培养基，诱导培养7～20天，获得内耳毛细胞前体；所述的诱导分化培养基为添加有生长因子的基础培养基，所述生长因子主要包括表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基。
所述生长因子也可为表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子、全反式维甲酸的组合，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基，BDNF 10～30ng/mL基础培养基，ZTRA 0.5～2×10-8mol/L基础培养基。
骨髓间充质干细胞来源广泛，取材方便，不受医学伦理学和法律的制约；且骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞成熟和增殖，移植后具有逃避免疫排斥反应的特点。因此若骨髓间充质干细胞能被诱导分化内耳毛细胞，将很好的解决干细胞移植治疗感音神经性耳聋的细胞来源问题。
本发明采用贴壁法提取骨髓间充质干细胞，体外培养纯化后，选取表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、脑源性神经营养因子(BDNF)和全反式维甲酸(ATRA)，组合成不同的诱导条件，加入骨髓间充质干细胞基础培养液中，诱导骨髓间充质干细胞分化。在诱导过程中，观察细胞形态变化，并用免疫细胞化学方法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异抗原：myosinVI、pax-2、nestin、P27是否在诱导后的细胞表达，从而鉴定骨髓间充质干细胞能否被诱导分化为内耳毛细胞，试图为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供实验基础，并有较高先进性和重要临床意义。经筛选，EGF+IGF-1的组合，或者EGF+IGF-1+BDNF+ZTRA的组合，被认为是骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体的最佳诱导分化条件。
所述诱导培养所用培养基为本领域常用于骨髓间充质干细胞诱导培养的基础培养基，本发明中，所述基础培养基为含2％胎牛血清和1％N2辅剂的低糖DMEM液。所述基础培养基具体配制方法为：每100mL低糖DMEM液，加入2g胎牛血清和1gN2辅剂。
本发明将所述骨髓间充质干细胞培养传代至第4代后，再添加生长因子进行诱导培养。实验发现，P6期后，部分细胞失去典型的长梭形细胞样，变宽大，呈三角形，多边形，增殖速度开始变缓，传代间隔时间变长。2004年，Oswald等同样发现骨髓间充质干细胞在P6代后细胞逐渐变宽大，实验证实了这一结果。在传代过程中，干细胞可能在进行自发的分化，传代次数越多，越失去干细胞性。国外报道骨髓间充质干细胞可传代至30代以上，但此时干细胞特性值得怀疑。干细胞特性的维持可能与营养条件密切相关，同时需注意避免培养过程中理化因素对骨髓间充质干细胞的损害，如传代过程中，需注意控制胰酶消化时间，及注意吹打细胞时的轻柔。本发明只挑选P4代细胞作为处理细胞，因为此代细胞，干细胞特性维持良好，且已基本纯化。
所述传代培养所用培养基为本领域常用于骨髓间充质干细胞传代培养的培养基，本发明中所述传代培养在MSC培养液中进行，所述MSC培养液为低糖DMEM液与胎牛血清液体积比250∶44.117的混合溶液。
优选的，所述生长因子为表皮生长因子和胰岛素样生长因子-1的组合，添加量为：EGF 20ng/mL培养基，IGF-150 ng/mL培养基。
优选的，所述生长因子为表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子、全反式维甲酸的组合，添加量为：EGF 20ng/mL基础培养基，IGF-150ng/mL基础培养基，BDNF 20ng/mL基础培养基，ZTRA1×10-8mol/L基础培养基。
具体的，所述方法按如下步骤进行：(1)将分离提纯的大鼠骨髓间充质干细胞在在MSC培养基中传代培养，使骨髓间充质干细胞传代，获得稳定的传代的骨髓间充质干细胞；(2)经消毒处理的盖玻片经多聚赖氨酸包被后作为用于细胞爬片的备用盖玻片；(3)待步骤(1)的骨髓间充质干细胞传代传至第3代时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，离心后用MSC培养液重悬，得到细胞悬液，调整细胞悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为1×105～2×105/ml，将细胞悬液滴加于所述备用盖玻片上，覆盖上表面，盖玻片周边滴加基础培养基覆盖，在37℃、5％CO2条件下培养，细胞即在盖破片中生长，为第4代细胞；(4)待细胞生长覆备用盖玻片表面50％～60％时，倾去MSC培养液，加入诱导分化培养基，在37℃、5％CO2条件下培养，培养7～20天，获得内耳毛细胞前体。
骨髓间充质干细胞的分离提取对于本领域技术人员来说属于公知技术，可采用本领域常用方法进行。本发明中分离提纯骨髓间充质干细胞采用贴壁法。本发明仅以大鼠骨髓间充质干细胞进行实验，但保护范围并不仅限于此，实际应用中，可利用其他哺乳动物提取骨髓间充质干细胞，也可利用从人体抽出的骨髓，通过分离纯化得到人骨髓间充质干细胞，再按照本发明方法进行诱导分化获得内耳毛细胞前体，再进行自体移植，可完全消除免疫排斥。本发明中大鼠骨髓间充质干细胞分离提纯方法如下：取4～5周龄SD大鼠，脱颈处死，消毒后取出股骨，将股骨剪开，用低糖DMEM液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心，取沉淀，用15％干细胞培养液重悬，37℃、5％CO2条件下于培养瓶中培养10～16h，倾去未贴壁细胞，加入0.01M PBS，轻轻吹打去除贴壁不牢固细胞，再用0.01M PBS洗涤后，加入15％干细胞培养液，37℃、5％CO2条件下培养获得纯化的骨髓间充质干细胞。
所述15％干细胞培养液为低糖DMEM液与胎牛血清液体积比250∶44.117的混合溶液。
1968年，Friedenstein最早采用贴壁法分离提纯骨髓间充质干细胞，而Majumdar采用密度梯度离心法分离提纯骨髓间充质干细胞。据文献报道，贴壁法细胞纯度欠高，而密度梯度离心法细胞生长速度较差。实验发现贴壁法只要掌握培养技巧也能获得纯度很高的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞原代培养细胞刚接种时，细胞成圆形，24小时之内逐渐贴壁，胞质延伸，呈梭形样，生长迅速，经过有丝分裂形成各个克隆集落，成集落样生长，且贴壁较牢。根据骨髓间充质干细胞这些生长特性，认为首次换液时未贴壁细胞和贴壁不牢固细胞的去除，和首次传代时非克隆集落生长的细胞的去除对纯化骨髓间充质干细胞很重要。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法，为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供了坚实的基础，具有重大临床意义。
(四)附图说明
图1为骨髓间充质干细胞分离提纯和体外培养，相差显微镜下形态(10×10)；
图2为EGF+IGF-1诱导第7天和第12天，相差显微镜下形态(10×10)；
图3为未诱导组第7天和第12天，相差显微镜下形态(10×10)；
图4为EGF+IGF-1诱导组免疫细胞化学染色结果(细胞甩片10×10)；
图5为EGF+IGF-1+BDNF+ATRA诱导组免疫细胞化学染色结果(细胞爬片10×10)；
图6为未诱导组免疫细胞化学染色结果(细胞甩片10×10)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物：SD大鼠，4～5周龄，体重80～120g，购自浙江大学实验动物中心。
1.1.2实验试剂
1.1.2.1一般试剂
25cm2培养瓶 Orange scientific公司 比利时
6孔培养板 Becton Dickinson公司 美国
PBS液 吉诺生物医药技术有限公司 中国
0.25％胰蛋白酶 GIBCO公司 美国
多聚赖氨酸溶液 SIGMA公司 美国
优级胎牛血清FBS 杭州四季青生物工程有限公司 中国
低糖DMEM液 GIBCO公司 美国
N2辅剂 GIBCO/invitrogen公司 美国
2.1.2.2细胞诱导试剂
ATRA SIGMA公司 美国
EGF CYTOLAB/PEPROTECH公司 美国
bFGF CYTOLAB/PEPROTECH公司 美国
IGF-1 CYTOLAB/PEPROTECH公司 美国
BDNF CYTOLAB/PEPROTECH公司 美国
2.1.2.3免疫组化试剂
(1)一抗
Myosin VI SIGMA公司 美国
Pax-2 Zymed Laboratories公司 美国
Nestin BD Biosciences公司 美国
P27kip1 NEOMARKERS公司 美国
(2)二抗
辣根过氧化物酶酶联IgG 福州迈新生物技术公司 中国
(3)显色试剂
DAB显色试剂盒 福州迈新生物技术公司 中国
1.1.3常用试剂配制
1.1.3.1细胞因子的分装、贮存
(1)bFGF的分装、贮存：
bFGF试剂为粉剂，净重量10ug，使用溶度为10ng/ml，贮存浓度0.01ug/ul。
(2)EGF的分装、贮存：
EGF试剂为粉剂，净重量100ug，使用溶度为50ng/ml，贮存浓度0.02ug/ul。
(3)IGF-1的分装、贮存：
IGF-1试剂为粉剂，净重量20ug，使用溶度为50ng/ml，贮存浓度0.05ug/ul。
(4)BDNF和NT-3的分装、贮存：
BDNF试剂为粉剂，净重量2ug，使用溶度为20ng/ml，贮存浓度0.02ug/ul。
(5)以上生长因子，冻存于-20℃冰箱。
1.1.3.2 ATRA的分装、贮存
ATRA试剂为粉剂，净重量50mg，分子量300.4，使用溶度1×10-8M，贮存
浓度0.01M，锡纸包裹eppendorf管避光，冻存于-20℃冰箱。
1.1.3.3 MSC培养液的配制
低糖DMEM液250ml+44.117ml胎牛血清，配成含15％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM液，即MSC培养液
1.1.3.4诱导培养液的配制
首先配置含2％FBS和1％N2辅剂的低糖DMEM液，作为基础培养液，然后
根据培养条件，在诱导时加入细胞因子。
1.1.3.5 DAB底物配制
在1.5ml eppendorf管中先加入0.85ml蒸馏水，再依次加入DAB显色试剂盒中的试剂A、B、C各50μl，混匀即成1ml的DAB显色液。
1.1.4主要设备
1.Heraeus细胞培养箱 Heraeus公司 德国
2.OLMPUS倒置相差显微镜 OLMPUS公司 日本
3.802离心机 上海手术器械厂 中国
4.Heraeus Biofuge离心机 Heraeus公司 德国
5.Heraeus cabfuge 300离心机 Heraeus公司 德国
6.Eppendorf Centrifuge 5403离心机 Becton Dickinson公司 美国
7.79-1磁力加热搅拌器 常州国华电器有限公司 中国
8.超净工作台 Heraeus公司 德国
9.DK-8D型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司中国
11.计算机成像系统 Zeiss公司 德国
14.水平离心器 Heraeus公司 德国
2.实验方法
2.1骨髓间充质干细胞的分离和提纯
取4-5周龄SD大鼠(每次实验1-2只，共用20只)，脱颈处死。75％的酒精浸泡5分钟，放置在超净台内的泡沫平板上，用大头针固定四肢，剪开皮肤，分离肌肉，取出股骨，刮净骨膜及残留肌肉。将股骨正中剪开，再用一毫升针筒用低糖DMEM液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液，1000rpm，5分钟离心去除上清，再用MSC培养液5ml重悬，接种于25cm2培养瓶中，放入细胞培养箱培养(37℃、5％CO2)。12小时后，倾去未贴壁细胞，并加入0.01M PBS 3ml轻轻吹打，去除贴壁不牢固细胞，0.01MPBS 3ml洗涤一遍，再加入MSC培养液5ml，放入细胞培养箱中培养。隔日换液，待细胞铺满瓶底约70～80％时传代。传代过程：倾去培养液，加入5mlPBS，轻轻摇晃清洗瓶底，倾去洗涤液，加入在预热的0.25％胰蛋白酶1.5ml，覆盖瓶底；显微镜下观察细胞形态变化，待大多数细胞变圆，而未脱离瓶底悬浮时，加入细胞培养液3ml，中和胰酶，轻轻吹打瓶底，悬浮细胞，将细胞悬液转移至15ml试管中，1000rpm，5分钟，离心去除消化液，加入5mlMSC培养液，吹打均匀后，重新接种于25cm2培养瓶中，放入细胞培养箱中继续培养。传至第4代时，开始细胞诱导。(一般按1∶2、1∶3传代，细胞密度为8×104-2×105个/ml，按培养瓶底面积计算为：8×103-2× 104/CM2)。
2.2骨髓间充质干细胞的诱导
2.2.1细胞诱导条件
(1)诱导组：基础培养基+条件诱导剂
a.基础培养基 含2％FBS和1％N2的低糖DMEM液
b.条件诱导剂分组 EGF+IGF-1
EGF+bFGF
EGF+bFGF+IGF-1
EGF+bFGF+BDNF+ATRA
EGF+bFGF+IGF-1+BDNF
EGF+IGF-1+BDNF+ATRA
c.生长因子添加量： EGF 20ng/ml；IGF-150ng/ml基础培养基；
bFGF 10ng/ml基础培养基；BDNF20ng/ml
基础培养基；ATRA 1×10-8M基础培养基
(2)对照组(未诱导组)：
基础培养基(含2％FBS和1％N2的低糖DMEM液)
2.2.2.细胞诱导步骤
(1)盖破片处理：盖玻片放置在玻璃平皿中泡酸24小时，自来水冲洗，完全洗净酸液，蒸溜水漂洗，泡酒精2小时，自来水冲洗，蒸馏水漂洗，高压消毒备用。
(2)多聚赖氨酸配制、包被盖玻片：
a.灭菌的双蒸水1∶10稀释多聚赖氨酸溶液；
b.将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，降温至18-26℃；
c.将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟；
d.取出后，在60℃烘箱1小时干燥，或室温18～26℃过夜干燥待用。
(3)将多聚赖氨酸包被的盖玻片放置于六孔板，置超净台紫外线消毒过夜备用。
(4)细胞爬片：待细胞传代至第3代时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，离心后用MSC培养液重悬，细胞计数板计数，调整细胞浓度为1×105～2×105/ml，滴加细胞悬液于六孔板内的盖玻片上，覆盖上表面。盖玻片周边滴加基础培养基覆盖，小心移入培养箱内培养。细胞即在盖破片中生长，为第4代细胞。
(5)细胞诱导：分别在6孔培养板和25cm2培养瓶内诱导细胞。待细胞覆盖盖玻片表面50％～60％时，开始诱导，倾去MSC普通培养液，加入2ml(6孔培养板)和5ml(25cm2培养瓶)基础培养基：含2％胎牛血清和1％N2辅剂的低糖DMEM液，再根据条件诱导剂分组，依次加入生长因子，移入培养箱内培养，隔天更换诱导液。
2.2.3细胞形态观察
每天在相差显微镜下观察细胞形态动态变化，共15～20天，用数码相机拍照记录细胞形态，图片转至电脑整理、保存。由于第7天～第1 5天时细胞具有明显特征和代表性，所以，选取第7天和14天细胞来进行免疫细胞化学染色。
2.2.4免疫细胞化学染色检测细胞抗原
2.2.4.1免疫细胞化学分组
诱导组：在各种诱导条件下诱导第12天的骨髓间充质干细胞。
未诱导组：在基础培养基下培养第12天的骨髓间充质干细胞。
2.2.4.2免疫细胞化学染色步骤
实验采用免疫细胞化学染色二步法。
(1)标本制备：采用了细胞甩片和细胞爬片两种方法：a.细胞甩片：
用0.25％胰蛋白酶消化25cm2培养瓶贴壁细胞，离心后用PBS液重悬，调整细胞密度为2×105-2×106/ml。吸取100μl细胞悬液加入涂片机内，1000rpm离心4分钟，细胞均匀的涂在载玻片上。
b.细胞爬片(见诱导过程)。标本制备好后，用0.01M PBS振洗，2分钟×3次。
(2)细胞固定：每张甩片或爬片细胞滴加4％的多聚甲醛100μl，在室温下放置15分钟，用0.01M PBS振洗，5分钟×3次(湿盒内)。
(3)透膜：滴加0.3％triton x-10050μl(甩片)或100μl(爬片)，室温孵育10分钟，用0.01M PBS振洗，2分钟×3次(湿盒内)。
(4)非特异性抗原封闭：滴加10％的山羊血清50μl(甩片)或100μl(爬片)，室温孵育30分钟后(湿盒内)，甩去血清。
(5)一抗：滴加一抗50μl(甩片)或100μl(爬片)。一抗浓度：MyosinVI 1∶100；Pax-2 1∶100；Nestin 1∶150；P27kip1 1∶100。室温下孵育2小时(湿盒内)，用0.01M PBS振洗，5分钟×3次(湿盒内)。
(6)二抗：滴加辣根过氧化酶标记的二抗50μl(甩片)或100μl(爬片)，室温下孵育30分钟，5分钟×3次(湿盒内)。
(8)显色：滴加新鲜配制的DAB底物溶液100μl(甩片)或200μl(爬片)，置光镜下观察，5分钟后，浸入自来水中止反应，用自来水冲洗5分钟×3次。
(9)复染：浸苏木素染液10分钟，细胞核衬染，用自来水冲洗，5分钟×3次。迅速过盐酸酒精溶液去分化，用自来水冲洗，5分钟×3次。60℃自来水1分钟返蓝
(10)脱水：70％酒精3分钟，95％酒精3分钟，无水酒精3分钟。
(11)封片：用吹风机吹干玻片，中性树脂封片，标记后，放入玻片盒保存。
2.2.5免疫细胞化学玻片观察
在光镜下观察免疫组化玻片，并拍照记录，图片存入电脑。
2.2.6对照设置
阴性对照：选择空白对照方法，以PBS代替一抗作为阴性。
2.2.7免疫细胞化学染色结果判断标准
判定标准参照Fromowitz半定量分级法：
1)根据染色深浅计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，
棕褐色为3分；
2)100倍光镜下，计数10个不重复区视野，染色棕黄色细胞占总细胞的比例，＜5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。
3)两项结果相加：＜2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。
3.实验结果
3.1骨髓间充质干细胞生长特性
原代培养细胞刚接种时，细胞成圆形，半小时至24小时逐渐贴壁，胞质延伸，呈梭形样，轮廓清晰，细胞核大，可见较多核分裂相，经过有丝分裂形成各个克隆集落，成集落样生长。增殖迅速，一般7～10天就可长满一瓶(图1A为原代细胞，接种后第5天，已形成克隆集落，以长梭形细胞为主，但排列不整齐，形态不均一，有较多杂质细胞)。
传代后细胞，细胞排列变整齐，以栅栏状为主，少量集落排列成漩涡状。第一代到第五代(P1～P5)细胞形态仍成典型的长梭形，轮廓清晰，生长迅速，一般4天细胞即可扩增两至三倍，数量级可达到106，需要再次传代(图1B为第四代细胞，细胞呈典型的长梭形，形态均一，轮廓清晰，排列整齐，杂细胞少)；P6后，部分细胞失去典型的长梭形细胞样，变宽大，呈三角形，多边形，增殖速度开始变缓，传代间隔时间变长。
骨髓间充质干细胞表面缺乏绝对特异性抗原，因此没有通过检测细胞抗原的方法来鉴定细胞，而是根据细胞形态(长梭形)、生长方式(贴壁生长)和可分化性来鉴定。造血干细胞悬浮生长，呈圆形。
各组生长因子诱导第7天和第12天细胞形态如下：
EGF+IGF-1诱导组(见图2)：
A为诱导第7天，细胞仍呈梭形；B为诱导第12天，多数细胞胞质回缩呈短梭形、长方形样，少数细胞变细长，但未形成突触，未出现网络状、大环状结构。
EGF-1+bFGF诱导组：
诱导第7天，细胞已形成网络状、大环状结构。诱导第12天，形成网络状、大环状结构的细胞增多。在同一瓶细胞内，细胞密集区：细胞两端回缩，呈圆形或伸出2-6个短小的突触，与邻近胞体或突触相接，成网状。细胞不密集区：细胞两端伸长，呈细长形，有长突触，与相距较远胞体或突触相接，部分经多个细胞传递，形成大环形。
EGF+bFGF+IGF-1诱导组：
诱导第7天，部分细胞变圆，但伸出突触的少，部分细胞呈细长形，有突触，相连；B为诱导第12天，部分细胞仍呈圆形，如铺路石样，部分细胞呈细长形伸出突触但形成网状的少。
EGF+bFGF+IGF-1+BDNF诱导组：
诱导第7天，部分细胞呈细长形，两端形成突触。部分细胞两端回缩，呈圆形或长方形样；诱导第12天，细长和圆形细胞增多，圆形细胞开始伸出突触。
EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组：
大多数细胞形态呈短梭形样、长方形样，少数细长形，三角形，但未形成突触，未出现网络状、大环状结构。
未诱导组(见图3)：
A为培养第7天，B为培养第12天，大部分细胞呈梭形，边界模糊、丝絮状，轮廓不清，培养液中细胞碎片增多。
3.2各分化组细胞免疫细胞化学染色结果(见表1)
3.2.1 Myosin VI阳性或弱阳性的细胞组有EGF+IGF-1、EGF+IGF-1+BDNF+ATRA。
3.2.2 Pax-2 阳性或弱阳性的细胞组有 EGF+IGF-1、EGF+bFGF+BDNF+ATRA、EGF+IGF-1+BDNF+ATRA。
3.2.3全部细胞组Nestin、P27kip1都阳性。
各细胞组免疫细胞化学染色结果：
EGF+IGF-1组(见图4)；
Myosin VI(图4A)弱阳性，染色部位位于胞膜和胞浆；Pax-2(图4B)中度阳性，染色部位主要位于核膜，部分位于胞浆；Nestin(图4C)中度阳性，染色部位位于胞浆；D：P27kip1(图4D)弱阳性，染色部位主要位于胞浆，部分于胞核，全部细胞均有染色。
EGF+bFGF组：
Myosin VI、Pax-2阴性，细胞各部位未见染色；Nestin中度阳性，染色部位位于胞浆；P27kip1弱阳性，染色部位主要位于胞浆，部分于胞核，全部细胞均有染色。
EGF+bFGF+IGF-1组：
Myosin VI阴性，浅黄色为非特异性染色；Pax-2阴性，细胞各部位未见染色； Nestin中度阳性，染色部位位于胞浆；P27kip1弱阳性，染色部位主要位于胞浆，部分于胞核，全部细胞均有染色。
EGF+bFGF+BDNF+ATRA组：
Myosin VI阴性、细胞各部位未见染色；Pax-2弱阳性，染色部位主要位于核膜；部分位于胞浆；Nestin弱阳性，染色部位位于胞浆；P27kip1弱阳性，染色部位主要位于胞浆，部分于胞核，全部细胞均有染色。
EGF+bFGF+IGF-1+BDNF组：
Myosin VI阴性、Pax-2阴性，细胞各部位未见染色；Nestin中度阳性，染色部位位于胞浆，有突触的，如神经细胞样的细胞染色深，其他渐变的细胞染色浅或无染色；P27kip1中度阳性，染色部位主要位于胞浆，部分于胞核，全部细胞均有染色。
EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组(见图5)；
Myosin VI(图5A)中度阳性，染色部位位于胞膜和胞浆；Pax-2(图5B)中度阳性，染色部位主要位于核膜；部分位于胞浆；Nestin(图5C)、P27kip1(图5D)均为弱阳性，图片未显示。细胞形态呈短梭形样、长方形样，未形成突触，未出现网络状、大环状结构。
未诱导组(见图6)；Myosin VI(图6A) 阴性、Pax-2(图6B)阴性，细胞各部位未见染色；Nestin(图6C)弱阳性，染色部位位于胞浆，阳性细胞数量少；P27kip1(图6D)弱阳性，染色部位主要位于胞浆，部分于胞核，全部细胞均有染色。
表1：诱导组和未诱导组细胞免疫细胞化学染色结果
| 组别 | Myosin VI | Pax-2 | Nestin | P27kip1 |
| EGF+IGF-1EGF+bFGFEGF+bFGF+IGF-1EGF+bFGF+BDNF+ATRAEGF+bFGF+IGF-1+BDNFEGF+IGF-1+BDNF+ATRA未诱导组 | +----++- | ++--+-++- | +++++++++++ | ++++++++ |
注：Myosin VI是成熟毛细胞标志。Pax-2是内耳感觉前体细胞标志，在内耳发育中表达Pax-2的细胞将发育为支持细胞或毛细胞。Nestin是神经前体细胞标志，表达Nestin的细胞，具有分化为成熟神经细胞的能力；并且还可以分化为内耳毛细胞。P27kip1是内耳感觉前体细胞和支持细胞标志。
3.4 EGF+IGF-1组、EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组可诱导骨髓间充质干细胞分化为耳蜗毛细胞前体细胞
EGF+IGF-1组、EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组，细胞形态呈短梭形样、长方形样，少数细胞变细长，未形成突触，未出现网络状、大环状结构。MyosinVI、Pax-2、Nestin都有不同程度的阳性表达，其中
EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组，Myosin VI、Pax-2表达中度阳性。
EGF+IGF-1组、EGF+IGF-1+BDNF+ATRA组生长因子，被认为是骨髓间充质干细胞分化为耳蜗毛细胞前体细胞最好诱导分化条件。
3.5细胞的密度对骨髓间充质干细胞分化的影响
在同一个培养瓶内，在细胞密集区，细胞两端回缩，呈圆形或伸出2-6个短小的突触，与邻近胞体或突触形成相接，成网状。在细胞不密集区，细胞两端伸长，呈细长形，逐渐形成长突触，与相距较远胞体或突触相接，部分经多个细胞传递，形成大环形。
3.6未诱导组骨髓间充质干细胞的特征
未诱导组细胞(图6)，nestin表达弱阳性，P27kip1表达弱阳性，MyosinVI和Pax-2表达阴性。未诱导组骨髓间充质细胞仍呈梭形，且边界模糊、丝絮状，轮廓不清，部分细胞出现核碎裂，培养液中细胞碎片增多，细胞形态未出现如诱导组的变化(图3)。
Claims (10)
1.一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法，所述方法是将分离提纯的骨髓间充质干细胞经传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞转入诱导分化培养基，诱导培养7～20天，获得内耳毛细胞前体；所述的诱导分化培养基为添加有生长因子的基础培养基，所述生长因子主要包括表皮生长因子和胰岛素样生长因子-1，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子、全反式维甲酸的组合，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基，BDNF 10～30ng/mL基础培养基，ZTRA0.5～2×10-8mol/L基础培养基。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法按如下步骤进行：(1)将分离提纯的骨髓间充质干细胞在在MSC培养基中传代培养，使骨髓间充质干细胞传代，获得稳定的传代的骨髓间充质干细胞；(2)经消毒处理的盖玻片经多聚赖氨酸包被后作为用于细胞爬片的备用盖玻片；(3)待步骤(1)的骨髓间充质干细胞传代传至第3代时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，离心后用MSC培养液重悬，得到细胞悬液，调整细胞悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为1×105～2×105/ml，将细胞悬液滴加于所述备用盖玻片上，覆盖上表面，盖玻片周边滴加基础培养基覆盖，在37℃、5％CO2条件下培养，细胞即在盖破片中生长，为第4代细胞；(4)待细胞生长覆备用盖玻片表面50％～60％时，倾去MSC培养液，加入诱导分化培养基，在37℃、5％CO2条件下培养，培养7～20天，获得内耳毛细胞前体。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基础培养基为含2％胎牛血清和1％N2辅剂的低糖DMEM液。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将所述骨髓间充质干细胞培养传代至第4代后，再添加生长因子进行诱导培养。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述传代培养在低糖DMEM液与胎牛血清液体积比250∶44.117的混合溶液中进行。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子和胰岛素样生长因子-1的组合，添加量为：EGF 20ng/mL基础培养基，IGF-150ng/mL基础培养基。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长因子为表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子、全反式维甲酸的组合，添加量为：EGF 20ng/mL基础培养基，IGF-150ng/mL基础培养基，BDNF 20ng/mL基础培养基，ZTRA 1×10-8mol/L基础培养基。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述骨髓间充质干细胞分离提纯方法如下：取4～5周龄SD大鼠，脱颈处死，消毒后取出股骨，将股骨剪开，用低糖DMEM液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心，取沉淀，用15％干细胞培养液重悬，37℃、5％CO2条件下于培养瓶中培养10～16h，倾去未贴壁细胞，加入0.01MPBS去除贴壁不牢固细胞，再用0.01M PBS洗涤后，加入15％干细胞培养液，37℃、5％CO2条件下培养获得纯化的骨髓间充质干细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述15％干细胞培养液为低糖DMEM液与胎牛血清液体积比250∶44.117的混合液。
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