CN115094021B - 来源于母乳的细胞或细胞组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及的是来源于母乳的细胞或细胞组合物及其制备方法。该细胞或细胞组合物表达间充质干细胞阳性标志物CD105、CD73、CD29、CD166、CD44、CD90和间充质干细胞阴性标志物HLA‑DR、CD45、CD79a，部分表达多能干细胞标记物SOX2和Nanog，及淋巴细胞功能相关分子CD11a/CD18；不表达造血干细胞标志物CD34和骨髓间充质干细胞标志物STRO‑1，也不表达其余多能干细胞标记物OCT4、SSEA4和TRA‑1‑60。并且该细胞组合物强表达细胞CK14、Vimentin和Nestin，弱表达神经祖细胞标志物A2B5。采用该细胞或细胞组合物用于移植，有望修复早产儿脑白质损伤，保持脑白质损伤的脑部神经纤维的有序排列，促进胼胝体区神经轴突再髓鞘化，以及学习和记忆能力的恢复。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及的是来源于母乳的细胞或细胞组合物及其制备方法。
背景技术
随着辅助生殖和新生儿生命支持技术的发展，早产儿出生率和存活率显著提高。早产儿脑白质损伤成为导致小儿神经系统后遗症，如脑瘫、视听功能异常、认知障碍的主要病因之一，其临床表现类型也在不断变化，至今尚无有效药物或疗法。脑白质损伤患儿自幼终生残疾，给家庭乃至社会带来沉重负担。为此，2012年世界卫生组织将其指定为全球严重公共卫生问题。我国每年约有120万～150万早产儿出生，基中胎龄<32周的早产儿和(或)极低出生体重婴儿占16％，即每年约30万例，这些早产儿为脑白质损伤的高危人群，脑白质损伤防治问题依然严峻。
细胞移植治疗为新生儿脑损伤的治疗带来希望，研究表明干细胞移植治疗对脑白质损伤具有替代、保护、修复等作用，现有的细胞移植还存在着致瘤、免疫排斥等安全问题，我们需要寻找到更安全的具有神经疾病治疗倾向的细胞。
理想的治疗新生儿脑损伤的细胞不仅应该具有替代受损细胞重建蛋白质结构和功能，还能抑制神经元的凋亡和坏死，促进内源性神经干细胞的增殖、胼胝体区神经轴突再髓鞘化以及血脑屏障的修复等。人母乳细胞是近年来报道的一种新的细胞来源，在再生医学领域具有良好的研究潜力。有研究报道称母乳是间充质干细胞的丰富来源，并对获得的母乳细胞进行了表面标记物和三系分化性能的检测(Patki,S.,et al.2010)。还有研究表明母乳中部分细胞呈干细胞样，并且具有多能干细胞特性，在培养后可表达胚胎源性干细胞标记物，经分化后可形成各胚层的细胞类型，如神经元、肺、肌肉、骨等(Hassiotou,F.,etal.2012；Hosseini,S.M.,et al.2014)。
为了获得具有神经疾病治疗倾向的来源于母乳的细胞组合物，本实验培养基拟从神经培养基方向入手，选择NeuroCult NS A basal medium作为基础培养基，搭配NeuroCult SM1和N2 supplement A两种添加剂，并加入重组Human basic fibroblastgrowth factor和重组Human epithelial growth factor。因母乳获得环境复杂，为防止污染，加入2×抗真菌和细菌的Antibiotic-Antimycotic。并将常规培养基类型(对照培养基1)和文献报道的培养基(对照培养基2和3)进行平行对比培养。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种来源于母乳的细胞或细胞组合物，该细胞或细胞组合物具有神经疾病治疗倾向，可用于修复脑白质损伤。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种来源于母乳的细胞或细胞组合物，所述细胞或细胞组合物通过流式细胞术检测表达间充质干细胞阳性标志物CD105、CD73、CD29、CD166、CD44、CD90和间充质干细胞阴性标志物HLA-DR、CD45、CD79a，部分表达多能干细胞标记物SOX2和Nanog，及淋巴细胞功能相关分子CD11a/CD18；不表达造血干细胞标志物CD34和骨髓间充质干细胞标志物STRO-1，也不表达其余多能干细胞标记物OCT4、SSEA4和TRA-1-60。
进一步，所述细胞或细胞组合物表达细胞CK14、Vimentin和Nestin；所述细胞CK14为上皮细胞标志物，所述Vimentin为间充质干细胞标志物，所述Nestin为神经祖细胞或其它细胞系祖细胞标志物。
进一步，所述细胞或细胞组合物可以获得细胞克隆；所述细胞或细胞组合物汇合度可达到60～90％。
进一步，所述母乳为产妇分娩后1-5天内分泌的初乳。
本发明的目的之二在于提供一种细胞或细胞组合物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种细胞或细胞组合物的制备方法，具体步骤包括：
(1)将所述母乳进行预处理，得所述母乳的下层沉淀；
(2)采用细胞培养基重悬沉淀所述母乳的下层沉淀，并接种至细胞培养瓶中；
(3)待细胞达到适宜汇合度，采用胰酶或Tryp LE消化培养瓶中的细胞，细胞呈圆形后加入所述细胞培养基终止消化，得所述细胞或细胞组合物。
进一步，步骤(1)具体为：先利用生理盐水或PBS将母乳重悬，并在810g离心力、升降度为6的条件下4℃离心20分钟；离心后移除上层脂质及液体，再利用20ml生理盐水重悬沉淀后转移至新的离心管内，在710g离心力，升降度为6的条件下4℃离心5分钟；离心后移除上层脂质及液体，利用10ml培养基重悬沉淀后转移至新的离心管内，在500g离心力，升降度为6的条件下4℃离心5分钟。
进一步，步骤(3)具体为：当细胞汇合度达到60-90％，去除细胞培养瓶中的细胞培养基后先用生理盐水或PBS洗涤两次，再加入0.5ml 0.25％胰酶或Tryp LE消化细胞，显微镜下观察细胞呈圆形后加入5ml细胞培养基终止消化后吹打并收集细胞，将收集的细胞500g离心5分钟，去除上清，PBS缓冲液重悬沉淀，得所述细胞或细胞组合物。
进一步，细胞接种至细胞培养瓶后，前五天每隔一天更换一次培养基，五天后三天更换一次培养基。
进一步，所述细胞培养基由NeuroCult NS A basal medium、NeuroCult SM1、N2supplement A、Human basic fibroblast growth factor、Human epithelial growthfactor和Antibiotic-Antimycotic组成。
进一步，所述Antibiotic-Antimycotic由青霉素-链霉素和两性霉素B组成，所述Antibiotic-Antimycotic的工作浓度为2×。
进一步，所述NeuroCult NS A basal medium、NeuroCult SM1和N2 supplement按体积比90：2：1组成混合培养基，每465mL混合培养基中再加入10μg Human basicfibroblast growth factor和10μg Human epithelial growth factor，组成所述细胞培养基。
本发明的目的之三在于提供的是所述制备方法或所述细胞或细胞组合物在制备治疗脑白质损伤的细胞移植剂中的应用。
进一步，所述细胞或细胞组合物，能促进胼胝体区神经轴突再髓鞘化。
进一步，所述细胞或细胞组合物，能保持脑白质损伤造模后脑部神经纤维的有序排列。
进一步，所述细胞或细胞组合物，抑制神经元的凋亡和坏死。
进一步，所述细胞或细胞组合物，能促进脑白质损伤大鼠学习和记忆能力的恢复。
本发明的有益效果在于：
(1)本专利获得的来源于母乳的细胞组合物是一种未报道的细胞类型，与此前报道的从母乳中获得的间充质干细胞或胚胎干细胞的细胞流式检测差异明显，本专利的细胞组合物可以获得细胞克隆，且细胞汇合度可达60～90％。
(2)本专利获得的来源于母乳的细胞组合物可以保持脑白质损伤造模后脑部神经纤维的有序排列，抑制神经元的凋亡和坏死，促进胼胝体区神经轴突再髓鞘化以及学习和记忆能力的恢复。
(3)采用本专利发明的细胞培养基和培养方法培养出的细胞或细胞组合物表达间充质干细胞阳性标志物CD105(96.14％)、CD73(95.72％)、CD29(99.11％)、CD166(97.61％)、CD44(92.49％)和CD90(66.34％)，同时也表达间充质干细胞阴性标志物HLA-DR(92.90％)、CD45(61.53％)和CD79a(63.21％)，不表达造血干细胞标志物CD34(1.83％)和骨髓间充质干细胞标志物STRO-1(1.10％)，部分表达淋巴细胞功能相关分子CD11a/CD18(24.45％)。
(4)采用本专利发明的细胞培养基和培养方法培养出的细胞或细胞组合物部分细胞表达多能干细胞标记物SOX2(89.69％)和Nanog(19.25％)，不表达其余多能干细胞标记物OCT4(0.00％)、SSEA4(0.00％)和TRA-1-60(0.06％)。
(5)采用本专利发明的细胞培养基和培养方法培养出的细胞或细胞组合物强表达细胞CK14(上皮细胞标志物)、Vimentin(间充质干细胞标志物)和Nestin(神经祖细胞或其它细胞系祖细胞标志物)，弱表达神经祖细胞标志物A2B5。
附图说明
图1为实验培养基培养的细胞图；
图2为对照培养基1培养的细胞图；
图3为对照培养基2培养的细胞图；
图4为对照培养基3培养的细胞图；
图5～8为表面标记物流式检测结果，以下流式细胞图中横坐标均表示相对荧光强度，纵坐标均表示细胞数；
其中，图5-A为母乳细胞与PE荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图5-B为母乳细胞与PC5.5荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图5-C为母乳细胞与PC7荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图5-D为母乳细胞与FITC荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果；
图6-A为母乳细胞与PE荧光素偶联的CD105抗体结合情况的流式检测结果，图6-B为母乳细胞与PC5.5荧光素偶联的HLA-DR抗体结合情况的流式检测结果，图6-C为母乳细胞与PC7荧光素偶联的CD45抗体结合情况的流式检测结果，图6-D为母乳细胞与FITC荧光素偶联的CD90抗体结合情况的流式检测结果；
图7-A为母乳细胞与PE荧光素偶联的CD73抗体结合情况的流式检测结果，图7-B为母乳细胞与PE荧光素偶联的CD79a抗体结合情况的流式检测结果，图7-C为母乳细胞与FITC荧光素偶联的CD34抗体结合情况的流式检测结果，图7-D为母乳细胞与FITC荧光素偶联的CD44抗体结合情况的流式检测结果；
图8-A为母乳细胞与PE荧光素偶联的CD166抗体结合情况的流式检测结果，图8-B为母乳细胞与PE荧光素偶联的STRO-1抗体结合情况的流式检测结果，图8-C为母乳细胞与FITC荧光素偶联的CD29抗体结合情况的流式检测结果，图8-D为母乳细胞与FITC荧光素偶联的CD11a/CD18抗体结合情况的流式检测结果；
图9～10为ESC标记物流式检测结果，以下流式细胞图中横坐标均表示相对荧光强度，纵坐标均表示细胞数；
其中，图9-A为母乳细胞与FITC荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图9-B为母乳细胞与PE荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图9-C为母乳细胞与ECD荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图9-D为母乳细胞与PC5.5荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果，图9-E为母乳细胞与APC荧光素偶联的同型对照抗体结合情况的流式检测结果；
图10-A为母乳细胞与FITC荧光素偶联的SOX2抗体结合情况的流式检测结果，图10-B为母乳细胞与PE荧光素偶联的OCT4抗体结合情况的流式检测结果，图10-C为母乳细胞与ECD荧光素偶联的SSEA4抗体结合情况的流式检测结果，图10-D为母乳细胞与PC5.5荧光素偶联的TRA-1-60抗体结合情况的流式检测结果，图10-E为母乳细胞与APC荧光素偶联的Nanog抗体结合情况的流式检测结果；
图11为免疫荧光图；
图12为HE病理染色结果；
图13为假手术组、生理盐水治疗组和母乳细胞治疗组的脱潜伏期时间；(*表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；#表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.01。)
图14为假手术组、生理盐水治疗组和母乳细胞治疗组的游泳轨迹图；
图15为假手术组、生理盐水治疗组和母乳细胞治疗组的平台象限停留时间；(*表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；#表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；ns表示假手术组对比母乳细胞治疗组，p＞0.05。)
图16为假手术组、生理盐水治疗组和母乳细胞治疗组的平台穿越次数；(*表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；#表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；ns表示假手术组对比母乳细胞治疗组，p＞0.05。)
图17为假手术组的透射电镜实验结果；
图18为生理盐水治疗组的透射电镜实验结果；
图19为母乳细胞治疗组的透射电镜实验结果；
图20为假手术组、生理盐水治疗组和母乳细胞治疗组的轴突包裹的髓鞘数量(*表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示假手术组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；#表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.05，**表示母乳细胞治疗组对比生理盐水治疗组，p＜0.01；ns表示假手术组对比母乳细胞治疗组，p＞0.05)。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
对照培养基2和3为文献报道的培养基，对照培养基2参考文献Patki,S.,etal.2010.'Human breast milk is a rich source of multipotent mesenchymal stemcells',Hum Cell,23:35-40；对照培养基3参考文献Hosseini,S.M.,et al.2014.'Differentiation of human breast-milk stem cells to neural stem cells andneurons',Neurol Res Int,2014:807896。
实施例1.实验培养基
| 名称 | 厂商 | 含量 |
| NeuroCult NS A basal medium | STEMCELL | 450mL |
| NeuroCult SM1 | STEMCELL | 10mL |
| N2 supplement A | STEMCELL | 5mL |
| Human basic fibroblast growth factor | Novoprotein | 10μg |
| Human epithelial growth factor | Novoprotein | 10μg |
| Antibiotic-Antimycotic | Life technologies | 2× |
实施例2.对照培养基1
| 组分 | 厂商 | 含量 |
| DMEM/F12 | Life technologies | 450mL |
| FBS | Life technologies | 50mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Life technologies | 2× |
实施例3.对照培养基2
实施例4.对照培养基3
| 组分 | 厂商 | 含量 |
| DMEM/F12 | Life technologies | 450mL |
| KOSR | Life technologies | 50mL |
| 非必须氨基酸溶液 | Life technologies | 5mL |
| Human basic fibroblast growth factor | Novoprotein | 5μg |
| Antibiotic-Antimycotic | Life technologies | 2× |
实施例5.来源于母乳的细胞或细胞组合物培养
1)产妇签署知情同意书，清洁产妇乳房，利用吸奶泵获取5-15ml产妇初乳(新生儿出生后1-5天内的母乳)至预先添加了1ml Antibiotic-Antimycotic溶液【含青霉素(10000单位/ml)-链霉素(10000μg/ml)和两性霉素B(25μg/ml)】的保存管中；
2)将母乳2-8℃运输至实验室；
3)将母乳转移至50ml离心管内，利用生理盐水(或PBS)将母乳重悬至30ml；
4)将重悬后的母乳在810g离心力，升降度为6的条件下4℃离心20分钟；
5)离心后移除上层脂质及液体，利用20ml生理盐水重悬沉淀后转移至新的离心管内，在710g离心力，升降度为6的条件下4℃离心5分钟；
6)离心后移除上层脂质及液体，利用10ml培养基重悬沉淀后转移至新的离心管内，在500g离心力，升降度为6的条件下4℃离心5分钟；
7)离心后移除上层液体，利用1ml培养基重悬沉淀并计数，按0.5～1×106/cm2密度接种至T25瓶内，补足培养基至3～5ml；
8)前五天每隔一天换液一次，五天后三天换液一次；
9)待细胞汇合度达到60-90％，T25培养基去除培养基后用生理盐水(或PBS)洗涤两次，每次5ml；
10)加入0.5ml 0.25％胰酶(或Tryp LE消化)，镜下观察细胞呈圆形后加入5ml培养基终止消化后吹打并收集细胞；
11)将收集的细胞500g离心5分钟，去除上清，PBS缓冲液重悬沉淀；
12)将收集的细胞用于后续的流式检测、免疫荧光及动物实验。
实验培养基、对照培养基1和对照培养基2采用1-12步骤进行细胞培养，与实验培养基、对照培养基1和对照培养基2不同的是，对照培养基3所使用的T25培养瓶在培养前经明胶溶液包被后再用于细胞培养。
100×Antibiotic-Antimycotic溶液含青霉素(10000单位/ml)-链霉素(10000μg/ml)和两性霉素B(25μg/ml)，细胞培养时使用的工作浓度为2×。
结果：1)实验培养基：如图1所示，利用实验培养基培养3天后可见部分细胞贴壁，部分贴壁形态呈卵圆形，部分细胞形态呈长梭形；培养6天后可见部分细胞出现克隆性聚集，在第9天观察时克隆数增多，克隆直径明显增大；持续培养至18天，细胞或细胞组合物汇合度可达60～90％。
2)对照培养基1：如图2所示，细胞培养至3天时，可见部分细胞贴壁，大部分细胞呈长条形；培养至13天时，仍未见克隆出现，贴壁细胞膨大，部分呈卵圆形，胞内出现脂滴形空泡。
3)对照培养基2：如图3所示，细胞培养至3天时，可见部分细胞贴壁，大部分细胞呈长条形；培养至13天时，仍未见克隆出现，后续随着培养时间延长，仍无克隆出现。
4)如图4所示，细胞培养至3天时，可见部分细胞贴壁，大部分细胞呈长条形；培养至13天时，仍未见克隆出现，随着培养时间延长，细胞数量未出现增多，甚至出现降低情况。
实施例6.表面标记物流式检测
1)收集2×106个细胞或细胞组合物，细胞筛过滤后将细胞或细胞组合物平均分为6份；
2)其中1份细胞或细胞组合物作为同型抗体对照组孵育ISOTYPE-FITC、ISOTYPE-PE、ISOTYPE-PC5.5和ISOTYPE-PC7；
3)其余5组分别与CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC5.5、CD45-PC7；CD34-FITC、CD73-PE；CD29FITC、CD79a-PE；CD44-FITC、CD166-PE；CD11a/CD18-FITC，STRO-1-PE抗体进行孵育；
4)室温避光孵育20分钟；
5)每管加入5毫升PBS缓冲液重悬细胞或细胞组合物后离心去上清；
6)300微升重悬细胞后上流式细胞仪检测。
结果：如图5～8所示，实验培养基培养获得的细胞或细胞组合物表达2006年国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞阳性标志物CD105(96.14％)、CD73(95.72％)、CD29(99.11％)、CD166(97.61％)、CD44(92.49％)和CD90(66.34％)，同时也表达间充质干细胞阴性标志物HLA-DR(92.90％)、CD45(61.53％)和CD79a(63.21％)，不表达造血干细胞标志物CD34(1.83％)和骨髓间充质干细胞标志物STRO-1(1.10％)，部分表达淋巴细胞功能相关分子CD11a/CD18(24.45％)，表明获得的细胞或细胞组合物不是文献报道的间充质干细胞。
实施例7.胚胎干细胞标记物检测
1)收集1×106个细胞，细胞筛过滤后将细胞平均分为2份；
2)将细胞经LIFE公司FIX&PERM CELL PERMEABILIZATION REAGENTS固定和通透化后与抗体孵育；
3)将其中一份细胞作为同型抗体对照组孵育ISOTYPE-FITC、ISOTYPE-PE、ISOTYPE-PC5.5、ISOTYPE-ECD和ISOTYPE-APC；
4)另一份细胞孵育胚胎干细胞鉴定抗体SOX2-FITC、OCT4-PE、TRA-1-60-PC5.5、SSEA4-ECD和Nanog-APC；
5)室温孵育30分钟后，每管加入5毫升PBS缓冲液重悬细胞后离心去上清；
6)300微升重悬细胞上流式细胞仪检测。
(6)结果：如图9～10所示，实验培养基培养获得的细胞或细胞组合物部分细胞表达多能干细胞标记物SOX2(89.69％)和Nanog(19.25％)，不表达其余多能干细胞标记物OCT4(0.00％)、SSEA4(0.00％)和TRA-1-60(0.06％)。表明获得的细胞或细胞组合物不是文献报道的胚胎样干细胞。
实施例8.免疫荧光检测
1)吸弃培养板中培养液，并用PBS缓冲液浸洗3次，每次3分钟；
2)用4％的多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS缓冲液浸洗3次，每次3分钟；
3)加入0.5％Triton X-100室温通透30分钟；
4)PBS缓和液浸洗玻片3次，每次3分钟，滴加正常山羊血清，室温封闭1小时；
5)吸掉封闭液，滴加封闭液1:500稀释的一抗，包括角蛋白14(Cytokertin14，CK14)、波形蛋白(Vimentin)、巢蛋白(Nestin)和神经祖细胞标志物A2B5，并放入湿盒，4℃孵育过夜；
6)吸除一抗，并用PBS缓冲液浸洗3次，每次3分钟；
7)添加488标记的二抗，置于湿盒内，室温避光孵育2小时；
8)用PBS按1:500稀释DAPI，避光孵育5分钟后，用PBS缓冲液浸洗3次，每次3分钟；
9)利用荧光显微镜进行观察和拍照。
结果如图11所示，实验培养基培养获得的细胞或细胞组合物强表达细胞CK14(上皮细胞标志物)、Vimentin(间充质干细胞标志物)、Nestin(神经祖细胞或其它细胞系祖细胞标志物)和弱表达神经祖细胞标志物A2B5。
实施例9.动物实验
1)将3日龄SD大鼠吸入异氟烷麻醉后仰卧位固定，颈正中0.5cm小切口；
2)分离右侧颈动脉，颈动脉下穿线，结扎上下端剪断后缝合并消毒；
3)将术后小鼠放回鼠笼恢复1小时后，在6％低氧条件下处理2小时，以建立脑白质损伤模型组；
4)将3日龄SD大鼠吸入异氟烷麻醉后仰卧位固定，颈正中0.5cm小切口后仅分离右侧颈动脉，未进行颈动脉下穿线、结扎、剪断及低氧处理，以建立假手术组；
5)脑白质损伤模型建立后，将1×106个细胞或细胞组合物悬于5μL生理盐水中，注入脑白质损伤模型大鼠右侧脑室，作为母乳细胞治疗组；将5μL生理盐水注入脑白质损伤模型大鼠右侧脑室，作为生理盐水治疗组；
6)于治疗后7天、14天及28天取各模型组大脑进行石蜡切片和苏木精-伊红(hemotoxylin-eosin，HE)病理染色；流程如下：石蜡切片脱蜡至水后，苏木精染色5分钟，流水冲洗5秒；1％盐酸酒精处理20秒，流水冲洗5秒；0.5％伊红染色1分钟，流水冲洗2分钟；酒精梯度脱水后封片镜检；
7)于治疗后21天进行Morris水迷宫实验的定位航行试验和空间探索试验用以测试模型动物的空间记忆和学习能力；
①定位游泳航行试验流程如下：水迷宫试验水深32厘米，水温维持在25±1℃，水池分为四个象限，在第2象限放置平台，没于水面2厘米，食用增白剂掩盖平台位置；每日固定训练1次，连续5天；将大鼠面向池壁，从第3象限开始固定位置放置大鼠入水，逃避潜伏期时间为大鼠找到平台的时间；
②空间探索试验流程如下：经过定位航行试验后撤去平台，电脑于原位置设置虚拟平台，应用计算机软件追踪整个过程和数据分析，观察60秒内，大鼠穿越平台的次数，以及大鼠在平台象限停留的时间。
8)于治疗后28天取各模型组大脑进行切片并利用透射电镜扫描脱髓鞘情况。流程如下，28天后大鼠灌注后断颈取脑，分离皮质部位置于2.5％戊二醛固定液中，将其分为3mm2的组织块后置于2.5％戊二醛固定液中4℃保存。将固定厚度组织用PBS缓冲液洗涤两次，每次15分钟；用1％锇酸固定1小时后用PBS缓冲液洗涤两次，每次15分钟；30％、50％丙酮脱水，每次15分钟；70％丙酮饱和醋酸铀过夜后，用80％、90％丙酮脱水，每次15分钟，最后用100％丙酮脱水10分钟，包埋后超薄切片，枸橼酸铅溶液染色，透射电镜观察并采图。
结果：
1)HE病理染色结果：如图12所示，假手术组胼胝体区神经元排列有序，生理盐水治疗组神经纤维疏松，排列紊乱且有肿胀断裂。经过来源于母乳的细胞或细胞组合物治疗后的神经纤维较生理盐水治疗组神经纤维更致密，排列有序。
2)水迷宫实验结果：
①游泳航行实验结果：如图13所示，随着训练次数增多各组逃避潜伏期时间逐渐缩短。训练第3天，假手术组与生理盐水治疗组相比，逃脱潜伏期时间缩短，具有显著性差异；训练第5天和6天，假手术组和母乳细胞治疗组与生理盐水治疗组相比，逃脱潜伏期时间缩短，均具有显著差异。训练期间，假手术组与母乳细胞治疗组逃脱潜伏期时间均无显著性差异。图14为假手术组、生理盐水治疗组和母乳细胞治疗组的游泳轨迹图。
②空间探索试验结果：如图15和图16所示，假手术组在平台停留时间和平台穿越次数上均优于生理盐水治疗组，具有统计学差异；同时，母乳细胞治疗组在平台停留时间和平台穿越次数上也优于生理盐水治疗组，差异具有统计学意义；而假手术组与母乳细胞治疗组在平台停留时间和平台穿越次数上均无统计学差异。
3)透射电镜实验结果如图17～20所示，假手术组大鼠胼胝体区有髓鞘包裹的轴突为189.6±8.93个，而生理盐水治疗组大鼠胼胝体区出现大量轴突脱髓鞘，有髓鞘包裹的轴突为97.05±14.42个，经过来源于母乳的细胞或细胞组合物治疗后，母乳细胞治疗组的有髓鞘包裹的轴突为171.33±8.49个。假手术组与生理盐水组差异具有统计学意义，母乳细胞治疗组与生理盐水组差异具有统计学意义，假手术组与母乳细胞治疗组无统计学意义。
综上所述，本发明获得的来源于母乳的细胞或细胞组合物是一种未报道的细胞类型，与此前报道的从母乳中获得的间充质干细胞或胚胎干细胞样细胞流式检测差异明显，并且在重复文献方法时，无法获得细胞克隆。将本发明获得的母乳细胞用于脑白质损伤大鼠模型的治疗，能保持脑白质损伤造模后脑部神经纤维的有序排列，促进造模后胼胝体区神经轴突再髓鞘化，促进大鼠学习和记忆能力的恢复。
Claims (10)
1.一种来源于母乳的细胞或细胞组合物在制备治疗脑白质损伤的细胞移植剂中的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物通过流式细胞术检测表达间充质干细胞阳性标志物CD105、CD73、CD29、CD166、CD44、CD90和间充质干细胞阴性标志物HLA-DR、CD45、CD79a，部分表达多能干细胞标记物SOX2和Nanog，及淋巴细胞功能相关分子CD11a/CD18；不表达造血干细胞标志物CD34和骨髓间充质干细胞标志物STRO-1，也不表达其余多能干细胞标记物OCT4、SSEA4和TRA-1-60；
所述细胞或细胞组合物的制备方法包括如下步骤：
（1）将所述母乳进行预处理，得所述母乳的下层沉淀；
（2）采用细胞培养基重悬沉淀所述母乳的下层沉淀，并接种至细胞培养瓶中培养；
（3）待细胞达到适宜汇合度，采用胰酶或Tryp LE消化培养瓶中的细胞，细胞呈圆形后加入所述细胞培养基终止消化，得所述细胞或细胞组合物；
所述细胞培养基由NeuroCult NS A basal medium、NeuroCult SM1、N2 supplementA、Human basic fibroblast growth factor、Human epithelial growth factor和Antibiotic-Antimycotic组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物表达细胞CK14、Vimentin和Nestin；所述细胞CK14为上皮细胞标志物，所述Vimentin为间充质干细胞标志物，所述Nestin为神经祖细胞或其它细胞系祖细胞标志物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物可以获得细胞克隆；所述细胞或细胞组合物汇合度可达到60~90%。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述母乳为产妇分娩后1-5天内分泌的初乳。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Antibiotic-Antimycotic由青霉素-链霉素和两性霉素B组成，所述Antibiotic-Antimycotic的工作浓度为2×。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NeuroCult NS A basal medium、NeuroCult SM1和N2 supplement按体积比90：2：1组成混合培养基，每465mL混合培养基中再加入10μg Human basic fibroblast growth factor和10μg Human epithelial growthfactor，组成所述细胞培养基。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物能促进胼胝体区神经轴突再髓鞘化。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物能保持脑白质损伤造模后脑部神经纤维的有序排列。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物能抑制神经元的凋亡和坏死。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞或细胞组合物，能促进脑白质损伤大鼠学习和记忆能力的恢复。
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| differentiation of human breast-milk stem cells to Neutral stem cells and neurons;Seyed Mojtaba Hosseini等;Neurology research international;第2014卷;第2-3页2.1-2.6部分，第3页第3.1-3.2部分 * |
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