JP2007509601A - 脂肪組織から幹細胞を調製するための方法およびシステム - Google Patents
脂肪組織から幹細胞を調製するための方法およびシステム Download PDFInfo
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Abstract
Description
(項目1)
幹細胞を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;および
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程、
を包含する、方法。
(項目2)
上記脂肪吸引廃液は、生理食塩水、またはリンゲル液を使用して調製される、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記遠心分離は、800×g以下の範囲内の速度で行われる、項目1に記載の方法。
(項目4)
上記遠心分離は、400×g以上の範囲内の速度で行われる、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記比重による遠心分離は、370×g〜1100×gの範囲内の速度で行われる、項目1に記載の方法。
(項目6)
上記比重による遠心分離は、20℃における比重が1.076〜1.078g/mlである媒体を用いて行われる、項目1に記載の方法。
(項目7)
上記比重による遠心分離の媒体は、フィコール、パーコール、およびスクロースからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目8)
上記比重による遠心分離の媒体は、フィコールである、項目7に記載の方法。
(項目9)
上記収集された細胞層の比重は、比重1.050〜1.075の間の範囲である、項目1に記載の方法。
(項目10)
上記細胞層の収集は、ピペットを用いて行われる、項目1に記載の方法。
(項目11)
上記細胞層を、DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)およびそれらの混合物からなる群より選択される成分を含む培地中で培養する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目12)
上記比重による遠心分離は、密度勾配遠心分離を含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
血球を除去する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目14)
幹細胞を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引由来物質を得る工程;および
B)該脂肪吸引由来物質を遠心分離にかけ、脂肪組織を単離することなく細胞画分を得る工程、
を包含する、方法。
(項目15)
上記物質を、少なくとも一部の細胞が該物質から分離される条件に供する工程をさらに包含する、項目14に記載の方法。
(項目16)
上記条件は、細胞外マトリクスの分解のためのものである、項目15に記載の方法。
(項目17)
上記細胞外マトリクスの分解は、コラゲナーゼにより達成される、項目15に記載の方法。
(項目18)
工程B)において、上清を除去する工程をさらに包含する、項目14に記載の方法。
(項目19)
上記工程B)由来の物質を濾過する工程をさらに包含する、項目14に記載の方法。
(項目20)
血球を除去する工程をさらに包含する、項目14に記載の方法。
(項目21)
上記血球を除去する工程が、血球を分解する成分を加える工程を包含する、項目14に記載の方法。
(項目22)
幹細胞を調製するための方法であって、以下:
i)脂肪吸引由来物質を得る工程;
ii)脂肪組織を単離することなく、少なくとも一部の細胞が該物質から分離される条件に、該物質を供する工程;
iii)該物質を、遠心分離にかける工程;
iv)該物質に血球を分解する成分を加え、該物質を攪拌する工程;
v)該物質を遠心分離にかけ、ペレットを得る工程;および
vi)該ペレットから、該物質の上清を吸引する工程、
を包含する、方法。
(項目23)
上記物質を上記条件へ供する工程が、上記脂肪吸引廃液を維持する工程を包含する、項目22に記載の方法。
(項目24)
上記脂肪吸引由来物質が、脂肪吸引廃液と脂肪とを含む、項目22に記載の方法。
(項目25)
上記工程ii)における上記条件が、コラゲナーゼを加えることを包含する、項目22に記載の方法。
(項目26)
上記工程iii)における遠心分離が、400〜1200×gにて行われる、項目22に記載の方法。
(項目27)
血球を分解する上記成分が、塩化アンモニウムと炭酸水素カリウムとを含む、項目22に記載の方法。
(項目28)
上記塩化アンモニウムが、上記成分中に155mMにて含まれる、項目27に記載の方法。
(項目29)
上記炭酸水素カリウムが、上記成分中に10mMにて含まれる、項目27に記載の方法。
(項目30)
上記工程v)における上記遠心分離が、400〜1200×gにて行われる、項目22に記載の方法。
(項目31)
上記ペレットは、幹細胞を含む、項目22に記載の方法。
(項目32)
項目1〜31のいずれか1項に記載の方法によって調製される、幹細胞。
(項目33)
CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151、およびSH3からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を発現する、項目32に記載の幹細胞。
(項目34)
CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151、およびSH3を発現する、項目33に記載の幹細胞。
(項目35)
さらに、CD31、CD45、CD117、およびCD146からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも1つを発現する、項目33に記載の幹細胞。
(項目36)
CD56を発現しない、項目32に記載の幹細胞。
(項目37)
CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135、およびCD144からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を発現しない、項目32に記載の幹細胞。
(項目38)
CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135、およびCD144を発現しない、項目37に記載の幹細胞。
(項目39)
CD49dを発現し、CD56を発現しない、項目32に記載の幹細胞。
(項目40)
幹細胞を調製するためのシステムであって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得るための手段;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけて、細胞画分を得る手段;および
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける手段;
を含む、システム。
(項目41)
項目40に記載のシステムであって、該システムは、以下:
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する手段、
をさらに含む、システム。
(項目42)
幹細胞を調製するためのシステムであって、以下:
A)脂肪吸引由来物質を得るための手段;および
B)該脂肪吸引由来物質を遠心分離にかけ、脂肪組織を単離することなく細胞画分を得るための手段;
を含む、システム。
(項目43)
幹細胞を調製するためのシステムであって、以下:
i)脂肪吸引由来物質を得るための手段;
ii)脂肪組織を単離することなく、該物質を、少なくとも一部の細胞が該物質から分離される条件に供するための手段;
iii)該物質を遠心分離にかける手段;
iv)該物質に血球を分解する成分を加え、該物質を攪拌する手段;
v)該物質を遠心分離にかけ、ペレットを得るための手段;および
vi)該ペレットから該物質の上清を吸引するための手段、
を含む、システム。
(項目44)
外植片を得るための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程;および
E)収集された細胞層を培養して、外植片を得る工程、
を含む、方法。
(項目45)
組織移植片を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分より収集された細胞層を培養して、組織移植片を得る工程、
を含む、方法。
(項目46)
組織移植片を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程;および
E)収集された細胞層を培養して、組織移植片を得る工程、
を含む、方法。
(項目47)
組織移植片を移植するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程;
E)収集された細胞層を培養して、組織移植片を得る工程;および
F)該組織移植片を移植する工程、
を含む、方法。
(項目48)
幹細胞を調製するための脂肪吸引廃液の、使用。
(項目49)
血管内皮前駆細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、および筋細胞からなる群から選択される細胞を調製する方法であって、
項目1〜31のいずれか1項に記載の方法によって得られた幹細胞を培養する工程
を含む、方法。
(項目50)
分化細胞を調製するための方法であって、以下:
A)a)項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、
b)所望の部位に対応する分化細胞と、
を混合して混合物を得る工程;および
B)該混合物を、脂肪由来前駆細胞が分化するのに十分な条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
(項目51)
上記分化細胞は、間葉系細胞である、項目50に記載の方法。
(項目52)
上記分化細胞は、脂肪細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞および膵細胞からなる群より選択される、項目50に記載の方法。
(項目53)
上記分化細胞への分化を促進する因子を提供する工程をさらに包含する、項目50に記載の方法。
(項目54)
項目50に記載の方法であって、上記混合物は、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン(IBMX)、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンD、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジブチルcAMP(dbcAMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヨードデオキシウリジン(IdU)、ヒドロキシウレア(HU)、シトシンアラビノシド(AraC)、マイトマイシンC(MMC)、酪酸ナトリウム(NaBu)、ポリブレンおよびセレニウムからなる群より選択される成分のうち少なくとも1つを含む培地中で培養される、方法。
(項目55)
項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、所望の部位に対応する分化細胞とを含む、細胞混合物。
(項目56)
上記細胞混合物は、上記幹細胞の分化を誘導するのに十分な条件に供されたものである、項目55に記載の細胞混合物。
(項目57)
細胞移植のための組成物であって、以下:
a)項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;および
b)所望の部位に対応する分化細胞、
を含有する、組成物。
(項目58)
上記移植は、上記所望の部位において行われる、項目57に記載の組成物。
(項目59)
上記幹細胞と、上記分化細胞との間の比率は、約1:10〜約10:1である、項目57に記載の組成物。
(項目60)
上記幹細胞と、上記分化細胞との間の比率は、約1:2〜約2:1である、項目57に記載の組成物。
(項目61)
上記幹細胞と、上記分化細胞との間の比率は、実質的に等量である、項目57に記載の組成物。
(項目62)
上記分化細胞は、間葉系細胞を含む、項目57に記載の組成物。
(項目63)
上記分化細胞は、脂肪細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞および膵細胞からなる群より選択される、項目57に記載の組成物。
(項目64)
項目57に記載の組成物であって、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン(IBMX)、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンD、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジブチルcAMP(dbcAMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヨードデオキシウリジン(IdU)、ヒドロキシウレア(HU)、シトシンアラビノシド(AraC)、マイトマイシンC(MMC)、酪酸ナトリウム(NaBu)、ポリブレンおよびセレニウムからなる群より選択される成分のうち少なくとも1つをさらに含む、組成物。
(項目65)
上記幹細胞と、上記分化細胞とは、互いに同種異系である、項目57に記載の組成物。
(項目66)
上記幹細胞と、上記分化細胞とは、互いに同系である、項目57に記載の組成物。
(項目67)
分化細胞の不全に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法であって、
A)a)項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;および
b)所望の部位に対応する分化細胞、
を含有する、組成物を提供する工程、ならびに
B)被検体に、該組成物を投与する工程、
を包含する、方法。
(項目68)
分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための医薬であって、
a)項目1〜31に記載の方法で得られた幹細胞;
b)所望の部位に対応する分化細胞;および
c)薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、医薬。
(項目69)
a)項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、b)所望の部位に対応する分化細胞との混合物の、分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための医薬の調製のための、使用。
(項目70)
美容状態を処置または改善するための方法であって、以下:
A)a)項目1〜26のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;および
b)所望の部位に対応する分化細胞、
を含有する、組成物を提供する工程;ならびに
B)被検体に、該組成物を投与する工程、
を包含する、方法。
(項目71)
美容状態を処置または改善するため医薬であって、以下:
a)項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;
b)所望の部位に対応する分化細胞;および
c)薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、医薬。
(項目72)
a)項目1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、b)所望の部位に対応する分化細胞との混合物の、美容状態を処置または改善するための医薬の調製のための、使用。
本明細書において特に使用される用語は、以下のように定義される。
以下に本発明の好ましい実施形態が説明される。以下の実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。本明細書中を参酌して、本発明の範囲を逸脱することなく、変更および修正を行い得ることが、当業者に明らかに理解される。
本発明の1つの局面において、本発明は、脂肪吸引廃液から幹細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、A)脂肪吸引廃液を得る工程;B)その脂肪吸引廃液を遠心分離して細胞画分を得る工程;C)その細胞画分を比重による遠心分離(例えば、密度勾配遠心分離)にかける工程;および、D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程、を包含する。本方法において使用される脂肪吸引廃液としては、脂肪吸引時に一緒に吸引された液体(例えば、トゥメセント液および血液が挙げられるが、これらに限定されない)または、吸引脂肪を液体で洗浄する際に生じた廃液が挙げられるが、これらに限定されない。
得られた細胞を、DMEM培地に1.8×106細胞の濃度にて、60mm皿上に播種する。
1つの局面において、本発明は、幹細胞から分化細胞を調製するための方法を提供する。幹細胞から得られる分化細胞としては、最終的に分化した細胞のみならず、前駆細胞も含まれる。
本発明の細胞混合物は、所望の部位に対応する分化細胞への分化を促進する因子をさらに含み得る。この因子は、所望の部位に対応する分化細胞への分化を促進することが知られているかまたは確認されている任意の因子であり得る。好ましい分化誘導剤の例としては、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン(IBMX)、アスコルベート−2−ホスフェート(ascorbate−2−phosphate)、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF−β、ECGF、BMP、PDGFをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンD、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸(例えば、亜セレン酸ナトリウムなど)、リノレン酸、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、5−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、LIF、IL−2、IL−6などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジブチルcAMP(dbcAMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヨードデオキシウリジン(IdU)、ヒドロキシウレア(HU)、シトシンアラビノシド(AraC)、マイトマイシンC(MMC)、酪酸ナトリウム(NaBu)、ポリブレン、セレニウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
この幹細胞と所望の部位に対応する分化細胞との同時培養により、所望の性質を、好ましくは均質に含有する分化細胞を一定量以上で提供することができる。この方法は、A)a)脂肪由来前駆細胞と、b)所望の部位に対応する分化細胞とを混合して混合物を得る工程;およびB)この脂肪由来前駆細胞の分化が生じるに十分な条件で、この混合物を培養する工程、を包含する。
別の局面において、本発明は、細胞移植のための組成物(例えば、組織片、および移植片、ならびにこれらを含む組成物)を提供する。この移植は、所望の部位に対応する分化細胞の欠損または劣化などに伴う疾患、障害または異常状態を処置または予防するため、あるいは美容状態を処置または改善するためであれば、任意の目的で使用することができる。このような移植の場合、好ましくは、移植は、所望の部位に移植されるがそれに限定されず、最終的に所望の部位の処置または予防が可能なのであれば、本発明の細胞含有組成物は、任意の部位に投与または移植することができる。
別の局面において、本発明は、分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法、および美容状態を処置または改善するための方法を提供する。これらの方法は、A)a)脂肪由来前駆細胞;およびb)所望の部位に対応する分化細胞、を含む組成物を提供する工程、ならびにB)被検体にその組成物を投与する工程、を包含する。この方法において、移植に使用される分化細胞および脂肪吸引廃液由来の幹細胞は、本明細書において、「分化細胞を調製するための方法」において説明したような任意の形態および態様をとり得る。
別の局面において、本発明は、a)脂肪由来前駆細胞と、b)所望の部位に対応する分化細胞との混合物の、分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するため、あるいは美容状態を処置または改善するための医薬の調製のための使用を提供する。移植のための細胞混合物において用いられる分化細胞および脂肪由来前駆細胞は、本明細書において、「分化細胞を調製するための方法」において説明したような任意の形態をとり得る。
脂肪吸引手術前に予定吸引脂肪量を超える、過剰量のトゥメセント液(0.0001%アドレナリンを含む生理食塩水)を皮下脂肪層に注入し(トゥメセント法(tumescent法))、その後、脂肪吸引のために内径2〜3mmのカニューレ(金属製吸引筒)を使用して、脂肪吸引手術を行った。脂肪吸引手術は、当該分野において周知であり、例えば、美容外科手術プラクティス2(Cosmetic Operation Practice 2)、市田正成・谷野隆三郎・保阪善昭 共編、文光堂、P429−469に、その方法が記載される。これは、本明細書中に参考として援用される。
採取された廃液を、以下の2方法のいずれかを用いて処理することによって、幹細胞懸濁液を調製した。以下の2方法のいずれも、コラゲナーゼなどの酵素を用いる処理が不要であるため、コラゲナーゼなどの酵素の混入がない点においても、従来法で調製された脂肪組織由来の幹細胞とは異なる。
1)脂肪吸引廃液の液体部分(通常、2〜4リットル程度)を400×gで10分間遠心分離した。
2)上清を捨てた。ただし、沈殿した細胞は浮遊しやすいため、アスピレーターを用いて、細胞を損傷しないよう慎重に吸引した。
3)ペレット化した細胞(ほとんどが赤血球)を50mlのポリプロピレン製チューブ数本に移し、再度遠心分離(400×g、5分間)した。
4)上清を吸引し、総量が15〜20mlとなるようにペレット化細胞を集めた。マトリクス成分が多い場合は、そのマトリクス成分を100μmフィルターを用いて濾過・除去した。必要に応じて、再遠心分離を行なった。
5)50mlのチューブにフィコール(登録商標)15mlを入れ、その上に層を作るように極力ゆっくりと細胞液15〜20mlを加えた。
6)そのチューブを、400×gで30分遠心分離した。(18〜20℃)
7)遠心分離後、その細胞溶液は4層:上からA層(無細胞層、透明);B層(単核球層、淡赤色);C層(フィコール層、透明);およびD層(赤血球層、濃赤色)、に分離した。幹細胞を含む接着細胞群は、B層およびC層に含まれていた。A層を吸引後、B層および約3ml程度のC層を細胞懸濁液として回収し、50mlのチューブに移した。
8)回収した細胞懸濁液に、血清加PBS(10%FBS、もしくは10%ヒト血清を加えたPBS)を加えて50mlとした。その混合物をピペッティングにより混和し、次いでその混合物を遠心分離(400×g、5分)した。
9)上清を吸引し、再度血清加PBSを加えて50mlとした。その混合物をピペッティングにより混和し、次いでその混合物を遠心分離(400×g、5分)した。
10)上清を吸引した。幹細胞を含むペレット化細胞群を回収した。
1)クリーンベンチ内で、吸引管を用いて脂肪吸引廃液を吸引し、フィルター(ポアサイズ;120μm)付きリザーバーを通した。得られる濾液を、閉鎖分離バックに封入した。
2)セルセパレーター(血液成分分離装置ASTEC204、東京(日本)の(株)アムコより入手可能)で遠心分離を3回行い、比重の軽い血小板成分、比重の重い赤血球、顆粒球成分を可能な限り除去した。
3)幹細胞を高濃度に含む分画(約30〜40ml)を採取した。単離した細胞の比重は、1.050〜1.075の範囲であった。
実施例2において回収した幹細胞を、以下の手順でFACSを用いて特徴付けした。
CD 発現量
3 −
4 −
11c −
13 ++
14 −
15 −
16 −
19 −
29 ++
31 +
33 −
34 +
36 ++
38 −
44 +
45 +
49d ++
54 +
56 −
58 +
61 −
62E −
62P −
69 −
71 ++
73 ++
90 ++
104 −
105 ++
106 −
117 +
135 −
144 −
146 +
151 ++
235a −
SH3 +
STRO−1 +
「−」=発現は検出されず、
20%を+および++により表す。
「+」=20%以下の細胞に検出され、
「++」=20%以上の細胞に検出される。
さらに、複数の被検体から得られた脂肪吸引廃液の液体部分より幹細胞を回収し、その特徴付を行った。その結果を以下に示す。
「−」=発現は検出されず、「+」=発現が検出された、N.T.=試験せず。
脂肪吸引廃液由来の幹細胞を、以下の方法で脂肪生成性DMEM培地で培養することによって、脂肪細胞へ分化誘導した。
DMEM(10% FBSを含む) 100ml;
イソブチル−メチルキサンチン (0.5M) 100μl(終濃度0.5mM);
デキサメタゾン(10−4M) 1ml(終濃度1μM);
インスリン(10−3M) 1ml(終濃度10μM);および
インドメタシン 100μl(終濃度 200μM)。
1)培地を捨て、PBSで洗浄した;
2)約10分間、細胞を10%ホルマリンで固定した;
3)蒸留水で洗浄した;
4)60%イソプロピルアルコールを添加し、約1分間放置した;
5)細胞をオイルレッドO染色液*に移し、15分間放置した;
6)60%イソプロピルアルコールを添加し、1分放置した;
7)蒸留水で洗浄した;
8)ヘマトキシリンを添加し、2分間放置することによって、核染色を行なった;
9)蒸留水で洗浄した;
10)炭酸リチウム液**を添加し、数秒間放置することによって、色出しをした;
11)蒸留水で水洗した。
*:オイルレッドO染色液を以下の手順で調製した:
オイルレッドO 0.3g(SIGMA O−0625)を、99%イソプロピルアルコール100mlに溶解した。使用時に、この溶液と蒸留水とを6対4の割合で混ぜ、激しく振盪した。その30分後に、得られた溶液を濾過して使用した。
**:炭酸リチウム液は以下の手順で調製した:
3mgの炭酸リチウム飽和液(100ml蒸留水中に1.54g:Sigma−Aldrich)を、蒸留水100mlに加えた。
脂肪吸引廃液由来の幹細胞を、以下のように軟骨生成性(Chondrogenic)DMEM培地で培養することによって、軟骨細胞へ分化誘導した。
1)DMEM(血清含まず適切な抗生物質を含む)100ml;
インスリン(6.25mg/mL) 100μl(添加量625μL);
アスコルベート−2−ホスフェート(5μM) 1ml(終濃度50nM);および
仔ウシ血清 1ml(終濃度1%)を混合した。
2)得られた混合液を0.22μmフィルターを用いて濾過し、TGF−β1(1μg/ml)を1mlその混合物に加え、ピペッティング後、4℃で保管した。
1)培地を捨て、PBSで洗浄した;
2)約10分間、細胞を10%ホルマリンで固定した;
3)3%アセテート溶液を添加して、3分間放置した;
4)アルシアンブルー染色液*を添加して、約1時間放置した;
5)3%アセテート溶液を添加して、3分間放置した;
6)蒸留水で2分間洗浄した;
7)ヌクレアファーストレッド(ケルンエヒトロート)**を添加して、2分間放置した;
8)蒸留水で洗浄した。
*:アルシアンブルー染色液を以下の手順で調製した:
アルシアンブルー8GX 1gを3%酢酸水100mlに溶解し、濾過して使用した
**:ヌクレアファーストレッド(ケルンエヒトロート)溶液を以下の手順で調製した:
蒸留水100mlにヌクレアファーストレッド(ケルンエヒトロート)を0.1g添加し、そして硫酸アルミニウムを5g添加して、煮沸溶解した。生成物を濾過して使用した。
次に、分化細胞として、同意を得たヒト被験体から脂肪組織を調製した。分離は、当該分野において周知の技法を用いて行った。簡単に述べると、同意を得たヒト被験体から吸引された脂肪組織から、ヒト脂肪組織を無菌的に分離した。この組織塊は、脂肪細胞用の培地((500ml)組成=イーグル培地4.75g;10%NaHCO3 10ml;グルタミン 0.3g;カナマイシン(20mg/ml) 1.5ml;ペニシリンストレプトマイシン5ml;FBS(10%))中に保存した。その組織塊は、組織のまま使用してもよいし、さらに分離して脂肪細胞として使用してもよい。
イーグル培地成分 (9.5g中)
塩化ナトリウム 6400mg
塩化カリウム 400mg
塩化カルシウム(無水) 200mg
硫酸マグネシウム(無水) 97.7mg
リン酸二水素ナトリウム(無水) 108mg
硝酸第二鉄(九水塩) 0.1mg
ブドウ糖 1000mg
ピルビン酸ナトリウム 110mg
コハク酸 106mg
コハク酸ナトリウム(六水塩) 27mg
L−アルギニン塩酸塩 84mg
L−システイン塩酸塩(一水塩) 70.3mg
グリシン 30mg
L−ヒスチジン塩酸塩(一水塩) 42mg
L−イソロイシン 104.8mg
L−ロイシン 104.8mg
L−リジン塩酸塩 146.2mg
L−メチオニン 30mg
L−フェニルアラニン 66mg
L−セリン 42mg
L−スレオニン 95.2mg
L−トリプトファン 16mg
L−チロシン二ナトリウム 89.5mg
L−バリン 93.6mg
重酒石酸コリン 7.2mg
葉酸 4mg
ニコチンアミド 4mg
パントテン酸カルシウム 4mg
塩酸ピリドキサール 4mg
リボフラビン 0.4mg
塩酸チアミン 4mg
i−イノシトール 7.2mg
フェノールレッド 5mg。
次に、実施例2で調製した脂肪由来前駆細胞(PLA)をさらなる処理をせずに、実施例6で調製した分化細胞である脂肪組織(脂肪細胞集団)と混合した。分化が促進し再生されるかどうかを決定する。
脂肪由来幹細胞と脂肪組織とを混合する場合、再生脂肪の平均重量は、脂肪組織のみの場合よりも重い。従って、PLAの影響が明らかに実証されている。検査のためにSCIDマウスを切開すると、この再生による効果が確認できる。見られるように、脂肪由来幹細胞を含む混合物が投与された場合、その組織は有意に大きい。
実施例2で調製した脂肪吸引廃液由来の幹細胞を、DMEM(実施例7において使用したものと同一)中で維持した。生じた脂肪由来幹細胞を使用して、同様の効果を確認する。具体的には、この調製物を、実施例2において調製し、実施例7において使用した脂肪由来幹細胞または脂肪由来前駆細胞(PLA)の代わりに使用した。
M−199で培養した脂肪由来前駆細胞を、実施例2において調製され、実施例7において使用された脂肪由来幹細胞の代わりに使用する。M−199は、以下の成分を含む。
Medium199 9.5g
NaHCO3 2.2g
FBS (15%)
酸性−FGF 2μg
ヘパリン 5mg
抗菌−抗真菌剤 10ml
(注)以下の成分の単位はmg/mlである
L−アラニン 50
L−アルギニン・HCl 70
L−アスパラギン酸 60
L−システイン 0.1
L−シスチン 20
L−グルタミン酸 150(H2O)
L−グルタミン 100
グリシン 50
L−ヒスチジン・HCl・H2O 20
ヒドロキシ−L−プロリン 10
L−イソロイシン 40
L−ロイシン 120
L−リシン・HCl 70
L−メチオニン 30
L−フェニルアラニン 50
L−プロリン 40
L−セリン 50
L−トレオニン 60
L−トリプトファン 20
L−チロシン 40
L−バリン 50
グルタチオン(還元型) 0.05
CaCl2・2H2O 264.9
KCl 400
MgSO4・7H2O 97.7(無水型)
NaCl 6800
NaHCO3 2200
NaH2PO4 140(2H2O)
Fe(NO3)3・9H2O 0.72
CH3COONa・3H2O 83
フェノールレッド 15
D−ビオチン 0.01
葉酸 0.01
ニコチンアミド 0.025
パントテン酸カルシウム 0.01
ピリドキサール・HCl 0.025
ピリドキシン・HCl 0.025
リボフラビン 0.01
チアミン・HCl 0.01
アデニン 10(SO4)
塩化コリン 0.5
ヒポキサンチン 0.3
i−イノシトール 0.05
p−アミノ安息香酸 0.05
グアニン・HCl 0.3
キサンチン 0.3
チミン 0.3
ウラシル 0.3
ニコチン酸 0.025
ビタミンA 0.1
カルシフェロール 0.1
メナジン 0.01
α−トコフェロール 0.05
アスコルビン酸 20
Tween80 20
コレステロール 0.2
ATP・2Na 1
アデニル酸 0.2
リボース 0.5
デオキシリボース 0.5。
次に、骨細胞を用いて、本発明の細胞混合物を移植する同様の実験を行う。骨細胞については、当該分野において周知の技法を用いて、骨(骨組織)をマウスから採取する。この骨組織と実施例2で調製したPLAとを混合し、この混合物を骨に移植する。この場合、骨の再生を本発明の混合移植物が支持することが観察される。
次に、血管細胞を用いて、本発明の細胞混合物を移植する同様の実験を行う。血管細胞については、当該分野において周知の技法を用いて、血管(血管組織)をマウスから採取する。この血管組織と実施例2で調製したPLAとを混合し、その混合物を血管に移植する。この場合、血管の再生を本発明の混合移植物が支持することが観察される。
実施例2「脂肪吸引廃液からの、幹細胞懸濁液の調製」、「(I)調製方法1」において使用された細胞層の密度勾配遠心分離条件は、フィコールを用いた400×g、30分間であった。次に、この密度勾配遠心分離の条件をより詳細にアッセイした。
フィコール以外の使用可能な密度勾配遠心分離の媒体としては、パーコール(登録商標)、ヒストパーク(登録商標)、およびリンフォプレップなどが挙げられる。これらを用いて細胞層の密度勾配遠心分離を行って、フィコールの場合の結果と比較する。単離した細胞をFACSを使用して測定する。最も良好な純度を示す媒体は、フィコールである。
実施例2においては、400×g、30分間の遠心分離を行った。次に、以下の遠心分離条件をアッセイする。
次に、廃液と組織(今後、「脂肪組織+廃液」とも呼ぶ)とに分離する前の脂肪吸引物質を試験するために、本発明者らは、分離前の脂肪吸引物質を用いて同様の分離実験を行った。
1.「脂肪組織+廃液」(脂肪組織が「廃液」を覆っている)を含むカバー付き容器に、コラゲナーゼ(7.5%コラゲナーゼ、Sigma、総サンプルの1/100容量を加えた)を加え、適切な速度にて振盪した。37℃で30分間攪拌した後、脂肪細胞内マトリクスの主要な成分であるコラゲナーゼを分解し、脂肪細胞の単離を促進させた。ここでは、8本の500mlチューブまたは4本の1000mlチューブを使用した。
2.得られたサンプルを、800×gで遠心分離にかけ、これにより脂肪成分と細胞とを分離した。脂肪成分は、細胞よりも小さい比重を有する。遠心分離後、この物質を、油層、基質層、液体層および細胞層を含む4層に分離した。
3.この油層、基質層、および液体層を吸引し、細胞層のみを得た。この細胞層を、必要に応じて、500μmのフィルターおよび250μmのフィルターを用いて濾過した。500μmのフィルターであることは、必須ではないと考えられる。
4.10mlの溶解緩衝液(例えば、塩化アンモニウム水溶液および炭酸水素カリウム水溶液)を加え、2〜5分間攪拌して、赤血球を溶解する。必要に応じて、この溶解工程は省略され得る。
5.リン酸緩衝化生理食塩水を、生じたペレットに加えた。上記溶解緩衝液反応を停止させた。この溶解したサンプルを、100μmフィルターで濾過した。175mlの円錐形チューブを遠心分離に用いた。
6.得られたサンプルを、800×gまたは400×gで5分間のさらなる遠心分離にかけた。ペレット化した細胞が目的の細胞である。
7.上清を吸引して不要な溶液を除去し、その細胞の遠心分離を行った。収集された細胞を、同様の分析に供した。
実施例14によって調製された幹細胞について、実施例4のように分析した。
次に、脂肪吸引廃液を、赤血球の除去を省略することを除いて実施例2(調製方法1)のように処理し、幹細胞を得た。
本実施例においては、コンフルエントに近い条件下での培養が、種々の分化細胞への分化誘導を生じることを示す。
1)骨への分化
収集された細胞を、DMEM培地において1.8×107細胞/皿の濃度にて、60mm皿上で培養した。10日間の培養後、この細胞はコンフルエント近くになり、その時点で、その現在の培地と、分化誘導培地(組成:骨生成性培地の例は、10% FBSおよび5%馬血清を含むDMEMに、1μMデキサメタゾン、50μMアスコルベート−2−ホスフェート、10mM β−グリセロホスフェート、および1% ABAMを添加した培地であり得る)とを交換し、22日間培養した。この細胞を、von Kossa染色を用いて観察した。
培養培地を捨て、目的のサンプルをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄する。この洗浄したサンプルを、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定する。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、暗所で20分間、2.5%硝酸銀と接触させる。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、蛍光灯の下に15分間放置する。このサンプルを、0.5%ヒドロキノンと2分間インキュベーションし、続いて5%チオ硫酸ナトリウムと2分間インキュベーションする。次いで、このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、ヌクレアファーストレッド(Nuclear First Red)で2分間染色する。次いで、このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、マウントクイック(大道産業、日本)と共にマウントし、顕微鏡で観察する。
収集された細胞を、DMEM培地において1.8×107細胞/皿の濃度にて、60mm皿上で培養した。10日間の培養後、この細胞はコンフルエント近くになり、その時点で、その現在の培地と、分化誘導培地(組成:軟骨生成性培地の例は、1% FBSを含むDMEMに、6.25μg/mlインスリン、6.25μg/mlトランスフェリン、10ng/ml TGF β1、50nMアスコルベート−2−ホスフェート、および1% ABAMを添加した培地であり得る)とを交換し、22日間培養した。この細胞を、アルシアンブルー染色を用いて観察した。
目的のサンプルから培地を捨てる。このサンプルを、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定する。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、3%アセテートで3分間洗浄する。このサンプルを、アルシアンブルー染色溶液(組成:脂肪生成培地の例は、10%FBSを含むDMEMに、0.5mM IBMX、1μMデキサメタゾン、10μMインスリン、200μMインドメタシン、および1%AMAMを添加した培地であり得る)に、30分間浸す。このサンプルを、3%アセテートで3分間洗浄する。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、ヌクレアファーストレッドで2分間染色する。次いで、このサンプルを、milliQ水で洗浄する。次いで、このサンプルを、マウントクイック(大道産業、日本)と共にマウントし、顕微鏡で観察する。
3)脂肪への分化
収集された細胞を、DMEM培地において1.8×107細胞/皿の濃度にて、60mm皿上で培養した。10日間の培養後、この細胞はコンフルエント近くになり、その時点で、その現在の培地と、分化誘導培地(組成:脂肪生成培地の例は、10% FBSを含むDMEMに、0.5mM IBMX、1μMデキサメタゾン、10μMインスリン、200μMインドメタシン、および1% AMAMを添加した培地であり得る)とを交換し、12日間培養した。この細胞を、オイルレッドO染色を用いて観察した。
培養培地を捨て、目的のサンプルをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した。この洗浄したサンプルを、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で10分間固定する。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、60%イソプロピルアルコールに1分間浸す。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。このサンプルを、ヘマトキシリンに10分間浸す。このサンプルを、milliQ水で洗浄する。次いで、このサンプルを、炭酸リチウムに数秒間浸し、次いでmilliQ水で洗浄する。このサンプルを、マウントクイック(大道産業、日本)と共にマウントし、顕微鏡で観察する。
オイルレッドO 0.3gを、100mlの99%イソプロピルアルコールに溶解する。使用に際して、この溶液を6:4の割合でmilliQ水と混合し、そのまま30分間攪拌した。この混合溶液を、使用前に濾過した。
3mlの炭酸リチウム飽和溶液(100ml当たり1.54gの炭酸リチウム)を、100mlのmilliQ水に加えた。
本実施例においては、たとえ原材料が赤血球除去工程なしで調製されたとしても、コンフルエントに近い条件下の培養が、種々の分化細胞への分化を誘導することを示す。
本実施例においては、分化培地を使用した培養が、種々の分化細胞への分化を誘導することを示す。
1)骨への分化
収集された細胞を、分化誘導培地(組成:骨生成性培地の例は、10% FBSおよび5%馬血清を含むDMEMに、1μMデキサメタゾン、50μMアスコルベート−2−ホスフェート、10mM β−グリセロホスフェート、および1% ABAMを添加した培地であり得る)において1.8×107細胞/皿の濃度にて、60mm皿上に播種する。22日間培養後、このサンプルをvon Kossa染色で評価した。von Kossa染色は、上記実施例17で説明したように行った。
2)脂肪への分化
収集された細胞を、分化誘導培地(組成:脂肪生成培地の例は、10% FBSを含むDMEMに、0.5mM IBMX、1μMデキサメタゾン、10μMインスリン、200μMインドメタシン、および1% AMAMを添加した培地であり得る)において1.8×107細胞/皿の濃度にて、60mm皿上に播種した。25日間培養後、このサンプルを、オイルレッドO染色を用いて評価した。オイルレッドO染色は、上記実施例17で説明したように行った。
本実施例においては、たとえ原材料が赤血球除去工程なしで調製されたとしても、分化誘導培地での培養が、種々の分化細胞への分化を誘導することを示す。
本実施例は、脂肪吸引由来物質から得ることができる幹細胞数を示す。数量化は、ある容量の細胞サンプル中の細胞数を単純に計数して行った。
Claims (72)
- 幹細胞を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;および
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程、
を包含する、方法。 - 前記脂肪吸引廃液は、生理食塩水、またはリンゲル液を使用して調製される、請求項1に記載の方法。
- 前記遠心分離は、800×g以下の範囲内の速度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記遠心分離は、400×g以上の範囲内の速度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記比重による遠心分離は、370×g〜1100×gの範囲内の速度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記比重による遠心分離は、20℃における比重が1.076〜1.078g/mlである媒体を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記比重による遠心分離の媒体は、フィコール、パーコール、およびスクロースからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記比重による遠心分離の媒体は、フィコールである、請求項7に記載の方法。
- 前記収集された細胞層の比重は、比重1.050〜1.075の間の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞層の収集は、ピペットを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞層を、DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)およびそれらの混合物からなる群より選択される成分を含む培地中で培養する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記比重による遠心分離は、密度勾配遠心分離を含む、請求項1に記載の方法。
- 血球を除去する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 幹細胞を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引由来物質を得る工程;および
B)該脂肪吸引由来物質を遠心分離にかけ、脂肪組織を単離することなく細胞画分を得る工程、
を包含する、方法。 - 前記物質を、少なくとも一部の細胞が該物質から分離される条件に供する工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
- 前記条件は、細胞外マトリクスの分解のためのものである、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞外マトリクスの分解は、コラゲナーゼにより達成される、請求項15に記載の方法。
- 工程B)において、上清を除去する工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
- 前記工程B)由来の物質を濾過する工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
- 血球を除去する工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
- 前記血球を除去する工程が、血球を分解する成分を加える工程を包含する、請求項14に記載の方法。
- 幹細胞を調製するための方法であって、以下:
i)脂肪吸引由来物質を得る工程;
ii)脂肪組織を単離することなく、少なくとも一部の細胞が該物質から分離される条件に、該物質を供する工程;
iii)該物質を、遠心分離にかける工程;
iv)該物質に血球を分解する成分を加え、該物質を攪拌する工程;
v)該物質を遠心分離にかけ、ペレットを得る工程;および
vi)該ペレットから、該物質の上清を吸引する工程、
を包含する、方法。 - 前記物質を前記条件へ供する工程が、前記脂肪吸引廃液を維持する工程を包含する、請求項22に記載の方法。
- 前記脂肪吸引由来物質が、脂肪吸引廃液と脂肪とを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記工程ii)における前記条件が、コラゲナーゼを加えることを包含する、請求項22に記載の方法。
- 前記工程iii)における遠心分離が、400〜1200×gにて行われる、請求項22に記載の方法。
- 血球を分解する前記成分が、塩化アンモニウムと炭酸水素カリウムとを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記塩化アンモニウムが、前記成分中に155mMにて含まれる、請求項27に記載の方法。
- 前記炭酸水素カリウムが、前記成分中に10mMにて含まれる、請求項27に記載の方法。
- 前記工程v)における前記遠心分離が、400〜1200×gにて行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記ペレットは、幹細胞を含む、請求項22に記載の方法。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法によって調製される、幹細胞。
- CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151、およびSH3からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を発現する、請求項32に記載の幹細胞。
- CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151、およびSH3を発現する、請求項33に記載の幹細胞。
- さらに、CD31、CD45、CD117、およびCD146からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも1つを発現する、請求項33に記載の幹細胞。
- CD56を発現しない、請求項32に記載の幹細胞。
- CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135、およびCD144からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を発現しない、請求項32に記載の幹細胞。
- CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135、およびCD144を発現しない、請求項37に記載の幹細胞。
- CD49dを発現し、CD56を発現しない、請求項32に記載の幹細胞。
- 幹細胞を調製するためのシステムであって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得るための手段;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけて、細胞画分を得る手段;および
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける手段;
を含む、システム。 - 請求項40に記載のシステムであって、該システムは、以下:
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する手段、
をさらに含む、システム。 - 幹細胞を調製するためのシステムであって、以下:
A)脂肪吸引由来物質を得るための手段;および
B)該脂肪吸引由来物質を遠心分離にかけ、脂肪組織を単離することなく細胞画分を得るための手段;
を含む、システム。 - 幹細胞を調製するためのシステムであって、以下:
i)脂肪吸引由来物質を得るための手段;
ii)脂肪組織を単離することなく、該物質を、少なくとも一部の細胞が該物質から分離される条件に供するための手段;
iii)該物質を遠心分離にかける手段;
iv)該物質に血球を分解する成分を加え、該物質を攪拌する手段;
v)該物質を遠心分離にかけ、ペレットを得るための手段;および
vi)該ペレットから該物質の上清を吸引するための手段、
を含む、システム。 - 外植片を得るための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程;および
E)収集された細胞層を培養して、外植片を得る工程、
を含む、方法。 - 組織移植片を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分より収集された細胞層を培養して、組織移植片を得る工程、
を含む、方法。 - 組織移植片を調製するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程;および
E)収集された細胞層を培養して、組織移植片を得る工程、
を含む、方法。 - 組織移植片を移植するための方法であって、以下:
A)脂肪吸引廃液を得る工程;
B)該脂肪吸引廃液を遠心分離にかけ、細胞画分を得る工程;
C)該細胞画分を比重による遠心分離にかける工程;
D)赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程;
E)収集された細胞層を培養して、組織移植片を得る工程;および
F)該組織移植片を移植する工程、
を含む、方法。 - 幹細胞を調製するための脂肪吸引廃液の、使用。
- 血管内皮前駆細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、および筋細胞からなる群から選択される細胞を調製する方法であって、
請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法によって得られた幹細胞を培養する工程
を含む、方法。 - 分化細胞を調製するための方法であって、以下:
A)a)請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、
b)所望の部位に対応する分化細胞と、
を混合して混合物を得る工程;および
B)該混合物を、脂肪由来前駆細胞が分化するのに十分な条件下で培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記分化細胞は、間葉系細胞である、請求項50に記載の方法。
- 前記分化細胞は、脂肪細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞および膵細胞からなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記分化細胞への分化を促進する因子を提供する工程をさらに包含する、請求項50に記載の方法。
- 請求項50に記載の方法であって、前記混合物は、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン(IBMX)、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンD、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジブチルcAMP(dbcAMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヨードデオキシウリジン(IdU)、ヒドロキシウレア(HU)、シトシンアラビノシド(AraC)、マイトマイシンC(MMC)、酪酸ナトリウム(NaBu)、ポリブレンおよびセレニウムからなる群より選択される成分のうち少なくとも1つを含む培地中で培養される、方法。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、所望の部位に対応する分化細胞とを含む、細胞混合物。
- 前記細胞混合物は、前記幹細胞の分化を誘導するのに十分な条件に供されたものである、請求項55に記載の細胞混合物。
- 細胞移植のための組成物であって、以下:
a)請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;および
b)所望の部位に対応する分化細胞、
を含有する、組成物。 - 前記移植は、前記所望の部位において行われる、請求項57に記載の組成物。
- 前記幹細胞と、前記分化細胞との間の比率は、約1:10〜約10:1である、請求項57に記載の組成物。
- 前記幹細胞と、前記分化細胞との間の比率は、約1:2〜約2:1である、請求項57に記載の組成物。
- 前記幹細胞と、前記分化細胞との間の比率は、実質的に等量である、請求項57に記載の組成物。
- 前記分化細胞は、間葉系細胞を含む、請求項57に記載の組成物。
- 前記分化細胞は、脂肪細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞および膵細胞からなる群より選択される、請求項57に記載の組成物。
- 請求項57に記載の組成物であって、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン(IBMX)、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンD、甲状腺ホルモン、仔ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジブチルcAMP(dbcAMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヨードデオキシウリジン(IdU)、ヒドロキシウレア(HU)、シトシンアラビノシド(AraC)、マイトマイシンC(MMC)、酪酸ナトリウム(NaBu)、ポリブレンおよびセレニウムからなる群より選択される成分のうち少なくとも1つをさらに含む、組成物。
- 前記幹細胞と、前記分化細胞とは、互いに同種異系である、請求項57に記載の組成物。
- 前記幹細胞と、前記分化細胞とは、互いに同系である、請求項57に記載の組成物。
- 分化細胞の不全に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための方法であって、
A)a)請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;および
b)所望の部位に対応する分化細胞、
を含有する、組成物を提供する工程、ならびに
B)被検体に、該組成物を投与する工程、
を包含する、方法。 - 分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための医薬であって、
a)請求項1〜31に記載の方法で得られた幹細胞;
b)所望の部位に対応する分化細胞;および
c)薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、医薬。 - a)請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、b)所望の部位に対応する分化細胞との混合物の、分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または異常状態を処置または予防するための医薬の調製のための、使用。
- 美容状態を処置または改善するための方法であって、以下:
A)a)請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;および
b)所望の部位に対応する分化細胞、
を含有する、組成物を提供する工程;ならびに
B)被検体に、該組成物を投与する工程、
を包含する、方法。 - 美容状態を処置または改善するため医薬であって、以下:
a)請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞;
b)所望の部位に対応する分化細胞;および
c)薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、医薬。 - a)請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法で得られた幹細胞と、b)所望の部位に対応する分化細胞との混合物の、美容状態を処置または改善するための医薬の調製のための、使用。
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