CN108410800B - 一种培养人羊膜上皮细胞的培养基及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种培养人羊膜上皮细胞的培养基及应用，该培养基由以下四种组方组成：（1）改良的MCDB153基础培养基；（2）血清替代组合物；（3）细胞生长因子组合物；（4）一种小分子物质。本发明所提供的培养基不含血清或血浆（包括动物或人血清或血浆），因此，使用该体系培养人上皮细胞，在细胞治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病的风险。此外，该培养基组方成分明确，避免了因使用血清或血浆或血小板等血制品引起的批次间差异。该培养基适于人上皮细胞包括羊膜上皮细胞的培养，在组织工程等研究中应用前景广阔。

Description

一种培养人羊膜上皮细胞的培养基及应用
技术领域
本发明属于细胞与组织体外培养领域，涉及一种培养人羊膜上皮细胞的培养基及应用，使用该培养基扩增培养的多能干细胞，尤其适用于临床试验研究。
背景技术
干细胞是指具有多向分化能力和潜在无限自我更新能力的细胞。在胚胎发育过程中，出现于受精卵至桑椹胚阶段的细胞，具有形成一个完整个体能力，称之为全能干细胞。随着胚胎发育的过程进入囊胚阶段，出现由囊泡壁和内细胞团组成的囊泡组织。内细胞团发育成一个个体，分化为个体所需的所有组织细胞，称为胚胎干细胞，属于多能干细胞。囊泡壁发育成胎盘与脐带组织，是胚胎的附属组织。研究表明，胚胎干细胞在体内外可以分化为个体的所有组织细胞，因此，是再生医学重点研究对象之一。然而，胚胎干细胞涉及的法律、伦理及安全性问题（致瘤性），一直是其进入临床试验的一个壁垒。近年来的研究证实，来源于胎盘羊膜的上皮细胞（human amnion membrane epithelial cells, hEC），具有多向分化能力，在体外特殊诱导环境下，可以形成心肌细胞、骨细胞、胰岛、肝细胞、神经元等三胚层细胞，且其免疫原性低，具有抗炎性反应的能力，因此，也称为胎盘多能干细胞。此外，hEC没有端粒酶活性，因此，移植后发生体内肿瘤的可能性极低（Miki T, et al. Stemcell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells 2005; 23:1549-59）。因此，这种特殊来源的成体干细胞，在再生医学领域可能具有更广泛的应用价值（Parolini O, et al. Concise review: Isolation and characterization of cellsfrom human term placenta: Outcome of the first international Workshop onPlacenta Derived Stem Cells. Stem Cells 2008; 26:300-11.）。
将hEC应用于临床试验，首先面临两个技术难题：（1）使用无血清培养基进行有效扩增；（2）扩增过程中保持hEC的表型。目前，培养扩增hEC的标准培养基是含10-20%胎牛血清的DMEM/F12，胎牛血清和DMEM/F12基础培养基都已经商业化，是开展hEC实验室研究常用的培养体系。但是，胎牛血清成分复杂，批次间差异大，临床应用有导致人畜间疾病传播及引起免疫反应的风险。然而，目前商业化的上皮细胞无血清培养基扩增hEC的效果，远远不及这种含血清的体系。此外，由于体外培养的hEC可自分泌TGF-beta，从而使培养中的EC在上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）效应作用下，转化为间充质细胞（Alcaraz A, et al. Autocrine TGF-β induces epithelial to mesenchymaltransition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplant 2013; 22:1351-67），目标细胞比例逐步下降。可见，使用无血清培养基有效扩增hEC，是促使其进入临床试验的基础技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种无血清、化学成分清晰的培养基，适用于体外扩增培养人羊膜上皮细胞（或称胎盘多能干细胞）。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所指的无血清培养基，由以下组方组成：（1）经过改良的MCDB153基础培养基；（2）胰岛素、转铁蛋白等血清替代物组合；（3）促上皮细胞增殖的细胞因子；（4）抑制EMT的小分子物质。
所述（1）经过改良的基础培养基MCDB153，是在商售MCDB153培养基（Sigma，USA，Cat.No.M7403）基础上，添加了D-缬氨酸和微量元素钼。
所述改良的MCDB153基础培养基是在MCDB153培养基基础上，添加了20-200mg/LD-缬氨酸和1-20nM钼。推荐用量，D-缬氨酸用量为45-150mg/L；钼含量2.5-7.5nM。最佳用量，D-缬氨酸用量浓度为50mg/L；钼用量浓度为5nM。
上述所指微量元素是钼，可添加各种钼盐，如(NH4)6Mo7O24 • 4H2O。人类的四种酶活性依赖钼，包括亚硫酸盐氧化酶、黄嘌呤氧化还原酶、醛氧化酶和线粒体偕胺肟还原酶。MCDB153作为一种上皮细胞无血清培养基基础培养基，四水钼酸铵含量仅为1.24μg/L，相当于1nM。黄嘌呤氧化还原酶较多表达于上皮细胞内以及细胞膜表面，是产生活性氧和活性氮的关键物质。它在维系上皮细胞生物学特性中的具体作用尚不清楚，然而，有研究发现，该酶活性是促进皮肤伤口愈合的因素之一。钼盐可以激活黄嘌呤氧化还原酶。在正常人血液中，钼的含量为0.50 -15.73μg /100 ml,相当于52-165nM（Molybdenum levels inhumans. Data from website of International Molybdenum Association）。鉴于培养hEC的常用培养体系为含10-20%血清的DMEM/F12。此外，DMEM/F12中含四水钼酸铵6.18μg/L。因此，本发明的基础培养基在MCDB153的基础上添加了钼盐，如钼酸铵（Sigma, USA, CatNo. 431346）。可应用浓度范围是1-20nM，推荐用量为2.5-7.5nM，最佳用量为5nM。
L-缬氨酸是哺乳类动物的一种必需氨基酸，D-缬氨酸主要存在于放线菌。有资料表明，D-缬氨酸能够抑制成纤维细胞的增殖，从而维系内皮细胞的形态及功能（PiccianoPT, et al. Effects of D-valine on pulmonary artery endothelial cellmorphology and function in cell culture. Exp Cell Res. 1984; 151:134-47）。MCDB153培养基中含有L-缬氨酸，不含D-缬氨酸。在羊膜上皮细胞的培养过程中，也存在成纤维细胞污染的问题，因此，本发明使用D-缬氨酸在于干扰成纤维细胞的正常代谢，抑制成纤维细胞的增殖，从而提高目的细胞（上皮细胞）的纯度。D-缬氨酸可购于Sigma（美国，货号V1255），用量为20-200mg/L，推荐用量为45-150mg/L，推荐的适宜浓度为50mg/L。
组份（2）为胰岛素、转铁蛋白等血清替代物组合。这些组合包括胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、白蛋白、脂类混合物、肾上腺糖皮质激素等。这些成分是无血清培养基必需的成分，用量固定；
具体包括：人白蛋白（重组或天然）用量0.5-5g/L，适宜用量1-2.5g/L，最佳浓度2g/L；人胰岛素（重组或天然），美国Sigma公司产品，用量1-10μg/ml，适宜用量2.5-7.5μg/ml，最佳用量5μg/ml；人转铁蛋白（重组或天然），用量1-10μg/ml，适宜用量2.5-7.5μg/ml，最佳用量5μg/ml；乙醇胺，用量范围为0.5-10μl/L，适宜用量为1-5μl/L，最佳用量为2μl/L；O-磷酸乙醇胺，用量范围为1-50mg/L，适宜用量为10-25mg/L，最佳用量为15mg/L；1mL/L脂类混合物（即每升培养基中添加1mL的脂类混合物），可商购或自制，含胆固醇、脂肪酸、维生素E等；10-5M-10-7M氢化可的松琥珀酸钠或地塞米松或其他肾上腺皮质激素，最佳用量为为10-6M；甲状腺素3（T3）或其钠盐，适宜用量为0.5-5ng/ml，推荐用量为1-3ng/ml，最佳浓度为1.5ng/ml。
组份（3）为细胞生长因子组合。该组合包括：（A）人表皮生长因子（EGF）（重组或天然），用量为20-200ng/mL，推荐用量为25-100ng/mL，最佳浓度为50ng/mL；（B）人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,重组或天然），用量为0.1-100ng/mL，推荐用量为2.5-20ng/mL，最佳浓度为10ng/mL；（C）人催乳素（prolactin，重组或天然），用量为1-1000pg/mL，推荐用量为50-200pg/mL，最佳浓度为100pg/mL；（D）人转化生长因子-alpha（TGF-alpha，重组或天然），用量为20-200ng/mL，推荐用量为25-100ng/mL，最佳浓度为50ng/mL。这些细胞因子均可以促进人上皮细胞增殖。
组份（4）为一种小分子物质，即孕酮（progesterone），具体用量为25μM。
本发明的优点在于：（1）本发明提供的是一种无血清培养基，使用该培养基培养细胞，避免了因使用异种血清可能引起的人畜共患病以及免疫反应的风险；（2）本发明所提供的培养基化学成分明确，避免使用血清或血浆等因批次之间的差异引起的实验不确定性，不但适于信号转导等基础研究，也适于临床试验；（3）本发明使用了一种药物级别的小分子物质，使干细胞在传代过程中更好地保持了细胞的“干性（stemness）”，亦即，保留了细胞的潜在分化能力，从而可以在大规模扩增后，获得具有实用价值的干细胞。
附图说明
图1为不同培养基培养的人羊膜多能干细胞（上皮细胞）的形态。将人胎盘羊膜上皮细胞消化后，接种于含胎牛血清（FCS）的DMEM/F12或上皮细胞无血清培养基（Epi-SF）中，24小时（24hr）后可见部分细胞贴壁。48小时（48hr）换液去除非贴壁细胞。第5天可见卵圆形的贴壁细胞形成细胞簇（day5）。第一代（P1）时，细胞形态均一。第三代（P3）时，血清组出现梭形细胞，但形态上仍以卵圆形细胞为主。标示：20μm。
图2为不同培养基培养的人羊膜多能干细胞（上皮细胞）表面分子表达分析结果。在含10%胎牛血清（FCS）及无血清（Epi-SF）条件下培养至第3代时，收集细胞，进行流式细胞学分析。SSC：侧向角，表示细胞颗粒度。
图3为不同培养体系人羊膜多能干细胞（上皮细胞）增殖特点。将培养至第3代的人羊膜上皮细胞，分别悬浮于含1%FCS的DMEM/F12（Negative）、含10%FCS的DMEM/F12（positive）及无血清培养基（Epi-SF）中，培养72小时后MTT实验测定细胞活力。纵坐标：OD值。横坐标：实验分组。
具体实施方式
下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。
配制无血清培养基：按照附表1所示，配制无血清培养基。
表1. 实施例使用的无血清培养基的配方
实施例1
实验一 人羊膜多能干细胞（上皮细胞）的分离培养及形态学观察
1. 配制无血清培养基：按照表2所示，配制无血清培养基。
表2. 实施例使用的无血清培养基的配方
2.胎盘羊膜上皮细胞的分离
标本：人胎盘取自正常分娩出生后的胎儿，人体标本的使用符合中国人民解放军空军总医院伦理委员会制订的，关于人体标本应用于实验研究的规定。
分离步骤：按照文献报道的方法进行人羊膜上皮细胞的分离（Murphy S, et al.Amnion Epithelial Cell Isolation and Characterization for Clinical Use.Current Protocol Stem Cell Biology 2010; 13:1E.6.1-1E.6.25）。简言之，剥离羊膜组织，生理盐水洗涤5次，剪成长度为5cm左右的条状，加入0.05%胰蛋白酶消化15分钟。弃消化细胞，将组织块转移至一个新的容器，0.05%胰蛋白酶消化四次，每次30分钟。将消化获得的细胞离心，悬浮于上述无血清培养基或含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。计细胞数。
3. 羊膜上皮细胞的培养及观察
将上述细胞按照100,000个/cm2底面积，接种于直径为100mm的培养皿中。37°C，5%CO2，95%相对湿度条件下培养48小时。之后去除非贴壁细胞，换用新鲜的无血清培养基或含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，继续72小时。此时，贴壁细胞密度多接近80%。普通显微镜下观察并照相。
4. 传代：去除培养基，生理盐水洗涤2次。加入0.25%胰酶4ml/皿消化1分钟，消化过程中轻轻晃动培养瓶，吸除胰酶溶液。再加入4ml 0.25%胰酶消化2分钟，消化过程中轻轻晃动培养瓶，吸除胰酶溶液。再加入4ml 0.25%胰酶消化10分钟，消化过程中轻轻拍打培养瓶瓶壁，镜下观察到贴壁细胞呈圆形并从培养皿底部脱落，立即加入8ml完全培养基终止消化，用10ml移液管吸取细胞悬液转移到新的离心管中，再加入10ml生理盐水洗涤吹打培养瓶，一并转入50ml离心管中，吹打混匀，取50ul细胞悬液计数。700g，离心5分钟，去上清。将细胞悬浮于上述无血清培养基或含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。
5. 按照10000个/cm2底面积接种于直径为100mm培养皿中。继续传代至第三代。普通光学显微镜下观察并照相。
6. 结果：结果如附图1所示。可见两种培养基培养的细胞，形态呈卵圆形，簇状生长。细胞密度均达到80%左右。
7. 结果解释：两种培养基培养的细胞，为上皮细胞形态，纯度较好，未见其它形态细胞。表明第一代细胞形态单一，纯度较高。传代至第三代时，无血清培养基细胞形态仍均一，而含10%胎牛血清组出现成纤维样细胞（梭形细胞）。
实验二、不同培养基培养的人胎盘羊膜多能干细胞表面分子分析
1. 标本：人胎盘取自正常分娩出生后的胎儿，人体标本的使用符合中国人民解放军空军总医院伦理委员会制订的，关于人体标本应用于实验研究的规定。
2. 细胞分离、培养及扩增：按上述方法进行。传代至第三代时收集细胞进行抗体标记及流式细胞学分析。
3. 流式细胞学分析：收集细胞，加入FITC标记的小鼠源抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）和PE标记的小鼠抗人CD73单克隆抗体（美国BD公司产品），室温避光反应20分钟。PBS洗涤后，FACSCalibur收集至少10000个数据点。FlowJo7.6.1软件分析数据。
4. 结果及解释： 结果如图2所示，使用含血清的DMEM/F12培养3代后，只有部分细胞表达EpCAM（上皮细胞特异性标记），大部分表达CD73（间充质细胞特异性标记），表明在血清条件下培养，部分细胞转化为间充质细胞。然而，在无血清条件下，大部分细胞仍表达EpCAM，少部分细胞表达CD73，表明该条件下维系了细胞原有的表型。
实验三、不同培养条件下细胞增殖情况（MTT实验）
1.材料与试剂
（1）细胞：同上所述使用无血清培养基培养的人羊膜多能干细胞，第三代，来源于健康人。
（2）MTT和DMSO均为Sigma公司产品。
（3）无血清培养基按上述表格描述的方法制备。以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基为阳性对照，以含1%胎牛血清的DMEM/F12为阴性对照。
2.实验方法
（1）胰蛋白酶消化法收集第3代人羊膜上皮细胞，悬浮于无血清培养基中，计细胞数。调整细胞密度至2.0×107/ml。
（2）取三个1.5mlEP管，分别标示为1、2和3。按照下述表格分别加入不同的培养基。
表3. MTT实验分组
（3）将细胞悬液转移至96孔板，每孔含20000个细胞，总体积为100µl。将细胞置于37℃，5%CO2条件下培养72小时，之后，每孔加入MTT（1mg/ml）10µl，继续培养4小时。去除培养上清，每孔加入二甲基亚砜100µl。酶联免疫仪上测定每孔光密度值，测定波长为490nm。
（4）取每组OD值的平均值及标准差。t检验分析平均值差异显著性。
3、实验结果及分析
结果如图3所示。利用无血清体系培养组，OD值为1.31885±0.17225；含10%FCS的DMEM/F12（阳性对照组）为1.17866±0.14879；含1%FCS的DMEM/F12组（阴性对照组）为0.51143±0.07842。统计学分析显示，与阴性对照组比较，无血清培养基组和阳性对照组OD值显著高于阴性对照组（P<0.001）；无血清培养基组OD值与阳性对照组OD值无显著差别（P=0.08）。结果提示，无血清培养基与含10%FCS的DMEM/F12（标准对照）比较，两者促上皮细胞增殖活性相当。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于：该培养基由以下四种组方组成：
（1）改良的MCDB153基础培养基；
（2）血清替代组合物；
（3）细胞生长因子组合物；
（4）小分子物质；
所述改良的MCDB153基础培养基是在MCDB153培养基基础上，添加了20-200mg/L D-缬氨酸和1-20nM钼；
所述血清替代组合物包括：0.5-5g/L人白蛋白、1-10μg/mL人胰岛素、1-10μg/mL人转铁蛋白、0.5-10μL/L乙醇胺、1-50mg/L O-磷酸乙醇胺、1mL/L脂类混合物、10-7M -10-5M肾上腺皮质激素、0.5-5ng/mL甲状腺素T3或其钠盐；
所述细胞生长因子组合物包括：0.1-100ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子；20-200ng/mL人转化生长因子-alpha；20-200ng/mL人表皮生长因子；1-1000pg/mL人催乳素；
所述小分子物质是孕酮，用量为25μM。
2.根据权利要求1所述的培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于：D-缬氨酸用量为45-150mg/L；钼含量2.5-7.5nM。
3.根据权利要求1所述的培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于：D-缬氨酸用量浓度为50mg/L；钼用量浓度为5nM。
4.根据权利要求1所述的培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于：所述血清替代组合物包括：2g/L人白蛋白、5μg/mL人胰岛素、5μg/mL人转铁蛋白、2μL/L乙醇胺、15mg/L O-磷酸乙醇胺、1mL/L脂类混合物、10-6M肾上腺皮质激素、1.5ng/mL甲状腺素T3或其钠盐。
5.根据权利要求1所述的培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于：所述细胞生长因子组合物包括：10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子；50ng/mL人转化生长因子-alpha；50ng/mL人表皮生长因子；100pg/mL人催乳素。
6.权利要求1-5任一项所述的培养基在人羊膜上皮细胞培养中的应用。
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