CN1269956C - 用于皮肤角质细胞体外培养和扩增的无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于皮肤角质细胞体外培养和扩增的无血清培养基。本发明通过添加氨基酸、维生素、激素、生长因子、微量元素和抗氧化剂，可在一定程度上促进细胞增殖，延缓角质细胞的衰老，使之在体外扩增更多的倍数。利用本发明的培养基对角质细胞进行原代培养和传代培养，不需要滋养层细胞，也无需在培养瓶底部预铺胶原蛋白等细胞外基质来帮助角质细胞贴壁和生长。

Description

用于皮肤角质细胞体外培养和扩增的无血清培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养基，尤其涉及一种用于从皮肤组织分离得到的表皮角质细胞体外培养和扩增的化学成分明确的无血清培养基。

背景技术

皮肤烧伤患者和其它皮肤病患者以前都是通过自体皮肤移植或尸体皮肤移植，皮肤来源十分有限。随着生物技术的发展，目前可以用组织工程的方法体外构建人工皮肤，从而解决皮肤来源的问题。

皮肤组织构建需要大量的种子细胞，其中表皮角质细胞的体外培养是一个难点。角质细胞是一种定向干细胞，在体外培养过程中很容易衰老并分化，从而影响细胞增殖；其次由于生长环境的改变，从皮肤组织分离得到的角质细胞在体外失去了体内的三维环境，失去了多种细胞的支持和协同作用，加之目前的体外培养环境很难模拟细胞体内生存环境，因此难以获得大量种子细胞。所以在体外培养过程中如何调节体外培养环境、延缓角质细胞的分化和衰老，使之在体外扩增更多的倍数是角质细胞体外大规模扩增需要解决的“瓶颈”问题。

自1975年Rheinwald和Green体外培养角质细胞获得成功以来，研究和开发了一系列用于角质细胞体外培养和扩增的培养系统和培养基，但这些培养系统大都需要以3T3细胞作为滋养层[Rheinwald，J.G.，et al.，Nature，265，p.421-424(1977)]，或在培养皿底部预铺胞外基质[Gilchrest，J.CellPhysiol.112，p.197-206(1982)]，而培养基中往往要添加血清和化学成分不明确的蛋白(如：牛脑垂体抽提物、霍乱毒素等)[Johnson，E.W.，et al.，Invitro Cell.Dev.Biol.28(A)，p.429-435(1992)；Auger，F.A.，et al.，In vitro Cell.Dev.Biol.31，p.432-439(1995)]，以支持和刺激角质细胞贴壁、生长以及保持正常的细胞形态和蛋白分泌能力。但是用这些培养系统和培养基培养的角质细胞在基础研究及临床应用中存在种种问题：培养基中添加血清，一方面造成成纤维细胞的污染，影响角质细胞生长，加速角质细胞分化，另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，对细胞生物学、毒理学、病理学等基础研究(如：研究细胞因子、药物对角质细胞生长和分化的影响等)形成干扰；同时采用上述培养系统和培养基构建的人工皮肤组织进行体内移植，可能引起免疫反应或引入不安全因素(如：病毒或其它病原体等)，因此需要开发化学成分明确的无血清培养基。

为了开发一种无需添加不确定成分的补充物，且能支持角质细胞克隆形成、生长的培养基，人们研究了各种基础培养基、微量元素、多种激素和生长因子等对角质细胞生长的影响，在199、F12等培养基的基础上，通过优化克隆生长来调节培养基的组成，构成了新的培养基：MCDB151，在此培养基中补充1.0mg/mL胎牛血清蛋白(大分子蛋白)后能支持人的表皮角质细胞生长，但饲养层技术对于原代培养仍是必需的，且传代培养的克隆形成率较低[Peehl，D.M.，et al.，In Vitro，Vol.16(6)，pp.526-538(1980)]。

此后，文献[Tsao，M.C.，et al.，J.Cell.Physiol.，110，pp.219-229(1982)]报道，在MCDB151中添加微量元素，发明了一种新的培养基——MCDB152，在这种新的培养基中进一步添加了表皮生长因子、转铁蛋白、氢化可的松、乙醇胺、磷酸乙醇胺、黄体酮、镁和锶。乙醇胺和磷酸乙醇胺的作用是代替牛脑垂体提取物。原代培养时，角质细胞被转移到含有添加剂的MCDB152中，虽然培养基中没有不确定的成分，角质细胞还是能生长，但不能进一步传代，而且克隆形成率很低，只有2％左右，得到的细胞无法冷冻并复苏。另外在原代培养时仍然要求使用滋养层细胞。继MCDB152后，文献[Boyce，S.C.，Ham，R.G.，J.Invest.Dermatol.81，pp.33S-40S(1983)；J.Tiss.Cult.Meth.9，pp.83-93(1985)]披露了由Boyce和Ham进一步改善其中的钙离子浓度，并正式命名为MCDB153培养基，但是MCDB153也不是一个优秀的角质细胞无血清培养基，其局限性表现在繁殖和扩增细胞的能力有限，如果角质细胞在MCDB153中生长至完全汇合，则将快速丧失其传代能力。

由于在无血清培养基组成方面存在严重不足，因此在利用这些培养基培养角质细胞时，不得不添加透析过的血清、脑垂体抽提物、霍乱毒素或使用生长基质等，难以真正实现角质细胞体外无血清培养，细胞在培养过程中容易发生老化，从而影响细胞的大量扩增。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种用于皮肤角质细胞体外培养和扩增的无血清培养基，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的构思：

一种培养基是由各种营养成分包括氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素、激素、生长因子、微量元素等众多成分组成，在培养过程中任何一种营养物质的耗竭都会限制细胞生长，情况严重时会导致细胞死亡，但是如果营养物质过剩，在培养环境中也会积累大量副产物，对细胞产生毒性，并引起细胞死亡，因此要求培养基中各种营养成分必须均衡，以满足细胞生长、代谢和维持功能的需求。

角质细胞属于一种干细胞，在体外培养过程中很容易分化和衰老，影响细胞大量扩增，培养基中的各种成分对细胞老化有很大影响，因此在角质细胞培养基中添加一些延缓细胞老化、促进细胞增殖的成分，可延长细胞在体外的培养时间并提高增殖能力。例如：氧化损伤是导致细胞衰老的一个重要因素，在现有的角质细胞培养基中都没有添加抗氧化剂[US Pat.No.5712163，US Pat.No.4940666]，本发明通过添加抗氧化剂，一定程度上延缓了角质细胞的衰老，使之在体外扩增更多的倍数。

本发明用于皮肤角质细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于此无血清培养基为一种水溶液，包括基础培养基和以下的组分：

基础培养基            12-18g/L

组氨酸                0.1-1.0mmol/L

异亮氨酸              0.1-0.6mmol/L

色氨酸                0.05-0.3mmol/L

苯丙氨酸              0.3-0.6mmol/L

赖氨酸                0.7-1.2mmol/L

甲硫氨酸              0.05-0.3mmol/L

酪氨酸                0.3-0.6mmol/L

角质细胞生长因子      20-200ng/L和/或表皮生长因子5-20

ng/L

泛酸盐                0.02-0.04mmol/L

氯化胆碱              0.1-0.5mmol/L

叶酸                  0.01-0.03mmol/L

肌糖                  0.1-0.4mmol/L

烟酰胺                0.05-0.5mmol/L

维生素B6              0.02-0.06mmol/L

核黄素                0.001-0.01mmol/L

硫胺                  0.01-0.03mmol/L

胰岛素                1-20μg/L

转铁蛋白              1-20μg/L

乙醇胺                0.01-0.05mmol/L

磷酸乙醇胺            0.01-0.05mmol/L

氯化锶                1-5mmol/L

牛血清白蛋          5-20μg/L

氢化可的松          0.1-1μg/L

三碘甲状腺胺        10-40pmol/L

氯化钙              0.03-0.5mmol/L

氯化镁              5-10mmol/L

抗氧化剂            适量

青霉素              50-200U/L

链霉素              50-200U/L

所说的基础培养基包括MCDB153、无钙DMEM或无钙DMEM与Ham′s F12以体积比为1∶0.3～3的混合物。

所说的抗氧化剂包括巯基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或过氧化氢酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亚硒酸钠0.01-0.05mmol/L；

所说的MCDB153在文献[Boyce，S.C.，Ham，R.G.，J.Invest.Dermatol.81，pp.33S-40S(1983)；J.Tiss.Cult.Meth.9，pp.83-93(1985)]和SIGMA公司的产品目录中已有公开报道；

所说的无钙DMEM在SIGMA公司的产品目录中已有公开报道；

所说的Ham′s F12在SIGMA公司的产品目录中已有公开报道；

本发明的培养基的制备方法是十分容易的，将所述及的组分在常温下搅拌，溶解混合均匀，经0.2μm过滤膜过滤除菌后，即可用于角质细胞培养。

利用本发明的培养基对角质细胞进行原代培养和传代培养，由于添加氨基酸、维生素、激素、生长因子、微量元素和抗氧化剂，不需要滋养层细胞，也无需在培养瓶底部预铺胶原蛋白等细胞外基质来帮助角质细胞贴壁和生长，同时在一定程度上促进角质细胞增殖，延缓细胞衰老，使之在体外扩增更多的倍数。

附图说明

图1为原代培养至汇合角质细胞。

图2比较了鼠角质细胞在本发明的无血清培养基和传统培养基中的生长曲线。

具体实施方式

                        实施例1

以MCDB153作为基础培养基，其组分如下：(以1L计)

MCDB153                 17.61g

组氨酸                  0.3mmol

异亮氨酸                0.6mmol

色氨酸                  0.2mmol

苯丙氨酸                0.3mmol

赖氨酸                  0.7mmol

甲硫氨酸                0.2mmol

酪氨酸                  0.3mmol

氯化钙                  0.1mmol

氯化镁                  5mmol

角质细胞生长因子        100ng

泛酸盐                  0.021mmol

氯化胆碱                0.171mmol

叶酸                    0.024mmol

肌糖                    0.211mmol

烟酰胺                  0.082mmol

维生素B6                0.049mmol

核黄素                  0.003mmol

硫胺                0.03mmol

牛胰岛素            5μg

转铁蛋白            10μg

乙醇胺              0.05mmol

氯化锶              1mmol

牛血清白蛋白        10μg

氢化可的松          0.1μg

三碘甲状腺胺        40pmol

巯基乙醇            0.05mmol

青霉素：            100U

链霉素：            100U

将上述组分溶解在1L水中，搅拌混合，即为本发明所说的培养基。经0.2μm过滤膜过滤除菌后，可用于角质细胞培养。

                      实施例2

取新生1天的SD大鼠皮肤或人的包皮，剪成1cm²左右的皮肤块，用含有200U/mL庆大霉素的PBS清洗3遍，75％酒精清洗2遍，再用PBS清洗2遍。将皮肤组织加入到200U/mL的中性蛋白酶中，4℃消化18hr，使真皮和表皮分离，然后将表皮剪碎，用0.025％的胰酶/0.02％EDTA共6mL作用5min，2000rpm离心5min，并加10mg/mL大豆胰酶抑制剂2-3mL中和胰酶活性。150目筛网过滤，除去皮肤碎块。2000rpm离心5min，倒去上清，PBS清洗2遍，加入实施例1的角质细胞无血清培养基。细胞接种量为2×10⁴cells/cm²，每个25cm²的培养瓶中加培养基5mL，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每三天换液一次。角质细胞经7-10天长满培养瓶底部70％-80％后，可进行传代培养。附图1是利用本发明的无血清培养基培养原代角质细胞至汇合的照片。

                       实施例3

原代培养后的角质细胞加3mL 0.025％胰酶/0.02％EDTA进行消化，当细胞变圆、脱落后2000rpm离心5min，弃消化液，加入2-3mL 10mg/mL大豆胰酶抑制剂中和胰酶活性。2000rpm离心5min后倒去上清，PBS清洗两遍，以2×10⁴cells/mL接种量接种，每个培养瓶加入本发明所涉及的无血清培养基5mL，进行传代培养。附图2比较了鼠角质细胞在本发明的无血清培养基和传统培养基中的生长曲线。本发明的无血清培养基采用实施例1的培养基。

                       实施例4

角质细胞是一种分化能力比较强的细胞，其分化过程分成多个阶段，一般把角质细胞的交联衣壳蛋白(Cross-linked Envelope，CE)的形成认为是其分化的最终阶段。用0.25％(w/v)胰酶溶液消化方瓶中培养的细胞，PBS清洗后计细胞数，然后离心弃上清液，加入5mL含有1％十二烷基硫酸钠(SDS)、20mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的PBS溶液，90℃水浴10分钟，离心，计衣壳蛋白数。角质细胞衣壳蛋白比例＝(衣壳蛋白个数/总的细胞数)×100％。衰老的角质细胞可以通过β-半乳糖苷酶染色阳性来判别。在每代的培养末期，细胞用PBS缓冲液洗两遍，然后在室温下用3％的福尔马林固定3 5分钟。再用PBS缓冲液和双蒸水清洗，加入新鲜配制的SA β

半乳糖苷酶染色液：1mg/mL X-Gal，40mM柠檬酸，12mM磷酸钠，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，150mM氯化钠，2mM氯化镁，在37℃下过夜。计数细胞中蓝色细胞的比例，每个样品中最少计数700个细胞，衰老细胞的比例就是蓝色细胞占总细胞量的比例。附表1比较了人皮肤角质细胞在实施例1的无血清培养基和传统培养基中的分化和老化情况。

表1.人皮肤角质细胞在本发明的无血清培养基和传统培养基中的分化和老化情况

培养基	衰老细胞比例(％)	分化细胞比例(％)
			传统的无血清培养基实施例1的培养基	48±533±3	39±128±2

传统的无血清培养基采用[Yang，E.K.，et al.，Artificial Organs，24(1)，pp7-17(2000)；Hansbrough，J.F.，Epidermal Cells.In：Ricordi，C.，eds.Methods in cell transplantation.Austin：R.G.Landes Company Press，pp111-121(1995)]文献公开的角质细胞无血清培养基。

Claims (1)

1.用于皮肤角质细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于为一种水溶液，包括基础培养基和以下组分：

基础培养基                12-18g/L

组氨酸                    0.1-1.0mmol/L

异亮氨酸                  0.1-0.6mmol/L

色氨酸                    0.05-0.3mmol/L

苯丙氨酸                  0.3-0.6mmol/L

赖氨酸                    0.7-1.2mmol/L

甲硫氨酸                  0.05-0.3mmol/L

酪氨酸                    0.3-0.6mmol/L

角质细胞生长因子20-200ng/L    和/或表皮生长因子5-20ng/L

泛酸盐                    0.02-0.04mmol/L

氯化胆碱                  0.1-0.5mmol/L

叶酸                      0.01-0.03mmol/L

肌糖                      0.1-0.4mmol/L

烟酰胺                    0.05-0.5mmol/L

维生素B6                  0.02-0.06mmol/L

核黄素                    0.001-0.01mmol/L

硫胺                      0.01-0.03mmol/L

胰岛素                    1-20μg/L

转铁蛋白                  1-20μg/L

乙醇胺                    0.01-0.05mmol/L

磷酸乙醇胺                0.01-0.05mmol/L

氯化锶                    1-5mmol/L

牛血清白蛋白                  5-20μg/L

氢化可的松                    0.1-1μg/L

三碘甲状腺胺                  10-40pmol/L

氯化钙                        0.03-0.5mmol/L

氯化镁                        5-10mmol/L

抗氧化剂                      适量

青霉素                        50-200U/L

链霉素                        50-200U/L

所说的基础培养基为MCDB153；

所说的抗氧化剂选自巯基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或过氧化氢酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亚硒酸钠0.01-0.05mmol/L。

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