JP2023520379A - 機械的方式による生体組織を構成している組織及び細胞分離方法。 - Google Patents
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Abstract
本発明は、機械的方式による組織及び細胞分離方法に関し、より具体的には、脂肪組織を準備するステップと、前記脂肪組織を希釈液で希釈して脂肪組織混合液を製造するステップと、前記脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を微細化するステップと、微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を分離するステップを含む機械的方式による組織及び細胞分離方法に関する。
Description
本発明は、機械的方式により生体組織を構成している様々な組織及び細胞を分離する方法に関する。
生体組織は、再生治療及び美容目的にして使用できる様々な組織、細胞、物質が含まれており、これを分離するための様々な方法が利用されている。特に、脂肪組織は、一般に酵素を用いて組織を分解し遠心分離を行う方法が幅広く使用されているが、適切な医療用酵素がなく、使用される酵素に毒性があって酵素を用いて分解された脂肪組織から取得された物質の安全性に対する論議が行われている。ここで、酵素を使用することなく、脂肪組織から再生治療及び美容目的にして使用できる物質を取得するための様々な試みがある。例えば、アメリカ公開出願は、濾過方法及び装置（ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ）を開示している。
本発明は、前記言及した問題点を解決するために、生体組織の微細化工程以前に希釈のような前処理工程を行い、希釈による物理的、化学的、及び電気－機械的な効果によって生体組織、特に脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）において有用な組織及び細胞及び間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）、即ち、脂肪組織由来の幹細胞が含まれている細胞の分離工程の効率を向上させ得る、機械的方式による組織及び細胞の分離方法に関する。
しかし、本発明が解決しようとする課題は、以上で言及したものなどに制限されず、言及されない更なる課題は、下記の記載によって当該の分野当業者に明確に理解できるものである。
本発明の一実施形態により、脂肪組織を準備するステップと、前記脂肪組織を希釈液で希釈して脂肪組織混合液を製造するステップと、前記脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップと、微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するステップとを含む機械的方式による組織及び細胞分離方法に関する。
本発明の一実施形態に係る前記希釈液は、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、エタノール、生理食塩水、乳酸リンゲル液、リンゲル液、均衡電解質溶液、ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）、ＰＰＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）、ＰＲＰとＰＰＰの混合液及び静脈注射溶液からなる群より選択された少なくとも１つ以上を含むことができる。
本発明の一実施形態により、前記脂肪組織混合液のうち前記脂肪組織対前記希釈液の希釈比率は、１：９９～９９：１（ｖ／ｖ）であってもよい。
本発明の一実施形態により、前記希釈液は、前記脂肪組織混合液のうち２５％（体積）～７５％（体積）であってもよい。
本発明の一実施形態により、前記脂肪組織混合液を製造するステップは、前記希釈液の希釈比率に応じて回収された組織及び細胞の単位体積当たり細胞数及び細胞密度を調節することができる。
本発明の一実施形態により、前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、カッティング、破れ、引っかき、分解、及び分離のうち少なくとも１つ以上の工程を使用することができる。
本発明の一実施形態により、前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、１０μｍ～４，０００μｍの大きさで微細化することができる。
本発明の一実施形態により、前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、前記脂肪組織混合液を順次的に、前後に反復的に、又は、この２つの方式により複数のスクリーン貫通孔を通過するように移動させることができる。
本発明の一実施形態により、前記複数のスクリーンは、異なるか又は同じ大きさの貫通孔を含み、前記複数のスクリーンは、異なるか又は同じ形態の貫通孔を含むことができる。
本発明の一実施形態により、前記複数のスクリーンは、それぞれ１０μｍ～４，０００μｍの大きさの貫通孔を含むことができる。
本発明の一実施形態により、前記複数のスクリーンは、貫通孔の大きさの順に配列され、前記貫通孔の表面、内部、又はこの２つに突出した鋭いエッジを含むことができる。
本発明の一実施形態により、前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、互いに異なる大きさを有する複数の貫通孔を有する複数のスクリーンを内部に装着したハウジング、及び前記ハウジングの両面に注射機を連結した連結口を含む装置を使用することができる。
本発明の一実施形態により、前記微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するステップは、遠心分離、振動法、及びフィルタリングのうち少なくとも１つを用いて大きさと比重に応じて分離されることができる。
本発明の一実施形態により、前記微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するステップは、脂肪組織を構成している組織と幹細胞を含む間質細胞を分離することができる。
本発明は、機械的方式により脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を分離する工程で機械的微細化の手続きを行う前に、生理食塩水、乳酸リンゲル液、リンゲル液、均衡を保った電解質溶液、ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）、ＰＰＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）、ＰＲＰとＰＰＰの混合液又は静脈注射方式で投与可能な溶液などにより脂肪組織を希釈する希釈工程を行い、このような事前希釈方式は、希釈による物理的、化学的、及び電気－機械的な効果のよりもさらに多くの脂肪組織を構成している様々な細胞、及び脂肪組織由来の間質細胞、即ち、幹細胞が豊かに含まれている細胞を分離し、分離工程の効率を向上させることができる。
以下、添付の図面を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明の説明において、関連する公知機能又は構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にすると判断される場合、その詳細な説明は省略する。また、本明細書で使用される用語は、本発明の好適な実施形態を適切に表現するために使用された用語として、これはユーザ、運用者の意図又は本発明が属する分野の慣例などによって変わり得る。従って、本用語に対する定義は、本明細書の全般にわたった内容に基づいて記載されなければならない。各図面に提示された同じ参照符号は同じ部材を示す。
明細書の全体において、いずれかの部材が他の部材「上に」位置しているとするとき、これはいずれかの部材が異なる部材に接している場合のみならず、２つの部材の間に更なる部材が存在する場合も含む。
明細書の全体において、いずれかの部分がいずれかの構成要素を「含む」とすれば、これは他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含むことをを意味する。
以下、本発明の機械的な方式による組織及び細胞を分離方法について実施形態及び図面を参照して具体的に説明する。しかし、本発明がこのような実施形態及び図面に制限されることはない。
本発明は、機械的方式による組織を構成している様々な組織及び細胞を分離方法に関し、本発明の一実施形態に係る前記分離方法は、脂肪組織を準備するステップＳ１と、脂肪組織を希釈するステップＳ２と、脂肪組織を微細化するステップＳ３、及び脂肪組織及び脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を分離するステップＳ４を含む。
本発明の一実施形態により、脂肪組織を準備するステップＳ１は、脂肪組織で幹細胞を含んで脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するための脂肪組織サンプルを準備することで、動物（魚類、哺乳類など）などで由来した脂肪組織を収集し、脂肪組織を構成している組織及び細胞分離に利用できる濃縮された脂肪組織を準備してもよい。例えば、脂肪吸引（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）、脂肪組織切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）などの希望する方式で脂肪組織を収集し、脂肪吸引物（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）又は脂肪組織を濃縮するために、デカント（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）又は遠心分離法（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）により分離した脂肪組織の最上層（ｏｉｌ）及び下層に位置する不純物を除去することができる。前記デカントは、脂肪組織が血液や水よりも軽くて吸引容器をじっと立てておけば、数分後に脂肪組織は上方に浮び上がり、その後、脂肪組織の下方にある水分や血液を分離する方法である。
本発明の一実施形態により、脂肪組織を希釈するステップＳ２は、前記脂肪組織を希釈液で希釈して脂肪組織混合液を製造するステップであり、脂肪組織の微細化工程、分離工程のような加工処理、即ち、機械的に処理する前に濃縮された脂肪組織を最終的に回収（又は、分離）する組織及び細胞混合液の量及び密度に応じて、様々なプロトコル／方法による希釈工程を行うことができる。例えば、前記希釈液の希釈比率に応じて、分離工程に使用される脂肪組織又は最終的に回収する組織及び細胞混合液の単位体積当たり細胞数及び細胞密度を調節し、脂肪組織を構成している様々な組織、細胞、及び間質細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）の分離される量を増加させることができる。
本発明の一例として、前記希釈液は、静脈注入ルート（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｒｏｕｔｅ）に適用され得る溶液であってもよく、例えば、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、エタノール、生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）、乳酸リンゲル液（ｒｉｎｇｅｒ ｌａｃｔａｔｅ）、リンゲル液（ｒｉｎｇｅｒ）、均衡電解質溶液（ｂａｌａｎｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ）又は溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）、ＰＰＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）、ＰＲＰとＰＰＰの混合液、静脈注射溶液からなる群より選択された少なくとも１つ以上を含んでもよい。即ち、機械的方式により、脂肪組織から脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を分離及び取得する工程において、任意の静脈注入ルートにより適用される生理食塩水、リンゲル乳酸、リンゲル、均衡電解質溶液、ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）、ＰＰＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）、ＰＲＰとＰＰＰの混合液、又は、溶液を用いて脂肪組織を希釈する事前希釈（ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ）は、希釈による物理的、化学的、及び／又は電気機械的な効果により脂肪組織及び脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞の分離を増加させ、脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞分離工程の効率を向上させることができる。
本発明の一例として、前記希釈液は、前記脂肪組織混合液のうち、前記脂肪組織対前記希釈液の希釈比率は、１：９９～９９：１（ｖ／ｖ）；２０：８０～８０：２０（ｖ／ｖ）、又は、５０：５０～２０：８０（ｖ／ｖ）であり、好ましくは、前記希釈液は、前記脂肪組織混合液のうち２５％（体積）～７５％（体積）であってもよい。これは、微細化工程及び分離工程に使用される装置及びシステムのボリュームにより適切に調節し、回収された細胞及び組織の希釈液に含まれている細胞数及び／又は細胞密度を調節することができる。例えば、任意の静脈注入溶液など５０％の希釈液及び５０％の脂肪組織を使用することで、機械的な処理以前に希釈が行われ、次の工程が行われる。より具体的に、１０ｃｃの注射機又は容器に５ｃｃの脂肪組織及び５ｃｃの希釈液が使用されたり、２０ｃｃの注射機又は容器に１０ｃｃの脂肪組織及び１０ｃｃの希釈液が使用されてもよい。
本発明の一実施形態により、脂肪組織を微細化するステップＳ３は、前記希釈された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している多様な組織及び細胞を微細化するステップであり、カッティング、破れ、引っかき、分解、及び分離のうち少なくとも１つ以上の工程を用いて微細化することができる。
本発明の一例として、脂肪組織を微細化するステップＳ３は、脂肪組織混合液で脂肪組織、脂肪細胞、幹細胞を含む間質細胞、生体物質などを１０μｍ～４，０００μｍの大きさで均一に微細化することができる。
本発明の一例として、脂肪組織を微細化するステップＳ３は、前記脂肪組織混合液を複数のスクリーンが内蔵されたシステム又は装置を用いて微細化してもよい。
例えば、前記複数のスクリーンは、異なるか又は同じ大きさの貫通孔を含み、異なるか又は同じ形態の貫通孔を含んでもよい。これは、様々な大きさの脂肪細胞及び間質細胞を微細化することで、分離工程の効率を向上させることができる。
例えば、前記複数のスクリーンは、それぞれ単一又は複数の貫通孔を含んでもよい。
例えば、前記複数のスクリーンは、それぞれ１０μｍ～４，０００μｍの大きさの貫通孔を含み、前記貫通孔は、球状、楕円形、多角形、及び格子状のうち少なくとも１つ以上を含んでもよい。前記の大きさは、貫通孔の直径、長さなどを意味する。
例えば、前記貫通孔の表面、内部の又はこの２つに突出した鋭いエッジを含み、これは図４に示すように、鋭いエッジを含むブレード状に突出されてもよい。
例えば、前記複数のスクリーンは、システム又は装置内で貫通孔の大きさに応じて順次配列され、貫通孔が大きい順、又は、貫通孔が小さい順に配列されてもよい。
例えば、前記脂肪組織混合液は、前記複数のスクリーンが配列されたシステム又は装置内に投入され、入口から出口に移動して順次的、前後に反復的、又は、この２つの方式で複数のスクリーンの貫通孔を通過して微細化することができる。
例えば、前記複数のスクリーンが配列されたシステム又は装置内に脂肪組織を貫通孔を通過するように移動させる反復回数は、約３～３０回であってもよい。例えば、大きい微細気孔を有するスクリーンから相対的に小さい気孔を有するスクリーン、又は、逆の順に反復してもよい。
本発明の一例として、希釈された脂肪組織から脂肪組織を構成している組織及び細胞を取得する微細化工程が行われる複数のスクリーンを装着した装置は、図１を参照して示された生体組織微細化システム１を使用することができる。生体組織微細化システム１は、第１シリンジＣ１、第２シリンジＣ２、第２カバー１６０、第１カバー１５０、ハウジング１１０、第２ロッカー１９２、及び第１ロッカー１９１を含む。生体組織微細化システム１は、鋭いエッジを有するブレード状に突出部を有する様々な大きさの貫通孔を有する複数のスクリーンを含むディスク１２０が装着されたハウジング１１０で両側の接続部との間に装着され、ハウジング１１０の両側にある接続部にそれぞれ接続されている第１シリンジＣ１及び第２シリンジＣ２を含む。第１シリンジＣ１及び第２シリンジＣ２は、それぞれ希釈された脂肪組織混合物（ＢＴ）を収容するように構成された第１容器及び第２容器を形成し、内部に圧力を印加して脂肪組織（ＢＴ）をスクリーン１２０に向かって加圧するように構成された第１プッシュロッドを含んでもよい。２つのシリンジＣ１、Ｃ２のプランジャをそれぞれ加圧し、ハウジング１１０を介して希釈された脂肪組織をスクリーンを通過するように繰り返し移動させれば、様々な大きさを有する均質の微細化された脂肪組織を取得し、これを用いて様々な大きさの均質化された微細脂肪と、その他の脂肪組織を構成している組織及び細胞を機械的に分離することができる。
例えば、前記複数のスクリーンは、１０μｍ～４０００μｍの大きさの貫通孔を有し、ブレード状にブレードが貫通孔の中央に向かって突出した形状の貫通孔を含み、２０００μｍ～３０００μｍ、１０００μｍ～２０００μｍ、５００μｍ～１０００μｍ、及び２５０μｍ～５００μｍの大きさの微細孔を有するスクリーンの順に配列されてもよい。
例えば、前記複数のスクリーンは、微細化システム１において、複数のスクリーンを含むディスク１２０は、プレート１２１及び複数のスクリーン１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ、１２２ｄ、１２２ｅを含む。プレート１２１は、第１マウント１１１に固定されてもよい。プレート１２１は、第１中心開口１２１１を含む。即ち、脂肪組織を微細化するように構成された複数の貫通孔をそれぞれ含む複数のスクリーン１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ、１２２ｄ、１２２ｅのうち第１スクリーン１２２ａを選択し、選択された第１スクリーン１２２ａで脂肪組織を微細化した後、複数のスクリーン１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ、１２２ｄ、１２２ｅのうち第２スクリーン１２２ｂを選択し、選択された第２スクリーン１２２ｂで脂肪組織を微細化するように構成することができる。ここで、複数のスクリーン１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ、１２２ｄ、１２２ｅの選択及び順序は、ユーザに応じて決定され得るため、前記で説明したスクリーンの選択及び順序に拘束されることはない。
図４を参照すると、本発明の一実施形態により複数のスクリーンを装着した装置において、前記スクリーンの構成を例示的に示したものであり、図４において、スクリーン２２０は、プレート２２１及び貫通孔２２２を含むことができる。貫通孔２２２は、プレート２２１の複数の角によって規定されてもよい。例えば、スクリーン２２０は、貫通孔２２２の第１側に形成された第１線型部２２３ａ、貫通孔２２２の第１側に形成されて貫通孔２２２の中心に向かって第１方向Ｔ１に突出する第１突出部２２４ａ、貫通孔２２２の第２側に形成された第２線型部２２３ｂ、及び貫通孔２２２の第２側に形成されて貫通孔２２２の中心に向かって第２方向Ｔ２に突出する第２突出部２２４ｂを含む。第１突出部２２４ａ及び第２突出部２２４ｂは、スクリーン２２０に対して傾斜するように配向され、スクリーン２２０を通過する脂肪組織を掻いたり破ったりするように構成してもよい。第１方向Ｔ１に突出する第１突出部２２４ａの第１延長線Ｌ１、及び第２方向Ｔ２に突出する第２突出部２２４ｂの第２延長線Ｌ２は互いにズレる位置にあってもよい。即ち、第１延長線Ｌ１及び第２延長線Ｌ２は、相互平行しなくても接しなくてもよい。第１突出部２２４ａ及び第２突出部２２４ｂは、第１カバー１５０及び第２カバー１６０のいずれか１つのカバーに向かうように第１突出部２２４ａの方向Ｔ１及び第２突出部２２４ｂの方向Ｔ２が設定され得る。
本発明の一実施形態により、脂肪組織及び脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を分離するステップＳ４は、前記脂肪組織混合液で微細脂肪と脂肪組織を構成している様々な組織及び細胞を分離するステップであり、遠心分離、デカント、振動法（ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）、フィルタリングなどを使用することができる。
本発明の一例として、遠心分離、振動法、及びフィルタリングのうち少なくとも１つを用いて、比重及び／又は大きさに応じて分離し、希望する脂肪組織及び細胞を分離することができる。一例として、前記微細化工程を経た脂肪組織混合液を遠心分離により分離工程した後、４つの層（トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）層；脂肪組織、脂肪組織と希釈液＋体液の境界層で細胞が集約された間質細胞の集約（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）層；及び希釈液、体液、幹細胞を含む間質細胞溶液層）に分離されれば、ｉ）そのうちの最下層の幹細胞を有する間質細胞溶液層及びその真上の細胞が集約された層を注射機から回収することができる。前記２つの層は、互いに混合されて適用（治療）のために準備され得る。ｉｉ）溶液のみを希望する場合、幹細胞ないし間質細胞溶液（希釈液＋体液＋間質細胞）層に呼ばれる最下溶液層が使用されてもよい。ｉｉｉ）ジェル状の最終産物のみを希望する場合、最下層（間質細胞溶液層）から２番目の層である細胞集約層（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）が回収され、この層は粘性が高いことからジェルとして用いてもよい。又は、この層は、一般の脂肪組織と直接的に混合されて使用されてもよい。又は、この層は、取得された後に希望する希釈液に希釈して使用されてもよい。
異なる例として、最終産物の最上層であるトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）層を除去することで、上部の脂肪組織が下部の全体的な間質分化（分化）（ｓｔｒｏｍａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）層、即ち、脂肪組織層以下の全ての層を示す間質細胞集約層、希釈液、体液、及び間質細胞を含む間質細胞溶液層と混合されてもよく、混合物は、細胞濃縮（ｃｅｌｌ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ）脂肪組織の移植（ｇｒａｆｔ）として使用されてもよい。
以下、実施形態に通じて本発明をより詳細に説明するが、下記の実施形態は単に説明の目的のためのものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施形態
人体において、脂肪吸引方式により収集した脂肪組織から不純物を除去し、遠心分離してから濃縮された脂肪組織を準備した。前記濃縮された脂肪組織は、表１及び表２により、希釈工程を経て図２に示す装置で４００μｍ～４、０００μｍの大きさの貫通孔を有する複数のスクリーンを用いて３０回繰り返し微細化した。微細化工程の前に、希釈工程及び希釈比率に応じて間質細胞（有核細胞）の数及び密度を分析して表１及び表２に示した。微細化工程の前に希釈工程が行われていない対照群対比有核細胞数の比率を示した。
表１及び表２に示すように、希釈液を用いて微細化工程の前に希釈する場合、間質細胞（有核細胞）の細胞数及び密度が増加し、機械的な分離工程を介して脂肪組織で間質細胞（有核細胞）の分離量が増加することが確認できる。
上述したように実施形態がたとえ限定された実施形態と図面によって説明されたが、当技術分野で通常の知識を有する者であれば、前記記載から様々な修正及び変形が可能である。例えば、説明された技術が説明された方法とは異なる順に実行されたり及び／又は説明された構成要素が説明された方法とは異なる形態に結合又は組み合せわされたり、他の構成要素又は均等物によって代替、置換されても、適切な結果を達成することができる。従って、本発明の範囲は、開示された実施形態に限定されて定められるものではなく、特許請求の範囲及び特許請求の範囲と均等なものなどによって定められるものである。
Claims (14)
- 脂肪組織を準備するステップと、
前記脂肪組織を希釈液で希釈して脂肪組織混合液を製造するステップと、
前記脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップと、
微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するステップと、
を含む、機械的方式による組織及び細胞分離方法。 - 前記希釈液は、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、エタノール、生理食塩水、乳酸リンゲル液、リンゲル液、均衡電解質溶液、ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）、ＰＰＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）、ＰＲＰとＰＰＰの混合液及び静脈注射溶液からなる群より選択された少なくとも１つ以上を含む、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記脂肪組織混合液のうち前記脂肪組織対前記希釈液の希釈比率は、１：９９～９９：１（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記希釈液は、前記脂肪組織混合液のうち２５％（体積）～７５％（体積）である、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記脂肪組織混合液を製造するステップは、前記希釈液の希釈比率に応じて回収された組織及び細胞の単位体積当たり細胞数及び細胞密度を調節する、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、カッティング、破れ、引っかき、分解、及び分離のうち少なくとも１つ以上の工程を使用する、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、１０μｍ～４，０００μｍの大きさで微細化する、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、前記脂肪組織混合液を順次的に、前後に反復的に、又は、この２つの方式により複数のスクリーン貫通孔を通過するように移動させる、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記複数のスクリーンは、異なるか又は同じ大きさの貫通孔を含み、
前記複数のスクリーンは、異なるか又は同じ形態の貫通孔を含む、請求項８に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。 - 前記複数のスクリーンは、それぞれ１０μｍ～４，０００μｍの大きさの貫通孔を含む、請求項８に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記複数のスクリーンは、貫通孔の大きさの順に配列され、
前記貫通孔の表面、内部、又はこの２つに突出した鋭いエッジを含む、請求項８に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。 - 前記脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を微細化するステップは、互いに異なる大きさを有する複数の貫通孔を有する複数のスクリーンを内部に装着したハウジング、及び前記ハウジングの両面に注射機を連結した連結口を含む装置を使用する、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するステップは、遠心分離、振動法、及びフィルタリングのうち少なくとも１つを用いて大きさと比重に応じて分離される、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
- 前記微細化された脂肪組織混合液で脂肪組織と脂肪組織を構成している組織及び細胞を分離するステップは、脂肪組織を構成している組織と幹細胞を含む間質細胞を分離する、請求項１に記載の機械的方式による組織及び細胞分離方法。
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