TWI789620B - 篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法及其用途， 所述方法包括(a)於添加一誘發化合物之前、同時或之後，將一基因轉殖斑馬魚飼養於含有一待篩選藥物之培養基內作用一段時間，另提供一控制組係為未添加待篩選藥物；以及(b)分析基因轉殖斑馬魚之游泳行為，藉以判斷待篩選藥物是否具有預防或治療聽力損傷之效果。
Description
本發明係有關於一種篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法及其用途，尤其係指藉由斑馬魚行為快速篩選具有誘導、預防或治療聽力損傷的化合物。
內耳的毛細胞(Hair cells)在聽力扮演極重要的角色，某些遺傳突變和環境因素(例如聽覺創傷、年齡和耳毒性藥物)皆會導致毛細胞功能障礙，進而導致聽力喪失，這種感覺障礙在人類常見且為不可逆的損傷。一旦受損恐無法痊癒，因此，耳毒性藥物之篩選，以及提供預防或治療聽覺毛細胞受損之藥物已成為重要課題。
在發育、形態和生理功能上，斑馬魚雖然不像人類或老鼠具有明顯特化性的耳蝸(cochlea)結構，但斑馬魚卻同時具有內耳和側線兩種機械聽覺感受(mechanosensory)器官，且其聽覺的產生機制也與人類相似，且斑馬魚和哺乳動物之間的內耳的機械感覺毛細胞(Mechanosensory hair cells)具有高度保守(highly conserved)。此外，斑馬魚的胚胎發育機制也與哺乳動物相似，因此使用斑馬於進行測試具有多項優點，例如斑馬基因體已完全解碼、體型小、飼養容易且不需太多空間、具有光週期誘發產卵且產卵數量多(每次約100~200顆)、透明的胚胎利於觀察各器官的發育時期、胚胎發育期短(約2-3天)及世代週期短(約3 個月即發育性成熟)。
目前，已有相關發明提出使用斑馬魚篩選具有耳毒性藥物之方法，例如中華民國專利公告第I433933號即揭示一種「偵測機械性感測傳導通道之離子流量之方法及篩選影響機械性感測傳導通道之藥物之方法」，主要係提供利用掃描式離子選擇電極技術(scanning ion selective electrode technique, SIET)偵測機械性之離子通道之離子流量之方法，並藉由機械性感測傳導通道的離子流量篩選具有耳毒性副作用之藥物；然，上述方法流程較繁瑣且所需設備較為昂貴。
另，中華民國專利公告第I593966號亦揭示一種「篩選誘發及預防聽力損傷藥物的方法」，其係藉由分析基因轉殖斑馬魚之聽斑與側線系統毛細胞的螢光表現量，藉以判斷待篩選藥物是否具有誘發或預防聽力損傷之效果。
另，先前亦有使用斑馬魚作為藥物篩選平台，例如中華民國專利公告第I478002號「一種篩選治療或預防帕金森氏症及其併發症之候選藥物的方法」，係使用斑馬魚的游行距離或平均游行速度篩選治療或預防帕金森氏症(Parkinson's disease)及其併發症之候選藥物；中華民國專利公告第I447275號「斑馬魚癲癇模式及其建立方法、及使用其篩選抗癲癇藥物之方法」，其係先以化合物誘發類癲癇症狀產生之斑馬魚模型，並藉此斑馬魚模型篩選抗癲癇藥物；美國專利公告第US13899297號「利用斑馬魚模型篩選藥物的方法及其篩選之化合物(Methods for drug screen using zebrafish model and the compounds screened therefrom)」，提供一種以斑馬魚近視實驗模組作為篩選治療及/或預防近視及錐狀角膜疾病之候選藥物之平台。
然而，目前仍無研究提及斑馬魚行為與聽覺毛細胞損傷之關聯，若能開發出用於篩選保護聽覺毛細胞之化合物的方法或平台，於預防醫學或保健產業上將可帶來極大效益。
本發明主要目的為提供一種篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法及其用途，其係藉由與毛細胞存活率具正相關的斑馬魚行為快速判斷待篩選藥物是否具有預防或治療聽力損傷之效果。
為了達到上述實施目的，本發明提供一種篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法，其包括下列步驟：(a)於添加一誘發化合物之前、同時或之後，將一pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚飼養於含有一待篩選藥物之培養基內作用一段時間，另提供一控制組係為未添加待篩選藥物；以及(b)分析pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚之游泳行為，藉由比較未添加待篩選藥物之控制組以判斷待篩選藥物是否預防或治療聽力損傷。
本發明亦提供一種斑馬魚游泳行為作為篩選預防或治療聽力損傷藥物之平台之用途，其中斑馬魚為pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚。
於本發明之一實施例中，pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚係為一pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚胚胎，且專一表現螢光蛋白於內耳聽斑和側線毛細胞。
於本發明之一實施例中，游泳行為之分析包括：先將每一pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚放置於一24孔盤內，每孔加入1 ml胚胎培養液(egg water)，靜待15-20分鐘後，每15秒提供一次聲音與振動刺激，追蹤及記錄一固定區域內的游泳路徑共75秒，以及測量游泳移動距離。
於本發明之一實施例中，誘發化合物為胺基酸甘醣類抗生素(aminoglycoside antibiotics)，且誘發化合物於培養基之濃度係為3-30μM；較佳而言，誘發化合物為3-20μM新黴素(neomycin)作用0.5-2小時。
藉此，本方法可用以判斷待篩選藥物是否具有改善聽力損傷之效果。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明提供一種篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法，其包括下列步驟：(a)於添加一誘發化合物之前、同時或之後，將一pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚飼養於含有一待篩選藥物之培養基內作用一段時間，另提供一控制組係為未添加待篩選藥物；以及(b)分析pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚之游泳行為，藉由比較未添加待篩選藥物之控制組以判斷待篩選藥物是否預防或治療聽力損傷。上述誘發化合物可例如為胺基酸甘醣類抗生素(aminoglycoside antibiotics)，且誘發化合物於培養基之濃度係為3-30μM；較佳而言，誘發化合物為3-20μM新黴素(neomycin)作用0.5-2小時。
本發明亦提供一種斑馬魚游泳行為作為篩選預防或治療聽力損傷藥物之平台之用途。
上述游泳行為之分析包括：先將每一pvalb3b:GFP螢光基因轉殖斑馬魚放置於一24孔盤內，每孔加入1 ml胚胎培養液(egg water)，靜待15-20分鐘後，每15秒提供一次聲音與振動刺激，追蹤及記錄一固定區域內的游泳路徑共75秒，以及測量游泳移動距離。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
斑馬魚(Danio rerio)具有體積小、繁殖力高、外胚胎發育期短及透明的胚胎等優點，近年來已成為醫學研究中常用的動物模型生物。斑馬魚的側線(lateral line)是體表上的一系列感覺器官，主要由小的感覺玫瑰花狀斑塊(rosette-like patches)或稱神經丘(neuromasts)所組成，這些斑塊的發育、形態和生理學與哺乳動物內耳的聽覺毛細胞相似。阿魏酸(Ferulic acid，FA)衍生物已在美國的臨床試驗中用於預防和治療聽覺功能障礙，在本案實施例中，發明人發現斑馬魚游泳行為與轉基因魚在受精後天數7天(7 dpf (days post-fertilization))時的毛細胞存活率一致，因此建立了毛細胞報告基因株和斑馬魚的游泳行為方法，可作為篩選誘導、預防或治療聽力損失化合物的平台。為了驗證本發明方法與現有檢測聽覺毛細胞損傷方法之正相關性，分析新黴素或/及阿魏酸處理後，Tg(pvalb3b：TagGFP)螢光基因轉殖斑馬魚對於的毛細胞存活率與游泳行為影響。上述螢光基因轉殖斑馬魚品系中所含pvalb3b啟動子會驅動毛細胞專一性(hair cell-specific)的綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表現於內耳及側線(lateral line)。
實施例ㄧ：製備斑馬魚品系和飼養斑馬魚
本實施例使用的斑馬魚為本案發明人先前建立的Tg(pvalb3b：TagGFP)螢光基因轉殖斑馬魚品系(可參Chang-Chien et al., Journal of Functional Foods 2017; 28:157-167與發明人前案中華民國專利公告第I593966 號)，將成年斑馬魚飼養於28.5℃、14:10小時的明暗循環系統(light-dark cycle system)中。將斑馬魚胚胎置於0.06%海水並於28.5℃飼養，根據受精後的時數( hours postfertilization，簡稱hpf)分類。雖然側線毛細胞在斑馬幼魚4 dpf時具有機械轉導作用，但仍難以使用EthoVision XT視頻追蹤軟件在非刺激環境下檢測到信號，若使用受精後天數少於4天的斑馬幼魚作為行為分析平台無太大意義，本實施例在此選用7dpf斑馬幼魚作為研究的平台。
實施例二：不同劑量新黴素對於基因轉殖斑馬幼魚之毒性測試
目前已知新黴素是一種常見的氨基糖苷，能以劑量依存性方式誘導毛細胞損傷，本實施例使用由從Sigma-Aldrich購得的10mg/ml新黴素原液，並以胚胎培養液(egg water)稀釋成不同劑量；然後，將7dpf基因轉殖斑馬幼魚分別暴露於0、3.125、6.25和12.5μM新黴素中溫育30分鐘；之後，再直接使用正立螢光顯微鏡(Zeiss Axioplan 2，德國)在20至40倍的放大倍數觀察和分析在各斑馬幼魚的前、後側線神經丘(anterior and posterior neuromasts)，根據Raible和Kruse的命名法(參J.Comp.Neurol.2000；421：189-198.)，在各斑馬幼魚一側的六個神經丘，包括三個前側線神經丘[耳(otic)、枕骨(occipital)和中間(middle)]，以及三個後側線(後驅幹)神經丘，分析上述區域的毛細胞螢光表現量，以計算毛細胞存活率，每組斑馬幼魚數為50隻(n=50)。
結果請參閱第一圖，相較於空白對照組，當7dpf斑馬幼魚暴露於12.5μM新黴素時，毛細胞存活率顯著下降(18.71±0.56%)，但該劑量並未導致斑馬幼魚明顯的死亡；統計意義為*** P<0.001；若使用劑量為50μM的新黴素導致斑馬幼魚大量死亡(圖中未顯示)。
實施例三：不同劑量之阿魏酸與新黴素對於7dpf基因轉殖斑馬魚之毛細胞存活率與幼魚存活率之分析
為了確認阿魏酸是否能普遍保護毛細胞免於新黴素誘導的損傷，進行劑量反應分析以確認阿魏酸的最佳保護劑量。本實施例將基因轉殖斑馬幼魚暴露於0、25、50、75和100μM不同濃度的阿魏酸(Sigma-Aldrich；以100μM原液溶於DMSO)預處理60分鐘，然後於仍存在阿魏酸的條件下進行新黴素處理30分鐘。
在有或無阿魏酸的新黴素處理後，將斑馬幼魚放置0.06%的海水中沖洗3-4次；再將斑馬幼魚固定於凹陷玻片上的0.5%低熔點瓊脂糖(low-melting-point agarose，LE，Seakem)中，使用螢光顯微鏡在40倍放大下計算毛細胞的損傷情形。
結果請參閱第二圖，在7 dpf斑馬幼魚暴露於新黴素之前，先以0、25、50、75和100μM的阿魏酸將斑馬幼魚處理60分鐘，結果顯示相較於空白對照組(DMSO組)，阿魏酸在濃度為50μM時幼魚死亡率低(90.12±1.41%)且提供了對新黴素損害的最大保護；統計意義分別為相較於空白對照組*** P
＜0.001，ns代表無顯著差異。另，結果亦顯示阿魏酸或/和新黴素對7 dpf斑馬幼魚存活率無顯著影響，濃度為50μM的阿魏酸提供最大的毛細胞保護作用，使其免受新黴素(12.5μM)傷害，此結果與4 dpf斑馬幼魚的劑量不同。
實施例四：基因轉殖斑馬幼魚之行為測定
斑馬魚神經行為表型(neurobehavioral phenotypes)的多維特徵(multidimensional character)已作為一種新穎、快速、高通量的方法，用以開發具有比擬人類神經活性(neuroactive)、精神作用性(psychoactive)和記憶調節作用(memory-modulating)之化合物。本實施例測試新黴素誘導的毛細胞損傷是否導致斑馬魚游泳行為的改變，並測試阿魏酸是否能挽救行為改變。
在處理新黴素之前，將斑馬幼魚預處理至最佳濃度(最大的保護且毒性最小)的阿魏酸60分鐘，再將斑馬幼魚共同處理阿魏酸和0、3.125、6.25和12.5μM新黴素30分鐘，每組斑馬幼魚數為150隻(n=150)。在新黴素迅速破壞毛細胞後，繼續追蹤敲擊刺激下各組斑馬幼魚的游泳行為。在有或無阿魏酸預處理的情況下，將斑馬幼魚急性暴露於不同劑量的新黴素，並使用胚胎培養液中沖洗斑馬幼魚3次，以進一步研究斑馬幼魚在環境中的行為特徵。
將每隻斑馬幼魚分別放置於24孔盤上的各孔中，每孔加入1 ml的胚胎培養液，靜置於避光箱(lightproof box)內20分鐘後，使用敲擊設備(tapping device)和EthoVision XT視頻追蹤軟件(Noldus Information Technology)下對輕敲等級8的聲音/振動刺激(sound/vibration stimulus)進行15秒為間隔的觸覺反響應測試(touch-response testing)，以追蹤及記錄一固定區域內的游泳路徑，追蹤時間為共75秒，並量測各斑馬幼的游泳距離。 此外，每次測試係於當日16:00至18:00間進行。有關斑馬幼魚進行游泳行為分析之示意圖以及給予聲音/振動刺激之測試流程圖分別如第三圖和第四圖所示。
分析結果請參閱第五圖，紅線表示在75秒程序中斑馬幼魚游泳的軌跡，相較於空白對照組，單獨處理新黴素的斑馬幼魚游泳活性較低，且斑馬幼魚的游泳行為隨著新黴素濃度增加而變慢，游泳距離降低。
斑馬幼魚在共75秒測試中分別在第15、30秒進行第一、二次敲擊後每3、5、10和15秒間隔追蹤(如第四圖)，意即從第一次敲擊15秒開始，分別以3、5、10和15秒的間隔測量或自測試30秒後第二次敲擊，再分別以3、5、10和15秒的間隔測量。
結果請參閱第六圖，相較於空白對照組，新黴素導致7 dpf斑馬幼魚的游泳行為呈劑量依存性降低，此結果與毛細胞存活率呈劑量依存性降低(第一圖)之結果一致，第一、二次敲擊後所量測到的游泳行為變化則無太大差異；統計意義分別為* P
＜0.05、** P
＜0.01 和*** P
＜0.001。
進一步檢測阿魏酸處理是否改善7 dpf基因轉殖斑馬幼魚的游泳行為缺陷，在處理新黴素之前，將斑馬幼魚分別預處理0、25、50、75和100μM阿魏酸60分鐘，再將斑馬幼魚共同處理阿魏酸和12.5μM新黴素30分鐘，每組斑馬幼魚數為150隻(n=150)。在新黴素迅速破壞毛細胞後，繼續追蹤敲擊刺激下各組斑馬幼魚的游泳行為。
結果請參閱第七圖，相較於空白對照組與控制組，經阿魏酸處理過的斑馬幼魚具有較高的游泳活性，其結果與毛細胞保護作用一致，且阿魏酸不僅可以防止新黴素引起的毛細胞受損，也可以劑量依存性方式顯著增加了每隔5秒間隔的斑馬幼魚的游動距離；統計意義分別為相較於空白對照組*** P
＜0.001，或相較於未處理阿魏酸(只有新黴素)的控制組### P
＜0.001，ns代表無顯著差異。
實施例五：測定基因轉殖斑馬幼魚在0-75秒區間的游泳距離、轉彎次數與轉彎角度
承實施例四，檢測7 dpf基因轉殖斑馬幼魚在0-75秒區間的游泳距離，結果請參閱第八圖，相較於控制組的平均游泳距離為81.06±8.03cm，新黴素組的平均游泳距離為74.30±11.38cm，阿魏酸25µM組為75.25±11.19cm、阿魏酸50µM組為76.38±10.55cm、阿魏酸75µM組為76.36±10.90cm、阿魏酸100µM組為71.17±10.55cm；其中n值為150，統計意義分別為相較於控制組*** P
＜0.001，** P
＜0.01。
檢測基因轉殖斑馬幼魚在0-75秒區間的轉彎次數與轉彎角度，結果請參閱第九圖，相較於控制組的平均轉彎次數為14.86±7.50次，新黴素組的平均轉彎次數為11.81±7.74次，阿魏酸25µM組為12.79±7.86次、阿魏酸50µM組為13.11±7.74次、阿魏酸75µM組為13.33±7.99次、阿魏酸100µM組為10.37±7.50次；另，相較於控制組的平均轉彎角度為109.75±4.93度，新黴素組的平均轉彎角度為111.62±5.45度，阿魏酸25µM組為110.91±5.41度、阿魏酸50µM組為110.41±5.51度、阿魏酸75µM組為110.80±5.46度、阿魏酸100µM組為112.53±5.68度；其中n值為150，統計意義分別為相較於控制組*** P
＜0.001，** P
＜0.01，* P
＜0.05，ns代表無顯著差異。
上述結果顯示，經阿魏酸處理過的斑馬幼魚具有較高的游泳距離、轉彎次數與轉彎角度變化。
實施例六：分析基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間的游泳距離、游動速率、轉彎次數與轉彎角度變化情形
承實施例四，檢測7 dpf基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間(分別為15-18、15-20、15-25、15-30)的游泳距離、游動速率、轉彎次數與轉彎角度變化情形。
基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間的游動速率分析結果如第十圖與表一所示，其中n值為150，統計意義分別為相較於控制組*** P
＜0.001，** P
＜0.01，* P
＜0.05，ns代表無顯著差異。
表一：游泳距離分析結果
| 游泳距離 (cm) | ||||||
| 阿魏酸(µM) | 0 | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 新黴素(12.5µM) | - | + | + | + | + | + |
| 15-18 (3s) | 3.55±0.49 | 3.12±0.67 | 3.32±0.64 | 3.46±.0.94 | 3.30±0.68 | 3.08±0.71 |
| 15-20 (5s) | 5.68±0.72 | 4.97±0.99 | 5.23±0.9 | 5.48±.1.19 | 5.30±0.96 | 4.89±0.99 |
| 15-25 (10s) | 11.01±1.26 | 9.72±1.89 | 10.16±1.83 | 10.54±.1.94 | 10.31±1.76 | 9.59±1.73 |
| 15-30 (15s) | 16.31±1.78 | 14.53±2.74 | 15.07±2.64 | 15.53±.2.70 | 15.27±2.54 | 14.31±2.44 |
基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間的游動速率分析結果如第十一圖與表二所示，其中n值為150，統計意義分別為相較於控制組*** P
＜0.001，** P
＜0.01，* P
＜0.05，ns代表無顯著差異。
表二：游動速率分析結果
| 游動速率 (cm/s) | ||||||
| 阿魏酸(µM) | 0 | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 新黴素(12.5µM) | - | + | + | + | + | + |
| 15-18 (3s) | 1.19±0.16 | 1.04±0.22 | 1.16±0.21 | 1.16±0.31 | 1.10±0.22 | 1.03±0.23 |
| 15-20 (5s) | 1.14±0.14 | 1.00±0.19 | 1.05±0.19 | 1.10±0.23 | 1.06±0.19 | 0.98±0.19 |
| 15-25 (10s) | 1.11±0.12 | 0.97±0.18 | 1.06±0.18 | 1.02±0.19 | 1.03±0.17 | 0.96±0.17 |
| 15-30 (15s) | 1.09±0.11 | 0.97±0.18 | 1.01±0.17 | 1.04±0.18 | 1.02±0.16 | 0.96±0.16 |
基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間的轉彎次數分析結果如第十二圖與表三所示，其中n值為150，統計意義分別為相較於控制組** P
＜0.01，ns代表無顯著差異。
表三：轉彎次數分析結果
| 轉彎次數 (次) | ||||||
| 阿魏酸(µM) | 0 | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 新黴素(12.5µM) | - | + | + | + | + | + |
| 15-18 (3s) | 0.77±0.63 | 0.66±0.56 | 0.80±0.60 | 0.85±0.87 | 0.76±0.63 | 0.59±0.60 |
| 15-20 (5s) | 1.16±0.87 | 0.93±0.74 | 1.14±0.82 | 1.17±1.04 | 1.08±0.86 | 0.82±0.83 |
| 15-25 (10s) | 2.14±1.35 | 1.60±1.20 | 1.95±1.40 | 2.01±1.49 | 1.90±1.41 | 1.58±1.41 |
| 15-30 (15s) | 3.11±1.84 | 2.35±1.65 | 2.75±1.94 | 2.85±1.96 | 2.75±1.91 | 2.27±1.92 |
基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間的轉彎角度分析結果如第十三圖與表四所示，其中n值為150，統計意義分別為相較於控制組** P
＜0.01，* P
＜0.05，ns代表無顯著差異。
表四：轉彎角度分析結果
| 轉彎角度 (度) | ||||||
| 阿魏酸(µM) | 0 | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 新黴素(12.5µM) | - | + | + | + | + | + |
| 15-18 (3s) | 107.68 ±7.57 | 109.90 ±7.78 | 108.01 ±7.94 | 107.04 ±7.72 | 107.77 ±8.27 | 110.33 ±8.07 |
| 15-20 (5s) | 109.02 ±6.32 | 111.52 ±6.64 | 109.63 ±7.19 | 108.65 ±6.70 | 109.21 ±7.08 | 111.44 ±7.17 |
| 15-25 (10s) | 109.63 ±5.74 | 112.22 ±6.02 | 109.87 ±7.01 | 110.68 ±6.18 | 110.28 ±6.16 | 112.08 ±6.56 |
| 15-30 (15s) | 109.99 ±5.42 | 112.45 ±5.87 | 111.05 ±6.54 | 110.65 ±6.00 | 110.28 ±5.86 | 112.26 ±6.40 |
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明證實斑馬魚游泳行為與轉基因魚在受精後天數7天(7 dpf)時的毛細胞存活率一致，因此可應用於快速篩選誘導、預防或治療聽力損失的化合物。
2.本發明所建立的方法可有效地作為新舊藥物或天然化合物的篩選平台，尋找對耳毒性藥物具有保護作用的藥物成分，以應用於預防醫學上、作為聽力保健之用，或用於降低耳毒性藥物對於聽力所造成的二次傷害。
綜上所述，本發明之篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法及其用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
無
第一圖：不同劑量之新黴素對於7 dpf基因轉殖斑馬幼魚之毛細胞存活率與幼魚存活率之分析圖。
第二圖：不同劑量之阿魏酸與新黴素對於7 dpf基因轉殖斑馬幼魚之毛細胞存活率與幼魚存活率之分析圖。
第三圖：基因轉殖斑馬幼魚進行游泳行為分析之示意圖。
第四圖：基因轉殖斑馬幼魚進行游泳行為分析之測試流程圖。
第五圖：空白對照組與新黴素處理之基因轉殖斑馬幼魚在24孔盤中游泳之示意圖與游泳距離分析圖。
第六圖：基因轉殖斑馬幼魚在總共75秒測試中分別在第15、30秒進行第一、二次敲擊後每3、5、10和15秒間隔追蹤游泳距離之分析圖。
第七圖：基因轉殖斑馬幼魚在第15-20秒區間之游泳距離分析圖。
第八圖：基因轉殖斑馬幼魚在0-75秒區間之游泳距離分析圖。
第九圖：基因轉殖斑馬幼魚在0-75秒區間之轉彎次數與轉彎角度分析圖。
第十圖：基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間(分別為15-18、15-20、15-25、15-30)的游泳距離分析圖。
第十一圖：基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間(分別為15-18、15-20、15-25、15-30)的游動速率分析圖。
第十二圖：基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間(分別為15-18、15-20、15-25、15-30)的轉彎次數分析圖。
第十三圖：基因轉殖斑馬幼魚在15-30秒內不同區間(分別為15-18、15-20、15-25、15-30)的轉彎角度分析圖。
Claims (5)
- 一種使用斑馬魚篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法，其包括下列步驟：(a)於添加一誘發化合物之前、同時或之後，將一受精後7天的pvalb3b：GFP螢光基因轉殖斑馬魚飼養於含有一待篩選藥物之培養基內作用一段時間，另提供一控制組係為未添加該待篩選藥物，其中該誘發化合物為胺基酸甘醣類抗生素(aminoglycoside antibiotics)，該誘發化合物於該培養基之濃度係為3-30μM，且該作用時間為0.5-2小時；以及(b)分析該pvalb3b：GFP螢光基因轉殖斑馬魚之游泳行為，藉由比較該未添加待篩選藥物之控制組以判斷該待篩選藥物是否預防或治療聽力損傷，其中該游泳分析行為之分析包含先將每一該pvalb3b：GFP螢光基因轉殖斑馬魚放置於一24孔盤內，每孔加入1ml胚胎培養液(egg water)，靜待15-20分鐘後，每15秒提供一次聲音與振動刺激，追蹤及記錄一固定區域內的游泳路徑共75秒，以及測量游泳移動距離。
- 如請求項1所述之方法，其中該pvalb3b：GFP螢光基因轉殖斑馬魚係專一表現螢光蛋白於內耳聽斑和側線毛細胞。
- 如請求項1所述之方法，其中該胺基酸甘醣類抗生素為新黴素(neomycin)。
- 如請求項3所述之方法，其中該誘發化合物為3-20μM新黴素(neomycin)。
- 如請求項1所述之方法，其中該斑馬魚游泳行為之分析，是將該放置有該pvalb3b：GFP螢光基因轉殖斑馬魚的24孔盤，放置於一避光箱中靜置20分鐘，再提供聲音與振動刺激。
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| TW109128969A TWI789620B (zh) | 2020-08-25 | 2020-08-25 | 篩選預防或治療聽力損傷藥物的方法及其用途 |
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| TW202208849A TW202208849A (zh) | 2022-03-01 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2016028741A1 (en) * | 2014-08-18 | 2016-02-25 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Systems and methods for screening ototoxic, otoprotective, and otoregenerative compounds using aquatic models |
| TWI593966B (zh) * | 2015-03-12 | 2017-08-01 | 中山醫學大學 | 篩選誘發及預防聽力損傷藥物的方法 |
-
2020
- 2020-08-25 TW TW109128969A patent/TWI789620B/zh active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016028741A1 (en) * | 2014-08-18 | 2016-02-25 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Systems and methods for screening ototoxic, otoprotective, and otoregenerative compounds using aquatic models |
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
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| 上架日: 2018/08/04 * |
| 中山醫學大學生化微生物免疫研究所博士論文，2017 * |
| 網路文獻 Gopal, Suhasini R., et al. "Unconventional secretory pathway activation restores hair cell mechanotransduction in an USH3A model." Proceedings of the National Academy of Sciences 116.22 (2019): 11000-11009. |
| 網路文獻 張簡如， 利用斑馬魚動物模式探討人類聽力損傷 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202208849A (zh) | 2022-03-01 |
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