CN109715194A - 用于治疗神经障碍的颤蛋白组合物 - Google Patents

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Abstract

颤蛋白水平以及颤蛋白信号传导的变化改变认知功能。这可以通过向患者或对象给药治疗有效量的颤蛋白的重复序列片段或由颤蛋白的片段重复序列形成的构建物来实现。颤蛋白水平的变化可用于治疗各种不同的神经变性疾病、神经元损伤或中风，例如X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、自闭症、缺血、缺氧、阿兹海默氏病和精神分裂症。颤蛋白也可用于改变树突棘密度、长时程增强作用减弱、突触可塑性降低和联想学习缺陷。已发现，由全长颤蛋白的重复序列区3和全长颤蛋白的重复序列区5或由全长颤蛋白的重复序列区3和全长颤蛋白的重复序列区6形成的构建物是特别有用的。

Description

用于治疗神经障碍的颤蛋白组合物
与相关申请的交叉引用
本申请是2016年8月3日提交的题为“用于治疗神经障碍的颤蛋白组合物”(ReelinCompositions for Treatment of Neurological Disorders)的美国临时申请号62/370,519和2017年4月18日提交的题为“用于治疗神经障碍的颤蛋白组合物”(ReelinCompositions for Treatment of Neurological Disorders)的美国临时申请号62/486,729的非临时申请，所述美国临时申请的内容通过引用并入本文。
背景技术
已知脂蛋白受体信号传导系统通过大量信号转导途径的激活，在成年人CNS包括胆固醇体内平衡、细胞外蛋白的清除以及记忆形成、突触传递、可塑性和成熟的调节中发挥显著作用。
细胞外基质蛋白颤蛋白(Reelin)牵涉到大量神经障碍，包括精神分裂症(Guidotti等，精神分裂症和双相障碍中颤蛋白和谷氨酸脱羧酶67(GAD67)表达的降低：尸检大脑研究(Decrease in reelin and glutamic acid decarboxylase 67(GAD67)expression in schizophrenia and bipolar disorder:a postmortem brain study)，Arch.Gen Psychiatry.2000；57:1061–1069；Chen等，人类颤蛋白基因5’启动子区处单核苷酸多态性的鉴定以及与精神分裂症的关联研究(Identification of a singlenucleotide polymorphism at the 5’promoter region of human reelin gene andassociation study with schizophrenia)，Mol.Psychiatry.2002；7:447–448；Fatemi等，自闭症和精神分裂症中的颤蛋白糖蛋白(Reelin glycoprotein in autism andschizophrenia)，Int.Rev.Neurobiol.2005；71:179–187；Torrey等，尸检大脑中精神分裂症、双相障碍和重性抑郁症的神经化学标志物(Neurochemical markers forschizophrenia,bipolar disorder and major depression in postmortem brains)，Biol.Psychiatry.2005；57:252–260)、双相障碍(Fatemi等，在患有精神分裂症、双相障碍和重性抑郁症的对象的海马中颤蛋白的免疫反应性降低(Reduction in Reelinimmunoreactivity in hippocampus of subjects with schizophrenia,bipolardisorder and major depression)，Mol.Psychiatry.2000；5:654–663；Torrey等，尸检大脑中精神分裂症、双相障碍和重性抑郁症的神经化学标志物(Neurochemical markers forschizophrenia,bipolar disorder and major depression in postmortem brains)，Biol.Psychiatry.2005；57:252–260)、抑郁症(Knable等，严重精神病中海马的分子异常：来自于斯坦利神经病理学联盟的尸检发现(Molecular abnormalities of thehippocampus in severe psychiatric illness:postmortem findings from thestanley neuropathology consortium)，Mol.Psychiatry.2004；9:609–620；Lussier等，重复暴露于皮质甾酮但不约束，降低了成年大鼠海马中颤蛋白阳性细胞的数目(Repeatedexposure to corticosterone,but not restraint,decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus)，Neurosci.Lett.2009；460:170–174；Lussier等，颤蛋白作为抑郁症的推定易感因素：在杂合颤蛋白小鼠中检查重复的皮质甾酮的产抑郁效应(Reelin as a putative vulnerability factor for depression:examining the depressogenic effects of repeated corticosterone inheterozygous reeler mice)，Neuropharmacol.2011；60:1064–1074；Lussier等，在皮质甾酮处理的大鼠中抑郁症样行为的渐进性发生与粒细胞成熟的减缓和成年齿状回中颤蛋白表达的降低并行(The progressive development of depression-like behavior incorticosterone-treated rats is paralleled by slowed granule cell maturationand decreased reelin expression in the adult dentate gyrus)，Neuropharmacol.2013；71C,174–183；Lussier等，在经历重复的皮质甾酮给药但没有约束应激的大鼠中海马和杏仁核内的GABA能和谷氨酸能活性改变(Altered GABAergic andglutamatergic activity within the rat hippocampus and amygdala in ratssubjected to repeated corticosterone administration but not restraintstress)，Neurosci.2013；231:38–48；Fenton等，丙咪嗪针对长期皮质甾酮对抑郁症样行为、海马颤蛋白表达和神经元成熟的有害效应提供保护(Imipramine protects againstthe deleterious effects of chronic corticosterone on depression-likebehavior,hippocampal reelin expression and neuronal maturation)，Prog.Neuropsychopharmacol.Biol.Psychiatry.2015；60:52–59)、自闭症(Fatemi等，自闭症和精神分裂症中的颤蛋白糖蛋白(Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia)，Int.Rev.Neurobiol.2005；71:179–187)和阿兹海默氏病(AD)(Hoe等，DAB1和颤蛋白影响淀粉样前体蛋白和ApoE受体2的转运和加工(DAB1and Reelin effects on amyloidprecursor protein and ApoE receptor2trafficking and processing)，J.BiolChem.2006；281:35176–35185；Hoareau等，淀粉样前体蛋白细胞质结构域拮抗海马神经元的颤蛋白神经突生长抑制(Amyloid precursor protein cytoplasmic domainantagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons)，Neurobiol.Aging.2008；29:542–553)。目前，颤蛋白信号传导涉及细胞内级联事件的触发，正如在图1中所看到的。
颤蛋白信号传导似乎由被螯合的全长细胞外颤蛋白的定向蛋白水解所驱动，而不是像神经肽或小分子递质那样从中间神经元简单地生产并释放颤蛋白。正如在图2中看到的，已显示颤蛋白具有两个主要的切割位点，在EGF样重复序列2–3(R2–3)和重复序列6–7(R6–7)之间(Jossin等，由体内蛋白水解加工产生的颤蛋白的中央片段对于它在皮层板发育期间的功能是关键的(The central fragment of Reelin,generated by proteolyticprocessing in vivo,is critical to its function during cortical platedevelopment)，J.Neurosci.2004；24:514–521)。这些切割位点产生在图3中看到的5个主要片段，它们可以在成年和正在发育的大脑中被找到(Jossin等，颤蛋白被胚胎神经元的加工对在组织但不是在解离的培养神经元中的功能来说是重要的(Processing of Reelin byembryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociatedcultured neurons)，J.Neurosci.2007；27:4243–4252；Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissueplasminogen activator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5and their modulators)，PLoSOne.2012；7:e47793；Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activatorfollowing synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307)。中间的R3–6片段与VLDLR和ApoER2相互作用，并被认为是参与启动颤蛋白级联的下游信号传导的片段(Jossin等，由体内蛋白水解加工产生的颤蛋白的中央片段对于它在皮层板发育期间的功能是关键的(The central fragment of Reelin,generated by proteolytic processingin vivo,is critical to its function during cortical plate development)，J.Neurosci.2004；24:514–521)。
为了鉴定颤蛋白切割酶类例如丝氨酸蛋白酶组织纤溶酶原激活物(tPA)、基质金属蛋白酶(MMP)和具有血小板反应蛋白基序的去整合蛋白和金属蛋白酶(ADAMTS)以及这种蛋白水解加工的功能作用，已做出大量尝试(Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissueplasminogen activator following synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307；Nagy等，基质金属蛋白酶-9为海马晚期长时程增强作用和记忆所需(Matrixmetalloproteinase-9is required for hippocampal late-phase long-termpotentiation and memory)，J.Neurosci.2006；26:1923–1934；Nogi等，通过X-射线晶体学和电子断层扫描术揭示的具有信号传导能力的颤蛋白片段的结构(Structure of asignaling-competent reelin fragment revealed by X-ray crystallography andelectron tomography)，EMBO J.2006；25:3675–3683；Nakano等，颤蛋白的极端保守的C-端区域不是分泌所必需，但为下游信号传导的高效激活所需(The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required forefficient activation of downstream signaling)，J.Biol Chem.2007；282:20544–20552；Hisanaga等，具有血小板反应蛋白基序的去整合蛋白和金属蛋白酶4(ADAMTS-4)以异构型依赖性方式切割颤蛋白(A disintegrin and metalloproteinase withthrombospondin motifs 4(ADAMTS-4)cleaves Reelin in an isoform-dependentmanner)，FEBS Lett.2012；586:3349–3353；Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulatedproteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogenactivator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5and their modulators)，PLoS One.2012；7:e47793)。在脑中，细胞外颤蛋白的一种内源加工途径是通过丝氨酸蛋白酶组织纤溶酶原激活物(tPA)，其发生在野生型颤蛋白中R6与R7之间(Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissueplasminogen activator following synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307)。蛋白水解在tPA KO小鼠中没有看到，支持了这种蛋白酶在颤蛋白的NMDAR不依赖性LTP诱导的切割中的作用(Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogenactivator following synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307)，并且被丝酶抑制蛋白E1抑制剂阻断(Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulated proteolyticprocessing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5and their modulators)，PLoS One.2012；7:e47793)。进一步支持的是，将tPA与颤蛋白离体温浴45min产生N-R6片段(370kDa)，其被纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1；丝酶抑制蛋白E1)和氟代磷酸二异丙酯(一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)阻断，但不被抑肽酶或CR-50(一种结合在颤蛋白的N-端区域中的抗体；D’Arcangelo等，颤蛋白是被CR-50单克隆抗体识别的分泌的糖蛋白(Reelin is a secreted glycoprotein recognized bythe CR-50 monoclonal antibody)，J.Neurosci.1997；17:23–31；Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis ofreelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307)阻断。研究还暗示金属蛋白酶穿膜肽酶α和β参与颤蛋白在R6与R7重复序列之间的切割(Sato等，颤蛋白在它的第6和第7个重复序列之间的切割位点的确定和穿膜肽酶金属蛋白酶对所述切割的贡献(Determination of cleavage siteof Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprinmetalloproteases to the cleavage)，J.Biochem.2016；159:305–312)。然而，tPA敲除小鼠(Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activatorfollowing synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307)或穿膜肽酶β敲除小鼠(Sato等，颤蛋白在它的第6和第7个重复序列之间的切割位点的确定和穿膜肽酶金属蛋白酶对所述切割的贡献(Determination of cleavage site of Reelin between itssixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to thecleavage)，J.Biochem.2016；159:305–312)都没有表现出全长颤蛋白或颤蛋白片段的基础水平的差异，表明蛋白酶的组合参与了组成性颤蛋白水平和蛋白水解。
在成年海马中，糖蛋白颤蛋白由主要驻留在齿状回的门区和海马本身的腔隙层-分子层中的中间神经元表达。表达颤蛋白的细胞也可以在CA1和CA3区域的起层和放线层中找到，并且与海马的锥体细胞相关联。长时程增强作用(LTP)这种引起突触效能持久提高的突触可塑性形式的诱导，需要NMDA受体(NMDAR)激活和随后AMPA受体表达和功能的上调。AMPA受体(AMPAR)的变化可以通过增加亚基磷酸化或通过增加亚基合成和向特定突触位点的转运来实现。相反，NMDAR充当重合度检测器，并在突触可塑性的诱导中发挥主要作用。NMDAR离子通道的打开需要谷氨酸结合和突触后膜去极化两者。某些NMDAR亚基例如NR1、NR2A和NR2B，也在丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基处经历调节性磷酸化。NMDAR亚基的磷酸化调节通道动力学和向突触位点的转运两者。因此，如果颤蛋白对于突触可塑性的调节是重要的，则考虑到它们在突触可塑性的诱导和表达中的重要性，NMDAR和AMPAR将是符合逻辑的靶点。
最近已发现颤蛋白分子在体外和体内形成更高等级的复合体，例如Fc-RAP。通过显示颤蛋白在体内被分泌为二硫键连接的同二聚体，这个观察被进一步细化。位于分子的N-端处被称为CR-50表位的短区域的缺失废除了寡聚化。这种突变的颤蛋白在原代小鼠神经元中不能高效诱导Dab1磷酸化。
颤蛋白在突触可塑性和学习过程中发挥积极作用。本发明还包括颤蛋白的蛋白质加工机制的鉴定和使用，以增强和/或修复认知功能。例如，在本文中公开了：情境恐惧学习和θ脉冲刺激(tb-stim)引起颤蛋白加工的变化；金属蛋白酶、tPA和MMP-9在突触可塑性和学习期间差异地参与颤蛋白加工；颤蛋白片段补足物的增补可以增强联想性和空间学习和记忆；并且颤蛋白片段与Aβ斑结合，它的表达和加工被AD相关的突变改变，并且颤蛋白增补可以克服在Tg2576AD小鼠模型中发现的LTP缺乏。
一旦颤蛋白被GABA能中间神经元分泌到细胞外空间之后，它结合到二聚化的脂蛋白受体——极低密度脂蛋白受体(VLDLR)和载脂蛋白受体2(ApoER2)(D’Arcangelo等，颤蛋白是脂蛋白受体的配体(Reelin is a ligand for lipoprotein receptors)，Neuron.1999；24:471–479；Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synapticplasticity and learning)，J.Biol Chem.2002；277:39944–39952；Herz&Chen，颤蛋白、脂蛋白受体和突触可塑性(Reelin,lipoprotein receptors and synaptic plasticity)，Nat.Rev Neurosci.2006；7,850–859)。所述二聚化的受体酪氨酸磷酸化细胞内衔接蛋白Disabled-1(Dab1)，然后进行src家族酪氨酸激酶(SFK)如Fyn的酪氨酸磷酸化和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的磷酸化(D’Arcangelo等，颤蛋白是被CR-50单克隆抗体识别的分泌的糖蛋白(Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonalantibody)，J.Neurosci.1997；17:23–31；D’Arcangelo等，颤蛋白是脂蛋白受体的配体(Reelin is a ligand for lipoprotein receptors)，Neuron.1999；24:471–479；Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptorscooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning)，J.BiolChem.2002；277:39944–39952；Niu等，颤蛋白通过VLDLR/ApoER2-Dab1途径促进海马树突发育(Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1pathway)，Neuron.2004；41:71–84；Beffert等，通过颤蛋白调节突触可塑性和记忆涉及脂蛋白受体Apoer2的差异剪接(Modulation of synaptic plasticity and memory byReelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2)，Neuron.2005；47:567–579；Chen等，在皮层神经元中颤蛋白调节NMDA受体活性(Reelinmodulates NMDA receptor activity in cortical neurons)，J.Neurosci.2005；25,8209–8216；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activityin the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955；Qiu&Weeber，颤蛋白信号传导促进CA1谷氨酸能突触的成熟(Reelin signaling facilitates maturation ofCA1 glutamatergic synapses)，J.Neurophysiol.2007；97:2312–2321；Burrell等，(2014)，Fyn酪氨酸激酶提高载脂蛋白E受体2水平和磷酸化(Fyn tyrosine kinaseincreases Apolipoprotein E receptor 2 levels and phosphorylation)，PLoS One 9:e110845；Divekar等，配体诱导的载脂蛋白E受体2的同型和异型簇集(Ligand-inducedhomotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2)，J.BiolChem.2014；289:15894–15903)。
由NMDAR磷酸化造成的钙内流的增加导致突触后膜的去极化、从NR2B到NR2A受体亚型的NMDA受体的成熟和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(AMPAR)的插入(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoEreceptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning)，J.Biol Chem.2002；277:39944–39952；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPAreceptor activity in the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955；Qiu&Weeber，颤蛋白信号传导促进CA1谷氨酸能突触的成熟(Reelin signalingfacilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses)，J.Neurophysiol.2007；97:2312–2321)。Ca2+内流的增加和细胞的去极化增加CREB磷酸化和蛋白质合成，其最终引起长时程增强作用(LTP)的诱导和增强并提高突触可塑性以及学习和记忆(Niu等，在海马神经元中颤蛋白信号传导途径促进树突棘发育(The Reelin signaling pathway promotesdendritic spine development in hippocampal neurons)，J.Neurosci.2008；28:10339–10348；Rogers等，颤蛋白增补提高认知能力、突触可塑性和树突棘密度(Reelinsupplementation enhances cognitive ability,synaptic plasticity and dendriticspine density)，Learn.Mem.2011；18:558–564；Rogers等，在杂合颤蛋白小鼠中颤蛋白增补恢复感觉运动门控、突触可塑性和联想学习缺陷(Reelin supplementation recoverssensorimotor gating,synaptic plasticity and associative learning deficits inthe heterozygous reeler mouse)，J.Psychopharmacol.2013；27:386–395)。同时，Dab1磷酸化引起磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)的活化和抑制Tau磷酸化的糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的调节(Beffert等，颤蛋白介导的信号传导局部调控蛋白激酶B/Akt和糖原合成酶激酶3β(Reelin-mediated signaling locally regulates protein kinaseB/Akt and glycogen synthase kinase 3beta)，J.Biol Chem.2007；277:49958–49964)，以及调控p35向p25的转变，其负责CDK5的活化，这是Tau磷酸化的另一条途径(Beffert等，颤蛋白和周期蛋白依赖性激酶5依赖性信号合作调控神经元迁移和突触传递(Reelin andcyclin-dependent kinase 5-dependent signals cooperate in regulating neuronalmigration and synaptic transmission)，J.Neurosci.2004；24:1897–1906)。
因此，颤蛋白信号传导是针对大量病症中突触和神经元损失的疗法的有用靶点。例如，已显示颤蛋白结合到脂蛋白受体和淀粉样前体蛋白(APP)两者，并且已知在大量AD小鼠模型中与Aβ斑相关联(Chin等，在人类淀粉样前体蛋白转基因小鼠和患有阿兹海默氏病的人类的内嗅皮层中颤蛋白耗尽(Reelin depletion in the entorhinal cortex ofhuman amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer'sdisease)，J Neurosci 2007,27:2727-2733；Hoareau等，淀粉样前体蛋白细胞质结构域拮抗海马神经元的颤蛋白神经突生长抑制(Amyloid precursor protein cytoplasmicdomain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampalneurons)，Neurobiol Aging2008,29:542-553；Hoe等，DAB1和颤蛋白影响淀粉样前体蛋白和ApoE受体2的转运和加工(DAB1and Reelin effects on amyloid precursor proteinand ApoE receptor 2trafficking and processing)，J Biol Chem2006,281:35176-35185；Miettinen等，9月龄野生型小鼠的海马形成中的颤蛋白免疫反应性：APP/PS1基因型和卵巢切除术的影响(Reelin-immunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse:effects of APP/PS1genotype and ovariectomy)，J ChemNeuroanat.2005,30:105-1180)。
此外，在阿兹海默氏病(AD)中颤蛋白信号转导途径显得特别脆弱，可能对它的病理发生有贡献(Hoe等，DAB1和颤蛋白影响淀粉样前体蛋白和ApoE受体2的转运和加工(DAB1and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2trafficking and processing)，J Biol Chem 2006,281:35176-35185；Hoareau等，淀粉样前体蛋白细胞质结构域拮抗海马神经元的颤蛋白神经突生长抑制(Amyloid precursorprotein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition ofhippocampal neurons)，Neurobiol.Aging.2008；29:542–553)。
同样地，在成年人中颤蛋白可以影响突触可塑性。具有颤蛋白、ApoER2和VLDLR或Disabled-1(Dab1)敲除的小鼠显示出突触可塑性缺陷(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptors cooperate to enhancehippocampal synaptic plasticity and learning)，J.Biol Chem.2002；277:39944–39952；Qui等，2006，Beffert等，通过颤蛋白调节突触可塑性和记忆涉及脂蛋白受体Apoer2的差异剪接(Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involvesdifferential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2)，Neuron.2005；47:567–579)。治疗性干预例如颤蛋白的双侧脑室内注射(IVI)可用作疗法，并在野生型小鼠中增强学习和记忆和突触可塑性(Rogers等，颤蛋白增补提高认知能力、突触可塑性和树突棘密度(Reelin supplementation enhances cognitive ability,synaptic plasticity anddendritic spine density)，Learn.Mem.2011；18:558–564)。颤蛋白IVI也已显示如图4中可见的恢复在杂合颤蛋白小鼠中(Rogers等，在杂合颤蛋白小鼠中颤蛋白增补恢复感觉运动门控、突触可塑性和联想学习缺陷(Reelin supplementation recovers sensorimotorgating,synaptic plasticity and associative learning deficits in theheterozygous reeler mouse)，J.Psychopharmacol.2013；27:386–395)和安格尔曼综合征的小鼠模型中(Hethorn等，2016)看到的学习和记忆和LTP缺陷。因此，通过蛋白质给药或通过使用颤蛋白基因RELN的基因疗法补充颤蛋白水平在大量疾病中可能是潜在的治疗性干预。
如图1中所示，一旦颤蛋白被GABA能中间神经元分泌到细胞外空间之后，它结合到脂蛋白受体——极低密度脂蛋白受体(VLDLR)和载脂蛋白受体2(ApoER2)(D’Arcangelo等，颤蛋白是脂蛋白受体的配体(Reelin is a ligand for lipoprotein receptors)，Neuron.1999；24:471–479；Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synapticplasticity and learning)，J.Biol Chem.2002；277:39944–39952；Herz&Chen，颤蛋白、脂蛋白受体和突触可塑性(Reelin,lipoprotein receptors and synaptic plasticity)，Nat.RevNeurosci.2006；7,850–859；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPAreceptor activity in the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955)。配体相互作用引起受体二聚化和下游细胞内衔接蛋白Dab1的酪氨酸磷酸化(Howell等，小鼠disabled(mDab1)：一种牵涉到神经元发育的Src结合蛋白(Mouse disabled(mDab1):aSrc binding protein implicated in neuronal development)，EMBO J.1997；16:121–132；D’Arcangelo等，颤蛋白是脂蛋白受体的配体(Reelin is a ligand for lipoproteinreceptors)，Neuron.1999；24:471–479；Hiesberger等，颤蛋白直接结合到VLDL受体和ApoE受体2诱导disabled-1的酪氨酸磷酸化并调节tau磷酸化(Direct binding of Reelin toVLDL receptor and ApoE receptor 2induces tyrosine phosphorylation ofdisabled-1and modulates tau phosphorylation)，Neuron.1999；24:481–489；Strasser等，(2004)，受体簇集参与颤蛋白信号传导(Receptor clustering is involved inReelin signaling)，MolCell Biol.2004；24:1378–1386；Herz&Chen，颤蛋白、脂蛋白受体和突触可塑性(Reelin,lipoprotein receptors and synaptic plasticity)，Nat.Rev.Neurosci.2006；7,850–859；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPAreceptor activity in the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955；Trotter等，Dab1为突触可塑性和联想学习所需(Dab1is required for synapticplasticity and associative learning)，J.Neurosci.2013；33:15652-15668；Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellularproteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synapticpotentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307；Divekar等，配体诱导的载脂蛋白E受体2的同型和异型簇集(Ligand-induced homotypic and heterotypic clustering ofApolipoprotein E receptor 2)，J.Biol Chem.2014；289:15894–15903)。Dab1磷酸化激活Src家族酪氨酸激酶(SFK)例如Fyn，其磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，允许Ca2+内流增加(Chen等，在皮层神经元中颤蛋白调节NMDA受体活性(Reelin modulates NMDAreceptor activity in cortical neurons)，J.Neurosci.2005；25,8209–8216)。Ca2+内流的增强允许从NR2B到NR2A受体亚型的NMDA受体的成熟，增加膜α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体插入，并且可以有助于长时程增强作用的诱导和增强(LTP；Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptorscooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning)，J.Biol.Chem.2002；277,39944–39952；Beffert等，通过颤蛋白调节突触可塑性和记忆涉及脂蛋白受体Apoer2的差异剪接(Modulation of synaptic plasticity and memory byReelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2)，Neuron.2005；47:567–579；Chen等，在皮层神经元中颤蛋白调节NMDA受体活性(Reelinmodulates NMDA receptor activity in cortical neurons)，J.Neurosci.2005；25,8209–8216；Herz&Chen，颤蛋白、脂蛋白受体和突触可塑性(Reelin,lipoproteinreceptors and synaptic plasticity)，Nat.Rev Neurosci.2006；7,850–859；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-inducedenhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955；Qiu&Weeber，颤蛋白信号传导促进CA1谷氨酸能突触的成熟(Reelin signaling facilitates maturation of CA1glutamatergic synapses)，J.Neurophysiol.2007；97,2312–2321)。此外，Dab1诱导的磷酸化也可激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB/Akt)，其然后引起糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制(Beffert等，颤蛋白介导的信号传导局部调控蛋白激酶B/Akt和糖原合成酶激酶3β(Reelin-mediated signaling locally regulates protein kinase B/Akt and glycogensynthase kinase 3 beta)，J.Biol Chem.2002；277,49958–49964)，进而阻遏tau过度磷酸化(Ohkubo等，载脂蛋白E和颤蛋白配体通过载脂蛋白E受体/disabled-1/糖原合成酶激酶-3β级联调节tau磷酸化(Apolipoprotein E and Reelin ligands modulate tauphosphorylation through an Apolipoprotein E receptor/disabled-1/glycogensynthase kinase-3beta cascade)，FASEB J.2003；17,295–297)。
由于颤蛋白阳性细胞以最高数目存在于CA1腔隙层和门中，因此它们位于分别影响学习和记忆以及神经发生的适合位置中。事实上，已显示颤蛋白增强突触可塑性以及学习和记忆(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin andApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity andlearning)，J.Biol Chem.2002；277:39944–39952；Herz&Chen，颤蛋白、脂蛋白受体和突触可塑性(Reelin,lipoprotein receptors and synaptic plasticity)，Nat.RevNeurosci.2006；7,850–859；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptoractivity in the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955；Rogers&Weeber，颤蛋白和ApoE作用于信号转导、突触功能和记忆形成(Reelin and ApoE actionson signal transduction,synaptic function and memory formation)，Neuron GliaBiol.2008；4:259–270)，以及改变新生成年神经元的迁移(Zhao等，在成年海马中神经发生与神经胶质发生之间的平衡：颤蛋白的作用(Balance between neurogenesis andgliogenesis in the adult hippocampus:role for Reelin)，Dev.Neurosci.2007；29:84–90；Pujadas等，颤蛋白调控新生儿神经发生并增强棘过度生长和长时程增强作用(Reelin regulates postnatal neurogenesis and enhances spine hypertrophy andlong-term potentiation)，J.Neurosci.2010；30:4636–4649.doi；Teixeira等，颤蛋白途径的细胞自主失活损害海马中的成年神经发生(Cell-autonomous inactivation of theReelin pathway impairs adult neurogenesis in the hippocampus)，J.Neurosci.2012；32:12051–12065)。在海马中，细胞外颤蛋白积累在腔隙层中(Pesold等，皮层的双丛毛、水平和马尔提诺蒂细胞将颤蛋白偏好性地表达和分泌到神经元周网络中，非突触性地调节基因表达(Cortical bitufted,horizontal and Martinotti cellspreferentially express and secrete Reelin into perineuronal nets,non-synaptically modulating gene expression)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1999；96:3217–3222；Lussier等，重复暴露于皮质甾酮但不约束，降低了成年大鼠海马中颤蛋白阳性细胞的数目(Repeated exposure to corticosterone,but not restraint,decreases thenumber of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus)，Neurosci.Lett.2009；460:170–174)，使得它处于影响CA1中的突触活性的合适位置中(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoEreceptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning)，J.Biol Chem.2002；277:39944–39952；Herz&Chen，颤蛋白、脂蛋白受体和突触可塑性(Reelin,lipoprotein receptors and synaptic plasticity)，Nat.Rev.Neurosci.2006；7,850–859；Qiu等，在成年海马中颤蛋白诱导的NMDA和AMPA受体活性的差异增强(Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activityin the adult hippocampus)，J.Neurosci.2006；26:12943–12955；Rogers&Weeber，颤蛋白和ApoE作用于信号转导、突触功能和记忆形成(Reelin and ApoE actions on signaltransduction,synaptic function and memory formation)，Neuron Glia Biol.2008；4:259–270)。在这些区域中颤蛋白的内源切割可用于调控颤蛋白对这些过程的影响。
此外，已知脂蛋白受体信号传导系统通过大量信号转导途径在成年CNS中发挥显著作用，例如胆固醇稳态，细胞外蛋白的清除，调节记忆形成、突触传递、可塑性和成熟。重要的是，脂蛋白受体配体载脂蛋白E(apoE)是迟发型散发性阿兹海默氏病(AD)的最确认的风险因素之一(Hoe HS,Harris DC,Rebeck GW，原代神经元中的载脂蛋白E信号传导的多个途径(Multiple pathways of apolipoprotein E signaling in primary neurons)，JNeurochem 2005；93:145-155；Hoe HS,Freeman J,Rebeck GW，在原代神经元中载脂蛋白E降低tau激酶和phospho-tau水平(Apolipoprotein E decreases tau kinases andphospho-tau levels in primary neurons)，Mol Neurodegener 2006,1:18；Hoe HS,Pocivavsek A,Chakraborty G等，载脂蛋白E受体2与N-甲基-D天冬氨酸受体的相互作用(Apolipoprotein E receptor 2interactions with the N-methyl-Daspartatereceptor)，J Biol Chem 2006,281:3425-3431)。同样地，细胞外基质蛋白颤蛋白可以结合到脂蛋白受体和淀粉样前体蛋白(APP)两者，并已知与大量AD小鼠模型中的Aβ斑相关联(ChinJ,Massaro CM,Palop JJ等，在人类淀粉样前体蛋白转基因小鼠和患有阿兹海默氏病的人类的内嗅皮层中颤蛋白耗尽(Reelin depletion in the entorhinal cortex ofhuman amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer'sdisease)，J Neurosci 2007,27:2727-2733；Hoareau C,Borrell V,Soriano E,Krebs MO,Prochiantz A,Allinquant B，淀粉样前体蛋白细胞质结构域拮抗海马神经元的颤蛋白神经突生长抑制(Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelinneurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons)，Neurobiol Aging 2008,29:542-553；Hoe HS,Tran TS,Matsuoka Y,Howell BW,Rebeck GW，DAB1和颤蛋白影响淀粉样前体蛋白和ApoE受体2的转运和加工(DAB1 and Reelin effects on amyloid precursorprotein and ApoE receptor2 trafficking and processing)，J Biol Chem 2006,281:35176-35185；和Miettinen R,Riedel A,Kalesnykas G等，9月龄野生型小鼠的海马形成中的颤蛋白免疫反应性：APP/PS1基因型和卵巢切除术的影响(Reelin-immunoreactivity inthe hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse:effects of APP/PS1genotype and ovariectomy)，J Chem Neuroanat 2005,30:105-1180)。Aβ积累可以影响颤蛋白信号传导和脂蛋白受体功能，由此促进AD病理发生并影响突触和认知功能。
因此，需要的是以与颤蛋白相似的方式作用于脂蛋白受体系统，在认知功能的改善以及神经疾病例如AD和其他与衰老相关的神经变性障碍的治疗中用作治疗剂的特异性激动剂。
发明内容
本文描述的组合物和方法总的来说涉及通过提高和/或防止干扰颤蛋白水平以及由颤蛋白或颤蛋白信号传导所引发或维持的细胞信号转导来影响和增强认知功能的方法。
本发明提供了一种通过将治疗有效量的重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段给药到有需要的患者中，来治疗或校正神经系统的疾病或障碍的方法。在某些变化形式中，所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段是由重复序列R3至R5形成的颤蛋白片段(R3-R5)、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3(R3+R5)、颤蛋白片段重复序列R3、由重复序列R3至R6形成的颤蛋白片段(R3-R6)、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3(R3+R6)，其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6。任选地，在所述颤蛋白剪接片段是R3+R5的情况下，所述两个重复序列区即R3和R5通过重复序列区3环、重复序列区5环或其组合相连。可替选地，在所述颤蛋白剪接片段是R3+R6的情况下，所述两个重复序列区即R3和R6通过重复序列区3环、重复序列区6环或其组合相连。在特定形式中，所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段是颤蛋白片段重复序列R3、颤蛋白片段重复序列R4、颤蛋白片段重复序列R5、颤蛋白片段重复序列R6、颤蛋白片段重复序列R3至R4、颤蛋白片段重复序列R3至R5、颤蛋白片段重复序列R3至重复序列区R6、颤蛋白片段重复序列R4至R5、颤蛋白片段重复序列R5至R6、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3、连接到重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R4或上面提到的颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段的组合。在本发明的某些变化形式中，所述神经系统的疾病或障碍是神经变性疾病、神经元损伤(neuronal insult)、神经元障碍或中风。在特定变化形式中，所述神经元障碍选自X染色体易损综合征(fragile X syndrome)、威廉姆斯综合征(William’s syndrome)、雷特氏综合征(Rett syndrome)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、安格尔曼综合征(Angelman syndrome)、自闭症、颤蛋白缺乏症、双相障碍、抑郁症和精神分裂症。或者，所述神经系统的疾病或障碍是神经元损伤或阿兹海默氏病。
任选地，所述颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段通过肠胃外注射给药。在特定变化形式中，所述颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段被动脉内、静脉内、大脑内或脑室内注射。在本发明的特定变化形式中，颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段被双侧注射到所述患者的脑室(ventricle)中。在某些变化形式中，给药所述颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段以在CNS液中获得约10μM至约5nM的颤蛋白浓度。任选的浓度包括10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、3μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、220μM、225μM、240μM、250μM、270μM、275μM、280μM、300μM、320μM、325μM、340μM、350μM、370μM、375μM、380μM、400μM、420μM、425μM、440μM、450μM、470μM、475μM、480μM、500μM、520μM、525μM、540μM、550μM、570μM、575μM、580μM、600μM、620μM、625μM、640μM、650μM、670μM、675μM、680μM、700μM、720μM、725μM、740μM、750μM、770μM、775μM、780μM、800μM、820μM、825μM、840μM、850μM、870μM、875μM、880μM、900μM、920μM、925μM、940μM、950μM、970μM、975μM、980μM、1nM、1.1nM、1.2nM、1.3nM、1.4nM、1.5nM、1.6nM、1.7nM、1.8nM、1.9nM、2.0nM、2.1nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.1nM、3.2nM、3.3nM、3.4nM、3.5nM、3.6nM、3.7nM、3.8nM、3.9nM、4.0nM、4.1nM、4.2nM、4.3nM、4.4nM、4.5nM、4.6nM、4.7nM、4.8nM、4.9nM和5.0nM。例如，治疗浓度可以低于100nM、低于50nM、低于25nM、低于10nM或约5nM。剂量可以在所述蛋白质在动物体内的分布和通过血脑屏障的通过性的基础上计算。非限制性实例是颤蛋白以每30-36g患者质量1μl的5nM组合物的量给药。此外，治疗可以是不间断的、即连续的，或者治疗模式可以持续少于1年、少于6个月、少于3个月、少于1个月、少于1周或约1天。
在本发明的某些变化形式中，将从所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段形成的构建物插入到病毒载体中以形成颤蛋白载体，并将所述颤蛋白载体注射到所述对象中。任选的载体包括AAV9、AAV5、AAV1和AAV4。然而，其他载体、特别是本领域中已知的任何适合的AAV可用于本发明中，并且设想了这种用途。在特定变化形式中，所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段在CMV启动子的控制之下。
本发明还包括包含重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段的组合物，其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段是由重复序列R3至R5形成的颤蛋白片段(R3-R5)、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3(R3+R5)、颤蛋白片段重复序列R3、由重复序列R3至R6形成的颤蛋白片段(R3-R6)、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3(R3+R6)，其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6。任选地，在所述颤蛋白剪接片段是R3+R5的情况下，所述两个重复序列区即R3和R5，通过重复序列区3环、重复序列区5环或其组合相连。可替选地，在所述颤蛋白剪接片段是R3+R6的情况下，所述两个重复序列区即R3和R6，通过重复序列区3环、重复序列区6环或其组合相连。
在所述组合物的某些变化形式中，所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段被整合在构建物中以形成颤蛋白载体，所述构建物由插入到病毒载体中的所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段形成，并将所述颤蛋白载体注射到所述对象中。任选的载体包括AAV9、AAV5、AAV1和AAV4。然而，其他载体、特别是本领域中已知的任何适合的AAV可用于本发明中，并且设想了这种用途。在特定变化形式中，所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段在CMV启动子的控制之下。
上面提到的组合物也可用于治疗神经系统的疾病或障碍包括神经变性疾病、神经元损伤和中风的症状。非限制性实例包括X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、自闭症、缺血、缺氧、阿兹海默氏病、颤蛋白缺乏症、双相障碍、抑郁症、精神分裂症和中风。所述神经系统的疾病或障碍的症状的具体实例包括树突棘密度缺陷、长时程增强作用减弱、突触可塑性降低和联想学习缺陷。有用的治疗性组合物和量在上文公开。
上面提到的组合物也可用于在对象中提高树突棘密度。有用的治疗性组合物和量在上文公开。
上面公开的组合物也可用于提高突触可塑性、学习或改善认知功能。可用于提高突触可塑性、学习或改善认知功能的组合物和量与上文描述的相同。
附图说明
为了更充分地理解本发明，应该与附图相结合参考下面的详细描述，在所述附图中：
图1是成年突触可塑性中颤蛋白途径的图示。
图2是示出了成年大脑中颤蛋白的蛋白水解的图示。在成年大脑中，全长颤蛋白被GABA能中间神经元释放到细胞外空间中。该全长颤蛋白被大量不同酶在表皮生长因子(EGF)重复序列2–3(R2-R3)和6–7(R6-R7)之间酶促切割(用虚线指示)。例如，已显示组织纤溶酶原激活物(tPA)、穿膜肽酶α和β在R6与R7之间切割颤蛋白(Kohno等，颤蛋白的特异性蛋白水解切割的机制和重要性(Mechanism and significance of specific proteolyticcleavage of Reelin)，Biochem.Biophys.Res.Commun.2009；380:93–97；Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissueplasminogen activator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5and their modulators)，PLoSOne.2012；7:e47793；Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activatorfollowing synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307；Sato等，颤蛋白在它的第6和第7个重复序列之间的切割位点的确定和穿膜肽酶金属蛋白酶对所述切割的贡献(Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventhrepeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage)，J.Biochem.2016；159:305–312)，而基质金属蛋白酶(MMP)-9在R2与R3之间切割颤蛋白(Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulated proteolytic processing of Reelin throughinterplay of tissue plasminogen activator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5 and theirmodulators)，PLoS One.2012；7:e47793)。已显示ADAMTS 4和5在两个位点处切割颤蛋白(Hisanaga等，具有血小板反应蛋白基序的去整合蛋白和金属蛋白酶4(ADAMTS-4)以异构型依赖性方式切割颤蛋白(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondinmotifs 4(ADAMTS-4)cleaves Reelin in an isoform-dependent manner)，FEBSLett.2012；586:3349–3353；Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulated proteolyticprocessing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5 and their modulators)，PLoS One.2012；7:e47793)。其他尚有待鉴定的蛋白酶也可能参与颤蛋白加工。
图3是示出了全长颤蛋白(450kDa)和通过大量酶切割形成的颤蛋白片段的图示，所述切割导致产生范围为370–80kDa的5个片段。已显示，R3-R6片段[包含在全长颤蛋白(450kDa)、370kDa、190kDa和270kDa片段中]结合到脂蛋白受体ApoER2和VLDLR(Jossin等，由体内蛋白水解加工产生的颤蛋白的中央片段对于它在皮层板发育期间的功能是关键的(The central fragment of Reelin,generated by proteolytic processing in vivo,is critical to its function during cortical plate development)，J.Neurosci.2004；24:514–521)。已显示N-R2片段(180kDa)结合到α3β1-整合蛋白(Dulabon等，颤蛋白结合α3β1整合蛋白并抑制神经元迁移(Reelin binds alpha3beta1 integrinand inhibits neuronal migration)，Neuron.2000；27:33–44)，并且已显示神经元迁移在体内被CR-50抗体破坏(Nakajima等，在体内通过针对颤蛋白的CR-50mAb破坏海马发育(Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50mAb against Reelin)，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1997；94:8196–8201)。已显示C-端区域(R7-C；80kDa)参与颤蛋白的分泌及其正确折叠(de Bergeyck等，在“Orleans”颤蛋白突变(Reln[rl-Orl])中产生但不分泌截短的颤蛋白(A truncated Reelin protein is produced but notsecreted in the’Orleans’reeler mutation(Reln[rl-Orl])，Brain Res.Mol.BrainRes.1997；50:85–90；Jossin等，由体内蛋白水解加工产生的颤蛋白的中央片段对于它在皮层板发育期间的功能是关键的(The central fragment of Reelin,generated byproteolytic processing in vivo,is critical to its function during corticalplate development)，J.Neurosci.2004；24:514–521)和下游信号传导效能(Nakano等，颤蛋白的极端保守的C-端区域不是分泌所必需，但为下游信号传导的高效激活所需(Theextremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary forsecretion but is required for efficient activation of downstream signaling)，J.Biol.Chem.2007；282:20544–20552)。
图4是示出了θ-脉冲刺激后的LTP的图。
图5是全长颤蛋白的序列。内切核酸酶的识别位点描述在它们相应的序列上方。重复序列在左侧被标记，并且重复序列区被高亮显示。在每个重复序列区之间是融合环，其未被高亮显示。
图6是颤蛋白依赖性ApoER2受体的图示，示出了未活化的受体和有活性并发荧光的二聚化受体。所述系统被用于受体激活萤光素酶测定法中。
图7是示出了由导致产生各种不同片段的大量酶切割所形成的颤蛋白的颤蛋白片段的图示。将R3-R6片段与仅含第三剪接区的颤蛋白片段R3、含有剪接在一起的剪接区R3和R4的R3-4、含有剪接在一起的重复序列区R3、R4和R5的R3-R5和包含剪接到R6区的R5区的R5-R6片段进行比较。还示出了分别含有剪接到R5区或R6区的R3区的片段R3+R5和R3+R6。
图8是3+6颤蛋白片段的序列。所述片段通过将3-4环连接到5-6环，由此将重复序列3附连到重复序列6来形成。信号肽区用深灰色突出显示，随后是用浅灰色突出显示的重复序列区3。3-4的连接环区为中灰色，然后是深灰色的5-6的连接环区和重复序列区6。
图9是3+5颤蛋白片段的序列。所述片段通过将3-4环连接到4-5环，由此将重复序列3附连到重复序列5来形成。信号肽区用深灰色突出显示，随后是用浅灰色突出显示的重复序列区3。3-4的连接环区为中灰色，然后是深灰色的4-5的连接环区和重复序列区5。
图10是示出了使用小鼠颤蛋白片段的ApoER2萤光素酶测定法的图。
图11是示出了使用人类颤蛋白片段的ApoER2萤光素酶测定法的图。
图12是比较小鼠颤蛋白片段和人类颤蛋白片段的ApoER2萤光素酶测定法的图。
图13(A)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的印迹。代表性蛋白质印迹示出了ApoER2以及AKT和ERK的活性和磷酸化状态。ERK磷酸化是ERK活性的直接检测并代表上游信号传导途径的激活。
图13(B)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的图。在各个不同时间点测量ApoER2的活性并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为5-6。
图13(C)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的图。在各个不同时间点测量AKT的磷酸化水平并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为5-6。
图13(D)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的图。在各个不同时间点测量总AKT水平并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为5-6。
图13(E)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的图。在各个不同时间点测量细胞外调控激酶(ERK)的磷酸化水平并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为5-6。
图13(F)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的图。在各个不同时间点测量细胞外调控激酶(ERK)的总水平并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为5-6。
图13(G)是示出了用200μM纯化的代表重复序列3-6(R3-6)的颤蛋白片段处理并在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)裂解的原代神经元培养物的图。确定磷酸化的细胞外调控激酶(ERK)与总的细胞外调控激酶(ERK)之比并标准化到无处理(0时)。ERK的磷酸化状态是ERK活性的直接检测，并代表了上游信号传导途径的激活。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为5-6。
图14(A)是示出了用200μM纯化的颤蛋白片段处理的原代神经元培养物的印迹，所述片段代表了颤蛋白重复序列人类序列R3和R5(hR3+5)、人类重复序列R3至R6(hR3-6)、小鼠颤蛋白重复序列R3至6(R3-6)、小鼠N端至R2(NR2)和由全长序列和所有天然存在的片段构成的全长颤蛋白(FR)。对照(ctrl)由未处理的细胞构成。将颤蛋白在细胞上温浴60分钟，然后将细胞裂解。对总的和磷酸化的细胞外调控激酶(ERK)进行了代表性蛋白质印迹。
图14(B)是示出了用200μM纯化的颤蛋白片段处理的原代神经元培养物的图，所述片段代表了颤蛋白重复序列人类序列R3和R5(hR3+5)、人类重复序列R3至R6(hR3-6)、小鼠颤蛋白重复序列R3至6(R3-6)、小鼠N端至R2(NR2)和由全长序列和所有天然存在的片段构成的全长颤蛋白(FR)。对照(ctrl)由未处理的细胞构成。将颤蛋白在细胞上温浴60分钟，然后将细胞裂解。在各个不同时间点测量磷酸化的细胞外调控激酶(ERK)的水平并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为4。
图14(C)是示出了用200μM纯化的颤蛋白片段处理的原代神经元培养物的图，所述片段代表了颤蛋白重复序列人类序列R3和R5(hR3+5)、人类重复序列R3至R6(hR3-6)、小鼠颤蛋白重复序列R3至6(R3-6)、小鼠N端至R2(NR2)和由全长序列和所有天然存在的片段构成的全长颤蛋白(FR)。对照(ctrl)由未处理的细胞构成。将颤蛋白在细胞上温浴60分钟，然后将细胞裂解。在各个不同时间点测量细胞外调控激酶(ERK)的总水平并归一化到肌动蛋白。所有图显示了平均值±S.E.M。样本量为4。
图15是示出了使用全长颤蛋白的Dab-1磷酸化测定法的图。
图16是示出了Dab-1磷酸化随暴露于全长颤蛋白后的时间而变的线状图。
图17是示出了使用R3-6颤蛋白片段的Dab-1磷酸化测定法的图。
图18是示出了Dab-1磷酸化随暴露于R3-6颤蛋白片段后的时间而变的线状图。
图19.用Fc-RAP灌注增强了海马LTP诱导。海马切片用Fc-RAP(10μg/ml)、Fc(10μg/ml)或对照介质灌注。记录基线突触反应和HFS后即时以及HFS后直至60min()的增强作用。箭头表示用相隔20s的两串1-s长、100-Hz刺激诱导的LTP。水平线指示Fc-RAP、Fc或对照介质的施加。结果被显示为平均值±平均值的标准误差。fEPSP，场兴奋性突触后电位，Strasser等，2004。
图20(A)是示出了颤蛋白通过突触后机制提高NMDAR电流的电描记图。测量EPSCNMDA的图解。所述线代表未处理、模拟处理和颤蛋白处理，显示出颤蛋白处理通过钙传导提高NMDA受体功能。
图20(B)是示出了颤蛋白通过突触后机制提高NMDAR电流的电描记图。使用AP5测量EPSCNMDA的图解。所述线代表未处理、模拟处理和颤蛋白处理，显示出颤蛋白处理通过钙传导提高NMDA受体功能。
图21(A)是示出了EPSCNMDA的测量的图。深灰色迹线代表mEPSCNMDA。
图21(B)是示出了颤蛋白处理显著提高mEPSCNMDA振幅的图(实心圆圈，颤蛋白之前；空心圆圈，颤蛋白之后；***p<0.001；n＝18；配对t检验)。使用模拟处理没有效果[实心正方形，模拟处理之前；空心正方形，模拟处理之后；不显著(ns)，p>0.05；n＝13；配对t检验]。
图21(C)是示出了在三个时间点的突触传递的图，无颤蛋白处理、用颤蛋白处理和对两者进行比较的合成图。
图21(D)是示出了在来自于9个细胞的记录的基础上揭示出1/CV2比率和平均EPSCNMDA比率(颤蛋白之后/之前)没有相关性的图(r＝0.31；p＝0.4；Spearman检验)。
图22(A)是蛋白质印迹，显示出颤蛋白信号传导改变谷氨酸受体亚基的表面表达和总水平。代表性印迹显示出GluR1、NR1、NR2A和NR2B的表面和总水平两者。
图22(B)从4个蛋白质印迹实验合并的表面谷氨酸受体亚基的定量结果。与模拟组相比，在长期颤蛋白处理后表面GluR1和NR2A两者显著增加[GluR1，F(2,11)＝15.56，***P<0.001；NR2A，F(2,11)＝44.9，***P<0.001]，并且表面NR2B的水平显著降低[F(2,11)＝22.6，***P<0.001]。
图22(C)从4个蛋白质印迹实验合并的总蛋白水平的定量结果。颤蛋白处理显著提高总GluR1[F(2,11)＝11.2，**P<0.01]、NR2A[F(2,14)＝9.75，**P<0.01]的水平，并降低总NR2B的水平[F(2,11)＝4.1，*P<0.05]。相反，没有观察到NR1的总的或表面(在B中)水平。
图23(A)是显示了颤蛋白对树突棘密度的影响的图。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。WT神经元上的树突棘被显示在代表性原代树突的放大照片中。
图23(B)是显示了颤蛋白对树突棘密度的影响的图像。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。与WT小鼠相比，在HRM中树突棘减少，但在用颤蛋白处理后，棘密度被挽救。树突棘被定义为从原代树突的任何突起，不包括任何次生树突。对每50μm的树突进行树突棘计数和测量。与模拟处理的细胞(n＝3)相比，在颤蛋白处理的细胞(n＝3)中存在棘的显著增加。
图23(C)是显示了颤蛋白对树突棘密度的影响的图像。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。与WT小鼠相比，在HRM中树突棘减少，但在用颤蛋白处理后，棘密度被挽救。树突棘被定义为从原代树突的任何突起，不包括任何次生树突。对每50μm的树突进行树突棘计数和测量。与模拟处理的细胞(n＝3)相比，在颤蛋白处理的细胞(n＝3)中存在棘的显著增加。
图23(D)是显示了颤蛋白对树突棘密度的影响的图像。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。在颤蛋白敲除小鼠中树突棘非常稀少，但在用颤蛋白处理后，棘密度缺乏被挽救。树突棘被定义为从原代树突的任何突起，不包括任何次生树突。对每50μm的树突进行树突棘计数和测量。与模拟处理的细胞(n＝3)相比，在颤蛋白处理的细胞(n＝3)中存在棘的显著增加。
图23(E)是显示了颤蛋白对树突棘密度的影响的图像。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。在颤蛋白敲除小鼠中树突棘非常稀少，但在用颤蛋白处理后，棘密度缺乏被挽救。树突棘被定义为从原代树突的任何突起，不包括任何次生树突。对每50μm的树突进行树突棘计数和测量。与模拟处理的细胞(n＝3)相比，在颤蛋白处理的细胞(n＝3)中存在棘的显著增加。
图23(F)是显示了颤蛋白对树突棘密度的影响的图像。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。树突棘使用共聚焦显微镜来定量。树突棘被定义为从原代树突的任何突起，不包括任何次生树突。对每50μm的树突进行树突棘计数和测量。与模拟处理的细胞(n＝3)相比，在颤蛋白处理的细胞(n＝3)中存在棘的显著增加。
图24(A)是显示出MMP-9调节颤蛋白加工的印迹。MMP-9(活性形式；Calbiochem，PF140)影响颤蛋白加工的能力，通过将颤蛋白(50nM)与不同浓度的MMP-9(1-4ug/ml)在PBS中在37℃下反应3小时来确定。包含EDTA(10mM)作为阴性对照，因为它阻断MMP9活性。用1:10的反应液进行蛋白质印迹，并用抗颤蛋白抗体(G10)探测。
图24(B)是显示出MMP-9调节颤蛋白加工的印迹。MMP-9(250nM)在原代皮层神经元中影响颤蛋白加工的能力，24小时后在提取的蛋白质上清液中确定。对细胞蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析并用G10检测。
图24(C)是显示出MMP-9调节颤蛋白加工的印迹。MMP-9(250nM)在原代皮层神经元中影响颤蛋白加工的能力，24小时后在提取的蛋白质上清液中确定。对蛋白质提取物上清液进行蛋白质印迹分析并用G10检测。
图24(D)是显示出MMP-9调节颤蛋白加工的印迹。MMP-9抑制剂(25nM；Calbiochem444278)在原代皮层神经元中影响颤蛋白加工的能力，24小时后在提取的蛋白质上清液中确定。对细胞蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析并用G10检测。
图24(E)是显示出MMP-9调节颤蛋白加工的印迹。MMP-9抑制剂(25nM；Calbiochem444278)在原代皮层神经元中影响颤蛋白加工的能力，24小时后在提取的蛋白质上清液中确定。对蛋白质提取物上清液进行蛋白质印迹分析并用G10检测。
图25是显示出颤蛋白对树突棘密度的影响的印迹。将颤蛋白长期施加到原代海马神经元培养物，以检查它对树突棘密度的影响。培养物中的颤蛋白水平通过蛋白质印迹来确定。在0、6、12、24、48、72和96小时从培养物取出样品，以确定颤蛋白在体外的降解水平。最后一列颤蛋白代表施加到培养物的浓度的本源物。颤蛋白一直存在到引入到培养物中之后96小时，并且直至72小时才开始降解。
图26(A)是显示了颤蛋白增补可以提高联想学习和空间学习的图。野生型小鼠在接受恐惧条件化之前3小时通过双侧注射到脑室中给药5nM RAP或5nM颤蛋白。训练后24hrs，将小鼠置于情景中并测量僵直。发现RAP抑制学习和记忆，而颤蛋白引起增强(RAP n＝9，未电击n＝5，未处理n＝7，颤蛋白n＝5；p>0.05)。
图26(B)是显示了颤蛋白增补可以提高联想学习和空间学习的图。训练野生型小鼠通过Morris水迷宫发现隐蔽平台。对小鼠提供5nM颤蛋白(红色圆圈，n＝4)或介质(空心圆圈，n＝6)的单次注射。在第5天提供探索实验，然后在第6天训练小鼠发现新的平台位置。对小鼠提供5nM颤蛋白(n＝4)或介质(n＝6)的单次注射。
图26(C)是显示了颤蛋白增补可以提高联想学习和空间学习的图。训练野生型小鼠通过Morris水迷宫发现隐蔽平台。对小鼠提供5nM颤蛋白(红色圆圈，n＝4)或介质(空心圆圈，n＝6)的单次注射。检查来自于第1天个体实验的潜伏期。(*＝p>0.05)对小鼠提供5nM颤蛋白(n＝4)或介质(n＝6)的单次注射。
图27(A)是显示出情景恐惧条件化改变颤蛋白水平的印迹。使用3次电击的情景恐惧条件化方案(CFC)对野生型小鼠进行训练。未电击的小鼠(CS)被用作阴性对照，电击且暴露于情景的小鼠(CS/US)在训练后1、5、15、30和180分钟以及训练后18小时取出它们的海马(n＝4，时间点)。使用抗颤蛋白抗体(G10)检测海马匀浆液中的颤蛋白。
图27(B)是显示出情景恐惧条件化改变颤蛋白水平的图。使用3次电击的情景恐惧条件化方案(CFC)对野生型小鼠进行训练。未电击的小鼠(CS)被用作阴性对照，电击且暴露于情景的小鼠(CS/US)在训练后1、5、15、30和180分钟以及训练后18小时取出它们的海马(n＝4，时间点)。对全长颤蛋白的颤蛋白水平进行定量。星号表示双尾t-检验后的统计显著性，其中p<0.5。
图28(A)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的印迹。对来自于14月龄的野生型、Tg2576(SweAPP)、PS1-FAD(M146L)和2X(SweAPP x M146L)小鼠的分离的皮层的蛋白质印迹进行分析(n＝4)。与野生型相比，在Tg2576中没有检测到颤蛋白450、190和180kDa产物的显著差异，但在Tg2576和2X小鼠中，被G10识别的未鉴定的N-端物质显著升高。相反，在PS1-FAD和2X小鼠中颤蛋白450和180kDa产物显著升高(p<0.05)。
图28(B)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的印迹。对来自于14月龄的野生型、PS1-FAD(M146L)和2X(SweAPP x M146L)小鼠的分离的皮层的蛋白质印迹进行分析(n＝4)。在Tg2576小鼠中存在Dab1-pTyr220的显著减少，并且在PS1-FAD和2X小鼠两者中显著升高。
图28(C)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的图。在刺激之前施加颤蛋白(5nM)能够在Tg2576小鼠的CA1区域中挽救HFS刺激的LTP的缺乏。
图29(A)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的图像。在14月龄Tg2576小鼠的水平切片上使用3-表位策略对颤蛋白体内加工进行作图。颤蛋白-CT(G20)检测的含有R7-8的颤蛋白片段，被螯合在用6E10(抗Aβ抗体)检测的致密核心斑块的核心处。
图29(B)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的图像。在14月龄Tg2576小鼠的水平切片上使用3-表位策略对颤蛋白体内加工进行作图。颤蛋白-NT检测的含有N-R2的颤蛋白片段，被螯合在用6E10(抗Aβ抗体)检测的致密核心斑块的核心处。
图29(C)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的图像。在14月龄Tg2576小鼠的水平切片上使用3-表位策略对颤蛋白体内加工进行作图。颤蛋白–MT(AF3820)检测的含有R3-6的颤蛋白片段，被螯合在用6E10(抗Aβ抗体)检测的致密核心斑块的核心处。
图29(D)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的图像。将14月龄Tg2576小鼠水平切片的颤蛋白-CT(G20)和–MT(AF3820)的免疫荧光图像合并，其被螯合在用6E10(抗Aβ抗体)检测的致密核心斑块的核心处。
图29(E)是显示出在AD小鼠模型中颤蛋白信号传导被改变的图像。放大的14月龄Tg2576小鼠的免疫荧光图像显示出在tg2576小鼠模型中，颤蛋白-NT片段(N-R2)围绕斑块核心。比例尺＝15μm。
图30.向来自于12月龄Tg2576小鼠的海马切片提供使用标准的2串100Hz HFS的LTP诱导。将一组切片用5nM颤蛋白灌注。颤蛋白处理的切片显示出与野生型水平相比LTP诱导的提高。
图31是显示了使用颤蛋白的治疗在长期TBI中引起功能性恢复的图。抬高身体摆动试验指示了在用皮层冲击器引起创伤性脑损伤后基线的摆动偏离，其被颤蛋白减轻。
图32是显示了使用颤蛋白的治疗在长期TBI中引起功能性恢复的图。肢体运动不能(akinesia)指示了在用皮层冲击器引起创伤性脑损伤后基线的随意肢体运动的丧失，其被颤蛋白减轻。
图33是显示了使用颤蛋白的治疗在长期TBI中引起功能性恢复的图。爪抓握指示了在用皮层冲击器引起创伤性脑损伤后基线的肢体力量的丧失。
图34是在SA2和SA3中使用的一些构建物和颤蛋白切割位点的图示。MMP-9可以在区域2与3之间切割，但也已显示仅仅在体外反应期间在区域7中切割。tPA可以在区域6与7之间切割。提出的构建物被制造成没有体外MMP-9结合位点并具有C和N末端标签两者。Rln-Res＝颤蛋白切割抗性；Rln-Lab＝颤蛋白不稳定。
图35(A)是显示出tPA调节颤蛋白加工的印迹。tPA/纤溶酶原影响颤蛋白加工的能力，通过将颤蛋白(50nM)与tPA(60ug/ml)、无活性纤溶酶原(18ug/ml)、tPA和纤溶酶原、以及纤溶酶(有活性，0.5U/ml)在PBS中在37℃下反应45分钟来确定。反应在蛋白质印迹(以1:10)上进行，并用抗颤蛋白抗体(G10，一种识别N-R2的抗体)和抗颤蛋白抗体(Ab14，一种识别R7-8的抗体)探测。
图35(B)是显示出tPA调节颤蛋白加工的印迹。tPA在原代皮层神经元中影响颤蛋白代谢的能力，通过将新鲜上清液中的细胞与70nM tPA温浴24小时来确定。对细胞蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析并用G10检测。
图35(C)是显示出tPA调节颤蛋白加工的印迹。tPA在原代皮层神经元中影响颤蛋白代谢的能力，通过将新鲜上清液中的细胞与70nM tPA温浴24小时来确定。对蛋白质提取物上清液进行蛋白质印迹分析并用G10检测。
图36(A)是三表位作图的图示。颤蛋白由N-端区、然后是CR-50静电结构域(浅灰色)、F-脊椎蛋白结构域(H)和8个连续的EGF样重复序列构成。示出了各种不同的抗体，指示了颤蛋白结构的针对相应抗体的表位区。
图36(B)是三表位作图的图示。独特地识别颤蛋白的N-R2、R3-R6和R7-R8区域的抗体可用于确定全长颤蛋白及其主要片段的分布。
图37是显示了RAP对颤蛋白和ApoER2表达的影响的图。ApoER2表达的降低与在海马、额叶前皮层和顶叶皮层中施加GST-RAP(受体结合蛋白，其结合到所有脂蛋白受体)相关联。
图38(A)是显示了hR3-6的施加提高原代神经元培养物中的ApoEr2表达的印迹。将神经元(E17，DIV8)用hR3-6处理1hr，并用识别ApoEr2的抗体3326探测。N＝3-4。
图38(B)是显示了hR3-6的施加提高原代神经元培养物中的ApoEr2表达的图。将ApoEr2水平归一化到肌动蛋白并从蛋白质印迹定量。
优选实施方式的详细描述
当在本文中使用时，没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。因此，例如，对“多肽”的指称包括两种或更多种多肽的混合物等。
当在本文中使用时，“约”意味着近似或接近，并且在陈述数值或范围的情形中意味着所述数值的±15％。
当在本文中使用时，“给药”被用于描述将本发明的化合物单独地或与其他化合物相组合递送到患者的过程。所述组合物可以以各种不同的方式给药，包括口服、肠胃外(是指静脉内和动脉内和其他适合的肠胃外途径)、囊内(intratheceally)、肌肉内、皮下、结肠、直肠和鼻方式等。可以使用治疗疾病或病症的本发明的化合物的其他给药途径容易地治疗每种这些病症。本发明的化合物和组合物获得治疗或预防效果的剂量，正如本领域中已知的，由所述患者的情况决定。本文中患者的给药，可以通过本文中的化合物或组合物的单个或单元剂量，或通过化合物或组合物的合并或预包装或预先配制的剂量来实现。平均40g的小鼠具有重量为0.416g的大脑，160g的小鼠具有1.02g重的大脑，250g的小鼠具有1.802g重的大脑。平均人类大脑重量为1508g，这可用于指导实现本文描述的治疗所需的或对于实现所述治疗有用的治疗剂的量。
本发明的药物组合物可以按照用于制备可药用组合物的已知方法来配制。此外，当在本文中使用时，短语“可药用载体”意味着任何标准的可药用载体。所述可药用载体可以包括稀释剂、辅助剂和媒剂，以及植入物载体和惰性、无毒性的固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料，其不与本发明的活性成分反应。实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水和乳液例如油/水乳液。所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、它们的适合的混合物以及植物油。制剂被描述在本领域技术人员公知且容易获得的大量来源中。例如，《Remington制药学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)(Martin EW[1995]Easton Pennsylvania,Mack PublishingCompany，第19版)描述了可以与本发明相关联使用的制剂。
当在本文中使用时，“动物”意味着分类在动物界或后生动物界中的多细胞、真核生物。所述术语包括但不限于哺乳动物。非限制性实例包括啮齿动物、水生哺乳动物、驯养动物例如狗和猫、农场动物例如绵羊、猪、奶牛和马，以及人类。在使用术语“动物”或“哺乳动物”或它们的复数的情况下，设想了它也适用于任何动物。
当在本文中使用时，短语“保守替换”是指将氨基酸用具有相似性质(例如酸性、碱性、带正或负电荷、极性或非极性)的其他氨基酸替换。下面的表1含有对于彼此是保守替换的氨基酸。
表1示出了基于官能团分类的氨基酸，指示了保守替换。示出了编码每种氨基酸的冗长的三联体密码用于参考。
当在本文中使用时，“保守突变”是指将核苷酸用不引起氨基酸的编码改变的核苷酸替换，即改变为简并密码子中的冗余序列，或产生保守替换的核苷酸替换。密码子冗余性的实例示出在表2中。
表2示出了冗余的三联体密码和相应的编码氨基酸。
因此，对于密码子UUA的保守突变包括UUG、CUU、CUC、CUA和CUG。
当在本文中使用时，短语“从颤蛋白的片段重复序列形成的构建物”是指由从合并颤蛋白的重复序列区获得的片段产生的人造蛋白质。正如在本说明书中看到的，全长颤蛋白包含被称为重复序列的DNA或氨基酸(对于蛋白质来说)区域，例如R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8区，正如在图3的氨基酸序列和段落[0061]中看到的。环区位于这些重复序列区之间，其被用于连接两个重复序列区。
当在本文中使用时，“环区”意味着对应于RNA环结构的一段颤蛋白核酸序列，其配置在两个重复序列区之间并连接所述两个重复序列区。术语“重复序列区”意味着形成基础重复单元的一段颤蛋白核酸序列。具体的“重复序列区”在本说明书中公开。在特定实施方式中，所述“环区”是由在特定单链核苷酸区两侧带有互补区的核酸单链形成的结构，所述互补区以在所述互补区之间的单链核苷酸区被排除在双链体形成或Watson-Crick碱基配对之外的方式杂交。
当在本文中使用时，术语“患者”被理解为包括接受或打算接受治疗的动物，特别是哺乳动物，更特别是人类。
当在本文中使用时，术语“治疗有效量”意味着活性化合物或药剂在组织、系统、动物或人类中引发研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的生物或医学响应的量。对于神经变性疾病或神经损伤来说，有效量包括足以阻止神经元进一步退化或损伤、减轻所述神经变性疾病或神经损伤的症状或提高树突密度的量。在某些实施方式中，有效量是足以延迟神经变性疾病的发展的量。在某些实施方式中，有效量是足以阻止或延迟所述神经变性疾病的发生和/或复发的量。取决于需求或个体的颤蛋白代谢率，有效量可以在一剂或相隔2周或更多周的多个剂量中给药。
当在本文中使用时，“校正”是指潜在的神经变性疾病或损伤的消解。例如，校正阿兹海默氏病是指神经元死亡的终止。
当在本文中使用时，“治疗”是指获得有益或所需的临床结果。有益或所需的临床结果包括但不限于下述任一者或多者：一种或多种症状的减轻，神经变性疾病或来自于神经损伤的损害的程度的减小，神经变性疾病或神经损伤的状态的稳定化(即不恶化)，阻止或延迟神经变性疾病或神经损伤的发生或复发，延迟或减缓疾病进展，以及疾病状态的改善。本发明的方法设想了这些治疗方面中的任一者或多者。
当在本文中使用时，“神经元损伤”意味着由某个或某些外部条件造成的突然物理伤害产生的神经组织损伤。这些外部条件的非限制性实例包括暴力或事故、骨折、击打或手术程序。
“可药用”组分是适合用于人类和/或动物，与合理的利益/风险比相称的没有过量不利副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)的组分。
当在本文中使用时，“安全有效量”是指在以本发明的方式使用时，组分的足以产生所需治疗响应、与合理的利益/风险比相称的没有过量不利副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)的量。
“可药用载体”是用于将所讨论的一种或多种化合物递送到动物或人类的载体，例如溶剂、悬浮剂或媒剂。所述载体可以是液体或固体，并考虑计划的给药方式进行选择。当在本文中使用时，“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬液、胶体等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或药剂与所述活性成分不相容，否则都设想了将其用于治疗组合物中。
本发明的化合物可以被配制成药物组合物，并以适应于所选给药途径例如口服或腹膜内如静脉内或动脉内或脑内途径的各种不同形式给药到患者，例如人类患者。
所述活性化合物也可以通过输注或注射而大脑内或腹膜内给药，例如静脉内或动脉内。活性化合物或其盐的溶液可以制备在水或其他适合的溶剂中，并任选地与无毒性表面活性剂混合。也可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中和在油中制备分散系。在常见储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射或输注的药物剂型可以包括无菌水性溶液或分散系，或适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散系的包含活性成分的无菌粉剂。在所有情况下，最终的剂型必须是无菌的流体，并且在制造和储存条件下稳定。液体载体或媒剂可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒性甘油酯及其适合的混合物。适合的流动性可以通过在分散系的情况下维持所需的粒径或通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选地包含等渗剂，例如糖类、缓冲剂或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液通过将活性化合物以所需量并根据需要与上面列举的几种其他成分一起并入到适合的溶剂中，然后进行过滤除菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这产生活性成分加上存在于之前除菌过滤的溶液中的任何其他所需成分的粉剂。
有用的固体载体包括细分的固体例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、醇类或多元醇或水-醇/多元醇掺混物，本发明的化合物可以任选地在无毒性表面活性剂的帮助下以有效的水平溶解或分散在其中。
本发明的化合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。将小鼠和其他动物中的有效剂量外推到人类的方法，在本领域中是已知的(美国专利号4,938,949(Borch等))。
因此，本发明包括药物组合物，其包含如上所述的本发明的化合物，并具有或不具有可药用载体。适合于脑室内、脑内或肠胃外给药，包含有效治疗神经变性疾病或神经损伤的量的一种或多种化合物的药物组合物，是本发明的优选实施方式。
实施例1
使用颤蛋白的全长人类序列(Gene ID：5649，Nat’l Center for BiotechnologyInformation,U.S.Nat’l Library of Medicine,Bethesda,MD；Human Gene NomenclatureCommittee,Cambridgeshire,UK,HGNC:HGNC:9957)形成重组颤蛋白片段，以确定重复序列的具体区域。所述片段被商业化生产，并在收到后在构建物构建和蛋白质生产之前测序。
全长人类颤蛋白(SEQ ID No.1)
序列图谱，包括颤蛋白重复序列区和一些酶切位点，示出在图5中。
将HEK293细胞用pCrl载体中的全长颤蛋白基因稳定转染，以产生用于形成重组颤蛋白的片段。将全长颤蛋白如前所述插入到HEK293细胞中(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptors cooperate to enhancehippocampal synaptic plasticity and learning)，J.Biol.Chem.2002；277:39944–39952；Sinagra等，在体外海马成熟期间颤蛋白、极低密度脂蛋白受体和载脂蛋白E受体2控制体细胞NMDA受体组成(Reelin,very-low-density lipoprotein receptor,andapolipoprotein E receptor 2 control somatic NMDA receptor composition duringhippocampal maturation in vitro)，J.Neurosci.2005；25:6127–6136)。在合生后，将细胞在含有0.2％牛血清白蛋白的低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基中生长2天，然后收集培养基，除菌过滤，并通过Centricon Plus-80离心过滤装置(Millipore)浓缩。将颤蛋白在细胞外在两个位点处切割，导致产生三个主要片段：N-端到重复序列2(大致180kDa)、重复序列3–6的中央片段(大致190kDa)和由重复序列7和8构成的C-端片段(大致80kDa)(Nakajima等，在体内通过针对颤蛋白的CR-50mAb破坏海马发育(Disruption ofhippocampal development in vivo by CR-50mAb against Reelin)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997；94:8196–820；de Rouvroit等，(1999)，颤蛋白突变小鼠中缺陷的细胞外基质蛋白颤蛋白被金属蛋白酶加工(Reelin,the extracellular matrixprotein deficient in reeler mutant mice,is processed by a metalloproteinase)，Exp.Neurol.1999；156:214–217；Utsunomiya-Tate等，颤蛋白分子组装在一起形成被功能阻断性CR-50抗体抑制的大的蛋白复合体(Reelin molecules assemble together toform a large protein complex,which is inhibited by the function-blocking CR-50antibody)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97:9729–9734；Jossin等，由体内蛋白水解加工产生的颤蛋白的中央片段对于它在皮层板发育期间的功能是关键的(The centralfragment of Reelin,generated by proteolytic processing in vivo,is critical toits function during cortical plate development)，J.Neurosci.2004；24:514–521；Jossin等，颤蛋白被胚胎神经元的加工对在组织但不是在解离的培养神经元中的功能来说是重要的(Processing of Reelin by embryonic neurons is important for functionin tissue but not in dissociated cultured neurons)，J.Neurosci.2007；27:4243–4252；Koie等，颤蛋白重复序列3内的切割调控颤蛋白信号传导活性的持续时间和范围(Cleavage within Reelin repeat 3regulates the duration and range of thesignaling activity of Reelin protein)，J.Biol.Chem.2014；289:12922–12930；Krstic等，通过组织纤溶酶原激活物(tPA)、ADAMTS-4、ADAMTS-5及其调节物的相互作用调控颤蛋白的蛋白水解加工(Regulated proteolytic processing of Reelin through interplayof tissue plasminogen activator(tPA),ADAMTS-4,ADAMTS-5 and their modulators)，PLoS One.2012；7:e47793；Trotter等，在突触增强后颤蛋白被组织纤溶酶原激活物的细胞外蛋白水解(Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogenactivator following synaptic potentiation)，Neuroscience.2014；274:299–307)。此外，产生两个中间片段：一个由N-端到重复序列6构成(大致370kDa)，一个由重复序列6–8构成(大致270kDa)(Jossin等，由体内蛋白水解加工产生的颤蛋白的中央片段对于它在皮层板发育期间的功能是关键的(The central fragment of Reelin,generated byproteolytic processing in vivo,is critical to its function during corticalplate development)，J.Neurosci.2004；24:514–521)。
如上所讨论的，进行全长颤蛋白的切割，以形成粘性末端。对于重组颤蛋白来说，通过连接代表特定颤蛋白重复序列的DNA序列来产生两个或更多个颤蛋白片段。也对得到的颤蛋白重复序列区测序，以确认编码区得以维持并且阅读框采取正确取向。颤蛋白重组蛋白使用标准技术来生产，并在bluescript保持载体中扩增。将重组DNA克隆到表达载体中，并在HEK293细胞培养物中表达。
颤蛋白重复序列3(SEQ ID No.2)
TTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGATGCTGGTATGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCGAAGGAAACTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGACAAGAATCACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAGGAGAGCAGCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTTGTCCCAGTTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATATACTGCTGCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTTGAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAACACTTAACGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCCTCTGGACACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGCATTACCTGCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATGGGATACTCTGGCATTTGCTTCGAGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG
颤蛋白重复序列4(SEQ ID No.3)
CCCTTCAGCAACTCCCACAGTGTACAGCTCCAGTATTCTCTGAACAATGGCAAGGACTGGCATCTTGTCACCGAAGAGTGTGTTCCTCCAACCATTGGCTGTCTGCATTACACGGAAAGTTCAATTTACACCTCGGAAAGATTCCAGAATTGGAAGCGGATCACTGTCTACCTTCCACTCTCCACCATTTCTCCCAGGACCCGGTTCAGATGGATTCAGGCCAACTACACTGTGGGGGCTGATTCCTGGGCGATTGATAATGTTGTACTGGCCTCAGGGTGCCCTTGGATGTGCTCAGGACGAGGGATTTGTGATGCTGGACGCTGTGTGTGTGACCGGGGCTTTGGTGGACCCTATTGTGTTCCTGTTGTTCCTCTGCCCTCGATTCTTAAAGACGATTTCAATGGGAATTTACATCCTGACCTTTGGCCTGAAGTGTATGGTGCAGAGAGGGGGAATCTGAATGGTGAAACCATCAAATCTGGAACATCTCTAATTTTTAAAGGGGAAGGACTAAGGATGCTTATTTCAAGAGATCTAGATTGTACAAATACAATGTATGTCCAGTTTTCACTTAGATTTATAGCAAAAAGTACCCCAGAGAGATCTCACTCTATTCTGTTACAATTCTCCATCAGTGGAGGAATCACTTGGCACCTGATGGATGAATTTTACTTTCCTCAAACAACG
颤蛋白重复序列5(SEQ ID No.4)
GATAGCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACTGGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACCTTCTGCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGCAGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCACCCCAGCAGCACCTACTACGCAGGAACCATGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGGAAGCTGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTTCAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTCAGCCAGTGACATGGGCCATTGATAATGTCTACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGGACAGGGGAGCTGTATCAATGGAACCAAATGTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGTAAAATAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCTCAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATAGATTCTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCATCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAACCTCTTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCATGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCTAGATTTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGGATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAACCCGTGCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGTGGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTTCAGCAATTCCAGC
颤蛋白重复序列6(SEQ ID No.5)
GTCACAGACTCTTGTTATGCGATTGAATTGGAATACTCAGTAGATCTTGGATTGTCATGGCACCCATTGGTAAGGGACTGTCTGCCTACCAATGTGGAATGCAGTCGCTATCATCTGCAACGGATCCTGGTGTCAGACACTTTCAACAAGTGGACTAGAATCACTCTGCCTCTCCCTCCTTATACCAGGTCCCAAGCCACTCGTTTCCGTTGGCATCAACCAGCTCCTTTTGACAAGCAGCAGACATGGGCAATAGATAATGTCTATATCGGGGATGGCTGCATAGACATGTGCAGTGGCCATGGGAGATGCATCCAGGGAAACTGCGTCTGTGATGAACAGTGGGGTGGCCTGTACTGTGATGACCCCGAGACCTCTCTTCCAACCCAACTCAAAGACAACTTCAATCGAGCTCCATCCAGTCAGAACTGGCTGACTGTGAACGGAGGGAAATTGAGTACAGTGTGTGGAGCCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTCCATTTCAGTGGGGGTTGTAGTCGATTATTAGTCACTGTGGATCTAAACCTCACTAATGCTGAGTTCATCCAATTTTACTTCATGTATGGGTGCCTGATTACACCAAACAACCGTAACCAAGGTGTTCTCTTGGAATATTCTGTCAATGGAGGCATTACCTGGAACCTGCTCATGGAGATTTTCTATGACCAGTACAGT
颤蛋白重复序列环区3-4(SEQ ID No.6)
GAACCACAGATCATTTCCATTGACCTGCCACAGGACGCGAAGACACCTGCAACGGCATTTCGATGGTGGCAACCGCAACATGGGAAGCATTCAGCCCAGTGGGCTTTGGATGATGTTCTTATAGGAATGAATGACAGCTCTCAAACTGGATTTCAAGACAAATTTGATGGCTCTATAGATTTGCAAGCCAACTGGTATCGAATCCAAGGAGGTCAAGTTGATATTGACTGTCTCTCTATGGATACTGCTCTGATATTCACTGAAAACATAGGAAAACCTCGTTATGCTGAGACCTGGGATTTTCATGTGTCAGCATCTACCTTTTTGCAGTTTGAAATGAGCATGGGCTGTAGCAAG
颤蛋白重复序列环区4-5(SEQ ID No.7)
AATATACTTTTCATCAATGTTCCCTTGCCATACACTGCCCAAACCAATGCTACAAGATTCAGACTCTGGCAACCTTATAATAACGGTAAGAAAGAAGAAATCTGGATTGTTGATGACTTCATTATCGATGGAAATAATGTAAACAACCCTGTGATGCTCTTGGATACATTTGATTTTGGGCCCAGAGAAGACAATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAACATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCACCTGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTTGTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCGTGACCTAAATGTGAATGAGAACACCATCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACT
颤蛋白重复序列环区5-6(SEQ ID No.8)
AATGTGGGCAGGTACATTGCCCTGGAGATACCCTTGAAAGCCCGTTCTGGTTCTACTCGCCTTCGCTGGTGGCAACCGTCTGAGAATGGGCACTTCTACAGCCCCTGGGTTATCGATCAGATTCTTATTGGAGGAAATATTTCTGGTAATACGGTCTTGGAAGATGATTTCACAACCCTTGATAGTAGGAAATGGCTGCTTCACCCAGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATGCCCTGGTCTTCATTGAAAAGGCCAGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGAGGATTCCTTCCTACAGATAGACTTCGCTGCCTCCTGCTCA
重组人类颤蛋白基因构建物，偶联到R6片段的R3片段，即颤蛋白片段R3+R6(SEQID No.9)
重组人类颤蛋白蛋白质，偶联到R6片段的R3片段，即颤蛋白蛋白质片段R3+R6(SEQID No.10)
MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNSRELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSYCSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLNDGKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFYIQIGSKTSGITCIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILWHLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQDKFDGSITLDSRKWLLHPGGTKMPVCGSTGDALVFIEKASTRYVVSTDVAVNEDSFLQIDFAASCSVTDSCYAIELEYSVDLGLSWHPLVRDCLPTNVECSRYHLQRILVSDTFNKWTRITLPLPPYTRSQATRFRWHQPAPFDKQQTWAIDNVYIGDGCIDMCSGHGRCIQGNCVCDEQWGGLYCDDPETSLPTQLKDNFNRAPSSQNWLTVNGGKLSTVCGAVASGMALHFSGGCSRLLVTVDLNLTNAEFIQFYFMYGCLITPNNRNQGVLLEYSVNGGITWNLLMEIFYDQYS
*编码区在上面的DNA序列中着色，平白区域(没有字体修饰例如下划线、斜体)没有翻译在蛋白质中。
重组人类颤蛋白基因构建物，偶联到R5片段的R3片段，即颤蛋白片段R3+R5(SEQID No.11)
重组人类颤蛋白蛋白质，偶联到R5片段的R3片段，即颤蛋白蛋白质片段R3+R5(SEQID No.12)
MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNSRELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSYCSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLNDGKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFYIQIGSKTSGITCIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILWHLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQDKFDGSIDDNWFFYPGGNIGLYCPYSSKGAPEEDSAMVFVSNEVGEHSITTRDLNVNENTIIQFEINVGCSTDSSSADPVRLEFSRDFGATWHLLLPLCYHSSSHVSSLCSTEHHPSSTYYAGTMQGWRREVVHFGKLHLCGSVRFRWYQGFYPAGSQPVTWAIDNVYIGPQCEEMCNGQGSCINGTKCICDPGYSGPTCKISTKNPDFLKDDFEGQLESDRFLLMSGGKPSRKCGILSSGNNLFFNEDGLRMLMTRDLDLSHARFVQFFMRLGCGKGVPDPRSQPVLLQYSLNGGLSWSLLQEFLFSNSS
*编码区在上面的DNA序列中着色，平白区域(没有字体修饰例如下划线、斜体)没有翻译在蛋白质中。
实施例2
正如在实施例1中看到的，分离来自于颤蛋白的重复序列区。切下R3区以提供DNA粘性末端。将颤蛋白基因与EcoRI和BatXI温浴，并导致切下6300bp左右的区段。然后将所述切下的R3片段插入到AAV-9或AAV-5病毒载体中。如果病毒载体具有CMV启动子例如pMDLg/pPRE或pAD3000，则将所述载体在CMV启动子之后切开。然而，在转染时CMV启动子未被配置在所述载体中，例如使用pAdEasy-1的情况下，则与所述颤蛋白片段一起添加所述启动子。形成具有与EcoRI和BatXI互补的末端的构建物，并且所述构建物含有所述颤蛋白片段和CMV启动子。将所述构建物与载体在酶例如连接酶中温浴，形成含有所述颤蛋白片段和CMV启动子的新载体。将所述载体插入到细胞中，用于产生含有所述颤蛋白片段的病毒。
尽管上述实施例讨论颤蛋白R3，但所述方法被用于其他颤蛋白变体，包括实施例1中描述的片段R3-5、片段R3+5和片段R3+6。
实施例3
如实施例1中所述形成颤蛋白片段。使用ApoER2作为报告物，在萤光素酶测定法中检查颤蛋白的不同变化形式，包括片段R3-R6、R3+R5和R3+R6。然而，也考虑到了其他可替选剪接变体例如R2(NR2)、R6(NR6)、R3-C和R7-C对本发明的情况有用。
进行萤光素酶测定法，通过图6中所示当受体簇集时发光增加，来确定ApoER2受体簇集。将萤光素酶底物溶解在萤光素酶缓冲液(1:1)和偶联到第一组ApoER2受体蛋白的N-端萤光素酶和偶联到第二组ApoER2受体蛋白的C-端萤光素酶中。将所述萤光素酶偶联的ApoER2以1:1的比例添加到每个测定板(即50μL C-端萤光素酶比50μL N-端萤光素酶)。使用ApoER2作为报告物检查在图3、7-9中看到的人类颤蛋白的不同变化形式。在添加5nM所述试验颤蛋白后，将混合物振摇10min并检测光的产生。
如图10中看到的，除了R5-6之外的所有小鼠颤蛋白片段引起2倍至4倍的发光增加。正如在图11中看到的，人类颤蛋白片段的使用增加发光信号，最多显示出与对照相比2.5倍至3倍的增加。此外，大多数人类颤蛋白片段的活性与来自于图10的最有效颤蛋白相当，因为人类R3-5、人类R3-4和人类R3+R6表现出与R3-6大约相同或更高的萤光素酶活性。人类R3+R5表现出R3-6的约50％的活性，或与图10中看到的R3+R6、R3+R5和R4+R6相当。正如在图12中看到的，小鼠和人类片段两者都有效地诱导受体簇集，正如由萤光素酶信号的增加所证实的。
实施例4
通过试验ApoER受体的激活分析了颤蛋白细胞信号传导和加工的效应。最近的工作突出了颤蛋白信号传导在正常学习和记忆中的重要性(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptors cooperate to enhancehippocampal synaptic plasticity and learning)，J Biol Chem 2002,277:39944-39952)，以及这种信号传导被扰乱时的病理情况。例如，脂蛋白受体在认知过程中有作用，并暗示这个受体家族参与构成阿兹海默氏病(AD)发展的基础的病理过程。这些受体的两种主要配体apoE和颤蛋白，似乎具有可以显著影响突触功能的信号传导能力。APC现在是颤蛋白信号传导的候选调节物，因为它似乎具有结合到ApoER2并激活下游效应物的结构组成部分。测试颤蛋白信号传导的APC调节在科学和临床上具有重大意义，因为它可能产生新的治疗途径。
分析了颤蛋白对ApoER受体活化和信号传导途径的影响。从胚胎第17天的小鼠制备原代神经元培养物，并将其在增补有B27(GibcoBRL)和l-谷氨酰胺的无血清Neurobasal培养基(Gibco BRL)中，在37℃下和5％CO2下生长。允许细胞在培养物中成熟8天。将培养物用200μM纯化的代表重复序列3-6的颤蛋白片段(R3-6)处理。在颤蛋白处理后特定时间(0、10、30、60、120或240分钟)将细胞裂解。进行蛋白质印迹以确定总ApoER2表达、AKT、AKT的磷酸化、磷酸化的细胞外调控激酶(ERK)和总的细胞外调控激酶(ERK)，并标准化到未处理(0时)。ERK的磷酸化状态是ERK活性的直接检测，并代表了上游信号传导途径激活。
在图13(A)中看到的代表性蛋白质印迹显示出相对稳定的ApoER2表达。在归一化到肌动蛋白时，发现ApoER2表达在颤蛋白暴露后的前30分钟下降，随后表达水平稳定，正如在图13(B)中看到的。AKT水平在颤蛋白暴露后60分钟内下降，而磷酸化的AKT提高，正如在图13(A)中看到的。AKT和pAKT向肌动蛋白的归一化反映出印迹趋势，其中AKT水平在颤蛋白暴露后直至60分钟下降，随后提高返回到暴露前水平，正如在图13(D)中看到的。磷酸化的AKT在暴露后急剧增加直至60分钟，然后快速下降回到暴露前水平，正如在图13(C)中看到的。总ERK在整个实验中显得一致，而磷酸化的ERK 1和2在颤蛋白暴露后10分钟和240分钟时看到，正如在图13(A)中看到的。ERK和pERK1/2向肌动蛋白的归一化与所述印迹趋势匹配，显示出在颤蛋白暴露后10分钟时强烈磷酸化，并且在颤蛋白暴露后240分钟时轻微二次增加，正如在图13(E)和(F)中看到的。发现pERK与总ERK之比在颤蛋白后10分钟达到峰值，然后缓慢下降直至颤蛋白后120分钟，随后略微增加，正如在图13(G)中看到的。
为了证实所述结果不是对所使用的颤蛋白片段(R-3-6)特异的，正如在图14(A)中看到的，使用其他颤蛋白片段重复了所述原代神经元培养物实验。将所述原代神经元培养物用200μM纯化的颤蛋白片段处理，所述片段代表了颤蛋白重复序列人类序列R3和R5(hR3+5)、人类重复序列R3和R6(hR3+6)、小鼠颤蛋白重复序列R3至6(R3-6)、小鼠N端至重复序列R2(NR2)和由全长序列和所有天然存在的片段构成的全长颤蛋白(FR)。对照(ctrl)由未处理的细胞构成。将颤蛋白在细胞上温浴60分钟。如上所述将细胞裂解并进行蛋白质印迹以检测总ERK和磷酸化ERK。
在图14(A)中看到的代表性蛋白质印迹显示，颤蛋白处理对总ERK水平没有可辨别的影响。事实上，将结果归一化到肌动蛋白，显示出所述人类颤蛋白重组片段(hR3+5和hR3+6)引起总ERK水平的轻微下降，全长颤蛋白也是如此，正如在图14(C)中看到的，而小鼠片段(R3-6和NR2)具有总ERK的略微增加。然而，人类颤蛋白重组片段(hR3+5和hR3+6)与全长颤蛋白处理相似，引起磷酸化ERK1/2的强烈增加，正如在图14(B)中看到的。由重复序列3-6形成的小鼠颤蛋白片段(R3-6)显示出磷酸化ERK的略微增加，其与对照重叠。相反，小鼠N-端片段(NR2)显示出磷酸化ERK的下降。将磷酸化ERK与总ERK的水平进行比较显示，小鼠片段R3-6显示出磷酸化ERK与总ERK大致相当(对于R3-6来说1.15)，这与在图13(G)中看到的结果相符。使用模拟处理的对照培养物具有1.09的比率。小鼠N-端片段不触发ERK的磷酸化，因为水平约为对照的50％(0.53)。人类颤蛋白片段(R3+5和R3+6)引起ERK的磷酸化(分别为2.22和2)，与全长颤蛋白相近(2.5)。这些结果显示，人类颤蛋白片段与小鼠片段相比对ApoER2信号传导表现出更强的影响，并且可能在治疗中更加有效。
实施例5
通过试验颤蛋白途径蛋白的修饰来分析颤蛋白对细胞途径的影响。颤蛋白片段互补的变化似乎与下游颤蛋白信号传导的改变相关联，正如由主要的下游组分Dab-1的磷酸化所指示的。
DAB-1的磷酸化使用偶联到VLDLR和ApoEr的DAB-1报告物来分析。如上讨论的从胚胎第17天的小鼠制备原代神经元培养物。允许细胞在培养物中成熟8天。将板(96孔，24孔)通过向每个孔添加50μL或100μL聚-L-赖氨酸，用0.1mg/mL(0.01％)聚-L-赖氨酸溶液(从1mg/mL稀释)包被。将所述一个或多个孔在37℃下温浴最少1小时，并通过真空抽吸或其他手段除去溶液。将所述孔用150μL水清洗。将细胞以1:10悬浮在高葡萄糖培养基中并添加到板中，直至80-90％合生(20-24小时)。
将Opti M(无血清，又称为不完全)和高葡萄糖完全培养基加热至37℃。向两个Eppendorf管各自添加Opti-M(500μL)。向所述两个Eppendorf管中的第一个添加DNA(20μL)，并向第二个Eppendorf管添加lipofectamine(20μL)。将每个管的内含物混合，并将两种溶液在室温温浴5分钟。将两种ApoER2融合蛋白的DNA与lipofectamine混合在一起并在室温温浴20分钟。将所述转染混合物以10μL的量添加到含有细胞的96孔板的每个孔，并将混合物温浴。
48小时后，测量萤光素酶活性。将颤蛋白R3-6片段在100℃煮沸10min以充当对照。将萤光素酶底物溶解在萤光素酶缓冲液中(1:1)，并以1:1的比例向每个转染的板添加萤光素酶(即50uL萤光素酶比50uL转染溶液)。将所述混合物振摇10min，并检测光的产生。
在颤蛋白结合后，使用全长颤蛋白的处理对Dab-1产生可重复的影响，磷酸化状态变化很小，正如在图15和16中看到的。相反，将海马切片与R3-6片段接触显示出对Dab-1磷酸化的时间依赖性的影响，正如在图17和18中看到的。APC处理的单核细胞表现出有活性Dab1(Tyr220-p)、Akt Ser473-p和GSK3βSer9-p水平的提高。发现用RAP预处理或敲除ApoER2减弱了这些效应，而EPCR和PAR1的抑制剂没有影响。有趣的是，发现APC以30nM的亲和性结合到ApoER2，但不结合到可溶性VLDLR。将APC的效应与ApoER2信号传导相关联，发现受体结合蛋白(RAP)阻断APC介导的对U937细胞的内毒素诱导的组织因子促凝血活性的抑制。
最近已发现颤蛋白分子在体外和体内形成更高阶的复合体，例如Fc-RAP。通过显示颤蛋白在体内被分泌为二硫键连接的同二聚体，这个观察被进一步细化。位于分子的N-端处被称为CR-50表位的短区域的缺失废除了寡聚化。这种突变的颤蛋白在原代小鼠神经元中不能高效诱导Dab1磷酸化。同样地，针对CR-50表位的抗体在体外和体内拮抗颤蛋白功能。
RAP是一种细胞内蛋白，其可以以非常高的亲和力结合到脂蛋白受体家族。Fc-RAP融合蛋白是一种工程化蛋白，其由使用抗体的Fc区相连以形成粗略的“哑铃”形状的两个RAP分子构成。不是结合并抑制ApoER2和VLDLR，Fc-RAP可以引起受体簇集和ApoER2活化。Fc-RAP的添加通过提高LTP诱导而具有与颤蛋白施加一致的效应，正如在图19中看到的。主要差别在于Fc-RAP可能结合所有脂蛋白受体，但只能簇集ApoER2和VLDLR。
ApoER2和/或VLDLR的簇集诱导Dab1磷酸化和下游事件，包括SFK的活化和PKB/Akt的调节。此外，长时程增强作用(LTP)的调节——颤蛋白的生物效应之一，也通过颤蛋白不依赖性受体的簇集来模拟。这些发现强烈地建议，受体诱导的二聚化或寡聚化对于Dab1酪氨酸磷酸化和下游信号传导事件来说是足够的，不需另外的辅助受体提供酪氨酸激酶活性。不受任何特定理论限制，这暗示颤蛋白片段的治疗潜力是通过适合的受体二聚化和下游信号传导。
实施例6
颤蛋白具有增强CA1谷氨酸能响应的能力。在培养的海马神经元中，颤蛋白信号传导为树突状结构的正常发育所需。在不存在颤蛋白或细胞内衔接蛋白Dab1的情况下，神经元表现出迟缓的树突生长和树突分支的减少，这种表型与在缺少颤蛋白受体apoER2和VLDLR的神经元中所看到的的类似(Niu等，颤蛋白通过VLDLR/ApoER2-Dab1途径促进海马树突发育(Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway)，Neuron.2004；41:71-84)。HRM表现出海马依赖性情景恐惧条件化的学习和海马CA1区域中突触可塑性的缺陷。据信HRM的这些行为和生理表型部分是由突触连通性的降低或抑制造成的。这得到HRM具有降低的棘密度这一观察的支持。
从第18–19胚胎天(E)的小鼠胚胎获得混合的海马和皮层神经元培养物。将所述细胞以高密度(～750个细胞mm-2)铺板，并在增补有B27(Gibco BRL)的Neurobasal培养基(Gibco BRL)中生长。当得到80％合生时将细胞传代培养。
ApoER2存在于突触后并在CA1中与NMDAR形成有功能的复合体。mEPSC-NMDA的衍生图示在图20(A)-(B)和21(A)-(D)中。模拟处理的细胞由于NMDA受体(mEPSCNMDA)而具有微小的兴奋性突触后电流，其与模拟处理之前相比没有显著变化(p>0.05)。发现使用颤蛋白的处理显著提高mEPSCNMDA幅度(p<0.001)。
为了进一步验证突触NMDAR响应作为颤蛋白的突触后效应的结果而提高，分析了突触诱发的NMDAR全细胞电流的变差系数(CV)。当将9个实验中1/CV2比率针对30分钟颤蛋白施加之前和之后的平均EPSCNMDA比率作图时，没有确定相关性，正如在图21(C)和(D)中看到的。然而，在不同的平均EPSCNMDA比率下，1/CV2比率保持相对不变，证实了在CA1中颤蛋白通过突触后机制激活以提高NMDAR活性。
长期颤蛋白处理可以提高突触响应的AMPA组分，改变EPSCNMDA动力学和艾芬地尔敏感性。试验了CA1中的颤蛋白对AMPAR和NMDAR亚基的表达水平的影响。通过蛋白质印迹探测GluR1、NR1、NR2A和NR2B的总的和表面水平两者。在CA1细胞表面上分析了GluR1这种在发育成熟期间表达提高并在突触可塑性期间经历调控转运的AMPAR亚基。
图22(A)-(C)显示了与模拟处理组相比，颤蛋白处理显著提高表面GluR1的水平，通过长期颤蛋白处理后mEPSCAMPA和AMPA/NMDA电流比率的增加指示了受调控的表达和表面插入。没有观察到表面或总NR1水平的变化。相比较而言，与模拟处理相比在颤蛋白处理后总的和表面NR2A表达水平两者均显著提高。此外，在颤蛋白处理后总的和表面NR2B蛋白水平两者均显著降低。与未处理的对照组相比，模拟处理对不同的谷氨酸受体亚基水平没有影响。
分析了颤蛋白对海马树突的影响。从HRM胚胎培养的海马细胞从6-7日龄野生型、HRM和颤蛋白缺陷小鼠产生，并用5nm颤蛋白处理21天。器官型培养物的处理由每3天重复施加5nM颤蛋白共21天或未转染的HEK细胞培养基构成。所述细胞如上所述进行培养，并通过施加全细胞膜片钳电流将荧光染料注射到神经元细胞中，并将所述细胞在固定后在共聚焦显微镜下观察。
树突棘是覆盖树突表面的小的突起，并带有形成兴奋性突触的突触后结构。在大量认知疾病中发现了树突棘的形状异常或数目减少。树突棘数目的减少表明，颤蛋白/脂蛋白受体介导的信号传导的组成性水平为树突结构的发育所需，所述树突结构对于神经元进行大量信息处理是至关重要的。这种见解与显示出杂合颤蛋白小鼠(HRM)表现出树突棘密度降低和某些学习和记忆行为的表现受损的研究相一致。
培养的海马神经元具有明显更少的树突棘，这种表型可以通过向培养物添加外源重组颤蛋白来挽救。与来自于野生型培养物的年龄匹配的神经元相比，颤蛋白处理的HRM细胞在21天后显示出树突棘密度的提高，正如在图23(B)中看到的。相反，模拟物(来自于未稳定转染的细胞的调制培养基)施加没有显示出棘密度变化，正如在图23(C)中看到的。在颤蛋白敲除小鼠中的相同实验显示，与模拟对照相比颤蛋白施加也挽救树突棘密度，正如在图23(C)和23(F)中看到的。正如在图23(D)中看到的，两种颤蛋白处理的细胞类似于在WT细胞中看到的树突棘形态，并且在定量时，与模拟处理的对照相比在颤蛋白处理的HRM培养物中树突棘显著增加，并且与在野生型培养物中观察到的棘密度水平相近，正如在图24(A)中看到的。
为了验证这种施加流程代表了颤蛋白的长期施加，并且颤蛋白不被逐渐降解或从培养基主动去除，发明人在颤蛋白施加后0、6、12、24、48、72和96小时的时间点从培养板取出15μl培养基。这些等分试样的蛋白质印迹分析显示没有颤蛋白的降解或减少，正如在图25中看到的。因此，棘密度的提高是由在整个21天的施加中以生理相关水平存在的颤蛋白造成的。
实施例7
脂蛋白受体在认知过程中具有作用，并暗示这种受体家族参与病理过程。这些受体的两种主要配体apoE和颤蛋白，似乎具有能够显著影响突触功能的信号传导能力。颤蛋白杂合子显示出突触可塑性和认知功能两者的缺陷。颤蛋白表达的约50％的降低引起突触可塑性和认知功能两者的缺陷(Qiu等，颤蛋白单倍剂量不足的小鼠中的认知破坏和海马突触功能的改变(Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic functionin Reelin haploinsufficient mice)，Neurobiol Learn Mem.2006；85:228-242)。最近的工作突出了颤蛋白信号传导在正常学习和记忆中的重要性(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptors cooperate to enhancehippocampal synaptic plasticity and learning)，J Biol Chem 2002,277:39944-39952)，以及其中这种信号传导被扰乱的病理情况。APC现在是颤蛋白信号传导的候选调节物，因为它似乎具有结合到ApoER2并激活下游效应物的结构组成部分。
为了证实颤蛋白的学习和认知效应，将小鼠用有效阻断颤蛋白结合到其受体的脂蛋白拮抗剂RAP(受体结合蛋白)双侧输注。
将10周龄C57Bl/6小鼠(n＝55，雄性)饲养在正常条件下(20℃，50％相对湿度和12-h光/暗周期)并允许其随意取用水和食物。在适应环境后，将所述小鼠分组，未电击的虚假处理(未注射)组、电击的RAP注射组、电击的虚假处理(未注射)组和电击的颤蛋白处理组。颤蛋白处理由含有浓度为5nM的全长重组纯化颤蛋白蛋白质的2μl注射构成。在处理后3小时，进行情景恐惧条件化。在整个研究中采取必要的预防措施以减轻动物的疼痛和苦难。所有研究由对处理条件不知情的人员进行。在处理时，小鼠具有12-45g的体重。
对于双侧注射来说，将小鼠用异氟烷麻醉并置于立体定位手术装置(StoeltingCo.)上。在颅骨中部做出矢状切口，并将皮肤轻轻推开以放大开口。通过颅骨钻出两个孔，以允许Hamilton针头通过大脑进入脑室(距前囟AP-0.35mm、L±0.75mm和V-2.5mm)。将小鼠用0.5μL模拟对照或颤蛋白以1μL/min的速率双侧注射，以得到5nm的半球颤蛋白总浓度，正如以前所建立的(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelinand ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity andlearning)，J.Biol.Chem.2002；277:39944–39952；Rogers等，在杂合颤蛋白小鼠中颤蛋白增补恢复感觉运动门控、突触可塑性和联想学习缺陷(Reelin supplementation recoverssensorimotor gating,synaptic plasticity and associative learning deficits inthe heterozygous reeler mouse)，J.Psychopharmacol.2013；27:389–395)。然后将针头取出，将孔用牙科胶合剂密封，并将切口缝合。在手术后将小鼠在温暖的加热垫上的单个笼子中观察2h。每天测量直肠温度以监测炎症或感染反应；任何体温为100.5℉或更高温度的小鼠通过CO2吸入进行安乐死。允许动物恢复5天。以前显示这个时间过程对脑室内注射后的行为检查最适(Rogers等，颤蛋白增补提高认知能力、突触可塑性和树突棘密度(Reelinsupplementation enhances cognitive ability,synaptic plasticity and dendriticspine density)，Learn.Memory.2011；18:558–564；Rogers等，在杂合颤蛋白小鼠中颤蛋白增补恢复感觉运动门控、突触可塑性和联想学习缺陷(Reelin supplementation recoverssensorimotor gating,synaptic plasticity and associative learning deficits inthe heterozygous reeler mouse)，J.Psychopharmacol.2013；27:389–395)。
恐惧条件化训练在具有金属丝网底板的正方形消音仓室(25×25cm)中进行。在训练中，将小鼠置于具有背景白噪声的仓室中，并允许其探索3min，然后呈现条件刺激(90dB音调)30s。在28s时，提供非条件刺激[轻柔的(0.5mA)足底电击]总共2s。在90s的时间段后，进行第二对条件刺激/非条件刺激，然后经历另一个90s时间段，总共7min。情景恐惧条件化在所述训练后24h，在没有音调的同一仓室中进行3min，并评估僵直。提示性恐惧条件化在情景训练后进行，其中通过气味、光照和底板质地改变所述仓室。将小鼠置于改变的仓室中并给予3min的适应期(无音调)，然后在试验的最后3min提供90dB条件刺激(音调)。行为通过ANY-Maze软件(StoeltingCo.)来监测。僵直被评估为不动至少2s。
未接受训练电击的虚假处理的小鼠表现出非常少的僵直，仅有约15％的小鼠在听到音调后僵直。对于没有注射但接受电击训练的小鼠来说，约70％在听到音调后僵直，其只被颤蛋白处理的小鼠超越，后者表现出90％的僵直率，正如在图26(A)中看到的。作为比较，抑制颤蛋白受体结合的RAP的给药将对音调的反应降低到仅仅45％，尽管所述小鼠经过电击训练。分析显示，在未处理但电击训练的小鼠与RAP处理的小鼠之间存在反应的显著差异。
所述小鼠也被暴露于水迷宫试验。隐蔽平台水迷宫被用于评估空间学习和记忆。直径10cm的平台刚好浸没在充满不透明的水、深度足以使小鼠不能触碰到底的直径1.2m的水池的表面下。大的视觉提示被放置在空间周围。将小鼠置于水池中并允许其游泳最多60s来找到平台。训练由5个训练日构成，每日四次试验，相隔15min的时间间隔。在第6和8天，撤除平台并使用ANY-Maze视频追踪软件(StoeltingCo.)追踪每只小鼠的游泳模式60s(探索实验)。
正如在图26(B)中看到的，在脑室中单次注射颤蛋白改进了在隐蔽平台水迷宫中的空间学习。在第6天重新训练以找到不同平台位置(相反的)的小鼠与盐水注射的小鼠相比，继续显示出提高的学习能力。在训练前5天接受单次颤蛋白注射的小鼠显示出在第1天找到平台的较低的延时。在单次暴露于训练范式后，发现平台的延时显著减少，正如在图26(C)中看到的。被重新训练以找到不同平台位置的小鼠继续表现出颤蛋白和盐水注射之间的差异。处理与未处理的动物之间的游泳速度和所有其他活动性测量值保持相同。这些数据引人注目地说明了颤蛋白在体内调节学习和记忆形成的能力，以及旨在鉴定控制颤蛋白蛋白质加工的机制和所述片段随后如何调节认知功能的研究的重要性。
所述功能试验显示，较低的颤蛋白水平导致联想学习降低。当颤蛋白浓度提高时，颤蛋白缺乏对突触功能的影响得到补偿。在3-4月龄野生型小鼠中，在联想性恐惧条件化训练之前3小时进行重组颤蛋白片段补足物的直接双侧脑室输注，在训练后24小时试验时提高了记忆形成，正如在图26(A)-(C)中看到的。这些结果证实了颤蛋白为正常记忆形成所需，并提出了提高颤蛋白信号传导是否可以增强记忆的有趣问题。
然后分析了情景恐惧条件化对颤蛋白水平的影响。使用如上所讨论的3次电击的情景恐惧条件化方案(CFC)对野生型小鼠进行训练。未电击的小鼠(CS)用作阴性对照，电击且暴露于情景的小鼠(CS/US)在训练后1、5、15、30和180分钟以及训练后18小时取出它们的海马(n＝4，时间点)，并使用抗颤蛋白抗体(G10)分析海马匀浆物。
恐惧条件化的学习在情景恐惧条件化后18小时内产生颤蛋白表达和片段补足物、特别是450和180kDa片段的急剧变化，正如在图27(A)&(B)中看到的。此外，递送到Schaffer侧支途径的θ脉冲刺激在刺激后15分钟引起颤蛋白表达和片段切割的显著增加，正如在图27(A)&(B)中看到的。这些结果显示，造成突触可塑性的改变以及学习和记忆的调节的颤蛋白信号传导的完整性和控制，涉及将颤蛋白加工成功能不同的片段。
实施例8
颤蛋白信号传导涉及对兴奋性突触的各种不同的生理性改变以及正常的哺乳动物认知功能。最近的工作突出了颤蛋白信号传导在正常学习和记忆中的重要性(Weeber等，颤蛋白和ApoE受体合作以增强海马突触可塑性和学习(Reelin and ApoE receptorscooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning)，J BiolChem 2002,277:39944-39952)，以及其中这种信号传导被扰乱的病理情况。APC现在是颤蛋白信号传导的候选调节物，因为它似乎具有结合到ApoER2并激活下游效应物的结构组成部分。
脂蛋白受体在认知过程中发挥作用，并暗示这种受体家族参与构成阿兹海默氏病(AD)发展的基础的病理过程。这些受体的两种主要配体apoE和颤蛋白似乎具有可以显著影响突触功能的信号传导能力，直接与APP相互作用并调节它的代谢，并且对Aβ积累敏感。Aβ积累破坏脂蛋白受体信号传导，导致认知功能的同时破坏。此外，颤蛋白和/或脂蛋白受体信号传导的干扰导致APP代谢和Aβ清除的异常，其进而加重了Aβ积累和斑块沉积。因此，通过直接施用颤蛋白蛋白质或通过DNA基因疗法或RNA构建物或使用其他脂蛋白受体激动剂以增加颤蛋白信号传导，可用于减轻Aβ依赖性的认知破坏和斑块病理的发展。
在神经精神和神经变性障碍两者中已发现了关于颤蛋白蛋白水解在人类疾病中的作用的支持证据。例如，与非痴呆患者相比，在AD和额颞叶痴呆患者中N-R2片段增加(Sáez-Valero等，在额颞叶痴呆症和阿兹海默氏病中脑脊液颤蛋白的水平改变(Alteredlevels of cerebrospinal fluid reelin in frontotemporal dementia andAlzheimer’s disease)，J.Neurosci.Res.2003；72:132–136；Botella-López等，在阿兹海默氏病中颤蛋白表达和糖基化模式发生改变(Reelin expression and glycosylationpatterns arealtered in Alzheimer’s disease)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006；103:5573–5578)。在具有确认的抑郁症和双相障碍诊断的患者中，发现在血液样品中N-R2片段减少，而对于精神分裂症患者来说，N-R6片段增加(Fatemi等，在精神分裂症和情感障碍中颤蛋白及其异构型的水平改变(Altered levels of Reelin and its isoforms inschizophrenia and mood disorders)，Neuroreport.2001；12:3209–3215)。颤蛋白可能也在癫痫控制中发挥作用：癫痫模型具有改变的颤蛋白加工(Tinnes等，癫痫样活性干扰齿状回粒细胞定位所需的颤蛋白的蛋白水解加工(Epileptiform activity interferes withproteolytic processing of Reelin required for dentate granule cellpositioning)，FASEBJ.2011；25:1002–1013；Tinnes等，在实验性癫痫中TIMP-1抑制颤蛋白的蛋白水解加工(TIMP-1 inhibits the proteolytic processing of Reelin inexperimental epilepsy)，FASEBJ.2013；27:2542–2552；Kaneko等，在原代大鼠神经元细胞中红藻氨酸诱导的高尔基复合体片段化/分散改变了颤蛋白的蛋白水解：早期癫痫的体外模型(Kainic acid-induced golgi complex fragmentation/dispersal shifts theproteolysis of reelin in primary rat neuronal cells:an in vitro model ofearly stage epilepsy)，Mol.Neurobiol.2016；53:1874–1883)，其可能是MMP依赖性的。这些颤蛋白片段水平的差异指向颤蛋白水平和蛋白水解功能紊乱在疾病状态中的重要性。
颤蛋白的试验表明在AD的三种小鼠模型(PS1-FAD、SweAPPxPS1和Tg2576)中颤蛋白代谢被改变。将14月龄的野生型(未改变的同窝仔畜)、Tg2576(SweAPP)、PS1-FAD(M146L)和2X(SweAPP x M146L)小鼠在正常条件下(20℃，50％相对湿度和12-h光/暗周期)饲养，并允许其随意取用水和食物。在适应环境后，取出小鼠的皮层并将裂解液在蛋白质印迹上运行以检测不同的颤蛋白片段。在AD的三种小鼠模型(PS1-FAD、SweAPPxPS1和Tg2576)中颤蛋白代谢被改变，正如在图28(A)中看到的。与野生型相比，在Tg2576中没有检测到颤蛋白450、190和180kDa产物的显著差异，但在Tg2576和2X小鼠中，被G10识别的未鉴定的N-端物质显著增加。相反，在PS1-FAD和2X小鼠中，颤蛋白450和180kDa产物显著增加。颤蛋白片段补足物的这些变化似乎与下游颤蛋白信号传导的改变相关联。对于皮层的针对主要下游组分Dab-1的磷酸化的测试显示在SweAPPXPS1和PS1-FAD中DAB-1磷酸化提高，并且在单个SweAPP(Tg2576)小鼠中显著降低，正如在图28(B)中看到的。这些数据表明颤蛋白代谢对APP加工和/或Aβ积累的变化特别敏感。
在Tg2576小鼠中颤蛋白片段组成和Dab-1磷酸化的改变可能代表了受损的颤蛋白信号传导系统，这种现象如果是真的，可能造成在这些小鼠中报道的突触可塑性的缺陷(Mitchell等，在阿兹海默氏病APPswe Tg2576小鼠中X11β挽救记忆和长时程增强作用缺陷(X11beta rescues memory and long-term potentiation deficits in Alzheimer'sdisease APPswe Tg2576mice)，Hum Mol Genet.2009；18:4492-4500；Kotilinek等，环加氧酶-2抑制改善记忆和突触可塑性的淀粉样β介导的抑制(Cyclooxygenase-2inhibitionimproves amyloid-beta-mediated suppression of memory and synapticplasticity)，Brain.2008；131:651-664；Jacobsen等，在阿兹海默氏病的小鼠模型中早期发作的行为和突触缺陷(Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mousemodel of Alzheimer's disease)，Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103:5161-5166)。
为了确定外源颤蛋白的效果，将来自于8月龄Tg2576小鼠的急性海马切片用5nM重组颤蛋白片段补足物R3-6灌注。正如在图28(C)中看到的，颤蛋白片段的施用挽救了衰老Tg2576小鼠中的LTP缺陷，表明参与颤蛋白蛋白质加工下游的颤蛋白信号传导的生物化学和结构性机制在这些小鼠中是完整的。此外，重要的是注意到正常水平的突触可塑性在这个小鼠模型中是可获得的。颤蛋白片段也与衰老(15月龄)Tg2576小鼠中的致密核心斑块关联，正如在图29(A)-(D)中看到的。此外，颤蛋白和相关的脂蛋白受体激动剂可以挽救由Aβ积累和/或斑块病理导致的突触可塑性和认知功能的缺陷。在12月龄的AD小鼠模型(Tg2576)中，颤蛋白挽救LTP缺陷，正如在图30中看到的。
这些数据得到下述发现的支持，即颤蛋白与在衰老野生型小鼠的海马中检测到的含有Aβ的斑块有联系(Madhusudan等，在正常衰老期间颤蛋白阳性斑块的积累伴有基础前脑投射神经元的减少(Accumulation of reelin-positive plaques is accompanied bya decline in basal forebrain projection neurons during normal aging)，Eur JNeurosci.2009；30:1064-1076；Knuesel等，在淀粉样沉积物中颤蛋白的与衰老相关的积累(Age-related accumulation of Reelin in amyloidlike deposits)，NeurobiolAging.2009；30:697-716)。鉴于颤蛋白在突触功能中的已确立的作用，颤蛋白代谢和信号传导的完整性的改变在以前在AD小鼠模型中确立的学习和记忆变化中发挥深远的作用。
令人吃惊的是，在成年野生型小鼠中单次外源颤蛋白施用增强学习和记忆至少11天。脂蛋白受体在Aβ清除中的作用，以及在AD小鼠模型中鉴定到颤蛋白与Aβ斑块关联，证实了聚焦于颤蛋白作为AD的病因和病理发生中的治疗靶点，作为旨在除去Aβ和改善认知功能的AD治疗性干预的价值。
因此，通过颤蛋白蛋白质的直接施用或通过DNA基因疗法或RNA构建物或使用其他脂蛋白受体激动剂来提高颤蛋白信号传导，可用于减轻Aβ依赖性的认知破坏和斑块病理的发展。
实施例9
创伤性脑损伤(TBI)可以由各种不同的起源例如癫痫发作、头部创伤、癫痫持续状态(SE)和缺血引起(Shetty&Hattiangady，用于颞叶癫痫的干细胞疗法的展望(Prospectsof Stem Cell therapy for Temporal Lobe Epilepsy)，Stem Cells.2007；25:2396–2407；Ogawa等，缺血诱导的神经元细胞死亡和应激反应(Ischemia-induced neuronalcell death and stress response)，2007；9:573–587；Acharya等，用于预防癫痫的神经保护策略的进展(Progress in neuroprotective strategies for preventing epilepsy)，Prog Neurobiol.2008:363–404；等，从创伤性脑损伤到创伤后癫痫：关于过程和治疗选项动物模型告诉了我们什么？(From traumatic brain injury to posttraumaticepilepsy:what animal models tell us about the process and treatment options)，Epilepsia.2009；50(Suppl 2):21–9)。在损伤的急性阶段中，位于颗粒下层(SGZ)中的神经干细胞(NSC)增加神经发生，以尝试治愈所述损伤(Parent等，在成年大鼠海马中齿状回粒细胞神经发生被癫痫增加并有助于异常网络的重新组织(Dentate granule cellneurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant networkreorganization in the adult rat hippocampus)，J Neurosci.1997；17:3727–3738；Hattiangady等，长期颞叶癫痫与成年海马中齿状回神经发生的严重降低相关(Chronictemporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentateneurogenesis in the adult hippocampus)，Neurobiol Dis.2004；17:473–490；Shetty等，颞叶癫痫的红藻氨酸模型中的海马神经营养蛋白水平：在脑源性神经营养因子含量与异常齿状回苔藓状纤维出芽的发展之间缺少相关性(Hippocampal neurotrophin levelsin a kainate model of temporal lobe epilepsy:a lack of correlation betweenbrain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentatemossy fiber sprouting)，J Neurochem.2003；87:147–159；Hattiangady等，在海马的齿状回和CA1和CA3子区中脑源性神经营养因子、磷酸化的环AMP响应元件结合蛋白和神经肽Y早在中年就已降低(Brain-derived neurotrophic factor,phosphorylated cyclic AMPresponse element binding protein and neuropeptide Y decline as early asmiddle age in the dentate gyrus and CA1and CA3subfields of the hippocampus)，Exp Neurol.2005；195:353–371)。然而，对这些损伤的生理响应不能改善功能恢复，并引起学习缺陷和记忆和情绪功能紊乱(Jorge RE,Acion L,Starkstein SE,Magnotta V，创伤性脑损伤后的海马体积和情绪障碍(Hippocampal volume and mood disorders aftertraumatic brain injury)，Biol Psychiatry.2007；62:332–338；Potvin等，在背侧或腹侧海马病损和对脑下脚的邻近损伤后空间工作记忆任务的表现(Performance on spatialworking memory tasks after dorsal or ventral hippocampal lesions and adjacentdamage to the subiculum)，Behav Neurosci.2006；120:413–422)。来自于TBI的许多长期问题，由NSC的不良神经元分化、来自于NSC的神经元细胞的不正确迁移或分化和从神经元细胞伸出的基树突的不良或不正确的突触发生引起(Sanchez等，癫痫的新生儿缺氧模型中齿状回粒细胞的门基树突的突触连接(Synaptic connections of hilar basaldendrites of dentate granule cells in a neonatal hypoxia model of epilepsy)，Epilepsia.2012；53(Suppl 1):98–108)。
为了试验颤蛋白的给药对创伤性脑损伤(TBI)的影响，进行了一连串的运动行为测试、EBST、前肢运动不能和爪握试验。
将10周龄C57Bl/6小鼠(n＝55，雄性)饲养在正常条件下(20℃，50％相对湿度，12-h光/暗周期)，并允许其随意取用水和食物。在适应环境后，使用受控皮层冲击器(CCI；Pittsburgh Precision Instruments,Inc,Pittsburgh,PA)对小鼠进行TBI。实验程序得到动物护理和使用委员会批准。将小鼠分组：没有注射的虚假处理(无TBI)组，没有注射的TBI组，盐水模拟处理的TBI组，和使用颤蛋白的TBI组。颤蛋白处理动物由2ul注射液构成，其含有浓度为5nM的全长重组纯化颤蛋白。将虚假处理的动物麻醉，并经历手术程序但不经历皮层冲击。所有行为测试在试验日的光周期期间的同一时间进行。在整个研究期间采取必要的预防措施以减轻动物的疼痛和苦难。所有研究由对处理条件不知情的人员进行。在处理时，小鼠具有12-45g的体重。
深度麻醉使用鼻罩，使用一氧化二氮/氧气(69/30％)中的1–2％异氟烷来实现。将所有动物固定在立体定位框架中(David Kopf Instruments,Tujunga,CA,USA)。TBI损伤手术由对动物进行头皮切开以暴露出颅骨和开颅术构成。使用电钻进行半径约2.5mm的开颅术，计算的坐标为距前囟前方+0.2和侧右-0.2mm(Paxinos&Watson，(2005)，《采取立体定位坐标的小鼠大脑》(The mouse brain in stereotaxic coordinates)，第5版，San Diego,CA:Academic Press)。在开颅术后，在额-顶叶皮层处使用6.0m/s的速度对脑进行冲击，到达硬脑膜层下方1.0mm的深度并在脑中保持150毫秒(ms)。冲击器杆竖直倾斜15°，以相对于冲击表面处脑曲线的切向平面维持垂直位置。
与冲击器相连的线性可变位移传感器(Macrosensors,Pennsauken NJ)测量速度和持续时间以验证一致性。在手术后给药止痛剂酮洛芬(5mg kg–1)。将小鼠保持在密切监视下。
抬高身体摆动试验(EBST)包括通过尾巴操纵动物并记录摆动的方向(Borlongan&Sanberg，(1995)，抬高身体摆动试验：用于患有6-羟基多巴胺诱导的偏侧震颤麻痹的小鼠的一种新的行为参数(Elevated body swing test:a new behavioral parameter formice with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism)，The Journal ofneuroscience 15:5372–5378)。试验装置由透明有机玻璃箱(40 x 40 x 35.5cm)构成。在尾根处轻柔抓住动物，并通过尾巴抬高，直至动物的鼻子在表面上方2英寸(5cm)高度处。一旦动物的头部从身体的中线位置侧向移动大约10°，计数向左或右的摆动方向。在单次摆动后，将动物放回到有机玻璃箱中，并在重新试验之前允许它自由移动30秒。对每只动物重复这些步骤20次。通常，完整小鼠表现出50％的摆动偏离，也就是说，向左和向右的摆动数目相同。向一个方向75％的摆动偏离被用作TBI运动缺陷的标准判据。
在TBI手术之前和之后，对来自于虚假对照、无注射的TBI、模拟注射的TBI或使用颤蛋白的TBI组的年轻和衰老小鼠进行前肢运动不能试验(Borlongan CV,Hida H,NishinoH(1998)，运动功能障碍的早期评估有助于脑中动脉的成功阻断(Early assessment ofmotor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebralartery)，Neuroreport 9:3615–3621)。由两位对实验不知情的评估者使用下述前肢运动不能量表对同侧和对侧前爪的力量和运动性进行评分。将原初、虚假病灶或或偏侧震颤麻痹小鼠单个地放置在直立的有机玻璃筒(直径20cm，高30cm)中，并在它用前爪探索和触碰玻璃的同时视频记录5–15min。前爪接触由两位对实验不知情的评估者记录，并在晚些时候计算为(右侧接触数/总接触数)。50％的值被表征为正常并评分为1，用其右侧(同侧)前爪触碰80％的动物被认为受损并评分为2，而用其右侧(同侧)前爪触碰90％或更多的动物被认为严重受损并评分为3。记录每只个体动物的评分，然后将处理组的平均评分用于分析。
爪握包括在TBI手术之前和之后测试握力。异常的抓握说明了神经肌肉功能受损。在这个试验中，保持小鼠的身体靠着杆(Ibrahim AG,Raisman G,Li Y(2009)，前爪抓握的永久丧失需要完全剥夺来自于小鼠臂神经丛的至少4个背根的传入输入(Permanent lossof fore-paw grasping requires complete deprivation of afferent input from aminimum of four dorsal roots of the rmouse brachial plexus)，Exp Neurol 215:142–145)。由两位对实验不知情的评估者使用下述握力量表对同侧和对侧爪握力两者进行评分。在1至3的量表中，1为正常，2为受损，3为严重受损。记录每只个体动物的评分，然后将处理组的平均评分用于分析。
对每个时间点使用ANOVA和事后Bonferroni’s t-检验的重复测量来评估处理组之间的统计差异。在p<0.05时差异被认为是显著的。所有值被表示为平均值±SEM。
在TBI动物中用颤蛋白处理表现出改进的行为恢复。颤蛋白处理的小鼠在第1天表现出轻微摆动偏离，这到第2天消解，正如在图31中看到的。作为比较，用TBI处理并注射有媒剂或未注射的小鼠在整个试验中表现出更高的摆动偏离。因此，处理导致在第2天的恢复差异，颤蛋白处理的小鼠改善，而媒剂和未注射的小鼠显示出很少改善。颤蛋白处理也到第3天引起肢体运动不能的改善，正如在图32中看到的。到第5天，颤蛋白处理的小鼠表现出与虚假处理的动物相似的肢体运动不能，而TBI处理的给药媒剂或未注射的小鼠继续显示出运动不能。在颤蛋白处理的小鼠中爪抓握显示出稳态改善，正如在图33中看到的。
在创伤性脑损伤中生活方式的长期丧失部分是由愈合期间不正确的神经元细胞替换造成的。已发现颤蛋白在DG中保护GABA能中间神经元亚类，其是表达细胞外糖蛋白颤蛋白的神经元(Shetty，海马损伤诱导的认知和情绪功能障碍、改变的神经发生和癫痫：早期神经干细胞移植干预可以提供保护吗？(Hippocampal Injury Induced Cognitive andMood Dysfunction,Altered Neurogenesis and Epilepsy:Can Early Neural Stem CellGrafting Intervention Provide Protection？)，EpilepsyBehav.2014Sep；38:117-24)。这些GABA能中间神经元帮助从NCS形成的神经元细胞迁移到粒细胞层中(Gong等，在完整和癫痫海马中颤蛋白调控神经元祖细胞迁移(Reelin regulates neuronal progenitormigration in intact and epileptic hippocampus)，J Neurosci.2007；27:1803–1811)。不受任何特定理论限制，颤蛋白或颤蛋白片段的给药可以通过树突形成、GABA能中间神经元的保留或所述途径的组合起作用。
实施例10
树突棘是覆盖树突表面的小的突起，并带有形成兴奋性突触的突触后结构。在大量认知疾病中发现了树突棘的形状异常或数目减少，例如X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征和自闭症。树突棘数目的减少表明颤蛋白/脂蛋白受体介导的信号传导的组成性水平为树突结构的发育所需，所述发育对于神经元的大量信息加工来说是至关重要的。这种见解与显示出杂合颤蛋白小鼠(HRM)表现出树突棘密度降低和某些学习和记忆行为的表现受损的研究相一致。此外，颤蛋白增补恢复棘密度缺陷和相关的认知破坏。此外，颤蛋白信号转导引发参与CREB活化的通路，其对于早期记忆基因转录是必需的。这是在上面提到的人类认知障碍中被破坏的共同通路。
实施例11
最近显示，颤蛋白被金属蛋白酶的加工对于正常皮层板形成来说是必需的(Jossin等，颤蛋白信号通过磷脂酰肌醇3激酶和Akt来控制皮层发育并通过mTor来调控树突生长(Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt tocontrol cortical development and through mTor to regulate dendritic growth)，Mol Cell Biol.2007；27:7113-7124)，尽管负责的具体酶仍然未知。这个发现表明金属蛋白酶介导的颤蛋白加工可能对于成年大脑中的定向颤蛋白信号传导也是重要的。tPA和MMP-9两者都是候选金属蛋白酶，在调控突触可塑性和认知功能中具有被清楚证实的作用(Bozdagi等，基质金属蛋白酶-9在成熟海马突触生理学和可塑性中的体内作用(In vivoroles for matrix metalloproteinase-9 in mature hippocampal synapticphysiology and plasticity)，J Neurophysiol.2007；98:334-344；；Nagy等，基质金属蛋白酶-9为海马晚期长时程增强作用和记忆所需(Matrix metalloproteinase-9isrequired for hippocampal late-phase long-term potentiation and memory)，JNeurosci.2006；26:1923-1934；；Huang等，缺少编码组织型纤溶酶原激活物的基因的小鼠显示出在Schaffer对侧和苔藓状纤维通路两者中选择性干扰晚期长时程增强作用(Micelacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selectiveinterference with late-phase longterm potentiation in both Schaffercollateral and mossy fiber pathways)，Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93:8699-8704；Pang,P.T.和B.Lu，2004，在正常和衰老海马中晚期LTP和长期记忆的调控：分泌的蛋白质tPA和BDNF的作用(Regulation of late-phase LTP and long-term memory innormal and aging hippocampus:role of secreted proteins tPA and BDNF)，AgeingRes Rev 3:407-430；Zhuo,M.,D.M.Holtzman,Y.Li,H.Osaka,J.DeMaro,M.Jacquin和G.Bu，2000，组织纤溶酶原激活物受体LRP在海马长时程增强中的作用(Role of tissueplasminogen activator receptor LRP in hippocampal long-term potentiation)，JNeurosci 20:542-549；Baranes等，组织纤溶酶原激活物对海马苔藓状纤维通路中LTP的晚期和突触生长有贡献(Tissue plasminogen activator contributes to the late phaseof LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway)，Neuron.1998；21:813-825)。
产生370kDa产物的效能部分依赖于候选的颤蛋白切割酶tPA。这种潜在的调控机制对于如何将这种信号传导系统整合到已知的神经元调控机制中并协调参与生理过程例如学习和记忆，具有深远的意义。然而，颤蛋白在特定位点被切割，产生容易通过蛋白质印迹分析定量的颤蛋白片段的稳定模式。这些片段代表了具有不同于全长颤蛋白的性质的潜在的信号传导分子。从稳定转染的HEK293细胞纯化的重组颤蛋白含有与在海马中发现的主要片段尺寸相同的片段。
此外，使用识别N-R2区的抗体产生了关于颤蛋白在成年大脑中的定位的所有已知信息。所述N-R2区存在于颤蛋白的全长(N-R8)、N-R2和N-R6片段中，但不存在于其他主要片段中。因此，正如在表3中看到的三表位作图法产生了前所未有的空间分辨率，以监测颤蛋白产物生产和定位的变化。
表3.在3表位方法中使用的抗体及其性质、来源鉴定和表位位点识别。
抗体 识别位点 动物来源 商品化来源
G10 164-496 Ms,mAb Chemicon,MAB5364
G20 C-端 Gt,pAb SCBT,sc-7741
CR-50 420-450 Ms,mAb MBL,D223-3
H-221 3239-3460 Rb,pAb SCBT,sc-5578
AF3820 1221-2661 Gt,pAb R&D,AF3820
R4B 1810-1825 Ms,mAb Jossen等，2007
R5A 1985-2058 Ms,mAb Jossen等，2007
Ab12 3260-3428 Ms,mAb de Berkgeyck等，1998
Ab14 3260-3428 Ms,mAb de Berkgeyck等，1998
Ab17 3260-3428 Ms,mAb de Berkgeyck等，1998
为了在正常突触功能和记忆形成的背景中表征由tPA和MMP-9依赖性颤蛋白加工产生的特定片段，使用定点突变产生了切割抗性颤蛋白突变体构建物，正如在图34中看到的。颤蛋白突变体包括对tPA在R2-3处、对MMP-9在R6-7处和对两种酶在R2-3和R6-7处的切割有抗性的构建物(Rln-Res)。也考虑到了带有或不带切割抗性位点，模拟被tPA或MMP-9切割的片段。一种互补的颤蛋白构建物以与Rln-Res蛋白一致的方式添加标签，然而它不含两个改变的切割位点(颤蛋白切割不稳定；图34)。具有两个突变位点的带标签片段(阴性对照构建物)和显示出结合ApoER2和VLDLR的带标签R3-6片段(潜在阳性对照)被包括在内。将颤蛋白构建物亚克隆到含有N-端多组氨酸标签和/或C-端Myc标签的哺乳动物表达载体中，以允许晚些时候外源颤蛋白的识别。准确的切割位点可以通过使用与tPA或MMP-9反应的纯化的全长颤蛋白来鉴定，从而可以分离所得片段。
正如在图35(A)-(C)中看到的，将颤蛋白用tPA和MMP-9两者加工，以产生在体内存在的主要颤蛋白片段。正如可以看到的，在无细胞条件下tPA增加370kDa(N-R6)和80kDa(R7-8)片段，正如在图24(A)中看到的，表明tPA在R6-R7之间切割颤蛋白，正如在图27中看到的。颤蛋白被纤溶酶的切割产生大量以前未知身份的产物和180kDa片段的特异性保留。向原代神经元施用重组tPA导致细胞外颤蛋白从全长完全转变成370和180kDa形式，以及细胞内180kDa颤蛋白的减少。此外，MMP-9增加370kDa(N-R6)和180kDa(N-R2)片段两者，以及紧靠公知的180kDa片段下方存在的片段，正如在图24(B)&(C)中看到的，并通过MMP9的抑制得到确认，正如在图24(D)&(E)中看到的。这些在无细胞条件下的结果支持了MMP-9可以在两个切割位点R2-3和R6-7处切割颤蛋白；然而，向原代神经元施用MMP-9导致180kDa片段在细胞中的特异性积累，并且24小时的MMP-9抑制导致全长细胞内颤蛋白的急剧增加和细胞内180kDa颤蛋白的减少。这些结果表明，在正常条件下MMP-9负责在R2-R3之间切割颤蛋白，正如在图34的片段图谱上看到的。合在一起，这些初步数据表明MMP-9和tPA足以产生在体内发现的主要颤蛋白片段。结构分析鉴定到能够检测颤蛋白的各种不同片段的抗体，正如在图36(A)&(B)中看到的。海马中颤蛋白的蛋白质加工容易受到体外和体内突触活性影响。MMP-9和tPA似乎也参与颤蛋白代谢过程。
实施例12
颤蛋白在特定位点处切割，产生容易通过蛋白质印迹分析定量的颤蛋白片段的稳定模式。这些片段代表了具有不同于全长颤蛋白的性质的潜在的信号传导分子。从稳定转染的HEK293细胞纯化的重组颤蛋白含有与在海马中发现的主要片段尺寸相同的片段。重组颤蛋白片段补足物的施用可以(1)通过促进AMPA受体插入和提高NMDA受体功能来增加突触传递，(2)减少沉默突触，(3)改变突触形态和(4)增强LTP(Qiu&Weeber，颤蛋白信号传导促进CA1谷氨酸能突触的成熟(Reelin signaling facilitates maturation ofCA1glutamatergic synapses)，J Neurophysiol.2007；97:2312-2321；Qiu,S.,K.M.Korwek,A.R.Pratt-Davis,M.Peters,M.Y.Bergman和E.J.Weeber，2006，颤蛋白单倍剂量不足的小鼠中的认知破坏和海马突触功能的改变(Cognitive disruption and alteredhippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice)，NeurobiolLearn Mem 85:228-242)。
在暴露于颤蛋白后分析ApoER受体表达。从第18-19胚胎天(E)小鼠胚胎获得混合的海马和皮层神经元培养物。将所述细胞以高密度(～750个细胞mm-2)铺板，并生长在增补有B27(Gibco BRL)的Neurobasal培养基(Gibco BRL)中。在达到80％合生时将细胞传代培养。在将细胞传代培养第8次后，向培养基添加浓度为5nM的颤蛋白片段hR3-6，并将细胞与颤蛋白片段在37℃下温浴1小时。在温浴后，通过胰蛋白酶处理收集细胞，用培养基清洗，并使用基于SDS-β-巯基乙醇的裂解缓冲液裂解。从每种细胞培养物收集蛋白质，并将25g装载到SDS-PAGE凝胶上。在电泳后，将蛋白质转移到尼龙膜，并使用抗ApoER2抗体(Sigma-Aldrich，LRP8，兔抗hApoER2抗体)探测。
用GST-RAP(受体结合蛋白)处理细胞显示出受体表达的显著下降，正如在图37中看到的。因此，阻断颤蛋白结合到ApoER2的能力驱动ApoER2表达下降。然而，将细胞暴露于外源颤蛋白导致ApoER2受体表达提高。此外，用颤蛋白片段处理神经元细胞以剂量依赖性方式提高ApoEr2的表达，正如在图38(A)&(B)中看到的。
在上述说明书中，公开的所有文献、行为或信息，不构成承认所述文献、行为或信息或其任何组合是可公开获得的，被公众已知的，是本领域常识的一部分，或已知在优先权日期时与解决任何问题相关。
上面引用的所有出版物的公开内容各自以其整体通过引用明确并入本文，其程度等同于其各自单独地通过引用并入。
尽管已描述和说明了治疗神经障碍的方法的特定实施方式，但对于本领域技术人员来说，显然可以做出各种改变和修改而不背离本发明的广阔精神和原理。还应该理解，下面的权利要求书旨在涵盖本文中描述的本发明的总体和具体特征，以及在语言上可能被称为是落于其中的本发明的范围的所有陈述。

Claims (45)

1.一种治疗神经系统的疾病或障碍的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段给药到有需要的患者中；
其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段选自颤蛋白片段重复序列R3、颤蛋白片段重复序列R4、颤蛋白片段重复序列R5、颤蛋白片段重复序列R6、颤蛋白片段重复序列R3至R4、颤蛋白片段重复序列R3至R5、颤蛋白片段重复序列R3至重复序列区R6、颤蛋白片段重复序列R4至R5、颤蛋白片段重复序列R5至R6、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3、连接到重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R4或其组合；
其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6；并且
其中所述神经系统的疾病或障碍是神经变性疾病、神经元损伤、神经元障碍或中风。
2.权利要求1的方法，其中所述神经元障碍选自X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、自闭症、颤蛋白缺乏症、双相障碍、抑郁症和精神分裂症。
3.权利要求1的方法，其中所述神经系统的疾病或障碍是神经元损伤。
4.权利要求1的方法，其中所述颤蛋白以每30-36g患者质量1μl至2μl的5nM组合物之间的量给药。
5.权利要求1的方法，其中颤蛋白载体被动脉内、静脉内、大脑内或脑室内注射。
6.权利要求5的方法，其中所述颤蛋白被双侧注射到所述患者中。
7.权利要求1的方法，其还包括：
将由所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段形成的构建物插入到病毒载体中，以形成颤蛋白载体；并且
将所述颤蛋白载体注射到所述对象中。
8.权利要求7的方法，其中所述病毒载体选自AAV-9、AAV-5、AAV-4和AAV-1。
9.权利要求7的方法，其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段在CMV启动子的控制之下。
10.一种治疗神经系统的疾病或障碍的症状的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段给药到有需要的患者中；
其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段选自颤蛋白片段重复序列R3、颤蛋白片段重复序列R4、颤蛋白片段重复序列R5、颤蛋白片段重复序列R6、颤蛋白片段重复序列R3至R4、颤蛋白片段重复序列R3至R5、颤蛋白片段重复序列R3至重复序列区R6、颤蛋白片段重复序列R4至R5、颤蛋白片段重复序列R5至R6、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3、连接到重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R4或其组合；
其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6；并且
其中所述神经系统的疾病或障碍是神经变性疾病、神经元损伤、神经元障碍或中风。
11.权利要求10的方法，其中所述神经元障碍选自X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、自闭症、颤蛋白缺乏症、双相障碍、抑郁症和精神分裂症。
12.权利要求11的方法，其中所述神经系统的疾病或障碍的症状选自树突棘密度缺陷、长时程增强作用减弱、突触可塑性降低和联想学习缺陷。
13.权利要求10的方法，其中所述颤蛋白以每30-36g患者质量1μl至2μl的5nM组合物之间的量给药。
14.权利要求10的方法，其中颤蛋白载体被动脉内、静脉内、大脑内或脑室内注射。
15.权利要求14的方法，其中所述颤蛋白被双侧注射到所述患者中。
16.权利要求10的方法，其还包括：
将由所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段形成的构建物插入到病毒载体中，以形成颤蛋白载体；并且
将所述颤蛋白载体注射到所述对象中。
17.权利要求16的方法，其中所述病毒载体选自AAV-9、AAV-5、AAV-4和AAV-1。
18.权利要求16的方法，其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段在CMV启动子的控制之下。
19.一种在对象中提高树突棘密度的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段给药到有需要的患者中；
其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段选自颤蛋白片段重复序列R3、颤蛋白片段重复序列R4、颤蛋白片段重复序列R5、颤蛋白片段重复序列R6、颤蛋白片段重复序列R3至R4、颤蛋白片段重复序列R3至R5、颤蛋白片段重复序列R3至重复序列区R6、颤蛋白片段重复序列R4至R5、颤蛋白片段重复序列R5至R6、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3、连接到重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R4或其组合；
其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6。
20.权利要求19的方法，其中所述颤蛋白以每30-36g患者质量1μl至2μl的5nM组合物之间的量给药。
21.权利要求19的方法，其中颤蛋白载体被动脉内、静脉内、大脑内或脑室内注射。
22.权利要求21的方法，其中所述颤蛋白被双侧注射到所述患者中。
23.权利要求19的方法，其还包括：
将由所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段形成的构建物插入到病毒载体中，以形成颤蛋白载体；并且
将所述颤蛋白载体注射到所述对象中。
24.权利要求23的方法，其中所述病毒载体选自AAV-9、AAV-5、AAV-4和AAV-1。
25.权利要求23的方法，其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段在CMV启动子的控制之下。
26.一种提高突触可塑性、学习或改善认知功能的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段给药到有需要的患者中；
其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段选自颤蛋白片段重复序列R3、颤蛋白片段重复序列R4、颤蛋白片段重复序列R5、颤蛋白片段重复序列R6、颤蛋白片段重复序列R3至R4、颤蛋白片段重复序列R3至R5、颤蛋白片段重复序列R3至重复序列区R6、颤蛋白片段重复序列R4至R5、颤蛋白片段重复序列R5至R6、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3、连接到重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R4或其组合；
其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6。
27.权利要求26的方法，其中重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段以每30-36g患者质量1μl至2μl的5nM组合物之间的量给药。
28.权利要求26的方法，其中颤蛋白载体被动脉内、静脉内、大脑内或脑室内注射。
29.权利要求26的方法，其中所述颤蛋白被双侧注射到所述患者中。
30.权利要求26的方法，其还包括：
将由所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段形成的构建物插入到病毒载体中，以形成颤蛋白载体；并且
将所述颤蛋白载体注射到所述对象中。
31.权利要求30的方法，其中所述病毒载体选自AAV-9、AAV-5、AAV-4和AAV-1。
32.权利要求30的方法，其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段在CMV启动子的控制之下。
33.一种包含颤蛋白片段的组合物，其中所述片段进一步包含：
重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段；
其中所述重组颤蛋白片段或颤蛋白剪接片段选自颤蛋白片段重复序列R3、颤蛋白片段重复序列R4、颤蛋白片段重复序列R5、颤蛋白片段重复序列R6、颤蛋白片段重复序列R3至R4、颤蛋白片段重复序列R3至R5、颤蛋白片段重复序列R3至重复序列区R6、颤蛋白片段重复序列R4至R5、颤蛋白片段重复序列R5至R6、连接到颤蛋白片段重复序列R5的颤蛋白片段重复序列R3、连接到颤蛋白片段重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R3、连接到重复序列R6的颤蛋白片段重复序列R4或其组合；并且
其中R3是全长颤蛋白的重复序列区3，R4是全长颤蛋白的重复序列区4，R5是全长颤蛋白的重复序列区5，并且R6是全长颤蛋白的重复序列区6。
34.权利要求33的组合物，其中所述颤蛋白片段是连接到重复序列区R6的重复序列区R3或连接到重复序列区R5的重复序列区R3。
35.权利要求33的组合物，其中所述颤蛋白片段是重复序列区R3，并且其中所述重复序列区R3被配置在AAV-9载体或AAV-5病毒载体中。
36.权利要求35的组合物，其中所述颤蛋白片段在CMV启动子的表达控制之下。
37.一种使用权利要求33至36任一项的颤蛋白片段的方法。
38.一种药物，其由权利要求33至36任一项形成，其中所述药物被用于治疗神经系统的疾病或障碍；
其中所述神经系统的疾病或障碍是神经变性疾病、神经元损伤、神经元障碍或中风。
39.权利要求38的方法，其中所述神经元障碍选自X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、自闭症、颤蛋白缺乏症、双相障碍、抑郁症和精神分裂症。
40.权利要求38的方法，其中所述神经系统的疾病或障碍是神经元损伤。
41.一种药物，其由权利要求33至36任一项形成，其中所述药物被用于治疗神经系统的疾病或障碍的症状；
其中所述神经系统的疾病或障碍是神经变性疾病、神经元损伤、神经元障碍或中风。
42.权利要求41的方法，其中所述神经元障碍选自X染色体易损综合征、威廉姆斯综合征、雷特氏综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、自闭症、颤蛋白缺乏症、双相障碍、抑郁症和精神分裂症。
43.权利要求41的方法，其中所述神经系统的疾病或障碍是神经元损伤。
44.一种药物，其由权利要求33至36任一项形成，其中所述药物被用于提高突触可塑性、学习或改善认知功能。
45.一种药物，其由权利要求33至36任一项形成，其中所述药物被用于提高树突棘密度。
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