KR102523237B1 - 신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물 - Google Patents

신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102523237B1
KR102523237B1 KR1020197006269A KR20197006269A KR102523237B1 KR 102523237 B1 KR102523237 B1 KR 102523237B1 KR 1020197006269 A KR1020197006269 A KR 1020197006269A KR 20197006269 A KR20197006269 A KR 20197006269A KR 102523237 B1 KR102523237 B1 KR 102523237B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
riilin
repeat
rilin
fragment
Prior art date
Application number
KR1020197006269A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190035842A (ko
Inventor
에드윈 제이 위버
Original Assignee
유니버시티 오브 사우스 플로리다
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 사우스 플로리다 filed Critical 유니버시티 오브 사우스 플로리다
Publication of KR20190035842A publication Critical patent/KR20190035842A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102523237B1 publication Critical patent/KR102523237B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/473—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used alpha-Glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

리일린 수준 뿐만 아니라 리일린 신호전달의 변화는 인지 기능을 변경한다. 이는 치료적 유효량의 리일린의 반복체 단편, 또는 리일린의 단편 반복체로부터 형성된 구축물을 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계에 의해 달성될 수 있다. 리일린 수준에 대한 변화는 다양한 신경변성 질환, 뉴런 발작, 또는 뇌졸중, 예컨대 취약 X 증후군, 윌리엄 증후군, 레트 증후군, 다운 증후군, 안젤만 증후군, 자폐증, 국소빈혈, 저산소증, 알츠하이머병, 및 조현병을 치료하는데 사용될 수 있다. 리일린은 또한 수지상 가시 밀도, 감소된 장기간 강화작용, 및 감소된 시냅스 가소성 및 연상 학습 결핍을 변경하는데 사용될 수 있다. 전장 리일린의 반복체 영역 3 및 전장 리일린의 반복체 영역 5, 또는 전장 리일린의 반복체 영역 3 및 전장 리일린의 반복체 영역 6 으로부터 형성된 구축물이 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.

Description

신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
이 출원은 제목이 "신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물" 이고, 2016 년 8 월 3 일에 제출된 미국 가출원 제 62/370,519 호; 및 제목이 "신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물" 이고, 2017 년 4 월 18 일에 제출된 미국 가출원 제 62/486,729 호의 비-가출원이다; 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
지질단백질 수용체 신호전달 시스템은, 콜레스테롤 항상성, 세포외 단백질의 청소, 및 다수의 신호 변환 경로의 활성화를 통하는 기억 형성, 시냅스 전달, 가소성 (plasticity) 및 성숙의 조정을 포함하여, 성체 CNS 에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
세포외 매트릭스 단백질 리일린 (Reelin) 은 조현병 (Guidotti, et al., Decrease in reelin and glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67) expression in schizophrenia and bipolar disorder: a postmortem brain study. Arch. Gen Psychiatry. 2000; 57: 1061-1069; Chen, et al., Identification of a single nucleotide polymorphism at the 5' promoter region of human reelin gene and association study with schizophrenia. Mol. Psychiatry. 2002; 7: 447-448; Fatemi, et al., Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia. Int. Rev. Neurobiol. 2005; 71: 179-187, Torrey, et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder and major depression in postmortem brains. Biol. Psychiatry. 2005; 57: 252-26), 양극성 장애 (Fatemi, et al., Reduction in Reelin immunoreactivity in hippocampus of subjects with schizophrenia, bipolar disorder and major depression. Mol. Psychiatry. 2000; 5: 654-663; Torrey, et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder and major depression in postmortem brains. Biol. Psychiatry. 2005; 57: 252-260), 우울증 (Knable, et al., Molecular abnormalities of the hippocampus in severe psychiatric illness: postmortem findings from the stanley neuropathology consortium. Mol. Psychiatry. 2004; 9: 609-620; Lussier, et al., Repeated exposure to corticosterone, but not restraint, decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2009; 460: 170-174; Lussier, et al., Reelin as a putative vulnerability factor for depression: examining the depressogenic effects of repeated corticosterone in heterozygous reeler mice. Neuropharmacol. 2011; 60: 1064-1074; Lussier, et al., The progressive development of depression-like behavior in corticosterone-treated rats is paralleled by slowed granule cell maturation and decreased reelin expression in the adult dentate gyrus. Neuropharmacol. 2013; 71C, 174-183; Lussier, et al., Altered GABAergic and glutamatergic activity within the rat hippocampus and amygdala in rats subjected to repeated corticosterone administration but not restraint stress. Neurosci. 2013; 231: 38-48; Fenton, et al., Imipramine protects against the deleterious effects of chronic corticosterone on depression-like behavior, hippocampal reelin expression and neuronal maturation. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.Psychiatry. 2015; 60: 52-59.), 자폐증 (Fatemi, et al., Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia. Int. Rev. Neurobiol. 2005; 71: 179-187), 및 알츠하이머병 (AD) (Hoe, et al., DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor2 trafficking and processing. J. Biol Chem. 2006; 281: 35176-35185; Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol. Aging. 2008; 29: 542-553) 을 포함하는, 다수의 신경 장애의 원인임이 시사되어 왔다. 현재, 리일린 신호전달은, 도 1 에서 보여지는 바와 같은, 세포내 캐스케이드 사건의 유발을 수반한다.
리일린 신호전달은, 신경펩티드 또는 소분자 전달자와 같은, 중간뉴런으로부터 리일린의 단순 생산 및 방출과는 대조적으로, 격리된, 전장, 세포외 리일린의 유도된 단백질가수분해에 의해 추진되는 것으로 보인다. 리일린은, 도 2 에서 보여지는 바와 같이, EGF-유사 반복체 2-3 (R2-3) 및 반복체 6-7 (R6-7) 사이에 두 개의 주된 절단 자리를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004;24: 514-521). 이들 절단 자리는, 도 3 에서 보여지는, 성체 및 발달하는 뇌에서 발견될 수 있는 5 개의 주요 단편을 초래한다 (Jossin, et al., Processing of Reelin by embryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J. Neurosci. 2007;27: 4243-4252; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7:e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). 중간 R3-6 단편은 VLDLR 및 ApoER2 와 상호작용하고, 리일린 캐스케이드의 하류 신호전달을 개시하는데 관여하는 단편으로 여겨진다 (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004;24: 514-521).
리일린-절단 효소, 예컨대 세린 프로테아제 조직 플라스미노겐 활성화인자 (tPA), 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (MMP), 및 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나아제 (ADAMTS), 및 이러한 단백질분해 가공의 기능적 역할을 확인하려는 다수의 시도가 있었다 (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Nagy, et al., Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal late-phase long-term potentiation and memory. J. Neurosci. 2006;26: 1923-1934; Nogi, et al., Structure of a signaling-competent reelin fragment revealed by X-ray crystallography and electron tomography. EMBO J. 2006;25: 3675-3683; Nakano, et al., The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J. Biol Chem. 2007;282: 20544-20552; Hisanaga, et al., A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 (ADAMTS-4) cleaves Reelin in an isoform-dependent manner. FEBS Lett. 2012; 586: 3349-3353.; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7:e47793). 세포외 리일린의 대한 하나의 내인성 가공 경로는 뇌의 세린 프로테아제 조직 플라스미노겐 활성화인자 (tPA) 를 통하며, 이는 야생형 리일린의 R6 과 R7 사이에서 일어난다 (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). 단백질가수분해는 tPA KO 마우스에서는 보이지 않았으며, 이는 리일린의 NMDAR-독립적 LTP 유도되는 절단에 있어서의 이러한 프로테아제의 역할을 지지하고 (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307), 세르핀 E1 저해인자에 의해 차단되었다 (Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7:e47793). 추가로 지지하여, 45 min 동안 tPA 와 리일린의 생체외 인큐베이션은 N-R6 단편 (370 kDa) 을 생산했으며, 이는 플라스미노겐 활성화인자 저해인자 (PAI-1; 세르핀 E1) 및 디이소프로필 플루오로포스페이트 (세린 프로테아제 저해인자) 로 차단되었으나, 아프로티닌 또는 CR-50 (리일린의 N-말단 영역에 결합하는 항체; D'Arcangelo, et al., Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonal antibody. J. Neurosci. 1997;17: 23-31; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307) 에 의해 차단되지 않았다. 연구는 또한 R6 및 R7 반복체 사이의 리일린 절단에서 메탈로프로테아제 메프린 α 및 β 가 연루됨을 보여준다 (Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016;159: 305-312). 그러나, tPA 녹아웃 마우스 (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307) 및 메프린 β 녹아웃 마우스 (Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016;159: 305-312) 둘 모두는 전장 리일린 또는 리일린 단편의 기저 수준에서 차이를 입증하지 않으며, 이는 프로테아제의 조합이 구성적 리일린 수준 및 단백질가수분해에 관여한다는 것을 시사한다.
성체 해마에서, 당단백질 리일린은 치아이랑의 문 영역, 및 고유 해마의 층 소강-분자 층에 주로 거주하는 중간뉴런에 의해 발현된다. 리일린-발현 세포는 또한 부위 CA1 및 CA3 의 지향층 및 방사층에서 발견될 수 있고, 해마의 추상 세포와 연합된다. 시냅스 효율의 지속적 증가를 초래하는 시냅스 가소성의 형태, 장기간 강화작용 (long-term potentiation) (LTP) 의 유도는, NMDA 수용체 (NMDAR) 활성화 및 AMPA 수용체 발현 및 기능의 후속적인 상향조절을 요구한다. AMPA 수용체 (AMPAR) 의 변화는 증가된 아단위 인산화에 의해 또는 증가된 아단위 합성 및 특정 시냅스 자리로의 트래피킹 (trafficking) 에 의해 달성될 수 있다. 이와 대조적으로, NMDAR 은 동시 검출제로서의 역할을 하고, 시냅스 가소성의 유도에서 주요 역할을 수행한다. NMDAR 이온 채널의 개방은 글루타메이트 결합 및 시냅스후 막 탈분극 둘 모두를 요구한다. 일부 NMDAR 아단위, 예컨대 NR1, NR2A 및 NR2B 는 또한 세린/트레오닌 또는 티로신 잔기에서의 조정성 인산화에 적용된다. NMDAR 아단위의 인산화는 채널 동역학 및 시냅스 자리로의 트래피킹 둘 모두를 조정한다. 결과적으로 리일린이 시냅스 가소성의 조정에 중요한 경우에, 그 때 NMDAR 및 AMPAR 은 시냅스 가소성의 유도 및 발현에서의 그들의 중요성을 고려할 때 타당한 표적일 것이다.
리일린 분자는 최근에 시험관내에서 (in vitro) 및 생체내에서 (in vivo) 고차 복합체, 예컨대 Fc-RAP 를 형성하는 것으로 발견되었다. 이러한 관찰은 리일린이 생체내에서 다이설파이드-연결된 동종이합체로서 분비된다는 것을 보여줌으로써 정제된다. 분자의 N-말단에 위치하는, CR-50 에피토프로 호칭되는, 짧은 영역의 결실은 올리고머화를 없앤다. 이러한 돌연변이된 리일린은 일차 마우스 뉴런에서 Dab1 인산화를 효율적으로 유도하는데 실패한다.
리일린은 시냅스 가소성 및 학습의 과정에서 능동적 역할을 수행한다. 본 발명은 또한 인지 기능을 향상시키고/향상시키거나 복구하는 리일린 단백질 가공에 관한 메카니즘의 식별 및 사용을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 하기가 공개된다: 맥락적 공포 학습 (contextual fear learning) 및 세타 돌발 자극 (theta burst stimulation) (tb-stim) 은 리일린 가공의 변화를 야기하고; 메탈로프로테이나아제, tPA 및 MMP-9 는 시냅스 가소성 및 학습 동안 리일린 가공에서 차등적으로 관여하고; 리일린 단편 보체의 보충은 연상 및 공간 학습 및 기억을 향상시킬 수 있고; 리일린 단편은 Aβ 플라크와 연합하고, 그것의 발현 및 가공은 AD-관련 돌연변이에 의해 변경되고, 리일린 보충은 Tg2576 AD 마우스 모델에서 발견되는 LTP 결핍을 극복할 수 있다.
리일린이 GABA 생산성 중간뉴런에 의해 세포외 공간에 분비되면, 그것은 지질단백질 수용체, 초저밀도 지질단백질 수용체 (VLDLR) 및 아포지질단백질 수용체 2 (ApoER2) 에 결합하며, 이들은 이합체화한다 (D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006;7, 850-859). 이합체화된 수용체 티로신은 세포내 어댑터 단백질 Disabled-1 (Dab1) 을 인산화하고, 그 후 src 패밀리 티로신 키나아제 (SFK) 티로신, 예컨대 Fyn 의 인산화, 및 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NMDAR) 의 인산화가 뒤따른다 (D'Arcangelo, et al., Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonal antibody. J. Neurosci. 1997;17: 23-31; D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Niu, et al., Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway. Neuron. 2004; 41: 71-84; Beffert, et al. Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47: 567-579; Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007;97: 2312-2321; Burrell, et al., (2014). Fyn tyrosine kinase increases Apolipoprotein E receptor 2 levels and phosphorylation. PLoS One 9:e110845.; Divekar, et al., Ligand-induced homotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2. J. Biol Chem. 2014;289: 15894-15903).
NMDAR 인산화로 인한 칼슘 유입의 증가는 시냅스후 막의 탈분극, NR2B 로부터 NR2A 수용체 아형으로의 NMDA 수용체의 성숙, 및 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 수용체 (AMPAR) 삽입을 초래한다 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007;97: 2312-2321). 세포의 Ca2+ 유입 및 탈분극의 증가는 CREB 인산화 및 단백질 합성을 증가시키며, 이는 궁극적으로 장기간 강화작용 (LTP) 의 유도 및 향상 및 증가된 시냅스 가소성 및 학습 및 기억을 초래한다 (Niu, et al., The Reelin signaling pathway promotes dendritic spine development in hippocampal neurons. J. Neurosci. 2008; 28: 10339-10348.; Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity and dendritic spine density. Learn. Mem. 2011;18: 558-564; Rogers, et al. Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013;27: 386-395). 동시에, Dab1 인산화는 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 (PI3K), 단백질 키나아제 B (PKB/Akt) 의 활성화, 및 Tau 인산화를 저해하는 글리코겐 신타아제 키나아제 3 베타 (GSK3β) 의 조정 (Beffert, et al., Reelin-mediated signaling locally regulates protein kinase B /Akt and glycogen synthase kinase 3 beta. J. Biol Chem. 2007;277: 49958-49964), 뿐만 아니라, Tau 인산화로의 또다른 경로, CDK5 의 활성화의 원인이 되는 p35 에서 p25 로의 전환의 조절을 초래한다 (Beffert, et al., Reelin and cyclin-dependent kinase 5-dependent signals cooperate in regulating neuronal migration and synaptic transmission. J. Neurosci. 2004;24:1897-1906).
따라서, 리일린 신호전달은 다수의 병태에서의 시냅스 및 뉴런 손실에 대항하는 요법의 유용한 표적이다. 예를 들어, 리일린은 지질단백질 수용체 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 둘 모두에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 다수의 AD 마우스 모델에서 Aβ 플라크와 연합되는 것으로 알려져 있다 (Chin, et al. Reelin depletion in the entorhinal cortex of human amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer's disease. J Neurosci 2007, 27:2727-2733; Hoareau, et al. Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol Aging 2008, 29:542-553; Hoe, et al. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281:35176-35185; Miettinen, et al. Reelin-immunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse: effects of APP/PS1 genotype and ovariectomy. J Chem Neuroanat. 2005, 30:105-1180).
더욱이, 리일린 신호 변환 경로는 알츠하이머병 (AD) 에서 특히 취약한 것으로 보이며, 잠재적으로 그것의 발병에 기여한다 (Hoe, et al. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281:35176-35185; Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol. Aging. 2008; 29: 542-553).
유사하게, 리일린은 성체에서 시냅스 가소성에 영향을 미칠 수 있다. 리일린, ApoER2 및 VLDLR, 또는 Disabled-1 (Dab1) 이 녹아웃된 마우스는 시냅스 가소성의 결핍을 보인다 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952, Qui, et al., 2006, Beffert, et al., Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47:567-579). 치료적 개입, 예컨대 리일린의 양측 심실내 주사 (IVI) 는, 요법으로서 사용될 수 있고, 야생형 마우스에서 학습 및 기억 및 시냅스 가소성을 향상시킨다 (Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity and dendritic spine density. Learn. Mem. 2011;18: 558-564). 리일린 IVI 은 또한, 도 4 에서 보이는, 이종접합체 리일러 마우스 (Rogers, et al. Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013;27: 386-395) 에서, 및 안젤만 증후군의 마우스 모델 (Hethorn et al., 2016) 에서 보이는 학습 및 기억 및 LTP 결핍의 회복을 보여줬다. 따라서, 단백질 투여에 의한 또는 리일린 유전자 RELN 를 이용한 유전자 요법에 의한 리일린 수준의 보충은 다양한 질환에서 잠재적 치료적 개입일 수 있다.
리일린이 GABA 생산성 중간뉴런에 의해 세포외 공간 내에 분비되면 그것은 지질단백질 수용체, 초저밀도 지질단백질 수용체 (VLDLR) 및 아포지질단백질 수용체 2 (ApoER2) 에 결합하며, 이는 도 1 에서 보여진다 (D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al. Reelin and Apo E receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006;7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006;26: 12943-12955). 리간드 상호작용은 수용체 이합체화 및 하류 세포내 어댑터 단백질 Dab1 의 티로신 인산화를 초래한다 (Howell, et al., Mouse disabled (mDab1): a Src binding protein implicated in neuronal development. EMBO J. 1997;16: 121-132; D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Hiesberger, et al., Direct binding of Reelin to VLDL receptor and ApoE receptor 2 induces tyrosine phosphorylation of disabled-1 and modulates tau phosphorylation. Neuron. 1999; 24: 481-489; Strasser, et al., (2004). Receptor clustering is involved in Reelin signaling. Mol Cell Biol. 2004; 24: 1378-1386; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev.Neurosci. 2006;7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006;26: 12943-12955; Trotter, et al., Dab1 is required for synaptic plasticity and associative learning. J. Neurosci. 2013;33: 15652-15668; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Divekar, et al., Ligand-induced homotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2. J. Biol Chem. 2014;289: 15894-15903). Dab1 인산화는 Src 패밀리 티로신 키나아제 (SFK), 예컨대 Fyn 을 활성화시키며, 이는 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체를 인산화시켜 Ca2+ 유입의 증가를 허용한다 (Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216). Ca2+ 유입의 향상은 NR2B 로부터 NR2A 수용체 아형으로의 NMDA 수용체의 성숙, 증가된 막 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 (AMPA) 수용체 삽입을 허용하고, 장기간 강화작용의 유도 및 향상에 기여할 수 있다 (LTP; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol.Chem. 2002; 277, 39944-39952; Beffert, et al., Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47:567-579; Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006;7, 850-859.; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006;26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007;97, 2312-2321). 또한, Dab1-유도되는 인산화 또한 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 (PI3K) 및 단백질 키나아제 B (PKB/Akt) 를 활성화시킬 수 있고, 이는 그 후 글리코겐 신타아제 키나아제 3 베타 (GSK3β) 저해를 야기하여 (Beffert, et al., Reelin-mediated signaling locally regulates protein kinase B/Akt and glycogen synthase kinase 3beta. J. Biol Chem. 2002; 277, 49958-49964), 결국 tau 과인산화를 억제한다 (Ohkubo, et al., Apolipoprotein E and Reelin ligands modulate tau phosphorylation through an Apolipoprotein E receptor/disabled-1/glycogen synthase kinase-3beta cascade. FASEB J. 2003;17, 295-297).
리일린-양성 세포는 CA1 층 소강 및 문에서 가장 많은 수로 발견되므로, 그들은 학습 및 기억, 및 신경발생, 각각에서 영향을 미치는 주요한 위치에 있다. 실제로, 리일린은 시냅스 가소성 및 학습 및 기억을 향상시키며 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006;7, 850-859.; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006;26: 12943-12955; Rogers & Weeber, Reelin and ApoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008;4:259-270), 뿐만 아니라 신생 성체 뉴런의 이주를 변경는 것으로 밝혀졌다 (Zhao, et al., Balance between neurogenesis and gliogenesis in the adult hippocampus: role for Reelin. Dev. Neurosci. 2007; 29: 84-90; Pujadas, et al., Reelin regulates postnatal neurogenesis and enhances spine hypertrophy and long-term potentiation. J. Neurosci. 2010;30: 4636-4649.doi; Teixeira, et al., Cell-autonomous inactivation of the Reelin pathway impairs adult neurogenesis in the hippocampus. J. Neurosci. 2012;32: 12051-12065). 해마에서, 세포외 리일린은 층 소강에서 축적되며 (Pesold, et al., Cortical bitufted, horizontal and Martinotti cells preferentially express and secrete Reelin into perineuronal nets, non-synaptically modulating gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 3217-3222; Lussier, et al., Repeated exposure to corticosterone, but not restraint, decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2009; 460: 170-174), 이는 그것을 CA1 에서 시냅스 활성에 영향을 미치는 주요 위치에 있게 만든다 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 2006;7, 850-859.; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006;26: 12943-12955; Rogers & Weeber, Reelin and ApoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008;4:259-270). 이들 영역에서 리일린의 내인성 절단은 이들 과정에 대한 리일린의 효과를 조절하는데 사용될 수 있다.
게다가, 지질단백질 수용체 신호전달 시스템은 성체 CNS 예컨대 콜레스테롤 항상성, 세포외 단백질의 청소, 다수의 신호 변환 경로의 활성화를 통한 기억 형성, 시냅스 전달, 가소성 및 성숙의 조정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 중요하게도, 지질단백질 수용체 리간드 아포지질단백질 E (apoE) 는 후기-발병, 산발성 알츠하이머병 (AD) 에 관한 가장 많이 입증된 위험 인자 중 하나이다 (Hoe HS, Harris DC, Rebeck GW. Multiple pathways of apolipoprotein E signaling in primary neurons. J Neurochem 2005;93:145-155; Hoe HS, Freeman J, Rebeck GW. Apolipoprotein E decreases tau kinases and phospho-tau levels in primary neurons. Mol Neurodegener 2006, 1:18; Hoe HS, Pocivavsek A, Chakraborty G, et al. Apolipoprotein E receptor 2 interactions with the N-methyl-Daspartate receptor. J Biol Chem 2006, 281:3425-3431). 유사하게, 세포외 매트릭스 단백질 리일린은 지질단백질 수용체 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 둘 모두에 결합할 수 있고, 다수의 AD 마우스 모델에서 Aβ 플라크와 연합되는 것으로 알려져 있다 (Chin J, Massaro CM, Palop JJ, et al. Reelin depletion in the entorhinal cortex of human amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer's disease. J Neurosci 2007, 27:2727-2733; Hoareau C, Borrell V, Soriano E, Krebs MO, Prochiantz A, Allinquant B. Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol Aging 2008, 29:542-553; Hoe HS, Tran TS, Matsuoka Y, Howell BW, Rebeck GW. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281:35176-35185; and Miettinen R, Riedel A, Kalesnykas G, et al. Reelin-immunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse: effects of APP/PS1 genotype and ovariectomy. J Chem Neuroanat 2005, 30:105-1180). Aβ 축적은 리일린 신호전달 및 지질단백질 수용체 기능에 영향을 미쳐서, 그에 의해 AD 발병을 촉진하고 시냅스 및 인지 기능에 영향을 미칠 수 있다.
그러므로, 인지 기능의 개선 뿐만 아니라 신경 질환, 예컨대 AD 및 다른 연령 관련 신경변성 장애, 신경 장애의 치료에서 치료제로서 사용하기 위한 리일린과 유사한 방식으로 지질단백질 수용체 시스템에 대해 작용하는 특정 아고니스트가 필요하다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 일반적으로 리일린 수준 뿐만 아니라 리일린 또는 리일린 신호전달로 개시 또는 유지되는 세포성 신호 변환의 증가, 및/또는 간섭 방지에 의해 인지 기능에 영향을 미치고 이를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 치료적 유효량의 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편을 이를 필요로 하는 환자 내에 투여하여 신경계의 질환 또는 장애를 치료 또는 교정하는 방법을 제공한다. 일부 변형예에서, 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 반복체 R3 내지 R5 로 형성된 리일린 단편 (R3-R5), 리일린 단편 반복체 R5 에 연결된 리일린 단편 반복체 R3 (R3+R5), 리일린 단편 반복체 R3, 반복체 R3 내지 R6 으로 형성된 리일린 단편 (R3-R6), 리일린 단편 반복체 R6 에 연결된 리일린 단편 반복체 R3 (R3+R6) 이며, 여기에서 R3 은 전장 리일린의 반복체 영역 3 이고, R4 는 전장 리일린의 반복체 영역 4 이고, R5 는 전장 리일린의 반복체 영역 5 이고, R6 은 전장 리일린의 반복체 영역 6 이다. 임의로, 리일린 스플라이스 단편이 R3+R5 인 경우에, 두 개의 반복체 영역, 즉 R3 및 R5 는 반복체 영역 3 루프, 반복체 영역 5 루프, 또는 그들의 조합에 의해 연결된다. 대안적으로, 리일린 스플라이스 단편이 R3+R6 인 경우에, 두 개의 반복체 영역, 즉 R3 및 R6 은 반복체 영역 3 루프, 반복체 영역 6 루프, 또는 그들의 조합에 의해 연결된다. 특정 형태에서, 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 리일린 단편 반복체 R3, 리일린 단편 반복체 R4, 리일린 단편 반복체 R5, 리일린 단편 반복체 R6, 리일린 단편 반복체 R3 내지 R4, 리일린 단편 반복체 R3 내지 R5, 리일린 단편 반복체 R3 내지 반복체 영역 R6, 리일린 단편 반복체 R4 내지 R5, 리일린 단편 반복체 R5 내지 R6, 리일린 단편 반복체 R5 에 연결된 리일린 단편 반복체 R3, 리일린 단편 반복체 R6 에 연결된 리일린 단편 반복체 R3, 반복체 R6 에 연결된 리일린 단편 반복체 R4, 또는 위에서 언급된 리일린 단편(들) 또는 리일린 스플라이스 단편(들)의 조합이다. 본 발명의 일부 변형예에서, 신경계의 질환 또는 장애는 신경변성 질환, 뉴런 발작, 뉴런 장애, 또는 뇌졸중이다. 특정 변형예에서, 뉴런 장애는 취약 X 증후군, 윌리엄 증후군, 레트 증후군, 다운 증후군, 안젤만 증후군, 자폐증, 리일린 결핍증, 양극성 장애, 우울증, 및 조현병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 신경계의 질환 또는 장애는 뉴런 발작 또는 알츠하이머병이다.
임의로, 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 비경구 주사에 의해 투여된다. 특정 변형예에서, 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 동맥내, 정맥내, 대뇌내, 또는 심실내 주사된다. 본 발명의 특정 변형예에서, 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 환자의 심실 내에 양측에 주사된다. 일부 변형예에서, 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 약 10 μM 내지 약 5 nM 의 CNS 유체 내 리일린의 농도를 수득하도록 투여된다. 임의적 농도는 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM, 80 μM, 85 μM, 90 μM, 100 μM, 110 μM, 120 μM, 130 μM, 140 μM, 150 μM, 160 μM, 170 μM, 180 μM, 190 μM, 200 μM, 220 μM, 225 μM, 240 μM, 250 μM, 270 μM, 275 μM, 280 μM, 300 μM, 320 μM, 325 μM, 340 μM, 350 μM, 370 μM, 375 μM, 380 μM, 400 μM, 420 μM, 425 μM, 440 μM, 450 μM, 470 μM, 475 μM, 480 μM, 500 μM, 520 μM, 525 μM, 540 μM, 550 μM, 570 μM, 575 μM, 580 μM, 600 μM, 620 μM, 625 μM, 640 μM, 650 μM, 670 μM, 675 μM, 680 μM, 700 μM, 720 μM, 725 μM, 740 μM, 750 μM, 770 μM, 775 μM, 780 μM, 800 μM, 820 μM, 825 μM, 840 μM, 850 μM, 870 μM, 875 μM, 880 μM, 900 μM, 920 μM, 925 μM, 940 μM, 950 μM, 970 μM, 975 μM, 980 μM, 1 nM, 1.1 nM, 1.2 nM, 1.3 nM, 1.4 nM, 1.5 nM, 1.6 nM, 1.7 nM, 1.8 nM, 1.9 nM, 2.0 nM, 2.1 nM, 2.2 nM, 2.3 nM, 2.4 nM, 2.5 nM, 2.6 nM, 2.7 nM, 2.8 nM, 2.9 nM, 3.0 nM, 3.1 nM, 3.2 nM, 3.3 nM, 3.4 nM, 3.5 nM, 3.6 nM, 3.7 nM, 3.8 nM, 3.9 nM, 4.0 nM, 4.1 nM, 4.2 nM, 4.3 nM, 4.4 nM, 4.5 nM, 4.6 nM, 4.7 nM, 4.8 nM, 4.9 nM, 및 5.0 nM 을 포함한다. 예를 들어, 치료적 농도는 100 nM 미만, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 10nM 미만, 또는 약 5 nM 일 수 있다. 투여량은 동물 몸체 내 단백질의 분포 및 혈액 뇌 장벽으로의 접근에 기초하여 계산될 수 있다. 비-제한적 예에서 리일린은 각각 30-36 g 의 환자 질량에 대해 1 μl 의 5 nM 조성물로 투여된다. 게다가, 치료는 계속 진행 중, 즉 연속적일 수 있거나, 또는 치료 섭생법은 1 년 미만, 6 개월 미만, 3 개월 미만, 1 개월 미만, 1 주 미만, 또는 약 1 일 지속될 수 있다.
본 발명의 일부 변형예에서, 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편으로부터 형성된 구축물이 바이러스 벡터 내에 삽입되어 리일린 벡터를 형성하고, 리일린 벡터는 대상체 내에 주사된다. 임의적 벡터는 AAV9, AAV5, AAV1 및 AAV4 를 포함한다. 그러나, 다른 벡터, 특히 기술분야에 알려진 임의의 적합한 AAV 가 본 발명에서 이용될 수 있을 것이고 그러한 용도에 고려된다. 특정 변형예에서, 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 CMV 프로모터의 제어 하에 있다.
본 발명은 또한 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기에서 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 반복체 R3 내지 R5 로 형성된 리일린 단편 (R3-R5), 리일린 단편 반복체 R5 에 연결된 리일린 단편 반복체 R3 (R3+R5), 리일린 단편 반복체 R3, 반복체 R3 내지 R6 으로 형성된 리일린 단편 (R3-R6), 리일린 단편 반복체 R6 에 연결된 리일린 단편 반복체 R3 (R3+R6) 이며, 여기에서 R3 은 전장 리일린의 반복체 영역 3 이고, R4 는 전장 리일린의 반복체 영역 4 이고, R5 는 전장 리일린의 반복체 영역 5 이고, R6 은 전장 리일린의 반복체 영역 6 이다. 임의로, 리일린 스플라이스 단편이 R3+R5 인 경우에, 두 개의 반복체 영역, 즉 R3 및 R5, 는 반복체 영역 3 루프, 반복체 영역 5 루프, 또는 그들의 조합에 의해 연결된다. 대안적으로, 리일린 스플라이스 단편이 R3+R6 인 경우에, 두 개의 반복체 영역, 즉 R3 및 R6 은 반복체 영역 3 루프, 반복체 영역 6 루프, 또는 그들의 조합에 의해 연결된다.
조성물의 일부 변형예에서, 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 바이러스 벡터 내에 삽입된 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편으로부터 형성된 구축물 내에 통합되어 리일린 벡터를 형성하고, 리일린 벡터는 대상체 내에 주사된다. 임의적 벡터는 AAV9, AAV5, AAV1 및 AAV4 를 포함한다. 그러나, 다른 벡터, 특히 기술분야에 알려진 임의의 적합한 AAV 가 본 발명에서 이용될 수 있을 것이고 그러한 용도에 고려된다. 특정 변형예에서, 재조합 리일린 단편 또는 리일린 스플라이스 단편은 CMV 프로모터의 제어 하에 있다.
위에서 언급된 조성물은 또한, 신경변성 질환, 뉴런 발작, 및 뇌졸중을 포함하는, 신경계의 질환 또는 장애의 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 비제한적 예는 취약 X 증후군, 윌리엄 증후군, 레트 증후군, 다운 증후군, 안젤만 증후군, 자폐증, 국소빈혈, 저산소증, 알츠하이머병, 리일린 결핍증, 양극성 장애, 우울증, 조현병, 및 뇌졸중을 포함한다. 신경계의 질환 또는 장애의 증상의 구체적 예는 수지상 가시 (dendritic spine) 밀도의 부족, 감소된 장기간 강화작용 (long-term potentiation), 감소된 시냅스 가소성 및 연상 학습 결핍을 포함한다. 유용한 치료적 조성물 및 양은 위에서 개시되어 있다.
위에서 언급된 조성물은 또한 대상체 내 수지상 가시 밀도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 유용한 치료적 조성물 및 양은 위에서 개시되어 있다.
위에서 개시된 조성물은 또한 시냅스 가소성, 학습 증가, 또는 인지 기능 개선에서 유용하다. 시냅스 가소성, 학습 증가, 또는 인지 기능 개선에서 사용될 수 있는 조성물 및 양은 위에서 기재된 바와 동일하다.
본 발명의 더 완전한 이해를 위해, 하기 상세한 설명을 첨부된 도면과 함께참조할 수 있으며, 도면에서:
도 1 은 성체 시냅스 가소성에서 리일린 경로의 도해이다.
도 2 는 성체 뇌에서의 리일린 단백질가수분해를 보여주는 도해이다. 전장 리일린은 성체 뇌에서의 GABA 생산성 중간뉴런에 의해 세포외 공간 내에 방출된다. 이러한 전장 리일린은 표피 성장 인자 (EGF) 반복체 2-3 (R2-R3) 및 6-7 (R6-R7) 사이에서 (점선으로 표시됨) 다수의 상이한 효소에 의해 효소적으로 절단된다. 예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성화인자 (tPA), 메프린 α 및 β 는 리일린을 R6 과 R7 사이에서 절단하며 (Kohno, et al., Mechanism and significance of specific proteolytic cleavage of Reelin. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2009;380: 93-97.; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7:e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016;159: 305-312), 한편 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (MMP)-9 는 리일린을 R2 와 R3 사이에서 절단하는 것으로 밝혀졌다 (Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7:e47793). ADAMTS 4 및 5 는 리일린을 양쪽 자리에서 절단하는 것으로 밝혀졌다 (Hisanaga, et al., A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 (ADAMTS-4) cleaves Reelin in an isoform-dependent manner. FEBS Lett. 2012;586: 3349-3353.; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7:e47793). 기타, 아직 확인되지 않은 프로테아제가 또한 리일린 가공에 잠재적으로 관여한다.
도 3 은 전장 리일린 (450 kDa) 및 370-80 kDa 범위의 5 개의 단편의 생산을 초래하는 다수의 효소의 절단에 의해 형성되는 리일린의 단편을 보여주는 도해이다. R3-R6 단편 [전장 리일린 (450 kDa), 370 kDa, 190 kDa, 및 270 kDa 단편에 포함됨] 은 지질단백질 수용체, ApoER2 및 VLDLR 에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004;24: 514-521). N-R2 단편 (180 kDa) 은 α3β1-인테그린에 결합하는 것으로 밝혀졌고 (Dulabon, et al., Reelin binds alpha3beta1 integrin and inhibits neuronal migration. Neuron. 2000;27:33-44), 뉴런 이주는 생체내에서 CR-50 항체에 의해 파괴되는 것으로 밝혀졌다 (Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1997;94:8196-8201). C-말단 영역 (R7-C; 80 kDa) 은 리일린의 분비, 뿐만 아니라 그것의 적절한 폴딩 (de Bergeyck, et al., A truncated Reelin protein is produced but not secreted in the 'Orleans' reeler mutation (Reln[rl-Orl]). Brain Res. Mol. Brain Res. 1997;50:85-90; Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004;24: 514-521), 및 하류 신호전달 효능에 관여하는 것으로 밝혀졌다 (Nakano, et al., The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J. Biol. Chem. 2007;282:20544-20552).
도 4 는 세타-돌발 자극시 LTP 를 보여주는 그래프이다.
도 5 는 전장 리일린의 서열이다. 엔도뉴클레아제의 인지 자리는 그들의 각각의 서열 위에 표시되어 있다. 반복체 서열은 왼쪽의 표시이고 반복체 영역은 강조표시되어 있다. 각각의 반복체 영역 사이에는 융합 루프가 있으며, 이는 강조표시되어 있지 않다.
도 6 은 불활성화된 수용체 및 활성이고 형광을 발하는 이합체화된 수용체를 보여주는, 리일린-의존적 ApoER2 수용체의 도해이다. 시스템은 수용체 활성화 루시페라아제 어세이에서 사용된다.
도 7 은 다양한 단편의 생산을 초래하는 다수의 효소에 의한 절단에 의해 형성되는 리일린의 리일린 단편을 보여주는 도해이다. R3-R6 단편은 리일린 단편 R3 (이는 오직 제 3 스플라이스 영역을 함유함), R3-4 (이는 함께 스플라이싱된 스플라이스 영역 R3 및 R4 를 함유함), R3-R5 (이는 함께 스플라이싱된 반복체 영역 R3, R4, 및 R5 를 함유함), 및 R5-R6 단편 (이는 영역 R6 에 스플라이싱된 영역 R5 를 포함함) 과 비교된다. 또한 보여지는 것은 단편 R3+R5 및 R3+R6 (이는 각각 R5 영역 또는 R6 영역에 스플라이싱된 R3 영역을 함유함) 이다.
도 8 은 3 + 6 리일린 단편의 서열이다. 단편은 3-4 루프를 5-6 루프에 연결하여, 반복체 3 을 반복체 6 에 부착하여 형성된다. 신호 펩티드 영역은 어두운 회색으로 강조표시되어 있으며, 그에 뒤이어 반복체 영역 3 이 있으며, 밝은 회색으로 강조표시되어 있다. 3-4 에 관한 연결하는 루프 영역은 중간 회색이며, 그에 뒤이어 5-6 에 관한 연결하는 루프 영역 및 반복체 영역 6 이 있으며, 어두운 회색이다.
도 9 는 3 + 5 리일린 단편의 서열이다. 단편은 3-4 루프를 4-5 루프에 연결하여, 반복체 3 을 반복체 5 에 부착하여 형성된다. 신호 펩티드 영역은 어두운 회색으로 강조표시되어 있으며, 그에 뒤이어 반복체 영역 3 이 있으며, 밝은 회색으로 강조표시되어 있다. 3-4 에 관한 연결하는 루프 영역은 중간 회색이며, 그에 뒤이어 4-5 에 관한 연결하는 루프 영역 및 반복체 영역 5 이 있으며, 어두운 회색이다.
도 10 은 마우스 리일린 단편을 사용하는 ApoER2 루시페라아제 어세이를 보여주는 그래프이다.
도 11 은 인간 리일린 단편을 사용하는 ApoER2 루시페라아제 어세이를 보여주는 그래프이다.
도 12 는 마우스 리일린 단편 및 인간 리일린 단편의 ApoER2 루시페라아제 어세이를 비교하는 그래프이다.
도 13(A) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 블롯이다. ApoER2 및 AKT 및 ERK 의 활성 및 인산화 상태를 보여주는 대표적 웨스턴 블롯. ERK 인산화는 ERK 활성의 직접 검출이고, 상류 신호전달 경로 활성화를 나타낸다.
도 13(B) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. ApoER2 의 활성을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 5-6 이다.
도 13(C) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. AKT 의 인산화 수준을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 5-6 이다.
도 13(D) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. 총 AKT 의 수준을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 5-6 이다.
도 13(E) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 의 인산화 수준을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 5-6 이다.
도 13(F) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 의 총 수준을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 5-6 이다.
도 13(G) 는 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리되고 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. 인산화된 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 대 총 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 의 비를 확인하고 무처리 (시간 0) 로 표준화했다. ERK 의 인산화 상태는 ERK 활성의 직접 검출이고, 상류 신호전달 경로 활성화를 나타낸다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 5-6 이다.
도 14(A) 는 리일린 반복체 인간 서열 R3 및 R5 (hR3+5), 인간 반복체 R3 내지 R6 (hR3-6), 마우스 리일린 반복체 R3 내지 6 (R3-6), 마우스 N 말단 내지 R2 (NR2) 및 전장 서열 및 모든 자연 발생적 단편으로 이루어지는 전장 리일린 (FR) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 블롯이다. 대조군 (ctrl) 은 비-처리된 세포로 이루어졌다. 리일린을 세포 상에서 60 분 동안 인큐베이션하고, 세포를 용해시켰다. 대표적 웨스턴 블롯을 총 및 인산화된 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 에 대해 수행했다.
도 14(B) 는 리일린 반복체 인간 서열 R3 및 R5 (hR3+5), 인간 반복체 R3 내지 R6 (hR3-6), 마우스 리일린 반복체 R3 내지 6 (R3-6), 마우스 N 말단 내지 R2 (NR2) 및 전장 서열 및 모든 자연 발생적 단편으로 이루어지는 전장 리일린 (FR) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. 대조군 (ctrl) 은 비-처리된 세포로 이루어졌다. 리일린을 세포 상에서 60 분 동안 인큐베이션하고, 세포를 용해시켰다. 인산화된 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 의 수준을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 4 이다.
도 14(C) 는 리일린 반복체 인간 서열 R3 및 R5 (hR3+5), 인간 반복체 R3 내지 R6 (hR3-6), 마우스 리일린 반복체 R3 내지 6 (R3-6), 마우스 N 말단 내지 R2 (NR2) 및 전장 서열 및 모든 자연 발생적 단편으로 이루어지는 전장 리일린 (FR) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리된 일차 뉴런 배양물을 보여주는 그래프이다. 대조군 (ctrl) 은 비-처리된 세포로 이루어졌다. 리일린을 세포 상에서 60 분 동안 인큐베이션하고, 세포를 용해시켰다. 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 의 총 수준을 다양한 시점에 측정하고 액틴으로 정규화했다. 모든 그래프는 평균 ± S.E.M. 을 보여준다. 샘플 크기는 4 이다.
도 15 는 전장 리일린을 사용하는 Dab-1 인산화 어세이를 보여주는 그래프이다.
도 16 은 전장 리일린에 대한 노출 후에 시간의 흐름에 따른 Dab-1 인산화를 보여주는 선 그래프이다.
도 17 은 R3-6 리일린 단편을 사용하는 Dab-1 인산화 어세이를 보여주는 그래프이다.
도 18 은 R3-6 리일린 단편에 대한 노출 후에 시간의 흐름에 따른 Dab-1 인산화를 보여주는 선 그래프이다.
도 19 Fc-RAP 에 의한 관류는 해마 LTP 유도를 향상시킨다. 해마 슬라이스를 Fc-RAP (10 ㎍/ml), Fc (10 ㎍/ml), 또는 대조군 배지로 관류시켰다. 기준선 시냅스 응답 (†) 및 HFS 직후의 (‡) 및 HFS 후 60 min 까지의 (□) 강화작용을 기록했다. 화살촉은 20 s 로 분리되는, 2 회 연속의 1-s-길이, 100-Hz 자극으로 유도된 LTP 를 나타낸다. 수평선은 Fc-RAP, Fc, 또는 대조군 배지의 적용을 나타낸다. 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다. fEPSP, 장 흥분성 시냅스후 전위 (Strasser et al 2004).
도 20(A) 는 리일린이 시냅스후 메카니즘을 통해 NMDAR 전류를 향상시키는 것을 보여주는 전기도이다. EPSCNMDA 의 측정의 도해. 선은 무처리, 모의 (mock) 처리, 및 리일린 처리를 나타내며, 리일린 처리가 칼슘 전도도를 통해 NMDA 수용체 기능을 증가시키는 것을 보여준다.
도 20(B) 는 리일린이 시냅스후 메카니즘을 통해 NMDAR 전류를 향상시키는 것을 보여주는 전기도이다. AP5 의 존재 하의 EPSCNMDA 의 측정의 도해. 선은 무처리, 모의 처리, 및 리일린 처리를 나타내며, 리일린 처리가 칼슘 전도도를 통해 NMDA 수용체 기능을 증가시키는 것을 보여준다.
도 21(A) 는 EPSCNMDA 의 측정을 보여주는 그래프이다. 짙은 회색 자취는 mEPSCNMDA 를 나타낸다.
도 21(B) 는 리일린 처리가 mEPSCNMDA 진폭을 유의하게 증가시킨 것을 보여주는 그래프이다 (닫힌 원, 리일린 전; 열린 원, 리일린 후; ***p < 0.001; n = 18; 짝지은 t 시험). 모의에 의한 처리는 효과가 없었다 [닫힌 사각형, 모의 전; 열린 사각형, 모의 후; 유의하지 않음 (ns), p > 0.05; n = 13; 짝지은 t 시험].
도 21(C) 는 세 시점에서 시냅스 전달을 보여주는 그래프이다. 리일린 무처리, 리일린 처리 및 둘을 비교하는 합성 그래프.
도 21(D) 는 1/CV2 비 및 평균 EPSCNMDA 비 (리일린 전/후) 의 상관관계가 없다는 것을 보여주는 그래프이고, 9 개의 세포로부터의 기록에 기초하여 밝혀졌다 (r = 0.31; p = 0.4; 스피어만 시험).
도 22(A) 는 리일린 신호전달이 글루타메이트 수용체 아단위의 표면 발현 및 총 수준을 변경하는 것을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 대표적 블롯은 표면 및 총 GluR1, NR1, NR2A, 및 NR2B 둘 모두의 수준을 보여준다.
도 22(B) 웨스턴 블롯의 4 회 실험으로부터 모은 (pooled) 표면 글루타메이트 수용체 아단위의 정량적 결과. 모의 군과 비교할 때, 만성 리일린 처리 후에 표면 GluR1 및 NR2A 는 둘 모두 유의하게 증가했고 [GluR1, F(2,11) = 15.56, ***P < 0.001; NR2A, F(2,11) = 44.9, ***P < 0.001], 표면 NR2B 의 수준은 유의하게 감소했다 [F(2,11) = 22.6, ***P < 0.001].
도 22(C) 웨스턴 블롯의 4 회 실험으로부터 모은 총 단백질 수준의 정량적 결과. 리일린 처리는 총 GluR1 의 수준을 유의하게 증가시켰고 [F(2,11) = 11.2, **P < 0.01], NR2A [F(2,14) = 9.75, **P < 0.01], 총 NR2B 의 수준을 감소시켰다 [F(2,11) = 4.1, *P < 0.05]. 이와 대조적으로, NR1 의 총 및 표면 (B 에서) 수준 둘 모두 관찰되지 않았다.
도 23(A) 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 그래프이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. WT 뉴런 상의 수지상 가시가 대표적 일차 수지상돌기 (dendrite) 의 확대된 사진에서 보여진다.
도 23(B) 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 이미지이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. 수지상 가시는 WT 마우스와 비교할 때 HRM 에서 감소되지만, 리일린에 의한 처리 후에, 가시 밀도는 구조된다. 수지상 가시는 임의의 이차 수지상돌기를 배제하는 일차 수지상돌기로부터의 임의의 돌출로서 정의되었다. 수지상 가시를 수지상돌기 50 μm 마다 계수하고 측정한다. 모의-처리된 세포 (n=3) 에 비해 리일린-처리된 세포 (n=3) 에서 가시의 유의한 증가가 존재한다.
도 23(C) 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 이미지이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. 수지상 가시는 WT 마우스와 비교할 때 HRM 에서 감소되지만, 리일린에 의한 처리 후에, 가시 밀도는 구조된다. 수지상 가시는 임의의 이차 수지상돌기를 배제하는 일차 수지상돌기로부터의 임의의 돌출로서 정의되었다. 수지상 가시를 수지상돌기 50 μm 마다 계수하고 측정한다. 모의-처리된 세포 (n=3) 에 비해 리일린-처리된 세포 (n=3) 에서 가시의 유의한 증가가 존재한다.
도 23(D) 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 이미지이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. 수지상 가시는 녹아웃 리일린 마우스에서 매우 희박하지만, 리일린에 의한 처리 후에, 가시 밀도 결핍은 구조된다. 수지상 가시는 임의의 이차 수지상돌기를 배제하는 일차 수지상돌기로부터의 임의의 돌출로서 정의되었다. 수지상 가시를 수지상돌기 50 μm 마다 계수하고 측정한다. 모의-처리된 세포 (n=3) 에 비해 리일린-처리된 세포 (n=3) 에서 가시의 유의한 증가가 존재한다.
도 23(E) 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 이미지이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. 수지상 가시는 녹아웃 리일린 마우스에서 매우 희박하지만, 리일린에 의한 처리 후에, 가시 밀도 결핍은 구조된다. 수지상 가시는 임의의 이차 수지상돌기를 배제하는 일차 수지상돌기로부터의 임의의 돌출로서 정의되었다. 수지상 가시를 수지상돌기 50 μm 마다 계수하고 측정한다. 모의-처리된 세포 (n=3) 에 비해 리일린-처리된 세포 (n=3) 에서 가시의 유의한 증가가 존재한다.
도 23(F) 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 이미지이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. 수지상 가시를 공초점 현미경을 사용하여 정량화했다. 수지상 가시는 임의의 이차 수지상돌기를 배제하는 일차 수지상돌기로부터의 임의의 돌출로서 정의되었다. 수지상 가시를 수지상돌기 50 μm 마다 계수하고 측정한다. 모의-처리된 세포 (n=3) 에 비해 리일린-처리된 세포 (n=3) 에서 가시의 유의한 증가가 존재한다.
도 24(A) 는 MMP-9 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 리일린 가공에 영향을 미치는 MMP-9 (활성; Calbiochem, PF140) 의 능력을 리일린 (50 nM) 을 상이한 농도의 MMP-9 (1-4 ug/ml) 와 PBS 중에서 37 ℃ 에서 3 시간 동안 반응시킴으로써 확인했다. EDTA (10 mM) 는 그것이 MMP9 활성을 차단하므로 음성 대조군으로서 포함되었다. 웨스턴 블롯을 1:10 의 반응으로 실행하고, 항-리일린 (G10) 으로 프로브했다.
도 24(B) 는 MMP-9 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 일차 피질 뉴런에서 리일린 가공에 영향을 미치는 MMP-9 (250 nM) 의 능력을 상청액 추출된 단백질에서 24 시간 후에 확인했다. 세포성 단백질 추출물을 웨스턴 분석 및 G10 을 이용한 검출에 적용했다.
도 24(C) 는 MMP-9 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 일차 피질 뉴런에서의 리일린 가공에 영향을 미치는 MMP-9 (250 nM) 의 능력을 상청액 추출된 단백질에서 24 시간 후에 확인했다. 상청액 단백질 추출물을 웨스턴 분석 및 G10 을 이용한 검출에 적용했다.
도 24(D) 는 MMP-9 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 일차 피질 뉴런에서의 리일린 가공에 영향을 미치는 MMP-9 저해인자 (25 nM; Calbiochem 444278) 의 능력을 상청액 추출된 단백질에서 24 시간 후에 확인했다. 세포성 단백질 추출물을 웨스턴 분석 및 G10 을 이용한 검출에 적용했다.
도 24(E) 는 MMP-9 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 일차 피질 뉴런에서의 리일린 가공에 영향을 미치는 MMP-9 저해인자 (25 nM; Calbiochem 444278) 의 능력을 상청액 추출된 단백질에서 24 시간 후에 확인했다. 상청액 단백질 추출물을 웨스턴 분석 및 G10 을 이용한 검출에 적용했다.
도 25 는 수지상 가시 밀도에 대한 리일린 효과를 보여주는 블롯이다. 리일린을 일차 해마 뉴런 배양물에 만성적으로 적용하여 수지상 가시 밀도에 대한 그것의 효과를 검토했다. 배양물 내 리일린 수준을 웨스턴 블롯에 의해 확인했다. 0, 6, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간에 배양물로부터 샘플을 취하여 시험관내 리일린 분해의 수준을 확인했다. 리일린의 마지막 칼럼은 배양물에 투여된 농도에서 선천을 나타낸다. 리일린은 배양물 내로 도입 후 96 시간까지 존재했고, 분해는 72 시간까지 시작하지 않았다.
도 26(A) 는 리일린 보충이 연상 학습 및 공간 학습을 개선할 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다. 공포 조건화를 받기 전 3 시간에 야생형 마우스에게 5 nM RAP 또는 5 nM 리일린을 심실 내에 양측 주사에 의해 제공했다. 훈련 후 24 hrs 에, 마우스를 맥락 내에 배치하고, 얼어붙음 (freezing) 을 측정했다. RAP 는 학습 및 기억을 저해하는 것으로 발견되었으며, 한편 리일린은 향상을 초래했다 (RAP n=9, 충격 없음 n=5, 처리 없음 n=7, 리일린 n=5; p>0.05).
도 26(B) 는 리일린 보충이 연상 학습 및 공간 학습을 개선할 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다. 야생형 마우스를 모리스 수중 미로를 통해 숨겨진 플랫폼을 찾도록 훈련했다. 마우스에게 5 nM 리일린 (적색 원, n=4) 또는 비히클 (열린 원, n=6) 의 단일 주사를 제공했다. 제 5 일에, 프로브 시험을 제공하고, 그 후 제 6 일에 마우스를 새로운 플랫폼 장소를 찾도록 훈련시켰다. 마우스에게 5 nM 리일린 (n=4) 또는 비히클 (n=6) 의 단일 주사를 제공했다.
도 26(C) 는 리일린 보충이 연상 학습 및 공간 학습을 개선할 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다. 야생형 마우스를 모리스 수중 미로를 통해 숨겨진 플랫폼을 찾도록 훈련했다. 마우스에게 5 nM 리일린 (적색 원, n=4) 또는 비히클 (열린 원, n=6) 의 단일 주사를 제공했다. 제 1 일에 개별 시험으로부터의 잠재시간 (latency) 의 조사 (*=p>0.05). 마우스에게 5 nM 리일린 (n=4) 또는 비히클 (n=6) 의 단일 주사를 제공했다.
도 27(A) 는 맥락적 공포 조건화가 리일린 수준을 변경한다는 것을 보여주는 블롯이다. 야생형 마우스를 3-충격, 맥락적 공포 조건화 (contextual fear conditioning) 프로토콜 (CFC) 로 훈련시켰다. 충격받지 않은 마우스 (CS) 를 음성 대조군으로서 사용했고, 충격받은, 맥락-노출된 마우스 (CS/US) 는 훈련 후 1, 5, 15, 30, 및 180 분, 뿐만 아니라 훈련 후 18 시간에 그들의 해마가 제거되었다 (n = 4, 시점). 리일린은 항-리일린 (G10) 을 사용하여 해마 균질액에서 검출되었다.
도 27(B) 는 맥락적 공포 조건화가 리일린 수준을 변경한다는 것을 보여주는 그래프이다. 야생형 마우스를 3-충격, 맥락적 공포 조건화 프로토콜 (CFC) 로 훈련시켰다. 충격받지 않은 마우스 (CS) 를 음성 대조군으로서 사용했고, 충격받은, 맥락-노출된 마우스 (CS/US) 는 훈련 후 1, 5, 15, 30, 및 180 분, 뿐만 아니라 훈련 후 18 시간에 그들의 해마가 제거되었다 (n = 4, 시점). 전장 리일린의 리일린 수준을 정량화했다. 별표는 양쪽-꼬리 t-시험 후의 통계적 유의성을 나타내며, p < 0.5 이다.
도 28(A) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 블롯이다. 14-개월령 야생형, Tg2576 (SweAPP), PS1-FAD (M146L), 및 2X (SweAPP x M146L) 로부터의 단리된 피질의 웨스턴 블롯을 분석에 적용했다 (n = 4). 야생형에 비해 Tg2576 에서 리일린 450, 190 및 180 kDa 생성물에서 유의한 차이가 검출되지 않았으나, Tg2576 및 2X 마우스에서 G10 에 의해 인지되는 미확인 N-말단 종이 유의하게 상승되었다. 이와 대조적으로, PS1-FAD 및 2X 마우스에서 리일린 450 및 180 kDa 생성물은 유의하게 상승되었다 (p < 0.05).
도 28(B) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 블롯이다. 14-개월령 야생형, PS1-FAD (M146L), 및 2X (SweAPP x M146L) 로부터의 단리된 피질의 웨스턴 블롯을 분석에 적용했다 (n = 4). Tg2576 마우스에서 Dab1-pTyr220 의 유의한 감소, 및 PS1-FAD 및 2X 마우스 둘 모두에서 유의한 상승이 존재했다.
도 28(C) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 그래프이다. 자극 전에 리일린 (5 nM) 의 적용은 Tg2576 마우스의 부위 CA1 에서 HFS-자극된 LTP 의 결핍을 구조할 수 있다.
도 29(A) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 이미지이다. 생체내 리일린 가공을 매핑하기 위한 3-에피토프 전략을 14-개월령 Tg2576 수평 절편에 대해 이용했다. 리일린-CT (G20) 는 R7-8 을 함유하는 리일린 단편을 검출했고, 6E10 (항-Aβ) 로 탐지된 밀집한-코어 플라크의 코어에서 격리되었다.
도 29(B) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 이미지이다. 생체내 리일린 가공을 매핑하기 위한 3-에피토프 전략을 14-개월령 Tg2576 수평 절편에 대해 이용했다. 리일린-NT 는 N-R2 를 함유하는 리일린 단편을 검출했고, 6E10 (항-Aβ) 로 탐지된 밀집한-코어 플라크의 코어에서 격리되었다.
도 29(C) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 이미지이다. 생체내 리일린 가공을 매핑하기 위한 3-에피토프 전략을 14-개월령 Tg2576 수평 절편에 대해 이용했다. 리일린-MT (AF3820) 는 R3-6 을 함유하는 리일린 단편을 검출했고, 6E10 (항-Aβ) 로 탐지된 밀집한-코어 플라크의 코어에서 격리되었다.
도 29(D) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 이미지이다. 리일린-CT (G20) 및 -MT (AF3820) 에 관한 14-개월령 Tg2576 수평 절편의 면역형광 이미지를 조합하고, 6E10 (항-Aβ) 로 탐지된 밀집한-코어 플라크의 코어에서 격리되었다.
도 29(E) 는 리일린 신호전달이 AD 마우스 모델에서 변경된다는 것을 보여주는 이미지이다. 14-개월령 Tg2576 의 확대된 면역형광 이미지는 tg2576 마우스 모델에서 리일린-NT 단편 (N-R2) 이 플라크 코어를 둘러싸는 것을 보여준다. 축척 막대 = 15 μm.
도 30 표준 2-연속, 100Hz HFS 를 사용하는 LTP 유도를 12-개월령 Tg2576 마우스로부터의 해마 슬라이스에 실시했다. 한 세트의 슬라이스를 5 nM 리일린으로 관류시켰다. 리일린 처리된 슬라이스는 야생형 수준에 비해 LTP 유도의 증가를 보였다.
도 31 은 리일린에 의한 처리가 만성 TBI 에서 기능적 회복을 발휘한다는 것을 보여주는 그래프이다. 상승된 몸체 흔들림 시험 (elevated body swing test) 은 피질 충격기에 의한 외상성 뇌 손상 후 기준선에 대한 흔들림 치우침 (swing bias) 을 나타내며, 이는 리일린으로 완화된다.
도 32 는 리일린에 의한 처리가 만성 TBI 에서 기능적 회복을 발휘한다는 것을 보여주는 그래프이다. 다리 운동불능은 피질 충격기에 의한 외상성 뇌 손상 후 기준선에 대한 자발적 다리의 손실을 나타내며, 이는 리일린으로 완화된다.
도 33 은 리일린에 의한 처리가 만성 TBI 에서 기능적 회복을 발휘한다는 것을 보여주는 그래프이다. 발 움켜잡음은 피질 충격기에 의한 외상성 뇌 손상 후 기준선에 대한 다리 강도의 손실을 나타낸다.
도 34 는 SA2 및 SA3 에서 사용된 일부 구축물 및 리일린 절단의 자리의 도해이다. MMP-9 는 영역 2 와 3 사이에서 절단할 수 있으나, 또한 오직 시험관내 반응 동안 영역 7 에서 절단하는 것으로 밝혀졌다. tPA 는 영역 6 과 7 사이에서 절단할 수 있다. 제안된 구축물은 C 및 N 말단 표지 둘 모두를 포함하고 시험관내 MMP-9 결합 자리를 포함하지 않도록 제조된다. Rln-Res = 리일린 절단 저항성; Rln-Lab = 리일린 불안정성.
도 35(A) 는 tPA 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 리일린 가공에 영향을 미치는 tPA/플라스미노겐의 능력을 리일린 (50 nM) 을 tPA (60 ug/ml), 불활성 플라스미노겐 (18 ug/ml), tPA 및 플라스미노겐, 및 플라스민 (활성, 0.5 U/ml) 과 PBS 중에서 45 분 동안 37℃ 에서 반응시켜 확인했다. 반응을 웨스턴 (1:10 에서) 으로 수행하고, 항-리일린 (G10, N-R2 인지 항체) 및 항-리일린 (Ab14, R7-8 인지 항체) 으로 프로브했다.
도 35(B) 는 tPA 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 일차 피질 뉴런에서의 리일린 대사에 영향을 미치는 tPA 의 능력을 세포를 신선한 상청액에서 24 시간 동안 70 nM tPA 와 함께 인큐베이션하여 확인했다. 세포성 단백질 추출물을 웨스턴 분석 및 G10 을 이용한 검출에 적용했다.
도 35(C) 는 tPA 가 리일린 가공을 조정하는 것을 보여주는 블롯이다. 일차 피질 뉴런에서의 리일린 대사에 영향을 미치는 tPA 의 능력을 세포를 신선한 상청액에서 24 시간 동안 70 nM tPA 와 함께 인큐베이션하여 확인했다. 상청액 단백질 추출물을 웨스턴 분석 및 G10 을 이용한 검출에 적용했다.
도 36(A) 는 트리-에피토프 매핑의 도해이다. 리일린은 N-말단 영역 및 그에 뒤이은 CR-50 정전기적 도메인 (밝은 회색), F-스폰딘 도메인 (H), 및 8 개의 구성적 EGF-유사 반복체로 이루어진다. 다양한 항체가 보여지며, 각각의 항체에 관한 리일린 구조의 에피토프 영역을 나타낸다.
도 36(B) 는 트리-에피토프 매핑의 도해이다. 리일린의 N-R2, R3-R6, 및 R7-R8 영역을 구별되게 인지하는 항체를 사용하여 전장 리일린 및 그것의 주요 단편의 분포를 확인할 수 있다.
도 37 은 리일린 및 ApoER2 발현에 대한 RAP 의 효과를 보여주는 그래프이다. 감소된 ApoER2 발현은 해마, 전액골 피질, 및 두정 피질에서의 GST-RAP (모든 지질단백질 수용체에 결합하는, 수용체 연합된 단백질) 적용과 연결된다.
도 38(A) 는 일차 뉴런 배양물에서 hR3-6 의 적용이 ApoEr2 발현을 증가시킨다는 것을 보여주는 블롯이다. 뉴런 (E17, DIV8) 은 hR3-6 으로 1hr 동안 처리되고 ApoEr2 를 인지하는 항체3326 로 프로브되었다. N=3-4.
도 38(B) 는 일차 뉴런 배양물에서 hR3-6 의 적용이 ApoEr2 발현을 증가시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. ApoEr2 수준을 액틴으로 정규화하고 웨스턴 블롯으로부터 정량화했다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
본원에서 사용되는, 단수형 "하나", "한" 및 "그" 는 문맥이 명백히 다르게 지시하지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드" 의 언급은 둘 이상의 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 등이다.
본원에서 사용되는, "약" 은 대략 또는 거의를 의미하고, 제시된 수치 값 또는 범위의 맥락에서 수치의 ±15% 를 의미한다.
본원에서 사용되는, "투여" 또는 "투여하는" 은 본 발명의 화합물이, 단독으로 또는 다른 화합물과의 조합으로, 환자에게 전달되는 과정을 기재하는데 사용된다. 조성물은 특히 경구, 비경구 (정맥내 및 동맥내 및 다른 적당한 비경구 경로를 언급함), 수막공간내, 근육내, 피하, 결장으로, 직장으로, 및 비강으로를 포함하는 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 이들 병태 각각은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 본 발명의 화합물의 다른 투여 경로를 사용하여 쉽게 치료될 수 있다. 치료적 또는 예방적 효과를 얻기 위한 본 발명의 화합물 및 조성물의 용량은 기술분야에 알려진 환자의 상황에 의해 결정된다. 본원에서의 환자의 용량은 본원에서의 화합물 또는 조성물의 개별 또는 단위 용량을 통해 또는 화합물 또는 조성물의 조합된 또는 예비포장된 또는 예비-제형화된 용량에 의해 달성될 수 있다. 평균 40 g 마우스는 뇌 무게 0.416 g 을 갖고, 160 g 마우스는 뇌 무게 1.02 g 을 갖고, 250 g 마우스는 뇌 무게 1.802 g 을 갖는다. 평균 인간 뇌는 무게가 1508 g 이고, 이는 본원에 기재된 치료를 달성하는데 필요한 또는 유용한 치료제의 양을 지시하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 알려진 방법에 따라 제형화될 수 있다. 게다가, 본원에서 사용되는, 구절 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 임의의 표준 약학적으로 허용가능한 담체를 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 희석제, 아주반트, 및 비히클, 뿐만 아니라 이식 담체, 및 불활성, 비-독성 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 또는 캡슐화 재료 (이는 본 발명의 활성 성분과 반응하지 않음) 를 포함할 수 있다. 예는 인산 완충 식염수, 생리 식염수, 물, 및 에멀전, 예컨대 오일/물 에멀전을 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 담체는, 예를 들어, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 제형은 당업자에게 잘 알려져 있고 쉽게 입수가능한 다수의 출처에 기재되어 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.) 는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 제형을 기재한다.
본원에서 사용되는 "동물" 은 동물계 또는 후생동물아계에 분류되는 다세포성, 진행 유기체를 의미한다. 그 용어는 포유류를 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 비-제한적 예는 설치류, 수생 포유류, 가정용 동물 예컨대 개 및 고양이, 농장 동물 예컨대 양, 돼지, 소 및 말, 및 인간을 포함한다. 용어 "동물" 또는 "포유류" 또는 그들의 복수형이 사용되는 경우에, 그것이 또한 임의의 동물에 적용되는 것이 고려된다.
본원에서 사용되는 구절 "보존적 치환" 은 유사한 특성 (예를 들어 산성, 염기성, 양으로 또는 음으로 하전된, 극성 또는 비-극성) 을 갖는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 언급한다. 하기 표 1 은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다.
표 1 은 보존적 치환의 지표인, 기능적 기 카테고리에 기초하는, 아미노산을 보여준다. 각각의 아미노산을 인코딩하는 중복성 삼중 부호가 참조로 제시되어 있다.
Figure 112019021510205-pct00001
본원에서 사용되는 "보존적 돌연변이" 는 아미노산에 관한 인코딩에서 변경을 초래하지 않는 것으로의 뉴클레오티드의 치환, 즉 축퇴성 코돈에서 중복성 서열로의 변화, 또는 보존적 치환을 초래하는 치환을 언급한다. 코돈 중복성의 예가 표 2 에 제시되어 있다.
표 2 는 중복성 삼중 부호 및 상응하는 인코딩되는 아미노산을 나타낸다.
Figure 112019021510205-pct00002
따라서, 코돈 UUA 에 대한 보존적 돌연변이는 UUG, CUU, CUC, CUA, 및 CUG 를 포함한다.
본원에서 사용되는 구절 "리일린의 단편 반복체로부터 형성된 구축물" 은 리일린의 반복체 영역을 조합하여 수득되는 단편으로부터 생성되는 인공 단백질을 언급한다. 본 명세서에서 언급되는, 전장 리일린은 반복체로 명명되는 DNA 또는 아미노산 (단백질의 경우) 의 영역, 예컨대 도 3 및 단락 [0061] 의 아미노산 서열에 제시된 영역 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8 로 구성된다. 루프 영역이 이들 반복체 영역 사이에 위치하며, 두 개의 반복체 영역을 연결하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 "루프 영역" 은 RNA 루프 구조에 상응하고, 두 개의 반복체 영역 사이에 배치되고, 두 개의 반복체 영역을 연결하는 리일린 핵산 서열의 분절을 의미한다. 용어 "반복체 영역" 은 근본적 반복 단위를 형성하는 리일린 핵산 서열의 분절을 의미한다. 특정 "반복체 영역" 이 명세서 전체에서 개시된다. 특정 구현예에서, "루프 영역" 은 상보적 영역 사이의 단일 가닥 뉴클레오티드 영역은 두가닥 형성 또는 완슨-크릭 염기 쌍형성으로부터 배제되게 하는 방식으로, 특정 단일 가닥 뉴클레오티드 영역의 측면에 있는 상보적 영역을 갖는 핵산의 단일 가닥에 의해 형성되는 구조이다.
본원에서 사용되는 용어 "환자" 는 동물, 특히 포유류, 더욱 특히 치료를 받고 있는 또는 받을 것이 의도되는 인간을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량" 은 연구자, 수의사, 의사, 또는 다른 임상의에 의해 추구되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 유발하는 활성 화합물 또는 약학적 제제의 양을 의미한다. 신경변성 질환 또는 신경 발작의 언급에서, 유효량은 추가의 뉴런 변성 또는 손상을 방지하거나, 신경변성 질환 또는 신경 발작의 증상을 감소시키거나, 또는 수지상돌기 밀도를 개선하기에 충분한 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 유효량은 신경변성 질환의 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 유효량은 신경변성 질환의 발생 및/또는 재발을 방지하거나 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 필요 또는 유효량은 리일린 대사의 개체 속도에 따라 2 이상의 주로 분리되는 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는, "교정 (correcting)" 은 근원적인 신경변성 질환 또는 손상의 해결을 언급한다. 예를 들어, 알츠하이머병의 교정은 뉴런 사망의 중단을 언급한다.
본원에서 사용되는, "치료" 또는 "치료하는" 은 유익한 또는 요망되는 임상 결과를 수득하는 것을 언급한다. 유익한 또는 요망되는 임상 결과는 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하나, 그에 제한되지 않는다: 하나 이상의 증상의 완화, 신경변성 질환 또는 신경 발작으로부터의 손상의 정도의 감소, 신경변성 질환 또는 신경 발작의 상태의 안정화 (즉, 악화하지 않음), 신경변성 질환 또는 신경 발작의 발생 또는 재발의 방지 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 둔화 및 질환 상태의 개선. 본 발명의 방법은 이들 치료 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
본원에서 사용되는, "뉴런 발작" 은 일부 외부 조건 또는 조건들로부터 초래되는 돌연한 물리적 손상에 의해 생성되는 신경 조직 손상을 의미한다. 그러한 외부 조건의 비제한적 예는 조건 폭행 또는 사고, 골절, 강타, 또는 수술 절차를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한" 성분은 타당한 위험/유익 비에 상응하는 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극, 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물에게 사용하기에 적합한 것이다.
본원에서 사용되는, "안전한 유효량" 은 본 발명의 방식으로 사용될 때 타당한 위험/유익 비에 상응하는 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극, 및 알레르기 반응) 없이 요망되는 치료적 응답을 산출하기에 충분한 성분의 양을 언급한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 문제의 화합물 또는 화합물을 동물 또는 인간에게 전달하기 위한 담체, 예컨대 용매, 현탁화제 또는 비히클이다. 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 고려되는 계획된 투여 방식에 따라 선택된다. 본원에서 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체" 는 임의의 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅, 희석제, 항세균 및 항진균제, 등장화 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 제제의 사용은 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료적 조성물에서의 그것의 사용이 고려된다.
본 발명의 화합물은 약학적 조성물로서 제형화되고 환자, 예컨대 인간 환자에게, 선택된 투여 경로, 예를 들어, 경구 또는 복강내, 예컨대 정맥내 또는 동맥내, 또는 대뇌내 경로에 적합한 다양한 형태로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 또한 대뇌내 또는 복강내, 예컨대 정맥내 또는 동맥내, 주입 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 그것의 염의 용액은, 임의로 비독성 계면활성제와 혼합된, 물 또는 다른 적합한 용매 중에, 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴, 및 그들의 혼합물 중에 및 오일 중에 제조될 수 있다. 일상적 저장 및 사용의 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다.
주사 또는 주입에 적합한 약학적 투여 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산물 또는 멸균 주사가능한 또는 주입가능한 용액 또는 분산물의 즉석 제조에 적합한 활성 성분을 포함하는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 궁극적 투여 형태는 제조 및 저장 조건 하에 멸균, 유체 및 안정적이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 식물유, 비독성 글리세릴 에스테르, 및 그들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산매일 수 있다. 분산물의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 또는 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 완충제 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴의 사용에 의해 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 활성 화합물을 요구되는 양으로 적당한 용매 중에 위에서 열거된 여러 다른 성분과 함께 혼입시키고, 그에 뒤이어 필터 멸균하여 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 사전 멸균-여과된 용액을 제시하는 활성 성분 및 임의의 부가적 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 얼어붙음 건조 기술이다.
유용한 고체 담체는 미분 고체 예컨대 탈크, 클레이, 미세결정질 셀룰로오스, 실리카, 알루미나 등을 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 알코올 또는 글리콜 또는 물-알코올/글리콜 블렌드를 포함하며, 여기에 본 발명의 화합물이, 임의로 비-독성 계면활성제의 도움으로, 유효 수준으로 용해 또는 분산될 수 있다.
본 발명의 화합물의 유용한 투여량은 그들의 시험관내 활성, 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스, 및 다른 동물에서의 유효 투여량을, 인간에게 외삽하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다 (미국 특허 제 4,938,949 호 (Borch et al.)).
따라서, 본 발명은, 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 또는 함유하지 않는, 위에서 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 신경변성 질환 또는 신경 발작을 치료하는데 유효한 양의 하나 이상의 화합물을 포함하는, 심실내, 대뇌내, 또는 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 본 발명의 바람직한 구현예이다.
실시예 1
반복체의 특정 영역을 확인하기 위해 리일린의 전장, 인간 서열 (Gene ID: 5649, Nat'l Center for Biotechnology Information, U.S. Nat'l Library of Medicine, Bethesda, MD; Human Gene Nomenclature Committee, Cambridgeshire, UK, HGNC:HGNC:9957) 을 사용하여 재조합 리일린 단편을 형성했다. 단편은 상업적으로 생산되었고, 구축물 구축 및 단백질 생산 전에, 도착시 서열분석되었다.
전장, 인간 리일린 (SEQ ID No. 1)
Figure 112019021510205-pct00003
Figure 112019021510205-pct00004
Figure 112019021510205-pct00005
Figure 112019021510205-pct00006
Figure 112019021510205-pct00007
Figure 112019021510205-pct00008
리일린 반복체 영역 및 일부 효소 절단 자리를 포함하는, 서열 맵이, 도 5 에 나타나 있다.
HEK293 세포를 pCrl 벡터 내 전장 리일린 유전자로 안정적으로 트랜스펙션하여 재조합 리일린의 형성을 위한 단편을 생성했다. 전장 리일린을 이전에 기재된 바와 같이 HEK293 세포 내에 삽입했다 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol. Chem. 2002;277:39944-39952; Sinagra, et al., Reelin, very-low-density lipoprotein receptor, and apolipoprotein E receptor 2 control somatic NMDA receptor composition during hippocampal maturation in vitro. J. Neurosci. 2005;25:6127-6136). 컨플루언트 (confluent) 되면, 세포를 0.2% 소 혈청 알부민을 함유하는 저-글루코스 둘베코 변형 이글 배지에서 2 일 동안 성장시키고, 그에 뒤이어 배지 수집, 멸균 여과, 및 Centricon Plus-80 원심분리 필터 유닛 (Millipore) 에 의한 농축을 수행했다. 리일린을 두 개의 자리에서 세포외 절단하여, 세 개의 주요 단편의 생성을 초래했다: N-말단 내지 반복체 2 (대략 180 kDa), 반복체 3-6 으로부터의 중심 단편 (대략 190 kDa), 및 반복체 7 및 8 로 이루어지는 C-말단 단편 (대략 80 kDa) (Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997;94: 8196-820; de Rouvroit, et al., (1999) Reelin, the extracellular matrix protein decient in reeler mutant mice, is processed by a metalloproteinase. Exp. Neurol. 1999;156:214-217; Utsunomiya-Tate, et al., Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inhibited by the function-blocking CR-50 antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97: 9729-9734; Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004;24:514-521; Jossin, et al., Processing of Reelin by embryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J. Neurosci. 2007;27:4243-4252; Koie, et al., Cleavage within Reelin repeat 3 regulates the duration and range of the signaling activity of Reelin protein. J. Biol. Chem. 2014;289:12922-12930; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5, and their modulators. PLoS One. 2012;7:e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014;274:299-307). 부가적으로, 두 개의 중간체 단편을 생산한다: N-말단 내지 반복체 6 으로 이루어지는 하나 (대략 370 kDa), 및 반복체 6-8 로 이루어지는 하나 (대략 270 kDa) (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004;24:514-521).
전장 리일린의 절단을, 위에 논의된 바와 같이, 수행하여 점착성 말단을 형성했다. 재조합 리일린을 위해, 특정 리일린 반복체를 나타내는 DNA 서열을 결찰시켜 둘 이상의 리일린 단편을 생성했다. 결과적인 리일린 반복체 영역을 또한 서열분석하여 코딩 영역이 유지되고 해독 틀이 올바른 배향으로 있는지를 확인했다. 리일린 재조합 단백질을 표준 기술을 사용하여 생산하고, 블루스크립트 홀딩 벡터 내에서 증폭시켰다. 재조합 DNA 를 발현 벡터 내로 클로닝하고, HEK293 세포 배양물에서 발현시켰다.
리일린 반복체 3 (SEQ ID No. 2)
Figure 112019021510205-pct00009
리일린 반복체 4 (SEQ ID No. 3)
Figure 112019021510205-pct00010
리일린 반복체 5 (SEQ ID No. 4)
Figure 112019021510205-pct00011
리일린 반복체 6 (SEQ ID No. 5)
Figure 112019021510205-pct00012
리일린 반복체 루프 영역 3-4 (SEQ ID No. 6)
Figure 112019021510205-pct00013
리일린 반복체 루프 영역 4-5 (SEQ ID No. 7)
Figure 112019021510205-pct00014
리일린 반복체 루프 영역 5-6 (SEQ ID No. 8)
Figure 112019021510205-pct00015
재조합, 인간 리일린 유전자 구축물, R6 단편에 접합된 R3 단편, 즉 리일린 단편 R3 + R6 (SEQ ID No. 9)
Figure 112019021510205-pct00016
재조합, 인간 리일린 단백질, R6 단편에 접합된 R3 단편, 즉 리일린 단백질 단편 R3 + R6 (SEQ ID No. 10)
Figure 112019021510205-pct00017
* 위의 DNA 서열에서 코딩 영역은 색이 있고, 순백색 영역 (글꼴 변경 예컨대 밑줄, 기울림꼴이 없음) 은 단백질로 번역되지 않는다.
재조합, 인간 리일린 유전자 구축물, R5 단편에 접합된 R3 단편, 즉 리일린 단편 R3 + R5 (SEQ ID No. 11)
Figure 112019021510205-pct00018
재조합, 인간 리일린 단백질, R5 단편에 접합된 R3 단편, 즉 리일린 단백질 단편 R3 + R5 (SEQ ID No. 12)
Figure 112019021510205-pct00019
* 위의 DNA 서열에서 코딩 영역은 색이 있고, 순백색 영역 (글꼴 변경 예컨대 밑줄, 기울림꼴이 없음) 은 단백질로 번역되지 않는다.
실시예 2
리일린으로부터의 반복체 영역을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 단리했다. R3 영역을 절제하여 DNA 의 점착성 말단을 제공했다. 리일린 유전자를 EcoRI 및 BatXI 와 함께 인큐베이션하고, 대략 6300 bp 의 분절의 절제를 초래했다. 절제된 R3 단편을 그 후 AAV-9 또는 AAV-5 바이러스 벡터 내에 삽입했다. pMDLg/pPRE 또는 pAD3000 와 같이 벡터가 CMV 프로모터를 보유하는 경우에, 바이러스 벡터를 CMV 프로모터 후에 절단했다. 그러나, pAdEasy-1 와 같이, 트랜스펙션시에 CMV 프로모터가 벡터에 배치되지 않는 경우에, 프로모터를 리일린 단편과 함께 첨가했다. EcoRI 및 BatXI 에 대한 상보적 말단을 갖는 구축물을 형성하며, 구축물은 리일린 단편 및 CMV 프로모터를 함유한다. 구축물을 효소, 예컨대 리가아제 중 벡터와 함께 인큐베이션하여, 리일린 단편 및 CMV 프로모터를 함유하는 새로운 벡터를 형성한다. 리일린 단편을 함유하는 바이러스의 생성을 위해 벡터를 세포 내에 삽입했다.
상기 실시예는 리일린 R3 을 논의했지만, 방법을 실시예 1 에 기재된 단편 R3-5, 단편 R3+5, 및 단편 R3+6 을 포함하는 다른 리일린 변이체에 사용했다.
실시예 3
리일린 단편을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 형성했다. 단편 R3-R6, R3+R5, 및 R3+R6 을 포함하는, 리일린의 상이한 변이형을 루시페라아제 어세이에서 리포터로서 ApoER2 를 사용하여 조사했다. 그러나, 다른 대안적 스플라이싱 변이체, 예컨대 R2 (NR2), R6 (NR6), R3-C 및 R7-C 가 또한 본 발명의 유용한 양태로 여겨진다.
루시페라아제 어세이를 수행하여, 도 6 에 제시된 바와 같이, 수용체가 클러스터화할 때의 빛 방출 증가를 통해 ApoER2 수용체 클러스터링을 확인했다. 루시페라아제 기질을 루시페라아제 완충제 (1:1) 및 첫번째 세트의 ApoER2 수용체 단백질에 접합된 N-말단 루시페라아제 및 두번째 세트의 ApoER2 수용체 단백질에 접합된 C-말단 루시페라아제에 용해시켰다. 루시페라아제-접합된 ApoER2 를 각각의 어세이 플레이트에 1:1 비로 첨가했다 (즉, 50 μL C-말단 루시페라아제를 50 μL N-말단 루시페라아제에 첨가했다). 도 3, 7-9 에 제시된, 인간 리일린의 상이한 변이형을 리포터로서 ApoER2 를 사용하여 조사했다. 5 nM 의 시험 리일린의 첨가 후에, 믹스를 10 min 동안 진탕시키고, 빛 생성을 검출했다.
R5-6 을 제외한, 모든 마우스 리일린 단편이, 빛 방출에서 2-배 내지 4-배 증가를 초래했으며, 이는 도 10 에서 보여진다. 인간 리일린 단편의 사용은 방출 신호를 증가시켰으며, 대부분이 대조군에 비해 2.5-배 내지 3-배 증가를 보였으며, 이는 도 11 에서 보여진다. 또한, 대부분의 인간 리일린 단편의 활성은 도 10 으로부터의 가장 효과적인 리일린과 비슷했으며, 인간 R3-5, 인간 R3-4, 및 인간 R3+R6 은 R3-6 과 대략 동일하거나 또는 더 높은 루시페라아제 활성을 나타냈다. 인간 R3+R5 는 R3-6 의 활성의 약 50%, 또는 도 10 에서 보여지는 R3+R6, R3+R5, 및 R4+R6 과 비슷한 활성을 나타냈다. 도 12 에서 보여지는 바와 같이, 마우스 및 인간 단편은 둘 모두 수용체 클러스터링을 유도하는데 효과적이었으며, 이는 루시페라아제 신호전달의 증가에 의해 입증된다.
실시예 4
ApoER 수용체의 활성화를 시험하여 리일린 세포 신호전달 및 가공의 효과를 분석했다. 최근의 연구는 정상적 학습 및 기억에서 리일린 신호전달의 중요성 (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277:39944-39952), 뿐만 아니라 이러한 신호전달이 동요되는 병리학적 경우를 강조했다. 예를 들어, 지질단백질 수용체는 인지 과정에서 일정한 역할을 하고, 알츠하이머병 (AD) 의 진행의 기저를 이루는 병리학적 과정에서 이러한 수용체 패밀리가 연루되는 것이 시사되었다. 이들 수용체에 대한 주요 리간드 중 두 가지, apoE 및 리일린은 시냅스 기능에 유의하게 영향을 미칠 수 있는 신호전달 능력을 갖는 것으로 보인다. APC 는 현재 리일린 신호전달의 후보 조정인자이며, 이는 그것이 ApoER2 에 결합하는 구조적 부분을 갖고 하류 효과기를 활성화시키는 것으로 보이기 때문이다. 리일린 신호전달의 APC 조정을 시험하는 것은 엄청난 과학적 및 임상적 관련성을 가지며, 이는 그것이 신규한 치료적 방안을 초래할 수 있기 때문이다.
ApoER 수용체 활성화 및 신호전달 경로에 대한 리일린의 효과를 분석했다. 일차 뉴런 배양물을 제 17 배아일 (embryonic day) 마우스로부터 제조하고, B27 (Gibco BRL) 및 l-글루타민이 보충된 무혈청 Neurobasal 배지 (Gibco BRL) 에서 37℃ 에서 5% CO2 중에서 성장시켰다. 세포를 배양물에서 8 일 동안 성숙하게 두었다. 배양물을 반복체 3-6 (R3-6) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리했다. 세포를 리일린 처리 후 특정 시점 (0, 10, 30, 60, 120 또는 240 분) 에 용해시켰다. 총 ApoER2 발현, AKT, AKT 의 인산화, 인산화된 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 및 총 세포외 조절되는 키나아제 (ERK) 에 관한 웨스턴을 측정하고, 무처리 (시간 0) 로 표준화시켰다. ERK 의 인산화 상태는 ERK 활성의 직접 검출이고, 상류 신호전달 경로 활성화를 나타낸다.
도 13(A) 에서 보여지는, 대표적 웨스턴 블롯은 상대적으로 안정적인 ApoER2 발현을 보여준다. 액틴으로 정규화되었을 때, ApoER2 발현은 리일린 노출 후 첫번째 30 분 동안 하락하며, 그에 뒤이어 발현 수준이 안정화되는 것이 발견되었으며, 이는 도 13(B) 에서 보여진다. AKT 수준은 리일린 노출 후 60 분에 걸쳐 하락했으며, 한편 인산화된 AKT 는 증가했으며, 이는 도 13(A) 에서 보여진다. 액틴으로의 AKT 및 pAKT 의 정규화는 블롯 경향을 반영했으며, AKT 수준은 리일린 노출 후 60 분까지 하락했으며, 그에 뒤이어 노출 전 수준으로 다시 증가했으며, 이는 도 13(D) 에서 보여진다. 인산화된 AKT 는 노출 후 60 분까지 극적으로 증가했으며, 그 후 노출전 수준으로 신속히 하락했으며, 이는 도 13(C) 에서 보여진다. 총 ERK 는 실험을 통해 일정한 것으로 보였으며, 한편 인산화된 ERK 1 및 2 는 리일린 노출 후 10 분 및 240 분에 보였으며, 이는 도 13(A) 에서 보여진다. 액틴으로의 ERK 및 pERK1/2 의 정규화는 블롯 경향과 일치했으며, 리일린 노출 후 10 분에 강한 인산화를 보이며, 리일린 후 240 분에 약간의 이차 증가가 있으며, 이는 도 13(E) 및 (F) 에서 보여진다. pERK 대 총 ERK 의 비는 리일린 후 10 분에 피크를 이루는 것으로 발견되었으며, 이는 그 후 리일린 후 120 분까지 서서히 하락했고, 그 후 약간 증가했으며, 이는 도 13(G) 에서 보여진다.
결과가 사용된 리일린 단편 (R3-6) 에 특정하지 않았다는 것을 확인하기 위해서, 일차 뉴런 배양물 실험을 다른 리일린 단편으로 반복했으며, 이는 도 14(A) 에서 보여진다. 일차 뉴런 배양물을 리일린 반복체 인간 서열 R3 및 R5 (hR3+5), 인간 반복체 R3 및 R6 (hR3+6), 마우스 리일린 반복체 R3 내지 6 (R3-6), 마우스 N 말단 내지 반복체 R2 (NR2) 및 전장 서열 및 모든 자연 발생적 단편으로 이루어지는 전장 리일린 (FR) 을 나타내는 200 μM 정제된 리일린 단편으로 처리했다. 대조군 (ctrl) 은 비-처리된 세포로 이루어졌다. 리일린을 세포 상에서 60 분 동안 인큐베이션했다. 세포를 용해시키고, 웨스턴 블롯을 위에서 총 ERK 및 인산화된 ERK 에 관해 기재된 바와 같이 수행했다.
도 14(A) 에서 보이는, 대표적 웨스턴 블롯은 리일린 처리가 총 ERK 수준에 대해 분간할 수 있는 영향을 갖지 않는다는 것을 보여줬다. 실제로, 액틴으로의 결과의 정규화는 인간 리일린 재조합 단편 (hR3+5 및 hR3+6) 이 전장 리일린이 그랬던 것처럼 총 ERK 수준에서 약간의 하락을 초래한 것을 보여줬으며, 이는 도 14(C) 에서 보여지며, 한편 마우스 단편 (R3-6 및 NR2) 은 총 ERK 에서 약간의 증가를 보였다. 그러나, 인간 리일린 재조합 단편 (hR3+5 및 hR3+6) 은, 전장 리일린 처리와 유사하게, 인산화된 ERK1/2 에서 강한 증가를 초래했으며, 이는 도 14(B) 에서 보여진다. 반복체 3-6 으로 형성되는 마우스 리일린 단편 (R3-6) 은 인산화된 ERK 에서 약간의 증가를 보였으며, 이는 대조군과 겹쳐진다. 이와 대조적으로, 마우스 N-말단 단편 (NR2) 은 인산화된 ERK 에서 하락을 보였다. 인산화된 ERK 대 총 ERK 의 수준의 비교는 마우스 단편 R3-6 이 총 ERK 와 대략 대등한 인산화를 보였다는 것을 보여줬으며 (R3-6 의 경우 1.15), 이는 도 13(G) 에서 보여지는 결과를 확증해준다. 모의 처리를 한 대조군 배양물은 1.09 의 비를 갖는다. 마우스 N-말단 단편은 ERK 의 인산화를 유발하지 않았으며, 수준은 대조군의 약 50% (0.53) 였다. 인간 리일린 단편 (R3+5 및 R3+6) 은 ERK 의 인산화 (각각, 2.22 및 2) 를 초래했으며, 이는 전장 리일린 (2.5) 과 유사했다. 이들 결과는 ApoER2 신호전달에 대해 인간 리일린 단편이 마우스 단편보다 더 강한 효과를 나타내고, 치료에서 더욱 효과적일 것이라는 것을 보여준다.
실시예 5
리일린 경로 단백질 개질에 관해 시험하여 세포성 경로에 대한 리일린의 효과를 분석했다. 리일린 단편 보체에서의 변화는 하류 리일린 신호전달에서의 변경과 상관관계가 있는 것으로 보이며, 이는 주요 하류 성분, Dab-1 의 인산화에 의해 시사된다.
DAB-1 의 인산화를 VLDLR 및 ApoEr 에 접합된 DAB-1 리포터를 사용하여 분석했다. 일차 뉴런 배양물을 위에 논의된 바와 같이 제 17 배아일 마우스로부터 제조했다. 세포를 배양물에서 8 일 동안 성숙하게 두었다. 50 μL 또는 100 μL 의 폴리-L-라이신을 각각의 웰에 첨가하여, 플레이트 (96-웰, 24 웰) 를 0.1 mg/mL (0.01%) 폴리-L-라이신 용액 (1 mg/mL 로부터 희석됨) 으로 코팅했다. 웰 또는 웰들을 37℃ 에서 최소 1 시간 동안 인큐베이션하고, 용액을 진공 흡인 또는 다른 수단에 의해 제거했다. 웰을 150 μL 의 물로 세정했다. 세포를 고 글루코스 배지에 1:10 현탁시키고, 80-90% 컨플루언스 (confluence) 까지 (20-24 시간 동안) 플레이트에 첨가했다.
Opti M (혈청 비함유, 완전하지 않은 것으로 알려짐) 및 고 글루코스 완전 배지를 37℃ 로 가열했다. Opti-M (500 μL) 을 두 개의 에펜도르프 튜브 각각에 첨가했다. DNA (20 μL) 를 두 개 중 첫번째 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 리포펙타민 (20 μL) 을 두번째 에펜도르프 튜브에 첨가했다. 각각의 튜브의 내용물을 혼합하고, 두 개의 용액을 실온에서 5 분 동안 인큐베이션했다. 두 개의 ApoER2 융합 단백질에 대한 DNA 및 리포펙타민을 함께 혼합하고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션했다. 트랜스펙션 믹스를 세포를 함유하는 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 10 μL 첨가하고, 믹스를 인큐베이션했다.
48 시간 후에, 루시페라아제 활성을 측정했다. 리일린 R3-6 단편을 100℃ 에서 10 min 동안 비등시켜 대조군으로서의 역할을 하게 했다. 루시페라아제 기질을 루시페라아제 완충제 (1:1) 에 용해시키고, 루시페라아제를 각각의 트랜스펙션된 플레이트에 1:1 비 (즉, 50 uL 루시페라아제를 50 uL 트랜스펙션 용액에 첨가했다) 로 첨가했다. 믹스를 10 min 동안 진탕시키고, 빛 생성을 검출했다.
리일린의 결합시에, 전장 리일린에 의한 처리는 Dab-1 에 대한 재현가능한 효과를 초래했으며, 인산화 상태에서 적은 변경이 있으며, 이는 도 15 및 16 에서 보여진다. 이와 대조적으로, 해마 슬라이스와 R3-6 단편의 접촉은 Dab-1 인산화에 대한 시간-의존적 효과를 보였으며, 이는 도 17 및 18 에서 보여진다. APC-처리된 단핵구는 증가된 활성 Dab1 (Tyr220-p), Akt Ser473-p, 및 GSK3β Ser9-p 수준을 입증했다. RAP 에 의한 사전처리 또는 ApoER2 의 녹다운은 이들 효과를 약화시키는 것으로 발견되었으며, 한편 EPCR 및 PAR1 의 저해인자는 효과를 갖지 않았다. 흥미롭게도, APC 는 ApoER2 에 30 nM 친화도로 결합하지만, 가용성 VLDLR 에는 결합하지 않는 것으로 발견되었다. APC 의 효과를 ApoER2 신호전달과 관련시키면, 수용체 연합된 단백질 (RAP) 은 U937 세포의 엔도톡신-유도되는 조직 인자 응고촉진 활성의 APC-매개되는 저해를 차단하는 것으로 발견되었다.
리일린 분자는 최근에 시험관내에서 및 생체내에서 고차 복합체, 예컨대 Fc-RAP 를 형성하는 것으로 발견되었다. 이러한 관찰은 리일린이 생체내에서 다이설파이드-연결된 동종이합체로서 분비된다는 것을 보여줌으로써 추가로 정제된다. 분자의 N-말단에 위치하는, CR-50 에피토프로 호칭되는, 짧은 영역의 결실은 올리고머화를 없앤다. 이러한 돌연변이된 리일린은 일차 마우스 뉴런에서 Dab1 인산화를 효율적으로 유도하는데 실패한다. 유사하게, CR-50 에피토프에 대한 항체는 시험관내에서 및 생체내에서 리일린 기능에 대항한다.
RAP 는 지질단백질 수용체의 패밀리에 매우 높은 친화도로 결합할 수 있는 세포내 단백질이다. Fc-RAP 융합 단백질은 항체의 Fc 영역을 사용하는 연결되어 거친 '덤벨' 모양을 형성하는 두 개의 RAP 분자로 이루어지는 조작된 단백질이다. ApoER2 및 VLDLR 에 결합하여 이들을 저해하는 대신에, Fc-RAP 는 수용체 클러스터링 및 ApoER2 활성화를 야기할 수 있다. Fc-RAP 의 첨가는 LTP 유도를 증가시킴으로써 리일린 적용과 동일한 효과를 가지며, 이는 도 19 에서 보여진다. 주된 차이점은 Fc-RAP 는 아마도 모든 지질단백질 수용체에 결합하지만, 오직 ApoER2 및 VLDLR 만 클러스터링한다는 점이다.
ApoER2 및/또는 VLDLR 의 클러스터링은 Dab1 인산화 및 SFK 의 활성화 및 PKB/Akt 의 조정을 포함하는 하류 사건을 유도한다. 게다가, 리일린의 생물학적 효과 중 하나인, 장기간 강화작용 (LTP) 의 조정은 또한 리일린-독립적 수용체 클러스터링에 의해 모방된다. 이들 발견은 티로신 키나아제 활성을 제공하는 부가적 공-수용체에 대한 필요 없이 수용체-유도되는 이합체화 또는 올리고머화가 Dab1 티로신 인산화 및 하류 신호전달 사건에 충분하다는 것을 강하게 시사한다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 이는 리일린 단편의 치료적 잠재성은 적당한 수용체 이합체화 및 하류 신호전달을 통한다는 것을 시사한다.
실시예 6
리일린은 CA1 글루타메이트성 응답을 강화시키는 능력을 갖는다. 배양된 해마 뉴런에서, 리일린 신호전달은 수지상 구조의 정상적 발달에 요구된다. 리일린 또는 세포내 어댑터 단백질 Dab1 의 부재 하에, 뉴런은 부진한 수지상 성장 및 수지상 가지의 감소를 보이며, 이 표현형은 리일린 수용체 apoER2 및 VLDLR 을 결여하는 뉴런에서 보이는 것과 유사하다 (Niu, et al., Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway. Neuron. 2004;41:71-84). HRM 은 해마의 부위 CA1 에서 해마-의존적 맥락적 공포 조건화된 학습 및 시냅스 가소성의 결핍을 보인다. HRM 의 이들 행동 및 생리적 표현형은 감소된 또는 저해된 시냅스 연결성에 부분적으로 기인한다고 여겨진다. 이는 HRM 은 가시 밀도의 감소를 갖는다는 것의 관찰에 의해 지지된다.
혼합된 해마 및 피질 뉴런 배양물을 제 18-19 배아일 (E) 마우스 배아로부터 수득했다. 세포를 고밀도 (~750 세포 mm-2) 로 플레이팅하고, B27 (Gibco BRL) 이 보충된 Neurobasal 배지 (Gibco BRL) 에서 성장시켰다. 80% 컨플루언스일 때 세포를 부차배양했다.
ApoER2 는 시냅스후에 존재하고, CA1 에서 NMDAR 과 기능적 복합체를 형성한다. mEPSC-NMDA 의 유도는 도 20(A)-(B) 및 21(A)-(D) 에서 도시된다. 모의 처리된 세포는 모의 처리 전과 비교할 때 유의하게 변화되지 않은 NMDA 수용체 (mEPSCNMDA) 로 인한 미니어처 흥분성 시냅스후 전류를 가졌다 (p > 0.05). 리일린에 의한 처리는 mEPSCNMDA 진폭을 유의하게 증가시키는 것으로 발견되었다 (p < 0.001).
리일린의 시냅스후 효과의 결과로서 시냅스 NMDAR 응답이 증가되었다는 것을 추가로 입증하기 위해서, 시냅스로-유발되는 NMDAR 전체-세포 전류의 변동 계수 (CV) 를 분석했다. 9 회의 실험에서 리일린 적용 30 분 전에 및 후에 평균 EPSCNMDA 비에 대해 1/CV2 비를 그래프로 그릴 때, 상관관계가 확립되지 않았으며, 도 21(C) 및 (D) 에서 보인다. 그러나, 평균 EPSCNMDA 비가 변화할 때 1/CV2 비는 상대적으로 변화하지 않은 채 유지되며, 이는 CA1 에서 시냅스후 메카니즘을 통한 리일린 활성화가 NMDAR 활성을 향상시킨다는 것을 확인시켜 준다.
만성 리일린 처리는 시냅스 응답의 AMPA 성분을 증가시켜, EPSCNMDA 동역학 및 이펜프로딜 민감성을 변경할 수 있다. AMPAR 및 NMDAR 아단위의 발현 수준에 대한 CA1 내 리일린의 효과를 시험했다. GluR1, NR1, NR2A, 및 NR2B 의 총 및 표면 수준 둘 모두를 웨스턴 블롯팅에 의해 프로브했다. GluR1 (발달 성숙 동안 증가하게 발현되고 시냅스 가소성 동안 트래피킹을 조절하기 위해 적용되는 AMPAR 아단위) 을 CA1 세포 표면에서 분석했다.
도 22(A)-(C) 는 모의-처리된 군과 비교할 때 리일린 처리가 표면 GluR1 의 수준을 유의하게 증가시켰다는 것을 보여주며, 이는 만성 리일린 처리 후 증가된 mEPSCAMPA 및 AMPA/NMDA 전류 비를 통한 조절되는 발현 및 표면 삽입을 시사한다. 표면 및 총 NR1 수준의 변화 둘 모두가 관찰되지 않았다. 비교에서, 총 및 표면 NR2A 발현 수준 둘 모두는 모의 처리에 비해 리일린 처리 후 유의하게 증가되었다. 더욱이, 총 및 표면 NR2B 단백질 수준 둘 모두는 리일린 처리 후에 유의하게 감소되었다. 비-처리된 대조군과 비교할 때 모의 처리는 상이한 글루타메이트 수용체 아단위 수준에 대해 효과를 갖지 않았다.
해마 수지상돌기에 대한 리일린의 효과를 분석했다. 해마 세포를 6-7 일령 야생형, HRM 및 리일린-결핍성 마우스로부터 생성한 HRM 배아로부터 배양하고, 5 nm 리일린으로 21 일 동안 처리했다. 기관형 배양물의 처리는 21 일 동안 3 일 마다 반복된 5 nM 리일린 적용 또는 비-트랜스펙션된 HEK 세포 배지로 이루어졌다. 세포를 위에서 기재된 바와 같이 배양하고, 전체 세포 패치 클램프 전류를 투여함으로써 형광 염료를 뉴런 세포 내에 주사하고, 세포를 고정 후에 공초점 현미경 하에 시각화했다.
수지상 가시는 수지상돌기의 표면을 커버하고 흥분성 시냅스를 형성하는 시냅스후 구조를 보유하는 작은 돌출부이다. 수지상 가시의 비정상적 모양 또는 감소된 수가 다수의 인지 질환에서 발견된다. 수지상 가시의 수의 감소는 구성적 수준의 리일린/지질단백질 수용체-매개되는 신호전달이 뉴런에 의한 집중적 정보 가공에 결정적인 수지상 구조의 발달에 요구된다는 것을 시사한다. 이러한 개념은 이종접합체 리일러 마우스 (HRM) 가 감소된 수지상 가시 밀도 및 특정 학습 및 기억 행동에서의 손상된 성능을 보인다는 것을 보여주는 연구와 일치한다.
배양된 해마 뉴런은 유의하게 더 적은 수지상 가시를 가졌으며, 이 표현형은 배양물에 외인성 재조합 리일린을 첨가하여 구조될 수 있다. 리일린-처리된 HRM 세포는 21 일 후에 야생형 배양물로부터의 연령 일치 뉴런과 비교할 때 수지상 가시 밀도에서 증가를 보였으며, 이는 도 23(B) 에서 보여진다. 이와 대조적으로, 모의 (비-안정적으로 트랜스펙션된 세포로부터의 조건화된 배지) 적용은 가시 밀도에서 변화를 보이지 않았으며, 이는 도 23(C) 에서 보여진다. 리일린 녹아웃 마우스에서의 동일한 실험은 리일린 적용이 모의 대조군과 비교할 때 또한 수지상 가시 밀도를 구조했다는 것을 보여줬으며, 이는 도 23(C) 및 23(F) 에서 보여진다. 둘 모두의 리일린 처리된 세포는 WT 세포에서 보이는 수지상 가시 형태와 비슷하고, 이는 도 23(D) 에서 보여지며, 정량화되었을 때, 수지상 가시는 모의 처리된 대조군과 비교할 때 리일린-처리된 HRM 배양물에서 유의하게 증가되었고, 야생형 배양물에서 관찰되는 가시 밀도 수준과 유사하며, 이는 도 24(A) 에서 보여진다.
이러한 적용 프로토콜이 리일린의 만성 적용을 나타내고 리일린이 붕괴되거나 또는 배지로부터 능동적으로 제거된다는 것을 입증하기 위해서, 발명자들은 리일린 적용 후 0, 6, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간의 시점에 15 μl 의 배지를 배양 플레이트로부터 제거했다. 이들 분취물의 웨스턴 분석은 리일린의 분해 또는 감소를 보이지 않았으며, 이는 도 25 에서 보여진다. 따라서, 가시 밀도의 증가는 전체 21-일 적용 동안 생리학적 적절한 수준으로 존재하는 리일린으로 인한 것이다.
실시예 7
지질단백질 수용체는 인지 과정에서 일정한 역할을 하고, 병리학적 과정에서 이러한 수용체 패밀리가 연루되는 것이 시사되었다. 이들 수용체에 대한 주요 리간드 중 두 가지, apoE 및 리일린은 시냅스 기능에 유의하게 영향을 미칠 수 있는 신호전달 능력을 갖는 것으로 보인다. 리일린 이종접합체는 시냅스 가소성 및 인지 기능 둘 모두에서 결핍을 보인다. 리일린 발현의 대략 50% 감소는 시냅스 가소성 및 인지 기능 둘 모두에서 결핍을 초래한다 (Qiu, et al., Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem. 2006; 85:228-242). 최근의 연구는 정상적 학습 및 기억에서 리일린 신호전달의 중요성 (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277:39944-39952), 뿐만 아니라 이러한 신호전달이 동요되는 병리학적 경우를 강조했다. APC 는 현재 리일린 신호전달의 후보 조정인자이며, 이는 그것이 ApoER2 에 결합하는 구조적 부분을 갖고 하류 효과기를 활성화시키는 것으로 보이기 때문이다.
리일린의 학습 및 인지 효과를 확증하기 위해서, 그것의 수용체에 대한 리일린 결합을 효과적으로 차단하는 지질단백질 안타고니스트 RAP (수용체 연합된 단백질) 를 마우스에게 양측에 주입했다.
10-주령 C57Bl/6 마우스 (n= 55, 수컷) 를 정상적 조건 (20℃, 50% 상대 습도, 및 12-h 명/암 주기) 하에 수용하고, 물 및 음식을 임의로 허용했다. 환경으로 정규화 후에, 마우스를 하기 군들로 분리했다: 충격받지 않는 거짓 (sham) 처리 (주사 없음), 충격받는 RAP 주사, 충격받는 거짓 처리 (주사 없음), 및 충격받는 리일린 처리. 리일린 처리된 동물은 5 nM 농도의 전장 재조합, 정제된 리일린 단백질 함유 2 μl 주사로 이루어졌다. 처리 후 3 시간에, 맥락적 공포 조건화를 수행했다. 연구 동안 내내 동물의 통증 및 고통을 감소시키기 위해 필요한 주의를 기울였다. 모든 연구는 처리 조건에 대해 요원 블라인드로 수행했다. 처리 시점에, 마우스는 12-45 g 의 중량을 가졌다.
양측 주사를 위해, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 정위적 수술 장비 (Stoelting Co.) 상에 배치했다. 시상봉합 절개를 두개골 중앙에 실시하고, 피부를 부드럽게 눌러서 다시 구멍을 확대시켰다. 드릴로 두개골을 통해 두 개의 구멍을 뚫어서 뇌를 통해 심실 내로의 해밀턴 바늘의 통과를 허용한다 (AP -0.35 mm, L ± 0.75 mm, 및 V -2.5 mm, 브레그마로부터). 마우스에게 0.5 μL 모의 대조군 또는 리일린을 양측에 주사하여 1 μL/min 의 속도에서 리일린의 5 nm 총 반구체 농도를 산출하며, 이는 이전에 확립된 바와 같다 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol. Chem. 2002;277:39944-39952; Rogers, et al., Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning decits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013;27:389-395). 바늘을 그 후 제거하고, 치과용 시멘트로 구멍을 밀봉하고, 절개를 봉합한다. 마우스를 따뜻한 가열 패드 위에서 개별 우리 내에서 2 h 동안 수술 후에 관찰했다. 직장 온도를 매일 측정하여 염증 또는 감염 반응을 모니터링했다; 100.5 ℉ 이상의 온도를 갖는 임의의 마우스를 CO2 흡입을 통해 안락사시켰다. 동물을 5 일 동안 회복되게 두었다. 이러한 시간 경과가 심실내 주사 후 행동 조사에 최적이라는 것이 이전에 밝혀졌다 (Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity, and dendritic spine density. Learn. Memory. 2011;18:558-564; Rogers, et al., Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning decits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013;27:389-395).
공포 조건화 훈련을 와이어 그리드 바닥재가 있는 정사각형 감음 체임버 (25 x 25 cm) 에서 수행했다. 훈련에서, 마우스를 배경 백색 소음이 있는 체임버에 배치하고, 3 min 동안 탐험하도록 놔둔 후에, 30 s 동안 조건화된 자극을 제시했다 (90 dB 음조). 28 s 에서, 조건화되지 않은 자극 [약한 (0.5 mA) 발 충격] 을 총 2 s 동안 투여했다. 90 s 의 기간 후에, 두번째 조건화된 자극/조건화되지 않은 자극 쌍을 수행했으며, 그에 뒤이어 또다른 90 s 기간을, 총 7 min 동안 수행했다. 맥락적 공포 조건화를, 3 min 동안, 음조 없이, 동일한 체임버 내에서 훈련 후 24 h 에 수행하고, 얼어붙음을 평가했다. 단서가 주어진 공포 조건화를 체임버를 냄새, 조명, 및 바닥 질감에 의해 변경하는 맥락적 시험에 따라 수행했다. 마우스를 변경된 체임버 내에 배치하고, 3 min 습관화 시기 (음조 없음), 그에 뒤이어 90 dB 조건화된 자극 (음조) 을 시험의 마지막 3 min 동안 제공했다. 행동을 ANY-Maze 소프트웨어 (Stoelting Co.) 를 통해 모니터링했다. 얼어붙음을 적어도 2 s 동안의 부동성으로서 평가했다.
훈련 충격을 받지 않은 거짓 처리된 마우스는 매우 적은 얼어붙음을 보였으며, 마우스 중 오직 약 15% 만이 음조를 듣고 얼어붙었다. 주사하지 않았으나 충격 훈련을 받은 마우스의 경우에, 약 70% 가 음조를 듣고 얼어붙었으며, 이는 90% 얼어붙음 속도를 보인 리일린-처리된 마우스에 의해서만 초월되었으며, 이는 도 26(A) 에서 보여진다. 그에 비해, 리일린 수용체 결합을 저해하는, RAP 의 투여는, 마우스가 충격-훈련되었음에도, 음조에 대한 응답을 오직 45% 로 감소시켰다. 분석은 비-처리된, 그러나 충격-훈련된 마우스와 RAP-처리된 마우스 사이에 응답에서 유의한 차이가 있었다는 것을 보여줬다.
마우스를 또한 수중 미로 시험에 노출시켰다. 숨겨진 플랫폼 수중 미로를 사용하여 공간 학습 및 기억을 평가했다. 마우스가 바닥을 건드릴 수 없을 정도로 충분히 깊은, 불투명한 물로 채워진 1.2 m 직경 푸울 내에서 10 cm 직경 플랫폼을 표면 바로 아래에 물 속에 잠기게 했다. 큰 시각적 단서를 방 사방에 위치시켰다. 마우스를 푸울 내에 배치하고, 최대 60 s 동안 수영하여 플랫폼을 찾도록 놔두었다. 훈련은 5 훈련일로 이루어졌으며, 15 min 시험간 간격에 의해 분리되는, 하루 당 4 회 시험이 있었다. 제 6 일 및 제 8 일에, 플랫폼을 제거하고, ANY-미로 비디오 추적 소프트웨어 (Stoelting Co.) 를 사용하여 각각의 마우스의 수영 패턴을 60 s 동안 추적했다 (프로브 시험).
심실 내로의 리일린의 단일 주사는 숨겨진 플랫폼 수중 미로 내에서의 공간 학습을 개선했으며, 이는 도 26(B) 에서 보여진다. 제 6 일에 상이한 플랫폼 장소 (반대편) 를 찾도록 재훈련된 마우스는 염분 주사된 마우스와 비교할 때 증가된 학습 능력을 계속 보였다. 훈련 전 5 일에 단일 리일린 주사를 맞은 마우스는 제 1 일에 플랫폼을 찾기까지의 잠재시간이 더 낮았다. 플랫폼을 찾기까지의 잠재시간은 훈련 패러다임에 단일 노출 후에 유의하게 감소되었으며, 이는 도 26(C) 에서 보여진다. 상이한 플랫폼 장소를 찾도록 재훈련된 마우스는 리일린 및 염분 주사 사이에 차이를 계속 보였다. 처리된 및 비-처리된 동물 사이에서 수영 속도 및 모든 다른 활동 측정값은 동일하게 유지되었다. 이들 데이타는 생체내 학습 및 기억 형성을 조정하는 리일린의 능력 및 리일린 단백질 가공을 제어하는 메카니즘 및 단편이 후속적으로 인지 기능을 조정하는 과정을 확인하는 것을 목표로 하는 연구의 중요성을 극적으로 보여준다.
기능적 시험은 더 낮은 리일린 수준이 감소된 연상 학습을 초래한다는 것을 보여줬다. 시냅스 기능에 대한 리일린 결핍증의 효과는 리일린 농도가 향상될 때 보상된다. 연상 공포 조건화 훈련 전 3 시간에 재조합 리일린 단편 보체의 직접 양측 심실 주입은 3-4-개월령 야생형 마우스에서 훈련 후 24 시간에 시험될 때 기억 형성을 향상시켰으며, 이는 도 26(A)-(C) 에서 보여진다. 이들 결과는 정상적 기억 형성을 위한 리일린에 관한 요건을 입증하고, 증가하는 리일린 신호전달이 기억을 향상시킬 수 있는지 여부에 대한 흥미로운 의문을 제기한다.
리일린 수준에 대한 맥락적 공포 조건화의 효과를 그 후 분석했다. 야생형 마우스를 위에 논의된 바와 같이 3-충격, 맥락적 공포 조건화 프로토콜 (CFC) 로 훈련시켰다. 충격받지 않은 마우스 (CS) 를 음성 대조군으로서 사용했고, 충격받은, 맥락-노출된 마우스 (CS/US) 는 훈련 후 1, 5, 15, 30, 및 180 분, 뿐만 아니라 훈련 후 18 시간에 그들의 해마가 제거되었고 (n = 4, 시점), 해마 균질액을 항-리일린 (G10) 을 사용하여 분석했다.
공포 조건화된 학습은, 특히 450 및 180 kDa 단편에서, 맥락적 공포 조건화 후 18 시간에 걸쳐 리일린 발현 및 단편 보체에서 극적 변화를 초래하며, 이는 도 27(A) & (B) 에서 보여진다. 더욱이, 쉐퍼 평행 경로 (Schaffer collateral pathway) 에 전달된 세타 돌발 자극은 자극 후 15 분에 리일린 발현 및 단편 절단에서 유의한 증가를 초래했으며, 이는 도 27 (A) & (B) 에서 보여진다. 이들 결과는 시냅스 가소성의 변경 및 학습 및 기억의 조정의 원인이 되는 리일린 신호전달의 통합 및 제어가 리일린을 기능적으로-구별되는 단편으로 가공하는 것을 수반한다는 것을 보여준다.
실시예 8
리일린 신호전달은 흥분성 시냅스에 대한 여러 가지 생리학적 변화, 뿐만 아니라 정상적 포유동물 인지 기능에 관여된다. 최근의 연구는 정상적 학습 및 기억에서 리일린 신호전달의 중요성 (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277:39944-39952), 뿐만 아니라 이러한 신호전달이 동요되는 병리학적 경우를 강조했다. APC 는 현재 리일린 신호전달의 후보 조정인자이며, 이는 그것이 ApoER2 에 결합하는 구조적 부분을 갖고 하류 효과기를 활성화시키는 것으로 보이기 때문이다.
지질단백질 수용체는 인지 과정에서 일정한 역할을 하고, 알츠하이머병 (AD) 의 진행의 기저를 이루는 병리학적 과정에서 이러한 수용체 패밀리가 연루되는 것이 시사되었다. 이들 수용체에 대한 주요 리간드 중 두 가지, apoE 및 리일린은 시냅스 기능에 유의하게 영향을 미칠 수 있는 신호전달 능력을 갖는 것으로 보이고, APP 와 직접 상호작용하고 그것의 대사를 조정하고, Aβ 축적에 민감성이다. Aβ 축적은 지질단백질 수용체 신호전달을 파괴하여, 인지 기능의 수반되는 파괴를 초래한다. 게다가, 리일린 및/또는 지질단백질 수용체 신호전달의 간섭은 이상 APP 대사 및 Aβ 청소를 초래하며, 이는 결국 Aβ 축적 및 플라크 침적을 악화시킨다. 그러므로, 직접 리일린 단백질 적용을 통한, 또는 DNA 유전자 요법 또는 RNA 구축물, 또는 다른 지질단백질 수용체 아고니스트의 사용에 의한 증가된 리일린 신호전달을 사용하여 Aβ-의존적 인지 파괴 및 플라크 병리학의 진행을 완화시킬 수 있다.
인간 질환에서 리일린 단백질가수분해의 역할에 대한 지지는 신경정신과적 및 신경변성 장애 둘 모두에서 발견되었다. 예를 들어, N-R2 단편은 비-치매 환자와 비교할 때 AD 및 전측두엽 치매 환자에서 증가되었다 (Saez-Valero, et al., Altered levels of cerebrospinal fluid reelin in frontotemporal dementia and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 2003;72:132-136; Botella-Lopez, et al. Reelin expression and glycosylation patterns arealtered in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103:5573-5578). 우울증 및 양극성 장애로 확진받은 환자에서, N-R2 단편은 혈액 샘플에서 감소된 것으로 발견되었으며, 한편 조현병 환자의 경우에 N-R6 단편은 증가되었다 (Fatemi, et al., Altered levels of Reelin and its isoforms in schizophrenia and mood disorders. Neuroreport. 2001;12:3209-3215). 리일린은 또한 발작 제어에서 일정한 역할을 할 수 있다: 간질 모델은 MMP-의존적일 수 있는 변경된 리일린 가공을 갖는다 (Tinnes, et al., Epileptiform activity interferes with proteolytic processing of Reelin required for dentate granule cell positioning. FASEBJ. 2011;25:1002-1013; Tinnes, et al., TIMP-1 inhibits the proteolytic processing of Reelin in experimental epilepsy. FASEBJ. 2013;27:2542-2552; Kaneko, et al., Kainic acid-induced golgi complex fragmentation/dispersal shifts the proteolysis of reelin in primary rat neuronal cells: an in vitro model of early stage epilepsy. Mol. Neurobiol. 2016;53:1874-1883). 리일린 단편 수준에서의 이들 차이는 질환 상태에서 리일린 수준 및 단백질분해 기능장애에서의 중요성을 암시한다.
리일린의 시험은 AD 에 관한 세 개의 마우스 모델 (PS1-FAD, SweAPPxPS1, 및 Tg2576) 에서 리일린 대사가 변경된다는 것을 나타낸다. 14-개월령 야생형 (변경되지 않은 한배새끼), Tg2576 (SweAPP), PS1-FAD (M146L), 및 2X (SweAPP x M146L) 을 정상적 조건 (20℃, 50% 상대 습도, 및 12-h 명/암 주기) 하에 수용하고, 물 및 음식을 임의로 허용했다. 환경으로 정규화 후에, 마우스의 피질을 제거하고, 용해물에 대해 상이한 리일린 단편에 관한 웨스턴 블롯팅을 수행했다. 리일린 대사가 AD 에 관한 세 개의 마우스 모델 (PS1-FAD, SweAPPxPS1, 및 Tg2576) 에서 변경되며, 이는 도 28(A) 에서 보여진다. 야생형에 비해 Tg2576 에서 리일린 450, 190 및 180 kDa 생성물에서의 유의한 차이가 검출되지 않았으나, Tg2576 및 2X 마우스에서 G10 에 의해 인지되는 미확인 N-말단 종이 유의하게 상승되었다. 이와 대조적으로, PS1-FAD 및 2X 마우스에서 리일린 450 및 180 kDa 생성물이 유의하게 상승되었다. 리일린 단편 보체에서의 이들 변화는 하류 리일린 신호전달에서의 변경과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 주요 하류 성분, Dab-1 의 인산화에 관한 피질의 시험은, SweAPPXPS1 및 PS1-FAD 에서 증가된 DAB-1 인산화를 보였고, 단일 SweAPP (Tg2576) 마우스에서 유의하게 감소되었으며, 이는 도 28(B) 에서 보여진다. 이들 데이타는 리일린 대사가 APP 가공 및/또는 Aβ 축적의 변화에 특히 민감하다는 것을 시사한다.
Tg2576 마우스에서 리일린 단편 조성물 및 Dab-1 인산화에서의 변경은 타협된 (compromised) 리일린 신호전달 시스템을 나타낼 수 있으며, 이 현상은 참인 경우에 이들 마우스에서 보고되는 시냅스 가소성 결핍의 원인이 될 수 있다 (Mitchell, et al., X11beta rescues memory and long-term potentiation deficits in Alzheimer's disease APPswe Tg2576 mice. Hum Mol Genet. 2009; 18:4492-4500; Kotilinek, et al., Cyclooxygenase-2 inhibition improves amyloid-beta-mediated suppression of memory and synaptic plasticity. Brain. 2008; 131:651-664; Jacobsen, et al., Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103:5161-5166).
외인성 리일린의 효과를 확인하기 위해서, 8-개월령 Tg2576 마우스로부터의 급성 해마 슬라이스를 5 nM 재조합 리일린 단편 보체 R3-6 으로 관류시켰다. 늙은 Tg2576 마우스에서 리일린 단편 적용은 LTP 결핍을 구조했으며, 이는 도 28(C) 에서 보여지며, 이는 이들 마우스에서 리일린 단백질 가공의 하류에서 리일린 신호전달에 관여되는 생화학적 및 구조적 기구가 온전하다는 것을 시사한다. 게다가, 이러한 마우스 모델에서 시냅스 가소성의 정상적 수준이 수득가능하다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 늙은 (15-개월령) Tg2576 마우스에서 리일린 단편은 또한 밀집한 코어 플라크와 연합되며, 이는 도 29(A)-(D) 에서 보여진다. 더욱이, 리일린 및 관련 지질단백질 수용체 아고니스트는 Aβ 축적 및/또는 플라크 병리학으로부터 초래되는 시냅스 가소성 및 인지 기능의 결핍을 구조할 수 있다. AD 에 관한 12-개월령 마우스 모델 (Tg2576) 에서 리일린은 LTP 결핍을 구조했으며, 이는 도 30 에서 보여진다.
이들 데이타는 늙은 야생형 마우스의 해마에서 Aβ-함유 플라크와 연합된 리일린이 검출되었다는 발견에 의해 지지된다 (Madhusudan, et al., Accumulation of reelin-positive plaques is accompanied by a decline in basal forebrain projection neurons during normal aging. Eur J Neurosci. 2009; 30:1064-1076; Knuesel, et al., Age-related accumulation of Reelin in amyloidlike deposits. Neurobiol Aging. 2009; 30:697-716). 시냅스 기능에 있어서의 리일린에 관한 확립된 역할에 비추어, 이전에 확립된 AD 마우스 모델에서 리일린 대사 및 신호전달의 온전성의 변화는 학습 및 기억 변화에서 현저한 역할을 수행한다.
놀랍게도, 성체 야생형 마우스에서 외인성 리일린 적용은 적어도 11 일 동안 단일 학습 및 기억을 향상시킨다. Aβ 청소에 있어서의 지질단백질 수용체의 역할, 및 AD 마우스 모델에서 Aβ 플라크에 대한 리일린 연합의 확인은, Aβ 의 제거 및 인지 기능의 개선을 목표로 하는 AD 치료적 개입으로서 AD 의 병인학 및 발병기전에서 치료적 표적으로서 리일린에 초점을 맞추는 것의 가치를 입증한다.
그러므로, 직접 리일린 단백질 적용을 통한, 또는 DNA 유전자 요법 또는 RNA 구축물, 또는 다른 지질단백질 수용체 아고니스트의 사용에 의한 증가된 리일린 신호전달을 사용하여 Aβ-의존적 인지 파괴 및 플라크 병리학의 진행을 완화시킬 수 있다.
실시예 9
외상성 뇌 손상 (TBI) 은 다양한 기원, 예컨대 발작, 두부 외상, 간질 지속증 (SE), 및 국소빈혈로부터 초래할 수 있다 (Shetty & Hattiangady, Prospects of Stem Cell therapy for Temporal Lobe Epilepsy. Stem Cells. 2007;25:2396-2407; Ogawa, et al., Ischemia-induced neuronal cell death and stress response. 2007;9:573-587; Acharya, et al., Progress in neuroprotective strategies for preventing epilepsy. Prog Neurobiol. 2008:363-404; Pitkanen, et al., From traumatic brain injury to posttraumatic epilepsy: what animal models tell us about the process and treatment options. Epilepsia. 2009;50 (Suppl 2):21-9). 손상의 급성기 동안, 과립하 구역 (SGZ) 에 위치하는 신경 줄기 세포 (NSC) 는 손상을 치유하려는 시도로 신경발생을 증가시킨다 (Parent, et al., Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 1997;17:3727-3738; Hattiangady, et al., Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiol Dis. 2004;17:473-490; Shetty, et al., Hippocampal neurotrophin levels in a kainate model of temporal lobe epilepsy: a lack of correlation between brain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentate mossy fiber sprouting. J Neurochem. 2003;87:147-159; Hattiangady, et al., Brain-derived neurotrophic factor, phosphorylated cyclic AMP response element binding protein and neuropeptide Y decline as early as middle age in the dentate gyrus and CA1 and CA3 subfields of the hippocampus. Exp Neurol. 2005;195:353-371). 그러나, 이들 손상에 대한 생리학적 응답은 기능적 회복을 개선하는데 실패하고, 학습 부진 및 기억 및 기분 장애를 초래한다 (Jorge RE, Acion L, Starkstein SE, Magnotta V. Hippocampal volume and mood disorders after traumatic brain injury. Biol Psychiatry. 2007;62:332-338; Potvin, et al., Performance on spatial working memory tasks after dorsal or ventral hippocampal lesions and adjacent damage to the subiculum. Behav Neurosci. 2006;120:413-422). TBI 로부터의 만성 문제 중 다수는 NSC 의 불량한 뉴런 분화, NSC 로부터의 뉴런 세포의 부적절한 이주 또는 분화, 및 뉴런 세포로부터 돌출하는 기저 수지상돌기 상에서의 불량한 또는 부적절한 시냅스생성에 의해 야기된다 (Sanchez, et al., Synaptic connections of hilar basal dendrites of dentate granule cells in a neonatal hypoxia model of epilepsy. Epilepsia. 2012;53 (Suppl 1):98-108).
외상성 뇌 손상 (TBI) 에 관한 리일린의 투여의 효과를 시험하기 위해서, 일련의 운동 행동 시험, EBST, 앞다리 운동불능, 및 발-움켜잡음 시험을 수행했다.
10-주령 C57Bl/6 마우스 (n= 55, 수컷) 를 정상적 조건 (20℃, 50% 상대 습도, 및 12-h 명/암 주기) 하에 수용하고, 물 및 음식을 임의로 허용했다. 환경으로 정규화 후에, 마우스를 제어되는 피질 충격기 (CCI; Pittsburgh Precision Instruments, Inc, Pittsburgh, PA) 를 사용하는 TBI 에 적용했다. 실험 절차를 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았다. 마우스를 하기 군들로 분리했다: 주사하지 않은 거짓 처리 (TBI 없음), 주사하지 않은 TBI, 염분 군으로 모의 처리한 TBI, 및 리일린 처리를 한 TBI. 리일린 처리된 동물은 5 nM 농도의 전장 재조합, 정제된 리일린 단백질 함유 2 ul 주사로 이루어졌다. 거짓-처리된 동물을 마취시키고, 수술 절차를 받게 하였으나, 피질 충격은 받게 하지 않았다. 모든 행동 시험을 시험일 전체에서 명 주기 동안 동일한 시간에 수행했다. 연구 동안 내내 동물의 통증 및 고통을 감소시키기 위해 필요한 주의를 기울였다. 모든 연구는 처리 조건에 대해 요원 블라인드로 수행했다. 처리 시점에, 마우스는 12-45 g 의 중량을 가졌다.
코 마스크를 사용하여 아산화질소/산소 (69/30%) 중 1-2% 이소플루란으로 깊은 마취를 달성했다. 모든 동물을 정위적 틀에 고정시켰다 (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). TBI 손상 수술은 동물을 두개골을 노출시키는 두피 절개, 및 머리뼈절제에 적용하는 것으로 이루어졌다. 전기 드릴을 사용하여 브레그마로부터 +0.2 전방 및 -0.2 mm 우측면으로부터 계산된 좌표에서 약 2.5 mm 반경의 머리뼈절제를 수행했다 (Paxinos & Watson, (2005) The mouse brain in stereotaxic coordinates. 5th ed. San Diego, CA: Academic Press). 머리뼈절개술 후에 전두-두정 피질에서 6.0 m/s 의 속도로 경질막 층 아래 1.0 mm 의 깊이에 도달하게 하고 뇌에서 150 밀리초 (ms) 동안 유지되게 하여 뇌에 충격을 가했다. 충격기 막대는 수직으로 15°각도이며, 충격면에서 뇌 만곡의 접선면에 대해 직각 위치를 유지했다.
충격기에 연결된 선형 가변 변위 변환기 (Macrosensors, Pennsauken NJ) 는 속도 및 지속시간을 측정하여 일관성을 확인했다. 진통제 케토프로펜 (5 mg kg-1) 을 수술 후에 투여했다. 마우스를 엄격한 감독 하에 유지했다.
상승된 몸체 흔들림 시험 (EBST) 은 동물을 그것의 꼬리에 의해 취급하고 흔들림의 방향을 기록하는 것을 수반했다 (Borlongan & Sanberg, (1995) Elevated body swing test: a new behavioral parameter for mice with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism. The Journal of neuroscience 15: 5372-5378). 시험 장비는 투명한 플렉시유리 박스 (40 x 40 x 35.5 cm) 로 이루어졌다. 동물을 꼬리의 기저부에서 부드럽게 집어 올리고, 동물의 코가 표면 위 2 인치 (5 cm) 의 높이에 있을 때까지 꼬리에 의해 상승시켰다. 동물 머리가 신체의 정중선 위치로부터 대략 10 도 옆으로 움직이면, 왼쪽 또는 오른쪽의, 흔들림의 방향을 계수했다. 단일 흔들림 후에, 동물을 다시 플렉시유리 박스에 배치하고, 재시험 전에 30 초 동안 자유롭게 움직이게 놔두었다. 이들 단계를 각각의 동물에게 20 번 반복했다. 정상적으로는, 온전한 마우스는 50% 흔들림 치우침, 즉, 왼쪽으로 및 오른쪽으로 동일한 수의 흔들림을 나타낸다. 한 방향을 향하는 75% 흔들림 치우침을 TBI 운동 결핍의 기준으로서 사용했다.
거짓 대조군, 주사하지 않은 TBI, 모의 주사를 한 TBI 또는 리일린 처리를 한 TBI 로부터의 젊은 및 늙은 마우스를 TBI 수술 전에 및 후에 앞다리 운동불능을 시험했다 (Borlongan CV, Hida H, Nishino H (1998) Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport 9:3615-3621). 동측 및 대측 앞발 강도 및 운동성을 두 명의 실험에 대해 블라인드인 평가자가 하기 앞다리 운동불능 등급을 사용하여 점수매겼다. 나이브 (naive), 거짓-병변이 있는, 또는 반파킨슨병이 있는 마우스를 수직으로 세워 둔 플렉시유리 실린더 (직경 20 cm, 높이 30 cm) 에 개별적으로 배치하고, 5-15 min 동안 그것이 탐험하고 그것의 앞발로 유리를 만지는 동안 비디오로 기록했다. 앞발 접촉은 두 명의 실험적으로 블라인드인 평가자가 기록했고, 이후에 (우측 접촉의 수/총 접촉의 수) 로서 계산했다. 50% 의 값은 정상으로 특징지어지고 점수가 1 이고, 그것의 우측 (동측) 앞발로 80% 를 만진 동물은 손상된 것으로 여겨지고 점수가 2 이고, 한편 그것의 우측 (동측) 앞발로 90% 이상을 만진 동물은 심각하게 손상된 것으로 여겨지고 점수가 3 이다. 점수를 각각의 개별 동물에 대해 집계하고, 그 후 처리 군에 대한 평균 점수를 분석에 사용했다.
발 움켜잡음은 TBI 수술 전에 및 후에 움켜잡음 강도를 시험하는 것을 수반했다. 비정상적 움켜잡음은 손상된 신경근 기능의 지표이다. 이러한 시험에서, 마우스를 그들의 몸체를 기둥에 붙여 유지했다 (Ibrahim AG, Raisman G, Li Y (2009) Permanent loss of fore-paw grasping requires complete deprivation of afferent input from a minimum of four dorsal roots of the rmouse brachial plexus. Exp Neurol 215:142-145). 동측 및 대측 발 움켜잡음 강도 둘 모두를 두 명의 실험적으로 블라인드인 평가자가 하기 움켜잡음 강도 등급을 사용하여 점수매겼다. 1 내지 3 의 등급에서, 1 은 정상이고, 2 는 손상된 것이고, 3 은 심각하게 손상된 것이다. 점수를 각각의 개별 동물에 대해 집계하고, 그 후 처리 군에 대한 평균 점수를 분석에 사용했다.
각각의 시점에 대한 ANOVA 및 사후 본페로니 t-검증 (post hoc Bonferroni's t-tests) 의 반복된 측정을 사용하여 처리 군 사이의 통계적 차이를 평가했다. 차이는 p<0.05 에서 유의한 것으로 여겨졌다. 모든 값은 평균 ±SEM 로서 표현된다.
리일린에 의한 처리는 TBI 동물에서 개선된 행동 회복을 보였다. 리일린-처리된 마우스는 제 1 일에 약간의 흔들림 치우침을 보였으며, 이는 제 2 일 쯤에 해결되었으며, 이는 도 31 에서 보여진다. 비교하면, TBI 로 처리되고 비히클 주사된 또는 주사되지 않은 마우스는 시험 동안 내내 더 높은 흔들림 치우침을 보였다. 따라서, 처리는 제 2 일에 분기하는 회복을 초래했으며, 리일린-처리된 마우스는 개선되었으며, 한편 비히클 주사된 및 주사되지 않은 마우스는 적은 개선을 보였다. 리일린 처리는 또한 제 3 일 쯤에 다리 운동불능에 개선을 초래했으며, 이는 도 32 에서 보여진다. 제 5 일 쯤에, 리일린-처리된 마우스는 거짓-처리된 동물과 유사한 다리 운동불능을 보였으며, 한편 비히클 투여된 또는 주사되지 않은 TBI-처리된 마우스는 계속 운동불능을 보였다. 발 움켜잡음은 리일린-처리된 마우스에서 꾸준한 개선을 보였으며, 이는 도 33 에서 보여진다.
외상성 뇌 손상에서 생활방식이 만성 손실은 부분적으로 치유 동안 부적절한 뉴런 세포 대체로 인한 것이다. 리일린은 DG 에서 세포외 당단백질 리일린을 발현하는 뉴런인 GABA-생산성 중간뉴런의 서브클래스를 보호하는 것으로 발견되었다 (Shetty, Hippocampal Injury Induced Cognitive and Mood Dysfunction, Altered Neurogenesis and Epilepsy: Can Early Neural Stem Cell Grafting Intervention Provide Protection? Epilepsy Behav. 2014 Sep;38:117-24). 이들 GABA-생산성 중간뉴런은 NCS 로부터 형성된 뉴런 세포가 과립 세포 층 내로 이주하는 것을 보조한다 (Gong, et al., Reelin regulates neuronal progenitor migration in intact and epileptic hippocampus. J Neurosci. 2007;27:1803-1811). 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 리일린 또는 리일린 단편의 투여는 수지상돌기 형성, GABA-생산성 중간뉴런의 유지, 또는 경로의 조합을 통해 작업될 수 있다.
실시예 10
수지상 가시는 수지상돌기의 표면을 커버하고 흥분성 시냅스를 형성하는 시냅스후 구조를 보유하는 작은 돌출부이다. 수지상 가시의 비정상적 모양 또는 감소된 수가 다수의 인지 질환, 예컨대 취약 X 증후군, 윌리엄 증후군, 레트 증후군, 다운 증후군, 안젤만 증후군 및 자폐증에서 발견된다. 수지상 가시의 수의 감소는 구성적 수준의 리일린/지질단백질 수용체-매개되는 신호전달이 뉴런에 의한 집중적 정보 가공에 결정적인 수지상 구조의 발달에 요구된다는 것을 시사한다. 이러한 개념은 이종접합체 리일러 마우스 (HRM) 가 감소된 수지상 가시 밀도 및 특정 학습 및 기억 행동에서의 손상된 성능을 보인다는 것을 보여주는 연구와 일치한다. 게다가, 리일린 보충은 가시 밀도 결함 및 관련된 인지 파괴를 회복시킨다. 또한, 리일린 신호 변환은 조기 기억 유전자 전사에 필수적인 CREB 활성화에 관여되는 경로를 개시한다. 이는 위에서 언급된 인간 인지 장애에서 파괴되는 공통 경로이다.
실시예 11
최근에 메탈로프로테이나아제(들)에 의한 리일린의 가공이 정상적 피질 판 형성에 필수적이라는 것이 밝혀졌지만 (Jossin, et al., Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol Cell Biol. 2007; 27:7113-7124), 원인이 되는 특정 효소는 아직 알려지지지 않았다. 이러한 발견은 메탈로프로테이나아제-매개되는 리일린 가공이 성체 뇌에서 유도되는 리일린 신호전달에 또한 중요할 수 있다는 것을 시사한다. tPA 및 MMP-9 둘 모두는 후보 메탈로프로테이나아제이며, 시냅스 가소성 및 인지 기능의 조절에 있어서의 역할이 분명히 입증되었다 (Bozdagi, et al., In vivo roles for matrix metalloproteinase-9 in mature hippocampal synaptic physiology and plasticity. J Neurophysiol. 2007; 98:334-344; Nagy, et al., Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal late-phase long-term potentiation and memory. J Neurosci. 2006; 26:1923-1934; Huang, et al., Mice lacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selective interference with late-phase longterm potentiation in both Schaffer collateral and mossy fiber pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93:8699-8704; Pang, P. T., and B. Lu. 2004. Regulation of late-phase LTP and long-term memory in normal and aging hippocampus: role of secreted proteins tPA and BDNF. Ageing Res Rev 3:407-430; Zhuo, M., D. M. Holtzman, Y. Li, H. Osaka, J. DeMaro, M. Jacquin, and G. Bu. 2000. Role of tissue plasminogen activator receptor LRP in hippocampal long- term potentiation. J Neurosci 20:542-549; Baranes, et al., Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron. 1998; 21:813-825).
370 kDa 생성물을 생성하는 효능은 후보 리일린-절단 효소, tPA 에 부분적으로 의존적이다. 이러한 잠재적 조절 메카니즘은 이러한 신호전달 시스템이 뉴런 조절의 알려진 메카니즘 내에 통합되고 생리학적 과정 예컨대 학습 및 기억에 조화롭게 참여하는 방법에 대해 심오한 영향을 갖는다. 그러나, 리일린은 특정 자리에서 절단되어 웨스턴 블롯 분석에 의해 쉽게 정량화되는 리일린 단편의 안정적 패턴을 초래한다. 이들 단편은 전장 리일린과 다른 독특한 특성을 갖는 잠재적 신호전달 분자에 해당한다. 안정적으로 트랜스펙션된 HEK293 세포로부터 정제된 재조합 리일린은 해마에서 발견되는 주요 단편과 동일한 크기의 단편을 함유한다.
더욱이, 성체 뇌에서의 리일린 국소화에 관해 알려져 있는 모든 것은 N-R2 영역을 인지하는 항체를 사용하여 생성되었다. N-R2 영역은 리일린의 전장 (N-R8), N-R2 및 N-R6 단편에는 존재하지만, 다른 주요 단편에는 존재하지 않는다. 그러므로, 표 3 에서 보이는 바와 같은, 3-에피토프 매핑 접근법은 리일린 생성물 생산 및 국소화의 변화를 모니터링하는 탁월한 공간 해상도를 제공했다.
표 3. 3-에피토프 접근법에서 이용되는 항체와 특성, 출처 식별 및 에피토프 자리 인지.
Figure 112019021510205-pct00020
정상적 시냅스 기능 및 기억 형성의 맥락에서 tPA- 및 MMP-9-의존적 리일린 가공에 의해 생산되는 특정 단편을 특성분석하기 위해서, 자리-지정 돌연변이유발을 사용하여 절단-저항성 리일린 돌연변이체 구축물을 생성했으며, 이는 도 34 에서 보여진다. 리일린 돌연변이체는 tPA 에 의한 R2-3 에서의 절단, MMP-9 에 의한 R6-7 에서의 절단 및 둘 모두의 효소에 의한 R2-3 및 R6-7 에서의 절단에 저항성 (Rln-Res) 인 구축물을 포함한다. 절단 저항성 자리가 있는, 또는 없는 tPA 또는 MMP-9 에 의한 절단을 모방하는 단편이 또한 고려된다. 하나의 상보적 리일린 구축물은 Rln-Res 단백질과 동일한 방식으로 표지된다; 그러나, 그것은 절단을 위한 두 개의 변경된 자리를 함유하지 않는다 (리일린 절단 불안정성; 도 34). 두 개의 자리 모두가 돌연변이되도록 생성된 표지된 단편 (음성 대조군 구축물) 및 ApoER2 및 VLDLR 에 결합하는 것으로 밝혀진 표지된 R3-6 단편 (잠재적 양성 대조군) 이 포함된다. 리일린 구축물은 외인성 리일린의 나중의 인지를 허용하는 N-말단 폴리히스티딘 표지 및/또는 C-말단 Myc 표지를 함유하는 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 정확한 절단 자리는 정제된 전장 리일린을 사용하여 tPA 또는 MMP-9 와 반응시켜 식별될 수 있고, 그러므로 결과적인 단편은 단리될 수 있다.
리일린은 tPA 및 MMP-9 둘 모두에 의해 가공되어 생체내에서 발견되는 주요 리일린 단편 생성물을 생성하며, 이는 도 35(A)-(C) 에서 보여진다. 보여지는 바와 같이, 무세포 조건 하에 tPA 는 370 kDa (N-R6) 및 80 kDa (R7-8) 단편을 증가시키며, 이는 도 24(A) 에서 보여지며, 이는 tPA 가 리일린을 R6-R7 사이에서 절단한다는 것을 시사하며, 이는 도 27 에서 보여진다. 플라스민에 의한 리일린의 절단은 이전에 알려지지 않은 정체의 다양한 생성물 및 180 kDa 단편의 특정한 체류를 초래한다. 일차 뉴런에 대한 재조합 tPA 의 적용은 전장으로부터 370 및 180 kDa 형태로의 세포외 리일린의 완전한 전환, 및 세포내 180 kDa 리일린의 감소를 초래했다. 게다가, MMP-9 는 370 kDa (N-R6) 및 180 kDa (N-R2) 단편 둘 모두, 뿐만 아니라, 도 24(B) & (C) 에서 보여지는 바와 같은, 잘 알려진 180 kDa 단편 바로 아래에서 발견되고, 도 24(D) & (E) 에서 보여지는 바와 같은, MMP9 의 저해에 의해 확인되는 단편을 증가시킨다. 무세포 조건 하에서의 이들 결과는 MMP-9 가 리일린을 절단 자리, R2-3 및 R6-7 둘 모두에서 절단할 수 있다는 것을 지지한다; 그러나, 일차 뉴런에 대한 MMP-9 의 적용은 세포 내 180 kDa 단편의 특정한 축적을 초래했고, 24 시간 동안 MMP-9 저해는 전장 세포성 리일린의 극적 증가 및 세포성 180 kDa 리일린의 감소를 초래했다. 이들 결과는 정상적 조건 하에서, MMP-9 가 리일린을 R2-R3 사이에서 절단하는 것을 책임진다는 것을 시사하며, 이는 도 34 의 단편 맵에서 볼 수 있다. 종합하면, 이들 예비 데이타는 MMP-9 및 tPA 가 생체내에서 발견되는 주요 리일린 단편의 생성에 충분하다는 것을 시사한다. 구조의 분석은 리일린의 다양한 단편을 검출할 수 있는 항체를 식별했으며, 이는 도 36(A) & (B) 에서 보여진다. 해마에서의 리일린 단백질 가공은 시험관내 및 생체내 시냅스 활성에 취약하다. 또한 MMP-9 및 tPA 는 리일린 대사의 과정에 관여되는 것으로 보인다.
실시예 12
리일린은 특정 자리에서 절단되어 웨스턴 블롯 분석에 의해 쉽게 정량화되는 리일린 단편의 안정적 패턴을 초래한다. 이들 단편은 전장 리일린과 다른 독특한 특성을 갖는 잠재적 신호전달 분자에 해당한다. 안정적으로 트랜스펙션된 HEK293 세포로부터 정제된 재조합 리일린은 해마에서 발견되는 주요 단편과 동일한 크기의 단편을 함유한다. 재조합 리일린 단편 보체의 적용은 (1) AMPA 수용체 삽입을 촉진하고 NMDA 수용체 기능을 증가시킴으로써 시냅스 전달을 증가시키고, (2) 침묵 시냅스를 감소시키고, (3) 시냅스 형태를 변경하고 (4) LTP 를 향상시킬 수 있다 (Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 2007; 97:2312-2321; Qiu, S., K. M. Korwek, A. R. Pratt-Davis, M. Peters, M. Y. Bergman, and E. J. Weeber. 2006. Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem 85:228-242).
리일린에 노출 후에 ApoER 의 수용체 발현을 분석했다. 혼합된 해마 및 피질 뉴런 배양물을 제 18-19 배아일 (E) 마우스 배아로부터 수득했다. 세포를 고밀도 (~750 세포 mm-2) 로 플레이팅하고, B27 (Gibco BRL) 이 보충된 Neurobasal 배지 (Gibco BRL) 에서 성장시켰다. 80% 컨플루언스일 때 세포를 부차배양했다. 세포를 8 번째 부차배양한 후에, 5 nM 농도의 리일린 단편 hR3-6 을 배지에 첨가하고, 세포를 리일린 단편과 함께 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후에, 세포를 트립신화에 의해 수집하고, 배지로 세정하고, SDS-β-메르캅토에탄올계 용해 완충제를 사용하여 용해시켰다. 단백질을 각각의 세포 배양물로부터 수집하고, 25 g 을 SDS-PAGE 겔 상에 로딩했다. 전기영동 후에, 단백질을 나일론 막에 옮기고, 항-ApoER2 항체 (Sigma-Aldrich, LRP8, 토끼 항-hApoER2) 를 사용하여 프로브했다.
GST-RAP (수용체 연합되는 단백질) 에 의한 세포의 처리는 수용체 발현의 실질적 하락을 보여줬으며, 이는 도 37 에서 보여진다. 따라서, 리일린이 ApoER2 에 결합하는 능력의 차단은 ApoER2 발현을 하락을 유도한다. 그러나, 외인성 리일린에 대한 세포의 노출은 ApoER2 수용체 발현의 증가를 초래했다. 또한, 리일린 단편에 의한 뉴런 세포의 처리는 ApoEr2 의 발현을 용량-의존적 방식으로 증가시키며, 이는 도 38(A) & (B) 에서 보여진다.
전술한 설명에서, 기재된 모든 문헌, 조항, 또는 정보는 그 문헌, 조항, 또는 정보 또는 이의 임의의 조합이 공중이 이용가능한, 공중에 알려진, 당업계의 일반 지식의 일부였다는 것, 또는 우선일의 임의의 과제를 해결하기에 적절한 것으로 알려졌다는 것을 허용하지 않는다.
위에서 언급된 모든 문헌의 공개는 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 경우와 동일한 정도로, 각각 그것의 전문이, 참조로 본원에 명백히 포함된다.
신경 장애의 치료 방법의 특정 구현예가 기재되고 설명되었지만, 본 발명의 넓은 주제 및 원리에서 벗어나지 않으면서 변화 및 수정이 가능하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 하기 청구항은 본원에 기재된 본 발명의 일반적 및 구체적 특색 전부, 및, 언어에 따라, 그안에 포함되는 것으로 여겨질 본 발명의 범위의 모든 서술을 포괄하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> University of South Florida <120> Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders <130> 1372.1144 <140> PCT/US2017/045307 <141> 2017-08-03 <150> 63/370,519 <151> 2016-08-03 <150> 62/486,729 <151> 2017-04-18 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11580 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Full length Reelin <400> 1 cacgcgtggg ctcggcgggg gcccgctccc aggcccgctc ccgagcccgt tccgctcccg 60 tccgccttct tctcgccttc tctccgcgtg gctcctccgt cccggcgtct ccaaaactga 120 atgagcgagc ggcgcgtagg gcgscggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcatgga 180 gcgcagtggc tgggcccggc agactttcct cctagcgctg ttgctggggg cgacgctgag 240 ggcgcgcgcg gcggctggct attacccccg cttttcgccc ttctttttcc tgtgcaccca 300 ccacggggag ctggaagggg atggggagca gggcgaggtg ctcatttccc tgcatattgc 360 gggcaacccc acctactacg ttccgggaca agaataccat gtgacaattt caacaagcac 420 cttttttgac ggcttgctgg tgacaggact atacacatct acaagtgttc aggcatcaca 480 gagcattgga ggttccagtg ctttcggatt tgggatcatg tctgaccacc agtttggtaa 540 ccagtttatg tgcagtgtgg tagcctctca cgtgagtcac ctgcccacaa ccaacctcag 600 tttcatctgg attgctccac ctgcgggcac aggctgtgtg aatttcatgg ctacagcaac 660 acaccggggc caggttattt tcaaagatgc tttagcccag cagttgtgtg aacaaggagc 720 tccaacagat gtcactgtgc acccacatct agctgaaata catagtgaca gcattatcct 780 gagagatgac tttgactcct accaccaact gcaattaaat ccaaatatat gggttgaatg 840 taacaactgt gagactggag aacagtgtgg cgcgattatg catggcaatg ccgtcacctt 900 ctgtgaacca tatggcccac gagaactgat taccacaggc cttaatacaa caacagcttc 960 tgtcctccaa ttttccattg ggtcaggttc atgtcgcttt agttattcag accccagcat 1020 catcgtgtta tatgccaaga ataactctgc ggactggatt cagctagaga aaattagagc 1080 cccttccaat gtcagcacaa tcatccatat cctctacctt cctgaggacg ccaaagggga 1140 gaatgtccaa tttcagtgga agcaggaaaa tcttcgtgta ggtgaagtgt atgaagcctg 1200 ctgggcctta gataacatct tgatcatcaa ttcagctcac agacaagtcg ttttagaaga 1260 tagtctcgac ccagtggaca caggcaactg gcttttcttc ccaggagcta cagttaagca 1320 tagctgtcag tcagatggga actccattta tttccatgga aatgaaggca gcgagttcaa 1380 ttttgccacc accagggatg tagatctttc cacagaagat attcaagagc aatggtcaga 1440 agaatttgag agccagccta caggatggga tgtcttggga gctgtcattg gtacagaatg 1500 tggaacgata gaatcaggct tatcaatggt cttcctcaaa gatggagaga ggaaattatg 1560 cactccatcc atggacacta ccggttatgg gaacctgagg ttttactttg tgatgggagg 1620 aatttgtgac cctggaaatt ctcatgaaaa tgacataatc ctgtatgcaa aaattgaagg 1680 aagaaaagag catataacac tggataccct ttcctattcc tcatataagg ttccgtcttt 1740 ggtttctgtg gtcatcaatc ctgaacttca gactcctgct accaaatttt gtctcaggca 1800 aaagaaccat caaggacata ataggaatgt ctgggctgta gactttttcc atgtcttgcc 1860 tgttctccct tctacaatgt ctcacatgat acagttttcc atcaatctgg gatgtggaac 1920 gcatcagcct ggtaacagtg tcagcttgga attttctacc aaccatgggc gctcctggtc 1980 cctccttcac actgaatgct tacctgagat ctgtgctgga ccccacctcc cccacagcac 2040 tgtctactcc tctgaaaact acagtgggtg gaaccgaata acaattcccc ttcctaacgc 2100 agcactaacc cggaacacca ggattcgctg gagacaaaca ggaccaatcc ttggaaacat 2160 gtgggcaatt gataatgttt atattggccc gtcatgtctc aaattctgtt ctggcagagg 2220 acagtgcact agacatggtt gcaagtgtga ccctggattt tctggcccag cttgtgagat 2280 ggcatcccag acattcccaa tgtttatttc tgaaagcttt ggcagttcca ggctctcctc 2340 ttaccataac ttttactcta tccgtggtgc tgaagtcagc tttggttgtg gtgtcttggc 2400 cagtggtaag gccctggttt tcaacaaaga agggcggcgt cagctaatta catctttcct 2460 tgacagctca caatccaggt ttctccagtt cacactgaga ctggggagca aatctgttct 2520 gagcacgtgc agagcccctg atcagcctgg tgaaggagtt ttgctgcatt attcttatga 2580 taatgggata acttggaaac tcctggagca ttattcatat ctcagctatc atgagcccag 2640 aataatctcc gtagaactac caggtgatgc aaagcagttt ggaattcagt tcagatggtg 2700 gcaaccgtat cattcttccc agagagaaga tgtatgggct attgatgaga ttatcatgac 2760 atctgtgctt ttcaacagca ttagtcttga ctttaccaat cttgtggagg tcactcagtc 2820 tctgggattc taccttggaa atgttcagcc atactgtggc cacgactgga ccctttgttt 2880 tacaggagat tctaaacttg cctcaagtat gcgctatgtg gaaacacaat caatgcagat 2940 aggagcatcc tatatgattc agttcagttt ggtgatggga tgtggccaga aatacacccc 3000 acacatggac aaccaggtga agctggagta ctcaaccaac cacggcctta cctggcacct 3060 cgtccaagaa gaatgccttc caagtatgcc aagttgtcag gaatttacat cagcaagtat 3120 ttaccatgcc agtgagttta cacagtggag gagagtcata gtgcttcttc cccagaaaac 3180 ttggtccagt gctacccgtt tccgctggag ccagagctat tacacagctc aagacgagtg 3240 ggctttggac agcatttaca ttgggcagca gtgccccaac atgtgcagtg ggcatggctc 3300 atgcgatcat ggcatatgca ggtgtgacca ggggtaccaa ggcactgaat gccacccaga 3360 agctgccctt ccgtccacaa ttatgtcaga ttttgagaac cagaatggct gggagtctga 3420 ctggcaagaa gttattgggg gagaaattgt aaaaccagaa caagggtgtg gtgtcatctc 3480 ttctggatca tctctgtact tcagcaaggc tgggaaaaga cagctggtga gttgggacct 3540 ggatacttct tgggtggact ttgtccagtt ctacatccag ataggcggag agagtgcttc 3600 atgcaacaag cctgacagca gagaggaggg cgtcctcctt cagtacagca acaatggggg 3660 catccagtgg cacctgctag cagagatgta cttttcagac ttcagcaaac ccagatttgt 3720 ctatctggag cttccagctg ctgccaagac cccttgcacc aggttccgct ggtggcagcc 3780 cgtgttctca ggggaggact atgaccagtg ggcagtcgat gacatcatca ttctgtccga 3840 gaagcagaag cagatcatcc cagttatcaa tccaacttta cctcagaact tttatgagaa 3900 gccagctttt gattacccta tgaatcagat gagtgtgtgg ttgatgttgg ctaatgaagg 3960 aatggttaaa aatgaaacct tctgtgctgc cacaccatca gcaatgatat ttggaaaatc 4020 agatggagat cgatttgcag taactcgaga tttgaccctg aaacctggat atgtgctaca 4080 gttcaagcta aacataggtt gtgccaatca attcagcagt actgctccag ttcttcttca 4140 gtactctcat gatgctggta tgtcctggtt tctggtgaaa gaaggctgtt acccggcttc 4200 tgcaggcaaa ggatgcgaag gaaactccag agaactaagt gagcccacca tgtatcacac 4260 aggggacttt gaagaatgga caagaatcac cattgttatt ccaaggtctc ttgcatccag 4320 caagaccaga ttccgatgga tccaggagag cagctcacag aaaaacgtgc ctccatttgg 4380 tttagatgga gtgtacatat ccgagccttg tcccagttac tgcagtggcc atggggactg 4440 catttcagga gtgtgtttct gtgacctggg atatactgct gcacaaggaa cctgtgtgtc 4500 aaatgtcccc aatcacaatg agatgttcga taggtttgag gggaagctca gccctctgtg 4560 gtacaagata acaggtgccc aggttggaac tggctgtgga acacttaacg atggcaaatc 4620 tctctacttc aatggccctg ggaaaaggga agcccggacg gtccctctgg acaccaggaa 4680 tatcagactt gttcaatttt atatacaaat tggaagcaaa acttcaggca ttacctgcat 4740 caaaccaaga actagaaatg aagggcttat tgttcagtat tcaaatgaca atgggatact 4800 ctggcatttg cttcgagagt tggacttcat gtccttcctg gaaccacaga tcatttccat 4860 tgacctgcca caggacgcga agacacctgc aacggcattt cgatggtggc aaccgcaaca 4920 tgggaagcat tcagcccagt gggctttgga tgatgttctt ataggaatga atgacagctc 4980 tcaaactgga tttcaagaca aatttgatgg ctctatagat ttgcaagcca actggtatcg 5040 aatccaagga ggtcaagttg atattgactg tctctctatg gatactgctc tgatattcac 5100 tgaaaacata ggaaaacctc gttatgctga gacctgggat tttcatgtgt cagcatctac 5160 ctttttgcag tttgaaatga gcatgggctg tagcaagccc ttcagcaact cccacagtgt 5220 acagctccag tattctctga acaatggcaa ggactggcat cttgtcaccg aagagtgtgt 5280 tcctccaacc attggctgtc tgcattacac ggaaagttca atttacacct cggaaagatt 5340 ccagaattgg aagcggatca ctgtctacct tccactctcc accatttctc ccaggacccg 5400 gttcagatgg attcaggcca actacactgt gggggctgat tcctgggcga ttgataatgt 5460 tgtactggcc tcagggtgcc cttggatgtg ctcaggacga gggatttgtg atgctggacg 5520 ctgtgtgtgt gaccggggct ttggtggacc ctattgtgtt cctgttgttc ctctgccctc 5580 gattcttaaa gacgatttca atgggaattt acatcctgac ctttggcctg aagtgtatgg 5640 tgcagagagg gggaatctga atggtgaaac catcaaatct ggaacatctc taatttttaa 5700 aggggaagga ctaaggatgc ttatttcaag agatctagat tgtacaaata caatgtatgt 5760 ccagttttca cttagattta tagcaaaaag taccccagag agatctcact ctattctgtt 5820 acaattctcc atcagtggag gaatcacttg gcacctgatg gatgaatttt actttcctca 5880 aacaacgaat atacttttca tcaatgttcc cttgccatac actgcccaaa ccaatgctac 5940 aagattcaga ctctggcaac cttataataa cggtaagaaa gaagaaatct ggattgttga 6000 tgacttcatt atcgatggaa ataatgtaaa caaccctgtg atgctcttgg atacatttga 6060 ttttgggccc agagaagaca attggttttt ctatcctggt ggtaacatcg gtctttattg 6120 tccatattct tcaaaggggg cacctgaaga agattcagct atggtgtttg tttcaaatga 6180 agttggtgag cattccatta ccacccgtga cctaaatgtg aatgagaaca ccatcataca 6240 atttgagatc aacgttggct gttcgactga tagctcatcc gcggatccag tgagactgga 6300 attttcaagg gacttcgggg cgacctggca ccttctgctg cccctctgct accacagcag 6360 cagccacgtc agctctttat gctccaccga gcaccacccc agcagcacct actacgcagg 6420 aaccatgcag ggctggagga gggaggtcgt gcactttggg aagctgcacc tttgtggatc 6480 tgtccgtttc agatggtacc agggatttta ccctgccggc tctcagccag tgacatgggc 6540 cattgataat gtctacatcg gtccccagtg tgaggagatg tgtaatggac aggggagctg 6600 tatcaatgga accaaatgta tatgtgaccc tggctactca ggtccaacct gtaaaataag 6660 caccaaaaat cctgattttc tcaaagatga tttcgaaggt cagctagaat ctgatagatt 6720 cttattaatg agtggtggga aaccatctcg aaagtgtgga atcctttcta gtggaaacaa 6780 cctctttttc aatgaagatg gcttgcgcat gttgatgaca cgagacctgg atttatcaca 6840 tgctagattt gtgcagttct tcatgagact gggatgtggt aaaggcgttc ctgaccccag 6900 gagtcaaccc gtgctcctac agtattctct caacggtggc ctctcgtgga gtcttcttca 6960 ggagttcctt ttcagcaatt ccagcaatgt gggcaggtac attgccctgg agataccctt 7020 gaaagcccgt tctggttcta ctcgccttcg ctggtggcaa ccgtctgaga atgggcactt 7080 ctacagcccc tgggttatcg atcagattct tattggagga aatatttctg gtaatacggt 7140 cttggaagat gatttcacaa cccttgatag taggaaatgg ctgcttcacc caggaggcac 7200 caagatgccc gtgtgtggct ctactggtga tgccctggtc ttcattgaaa aggccagcac 7260 ccgttacgtg gtcagcacag acgttgccgt gaatgaggat tccttcctac agatagactt 7320 cgctgcctcc tgctcagtca cagactcttg ttatgcgatt gaattggaat actcagtaga 7380 tcttggattg tcatggcacc cattggtaag ggactgtctg cctaccaatg tggaatgcag 7440 tcgctatcat ctgcaacgga tcctggtgtc agacactttc aacaagtgga ctagaatcac 7500 tctgcctctc cctccttata ccaggtccca agccactcgt ttccgttggc atcaaccagc 7560 tccttttgac aagcagcaga catgggcaat agataatgtc tatatcgggg atggctgcat 7620 agacatgtgc agtggccatg ggagatgcat ccagggaaac tgcgtctgtg atgaacagtg 7680 gggtggcctg tactgtgatg accccgagac ctctcttcca acccaactca aagacaactt 7740 caatcgagct ccatccagtc agaactggct gactgtgaac ggagggaaat tgagtacagt 7800 gtgtggagcc gtggcgtcgg gaatggctct ccatttcagt gggggttgta gtcgattatt 7860 agtcactgtg gatctaaacc tcactaatgc tgagttcatc caattttact tcatgtatgg 7920 gtgcctgatt acaccaaaca accgtaacca aggtgttctc ttggaatatt ctgtcaatgg 7980 aggcattacc tggaacctgc tcatggagat tttctatgac cagtacagta agcccggatt 8040 tgtgaatatc cttctccctc ctgatgctaa agagattgcc actcgcttcc gctggtggca 8100 gccaagacat gacggcctgg atcagaacga ctgggccatt gacaatgtcc tcatctcagg 8160 ctctgctgac caaaggaccg ttatgctgga caccttcagc agcgccccag taccccagca 8220 cgagcgctcc cctgcagatg ccggccctgt cgggaggatc gcctttgaca tgtttatgga 8280 agacaaaact tcagtgaatg agcactggct attccatgat gattgtacag tagaaagatt 8340 ctgtgactcc cctgatggtg tgatgctctg tggcagtcat gatggacggg aggtgtatgc 8400 agtgacccat gacctgactc ccactgaagg ctggattatg caattcaaga tctcagttgg 8460 atgtaaggtg tctgaaaaaa ttgcccagaa tcaaattcat gtgcagtatt ctactgactt 8520 cggtgtgagt tggaattatc tggtccctca gtgcttgcct gctgacccaa aatgctctgg 8580 aagtgtttct cagccatctg tattctttcc aactaaaggg tggaaaagga tcacctaccc 8640 acttcctgaa agcttagtgg gaaatccggt aaggtttagg ttctatcaga agtactcaga 8700 catgcagtgg gcaatcgata atttctacct gggccctgga tgcttggaca actgcagggg 8760 ccatggagat tgcttaaggg aacagtgcat ctgtgatccg ggatactcag ggccaaactg 8820 ctacttgacc cacactctga agactttcct gaaggaacgc tttgacagtg aagaaatcaa 8880 acctgactta tggatgtcct tagaaggtgg aagtacttgc actgagtgtg gaattcttgc 8940 cgaggacact gcactctatt ttgggggatc cactgtgaga caagcggtta cacaagattt 9000 ggatcttcga ggtgcaaagt tcctgcaata ctgggggcgc atcggtagtg agaacaacat 9060 gacctcttgc catcgtccca tctgccggaa ggaaggcgtg ctgttggact actctaccga 9120 tggaggaatt acctggactt tgctccatga gatggattac cagaaataca tttctgttag 9180 acacgactac atacttcttc ctgaagatgc cctcaccaac acaactcgac ttcgctggtg 9240 gcagcctttt gtgatcagca atggaattgt ggtctctggg gtggagcgtg ctcagtgggc 9300 actggacaac attttgattg gtggagcaga aatcaatccc agccaattgg tggacacttt 9360 tgatgatgaa ggcacttccc atgaagaaaa ctggagtttt taccctaatg ctgtaaggac 9420 agcaggattt tgtggcaatc catcctttca cctctattgg ccaaataaaa agaaggacaa 9480 gactcacaat gctctctcct cccgagaact cattatacag ccaggataca tgatgcagtt 9540 taaaattgtg gtgggttgtg aagccacttc ttgtggtgac cttcattccg taatgctgga 9600 atacactaag gatgcaagat cggattcctg gcagctcgta cagacccagt gccttccttc 9660 ctcttctaac agcattggct gctccccttt ccagttccat gaagccacca tctacaactc 9720 tgtcaacagc tcaagctgga aaagaatcac catccagctg cctgaccatg tctcctctag 9780 tgcaacacag ttccgctgga tccagaaggg agaagaaact gagaagcaaa gctgggcaat 9840 tgaccacgtg tacattggag aggcttgccc caagctctgc agcgggcacg gatactgcac 9900 gaccggtgcc atctgcatct gcgacgagag cttccaaggt gatgactgct ctgttttcag 9960 tcacgacctt cccagttata ttaaagataa ttttgagtcc gcaagagtca ccgaggcaaa 10020 ctgggagacc attcaaggtg gagtcatagg aagtggctgt gggcagctgg ccccctacgc 10080 ccatggagac tcactgtact ttaatggctg tcagatcagg caagcagcta ccaagcctct 10140 ggatctcact cgagcaagca aaatcatgtt tgttttgcaa attgggagca tgtcgcagac 10200 ggacagctgc aacagtgacc tgagtggccc ccacgctgtg gacaaggcgg tgctgctgca 10260 atacagcgtc aacaacggga tcacctggca tgtcatcgcc cagcaccagc caaaggactt 10320 cacacaagct cagagagtgt cttacaatgt ccccctggag gcacggatga aaggagtctt 10380 actgcgctgg tggcaaccac gccacaatgg aacaggtcat gatcaatggg ctttggacca 10440 tgtggaggtc gtcctagtaa gcactcgcaa acaaaattac atgatgaatt tttcacgaca 10500 acatgggctc agacatttct acaacagaag acgaaggtca cttaggcgat acccatgaag 10560 aatcaaaaag tttatttttt ttcttccaac atgtgatgtg ttgctctcca ttcttttaaa 10620 tctcgcacta catctgatat caggaaatat ctgtgaagga cttggtgatt acctgaaagc 10680 ccttctcaag accgagtgta caccactttc ccacactgtg aactaatgac aagtgactta 10740 tttgctcata agtaaatgtc ttcatgttga tgtgtccgtg aaagttgtga tctgttgtaa 10800 tatcagttac agtggcagta ttgacaataa gaaacagttt aacagaaaaa tgaaatttaa 10860 gcacaaaaaa tttaagagat tttatgttta aaatggcatt tagcacagta tttaacattc 10920 ttggtcacaa agctatttaa gtggactgta tttcagctat gtctcatgtt ttatatgatt 10980 aaattatcat tgtttgtcct ttatgtattc tcttctacaa tacaacacat tgaaactgta 11040 tttacttgtt atgttgtaat attttgctgc tgaatttggg gctacttata ttctgcagaa 11100 aattaattga aatacctatt caagaagata gttgtaaaga tattgtatct cctttaatat 11160 actccttaaa aatgtatgtt ggtttagcgt tgttttgtgg ataagaaaaa tgcttgaccc 11220 tgaaatattt tctactttaa attgtggatg aagaccctat ctcccacaaa taagttccca 11280 tttccttgtc taaagatctt tttttaagtg ttctgtggct gatttactaa cagtaactgc 11340 cattttttgt ctgtgataac agagtgattt gtaaaacagt ggttgttttt tcattgtgtt 11400 ttcttcgtgg attgtttttt ctgcgggtca tattcatacc ttctgatgaa gttgtacaac 11460 accagcaaca ttataatggc cctgtagctc tgaatgctat ttgtgtaact gaaaggttgc 11520 actctagggt gaaccaagct ataaaagccc atgcttaaat aaaaattatg tccaaaagcc 11580 <210> 2 <211> 729 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat 3 <400> 2 ttcagcagta ctgctccagt tcttcttcag tactctcatg atgctggtat gtcctggttt 60 ctggtgaaag aaggctgtta cccggcttct gcaggcaaag gatgcgaagg aaactccaga 120 gaactaagtg agcccaccat gtatcacaca ggggactttg aagaatggac aagaatcacc 180 attgttattc caaggtctct tgcatccagc aagaccagat tccgatggat ccaggagagc 240 agctcacaga aaaacgtgcc tccatttggt ttagatggag tgtacatatc cgagccttgt 300 cccagttact gcagtggcca tggggactgc atttcaggag tgtgtttctg tgacctggga 360 tatactgctg cacaaggaac ctgtgtgtca aatgtcccca atcacaatga gatgttcgat 420 aggtttgagg ggaagctcag ccctctgtgg tacaagataa caggtgccca ggttggaact 480 ggctgtggaa cacttaacga tggcaaatct ctctacttca atggccctgg gaaaagggaa 540 gcccggacgg tccctctgga caccaggaat atcagacttg ttcaatttta tatacaaatt 600 ggaagcaaaa cttcaggcat tacctgcatc aaaccaagaa ctagaaatga agggcttatt 660 gttcagtatt caaatgacaa tgggatactc tggcatttgc ttcgagagtt ggacttcatg 720 tccttcctg 729 <210> 3 <211> 690 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat 4 <400> 3 cccttcagca actcccacag tgtacagctc cagtattctc tgaacaatgg caaggactgg 60 catcttgtca ccgaagagtg tgttcctcca accattggct gtctgcatta cacggaaagt 120 tcaatttaca cctcggaaag attccagaat tggaagcgga tcactgtcta ccttccactc 180 tccaccattt ctcccaggac ccggttcaga tggattcagg ccaactacac tgtgggggct 240 gattcctggg cgattgataa tgttgtactg gcctcagggt gcccttggat gtgctcagga 300 cgagggattt gtgatgctgg acgctgtgtg tgtgaccggg gctttggtgg accctattgt 360 gttcctgttg ttcctctgcc ctcgattctt aaagacgatt tcaatgggaa tttacatcct 420 gacctttggc ctgaagtgta tggtgcagag agggggaatc tgaatggtga aaccatcaaa 480 tctggaacat ctctaatttt taaaggggaa ggactaagga tgcttatttc aagagatcta 540 gattgtacaa atacaatgta tgtccagttt tcacttagat ttatagcaaa aagtacccca 600 gagagatctc actctattct gttacaattc tccatcagtg gaggaatcac ttggcacctg 660 atggatgaat tttactttcc tcaaacaacg 690 <210> 4 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat 5 <400> 4 gatagctcat ccgcggatcc agtgagactg gaattttcaa gggacttcgg ggcgacctgg 60 caccttctgc tgcccctctg ctaccacagc agcagccacg tcagctcttt atgctccacc 120 gagcaccacc ccagcagcac ctactacgca ggaaccatgc agggctggag gagggaggtc 180 gtgcactttg ggaagctgca cctttgtgga tctgtccgtt tcagatggta ccagggattt 240 taccctgccg gctctcagcc agtgacatgg gccattgata atgtctacat cggtccccag 300 tgtgaggaga tgtgtaatgg acaggggagc tgtatcaatg gaaccaaatg tatatgtgac 360 cctggctact caggtccaac ctgtaaaata agcaccaaaa atcctgattt tctcaaagat 420 gatttcgaag gtcagctaga atctgataga ttcttattaa tgagtggtgg gaaaccatct 480 cgaaagtgtg gaatcctttc tagtggaaac aacctctttt tcaatgaaga tggcttgcgc 540 atgttgatga cacgagacct ggatttatca catgctagat ttgtgcagtt cttcatgaga 600 ctgggatgtg gtaaaggcgt tcctgacccc aggagtcaac ccgtgctcct acagtattct 660 ctcaacggtg gcctctcgtg gagtcttctt caggagttcc ttttcagcaa ttccagc 717 <210> 5 <211> 693 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat 6 <400> 5 gtcacagact cttgttatgc gattgaattg gaatactcag tagatcttgg attgtcatgg 60 cacccattgg taagggactg tctgcctacc aatgtggaat gcagtcgcta tcatctgcaa 120 cggatcctgg tgtcagacac tttcaacaag tggactagaa tcactctgcc tctccctcct 180 tataccaggt cccaagccac tcgtttccgt tggcatcaac cagctccttt tgacaagcag 240 cagacatggg caatagataa tgtctatatc ggggatggct gcatagacat gtgcagtggc 300 catgggagat gcatccaggg aaactgcgtc tgtgatgaac agtggggtgg cctgtactgt 360 gatgaccccg agacctctct tccaacccaa ctcaaagaca acttcaatcg agctccatcc 420 agtcagaact ggctgactgt gaacggaggg aaattgagta cagtgtgtgg agccgtggcg 480 tcgggaatgg ctctccattt cagtgggggt tgtagtcgat tattagtcac tgtggatcta 540 aacctcacta atgctgagtt catccaattt tacttcatgt atgggtgcct gattacacca 600 aacaaccgta accaaggtgt tctcttggaa tattctgtca atggaggcat tacctggaac 660 ctgctcatgg agattttcta tgaccagtac agt 693 <210> 6 <211> 357 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat Loop Region 3-4 <400> 6 gaaccacaga tcatttccat tgacctgcca caggacgcga agacacctgc aacggcattt 60 cgatggtggc aaccgcaaca tgggaagcat tcagcccagt gggctttgga tgatgttctt 120 ataggaatga atgacagctc tcaaactgga tttcaagaca aatttgatgg ctctatagat 180 ttgcaagcca actggtatcg aatccaagga ggtcaagttg atattgactg tctctctatg 240 gatactgctc tgatattcac tgaaaacata ggaaaacctc gttatgctga gacctgggat 300 tttcatgtgt cagcatctac ctttttgcag tttgaaatga gcatgggctg tagcaag 357 <210> 7 <211> 381 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat Loop Region 4-5 <400> 7 aatatacttt tcatcaatgt tcccttgcca tacactgccc aaaccaatgc tacaagattc 60 agactctggc aaccttataa taacggtaag aaagaagaaa tctggattgt tgatgacttc 120 attatcgatg gaaataatgt aaacaaccct gtgatgctct tggatacatt tgattttggg 180 cccagagaag acaattggtt tttctatcct ggtggtaaca tcggtcttta ttgtccatat 240 tcttcaaagg gggcacctga agaagattca gctatggtgt ttgtttcaaa tgaagttggt 300 gagcattcca ttaccacccg tgacctaaat gtgaatgaga acaccatcat acaatttgag 360 atcaacgttg gctgttcgac t 381 <210> 8 <211> 351 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Repeat Loop Region 5-6 <400> 8 aatgtgggca ggtacattgc cctggagata cccttgaaag cccgttctgg ttctactcgc 60 cttcgctggt ggcaaccgtc tgagaatggg cacttctaca gcccctgggt tatcgatcag 120 attcttattg gaggaaatat ttctggtaat acggtcttgg aagatgattt cacaaccctt 180 gatagtagga aatggctgct tcacccagga ggcaccaaga tgcccgtgtg tggctctact 240 ggtgatgccc tggtcttcat tgaaaaggcc agcacccgtt acgtggtcag cacagacgtt 300 gccgtgaatg aggattcctt cctacagata gacttcgctg cctcctgctc a 351 <210> 9 <211> 1895 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Fragment R3 and R6 <400> 9 aagcttccac catggagcgc agtggctggg cccggcagac tttcctccta gcgctgttgc 60 tgggggcgac gctgagggcg cgcgcgttca gcagtactgc tccagttctt cttcagtact 120 ctcatgatgc tggtatgtcc tggtttctgg tgaaagaagg ctgttacccg gcttctgcag 180 gcaaaggatg cgaaggaaac tccagagaac taagtgagcc caccatgtat cacacagggg 240 actttgaaga atggacaaga atcaccattg ttattccaag gtctcttgca tccagcaaga 300 ccagattccg atggatccag gagagcagct cacagaaaaa cgtgcctcca tttggtttag 360 atggagtgta catatccgag ccttgtccca gttactgcag tggccatggg gactgcattt 420 caggagtgtg tttctgtgac ctgggatata ctgctgcaca aggaacctgt gtgtcaaatg 480 tccccaatca caatgagatg ttcgataggt ttgaggggaa gctcagccct ctgtggtaca 540 agataacagg tgcccaggtt ggaactggct gtggaacact taacgatggc aaatctctct 600 acttcaatgg ccctgggaaa agggaagccc ggacggtccc tctggacacc aggaatatca 660 gacttgttca attttatata caaattggaa gcaaaacttc aggcattacc tgcatcaaac 720 caagaactag aaatgaaggg cttattgttc agtattcaaa tgacaatggg atactctggc 780 atttgcttcg agagttggac ttcatgtcct tcctggaacc acagatcatt tccattgacc 840 tgccacagga cgcgaagaca cctgcaacgg catttcgatg gtggcaaccg caacatggga 900 agcattcagc ccagtgggct ttggatgatg ttcttatagg aatgaatgac agctctcaaa 960 ctggatttca agacaaattt gatggctcta taacccttga tagtaggaaa tggctgcttc 1020 acccaggagg caccaagatg cccgtgtgtg gctctactgg tgatgccctg gtcttcattg 1080 aaaaggccag cacccgttac gtggtcagca cagacgttgc cgtgaatgag gattccttcc 1140 tacagataga cttcgctgcc tcctgctcag tcacagactc ttgttatgcg attgaattgg 1200 aatactcagt agatcttgga ttgtcatggc acccattggt aagggactgt ctgcctacca 1260 atgtggaatg cagtcgctat catctgcaac ggatcctggt gtcagacact ttcaacaagt 1320 ggactagaat cactctgcct ctccctcctt ataccaggtc ccaagccact cgtttccgtt 1380 ggcatcaacc agctcctttt gacaagcagc agacatgggc aatagataat gtctatatcg 1440 gggatggctg catagacatg tgcagtggcc atgggagatg catccaggga aactgcgtct 1500 gtgatgaaca gtggggtggc ctgtactgtg atgaccccga gacctctctt ccaacccaac 1560 tcaaagacaa cttcaatcga gctccatcca gtcagaactg gctgactgtg aacggaggga 1620 aattgagtac agtgtgtgga gccgtggcgt cgggaatggc tctccatttc agtgggggtt 1680 gtagtcgatt attagtcact gtggatctaa acctcactaa tgctgagttc atccaatttt 1740 acttcatgta tgggtgcctg attacaccaa acaaccgtaa ccaaggtgtt ctcttggaat 1800 attctgtcaa tggaggcatt acctggaacc tgctcatgga gattttctat gaccagtaca 1860 gtgattacaa ggatgacgac gataagtgac tcgag 1895 <210> 10 <211> 617 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Protein Fragment R3 and R6 <400> 10 MERSGWARQT FLLALLLGAT LRARAFSSTA PVLLQYSHDA GMSWFLVKEG CYPASAGKGC 60 EGNSRELSEP TMYHTGDFEE WTRITIVIPR SLASSKTRFR WIQESSSQKN VPPFGLDGVY 120 ISEPCPSYCS GHGDCISGVC FCDLGYTAAQ GTCVSNVPNH NEMFDRFEGK LSPLWYKITG 180 AQVGTGCGTL NDGKSLYFNG PGKREARTVP LDTRNIRLVQ FYIQIGSKTS GITCIKPRTR 240 NEGLIVQYSN DNGILWHLLR ELDFMSFLEP QIISIDLPQD AKTPATAFRW WQPQHGKHSA 300 QWALDDVLIG MNDSSQTGFQ DKFDGSITLD SRKWLLHPGG TKMPVCGSTG DALVFIEKAS 360 TRYVVSTDVA VNEDSFLQID FAASCSVTDS CYAIELEYSV DLGLSWHPLV RDCLPTNVEC 420 SRYHLQRILV SDTFNKWTRI TLPLPPYTRS QATRFRWHQP APFDKQQTWA IDNVYIGDGC 480 IDMCSGHGRC IQGNCVCDEQ WGGLYCDDPE TSLPTQLKDN FNRAPSSQNW LTVNGGKLST 540 VCGAVASGMA LHFSGGCSRL LVTVDLNLTN AEFIQFYFMY GCLITPNNRN QGVLLEYSVN 600 GGITWNLLME IFYDQYS 617 <210> 11 <211> 1937 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Fragment R3 and R5 <400> 11 aagcttccac catggagcgc agtggctggg cccggcagac tttcctccta gcgctgttgc 60 tgggggcgac gctgagggcg cgcgcgttca gcagtactgc tccagttctt cttcagtact 120 ctcatgatgc tggtatgtcc tggtttctgg tgaaagaagg ctgttacccg gcttctgcag 180 gcaaaggatg cgaaggaaac tccagagaac taagtgagcc caccatgtat cacacagggg 240 actttgaaga atggacaaga atcaccattg ttattccaag gtctcttgca tccagcaaga 300 ccagattccg atggatccag gagagcagct cacagaaaaa cgtgcctcca tttggtttag 360 atggagtgta catatccgag ccttgtccca gttactgcag tggccatggg gactgcattt 420 caggagtgtg tttctgtgac ctgggatata ctgctgcaca aggaacctgt gtgtcaaatg 480 tccccaatca caatgagatg ttcgataggt ttgaggggaa gctcagccct ctgtggtaca 540 agataacagg tgcccaggtt ggaactggct gtggaacact taacgatggc aaatctctct 600 acttcaatgg ccctgggaaa agggaagccc ggacggtccc tctggacacc aggaatatca 660 gacttgttca attttatata caaattggaa gcaaaacttc aggcattacc tgcatcaaac 720 caagaactag aaatgaaggg cttattgttc agtattcaaa tgacaatggg atactctggc 780 atttgcttcg agagttggac ttcatgtcct tcctggaacc acagatcatt tccattgacc 840 tgccacagga cgcgaagaca cctgcaacgg catttcgatg gtggcaaccg caacatggga 900 agcattcagc ccagtgggct ttggatgatg ttcttatagg aatgaatgac agctctcaaa 960 ctggatttca agacaaattt gatggctcta tagatgacaa ttggtttttc tatcctggtg 1020 gtaacatcgg tctttattgt ccatattctt caaagggggc acctgaagaa gattcagcta 1080 tggtgtttgt ttcaaatgaa gttggtgagc attccattac cacccgtgac ctaaatgtga 1140 atgagaacac catcatacaa tttgagatca acgttggctg ttcgactgat agctcatccg 1200 cggatccagt gagactggaa ttttcaaggg acttcggggc gacctggcac cttctgctgc 1260 ccctctgcta ccacagcagc agccacgtca gctctttatg ctccaccgag caccacccca 1320 gcagcaccta ctacgcagga accatgcagg gctggaggag ggaggtcgtg cactttggga 1380 agctgcacct ttgtggatct gtccgtttca gatggtacca gggattttac cctgccggct 1440 ctcagccagt gacatgggcc attgataatg tctacatcgg tccccagtgt gaggagatgt 1500 gtaatggaca ggggagctgt atcaatggaa ccaaatgtat atgtgaccct ggctactcag 1560 gtccaacctg taaaataagc accaaaaatc ctgattttct caaagatgat ttcgaaggtc 1620 agctagaatc tgatagattc ttattaatga gtggtgggaa accatctcga aagtgtggaa 1680 tcctttctag tggaaacaac ctctttttca atgaagatgg cttgcgcatg ttgatgacac 1740 gagacctgga tttatcacat gctagatttg tgcagttctt catgagactg ggatgtggta 1800 aaggcgttcc tgaccccagg agtcaacccg tgctcctaca gtattctctc aacggtggcc 1860 tctcgtggag tcttcttcag gagttccttt tcagcaattc cagcgattac aaggatgacg 1920 acgataagtg actcgag 1937 <210> 12 <211> 631 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Reelin Protein Fragment R3 and R5 <400> 12 MERSGWARQT FLLALLLGAT LRARAFSSTA PVLLQYSHDA GMSWFLVKEG CYPASAGKGC 60 EGNSRELSEP TMYHTGDFEE WTRITIVIPR SLASSKTRFR WIQESSSQKN VPPFGLDGVY 120 ISEPCPSYCS GHGDCISGVC FCDLGYTAAQ GTCVSNVPNH NEMFDRFEGK LSPLWYKITG 180 AQVGTGCGTL NDGKSLYFNG PGKREARTVP LDTRNIRLVQ FYIQIGSKTS GITCIKPRTR 240 NEGLIVQYSN DNGILWHLLR ELDFMSFLEP QIISIDLPQD AKTPATAFRW WQPQHGKHSA 300 QWALDDVLIG MNDSSQTGFQ DKFDGSIDDN WFFYPGGNIG LYCPYSSKGA PEEDSAMVFV 360 SNEVGEHSIT TRDLNVNENT IIQFEINVGC STDSSSADPV RLEFSRDFGA TWHLLLPLCY 420 HSSSHVSSLC STEHHPSSTY YAGTMQGWRR EVVHFGKLHL CGSVRFRWYQ GFYPAGSQPV 480 TWAIDNVYIG PQCEEMCNGQ GSCINGTKCI CDPGYSGPTC KISTKNPDFL KDDFEGQLES 540 DRFLLMSGGK PSRKCGILSS GNNLFFNEDG LRMLMTRDLD LSHARFVQFF MRLGCGKGVP 600 DPRSQPVLLQ YSLNGGLSWS LLQEFLFSNS S 631

Claims (64)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 하기로 이루어지는 2 내지 4 개의 리일린 반복체를 포함하는, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편을 발현하기 위한 바이러스 벡터:
    하나의 리일린 반복체 R3, 및 리일린 반복체 R4, R5 및 R6 로부터 선택되는 하나의 리일린 반복체, 또는
    하나의 리일린 반복체 R3, 및 리일린 반복체 R4 및 R5, 또는
    하나의 리일린 반복체 R3, 및 리일린 반복체 R4, R5 및 R6,
    여기서,
    리일린 반복체 R3 는 리일린 반복체 R4, R5 및 R6 에 대해 아미노 말단이고,
    리일린 반복체 R4 는, 존재하는 경우, 리일린 반복체 R5 및 R6 에 대해 아미노 말단이고,
    리일린 반복체 R5 는, 존재하는 경우, 리일린 반복체 R6 에 대해 아미노 말단이고,
    리일린 반복체 R3 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 2 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고,
    리일린 반복체 R4 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 3 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고,
    리일린 반복체 R5 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 4 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고,
    리일린 반복체 R6 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 5 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩됨.
  48. 제 47 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, 바이러스 벡터:
    리일린 반복체 R3 및 R4 사이에 위치하는, SEQ ID NO. 6 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 루프 영역,
    리일린 반복체 R4 및 R5 사이에 위치하는, SEQ ID NO. 7 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 루프 영역, 또는
    리일린 반복체 R5 및 R6 사이에 위치하는, SEQ ID NO. 8 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 루프 영역.
  49. 하기로 이루어지는 2 내지 3 개의 리일린 반복체를 포함하는, 활성 재조합 리일린 반복체 융합 단백질을 발현하기 위한 바이러스 벡터:
    하나의 리일린 반복체 R4, 및 리일린 반복체 R5 및 R6 로부터 선택되는 하나의 리일린 반복체, 또는
    하나의 리일린 반복체 R4, 및 2 개의 리일린 반복체 R5 및 R6,
    여기서,
    리일린 반복체 R4 는 리일린 반복체 R5 및 R6 에 대해 아미노 말단이고,
    리일린 반복체 R5 는, 존재하는 경우, 리일린 반복체 R6 에 대해 아미노 말단이고,
    리일린 반복체 R4 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 3 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고,
    리일린 반복체 R5 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 4 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고,
    리일린 반복체 R6 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 5 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩됨.
  50. 단일 리일린 반복체 R3 폴리펩티드를 포함하는, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편을 발현하기 위한 바이러스 벡터로서, 상기 리일린 반복체 R3 폴리펩티드는 SEQ ID NO. 2 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 바이러스 벡터.
  51. SEQ ID NO. 9 또는 11 의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편을 발현하기 위한 바이러스 벡터.
  52. 제 47 항, 제 49 항, 제 50 항 및 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터 (AAV) 인, 바이러스 벡터.
  53. 제 52 항에 있어서, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편은 리일린-의존적인 아포지질단백질 수용체 (ApoER) 활성화 및 신호전달을 유도하는, 바이러스 벡터.
  54. 제 53 항에 있어서, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편은 수지상 가시 밀도, 장기간 강화작용 및 시냅스 가소성을 증가시키는, 바이러스 벡터.
  55. 제 53 항에 있어서, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편은 신경계의 질환 또는 장애를 치료하는, 바이러스 벡터.
  56. 제 55 항에 있어서, 신경계의 질환 또는 장애는 알츠하이머병, 안젤만 증후군, 취약 X 증후군, 윌리엄 증후군, 레트 증후군, 다운 증후군, 자폐증, 양극성 장애, 우울증, 조현병, 또는 외상성 뇌 손상을 포함하는, 바이러스 벡터.
  57. 제 57 항에 있어서, 신경계의 질환 또는 장애는 학습 결핍을 야기하는, 바이러스 벡터.
  58. 제 52 항에 있어서, 아데노-관련 바이러스 벡터 (AAV) 는 AAV-9, AAV-5, AAV-4 및 AAV-1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
  59. 제 52 항에 있어서, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편은 인지 기능을 개선시키는, 바이러스 벡터.
  60. 제 52 항에 있어서, 활성 재조합 리일린 반복체 단백질 단편은 ApoER2 수용체 이합체화 및 세포외 조절되는 키나아제 1/2 (ERK1/2) 인산화를 증가시키는, 바이러스 벡터.
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
KR1020197006269A 2016-08-03 2017-08-03 신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물 KR102523237B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662370519P 2016-08-03 2016-08-03
US62/370,519 2016-08-03
US201762486729P 2017-04-18 2017-04-18
US62/486,729 2017-04-18
PCT/US2017/045307 WO2018027037A2 (en) 2016-08-03 2017-08-03 Reelin compositions for treatment of neurological disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190035842A KR20190035842A (ko) 2019-04-03
KR102523237B1 true KR102523237B1 (ko) 2023-04-18

Family

ID=61073666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197006269A KR102523237B1 (ko) 2016-08-03 2017-08-03 신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20190169246A1 (ko)
EP (1) EP3506927A4 (ko)
JP (1) JP7253800B2 (ko)
KR (1) KR102523237B1 (ko)
CN (1) CN109715194A (ko)
AU (1) AU2017306558A1 (ko)
BR (1) BR112019002204A8 (ko)
CA (1) CA3032697A1 (ko)
CO (1) CO2019001060A2 (ko)
IL (1) IL264603B2 (ko)
MX (1) MX2019001421A (ko)
NZ (1) NZ750291A (ko)
WO (1) WO2018027037A2 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4090344A4 (en) * 2020-01-17 2024-03-06 Univ South Florida METHODS OF TREATING FRAGILE X SYNDROME WITH REELIN
WO2023288325A2 (en) * 2021-07-16 2023-01-19 Ptc Therapeutics Inc. Recombinant reelin gene therapy
KR20240007846A (ko) 2022-07-08 2024-01-17 재단법인대구경북과학기술원 Ｒｅｅｌｉｎ을 발현하는 신경세포의 대량생산방법
WO2024081934A1 (en) * 2022-10-13 2024-04-18 The General Hospital Corporation Compositions and methods using reelin in alzheimer's disease

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6323177B1 (en) * 1999-06-16 2001-11-27 St. Jude Children's Research Hospital Interaction of reelin with very low density lipoprotein (VLDL) receptor for screening and therapies
US7510850B2 (en) * 2005-11-10 2009-03-31 Carnegie Institution Of Washington Isolation of the mitotic spindle matrix and its methods of use
WO2010091399A2 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 University Of South Florida Reelin rescues cognitive function
WO2013172964A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating amyloid deposits
EP2914281A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating proteinopathies
CA2918902C (en) 2013-07-26 2023-04-04 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
AU2015364636B9 (en) 2014-12-16 2021-12-02 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Gene therapy for Juvenile Batten Disease

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
European journal of Neuroscience, Vol. 41, pp. 1372-1380 (2015)*
Frontiers in Cellular Neuroscience, Vol. 10, No. 75, pp. 1-8 (2016.3)

Also Published As

Publication number Publication date
CA3032697A1 (en) 2018-02-08
CN109715194A (zh) 2019-05-03
EP3506927A2 (en) 2019-07-10
NZ750291A (en) 2021-07-30
WO2018027037A3 (en) 2018-03-01
BR112019002204A2 (pt) 2019-07-09
CO2019001060A2 (es) 2019-02-19
IL264603B2 (en) 2023-10-01
JP7253800B2 (ja) 2023-04-07
IL264603A (en) 2019-02-28
JP2019524775A (ja) 2019-09-05
EP3506927A4 (en) 2020-05-06
MX2019001421A (es) 2019-09-04
WO2018027037A2 (en) 2018-02-08
AU2017306558A1 (en) 2019-02-21
KR20190035842A (ko) 2019-04-03
US20190169246A1 (en) 2019-06-06
BR112019002204A8 (pt) 2019-10-01
IL264603B1 (en) 2023-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102523237B1 (ko) 신경 장애의 치료를 위한 리일린 조성물
Yoshiyama et al. Anti-inflammatory action of donepezil ameliorates tau pathology, synaptic loss, and neurodegeneration in a tauopathy mouse model
US10729744B2 (en) Reelin rescues cognitive function
JP2019513752A (ja) 神経変性疾患を治療するためのｔｄｐ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤
Jeong et al. Broad activation of the Parkin pathway induces synaptic mitochondrial deficits in early tauopathy
Creed et al. Analysis of hemisphere-dependent effects of unilateral intrastriatal injection of α-synuclein pre-formed fibrils on mitochondrial protein levels, dynamics, and function
Zhang et al. Tachykinin receptor 3 in the lateral habenula alleviates pain and anxiety comorbidity in mice
JP7077343B2 (ja) 操作された遺伝子を含む発現ベクター
EA045597B1 (ru) Композиции рилина для лечения неврологических расстройств
Andreou Glutamate in Migraine Neurobiology and Treatment
Astrocyte-Mediated ASNTR 2023 Abstracts
Mottolese Role of neuroinflammation in the pathophysiology of CDKL5 deficiency disorder
Sironi Loss of C9orf72 Function Impairs the Peripheral Neuromuscular System and Anticipates Symptoms in ALS Mice
Greco Deficiency in CCR5, a Mediator of Neuroinflammation, Normalizes Timp Levels, Working Memory, and Gamma Oscillation Power in APOE4 Targeted Replacement Mice
Matuszko Extracellular matrix regulation of GABA-ergic interneurons and schizophrenia
Bergamo Oral communications and posters: schedule and abstracts
Mensch Unraveling the physiopathological actions of the newly discovered Aη peptides in the brain
Gulisano A renewed vision for Amyloid beta and tau in Alzheimer s disease pathophysiology
KR20230059144A (ko) 알츠하이머병 모델 동물의 제조방법 및 그에 의해 제조된 알츠하이머병 모델 동물
CN114796493A (zh) 血管源性bace1作为脑小血管损伤相关疾病的治疗靶点的用途
Simon Re-expression of MeCP2 in early adulthood recovers cortical function in Rett syndrome
Njie Cellular and proteolytic studies of Alzheimer's disease amyloid beta peptide with microglia, stem cells and MMP9
Weeber et al. Reelin rescues congnitive function
Ferrer Ferrer Mental retardation-related protease neurotrypsin in spinogenesis, synaptic plasticity and learning
Lampe Impact of pleiotrophin gene therapy in 6-hydroxydopamine and AAV alpha-synuclein rodent models of Parkinson's disease

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant