EA045597B1 - Композиции рилина для лечения неврологических расстройств - Google Patents
Композиции рилина для лечения неврологических расстройств Download PDFInfo
- Publication number
- EA045597B1 EA045597B1 EA201990199 EA045597B1 EA 045597 B1 EA045597 B1 EA 045597B1 EA 201990199 EA201990199 EA 201990199 EA 045597 B1 EA045597 B1 EA 045597B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- reelin
- repeat
- fragment
- viral vector
- mice
- Prior art date
Links
- 102000043322 Reelin Human genes 0.000 title claims description 706
- 108700038365 Reelin Proteins 0.000 title claims description 696
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 34
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 title description 8
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 title description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 220
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 62
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 claims description 57
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 50
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 44
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 44
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 38
- 230000013016 learning Effects 0.000 claims description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 31
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 31
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 19
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 230000027928 long-term synaptic potentiation Effects 0.000 claims description 13
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 claims description 7
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 208000009575 Angelman syndrome Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006289 Rett Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 112
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 68
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 57
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 56
- 210000003520 dendritic spine Anatomy 0.000 description 52
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 52
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 51
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 45
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 45
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 39
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 38
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 37
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 35
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 34
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 32
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 32
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 32
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 31
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 31
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 30
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 30
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 29
- 101000686481 Homo sapiens Reelin Proteins 0.000 description 28
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 23
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 23
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 20
- 108010015340 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Proteins 0.000 description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 102000001851 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Human genes 0.000 description 18
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 18
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 description 18
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 18
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 18
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 18
- 102100039066 Very low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 17
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 101710177612 Very low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 16
- 108010000985 reelin receptor Proteins 0.000 description 16
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 16
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 14
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 14
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 101000686477 Mus musculus Reelin Proteins 0.000 description 14
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 14
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 14
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 14
- 101150105513 Dab1 gene Proteins 0.000 description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 13
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 13
- 102100040328 Zinc finger and BTB domain-containing protein 12 Human genes 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 13
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 13
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 13
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 12
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000012549 training Methods 0.000 description 12
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 11
- 230000035045 associative learning Effects 0.000 description 11
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 11
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 230000003977 synaptic function Effects 0.000 description 11
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 11
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 10
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 10
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102100029458 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2A Human genes 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 9
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 9
- 108091008634 hepatocyte nuclear factors 4 Proteins 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 8
- 102100022630 Glutamate receptor ionotropic, NMDA 2B Human genes 0.000 description 8
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 8
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 8
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 210000001153 interneuron Anatomy 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 8
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 8
- CVYPRDPBCXSVBN-WDZFZDKYSA-N (5z)-5-[[5-[(4-chlorophenyl)methylsulfanyl]-1-methyl-3-(trifluoromethyl)pyrazol-4-yl]methylidene]-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-4-one Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1CSC=1N(C)N=C(C(F)(F)F)C=1\C=C1/SC(=S)NC1=O CVYPRDPBCXSVBN-WDZFZDKYSA-N 0.000 description 7
- 108091005663 ADAMTS5 Proteins 0.000 description 7
- 102000051389 ADAMTS5 Human genes 0.000 description 7
- 102000003678 AMPA Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108090000078 AMPA Receptors Proteins 0.000 description 7
- 206010001541 Akinesia Diseases 0.000 description 7
- OQEBIHBLFRADNM-UHFFFAOYSA-N D-iminoxylitol Natural products OCC1NCC(O)C1O OQEBIHBLFRADNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 7
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 7
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 7
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 7
- 230000003371 gabaergic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 7
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 102100040705 Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 Human genes 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 108091007169 meprins Proteins 0.000 description 6
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 5
- OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N Corticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 5
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 5
- 102000034570 NR1 subfamily Human genes 0.000 description 5
- 108020001305 NR1 subfamily Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 5
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 5
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N corticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 5
- 230000000848 glutamatergic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 5
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 5
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 5
- 108010031117 low density lipoprotein receptor-related protein 8 Proteins 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 4
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 4
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 4
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 4
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 4
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 4
- 102100028561 Disabled homolog 1 Human genes 0.000 description 4
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000915416 Homo sapiens Disabled homolog 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 4
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 4
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- OQEBIHBLFRADNM-UOWFLXDJSA-N (2r,3r,4r)-2-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol Chemical compound OC[C@H]1NC[C@@H](O)[C@@H]1O OQEBIHBLFRADNM-UOWFLXDJSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 3
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 3
- 208000036632 Brain mass Diseases 0.000 description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 3
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 3
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 206010049644 Williams syndrome Diseases 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 3
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 3
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 3
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 3
- 208000024714 major depressive disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000017511 neuron migration Effects 0.000 description 3
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 3
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 3
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 3
- 230000005236 sound signal Effects 0.000 description 3
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000009782 synaptic response Effects 0.000 description 3
- 201000008914 temporal lobe epilepsy Diseases 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000009750 upstream signaling Effects 0.000 description 3
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 3
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 2
- 108091005664 ADAMTS4 Proteins 0.000 description 2
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 2
- 238000010173 Alzheimer-disease mouse model Methods 0.000 description 2
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025454 Cyclin-Dependent Kinase 5 Proteins 0.000 description 2
- 102100026805 Cyclin-dependent-like kinase 5 Human genes 0.000 description 2
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 2
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000005765 Proto-Oncogene Proteins c-akt Human genes 0.000 description 2
- 108010045717 Proto-Oncogene Proteins c-akt Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004289 cerebral ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000031154 cholesterol homeostasis Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000007267 depressive like behavior Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000001353 entorhinal cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 2
- 230000027984 hippocampus development Effects 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 2
- 230000001722 neurochemical effect Effects 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 2
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000005809 status epilepticus Diseases 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 230000027912 synapse maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007617 synaptic impairment Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- URAYPUMNDPQOKB-UHFFFAOYSA-N triacetin Chemical compound CC(=O)OCC(OC(C)=O)COC(C)=O URAYPUMNDPQOKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- BAAVRTJSLCSMNM-CMOCDZPBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 BAAVRTJSLCSMNM-CMOCDZPBSA-N 0.000 description 1
- YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFLKXTYAOJFAC-UHFFFAOYSA-N 3-(3-methyl-1,2-oxazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound CC1=NOC=C1CCC(O)=O LRFLKXTYAOJFAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYNVMODNBIQBMV-UHFFFAOYSA-N 4-[1-hydroxy-2-[4-(phenylmethyl)-1-piperidinyl]propyl]phenol Chemical compound C1CC(CC=2C=CC=CC=2)CCN1C(C)C(O)C1=CC=C(O)C=C1 UYNVMODNBIQBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 1
- 102000029791 ADAM Human genes 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- 208000022099 Alzheimer disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 101800001718 Amyloid-beta protein Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical class C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 description 1
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010009900 Endothelial Protein C Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000009839 Endothelial Protein C Receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001039207 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 101001098529 Homo sapiens Proteinase-activated receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713169 Homo sapiens Solute carrier family 52, riboflavin transporter, member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000595467 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-M Kainate Chemical compound CC(=C)[C@H]1C[NH2+][C@H](C([O-])=O)[C@H]1CC([O-])=O VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N Lycoperodine 1 Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1CN[C@H](C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010061296 Motor dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 101150097381 Mtor gene Proteins 0.000 description 1
- 101500024276 Mus musculus Tumor necrosis factor, membrane form Proteins 0.000 description 1
- 206010050081 Neonatal hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001282736 Oriens Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010036312 Post-traumatic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007131 Proto-Oncogene Proteins c-fyn Human genes 0.000 description 1
- 108010072960 Proto-Oncogene Proteins c-fyn Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150057388 Reln gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000038012 SFKs Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100036862 Solute carrier family 52, riboflavin transporter, member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036428 Spondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710092167 Spondin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 240000002033 Tacca leontopetaloides Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019400 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108010023795 VLDL receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N alpha-Kainic acid Natural products CC(=C)C1CNC(C(O)=O)C1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 208000028683 bipolar I disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025307 bipolar depression Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000003461 brachial plexus Anatomy 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000009460 calcium influx Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000453 cell autonomous effect Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007960 cellular response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000007428 craniotomy Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000024573 dendritic spine development Effects 0.000 description 1
- 239000003479 dental cement Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical class CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001787 epileptiform Effects 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036749 excitatory postsynaptic potential Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000004022 gliogenesis Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000000285 glutaminergic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001087 glyceryl triacetate Substances 0.000 description 1
- 235000013773 glyceryl triacetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000026781 habituation Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000000343 hippocampal mossy fiber Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 229960003998 ifenprodil Drugs 0.000 description 1
- BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N imipramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004801 imipramine Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N kainic acid Chemical compound CC(=C)[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)[C@H]1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N 0.000 description 1
- 229950006874 kainic acid Drugs 0.000 description 1
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000991 ketoprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000009207 neuronal maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N oxidopamine Chemical compound NCCC1=CC(O)=C(O)C=C1O DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002442 prefrontal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010831 regulation of synaptic plasticity Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007596 spatial working memory Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007470 synaptic degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 230000005919 time-dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229960002622 triacetin Drugs 0.000 description 1
- 108010032276 tyrosyl-glutamyl-tyrosyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на смежные заявки
Заявка на данный патент представляет собой обычную заявку предварительной заявки на патент США № 62/370,519, озаглавленной Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders и поданной 3 августа 2016 г., и предварительной заявки на патент США № 62/486,729, озаглавленной Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders и поданной 18 апреля 2017 г., содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
Известно, что сигнальная система липопротеиновых рецепторов играет значимую роль в ЦНС взрослого организма, включающую гомеостаз холестерина, клиренс внеклеточных белков и модуляцию формирования памяти, синаптическую передачу, пластичность и созревание посредством активации многочисленных путей передачи сигнала.
Белок внеклеточного матрикса рилин вовлечен в многочисленные неврологические расстройства, включая шизофрению (Guidotti, et al., Decrease in reelin and glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67) expression in schizophrenia and bipolar disorder: a postmortem brain study. Arch. Gen Psychiatry. 2000; 57: 10611069; Chen, et al., Identification of a single nucleotide polymorphism at the 5' promoter region of human reelin gene and association study with schizophrenia. Mol. Psychiatry. 2002; 7: 447-448; Fatemi, et al., Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia. Int. Rev. Neurobiol. 2005; 71: 179-187, Torrey, et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder and major depression in postmortem brains. Biol. Psychiatry. 2005; 57: 252-26), биполярное расстройство (Fatemi, et al., Reduction in Reelin immunoreactivity in hippocampus of subjects with schizophrenia, bipolar disorder and major depression. Mol. Psychiatry. 2000; 5: 654-663; Torrey, et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder and major depression in postmortem brains. Biol. Psychiatry. 2005; 57: 252-260), депрессию (Knable, et al., Molecular abnormalities of the hippocampus in severe psychiatric illness: postmortem findings from the Stanley neuropathology consortium. Mol. Psychiatry. 2004; 9: 609-620; Lussier, et al., Repeated exposure to corticosterone, but not restraint, decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2009; 460: 170-174; Lussier, et al., Reelin as a putative vulnerability factor for depression: examining the depressogenic effects of repeated corticosterone in heterozygous reeler mice. Neuropharmacol. 2011; 60: 1064-1074; Lussier, et al., The progressive development of depression-like behavior in corticosterone-treated rats is paralleled by slowed granule cell maturation and decreased reelin expression in the adult dentate gyrus. Neuropharmacol. 2013; 71C, 174-183; Lussier, et al., Altered GABAergic and glutamatergic activity within the rat hippocampus and amygdala in rats subjected to repeated corticosterone administration but not restraint stress. Neurosci. 2013; 231: 38-48; Fenton, et al., Imipramine protects against the deleterious effects of chronic corticosterone on depression-like behavior, hippocampal reelin expression and neuronal maturation. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.Psychiatry. 2015; 60: 52-59), аутизм (Fatemi, et al., Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia. Int. Rev. Neurobiol. 2005; 71: 179-187) и болезнь Альцгеймера (БА) (Hoe, et al., DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor2 trafficking and processing. J. Biol Chem. 2006; 281: 35176-35185; Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol. Aging. 2008; 29: 542-553). В настоящее время в активацию сигнального пути рилина вовлечен запуск событий внутриклеточного каскада, как показано на фиг. 1.
По-видимому, активация сигнального пути рилина направляется протеолизом изолированного полноразмерного внеклеточного рилина, противоположным простой продукции и высвобождению рилина из промежуточных нейронов, например, с нейропептидами или низкомолекулярными трансмиттерами. Показано, что рилин содержит два основных участка расщепления между ЭФР-подобными повторами 23 (R2-3) и повторами 6-7 (R6-7), как видно на фиг. 2 (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521). Эти участки расщепления образуют в результате пять фрагментов большого размера, которые можно обнаружить в головном мозге взрослого и развивающегося организма, см. на фиг. 3 (Jossin, et al., Processing of Reelin by embryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J. Neurosci. 2007; 27: 4243-4252; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). Средний фрагмент R3-6 взаимодействует с рецептором липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНПР) и рецептором ApoE (ApoER2) и считается фрагментом, вовлеченным в инициацию нисходящего сигнального каскада рилина (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521).
Были сделаны многочисленные попытки идентифицировать ферменты, расщепляющими рилин, такие как сериновая протеаза тканевой активатор плазминогена (tPA), матриксные металлопротеиназы (MMP) и ADAM-протеазы - дизинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами (ADAMTS), и функциональную роль этого протеолитического процессинга (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Nagy, et al., Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal late-phase long-term potentiation
- 1 045597 and memory. J. Neurosci. 2006; 26: 1923-1934; Nogi, et al., Structure of a signaling-competent reelin fragment revealed by X-ray crystallography and electron tomography. EMBO J. 2006; 25: 3675-3683; Nakano, et al., The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J. Biol Chem. 2007; 282: 20544-20552; Hisanaga, et al., A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 (ADAMTS-4) cleaves Reelin in an isoform-dependent manner. FEBS Lett. 2012; 586: 3349-3353; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793). Один из эндогенных путей процессинга внеклеточного рилина осуществляется посредством сериновой протеазы тканевого активатора плазминогена (tPA) в головном мозге между R6 и R7 в рилине дикого типа (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). У нокаут-мышей (KO; от англ. knock-out) по tPA протеолиз не наблюдается, что подтверждает роль этой протеазы в независимом от рецептора НМДА (Nметил-D-аспартата), индуцируемом долговременной потенциацией синаптической передачи (ДВПСП) расщеплении рилина (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307), которое блокируется ингибитором серпина El (Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793). Дополнительным подтверждением является инкубация tPA с рилином ex vivo в течение 45 мин с образованием фрагмента NR6 (370 кДа), которое блокировалось ингибитором активатора плазминогена (PAI-1; серпин E1) и диизопропилфторфосфатами (ингибитор сериновых протеаз), но не блокировалось апротинином или CR-50 (антитело, которое связывается с N-концевым участком рилина; D'Arcangelo, et al., Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonal antibody. J. Neurosci. 1997; 17: 23-31; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). Исследования также позволяют предположить участие металлопротеаз меприна α и β в расщеплении рилина между повторами R6 и R7 (Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016; 159: 305-312). Однако ни у нокаут-мышей по tPA (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307), ни у нокаутмышей по меприну β (Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016; 159: 305-312) не показаны различия в исходных уровнях полноразмерного рилина или фрагментов рилина, что позволяет предположить, что в конститутивные уровни и протеолиз рилина вовлечены комбинации протеаз.
В гиппокампе взрослого организма гликопротеин рилин экспрессируется промежуточными нейронами, расположенными в основном в прикорневом участке зубчатой извилины и в слое stratum lacunosum-moleculare самого гиппокампа. Экспрессирующие ренин клетки могут также находиться в stratum oriens и stratum radiatum областей CA1 и CA3 и ассоциированы с пирамидальными клетками гиппокампа. Для индукции долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП), являющейся формой синаптической пластичности, которая приводит в результате к продолжительному повышению эффективности синаптической передачи, необходима активация рецепторов НМДА (НМДАР) и последующая стимуляция экспрессии и функции рецептора альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовой кислоты (АМПК). Изменения рецепторов АМПК (АМПКР) могут быть достигнуты либо путем усиления фосфорилирования субъединицы, либо путем усиления синтеза субъединицы и миграции в специфичные синаптические участки. Напротив, НМДАР служат в качестве детекторов совпадения и играют основную роль в индукции синаптической пластичности. Для открытия ионных каналов НМДАР требуется связывание глутамата и деполяризация постсинаптической мембраны. Некоторые субъединицы НМДАР, такие как NR1, NR2A и NR2B, также подвергаются модуляторному фосфорилированию в остатках серина/треонина или тирозина. В результате фосфорилирования субъединиц НМДАР осуществляется модулирование как кинетики каналов, так и миграция к синаптическим участкам. Из этого следует, что, если рилин важен для модулирования синаптической пластичности, логично, что НМДАР и АМПКР должны быть его мишенями с учетом их значимости в индукции и экспрессии синаптической пластичности.
Недавно было обнаружено, что молекулы рилина образуют комплексы высокого порядка in vitro и in vivo, такие как Fc-рецептор-ассоциированный белок (RAP; от англ. receptor-associated protein). Это наблюдение было дополнительно уточнено путем демонстрации, что рилин секретируется in vivo в виде гомодимера, связанного дисульфидными связями. Делеция короткого участка, называемого эпитопом CR-50, локализованная на N-конце молекулы, препятствует олигомеризации. Этот мутированный рилин неспособен эффективно индуцировать фосфорилирование Dab1 в первичных нейронах мыши.
Рилин играет активную роль в процессах синаптической пластичности и обучения. Изобретение также включает идентификацию и использование механизмов процессинга белка рилина для усиления и/или репарации когнитивной функции. Например, в настоящем документе раскрыто, что: научение рефлексу ситуативного страха и стимуляция тета-вспышек (tb-стимуляция) вызывают изменения в процессинге рилина; металлопротеиназы, tPA и MMP-9 по-разному участвуют в процессинге рилина при про- 2 045597 цессах синаптической пластичности и научения; восполнение фрагмента комплемента рилина может приводить к усилению ассоциативного и пространственного научения и памяти; а ассоциация фрагментов рилина с Άβ бляшками, его экспрессия и процессинг изменяются в результате связанных с БА мутаций, и при восполнении рилина дефициты ДВПСП, обнаруживаемые в модели мышей Tg2576 AD, могут быть преодолены.
Как только рилин секретируется ГАМК-эргическими промежуточными нейронами во внеклеточное пространство, он связывается с липопротеиновыми рецепторами - рецептором липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНПР) и рецептором аполипопротеина 2 (ApoER2), вызывая их димеризацию (D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859). Димеризованные рецепторы фосфорилируют в остатке тирозина внутриклеточный адаптерный белок Disabled-1 (Dab1) с последующим фосфорилированием остатков тирозина тирозинкиназ семейства src (SFK), подобным Fyn, и фосфорилированием рецептора N-метил-D-аспартата (НМДАР) (D'Arcangelo, et al., Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonal antibody. J. Neurosci. 1997; 17: 23-31; D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Niu, et al., Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway. Neuron. 2004; 41: 71-84; Beffert, et al. Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47: 567-579; Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007; 97: 2312-2321; Burrell, et al., (2014). Fyn tyrosine kinase increases Apolipoprotein E receptor 2 levels and phosphorylation. PLoS One 9:e110845; Divekar, et al., Ligandinduced homotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2. J. Biol Chem. 2014; 289: 1589415903).
Возрастание инфлюкса кальция вследствие фосфорилирования НМДАР приводит к деполяризации постсинаптической мембраны, созреванию рецепторов НМДА от подтипа NR2B до подтипа NR2A рецептора и инсерции рецептора а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМПКР) (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007; 97: 2312-2321). Повышение инфлюкса Ca2+ и деполяризации клетки приводит к повышению фосфорилирования и синтеза белка цАМФответного элемента активирующего белка (CREB; от англ. cAMP response element-binding protein), что приводит, в конечном счете, к индукции и усилению долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП) и повышению синаптической пластичности, обучения и памяти (Niu, et al., The Reelin signaling pathway promotes dendritic spine development in hippocampal neurons. J. Neurosci. 2008; 28: 1033910348.; Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity and dendritic spine density. Learn. Mem. 2011;18: 558-564; Rogers, et al. Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 386-395). В то же время, фосфорилирование Dab1 приводит в результате к активации фосфатидилинозит-3-киназы (PI3K, от англ. phosphatidylinositol-3-kinase), протеинкиназы В (PKB/Akt) и к модулированию киназы 3 бета гликогенсинтазы (GSK3 β; от англ. Glycogen synthase kinase 3 beta), которая ингибирует фосфорилирование белка Tau (Beffert, et al., Reelin-mediated signaling locally regulates protein kinase B /Akt and glycogen synthase kinase 3 beta. J. Biol Chem. 2007; 277: 49958-49964), а также регуляцию преобразования p35 в p25, который ответственен за активацию CDK5 - другого пути фосфорилирования Tau (Beffert, et al., Reelin and cyclin-dependent kinase 5-dependent signals cooperate in regulating neuronal migration and synaptic transmission. J. Neurosci. 2004; 24: 1897-1906).
Таким образом, активация сигнального пути рилина является полезной мишенью для терапевтических средств против утраты синапсов и нейронов при различных состояниях. Например, показано, что рилин связывается с обоими рецепторами - липопротеинов и белка-предшественника амилоида (APP), и известно, что в ряде биологических моделей БА на мышах он ассоциируется с Ae бляшками (Chin, et al. Reelin depletion in the entorhinal cortex of human amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer's disease. J Neurosci 2007, 27: 2727-2733; Hoareau, et al. 2006; 281: 35176-35185; Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol Aging 2008, 29: 542-553; Hoe, et al. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281: 35176-35185; Miettinen, et al. Reelinimmunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse: effects of APP/PS1 genotype and ovariectomy. J Chem Neuroanat. 2005, 30: 105-1180).
- 3 045597
Кроме того, пути передачи сигнала рилина, по-видимому, особенно восприимчивы к болезни Альцгеймера (БА), потенциально внося вклад в ее патогенез (Hoe, et al. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. 2006, 281: 35176-35185; 281: 35176-35185;
Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol. Aging. 2008; 29: 542-553).
Аналогично, рилин может оказывать влияние на синаптическую пластичность во взрослом организме. У мышей с нокаутом генов рилина, ApoER2 и ЛПНПР или Disabled-1 (Dab1) проявляется недостаточность синаптической пластичности (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952, Qui, et al., 2006, Beffert, et al., Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47: 567-579). Терапевтическое вмешательство, такое как двусторонние внутрижелудочковые инъекции (ДВИ) рилина, может применяться в качестве терапии и усиливать обучение, память и синаптическую пластичность у мышей дикого типа (Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity and dendritic spine density. Learn. Mem. 2011; 18: 558-564). Также показано, что ДВИ рилина восстанавливают дефициты обучения, памяти и ДВПСП, наблюдаемые у мышей, гетерозиготных по мутации reeler (Rogers, et al. Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 386-395), см. на фиг. 4, и в модели синдрома Ангельмана (Hethorn et al., 2016). Таким образом, восполнение содержания рилина путем введения белка или путем генотерапии геном рилина RELN может быть потенциальным терапевтическим вмешательством при ряде заболеваний.
Как только рилин секретируется ГАМК-эргическими промежуточными нейронами во внеклеточное пространство, он связывается с липопротеиновыми рецепторами - рецептором липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНПР) и рецептором аполипопротеина 2 (ApoER2), как показано на фиг. 1 (D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al. Reelin and Apo E receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955). Взаимодействие с лигандами приводит к димеризации рецепторов и фосфорилированию тирозина внутриклеточного адаптерного белка Dab1 нисходящего пути (Howell, et al., Mouse disabled (mDab1): a Src binding protein implicated in neuronal development. EMBO J. 1997; 16: 121-132; D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Hiesberger, et al., Direct binding of Reelin to VLDL receptor and ApoE receptor 2 induces tyrosine phosphorylation of disabled-1 and modulates tau phosphorylation. Neuron. 1999; 24: 481-489; Strasser, et al., (2004). Receptor clustering is involved in Reelin signaling. Mol Cell Biol. 2004; 24: 1378-1386; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Trotter, et al., Dab1 is required for synaptic plasticity and associative learning. J. Neurosci. 2013; 33: 15652-15668-31; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Divekar, et al., Ligand-induced homotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2. j. Biol Chem. 2014; 289: 15894-15903). Фосфорилирование Dab1 активирует семейство тирозинкиназ Src (SFK), таких как Fyn, которые фосфорилируют Nметил-D-аспартат (НМДА), обеспечивая возможность повышения инфлюкса Ca2+ (Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216). Усиление инфлюкса Ca2+ обеспечивает возможность для созревания рецепторов НМДА от подтипа NR2B до подтипа NR2A рецептора и инсерции рецептора а-амино-2-гидрокси-3-метил-5-изоксазолпропионовой кислоты (АМПКР) и может вносить вклад в индукцию и усиление долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol.Chem. 2002; 277, 39944-39952; Beffert, et al., Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47:567-579; Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007; 97, 2312-2321). Кроме того, индуцированное Dab1 фосфорилирование может также активировать фосфатидилинозит-3-киназу (PI3K), протеинкиназу B (PKB/Akt), что впоследствии вызывает ингибирование киназы 3 бета гликогенсинтазы (GSK3e) (Beffert, et al., Reelinmediated signaling locally regulates protein kinase B /Akt and glycogen synthase kinase 3 beta. J. Biol Chem. 2002; 277, 49958-49964), в свою очередь, подавляющее гиперфосфорилирование tau (Ohkubo, et al., Apolipoprotein E and Reelin ligands modulate tau phosphorylation through an Apolipoprotein E receptor/disabled1/glycogen synthase kinase-3beta cascade. FASEB J. 2003; 17, 295-297).
Поскольку рилин-положительные клетки обнаруживают в больших количествах в CA1 stratum la- 4 045597 cunosum и ножке гиппокампа, их локализация обладает преимуществом для влияния на обучение и память и на нейрогенез соответственно. Действительно, показано, что рилин усиливает синаптическую пластичность, обучение и память (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 1294312955; Rogers & Weeber, Reelin and ApoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008; 4: 259-270), а также изменяет миграцию вновь образующихся нейронов взрослого организма (Zhao, et al., Balance between neurogenesis and gliogenesis in the adult hippocampus: role for Reelin. Dev. Neurosci. 2007; 29: 84-90; Pujadas, et al., Reelin regulates postnatal neurogenesis and enhances spine hypertrophy and long-term potentiation. J. Neurosci. 2010; 30: 4636-4649.doi; Teixeira, et al., Cell-autonomous inactivation of the Reelin pathway impairs adult neurogenesis in the hippocampus. J. Neurosci. 2012; 32: 12051-12065). В гиппокампе внеклеточный рилин накапливается в stratum lacunosum (Pesold, et al., Cortical bitufted, horizontal and Martinotti cells preferentially express and secrete Reelin into perineuronal nets, non-synaptically modulating gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 3217-3222; Lussier, et al., Repeated exposure to corticosterone, but not restraint, decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2009; 460: 170-174), таким образом, его локализация обладает преимуществом для влияния на синаптическую активность CA1 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Rogers & Weeber, Reelin and ApoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008; 4: 259-270). Эндогенное расщепление рилина в этих участках можно использовать для регуляции действий рилина на эти процессы.
Кроме того, известно, что сигнальная система липопротеиновых рецепторов играет значимую роль в ЦНС взрослого организма, такую как гомеостаз холестерина, клиренс внеклеточных белков, модуляция формирования памяти, синаптическая передача, пластичность и созревание посредством активации многочисленных путей передачи сигнала. Важно, что лиганд липопротеиновых рецепторов аполипопротеин E (apoE) представляет один из наиболее достоверных факторов риска спорадической болезни Альцгеймера (БА) с поздним началом (Hoe HS, Harris DC, Rebeck GW. Multiple pathways of apolipoprotein E signaling in primary neurons. J Neurochem 2005; 93: 145-155; Hoe HS, Freeman J, Rebeck GW. Apolipoprotein E decreases tau kinases and phospho-tau levels in primary neurons. Mol Neurodegener 2006, 1: 18; Hoe HS, Pocivavsek A, Chakraborty G, et al. Apolipoprotein E receptor 2 interactions with the N-methyl-Daspartate receptor. J Biol Chem 2006, 281: 3425-3431). Аналогичным образом, внеклеточный матричный белок рилин может связываться с обоими рецепторами - липопротеинов и белка-предшественника амилоида (APP), и известно, что в ряде биологических моделей БА на мышах он ассоциируется с Ae бляшками (Chin J, Massaro CM, Palop JJ, et al. Reelin depletion in the entorhinal cortex of human amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer's disease. J Neurosci 2007, 27:2727-2733; Hoareau C, Borrell V, Soriano E, Krebs MO, Prochiantz A, Allinquant B. Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol Aging 2008, 29: 542-553; Hoe HS, Tran TS, Matsuoka Y, Howell BW, Rebeck GW. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281:35176-35185; and Miettinen R, Riedel A, Kalesnykas G, et al. Reelin-immunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse: effects of APP/PS1 genotype and ovariectomy. J Chem Neuroanat 2005, 30: 105-1180). Накопление Ae может влиять на активацию передачи сигнала рилина и функцию липопротеиновых рецепторов, стимулируя посредством этого патогенез БА и оказывая отрицательное влияние на синаптическую и когнитивную функцию.
Поэтому необходимы специфичные агонисты, действующие на систему липопротеиновых рецепторов аналогично рилину, для применения в качестве терапевтических средств в улучшении когнитивной функции, а также в лечении неврологического заболевания, такого как БА, и других возрастных нейродегенеративных расстройств и неврологических расстройств.
Краткое изложение сущности изобретения
Описанные в настоящем документе композиции и способы в целом относятся к способам влияния на когнитивную функцию и ее усиления посредством повышения содержания рилина и/или предотвращения взаимодействия с ним, а также на передачу клеточных сигналов, инициируемых или поддерживаемых рилином или активацией передачи сигнала рилина.
В настоящем изобретении предложен способ лечения или корректирования заболевания или расстройства нервной системы посредством введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества рекомбинантного фрагмента рилина или фрагмента сплайсинга рилина. В некоторых вариантах рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина представляет собой фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R5 (R3-R5), фрагмент рилинового повтора R3, со
- 5 045597 стыкованный с фрагментом рилинового повтора R5 (R3+R5), фрагмент рилинового повтора R3, фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R6 (R3-R6), фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R6 (R3+R6), где R3 представляет собой повторяющийся участок 3 полноразмерного рилина, R4 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, R5 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, a R6 представляет собой повторяющийся участок 6 полноразмерного рилина. Необязательно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R5, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R5, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка 5 или их комбинации. Альтернативно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R6, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R6, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка 6 или их комбинации. В конкретных вариантах рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина представляет собой фрагмент рилинового повтора R3, фрагмент рилинового повтора R4, фрагмент рилинового повтора R5, фрагмент рилинового повтора R6, фрагмент рилиновых повторов R3-R4, фрагмент рилиновых повторов R3-R5, фрагмент рилинового повтора R3 - повторяющегося участка R6, фрагмент рилиновых повторов R4-R5, фрагмент рилиновых повторов R5-R6, фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R5, фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R6, фрагмент рилинового повтора R4, состыкованный с повтором R6, ли комбинацию вышеупомянутого(ых) фрагмента(ов) рилина или фрагмента(ов) сплайсинга рилина. В некоторых вариантах изобретения заболевание или расстройство нервной системы представляет собой нейродегенеративное заболевание, поражение нейронов, нарушение функции нейронов или инсульт. В конкретных вариантах нарушение функции нейронов выбрано из группы, состоящей из синдрома ломкой X-хромосомы, синдрома Вильямса, синдрома Ретта, синдрома Дауна, синдрома Ангельмана, аутизма, дефицита рилина, биполярного расстройства, депрессии и шизофрении. Альтернативно заболевание или расстройство нервной системы представляет собой поражение нейронов или болезнь Альцгеймера.
Необязательно фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят путем парентеральной инъекции. В конкретных вариантах фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят путем внутриартериальной, внутривенной, внутричерепной или внутрижелудочковой инъекции. В конкретных вариантах изобретения фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят в желудочки головного мозга пациента с двух сторон. В некоторых вариантах фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят до получения концентрации рилина в жидкость ЦНС от около 10 мкмоль/л до около 5 нмоль/л. Возможные концентрации включают 10 мкмоль/л, 15 мкмоль/л, 20 мкмоль/л, 25 мкмоль/л, 30 мкмоль/л, 3 мкмоль/л 40 мкмоль/л 45 мкмоль/л, 50 мкмоль/л, 55 мкмоль/л, 60 мкмоль/л, 65 мкмоль/л, 70 мкмоль/л, 75 мкмоль/л, 80 мкмоль/л, 85 мкмоль/л, 90 мкмоль/л, 100 мкмоль/л, 110 мкмоль/л, 120 мкмоль/л, 130 мкмоль/л, 140 мкмоль/л, 150 мкмоль/л, 160 мкмоль/л, 170 мкмоль/л, 180 мкмоль/л, 190 мкмоль/л, 200 мкмоль/л, 220 мкмоль/л, 225 мкмоль/л, 240 мкмоль/л, 250 мкмоль/л, 270 мкмоль/л, 275 мкмоль/л,280 мкмоль/л, 300 мкмоль/л, 320 мкмоль/л, 325 мкмоль/л, 340 мкмоль/л, 350 мкмоль/л, 370 мкмоль/л,375 мкмоль/л, 380 мкмоль/л, 400 мкмоль/л, 420 мкмоль/л, 425 мкмоль/л, 440 мкмоль/л, 450 мкмоль/л,470 мкмоль/л, 475 мкмоль/л, 480 мкмоль/л, 500 мкмоль/л, 520 мкмоль/л, 525 мкмоль/л, 540 мкмоль/л,550 мкмоль/л, 570 мкмоль/л, 575 мкмоль/л, 580 мкмоль/л, 600 мкмоль/л, 620 мкмоль/л, 625 мкмоль/л,640 мкмоль/л, 650 мкмоль/л, 670 мкмоль/л, 675 мкмоль/л, 680 мкмоль/л, 700 мкмоль/л, 720 мкмоль/л,725 мкмоль/л, 740 мкмоль/л, 750 мкмоль/л, 770 мкмоль/л, 775 мкмоль/л, 780 мкмоль/л, 800 мкмоль/л,820 мкмоль/л, 825 мкмоль/л, 840 мкмоль/л, 850 мкмоль/л, 870 мкмоль/л, 875 мкмоль/л, 880 мкмоль/л,900 мкмоль/л, 920 мкмоль/л, 925 мкмоль/л, 940 мкмоль/л, 950 мкмоль/л, 970 мкмоль/л, 975 мкмоль/л,980 мкмоль/л, 1 нмоль/л, 1,1 нмоль/л, 1,2 нмоль/л, 1,3 нмоль/л, 1,4 нмоль/л, 1,5 нмоль/л, 1,6 нмоль/л,1,7 нмоль/л, 1,8 нмоль/л, 1,9 нмоль/л, 2,0 нмоль/л, 2,1 нмоль/л, 2,2 нмоль/л, 2,3 нмоль/л, 2,4 нмоль/л,2,5 нмоль/л, 2,6 нмоль/л, 2,7 нмоль/л, 2,8 нмоль/л, 2,9 нмоль/л, 3,0 нмоль/л, 3,1 нмоль/л, 3,2 нмоль/л,3,3 нмоль/л, 3,4 нмоль/л, 3,5 нмоль/л, 3,6 нмоль/л, 3,7 нмоль/л, 3,8 нмоль/л, 3,9 нмоль/л, 4,0 нмоль/л,4,1 нмоль/л, 4,2 нмоль/л, 4,3 нмоль/л, 4,4 нмоль/л, 4,5 нмоль/л, 4,6 нмоль/л, 4,7 нмоль/л, 4,8 нмоль/л,4,9 нмоль/л и 5,0 нмоль/л. Например, терапевтическая концентрация может составлять менее 100 нмоль/л, менее 50 нмоль/л, менее 25 нмоль/л, менее 10 нмоль/л или около 5 нмоль/л. Дозировки могут быть рассчитаны на основании распределения белка в организме животного и доступа через гематоэнцефалический барьер. Не имеющим ограничительного характера примером является пример, в котором рилин вводят в количестве 1 мкл композиции 5 нмоль/л на каждые 30-36 г массы тела пациента. Кроме того, лечение можно продолжить, т.е. оно может быть постоянным, либо схема лечения может продолжаться в течение менее 1 года, менее 6 месяцев, менее 3 месяцев, менее 1 месяца, менее 1 недели или около 1 суток.
В некоторых вариантах изобретения конструкцию, образованную из рекомбинантного фрагмента рилина или фрагмента сплайсинга рилина, встраивают в вирусный вектор с образованием вектора рилина, и вектор рилина вводят пациенту путем инъекции. Возможные векторы включают векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV; от англ. adeno-associated virus) AAV9, AAV5, AAV1 и AAV4. Однако другие векторы, особенно любой подходящий вектор AAV, известный в данной области техники, могут быть использованы в изобретении и рассмотрены для такого применения. В конкретных вариантах
- 6 045597 рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина находится под контролем цитомегаловирусного промотора (CMV).
Изобретение также включает композицию, содержащую рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина, который представляет собой фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R5 (R3-R5), фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R5 (R3+R5), фрагмент рилинового повтора R3, фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R6 (R3-R6), фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R6 (R3+R6), где R3 представляет собой повторяющийся участок 3 полноразмерного рилина, R4 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, R5 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, a R6 представляет собой повторяющийся участок 6 полноразмерного рилина. Необязательно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R5, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R5, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка 5 или их комбинации. Альтернативно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R6, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R6, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка б или их комбинации.
В некоторых вариантах композиции рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина интегрирован в конструкцию, образованную из рекомбинантного фрагмента рилина или фрагмента сплайсинга рилина, встроенного в вирусный вектор с образованием вектора рилина, и вектор рилина вводят пациенту путем инъекции. Возможные векторы включают векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV; от англ. adeno-associated virus) AAV9, AAV5, AAV1 и AAV4. Однако другие векторы, особенно любой подходящий вектор AAV, известный в данной области техники, могут быть использованы в изобретении и рассмотрены для такого применения. В конкретных вариантах рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина находится под контролем цитомегаловирусного промотора (CMV).
Вышеупомянутые композиции можно также применять для лечения симптома заболевания или расстройства нервной системы, включающего нейродегенеративные заболевания, нарушения функции нейронов и инсульт. Не имеющие ограничительного характера примеры включают синдром ломкой Xхромосомы, синдром Вильямса, синдром Ретта, синдром Дауна, синдром Ангельмана, аутизм, ишемию, гипоксию, болезнь Альцгеймера, дефицит рилина, биполярное расстройство, депрессию, шизофрению и инсульт.
Конкретные примеры симптомов заболевания или расстройства нервной системы включают недостаточность плотности дендритных шипиков, снижение долговременной потенциации, снижение синаптической пластичности и нарушения ассоциативного научения. Полезные терапевтические композиции и их количества описаны выше.
Вышеупомянутые композиции можно также применять для увеличения плотности дендритных шипиков у субъекта. Полезные терапевтические композиции и их количества описаны выше.
Описанные выше композиции также полезны для повышения синаптической пластичности, обучения или улучшения когнитивной функции. Композиции и количества, которые можно применять для повышения синаптической пластичности, обучения или улучшения когнитивной функции являются такими, как описано выше.
Краткое описание чертежей
Для более полного понимания изобретения следует ссылаться на последующее подробное описание изобретения, рассмотренное в сочетании с сопроводительными чертежами, на которых показано следующее.
На фиг. 1 представлена иллюстрация биохимического пути рилина в синаптической пластичности взрослого организма.
На фиг. 2 представлена иллюстрация, на которой показан протеолиз рилина в головном мозге взрослого организма. Полноразмерный рилин высвобождается во внеклеточное пространство ГАМКергическими промежуточными нейронами в головном мозге взрослого организма. Этот полноразмерный рилин претерпевает ферментативное расщепление между повторами 2-3 (R2-R3), подобными эпидермальному фактору роста (ЭФР) и 6-7 (R6-R7; указаны пунктирными линиями; под действием различных ферментов. Например, показано, что тканевой активатор плазминогена (tPA) меприн α и β расщепляет рилин между R6 и R7 (Kohno, et al., Mechanism and significance of specific proteolytic cleavage of Reelin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009; 380: 93-97; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016; 159: 305-312), при этом матриксные металлопротеиназы (MMP)-9 расщепляют рилин между R2 и R3 (Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793). 4; 5-4; Hisanaga, et al., A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 (ADAMTS-4) cleaves Reelin in an isoform- 7 045597 dependent manner. FEBS Lett. 2012; 586: 3349-3353; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS
One. 2012; 7: e47793). В процессинг рилина также потенциально вовлечены другие, еще не идентифицированные протеазы.
На фиг. 3 представлена иллюстрация, на которой показан полноразмерный рилин (450 кДа) и фрагменты рилина, образованные путем расщепления рядом ферментов, приводящего к образованию пяти фрагментов в диапазоне размера 370-80 кДа. Показано, что фрагмент R3-R6 [включенный в полноразмерный рилин (450 кДа), фрагменты 370 кДа, 190 кДа и 270 кДа] связывается с липопротеиновыми рецепторами ApoER2 ЛПОНПР (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521). Показано, что фрагмент N-R2 (180 кДа) связывается с а3в1-интегринами (Dulabon, et al., Reelin binds alpha3betal integrin and inhibits neuronal migration. Neuron. 2000;27:33-44.), а миграция нейронов нарушается in vivo антителом CR-50 (Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997;94:8196-8201). Показано, что C-концевой участок (R7-C; 80 кДа) вовлечен в секрецию рилина, а также в его правильный фолдинг (de Bergeyck, et al., A truncated Reelin protein is produced but not secreted in the 'Orleans' reeler mutation (Reln[rl-Orl]). Brain Res. Mol. Brain Res. 1997;50:85-90; Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521) и в эффективность перелачи нисходящих сигналов (Nakano, et al., The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J. Biol. Chem. 2007;282:20544-20552).
На фиг. 4 представлен график, показывающий ДВПСП при стимуляции тета-вспышки.
На фиг. 5 представлена последовательность полноразмерного рилина. Сайты распознавания для эндонуклеаз показаны над их соответствующей последовательностью. Повторяющиеся последовательности представлены метками с левой стороны, и повторяющиеся участки выделены. Между каждыми из повторяющихся участков находится петля слияния, которая не выделена.
На фиг. 6 представлена иллюстрация рилин-зависимого рецептора ApoER2, показывающая инактивированный рецептор и димеризованный рецептор, который является активным и флуоресцирует. Эту систему используют в анализе активации рецептора, основанном на количественном определении репортерного гена люциферазы.
На фиг. 7 представлена иллюстрация, на которой показаны фрагменты рилина, образованные путем расщепления рядом ферментов, приводящего в результате к образованию различных фрагментов. Фрагмент R3-R6 сравнивают с фрагментами рилина R3, который содержит только третий участок сплайсинга, R3-4, содержащим участки сплайсинга R3 и R4, состыкованные вместе, R3-R5, который содержит повторяющиеся участки R3, R4 и R5, состыкованные вместе, и фрагментом R5-R6, который включает участок R5, состыкованный с участком R6. Также показаны фрагменты R3+R5 и R3+R6, содержащие участки R3, состыкованные с участком R5 или с участком R6 соответственно.
На фиг. 8 представлена последовательность фрагмента рилина 3+6. Этот фрагмент был образован путем соединения петли 3-4 с петлей 5-6, присоединяя, таким образом, повтор 3 к повтору 6. Участок, соответствующий сигнальному пептиду, выделен темно-серым цветом, и за ним следует повторяющийся участок 3, выделенный светло-серым цветом. Соединительный петлевой участок для 3-4 выделен среднесерым цветом, и за ним следует соединительный петлевой участок 5-6 и повторяющийся участок 6, темно-серым цветом.
На фиг. 9 представлена последовательность фрагмента 3+5 рилина. Этот фрагмент был образован путем соединения петли 3-4 с петлей 4-5, присоединяя, таким образом, повтор 3 к повтору 5. Участок, соответствующий сигнальному пептиду, выделен темно-серым цветом, и за ним следует повторяющийся участок 3, выделенный светло-серым цветом. Соединительный петлевой участок для 3-4 выделен среднесерым цветом, и за ним следует соединительный петлевой участок 4-5 и повторяющийся участок 5, темно-серым цветом.
На фиг. 10 представлен график, показывающий анализ ApoER2 на основе количественного определения репортерного гена люциферазы с использованием фрагментов рилина мыши.
На фиг. 11 представлен график, показывающий анализ ApoER2 на основе количественного определения репортерного гена люциферазы с использованием фрагментов рилина человека.
На фиг. 12 представлен график сравнения анализа ApoER2 на основе количественного определения репортерного гена люциферазы с использованием фрагментов рилина мыши и фрагментов рилина человека.
На фиг. 13(A) представлен блот, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Репрезентативный Вестерн-блоттинг, на котором показан ApoER2 и активность и состояние фосфорилирования протеинкиназы B (AKT) и регулируемой внеклеточными сигналами киназы (ERK; от англ. Extracellular Regulated Kinase). Фосфорилирование ERK представляет собой прямое обнаружение актив- 8 045597 ности ERK и представляет активацию восходящего сигнального пути.
На фиг. 13(B) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Активность ApoER2 измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.
На фиг. 13(C) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Уровень фосфорилирования AKT измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.
На фиг. 13(D) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Общее содержание AKT измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.
На фиг. 13(E) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Уровень фосфорилирования внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.
На фиг. 13(F) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Общее содержание внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.
На фиг. 13(G) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Отношение количества фосфорилированной внеклеточно регулируемой киназы (ERK) к общему содержанию внеклеточно регулируемой киназы (ERK) определяли и стандартизовали по необработанному образцу (момент времени 0). Состояние фосфорилирования ERK представляет собой прямое обнаружение активности ERK и представляет активацию восходящего сигнального пути. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.
На фиг. 14(A) представлен блот, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены повторяющиеся участки R3 и R5 (hR3+5) последовательности рилина человека, повторы R3-R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут, и клетки подвергали лизису. Репрезентативный Вестерн-блоттинг был проведен для общей и фосфорилированной внеклеточно регулируемой киназы (ERK).
На фиг. 14(B) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены повторяющиеся участки R3 и R5 (hR3+5) последовательности рилина человека, повторы R3-R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут, и клетки подвергали лизису. Содержание фосфорилированной внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 4.
На фиг. 14(C) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены повторяющиеся участки R3 и R5 (hR3+5) последовательности рилина человека, повторы R3-R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и
- 9 045597 полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут, и клетки подвергали лизису. Общее содержание внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 4.
На фиг. 15 представлен график, показывающий количественные анализы фосфорилирования Dab-1 с использованием полноразмерного рилина.
На фиг. 16 представлен линейный график, показывающий фосфорилирование Dab-1 со временем под действием полноразмерного рилина.
На фиг. 17 представлен график, показывающий количественные анализы фосфорилирования Dab-1 с использованием фрагмента рилина R3-6.
На фиг. 18 представлен линейный график, показывающий фосфорилирование Dab-1 со временем под действием фрагмента рилина R3-6.
На фиг. 19 перфузия Fc-RAP усиливает индукцию ДВПСП в гиппокампе. Срезы гиппокампа перфузировали Fc-RAP (10 мкг/мл), Fc (10 мкг/мл) или контрольной средой. Регистрировали исходные синаптические ответы (f) и потенциация сразу после высокочастотной стимуляции (ВЧС) (J) и до 60 мин после ВЧС (-). Стрелкой показана ДВПСП, индуцированная двумя последовательностями стимуляции 100 Гц длительностью 1 секунда с интервалами 20 с. Горизонтальной линией показано нанесение Fc-RAP, Fc или контрольной среды. Результаты представлены в виде средних арифметических значений ± стандартные ошибки средних арифметических. fEPSP, возбуждающий постсинаптический потенциал поля; Strasser и соавт., 2004.
На фиг. 20(A) представлена электрограмма, показывающая, что рилин усиливает токи НМДАР посредством постсинаптических механизмов. Иллюстрация измерения EPSCНмдА. Линиями представлены: отсутствие обработки, ложная обработка и обработка рилином, и показано, что обработка рилином усиливает функционирование рецептора НМДА посредством кальциевой проводимости.
На фиг. 20(B) представлена электрограмма, показывающая, что рилин усиливает токи НМДАР посредством постсинаптических механизмов. Иллюстрация измерения EPSCнмдА с AP5. Линиями представлены: отсутствие обработки, ложная обработка и обработка рилином, и показано, что обработка рилином усиливает функционирование рецептора НМДА посредством кальциевой проводимости.
На фиг. 21(A) показан график, показывающий измерение EPSCнмдА. Толстой серой линией представлено mEPSCнмдА.
На фиг. 21(B) представлен график, показывающий, что обработка рилином статистически значимо повышает амплитуду mEPSCНМдА (заштрихованные круги, до добавления рилина; незаштрихованные круги, после добавления рилина; ***p<0,001; n=18; парный t-критерий). Ложная обработка не оказала влияния [заштрихованные квадраты, до ложной обработки; незаштрихованные квадраты, после ложной обработки; статистически незначимо (сн), p>0,05; n=13; парный t-критерий].
На фиг. 21(С) представлен график, показывающий синаптическую передачу в трех моментах времени, без обработки рилином, с обработкой рилином и составной график их сравнения.
На фиг. 21(D) представлен график, показывающий отсутствие корреляции коэффициентов 1/CV2 и средних арифметических значений коэффициентов EPSCнмдА (после/до воздействия рилина) на основании регистрации в девяти ячейках (r=0,31; p=0,4; критерий Спирмена).
На фиг. 22(A) представлен Вестерн-блоттинг, показывающий, что активация передачи сигнала рилина приводит к изменению поверхностной экспрессии и общего содержания субъединиц рецептора глутамата. Репрезентативные блоттинги показывают как общее, так и поверхностное содержание GluR1, NR1, NR2A и NR2B.
На фиг. 22(B). Объединенные результаты количественного определения субъединиц рецептора глутамата для 4 экспериментов методом Вестерн-блоттинга. По сравнению с группами с ложной обработкой количество обоих рецепторов GluR1 и NR2A на поверхности статистически значимо увеличивалось [GluR1, F(2,11) =15,56, ***P<0,001; NR2A, F(2,11)=44,9, ***P<0,001], а содержание рецептора NR2B на поверхности статистически значимо уменьшалось [F(2,11)=22,6, ***P<0,001] после хронической обработки рилином.
На фиг. 22(C) - объединенные результаты количественного определения субъединиц рецептора глутамата для 4 экспериментов методом Вестерн-блоттинга. Обработка рилином приводила к статистически значимому увеличению общего содержания GluR1 [F(2,11)=11,2, **P<0,01], NR2A [F(2,14)=9,75, **P<0,01] и уменьшению общего содержания NR2B [F(2,11)=4,1, *P<0,05]. Напротив, ни общее, ни поверхностное содержание NR1 (на B) не наблюдалось.
На фиг. 23(A) представлен график, показывающий влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Дендритные шипики на нейроне дикого типа (ДТ) показаны на увеличенной фотографии репрезентативного первичного дендрита.
На фиг. 23(B) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных
- 10 045597 шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. У мышей HRM количество дендритных шипиков было уменьшено по сравнению с мышами ДТ, но после обработки рилином плотность шипиков восстанавливалась. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением какихлибо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).
На фиг. 23(C) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. У мышей HRM количество дендритных шипиков было уменьшено по сравнению с мышами ДТ, но после обработки рилином плотность шипиков восстанавливалась. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением какихлибо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).
На фиг. 23(D) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Дендритные шипики у нокаут-мышей по рилину встречаются очень редко, но после обработки рилином недостаток дендритных шипиков восполнялся. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением каких-либо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).
На фиг. 23(E) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Дендритные шипики у нокаут-мышей по рилину встречаются очень редко, но после обработки рилином недостаток дендритных шипиков восполнялся. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением каких-либо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).
На фиг. 23(F) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Количественное определение дендритных шипиков проводили с помощью конфокального микроскопа. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением каких-либо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).
На фиг. 24(A) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность MMP-9 (активная; Калбиохем (Calbiochem), PF140) оказывать влияние на процессинг рилина определяли подвергая рилин (50 нмоль/л) взаимодействию с MMP-9 в различных концентрациях (1-4 мкг/мл) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при 37°С в течение 3 часов. В качестве отрицательного контроля в реакцию включали этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (10 ммоль/л), поскольку она блокирует активность MMP-9. Для Вестерн-блоттинга использовали 1:10 реакционной смеси и гибридизовали с антителом к рилину (G10).
На фиг. 24(B) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность MMP-9 (250 нмоль/л) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Клеточные экстракты белка подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.
На фиг. 24(C) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность MMP-9 (250 нмоль/л) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Экстракты белка супернатанта подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.
На фиг. 24(D) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность ингибитора MMP-9 (25 нмоль/л; Калбиохем 444278) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Клеточные экстракты белка подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.
На фиг. 24(E) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность ингибитора MMP-9 (25 нмоль/л; Калбиохем 444278) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Экстракты белка супернатанта подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.
- 11 045597
На фиг. 25 представлен график, показывающий влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Содержание рилина в культуре клеток определяли методом Вестерн-блоттинга. Из культуры отбирали образцы в моменты времени 0, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов для определения уровней деградации рилина in vitro. В последнем столбце представлен нативный рилин в концентрации, вводимой в культуру. Рилин присутствовал вплоть до 96 часов после внесения в культуру, и до 72 часов его деградация не начиналась.
На фиг. 26(A) представлен график, показывающий, что восполнение рилина может улучшать ассоциативное научение и пространственную память. Мыши дикого типа получали либо 5 нмоль/л RAP, либо 5 нмоль/л рилина путем двусторонней инъекции в желудочки головного мозга за 3 часа до выработки условного рефлекса в связи с переживанием чувства страха. Через 24 ч после подготовки мышей помещали в условия исследования и измеряли реакцию замирания. Было обнаружено, что RAP ингибирует способность к научению и память, при этом действие рилина приводило к их усилению (RAP n=9, без электроболевого раздражения n=5, без обработки n=7, рилин n=5; p>0,05).
На фиг. 26(B) представлен график, показывающий, что восполнение рилина может улучшать ассоциативное научение и пространственную память. Мышей дикого типа тренировали на поиск скрытой платформы в водном лабиринте Морриса. Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (красные круги, n=4), либо контрольного растворителя (пустые круги, n=6). В день 5 проводили пробное испытание, затем в день 6 мышей обучали находить новое расположение платформы. Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (n=4), либо контрольного растворителя (n=6).
На фиг. 26(C) представлен график, показывающий, что восполнение рилина может улучшать ассоциативное научение и пространственную память. Мышей дикого типа тренировали на поиск скрытой платформы в водном лабиринте Морриса. Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (красные круги, n=4), либо контрольного растворителя (пустые круги, n=6). Изучение латентных периодов индивидуальных испытаний в день 1. (*=p>0,05). Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (n=4), либо контрольного растворителя (n=6).
На фиг. 27(A) представляет собой блот, показывающий, что в условиях выработки условного рефлекса ситуативного страха содержание рилина изменяется. У мышей вырабатывали условный рефлекс ситуативного страха в соответствии с протоколом с 3 электроболевыми раздражителями (CFC; от англ. contextual fear conditioning protocol). У мышей, не подвергавшихся электроболевому раздражению (CS), используемых в качестве отрицательного контроля, и у мышей, подвергавшихся электроболевому раздражению в аналогичной ситуации (CS/US), извлекали гиппокамп через 1, 5, 15, 30 и 180 минут после выработки рефлекса, а также через 18 часов после выработки рефлекса (n=4 для каждого момента времени). В гомогенатах гиппокампа определяли рилин с помощью антитела к рилину (G10).
На фиг. 27(B) представляет собой блот, показывающий, что в условиях выработки условного рефлекса ситуативного страха содержание рилина изменяется. У мышей вырабатывали условный рефлекс ситуативного страха в соответствии с протоколом с 3 электроболевыми раздражителями (CFC; от англ. contextual fear conditioning protocol). У мышей, не подвергавшихся электроболевому раздражению (CS), используемых в качестве отрицательного контроля, и у мышей, подвергавшихся электроболевому раздражению в аналогичной ситуации (CS/US), извлекали гиппокамп через 1, 5, 15, 30 и 180 минут после выработки рефлекса, а также через 18 часов после выработки рефлекса (n=4 для каждого момента времени). Проводили количественное определение содержания полноразмерного рилина. Звездочками обозначена статистическая значимость после применения двухстороннего t-критерия, где p<0,5.
На фиг. 28(A) представлен блот, показывающий изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. Анализу методом Вестерн-блоттинга подвергали образцы изолированной коры головного мозга 14-месячных мышей дикого типа, Tg2576 (SweAPP), PS1-FAD (M146L) и 2X (SweAPP x M146L) (n=4). У мышей Tg2576 по сравнению с мышами дикого типа не было выявлено статистически значимых различий по содержанию продуктов рилина 450, 190 и 180 кДа, но у мышей Tg2576 и 2X отмечено статистически значимое увеличение количества неидентифицированных N-концевых последовательностей, распознаваемых антителом G10. В отличие от этого, количество продуктов рилина 450 и 180 кДа статистически значимо увеличивалось у мышей PS1-FAD и 2X (p<0,05).
На фиг. 28(B) представлен блот, показывающий изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. Анализу методом Вестерн-блоттинга подвергали образцы изолированной коры головного мозга 14-месячных мышей дикого типа, PS1-FAD (M146L) и 2X (SweAPP x M146L) (n=4). Отмечено статистически значимое уменьшение содержания Dab1-pTyr220 у мышей Tg2576 и его статистически значимое увеличение у обеих линий мышей PS1-FAD и 2X.
На фиг. 28(C) представлен график, показывающий изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. В результате нанесения рилина (5 нмоль/л) перед стимуляцией возобновлялась способность к восстановлению недостаточности ВЧС-стимулированной ДВПСП в области CA1 мышей Tg2576.
На фиг. 29(A) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На горизонтальных срезах 14-месячных мышей Tg2576 применяли 3- 12 045597 эпитопную стратегию картирования процессинга рилина in vivo. Обнаруживаемые антителом Reelin-CT (G20) фрагменты рилина, содержащие R7-8, были ограничены сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).
На фиг. 29(B) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На горизонтальных срезах 14-месячных мышей Tg2576 применяли 3эпитопную стратегию картирования процессинга рилина in vivo. Обнаруживаемые антителом Reelin-NT фрагменты рилина, содержащие N-R2, были ограничены сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).
На фиг. 29(C) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На горизонтальных срезах 14-месячных мышей Tg2576 применяли 3эпитопную стратегию картирования процессинга рилина in vivo. Обнаруживаемые антителом Reelin-MT (AF3820) фрагменты рилина, содержащие R3-6, были ограничены сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).
На фиг. 29(D) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. Иммунофлуоресцентное изображение горизонтальных срезов 14месячных мышей Tg2576 для антител Reelin-CT (G20) и -MT (AF3820) объединяли, ограничиваясь сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).
На фиг. 29(E) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На увеличенном иммунофлуоресцентном изображении 14-месячных мышей Tg2576 показаны фрагменты рилина Reelin-NT (N-R2), окружающие сердцевину бляшки у модельных мышей tg2576. Масштабная полоска=15 мкм.
На фиг. 30. К срезам гиппокампов от 12-месячных мышей Tg2576 применяли индукцию ДВПСП с использованием стандартной двойной последовательности ВЧС 100 Гц. Серию срезов перфузировали рилином 5 нмоль/л. В срезах, обработанных рилином, показано повышение индукции ДВПСП по сравнению с уровнями у мышей дикого типа.
На фиг. 31 представлен график, показывающий, что обработка рилином способствует восстановлению функций при хронической черепно-мозговой травме (ЧМТ). Тесты покачивания приподнятого тела, показывающие смещение покачивания тела на исходном уровне после травматического повреждения головного мозга кортикальным импактором, которое ослаблялось под действием рилина.
На фиг. 32 представлен график, показывающий, что обработка рилином способствует восстановлению функций при хронической ЧМТ. Акинезия конечностей, показывающая утрату произвольных движений конечностей на исходном уровне после травматического повреждения головного мозга кортикальным импактором, которая ослаблялась под действием рилина.
На фиг. 33 представлен график, показывающий, что обработка рилином способствует восстановлению функций при хронической ЧМТ. Захват лапы, показывающий утрату силы конечностей на исходном уровне после травматического повреждения головного мозга кортикальным импактором.
На фиг. 34 представлена иллюстрация некоторых конструкций, используемых в SA2 и SA3, и сайты расщепления рилина. MMP-9 может расщеплять его между участками 2 и 3, но также показано, что она расщепляет его в участке 7 только в реакциях in vitro. tPA может расщеплять его между участками 6 и 7. Предложенные конструкции получены без сайта связывания MMP-9 in vitro с обеими, C- и N-концевыми, метками. Rln-Res=рилин, устойчивый к расщеплению; Rln-Lab = лабильный рилин.
На фиг. 35(A) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина tPA. Способность tPA/плазминогена оказывать влияние на процессинг рилина определяли, подвергая взаимодействию рилин (50 нмоль/л) с tPA (60 мкг/мл), неактивным плазминогеном (18 мкг/мл), tPA и плазминогеном, а также плазмином (активный, 0,5 Ед./мл) в ФСБ в течение 45 минут при 37°С. Реакционные смеси наносили на Вестерн-блоттинг (в соотношении 1:10) и гибридизовали с антителом к рилину (G10, антитело, распознающее N-R2) и другим антителом к рилину (Ab14, антитело, распознающее R7-8).
На фиг. 35(B) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина tPA. Способность tPA оказывать влияние на метаболизм рилина в первичных кортикальных нейронах определяли путем инкубации клеток в свежесобранном супернатанте в течение 24 часов с 70 нмоль/л tPA. Клеточные экстракты белка подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.
На фиг. 35(C) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина tPA. Способность tPA оказывать влияние на метаболизм рилина в первичных кортикальных нейронах определяли путем инкубации клеток в свежесобранном супернатанте в течение 24 часов с 70 нмоль/л tPA. Экстракты белка супернатанта подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.
На фиг. 36(A) представлена иллюстрация трехэпитопного картирования. Рилин состоит из Nконцевого участка, за которым следуют электростатический домен CR-50 (светло-серый), Fспондиновый домен (H) и 8 последовательных ЭФР-подобных повторов. Показаны различные антитела, показывающие эпитопный участок структуры рилина для соответствующего антитела.
На фиг. 36(A) представлена иллюстрация трехэпитопного картирования. Антитела, по отдельности распознающие участки рилина N-R2, R3-R6 и R7-R8, можно использовать, чтобы определить распреде- 13 045597 ление полноразмерного рилина и его основных фрагментов.
На фиг. 37 представлен график, показывающий действие RAP на экспрессию рилина и ApoER2.
Сниженная экспрессия ApoER2 связана с применением GST-RAP (рецептор-ассоциированный белок, который связывается со всеми липопротеиновыми рецепторами) в гиппокампе, префронтальной коре и теменной коре головного мозга.
На фиг. 38(A) представлен блот, показывающий, что нанесение hR3-6 приводит к повышению экспрессии ApoEr2 в культурах первичных нейронов. Нейроны (E17, DIV8) обрабатывали hR3-6 в течение 1 ч и гибридизовали с антителом 3326, которое распознает ApoEr2. N=3-4.
На фиг. 38(A) представлен график, показывающий, что нанесение hR3-6 приводит к повышению экспрессии ApoEr2 в культурах первичных нейронов. Концентрации ApoEr2 нормализовали по актину и определяли количественно методом Вестерн-блоттинга.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
При использовании в настоящем документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явным образом не требует иного. Так, например, ссылка на полипептид включает смесь двух или более полипептидов и т. п.
При использовании в настоящем документе около означает приблизительно или почти, и в контексте указанного числового значения или диапазона означает ±15% числа.
При использовании в настоящем документе введение или вводимый используют для описания процесса, в котором пациенту доставляют соединения по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другими соединениями. Композицию можно вводить различными путями, включая среди прочего пероральный, парентеральный (относящийся к внутривенному и внутриартериальному и другим приемлемым парентеральным путям), подоболочечный, внутримышечный, подкожный, толстокишечный, ректальный и интраназальный. Каждое из этих состояний можно успешно лечить с использованием других путей введения соединений по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния. Дозирование соединений и композиций по настоящему изобретению для получения терапевтического или профилактического эффекта определяется в зависимости от обстоятельств пациента, как известно в данной области техники. В настоящем документе дозирование пациента можно осуществлять посредством индивидуальных или унифицированных доз соединений или композиций настоящего документа или посредством комбинированной, или предварительно упакованной, или предварительно включенной в лекарственную форму дозы соединений или композиций. У средней мыши с массой тела 40 г масса головного мозга составляет 0,416 г, а у мыши с массой тела 160 г масса головного мозга составляет 1,02 г, и у мыши с массой тела 250 г масса головного мозга составляет 1,802 г. Средняя масса головного мозга человека составляет 1508 г, что можно использовать для определения количества терапевтического средства, необходимого или полезного для осуществления лечения, описанного в настоящем документе.
Фармацевтические композиции объекта изобретения можно включать в лекарственные формы в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически полезных композиций. Кроме того, используемое в настоящем документе выражение фармацевтически приемлемый носитель означает любой из стандартных фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемый носитель может включать разбавители, адъюванты и инертные вещества, а также носители имплантатов и инертные нетоксичные твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующий материал, который не взаимодействует с активными ингредиентами по изобретению. Примеры включают, но не ограничены ими, фосфатно-солевой буферный раствор, физиологический раствор, воду и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п.), их подходящие смеси и растительные масла. Лекарственные формы описаны в ряде источников, хорошо известных и легко доступных специалистам в данной области техники. Например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.) описаны лекарственные формы, которые можно применять в связи с объектом изобретения.
Используемый в настоящем документе термин животное означает многоклеточный эукариотический организм, определяемый классификацией в царство Animalia или Metazoa. Этот термин включает, но не ограничен ими, млекопитающих. Не имеющие ограничительного характера примеры включают грызунов, водных млекопитающих, домашних животных, таких как собаки и кошки, сельскохозяйственные животные, такие как овцы, свиньи, коровы и лошади, и человека. При использовании терминов животное или млекопитающее или их множественного числа их также считают применимыми к любым животным.
Используемое в настоящем документе выражение консервативная замена относится к замене аминокислот другими аминокислотами, обладающими сходными свойствами (например, кислыми, основными, положительно или отрицательно заряженными, полярными или неполярными). В следующей табл. 1 содержатся аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга.
В табл. 1 показаны аминокислоты в соответствии с категориями по функциональным группам, указывающим на консервативные замены. Избыточный триплетный код, кодирующий каждую аминокислоту, приведен для ссылки.
- 14 045597
Таблица 1
Категория | 3-буквенная аминокислота | 1-буквенная аминокислота | Категория | 3-буквенная аминокислота | 1-буквенная аминокислота | |
Неполярные, алифатические | Gly | G | Полярные, незаряженны e | Ser | S | |
Ala | A | Thr | T | |||
Val | V | Cys | c | |||
Leu | L | Pro | P | |||
Met | M | Asn | N | |||
iLe | I | Gln | Q | |||
Ароматические | Phe | F | Положительн о заряженные | Lys | К | |
Tyr | Y | His | H | |||
T rp | w | Arg | R | |||
Отрицательно заряженные | Asp | D | ||||
Glu | E |
При использовании в настоящем документе консервативная мутация относится к замене нуклеотида на другой нуклеотид, которая не приводит к изменению кодирования аминокислоты, т.е. к изменению избыточной последовательности в вырожденных кодонах, или к замене, приводящей в результате к консервативной замене. Пример избыточности кодонов приведен в табл. 2.
В табл. 2 показан избыточный триплетный код и соответствующие кодируемые аминокислоты.
Таблица 2
U | C | A | G | |||||
U | UUU | Phe | ucu | Ser | UAU | Tyr | UGU | Cys |
UUC | Phe | ucc | Ser | UAC | Tyr | UGC | Cys | |
UUA | Leu | UCA | Ser | UAA | END | UGA | END | |
UUG | Leu | UCG | Ser | UAG | END | UGG | Trp | |
C | CUU | Leu | CCU | Pro | CAU | His | CGU | Arg |
CUC | Leu | CCC | Pro | CAC | His | CGC | Arg | |
CUA | Leu | CCA | Pro | CAA | Gin | CGA | Arg | |
CUG | Leu | CCG | Pro | CAG | Gin | CGG | Arg | |
A | AUU | lie | ACU | Thr | AAU | Asn | AGU | Ser |
AUC | lie | ACC | Thr | AAC | Asn | AGC | Ser | |
AUA | lie | АСА | Thr | AAA | Lys | AGA | Arg | |
AUG | Met | ACG | The | AAG | Lys | AGG | Arg | |
G | GUU | val· | GCU | Ala | GAU | Asp | GGU | Giy |
GUC | val· | GCC | Ala | GAC | Asp | GGC | Giy | |
GUA | val· | GCA | Ala | GAA | Glu | GGA | Giy | |
GUG | Val· | GCG | Ala | GAG | Giu | GGG | Giy |
Таким образом, консервативные мутации кодона UUA включают UUG, CUU, CUC, CUA и CUG.
Используемое в настоящем документе выражение конструкция, образованная из фрагментов рилиновых повторов относится к искусственному белку, образованному из фрагментов, полученных в результате комбинирования повторяющихся участков рилина. Как следует из описания, полноразмерный рилин состоит из участков ДНК или аминокислот (в случае белка), представляющих собой концевые повторы, таких как участки R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8, как видно из аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 3 и в параграфе [0061]. Между этими повторяющимися участками расположены петлевые участки, которые используют при состыковке двух повторяющихся участков.
При использовании в настоящем документе петлевой участок относится к сегменту нуклеиновокислотной последовательности рилина, соответствующей петлевой структуре РНК, которая расположена между двумя повторяющимися участками и соединяет два повторяющихся участка. Термин повторяющийся участок означает сегмент нуклеиново-кислотной последовательности рилина, который образует основное повторяющееся звено. Конкретные повторяющиеся участки раскрыты в тексте описания. В конкретных вариантах осуществления петлевой участок представляет собой структуру, образованную одной нитью нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарные участки, которые фланкируют конкретный однонитевой нуклеотидный участок и гибридизуются таким образом, что однонитевой нуклеотидный участок между комплементарными участками исключается из образования дуплекса или спаривания оснований по Уотсону-Крику.
Используемый в изобретении термин пациент понимают как включающий животное, в частности млекопитающее, и более конкретно человека, получающего или намеренного получать лечение.
Используемый в настоящем документе термин терапевтически эффективное количество означает количество активного соединения или фармацевтического агента, которое вызывает биологический или медицинский ответ в ткани, системе, у животного или у человека, ожидаемый исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом. В отношении нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов эффективное количество содержит количество, достаточное для предотвращения дальнейшей дегенерации или повреждения нейронов, уменьшения симптомов нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов или увеличения плотности дендритов. В некоторых вариантах осуществления эф- 15 045597 фективное количество представляет собой количество, достаточное для задержки развития нейродегенеративного заболевания. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой количество, достаточное для предотвращения или задержки возникновения и/или рецидива нейродегенеративного заболевания. Эффективное количество можно вводить в одной или более доз с интервалом в 2 или более недель в зависимости от потребности или индивидуальной скорости метаболизма рилина.
При использовании в настоящем документе коррекция относится к разрешению основного нейродегенеративного заболевания или повреждения. Например, коррекция болезни Альцгеймера относится к остановке гибели нейронов.
При использовании в настоящем документе лечение или лечащий относится к получению полезных или желательных клинических результатов. Полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены ими, любое одно или более из: смягчения одного или более симптомов, уменьшения степени нейродегенеративного заболевания или повреждения в результате поражения нейронов, стабилизации (т.е. отсутствие ухудшения течения) состояния при нейродегенеративном заболевании или поражении нервной системы, предотвращения или задержки возникновения или рецидива нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов, задержки или замедления прогрессирования заболевания и улучшения состояния при заболевании. В способах по изобретению рассматривают один или более из этих аспектов лечения.
При использовании в настоящем документе поражение нейронов означает повреждение нервной ткани, вызванное внезапной физической травмой в результате какого-либо внешнего условия или условий. Не имеющие ограничительного характера примеры таких внешних условий включают нападение или несчастный случай, перелом, удар или хирургическую процедуру.
Фармацевтически приемлемый компонент является таким, который пригоден для применения у человека и/или животных, не вызывая неоправданных нежелательных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция), соразмерных с обоснованным соотношением пользы и риска.
При использовании в настоящем документе безопасное и эффективное количество относится к количеству компонента, достаточному для получения желательного терапевтического ответа, не вызывающему неоправданных нежелательных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция), соразмерных с обоснованным соотношением пользы и риска.
Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, такой как растворитель, суспендирующий агент или инертное вещество, для доставки рассматриваемого(ых) соединения или соединений животному или человеку. Носитель может быть жидким или твердым и выбран плановым образом для предусмотренного введения. При использовании в настоящем документе фармацевтически приемлемый носитель включает все растворители, дисперсионные среды, инертные вещества, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоидные растворы и т. п. или любое из них. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. В терапевтических композициях рассматривают применение любых обычных сред или агентов за исключением случаев их несовместимости с активным ингредиентом.
Соединения по настоящему изобретению можно включать в лекарственные формы в виде композиций и вводить пациенту, такому как человек, в различных формах, приспособленных к выбранному пути введения, например пероральному или интраперитонеальному, например внутривенному, внутриартериальному или интрацеребральному пути.
Активное соединение можно также вводить интрацеребрально или интраперитонеально, например внутривенно или внутриартериально, путем инфузии или инъекции. Растворы активного соединения или его солей можно готовить в воде или в любом подходящем растворителе, возможно, смешивая с нетоксичным поверхностно-активным веществом (ПАВ). Дисперсии можно также готовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетине и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Фармацевтические дозированные формы, подходящие для инъекции или инфузии, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии, либо стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, которые приспособлены для приготовления стерильных инъекционных или инфузионных растворов или дисперсий непосредственно перед применением. Во всех случаях конечная дозированная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях производства и хранения. Жидкий носитель или инертное вещество может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т. п.), растительные масла, нетоксичные сложные эфиры глицерина и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсий или путем использования ПАВ. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов, например сахаров, буферов или хлорида натрия. Пролонгированной абсорбции инъекционных композиций можно добиться путем использования в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
- 16 045597
Стерильные инъекционные растворы готовят путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель, при необходимости с несколькими другими ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются технологии вакуумной сушки и сублимационной сушки, в результате которых получают порошок активного ингредиента с добавлением любого дополнительного желаемого ингредиента, представляющего собой растворы, предварительно стерилизованные фильтрованием.
Полезные твердые носители включают тонко измельченные твердые вещества, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, диоксид кремния, оксид алюминия и т. п. Полезные жидкие носители включают воду, спирты или гликоли или смеси воды и спирта/гликоля, в которых можно растворять или диспергировать настоящие соединения в эффективных концентрациях, возможно, с помощью нетоксичных ПАВ.
Полезные дозировки соединений по настоящему изобретению могут быть определены путем сравнения их активности in vitro и активности in vivo в биологических моделях. Способы экстраполяции эффективных дозировок у мышей и других животных на человека известны в данной области техники (патент США № 4,938,949 (Borch и соавт.)).
Соответственно, изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению, как описано выше, с фармацевтически приемлемым носителем или без носителя. Фармацевтические композиции, приспособленные для интравентрикулярного, интрацеребрального или парентерального введения, содержащие количество одного или более соединений, эффективное для лечения нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов, являются предпочтительным вариантом осуществления изобретения.
Пример 1.
Рекомбинантные фрагменты рилина были образованы с использованием полноразмерной последовательности рилина человека (Идентификационный № гена: 5649, Национальный центр биотехнологической информации, США, Национальная библиотека медицины, г. Бетезда, штат Мэдисон, США; Комитет по номенклатуре генов человека, графство Кембриджшир, Великобритания, HGNC:HGNC:9957) для определения специфичных участков повторов. Фрагменты были изготовлены коммерческим путем и секвенированы после доставки перед созданием конструкции и продуцированием белка.
Полноразмерный рилин человека (SEQ ID No. 1)
CACGCGTGGGCTCGGCGGGGGCCCGCTCCCAGGCCCGCTCCCGAGCCCGTTCCGCTCCCGTCCG
CCTTCTTCTCGCCTTCTCTCCGCGTGGCTCCTCCGTCCCGGCGTCTCCAAAACTGAATGAGCGA
GCGGCGCGTAGGGCGSCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCATGGAGCGCAGTGGCTG
GGCCCGGCAGACTTTCCTCCTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTGAGGGCGCGCGCGGCGGCT
GGCTATTACCCCCGCTTTTCGCCCTTCTTTTTCCTGTGCACCCACCACGGGGAGCTGGAAGGGG
ATGGGGAGCAGGGCGAGGTGCTCATTTCCCTGCATATTGCGGGCAACCCCACCTACTACGTTCC
GGGACAAGAATACCATGTGACAATTTCAACAAGCACCTTTTTTGACGGCTTGCTGGTGACAGGA
CTATACACATCTACAAGTGTTCAGGCATCACAGAGCATTGGAGGTTCCAGTGCTTTCGGATTTG
GGATCATGTCTGACCACCAGTTTGGTAACCAGTTTATGTGCAGTGTGGTAGCCTCTCACGTGAG
TCACCTGCCCACAACCAACCTCAGTTTCATCTGGATTGCTCCACCTGCGGGCACAGGCTGTGTG
AATTTCATGGCTACAGCAACACACCGGGGCCAGGTTATTTTCAAAGATGCTTTAGCCCAGCAGT
TGTGTGAACAAGGAGCTCCAACAGATGTCACTGTGCACCCACATCTAGCTGAAATACATAGTGA
CAGCATTATCCTGAGAGATGACTTTGACTCCTACCACCAACTGCAATTAAATCCAAATATATGG
GTTGAATGTAACAACTGTGAGACTGGAGAACAGTGTGGCGCGATTATGCATGGCAATGCCGTCA
CCTTCTGTGAACCATATGGCCCACGAGAACTGATTACCACAGGCCTTAATACAACAACAGCTTC
TGTCCTCCAATTTTCCATTGGGTCAGGTTCATGTCGCTTTAGTTATTCAGACCCCAGCATCATC
GTGTTATATGCCAAGAATAACTCTGCGGACTGGATTCAGCTAGAGAAAATTAGAGCCCCTTCCA
ATGTCAGCACAATCATCCATATCCTCTACCTTCCTGAGGACGCCAAAGGGGAGAATGTCCAATT
TCAGTGGAAGCAGGAAAATCTTCGTGTAGGTGAAGTGTATGAAGCCTGCTGGGCCTTAGATAAC
ATCTTGATCATCAATTCAGCTCACAGACAAGTCGTTTTAGAAGATAGTCTCGACCCAGTGGACA
CAGGCAACTGGCTTTTCTTCCCAGGAGCTACAGTTAAGCATAGCTGTCAGTCAGATGGGAACTC
CATTTATTTCCATGGAAATGAAGGCAGCGAGTTCAATTTTGCCACCACCAGGGATGTAGATCTT
TCCACAGAAGATATTCAAGAGCAATGGTCAGAAGAATTTGAGAGCCAGCCTACAGGATGGGATG
TCTTGGGAGCTGTCATTGGTACAGAATGTGGAACGATAGAATCAGGCTTATCAATGGTCTTCCT
CAAAGATGGAGAGAGGAAATTATGCACTCCATCCATGGACACTACCGGTTATGGGAACCTGAGG
TTTTACTTTGTGATGGGAGGAATTTGTGACCCTGGAAATTCTCATGAAAATGACATAATCCTGT
- 17 045597
ATGCAAAAATTGAAGGAAGAAAAGAGCATATAACACTGGATACCCTTTCCTATTCCTCATATAA GGTTCCGTCTTTGGTTTCTGTGGTCATCAATCCTGAACTTCAGACTCCTGCTACCAAATTTTGT CTCAGGCAAAAGAACCATCAAGGACATAATAGGAATGTCTGGGCTGTAGACTTTTTCCATGTCT TGCCTGTTCTCCCTTCTACAATGTCTCACATGATACAGTTTTCCATCAATCTGGGATGTGGAAC GCATCAGCCTGGTAACAGTGTCAGCTTGGAATTTTCTACCAACCATGGGCGCTCCTGGTCCCTC CTTCACACTGAATGCTTACCTGAGATCTGTGCTGGACCCCACCTCCCCCACAGCACTGTCTACT CCTCTGAAAACTACAGTGGGTGGAACCGAATAACAATTCCCCTTCCTAACGCAGCACTAACCCG GAACACCAGGATTCGCTGGAGACAAACAGGACCAATCCTTGGAAACATGTGGGCAATTGATAAT GTTTATATTGGCCCGTCATGTCTCAAATTCTGTTCTGGCAGAGGACAGTGCACTAGACATGGTT GCAAGTGTGACCCTGGATTTTCTGGCCCAGCTTGTGAGATGGCATCCCAGACATTCCCAATGTT TATTTCTGAAAGCTTTGGCAGTTCCAGGCTCTCCTCTTACCATAACTTTTACTCTATCCGTGGT GCTGAAGTCAGCTTTGGTTGTGGTGTCTTGGCCAGTGGTAAGGCCCTGGTTTTCAACAAAGAAG GGCGGCGTCAGCTAATTACATCTTTCCTTGACAGCTCACAATCCAGGTTTCTCCAGTTCACACT GAGACTGGGGAGCAAATCTGTTCTGAGCACGTGCAGAGCCCCTGATCAGCCTGGTGAAGGAGTT TTGCTGCATTATTCTTATGATAATGGGATAACTTGGAAACTCCTGGAGCATTATTCATATCTCA GCTATCATGAGCCCAGAATAATCTCCGTAGAACTACCAGGTGATGCAAAGCAGTTTGGAATTCA GTTCAGATGGTGGCAACCGTATCATTCTTCCCAGAGAGAAGATGTATGGGCTATTGATGAGATT ATCATGACATCTGTGCTTTTCAACAGCATTAGTCTTGACTTTACCAATCTTGTGGAGGTCACTC AGTCTCTGGGATTCTACCTTGGAAATGTTCAGCCATACTGTGGCCACGACTGGACCCTTTGTTT TACAGGAGATTCTAAACTTGCCTCAAGTATGCGCTATGTGGAAACACAATCAATGCAGATAGGA GCATCCTATATGATTCAGTTCAGTTTGGTGATGGGATGTGGCCAGAAATACACCCCACACATGG ACAACCAGGTGAAGCTGGAGTACTCAACCAACCACGGCCTTACCTGGCACCTCGTCCAAGAAGA ATGCCTTCCAAGTATGCCAAGTTGTCAGGAATTTACATCAGCAAGTATTTACCATGCCAGTGAG TTTACACAGTGGAGGAGAGTCATAGTGCTTCTTCCCCAGAAAACTTGGTCCAGTGCTACCCGTT TCCGCTGGAGCCAGAGCTATTACACAGCTCAAGACGAGTGGGCTTTGGACAGCATTTACATTGG GCAGCAGTGCCCCAACATGTGCAGTGGGCATGGCTCATGCGATCATGGCATATGCAGGTGTGAC CAGGGGTACCAAGGCACTGAATGCCACCCAGAAGCTGCCCTTCCGTCCACAATTATGTCAGATT TTGAGAACCAGAATGGCTGGGAGTCTGACTGGCAAGAAGTTATTGGGGGAGAAATTGTAAAACC AGAACAAGGGTGTGGTGTCATCTCTTCTGGATCATCTCTGTACTTCAGCAAGGCTGGGAAAAGA CAGCTGGTGAGTTGGGACCTGGATACTTCTTGGGTGGACTTTGTCCAGTTCTACATCCAGATAG GCGGAGAGAGTGCTTCATGCAACAAGCCTGACAGCAGAGAGGAGGGCGTCCTCCTTCAGTACAG CAACAATGGGGGCATCCAGTGGCACCTGCTAGCAGAGATGTACTTTTCAGACTTCAGCAAACCC
- 18 045597
AGATTTGTCTATCTGGAGCTTCCAGCTGCTGCCAAGACCCCTTGCACCAGGTTCCGCTGGTGGC AGCCCGTGTTCTCAGGGGAGGACTATGACCAGTGGGCAGTCGATGACATCATCATTCTGTCCGA GAAGCAGAAGCAGATCATCCCAGTTATCAATCCAACTTTACCTCAGAACTTTTATGAGAAGCCA GCTTTTGATTACCCTATGAATCAGATGAGTGTGTGGTTGATGTTGGCTAATGAAGGAATGGTTA AAAATGAAACCTTCTGTGCTGCCACACCATCAGCAATGATATTTGGAAAATCAGATGGAGATCG ATTTGCAGTAACTCGAGATTTGACCCTGAAACCTGGATATGTGCTACAGTTCAAGCTAAACATA GGTTGTGCCAATCAATTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGATGCTGGTA TGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCGAAGGAAA CTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGACAAGAATC ACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAGGAGAGCA GCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTTGTCCCAG TTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATATACTGCT GCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTTGAGGGGA AGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAACACTTAA CGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCCTCTGGAC ACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGCATTACCT GCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATGGGATACT CTGGCATTTGCTTCGAGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG
ВВЯЯаДИДДИ1ЯИ81ИДМИ8^
- 19 045597
ATATACTTTTCATCAATGTTCCCTTGCCATACACTGCCCAAACCAATGCTACAAGATTCAGACT CTGGCAACCTTATAATAACGGTAAGAAAGAAGAAATCTGGATTGTTGATGACTTCATTATCGAT GGAAATAATGTAAACAACCCTGTGATGCTCTTGGATACATTTGATTTTGGGCCCAGAGAAGACA ATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAACATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCACC TGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTTGTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCGT GACCTAAATGTGAATGAGAACACCATCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACTGATA GCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACTGGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACCTTCT GCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGCAGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCACCCC AGCAGCACCTACTACGCAGGAACCATGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGGAAGC TGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTTCAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTCAGCC AGTGACATGGGCCATTGATAATGTCTACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGGACAG GGGAGCTGTATCAATGGAACCAAATGTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGTAAAA TAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCTCAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATAGATT CTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCATCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAACCTC TTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCATGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCTAGAT TTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGGATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAACCCGT GCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGTGGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTTCAGC ^jjj^HgAATGTGGGCAGGTACATTGCCCTGGAGATACCCTTGAAAGCCCGTTCTGGTTCTA CTCGCCTTCGCTGGTGGCAACCGTCTGAGAATGGGCACTTCTACAGCCCCTGGGTTATCGATCA GATTCTTATTGGAGGAAATATTTCTGGTAATACGGTCTTGGAAGATGATTTCACAACCCTTGAT AGTAGGAAATGGCTGCTTCACCCAGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATG CCCTGGTCTTCATTGAAAAGGCCAGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGA GG^O^C—”
GAA TTGGAA TA C TCAGTA GA TC TTGGA TTG TCA TGGCACCCA TTGGTAAGGGA C TG TC TGCC TA CCAA TG TGGAA TGCAGTCGC TA TCA TC TGCAACGGA TCCTGGTG TCA GA CA С TTTCAA CAAGTG GACTA GAA TCA CTCTGCCTC TCCCTCCTTA TACCA GG TCCCAAGCCA C TCGTTTCCGTTGGCA T CAACCAGCTCCTTTTGACAAGCAGCAGACA TGGGCAA TAGA TAATGTCTA TA TCGGGGA TGGCT GCA TAGACA TGTGCAGTGGCCA TGGGAGA TGCA TCCAGGGAAACTGCGTCTGTGA TGAACAGTG GGGTGGCCTGTACTGTGATGACCCCGAGACCTCTCTTCCAACCCAACTCAAAGACAACTTCAAT CGAGCTCCA TCCA G TCA GAA CTGGCTGAC TG TGAA CGGA GGGAAA TTGA GTACAG TGTG TGGA G
- 20 045597
CCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTCCATTTCAGTGGGGGTTGTAGTCGATTATTAGTCACTGTGGA TCTAAACCTCACTAATGCTGAGTTCA TCCAA TTTTACTTCA TGTA TGGGTGCCTGA TTACACCA AACAACCGTAACCAAGGTGTTCTCTTGGAATATTCTGTCAATGGAGGCATTACCTGGAACCTGC TCATGGAGATTTTCTATGACCAGTACAGTAAGCCCGGATTTGTGAATATCCTTCTCCCTCCTGA TGCTAAAGAGATTGCCACTCGCTTCCGCTGGTGGCAGCCAAGACATGACGGCCTGGATCAGAAC GACTGGGCCATTGACAATGTCCTCATCTCAGGCTCTGCTGACCAAAGGACCGTTATGCTGGACA CCTTCAGCAGCGCCCCAGTACCCCAGCACGAGCGCTCCCCTGCAGATGCCGGCCCTGTCGGGAG GATCGCCTTTGACATGTTTATGGAAGACAAAACTTCAGTGAATGAGCACTGGCTATTCCATGAT GATTGTACAGTAGAAAGATTCTGTGACTCCCCTGATGGTGTGATGCTCTGTGGCAGTCATGATG GACGGGAGGTGTATGCAGTGACCCATGACCTGACTCCCACTGAAGGCTGGATTATGCAATTCAA GATCTCAGTTGGATGTAAGGTGTCTGAAAAAATTGCCCAGAATCAAATTCATGTGCAGTATTCT ACTGACTTCGGTGTGAGTTGGAATTATCTGGTCCCTCAGTGCTTGCCTGCTGACCCAAAATGCT CTGGAAGTGTTTCTCAGCCATCTGTATTCTTTCCAACTAAAGGGTGGAAAAGGATCACCTACCC ACTTCCTGAAAGCTTAGTGGGAAATCCGGTAAGGTTTAGGTTCTATCAGAAGTACTCAGACATG CAGTGGGCAATCGATAATTTCTACCTGGGCCCTGGATGCTTGGACAACTGCAGGGGCCATGGAG ATTGCTTAAGGGAACAGTGCATCTGTGATCCGGGATACTCAGGGCCAAACTGCTACTTGACCCA CACTCTGAAGACTTTCCTGAAGGAACGCTTTGACAGTGAAGAAATCAAACCTGACTTATGGATG TCCTTAGAAGGTGGAAGTACTTGCACTGAGTGTGGAATTCTTGCCGAGGACACTGCACTCTATT TTGGGGGATCCACTGTGAGACAAGCGGTTACACAAGATTTGGATCTTCGAGGTGCAAAGTTCCT GCAATACTGGGGGCGCATCGGTAGTGAGAACAACATGACCTCTTGCCATCGTCCCATCTGCCGG AAGGAAGGCGTGCTGTTGGACTACTCTACCGATGGAGGAATTACCTGGACTTTGCTCCATGAGA TGGATTACCAGAAATACATTTCTGTTAGACACGACTACATACTTCTTCCTGAAGATGCCCTCAC CAACACAACTCGACTTCGCTGGTGGCAGCCTTTTGTGATCAGCAATGGAATTGTGGTCTCTGGG GTGGAGCGTGCTCAGTGGGCACTGGACAACATTTTGATTGGTGGAGCAGAAATCAATCCCAGCC AATTGGTGGACACTTTTGATGATGAAGGCACTTCCCATGAAGAAAACTGGAGTTTTTACCCTAA TGCTGTAAGGACAGCAGGATTTTGTGGCAATCCATCCTTTCACCTCTATTGGCCAAATAAAAAG AAGGACAAGACTCACAATGCTCTCTCCTCCCGAGAACTCATTATACAGCCAGGATACATGATGC AGTTTAAAATTGTGGTGGGTTGTGAAGCCACTTCTTGTGGTGACCTTCATTCCGTAATGCTGGA ATACACTAAGGATGCAAGATCGGATTCCTGGCAGCTCGTACAGACCCAGTGCCTTCCTTCCTCT TCTAACAGCATTGGCTGCTCCCCTTTCCAGTTCCATGAAGCCACCATCTACAACTCTGTCAACA GCTCAAGCTGGAAAAGAATCACCATCCAGCTGCCTGACCATGTCTCCTCTAGTGCAACACAGTT CCGCTGGATCCAGAAGGGAGAAGAAACTGAGAAGCAAAGCTGGGCAATTGACCACGTGTACATT
- 21 045597
GGAGAGGCTTGCCCCAAGCTCTGCAGCGGGCACGGATACTGCACGACCGGTGCCATCTGCATCT GCGACGAGAGCTTCCAAGGTGATGACTGCTCTGTTTTCAGTCACGACCTTCCCAGTTATATTAA AGATAATTTTGAGTCCGCAAGAGTCACCGAGGCAAACTGGGAGACCATTCAAGGTGGAGTCATA GGAAGTGGCTGTGGGCAGCTGGCCCCCTACGCCCATGGAGACTCACTGTACTTTAATGGCTGTC AGATCAGGCAAGCAGCTACCAAGCCTCTGGATCTCACTCGAGCAAGCAAAATCATGTTTGTTTT GCAAATTGGGAGCATGTCGCAGACGGACAGCTGCAACAGTGACCTGAGTGGCCCCCACGCTGTG GACAAGGCGGTGCTGCTGCAATACAGCGTCAACAACGGGATCACCTGGCATGTCATCGCCCAGC ACCAGCCAAAGGACTTCACACAAGCTCAGAGAGTGTCTTACAATGTCCCCCTGGAGGCACGGAT GAAAGGAGTCTTACTGCGCTGGTGGCAACCACGCCACAATGGAACAGGTCATGATCAATGGGCT TTGGACCATGTGGAGGTCGTCCTAGTAAGCACTCGCAAACAAAATTACATGATGAATTTTTCAC GACAACATGGGCTCAGACATTTCTACAACAGAAGACGAAGGTCACTTAGGCGATACCCATGAAG AATCAAAAAGTTTATTTTTTTTCTTCCAACATGTGATGTGTTGCTCTCCATTCTTTTAAATCTC GCACTACATCTGATATCAGGAAATATCTGTGAAGGACTTGGTGATTACCTGAAAGCCCTTCTCA AGACCGAGTGTACACCACTTTCCCACACTGTGAACTAATGACAAGTGACTTATTTGCTCATAAG TAAATGTCTTCATGTTGATGTGTCCGTGAAAGTTGTGATCTGTTGTAATATCAGTTACAGTGGC AGTATTGACAATAAGAAACAGTTTAACAGAAAAATGAAATTTAAGCACAAAAAATTTAAGAGAT TTTATGTTTAAAATGGCATTTAGCACAGTATTTAACATTCTTGGTCACAAAGCTATTTAAGTGG ACTGTATTTCAGCTATGTCTCATGTTTTATATGATTAAATTATCATTGTTTGTCCTTTATGTAT TCTCTTCTACAATACAACACATTGAAACTGTATTTACTTGTTATGTTGTAATATTTTGCTGCTG AATTTGGGGCTACTTATATTCTGCAGAAAATTAATTGAAATACCTATTCAAGAAGATAGTTGTA AAGATATTGTATCTCCTTTAATATACTCCTTAAAAATGTATGTTGGTTTAGCGTTGTTTTGTGG ataagaaaaatgcttgaccctgaaatattttctactttaaattgtggatgaagaccctatctcc CACAAATAAGTTCCCATTTCCTTGTCTAAAGATCTTTTTTTAAGTGTTCTGTGGCTGATTTACT AACAGTAACTGCCATTTTTTGTCTGTGATAACAGAGTGATTTGTAAAACAGTGGTTGTTTTTTC ATTGTGTTTTCTTCGTGGATTGTTTTTTCTGCGGGTCATATTCATACCTTCTGATGAAGTTGTA CAACACCAGCAACATTATAATGGCCCTGTAGCTCTGAATGCTATTTGTGTAACTGAAAGGTTGC ACTCTAGGGTGAACCAAGCTATAAAAGCCCATGCTTAAATAAAAATTATGTCCAAAAGCC
Карта последовательности, включающая участки рилиновых повторов и некоторые сайты расщепления ферментами, представлена на фиг. 5.
Клетки HEK293 были стабильно трансфицированы полноразмерным геном рилина в векторе pCrl с получением фрагментов для образования рекомбинантного рилина. Полноразмерный рилин встраивали в клетки HEK293, как описано ранее (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol. Chem. 2002; 277: 39944-39952; Sinagra, et al., Reelin, verylow-density lipoprotein receptor, and apolipoprotein E receptor 2 control somatic NMDA receptor composition during hippocampal maturation in vitro. J. Neurosci. 2005; 25: 6127-6136). Как только клетки достигали конфлюэнтности, их выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы и с 0,2% бычьим сывороточным альбумином в течение 2 суток, после чего среду собирали, стерильно фильтровали и концентрировали с помощью устройств для центрифужного фильтрования Centricon Plus80 (Millipore). Рилин подвергали внеклеточному расщеплению в двух сайтах, в результате чего было получено три основных фрагмента: от N-конца до повтора 2 (примерно 180 кДа), центральный фрагмент из повтора 3-6 (примерно 190 кДа) и C-концевой фрагмент, состоящий из повторов 7 и 8 (примерно 80 кДа) (Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 8196-820; de Rouvroit, et al., (1999) Reelin, the extracellular matrix protein deficient in reeler mutant mice, is processed by a metalloproteinase. Exp. Neurol. 1999; 156: 214-217; Utsunomiya-Tate, et al., Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inhibited by the functionblocking CR-50 antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97:9729-9734; Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004 (Jossin, et al., Processing of Reelin by embryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J. Neurosci. 2007; 27: 4243-4252; Koie, et al., Cleavage within Reelin repeat 3 regulates the duration and range of the signaling activity of Reelin protein. J. Biol. Chem. 2014; 289: 12922-12930; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). Кроме того, получили два промежуточных фрагмента: один состоит из фрагмента от N-конца до повтора 6 (приблизительно 370 кДа), а другой состоит из повторов 6-8 (приблизи- 22 045597 тельно 270 кДа) (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521).
Расщепление полноразмерного рилина проводили, как обсуждалось выше, с образованием липких концов. Для получения рекомбинантного рилина было получено два или более рилиновых фрагмента путем лигирования последовательности ДНК, представляющей собой специфичные рилиновые повторы. Полученные в результате повторяющиеся участки рилина также были секвенированы, чтобы подтвердить, что кодирующие участки сохранены, а рамка считывания находится в правильной ориентации. Рекомбинантные рилиновые белки были получены с использованием стандартных методик и амплифицированы в несущих векторах Bluescript. Рекомбинантную ДНК клонировали в экспрессионном векторе и экспрессировали в культуре клеток HEK293.
Рилиновый повтор 3 (SEQ ID No. 2)
TTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGATGCTGGTATGTCCTGGTTTCTGG
TGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCGAAGGAAACTCCAGAGAACTAAG
TGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGACAAGAATCACCATTGTTATTCCA
AGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAGGAGAGCAGCTCACAGAAAAACG
TGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTTGTCCCAGTTACTGCAGTGGCCA
TGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATATACTGCTGCACAAGGAACCTGT
GTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTTGAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGT
GGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAACACTTAACGATGGCAAATCTCT
CTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCCTCTGGACACCAGGAATATCAGA
CTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGCATTACCTGCATCAAACCAAGAA
CTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATGGGATACTCTGGCATTTGCTTCG
AGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG
Рилиновый повтор 4 (SEQ ID No. 3)
CCCTTCAGCAACTCCCACAGTGTACAGCTCCAGTATTCTCTGAACAATGGCAAGGACTGGCATC
TTGTCACCGAAGAGTGTGTTCCTCCAACCATTGGCTGTCTGCATTACACGGAAAGTTCAATTTA
CACCTCGGAAAGATTCCAGAATTGGAAGCGGATCACTGTCTACCTTCCACTCTCCACCATTTCT
CCCAGGACCCGGTTCAGATGGATTCAGGCCAACTACACTGTGGGGGCTGATTCCTGGGCGATTG
ATAATGTTGTACTGGCCTCAGGGTGCCCTTGGATGTGCTCAGGACGAGGGATTTGTGATGCTGG
ACGCTGTGTGTGTGACCGGGGCTTTGGTGGACCCTATTGTGTTCCTGTTGTTCCTCTGCCCTCG
ATTCTTAAAGACGATTTCAATGGGAATTTACATCCTGACCTTTGGCCTGAAGTGTATGGTGCAG
AGAGGGGGAATCTGAATGGTGAAACCATCAAATCTGGAACATCTCTAATTTTTAAAGGGGAAGG
ACTAAGGATGCTTATTTCAAGAGATCTAGATTGTACAAATACAATGTATGTCCAGTTTTCACTT
AGATTTATAGCAAAAAGTACCCCAGAGAGATCTCACTCTATTCTGTTACAATTCTCCATCAGTG
GAGGAATCACTTGGCACCTGATGGATGAATTTTACTTTCCTCAAACAACG
Рилиновый повтор 5 (SEQ ID No. 4)
GATAGCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACTGGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACC
TTCTGCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGCAGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCA
CCCCAGCAGCACCTACTACGCAGGAACCATGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGG
AAGCTGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTTCAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTC AGCCAGTGACATGGGCCATTGATAATGTCTACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGG
ACAGGGGAGCTGTATCAATGGAACCAAATGTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGT
AAAATAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCTCAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATA
GATTCTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCATCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAA
CCTCTTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCATGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCT
AGATTTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGGATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAAC
CCGTGCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGTGGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTT
CAGCAATTCCAGC
- 23 045597
Рилиновый повтор 6 (SEQ ID No. 5)
GTCACAGACTCTTGTTATGCGATTGAATTGGAATACTCAGTAGATCTTGGATTGTCATGGCACC CATTGGTAAGGGACTGTCTGCCTACCAATGTGGAATGCAGTCGCTATCATCTGCAACGGATCCT GGTGTCAGACACTTTCAACAAGTGGACTAGAATCACTCTGCCTCTCCCTCCTTATACCAGGTCC CAAGCCACTCGTTTCCGTTGGCATCAACCAGCTCCTTTTGACAAGCAGCAGACATGGGCAATAG ATAATGTCTATATCGGGGATGGCTGCATAGACATGTGCAGTGGCCATGGGAGATGCATCCAGGG AAACTGCGTCTGTGATGAACAGTGGGGTGGCCTGTACTGTGATGACCCCGAGACCTCTCTTCCA ACCCAACTCAAAGACAACTTCAATCGAGCTCCATCCAGTCAGAACTGGCTGACTGTGAACGGAG GGAAATTGAGTACAGTGTGTGGAGCCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTCCATTTCAGTGGGGGTTG TAGTCGATTATTAGTCACTGTGGATCTAAACCTCACTAATGCTGAGTTCATCCAATTTTACTTC ATGTATGGGTGCCTGATTACACCAAACAACCGTAACCAAGGTGTTCTCTTGGAATATTCTGTCA ATGGAGGCATTACCTGGAACCTGCTCATGGAGATTTTCTATGACCAGTACAGT
Петлевой участок рилиновых повторов 3-4 (SEQ ID No. 6)
GAACCACAGATCATTTCCATTGACCTGCCACAGGACGCGAAGACACCTGCAACGGCATTTCGAT GGTGGCAACCGCAACATGGGAAGCATTCAGCCCAGTGGGCTTTGGATGATGTTCTTATAGGAAT GAATGACAGCTCTCAAACTGGATTTCAAGACAAATTTGATGGCTCTATAGATTTGCAAGCCAAC TGGTATCGAATCCAAGGAGGTCAAGTTGATATTGACTGTCTCTCTATGGATACTGCTCTGATAT TCACTGAAAACATAGGAAAACCTCGTTATGCTGAGACCTGGGATTTTCATGTGTCAGCATCTAC CTTTTTGCAGTTTGAAATGAGCATGGGCTGTAGCAAG
Петлевой участок рилиновых повторов 4-5 (SEQ ID No. 7)
AATATACTTTTCATCAATGTTCCCTTGCCATACACTGCCCAAACCAATGCTACAAGATTCAGAC TCTGGCAACCTTATAATAACGGTAAGAAAGAAGAAATCTGGATTGTTGATGACTTCATTATCGA TGGAAATAATGTAAACAACCCTGTGATGCTCTTGGATACATTTGATTTTGGGCCCAGAGAAGAC AATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAACATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCAC CTGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTTGTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCG TGACCTAAATGTGAATGAGAACACCATCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACT
Петлевой участок рилиновых повторов 5-6 (SEQ ID No. 8)
AATGTGGGCAGGTACATTGCCCTGGAGATACCCTTGAAAGCCCGTTCTGGTTCTACTCGCCTTC GCTGGTGGCAACCGTCTGAGAATGGGCACTTCTACAGCCCCTGGGTTATCGATCAGATTCTTAT TGGAGGAAATATTTCTGGTAATACGGTCTTGGAAGATGATTTCACAACCCTTGATAGTAGGAAA TGGCTGCTTCACCCAGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATGCCCTGGTCT TCATTGAAAAGGCCAGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGAGGATTCCTT CCTACAGATAGACTTCGCTGCCTCCTGCTCA
Рекомбинантная конструкция гена рилина человека, фрагмент R3, конъюгированный с фрагментом R6, т.е. фрагмент гена рилина R3 + R6 (SEQ ID NO. 9)
AAGCTTCCACC
TTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGAT
GCTGGTATGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCG AAGGAAACTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGAC AAGAATCACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAG GAGAGCAGCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTT GTCCCAGTTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATA TACTGCTGCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTT GAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAA CACTTAACGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCC TCTGGACACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGC ATTACCTGCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATG
GAAC C ACAGAT СATTTC
- 24 045597
CATTGACC_GCCACAGGACGCGAAGACACCTGCAACGGCATTTCGA_GGTGGCAACCGCAAC.AT
CTGGATTTCAAGACAAATTTGATGGCTCTATAACCCTTGATAGTAGGAAATGGCTGCTTCACCC
AGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATGCCCTGGTCTTCATTGAAAAGGCC
AGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGAGGATTCCTTCCTACAGATAGACT
TGGA TTGTCA TGGCACCCA TTGGTAAGGGACTGTCTGCCTACCAA TGTGGAA TGCAGTCGCTA T CA TC TGCAACGGA TCC TGGTG TCA GA CA CTTTCAA CAA GTGGAC TA GAA TCACTC TGCCTCTCC CTCCTTATACCAGGTCCCAAGCCACTCGTTTCCGTTGGCATCAACCAGCTCCTTTTGACAAGCA GCAGACA TGGGCAA TAGA TAA TGTCTA TA TCGGGGATGGCTGCATAGACA TGTGCAGTGGCCA T GGGAGATGCATCCAGGGAAACTGCGTCTGTGATGAACAGTGGGGTGGCCTGTACTGTGATGACC CCGAGACCTCTCTTCCAACCCAACTCAAAGACAACTTCAATCGAGCTCCATCCAGTCAGAACTG GCTGACTGTGAACGGAGGGAAATTGAGTACAGTGTGTGGAGCCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTC CATTTCAGTGGGGGTTGTAGTCGATTATTAGTCACTGTGGATCTAAACCTCACTAATGCTGAGT TCATCCAATTTTACTTCATGTATGGGTGCCTGATTACACCAAACAACCGTAACCAAGGTGTTCT CTTGGAA TA TTCTGTCAA TGGAGGCA TTACCTGGAACCTGCTCATGGAGA TTTTCTATGACCAG TACAGTGATTACAAGGATGACGACGATAAGTGACTCGAG
Рекомбинантная конструкция белка рилина человека, фрагмент R3, конъюгированный с фрагментом R6, т.е. фрагмент белка рилина R3 + R6 (SEQ ID No. 10)
MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNS RELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSY CSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLND GKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFYIQIGSKTSGITCIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILW HLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQ DKFDGSITLDSRKWLLHPGGTKMPVCGSTGDALVFIEKASTRYWSTDVAVNEDSFLQIDFAAS CSVTDSCYAIELEYSVDLGLSWHPLVRDCLPTNVECSRYHLQRILVSDTFNKWTRITLPLPPYT RSQATRFRWHQPAPFDKQQTWAIDNVYIGDGCIDMCSGHGRCIQGNCVCDEQWGGLYCDDPETS LPTQLKDNFNRAPSSQNWLTVNGGKLSTVCGAVASGMALHFSGGCSRLLVTVDLNLTNAEFIQF YFMYGCLITPNNRNQGVLLEYSVNGGITWNLLMEIFYDQYS * Кодирующие участки отмечены цветом в последовательности ДНК выше, участки простым шрифтом (без модификаций шрифта, таких как подчеркивание, курсив) не транслируются в белок.
Рекомбинантная конструкция гена рилина человека, фрагмент R3 конъюгирован с фрагментом R5, т.е. фрагмент гена рилина R3 + R5 (SEQ ID No. 11)
- 25 045597
ААбСТТССАССМДИМДЭДЖмИсИ
VTTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGAT GCTGGTATGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCG AAGGAAACTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGAC AAGAATCACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAG GAGAGCAGCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTT GTCCCAGTTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATA TACTGCTGCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTT GAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAA CACTTAACGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCC TCTGGACACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGC ATTACCTGCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATG GGATACTCTGGCATTTGCTTCGAGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG .... .
GACAATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAA
CATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCACCTGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTT GTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCGTGACCTAAATGTGAATGAGAACACCA TCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACTGATAGCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACT GGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACCTTCTGCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGC AGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCACCCCAGCAGCACCTACTACGCAGGAACCA TGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGGAAGCTGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTT CAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTCAGCCAGTGACATGGGCCATTGATAATGTC TACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGGACAGGGGAGCTGTATCAATGGAACCAAAT GTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGTAAAATAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCT CAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATAGATTCTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCA TCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAACCTCTTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCA TGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCTAGATTTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGG ATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAACCCGTGCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGT GGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTTCAGCAATTCCAGCGATTACAAGGATGACG ACGATAAGTGACTCGAG
Рекомбинантная конструкция белка рилина человека, фрагмент R3, конъюгированный с фрагментом R5, т.е. фрагмент белка рилина R3 + R5 (SEQ ID No. 12) MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNS RELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSY CSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLND GKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFYIQIGSKTSGITCIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILW HLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQ DKFDGSIDDNWFFYPGGNIGLYCPYSSKGAPEEDSAMVFVSNEVGEHSITTRDLNVNENTIIQF EINVGCSTDSSSADPVRLEFSRDFGATWHLLLPLCYHSSSHVSSLCSTEHHPSSTYYAGTMQGW RREWHFGKLHLCGSVRFRWYQGFYPAGSQPVTWAIDNVYIGPQCEEMCNGQGSCINGTKCICD PGYSGPTCKISTKNPDFLKDDFEGQLESDRFLLMSGGKPSRKCGILSSGNNLFFNEDGLRMLMT RDLDLSHARFVQFFMRLGCGKGVPDPRSQPVLLQYSLNGGLSWSLLQEFLFSNSS * Кодирующие участки отмечены цветом в последовательности ДНК выше, участки простым шрифтом (без модификаций шрифта, таких как подчеркивание, курсив) не транслируются в белок.
Пример 2.
Повторяющиеся участки выделяли из рилина, как показано в примере 1. Участок R3 вырезали с получением липких концов ДНК. Ген рилина инкубировали с ферментами EcoRI и BatXI, и в результате получили эксцизию сегмента около 6300 п. о. Впоследствии вырезанный фрагмент R3 был вставлен в вирусный вектор AAV-9 или AAV-5. Вирусный вектор расщепляли за промотором CMV, если вектор обладал промотором CMV, например pMDLg/pPRE или pAD3000. Однако, где промотор CMV не был расположен в векторе на момент трансфекции, таком как pAdEasy-1, этот промотор присоединяли вместе с фрагментом рилина. Конструкция, содержащая фрагмент рилина и промотор CMV, образована с ком- 26 045597 плементарными концами EcoRI и BatXI. Конструкцию инкубировали с вектором в ферменте, таком как лигаза, с образованием нового вектора, содержащего фрагмент рилина и промотор CMV. Вектор вводили в клетки с получением вирусов, содержащих фрагменты рилина.
Хотя в обсуждаемом выше примере приведен рилин R3, этот способ был использован для получения других вариантов рилина, включающих фрагмент R3-5, фрагмент R3+5 и фрагмент R3+6, описанные в примере 1.
Пример 3.
Фрагменты рилина были образованы, как описано в примере 1. Различные варианты рилина, включающие фрагмент R3-R6, R3+R5 и R3+R6, были исследованы с использованием ApoER2 в качестве генарепортера в количественном определении люциферазы. Однако другие альтернативные варианты сплайсинга, такие как R2 (NR2), R6 (NR6), R3-C и R7-C, также считают полезными аспектами изобретения.
Количественные определения люциферазы проводили, чтобы определить кластеризацию рецептора ApoER2 на основании увеличения испускания света при кластеризации рецептора, как показано на фиг. 6. Субстрат люциферазы растворяли в буфере для люциферазы (1:1), и N-концевую люциферазу конъюгировали с первой серией рецепторных белков ApoER2, а C-концевую люциферазу конъюгировали со второй серией рецепторных белков ApoER2. В каждый аналитический планшет вносили конъюгированный с люциферазой ApoER2, в соотношениях 1:1 (т.е. 50 мкл C-концевой люциферазы на 50 мкл Nконцевой люциферазы). Различные варианты рилина человека, показанные на фиг. 3, 7-9, были исследованы с использованием ApoER2 в качестве гена-репортера. После добавления 5 нмоль/л исследуемого рилина смесь перемешивали в течение 10 мин и определяли излучение света.
Все фрагменты рилина мыши за исключением R5-6 приводили в результате к 2-кратному - 4кратному увеличению испускания света, как показано на фиг. 10. Максимальное усиление светового сигнала при использовании фрагментов рилина человека было 2,5-3-кратным, как показано на фиг. 11. Кроме того, активность большинства фрагментов рилина человека была сопоставимой с наиболее эффективным рилином, показанным на фиг. 10, поскольку для фрагментов R3-5 рилина человека, R3-4 рилина человека и R3+R6 рилина человека была выявлена приблизительно одинаковая или повышенная активность люциферазы по сравнению с фрагментом R3-6. Фрагмент R3+R5 рилина человека характеризовался приблизительно 50%-ной активностью по сравнению с R3-6 или сопоставимой с R3+R6, R3+R5 и R4+R6, как показано на фиг. 10. Как показано на фиг. 12, фрагменты как мыши, так и человека обладали эффективностью при индукции кластеризации рецептора, о чем свидетельствует усиление активации сигнала люциферазы.
Пример 4.
Анализ влияния активации клеточного сигнала и процессинга рилина проводили путем тестирования активации рецептора ApoER. В недавней работе подчеркнута важная роль активации передачи сигнала рилина в нормальном обучении и памяти (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277: 39944-39952), а также в патологических случаях, где эта активация передачи сигнала нарушена. Например, липопротеиновые рецепторы играют роль в когнитивных процессах, и предполагают участие этого семейства рецепторов в патологических процессах, лежащих в основе прогрессирования болезни Альцгеймера (БА). Два основных лиганда этих рецепторов, apoE и рилин, по-видимому, обладают сигнальной способностью, которая может значимо влиять на синаптическую функцию. APC в настоящее время является модулятором-кандидатом активации передачи сигнала рилина, поскольку, по-видимому, обладает структурными группировками, которые связываются с ApoER2 и активируют нисходящие эффекторы. Исследование модулирования активации передачи сигнала рилина под действием APC имеет колоссальное научное и клиническое значения, поскольку может предоставить новые пути терапии.
Был проведен анализ влияния рилина на активацию и пути передачи сигнала рецептора ApoER. Культуру первичных нейронов получали из 17-дневных эмбрионов мышей и выращивали в бессывороточной питательной среде Neurobasal (Gibco BRL) с добавлением B27 (Gibco BRL) и l-глутамина при 37°С в 5% CO2. Клетки оставляли для созревания в культуре на 8 дней. Культуры клеток обрабатывали 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6). В определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином клетки подвергали лизису. Общую экспрессию ApoER2, AKT, фосфорилирование AKT, фосфорилирование внеклеточно регулируемой киназы (ERK) и общее содержание внеклеточно регулируемой киназы (ERK) определяли методом Вестерн-блоттинга и стандартизовали по необработанному образцу (момент времени 0). Состояние фосфорилирования ERK представляет собой прямое обнаружение активности ERK и представляет активацию восходящего сигнального пути.
На репрезентативном Вестерн-блоте, показанном на фиг. 13(A), видна относительно стабильная экспрессия ApoER2. При нормализации по актину было обнаружено снижение экспрессии ApoER2 в течение первых 30 минут после воздействия рилина, после чего уровни экспрессии стабилизировались, как видно на фиг. 13(B). Концентрации AKT снижались в течение 60 минут после воздействия рилина, при этом концентрации фосфорилированной AKT возрастали, как видно на фиг. 13(A). Нормализация AKT и pAKT по актину отражала тенденции, наблюдаемые на блоттинге, при этом концентрации AKT снижа- 27 045597 лись в течение 60 минут после воздействия рилина, после чего снова возрастали до уровней до воздействия, как видно на фиг. 13(D). В течение 60 минут после воздействия концентрация фосфорилированной AKT резко возрастала, затем быстро снижалась до уровней до воздействия, как видно на фиг. 13(C). Общее количество ERK, по-видимому, оставалось постоянным на протяжении всего эксперимента, при этом фосфорилированная ERK 1 и 2 была видна через 10 минут и через 240 минут после воздействия рилина, как видно на фиг. 13(A). Тенденции при нормализации ERK и pERK1/2 по актину тенденции, наблюдаемые на блоттинге, совпадали, что свидетельствует о сильном фосфорилировании через 10 минут после воздействия рилина с незначительным вторичном увеличении через 240 минут после воздействия рилина, как видно на фиг. 13(E) и (F). Пиковое отношение количества pERK к общему количеству ERK было обнаружено через 10 минут после воздействия рилина, а затем медленно снижалось на протяжении 120 минут после воздействия рилина и впоследствии незначительно увеличивалось, как видно на фиг. 13(G).
Чтобы подтвердить, что эти результаты не были специфичными для фрагмента рилина (R-3-6), эксперимент с культурой первичных нейронов повторяли с другими фрагментами рилина, как видно на фиг. 14(A). Культуры первичных нейронов обрабатывали 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены рилиновые повторы R3 и R5 (hR3+6) последовательности рилина человека, повторы R3 и R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут. Клетки подвергали лизису и ставили Вестерн-блоттинги, как описано выше, для определения общего содержания ERK и содержания фосфорилированной ERK.
На репрезентативном Вестерн-блоте, показанном на фиг. 14(A) показано, что обработка рилином не приводила к отчетливому влиянию на общее содержание ERK. Действительно, нормализация результатов по актину показала, что как рекомбинантные фрагменты рилина человека (hR3+5 и hR3+6), так и полноразмерный рилин приводили к незначительному снижению общего содержания ERK, как видно на фиг. 14(C), при этом фрагмент рилина мыши (R3-6 и NR2) приводили к незначительному увеличению содержания ERK. Однако обработка как рекомбинантными фрагментами рилина человека (hR3+5 и hR3+6), так и полноразмерным рилином вызывала значительное увеличение содержания фосфорилированной ERK1/2, как видно на фиг. 14(B). Фрагмент рилина мыши, образованный из повторов 3-6 (R3-6), показал незначительное увеличение количества фосфорилированной ERK, которое перекрывалось с контролем. Напротив, N-концевой фрагмент (NR2) рилина мыши приводил к уменьшению содержания фосфорилированной ERK. Сравнение содержания фосфорилированной ERK и общего содержания ERK показало, что под действием фрагмента R3-6 мыши фосфорилирование было предварительно эквивалентным общему содержанию ERK (1,15 для R3-6), что согласуется с результатами, показанными на фиг. 13(G). Контрольные культуры с ложной обработкой характеризовались отношением 1,09. N-Концевой фрагмент мыши не запускал фосфорилирование ERK, поскольку ее концентрации составляли около 50% от контрольных (0,53). Фрагменты рилина чеовека (R3+5 и R3+6) подобно полноразмерному рилину (2,5) приводили к фосфорилированию ERK (2,22 и 2 соответственно). Эти результаты показывают, что фрагменты рилина человека оказывают более сильное влияние на активацию передачи сигнала ApoER2, чем фрагменты рилина мыши, и, вероятно, они будут обладать большей действенностью при лечении.
Пример 5.
Анализ влияния рилина на метаболические пути клетки проводили путем тестирования белковмодификаторов рилинового пути. Изменения фрагмента комплемента рилина, по-видимому, коррелируют с изменениями активации нисходящей передачи сигнала рилина, на что указывает фосфорилирование основного компонента нисходящего пути Dab-1.
Анализ фосфорилирования DAB-1 проводили с использованием гена-репортера DAB-1, конъюгированного с ЛПОНПР и ApoEr. Культуру первичных нейронов получали из 17-девных эмбрионов мыши, как обсуждалось выше. Клетки оставляли для созревания в культуре на 8 дней. В лунки планшетов (96луночных, 24 луночных) наносили в виде покрытия раствора 0,1 мг/мл (0,01%) поли-Ь-лизина (разведенного из 1 мг/мл), добавляя в каждую лунку 50 мкл или 100 мкл поли-Ь-лизина. Лунку или лунки инкубировали при 37°С в течение как минимум 1 часа, и раствор удаляли отсасыванием в вакууме или иным путем. Лунки промывали 150 мкл воды. Клетки суспендировали в соотношении 1:10 в питательной среде с высоким содержанием глюкозы и добавляли в лунки планшетов до 80-90% конфлюэнтности (в течение 20-24 часов).
Среду Opti M (без сыворотки, т.е. неполную) и полную питательную среду с высоким содержанием глюкозы нагревали до 37°С. В каждую из двух пробирок типа Эппендорф добавляли среду Opti-M (500 мкл). В первую из двух пробирок типа Эппендорф добавляли ДНК (20 мкл), а во вторую пробирку типа Эппендорф добавляли липфектамин (20 мкл). Содержимое каждой пробирки перемешивали, и два раствора инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. ДНК двух слитых белков ApoER2 и липофектамин смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Смесь для трансфекции добавляли в количестве 10 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащую клет
- 28 045597 ки, и смесь инкубировали.
Спустя 48 часов измеряли активность люциферазы. Фрагмент рилина R3-6 кипятили при 100°С в течение 10 минут и использовали в качестве контроля. Субстрат люциферазы растворяли в буфере для люциферазы (1:1) и добавляли люциферазу в каждый трансфицированный планшет в соотношении 1:1 (т.е. 50 мкл люциферазы на 50 мкл раствора для трансфекции). Смесь перемешивали в течение 10 мин и определяли излучение света.
При связывании с рилином воздействие полноразмерного рилина приводило к воспроизводимому влиянию на Dab-1, вызывая незначительные изменения в состоянии фосфорилирования, как видно на фиг. 15 и 16. Напротив, при приведении в контакт срезов гиппокампа с фрагментом R3-6 показано зависимое от времени влияния на фосфорилирование Dab-1, как видно на фиг. 17 и 18. В обработанных APC моноцитах показано повышенное содержание активного Dab1 (Tyr220-p), Akt Ser473-p и GSK3e Ser9-p. Было обнаружено, что предварительная обработка RAP или нокдаун по гену ApoER2 ослабляет это влияние, при этом ингибиторы EPCR и PAR1 не оказывают никакого влияния. Интересно, что было обнаружено связывание APC с ApoER2 с аффинностью 30 нмоль/л, но не обнаружено связывание с ЛПОНПР. Что касается влияния APC на активацию передачи сигнала ApoER2, было обнаружено, что рецепторассоциированный белок (RAP) блокирует опосредованное APC ингибирование вызванную эндотоксином прокоагулянтную активность тканевого фактора клеток U937.
Недавно было обнаружено, что молекулы рилина образуют комплексы высокого порядка in vitro и in vivo, такие как Fc-рецептор-ассоциированный белок (RAP; от англ. receptor-associated protein). Это наблюдение было дополнительно уточнено путем демонстрации, что рилин секретируется in vivo в виде гомодимера, связанного дисульфидными связями. Делеция короткого участка, называемого эпитопом CR-50, локализованная на N-конце молекулы, препятствует олигомеризации. Этот мутированный рилин неспособен эффективно индуцировать фосфорилирование Dab1 в первичных нейронах мыши. Аналогично, антитело к эпитопу CR-50 антагонизирует функцию рилина in vitro и in vivo.
RAP представляет собой внутриклеточный белок, который может связываться с очень высокой аффинностью с семейством липопротеиновых рецепторов. Слитый белок Fc-RAP представляет собой сконструированный белок, состоящий из двух молекул RAP, соединенных с образованием гантелевидной формы с помощью Fc участка антитела. Вместо связывания ApoER2 и ЛПОНП и их ингибирования FcRAP может вызывать кластеризацию рецептора и активацию ApoER2. Добавление Fc-RAP оказывало такое же действие, как и нанесение рилина, за счет усиления индукции ДВПСП, как видно на фиг. 19. Основное отличие состоит в том, что Fc-RAP, вероятно, связывается со всеми липопротеиновыми рецепторами, а не только с кластерами ApoER2 и ЛПОНП.
Кластеризация ApoER2 и/или ЛПОНП вызывает фосфорилирование Dab1 и нисходящие события, включая активацию SFK и модурирование PKB/ Akt. Кроме того, модулирование долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП), являющееся одним из биологических эффектов рилина, также имитируется рилин-независимой кластеризацией рецептора. Эти результаты надежно подтверждают, что индуцированная рецептором димеризация или олигомеризация достаточна для фосфорилирования тирозина Dab1 и событий нисходящей передаче сигнала без необходимости в дополнительном сорецепторе, обеспечивающем активность тирозинкиназы. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, это позволяет предположить, что терапевтический потенциал фрагментов рилина осуществляется посредством димеризации соответствующих рецепторов и активации нисходящей передачи сигнала.
Пример 6.
Рилин обладает способностью к потенцированию глутаминергических рецепторов области CA1. В культивируемых нейронах гиппокампа активация передачи сигнала рилина требуется для нормального развития дендритных структур. В отсутствии рилина или внутриклеточного адаптерного белка Dab1 рост дендритов из нейронов останавливался, и сокращалось количестве дендритных ветвей - аналогичный фенотип наблюдали в нейронах, в которых отсутствовали рецепторы рилина apoER2 и ЛПОНПР (Niu, et al., Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway. Neuron. 2004; 41: 71-84). У мышей линии HRM проявляется недостаточность зависимого от гиппокампа, обусловленного научением ситуативного страха, и синаптической пластичности в области CA1 гиппокампа. Считают, что эти поведенческие и физиологические фенотипы HRM отчасти связаны со снижением или ингибированием способности к образованию синаптических связей. Это подтверждается наблюдением, что у мышей HRM уменьшается плотность дендритных шипиков.
Смешанные культуры нейронов гиппокампа и коры головного мозга получали из эмбрионов мыши в дни 18-19 эмбрионального развития (E). Клетки высевали с высокой плотностью (~750 клеток в мм-2) и выращивали в питательной среде Neurobasal (Gibco BRL) с добавлением B27 (Gibco BRL). Клетки пересевали при 80% конфлюэнтности.
ApoER2 присутствует в постсинапсах и образует функциональный комплекс с НМДАР в области CA1. Образование mEPSC-НМДА проиллюстрировано на фиг. 20(A)-(B) и 21(A)-(D). В ложнообработанных клетках постсинаптический ток возбуждения был незначительным в связи с тем, что рецепторы НМДА (mEPSCNMDA) не претерпевали статистически значимых изменений по сравнению с моментом времени, предшествующем ложной обработке (p>0,05). Было обнаружено, что воздействие рилина при
- 29 045597 водит к статистически значимому увеличению амплитуды mEPSCНМдА (p<0,001).
Чтобы дополнительно подтвердить, что синаптический ответ НМДАР увеличивается в результате постсинаптических действий рилина, проводили анализ коэффициента вариации (CV) вызванного НМДАР синаптического цельноклеточного тока. При нанесении на график отношений 1/CV2 против средних арифметических значений коэффициентов EPSCНМдА до и после 30-минутного нанесения рилина в девяти экспериментах, корреляция не наблюдалась, см. фиг. 21(C) и (D). Однако отношения 1/CV2 остаются относительно неизменными при варьирующих коэффициентах EPSCНМдА, что подтверждает активацию рилина в CA1 посредством постсинаптического механизма, усиливающую активность НМДАР.
При постоянном воздействии рилина может возрастать компонент синаптического ответа АМПК, что изменяет кинетику EPSCНМдА и чувствительность к ифенпродилу. Было исследовано влияние рилина в CA1 на уровни экспрессии субъединиц АМПКР и НМДАР. Как общие, так и поверхностные рецепторы GluR1, NR1, NR2A и NR2B наносили на Вестерн-блоттинг и подвергали гибридизации. Был проведен анализ субъединицы АМПКР GluR1 на поверхности клеток области CA1, экспрессия которой возрастает при созревании в процессе развития, а ее миграция подлежит регулированию в процессе синаптической пластичности.
На фиг. 22(A)-(C) показано, что воздействие рилина приводит к статистически значимому повышению поверхностного содержания GluR1 по сравнению с ложнообработанными группами, что указывает на регулируемую экспрессию и ее поверхностную инсерцию посредством увеличения mEPSCАМПК и соотношения тока АМПК/НМДА после постоянного воздействия рилина. Изменений поверхностного или общего содержания NR1 не наблюдали. Напротив, уровни общей и поверхностной экспрессии NR2A статистически значимо возрастали под действием рилина по сравнению с ложной обработкой. Кроме того, концентрации как общего, так и поверхностного белка NR2B после обработки рилином статистически значимо снижались. Ложная обработка не оказывала влияния на содержание различных субъединиц рецепторов глутамата по сравнению с необработанными контрольными группами.
Был проведен анализ действий рилина на дендриты гиппокампа. Культуру клеток гиппокампа получали из 6-7-дневных эмбрионов мышей дикого типа, линии HRM и мышей с дефицитом рилина и подвергали воздействию 5 нмоль/л рилина в течение 21 дня. Обработка органотипических культур заключалась в многократном нанесении на клетки 5 нмоль/л рилина или питательной среды нетрансфицированных клеток HEK один раз в 3 дня в течение 21 дня. Клетки культивировали, как описано выше, и вводили в нейрональные клетки флуоресцентный краситель путем применения тока к цельным клеткам с помощью пэтч-пипеток, и после фиксации клетки визуализировали под конфокальным микроскопом.
Дендритные шипики представляют собой небольшие отростки, которые покрывают поверхность дендритов и несут постсинаптические структуры, которые формируют синапсы возбуждения. Аномальную форму или уменьшение количества дендритных шипиков наблюдают при ряде когнитивных заболеваний. На основании уменьшения количества дендритных шипиков можно предположить, что дли развития дендритных структур, которые принципиально важны для интенсивной обработки информации нейронами, требуется конститутивный уровень активации передачи сигнала, опосредованной рилином/рецепторами липопротеинов. Это мнение согласуется с исследованиями, в которых показано, что мыши, гетерозиготные по мутации reeler (HRM), характеризуются сниженной плотностью дендритных шипиков и нарушением выполнения некоторых поведенческих функций научения и памяти.
Фенотип, характеризующийся статистически значимо уменьшенным количеством дендритных шипиков, мог быть скорректирован в результате добавления экзогенного рекомбинантного рилина в культуру клеток. В обработанных рилином клетках HRM показано увеличение плотности дендритных шипиков через 21 день по сравнению с совпадающими по возрасту нейронами культуры дикого типа, как видно на фиг. 23(B). Напротив, при ложной обработке (кондиционированная питательная среда от нестабильно трансфицированных клеток) изменения плотности шипиков не выявлено, как видно на фиг. 23(C). В таком же эксперименте с нокаут-мышами по гену рилина показано, что в результате нанесения рилина плотность дендритных шипиков также восстанавливалась по сравнению с ложнообработанными контролями, как видно на фиг. 23(C) и 23(F). Морфология дендритных шипиков в обоих видах клеток в результате воздействия рилина напоминала морфологию, наблюдаемую в клетках ДТ, как видно на фиг. 23(D), a при количественном определении было выявлено статистически значимое увеличение количества дендритных шипиков в культурах HRM, обработанных рилином, по сравнению с ложнообработанными контролями и сопоставимая плотность дендритных шипиков с уровнями, наблюдаемыми в культурах дикого типа, как видно на фиг. 24(A).
Чтобы удостовериться, что данный протокол нанесения рилина представляет собой хроническое воздействие рилина, и деградация или активное удаление рилина из питательной среды не происходит, авторы изобретения отбирали 15 мкл питательной среды из планшетов с культурами в моменты времени 0, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после нанесения рилина. Анализ этих аликвот методом Вестерн-блоттинга показал отсутствие деградации или уменьшения количества рилина, как видно на фиг. 25. Поэтому увеличение плотности дендритных шипиков связано с присутствием рилина в физиологически значимых количествах в течение всего 21-дневного периода его нанесения.
Пример 7.
- 30 045597
Липопротеиновые рецепторы играют роль в когнитивных процессах, и предполагают участие этого семейства рецепторов в патологических процессах. Два основных лиганда этих рецепторов, apoE и рилин, по-видимому, обладают сигнальной способностью, которая может значимо влиять на синаптическую функцию. У гетерозигот по рилину показана недостаточность как синаптической пластичности, так и когнитивной функции. Снижение экспрессии рилина приблизительно на 50% приводит к недостаточности как синаптической пластичности, так и когнитивной функции (Qiu, et al., Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem. 2006; 85:228242). В недавней работе подчеркнута важная роль активации передачи сигнала рилина в нормальном обучении и памяти (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277: 39944-39952), а также в патологических случаях, где эта активация передачи сигнала нарушена. APC в настоящее время является модулятором-кандидатом активации передачи сигнала рилина, поскольку, по-видимому, обладает структурными группировками, которые связываются с ApoER2 и активируют нисходящие эффекторы.
Чтобы подтвердить влияние рилина на научение и память, мышам с двух сторон вводили антагонист липопротеина RAP (рецептор-ассоциированный белок), который эффективно блокирует связывание рилина с его рецепторами.
Мышей линии C57Bl/6 десятинедельного возраста (n=55, самцы) содержали в обычных условиях (20°С, относительная влажность 50% и 12-часовой цикл света/темноты) и обеспечивали доступ к воде и корму без ограничений. После нормализации в условиях окружающей среды мышей делили на группы получавших холостой препарат (без инъекции) без электроболевого раздражителя, получавших инъекцию RAP с электроболевым раздражителем, получавших холостой препарат (без инъекции) с электроболевым раздражителем и получавших инъекцию рилина с электроболевым раздражителем. Введение рилина животным осуществляли путем инъекции 2 мкл полноразмерного рекомбинантного очищенного белка рилина в концентрации 5 нмоль/л. Через 3 часа после введения проводили выработку условного рефлекса ситуативного страха. Чтобы уменьшить боль и страдания животных на протяжении эксперимента, соблюдали необходимые меры предосторожности. Все исследования проводили сотрудники, не осведомленные об условиях введения веществ. На момент эксперимента масса тела мышей составляла 12-45 г.
Для выполнения двухсторонней инъекции мышам проводили анестезию изофлураном и помещали их в аппарат для стереотаксических операций (Stoelting Co.). Делали сагиттальный надрез в середине черепа, и кожу осторожно оттягивали назад, чтобы расширить отверстие. В черепной коробке просверливали два отверстия, допускающих проход иглы гамильтоновского шприца в желудочки головного мозга (AP -0,35 мм, L ± 0,75 мм и V -2,5 мм от брегмы). Мышам проводили двухстороннюю инъекцию 0,5 мкл холостого контрольного раствора или рилина с получением общей концентрации рилина в полушарии головного мозга 5 нмоль/л со скоростью 1 мкл/мин, как описано ранее (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol. Chem. 2002;277:3994439952; Rogers, et al., Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 389-395). Затем иглу извлекали, отверстия заклеивали зубным цементом и зашивали надрезы. После операции мышей наблюдали в течение 2 ч в отдельных клетках с теплой подогреваемой подстилкой. Для контроля воспалительных или инъекционных реакций ежедневно измеряли ректальную температуру; любую мышь с температурой 100,5°F или выше подвергали эвтаназии путем вдыхания CO2. Животных предоставляли 5-дневный восстановительный период. Ранее было показано, что это время оптимально для исследования поведения после внутрижелудочковой инъекции (Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity, and dendritic spine density. Learn. Memory. 2011; 18: 558-564; Rogers, et al., Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 389-395).
Выработку условного рефлекса ситуативного страха проводили в квадратной звукоизоляционной камере (25x25 см) с полом из проволочной решетки. При тренировке рефлекса мышей помещали в камеру с фоновым белым шумом и давали возможность освоить ее в течение 3 мин, после чего подавали условный раздражитель (звуковой сигнал 90 дБ) в течение 30 с. Через 28 с подавали безусловный раздражитель [слабое (0,5 мА) электроболевое раздражение лап] в течение в общей сложности 2 с. После периода 90 с проводили вторую пару условных/безусловных раздражителей, после чего следовал второй 90-секундный период, общее время составляло 7 мин. Мышей подвергали условиям ситуативного страха через 24 ч после тренировки в той же камере без звукового сигнала в течение 3 мин и проводили оценку реакции замирания. После ситуативного испытания проводили нацеленную выработку рефлекса ситуативного страха, в которой в камере меняли запах, освещение и текстуру пола. Мышей помещали в камеру с измененными условиями и обеспечивали фазу привыкания в течение 3 мин (без звукового сигнала), после чего в течение последних 3 мин испытания подавали условный стимул 90 дБ. Мониторинг поведения осуществляли с помощью программного обеспечения ANY-Maze (Stoelting Co.). Реакцию замирания оценивали как неподвижность в течение по меньшей мере 2 с.
- 31 045597
Мыши, получившие холостую обработку, не получавшие тренировочное электроболевое раздражение лап, проявляли очень незначительную реакцию замирания, при которой лишь около 15% мышей замирали, когда слышали звуковой сигнал. Около 70% мышей, не получавших инъекции, но получавших тренировочный электроболевой раздражитель, замирали, когда слышали звуковой сигнал, и только у мышей, которым вводили рилин, частота замирания превышала 90%, как видно на фиг. 26(A). По сравнению с этими результатами при введении RAP, который ингибирует связывание рилина с его рецепторами, ответ на звуковой сигнал уменьшался на 45% несмотря на тренировку мышей с электроболевым раздражителем. Анализ показал наличие статистически значимого различия ответа у мышей, не получавших препарат, но получавших электроболевой раздражитель, и у мышей, получавших RAP.
Мышей также подвергали тесту в водном лабиринте. Для оценки пространственного научения и памяти использовали водный лабиринт со скрытой платформой. Платформу диаметром 10 см погружали непосредственно под поверхность воды в бассейне диаметром 1,2 м, заполненном непрозрачной водой, достаточно глубоком, чтобы мыши не могли нащупать дно. В помещении по кругу располагали крупные визуальные ориентиры. Мышей помещали в бассейн и давали им возможность плавать в течение максимум 60 с, чтобы найти платформу. Тренировка состояла из пяти дней тренировки, по четыре тренировки в день с интервалом между ними 15 мин. На шестой и восьмой дни платформу перемещали и регистрировали характер плавания каждой мыши в течение 60 с с помощью видеорегистратора с программным обеспечением ANY-Maze (Stoelting Co.) (пробные испытания).
После однократной инъекции рилина в желудочки головного мозга пространственное научение поиску скрытой платформы в водном лабиринте улучшалось, как показано на фиг. 26(B). У мышей, которых повторно тренировали на поиск другого (противоположного) расположения платформы в день 6, улучшенная способность к научению сохранялась по сравнению с мышами, получавшими инъекцию только физиологического раствора. Мыши, получавшие однократную инъекцию рилина за 5 дней до тренировки, показали более короткий латентный период до нахождения платформы в первый день. Латентный период до нахождения платформы статистически значимо сокращался после однократного воздействия тренировочной парадигмы, как показано на фиг. 26(C). У мышей, которых повторно тренировали на поиск другого положения платформы, сохранялись различия между мышами, получавшими инъекции рилина и физиологического раствора. Скорости плавания и другие измерения активности у животных, получавших и не получавших вещество, оставались без изменений. Эти данные убедительно иллюстрируют способность рилина к модулированию научения и формирования памяти in vivo и важность исследований, нацеленных на идентификацию механизмов, контролирующих процессинг белка рилина и последующее модулирование когнитивной функции фрагментами рилина.
Функциональные тесты показали, что сниженные уровни рилина приводят к снижению способности к ассоциативному научению. Влияние дефицита рилина на синаптическую функцию компенсируется при повышении концентрации рилина. Прямая двухсторонняя инфузия рекомбинантного фрагмента рилина в желудочки головного мозга, выполненная за 3 часа до выработки условного рефлекса ситуативного страха, приводила к усилению формирования памяти у мышей дикого типа 3-4-месячного возраста при проведении теста через 24 часа после тренировки, как показано на фиг. 26(A)-(C). Эти результаты демонстрируют потребность в рилине для нормального функционирования памяти и поднимают интересный вопрос о том, может ли усиление активации передачи сигнала рилина улучшить память.
Затем был проведен анализ влияния выработки условного рефлекса ситуативного страха на содержание рилина в организме. У мышей дикого типа вырабатывали условный рефлекс ситуативного страха в соответствии с протоколом с 3 электроболевыми раздражителями (CFC). У мышей, не подвергавшихся электроболевому раздражению (CS), используемых в качестве отрицательного контроля, и у мышей, подвергавшихся электроболевому раздражению в аналогичной ситуации (CS/US), извлекали гиппокамп через 1, 5, 15, 30 и 180 минут после выработки рефлекса, а также через 18 часов после выработки рефлекса (n=4 для каждого момента времени) и проводили анализ гомогенатов гиппокампа с использованием антител к рилину (G10).
При научении ситуативному страху экспрессия рилина и фрагмента комплемента резко изменяется в течение 18 часов после выработки рефлекса ситуативного страха, особенно фрагментов 450 и 180 кДа, как видно на фиг. 27(A) и (B). Кроме того, стимуляция тета-вспышки, доставляемая в побочный путь Шеффера, приводила к статистически значимому повышению экспрессии рилина и расщепления фрагмента через 15 минут после стимуляции, как видно на фиг. 27(A) и (B). Эти результаты показывают, что процессинг рилина с образованием функционально различных фрагментов вовлечен в интеграцию и контроль активации передачи сигнала рилина, ответственной за изменение синаптической пластичности и модулирование научения и памяти.
Пример 8.
Активация передачи сигнала рилина вовлечена в ряд физиологических изменений возбуждающего синапса, а также в нормальную когнитивную функцию млекопитающих. В недавней работе подчеркнута важная роль активации передачи сигнала рилина в нормальном обучении и памяти (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277: 39944-39952), а также в патологических случаях, где эта активация передачи сигнала нарушена. APC в
- 32 045597 настоящее время является модулятором-кандидатом активации передачи сигнала рилина, поскольку, повидимому, обладает структурными группировками, которые связываются с ApoER2 и активируют нисходящие эффекторы.
Липопротеиновые рецепторы играют роль в когнитивных процессах, и предполагают участие этого семейства рецепторов в патологических процессах, лежащих в основе прогрессирования болезни Альцгеймера (БА). Два основных лиганда этих рецепторов, apoE и рилин, по-видимому, обладают сигнальной способностью, которая может значимо влиять на синаптическую функцию, непосредственно взаимодействуют с предшественником белка A-бета (APP) и модулируют его метаболизм, а также чувствительны к накоплению Ae. Накопление Ae нарушает активацию передачи сигнала липопротеиновых рецепторов, что в результате сопровождается нарушением когнитивной функции. Кроме того, взаимодействие активации передачи сигнала рилина и/или рецепторов липопротеина приводит к аберрантному метаболизму APP и клиренсу Ae, что, в свою очередь, усиливает накопление Ae и отложение бляшек. Поэтому усиление активации передачи сигнала рилина посредством прямого применения белка рилина иои путем применения генотерапии или конструкций РНК, либо применение других агонистов липопротеиновых рецепторов можно использовать для ослабления Ae-зависимого нарушения когнитивной функции и прогрессирования образования патологических бляшек.
Подтверждение роли протеолиза рилина при заболеваниях человека находят как при нервнопсихических, так и при нейродегенеративных расстройствах. Например, количество фрагмента N-R2 увеличивается у пациентов с БА и лобно-височной деменцией по сравнению с пациентами, не страдающими деменцией (Saez-Valero, et al., Altered levels of cerebrospinal fluid reelin in frontotemporal dementia and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 2003; 72: 132-136; Botella-L0pez, et al. Reelin expression and glycosylation patterns arealtered in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 5573-5578). У пациентов с подтвержденным диагнозом депрессии и биполярного расстройства обнаруживается уменьшение содержания фрагмента N-R2 в образцах крови, при этом у пациентов с шизофренией содержание фрагмента N-R6 увеличивается (Fatemi, et al., Altered levels of Reelin and its isoforms in schizophrenia and mood disorders. Neuroreport. 2001; 12: 3209-3215). Рилин может также играть роль в контроле судорог: в моделях эпилепсии процессинг рилина изменяется (Tinnes, et al., Epileptiform activity interferes with proteolytic processing of Reelin required for dentate granule cell positioning. FASEBJ. 2011; 25: 1002-1013; Tinnes, et al., TIMP-1 inhibits the proteolytic processing of Reelin in experimental epilepsy. FASEBJ. 2013; 27: 2542-2552; Kaneko, et al., Kainic acid-induced golgi complex fragmentation/dispersal shifts the proteolysis of reelin in primary rat neuronal cells: an in vitro model of early stage epilepsy. Mol. Neurobiol. 2016; 53: 1874-1883), которое может быть MMP-зависимыми. Эти различия в содержании фрагментов рилина указывают на значимость содержания рилина и нарушения его протеолитической функции при болезненных состояниях.
Тестирование рилина в трех моделях БА у мышей показано изменение метаболизма рилина в этих моделях (PS1-FAD, SweAPPxPS1 и Tg2576). Мышей дикого типа четырнадцатимесячного возраста (неизмененных однопометных мышей), линий Tg2576 (SweAPP), PS1-FAD (M146L) и 2X (SweAPP x M146L) содержали в нормальных условиях (20°С, относительная влажность 50% и 12-часовой цикл свет/темнота) и предоставляли свободный доступ к корму и воде. После нормализации в условиях окружающей среды извлекали кору головного мозга мышей и проводили Вестерн-блоттинги лизатов для определения различных фрагментов рилина. Метаболизм рилина в трех моделях БА у мышей (PS1-FAD, SweAPPxPS1 и Tg2576) изменяется, как видно на фиг. 28(A). У мышей Tg257б по сравнению с мышами дикого типа не было выявлено статистически значимых различий по содержанию продуктов рилина 450, 190 и 180 кДа, но у мышей Tg2576 и 2X отмечено статистически значимое увеличение количества неидентифицированных N-концевых последовательностей, распознаваемых антителом G10. В отличие от этого, количество продуктов рилина 450 и 180 кДа статистически значимо увеличивалось у мышей PS1FAD и 2X. Эти изменения фрагмента комплемента рилина, по-видимому, коррелируют с изменениями активации нисходящей передачи сигнала рилина. Исследование фосфорилирования основного компонента нисходящего пути Dab-1 в коре головного мозга показало повышенное фосфорилирование DAB-1 у мышей SweAPPXPS1 и PS1-FAD и его статистически значимое снижение у мышей с одиночной мутацией SweAPP (Tg2576), как видно на фиг. 28(B). Эти данные позволяют предположить, что метаболизм рилина особенно чувствителен к изменениям процессинга APP и/или к накоплению Ae.
Изменения состава фрагментов рилина и фосфорилирования Dab-1 у мышей Tg2576 могут свидетельствовать о нарушенной системе активации передачи сигнала рилина - явлении, которое может быть действительно ответственным за недостаточность синаптической пластичности, описанную у этой линии мышей (Mitchell, et al., X11beta rescues memory and long-term potentiation deficits in Alzheimer's disease APPswe Tg2576 mice. Hum Mol Genet. 2009; 18:4492-4500; Kotilinek, et al., Cyclooxygenase-2 inhibition improves amyloid-beta-mediated suppression of memory and synaptic plasticity. Brain. 2008; 131: 651-664; Jacobsen, et al., Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103: 5161-5166).
Чтобы определить влияние экзогенного рилина, свежие гиппокампальные срезы от 8-месячных мышей Tg2576 перфузировали раствором 5 нмоль/л рекомбинантного фрагмента комплемента рилина
- 33 045597
R3-6. Применение фрагмента рилина приводило к восстановлению недостаточности ДВПСП у пожилых мышей Tg2576, как видно на фиг. 28(C), что позволяет предположить, что у этих мышей биохимический и структурный механизм, вовлеченный в активацию передачи сигнала рилина после процессинга белка рилина, не затронут. Кроме того, важно отметить, что в этой модели мыши можно получить нормальные уровни синаптической пластичности. Фрагменты рилина также ассоциированы с бляшками с плотной сердцевиной у пожилых (15-месячных) мышей Tg2576, как видно на фиг. 29(A)-(D). Кроме того, рилин и родственные агонисты липопротеиновых рецепторов могут восстанавливать недостаточность синаптической пластичности и когнитивной функции, возникающую в результате накопления Ae и/или образования патологических бляшек. Рилин восстанавливал недостаточность ДВПСП у 12-месячных мышей модели БА (Tg2576), как видно на фиг. 30.
Эти данные подтверждаются результатами наблюдений, что рилин ассоциирован с Aeсодержащими бляшками, обнаруживаемыми в гиппокампе пожилых мышей дикого типа (Madhusudan, et al., Accumulation of reelin-positive plaques is accompanied by a decline in basal forebrain projection neurons during normal aging. Eur J Neurosci. 2009; 30: 1064-1076; Knuesel, et al., Age-related accumulation of Reelin in amyloidlike deposits. Neurobiol Aging. 2009; 30: 697-716). В свете установленной роли рилина в синаптической функции изменение целостности метаболизма рилина и активации передачи его сигнала играет значительную роль в изменениях научения и памяти, ранее установленных в моделях БА у мышей.
Однократное применение экзогенного рилина неожиданно привело к усилению научения и памяти у взрослых мышей дикого типа по меньшей мере в течение одиннадцати дней. Роль рецепторов липопротеина в клиренсе Ae и идентификация ассоциации рилина с бляшками Ae в модели БА у мышей свидетельствует о том, что важно уделять внимание изучению рилина в качестве терапевтической мишени в этиологии и патогенезе БА, поскольку терапевтическое вмешательство при БА нацелено на удаление Ae и улучшение когнитивной функции.
Поэтому усиление активации передачи сигнала рилина посредством прямого применения белка рилина иои путем применения генотерапии или конструкций РНК, либо применение других агонистов липопротеиновых рецепторов можно использовать для ослабления Ae-зависимого нарушения когнитивной функции и прогрессирования образования патологических бляшек.
Пример 9.
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) может иметь различные источники, например судороги, травму головы, эпилептический статус (ЭС) и ишемию (Shetty & Hattiangady, Prospects of Stem Cell therapy for Temporal Lobe Epilepsy. Stem Cells. 2007; 25: 2396-2407; Ogawa, et al., Ischemia-induced neuronal cell death and stress response. 2007; 9: 573-587; Acharya, et al., Progress in neuroprotective strategies for preventing epilepsy. Prog Neurobiol. 2008: 363-404; Pitkanen, et al., From traumatic brain injury to posttraumatic epilepsy: what animal models tell us about the process and treatment options. Epilepsia. 2009; 50 (Suppl 2):21-9). В течение острой фазы повреждения стволовые клетки нейронов (NSC), расположенные в субгранулярной зоне (SGZ), претерпевают усиленный нейрогенез в стремлении к заживлению повреждения (Parent, et al., Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 1997; 17: 3727-3738; Hattiangady, et al., Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiol Dis. 2004; 17: 473490; Shetty, et al., Hippocampal neurotrophin levels in a kainate model of temporal lobe epilepsy: a lack of correlation between brain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentate mossy fiber sprouting. J Neurochem. 2003; 87: 147-159; Hattiangady, et al., Brain-derived neurotrophic factor, phosphorylated cyclic AMP response element binding protein and neuropeptide Y decline as early as middle age in the dentate gyrus and CA1 and CA3 subfields of the hippocampus. Exp Neurol. 2005;195:353-371). Однако физиологические ответы на эти повреждения не в состоянии улучшить восстановление функций и приводят в результате к недостаточности способности к научению и памяти и к расстройствам настроения (Jorge RE, Acion L, Starkstein SE, Magnotta V. Hippocampal volume and mood disorders after traumatic brain injury. Biol Psychiatry. 2007; 62: 332-338; Potvin, et al., Performance on spatial working memory tasks after dorsal or ventral hippocampal lesions and adjacent damage to the subiculum. Behav Neurosci. 2006; 120: 413-422). Многие хронические проблемы ЧМТ вызваны слабой дифференцировкой нейронов NSC, неправильной миграцией или дифференцировкой нейронов из NSC и слабым или неправильным синаптогенезом на базальных дендритах, вырастающих из нейронов (Sanchez, et al., Synaptic connections of hilar basal dendrites of dentate granule cells in a neonatal hypoxia model of epilepsy. Epilepsia. 2012;53 (Suppl 1):98-108).
Для исследования влияния введения рилина в случае черепно-мозговой травмы (ЧМТ) провели батарею поведенческих тестов моторики, EBST, акинезии передних конечностей и силы захвата лапы.
Мышей линии C57Bl/6 десятинедельного возраста (n=55, самцы) содержали в обычных условиях (20°С, относительная влажность 50% и 12-часовой цикл света/темноты) и обеспечивали доступ к воде и корму без ограничений. После нормализации в условиях окружающей среды мышей повергали ЧМТ, используя контролируемый кортикальный импактор (CCI; Pittsburgh Precision Instruments, Inc, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США). Экспериментальные методики были одобрены комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных. Мышей делили на группы, получавшие холостую обра
- 34 045597 ботку (без ЧМТ) без инъекции, ЧМТ без инъекции, группу с ЧМТ, получавшую ложную обработку путем введения физиологического раствора, и группу с ЧМТ, получавшую рилин. Введение рилина животным осуществляли путем инъекции 2 мкл полноразмерного рекомбинантного очищенного белка рилина в концентрации 5 нмоль/л. Животных, подвергаемых ложной обработке, анестезировали и проводили хирургическую процедуру, но не подвергали воздействию на кору головного мозга. Все поведенческие тесты проводили при световом цикле в одно и то же время во все дни тестирования. Чтобы уменьшить боль и страдания животных на протяжении эксперимента, соблюдали необходимые меры предосторожности. Все исследования проводили сотрудники, не осведомленные об условиях введения веществ. На момент эксперимента масса тела мышей составляла 12-45 г.
Глубокая анестезия была достигнута введение 1-2% изофлурана в смеси оксида азота/кислорода (69/30%) с помощью носовой маски. Всех животных фиксировали в стереотаксической рамке (David Kopf Instruments, г. Туджунга, штат Калифорния, США). Операции по созданию ЧМТ заключались в том, что кожу голову животного надрезали, чтобы обнажить череп, и проводили краниоэктомию. Для проведения краниоэктомии использовали электрическое сверло радиуса около 2,5 мм, с координатами, рассчитанными от +0,2 вперед и -0,2 мм вправо от брегмы (Paxinos & Watson, (2005) The mouse brain in stereotaxic coordinates. 5th ed. San Diego, CA: Academic Press). После краниотомии вызывали повреждение головного мозга в области лобно-височной коры со скоростью 6,0 м/с, достигая глубины 1,0 мм ниже слоя твердых мозговых оболочек и оставляли сверло в головном мозге на 150 миллисекунд (мс). Стержень импактора устанавливали под углом 15° вертикально, сохраняя перпендикулярное положение в отношении тангенциальной плоскости кривизны головного мозга на повреждаемой поверхности.
Датчик линейного переменного смещения (Macrosensors, г. Пеннсаукен, штат Нью-Джерси, США), соединенный с импактором, позволял измерять скорость и длительность для подтверждения единообразия обработки. После операции вводили анальгетик кетопрофен (5 мг кг-1). Мышей держали под строгим наблюдением.
Тест покачивания приподнятого тела (EBST; от англ. Elevated body swing test) включал удерживание животного за хвост и регистрацию направлений покачивания (Borlongan & Sanberg, (1995) Elevated body swing test: a new behavioral parameter for mice with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism. The Journal of neuroscience 15: 5372-5378). Аппарат для теста состоял из прозрачной плексигласовой коробки (40x40x35,5 см). Животное осторожно брали за основание хвоста и приподнимали за хвост до тех пор, пока его нос не находился на 2 дюйма (5 см) над поверхностью. Направление покачивания, влево или вправо, отмечали, как только голова животного смещалась в сторону приблизительно на 10 градусов от среднего положения тела. После однократной регистрации покачиваний животное снова помещали в плексигласовую коробку и давали ему свободно побегать в течение 30 секунд, после чего выполняли повторное тестирование. Эти этапы повторяли 20 раз для каждого животного. В норме покачивание интактных мышей смещено на 50%, т.е. число покачиваний влево и вправо одинаково. 75% покачивание в одном направлении использовали как критерий нарушения моторики при ЧМТ.
Акинезию передних конечностей исследовали до и после операции ЧМТ у молодых и пожилых мышей с контрольной холостой обработкой, ЧМТ без инъекции, ЧМТ с ложной инъекцией или ЧМТ с инъекцией рилина (Borlongan CV, Hida H, Nishino H (1998) Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport 9:3615-3621). Силу и подвижность ипсилатеральных (со стороны повреждения) и контралатеральных передних лап оценивали в баллах двое экспериментаторов методом слепой оценки, используя приведенную ниже шкалу акинезии передних конечностей. Не подвергавшихся воздействию, подвергавшихся ложному воздействию или мышей с односторонней паркинсонической симптоматикой по отдельности помещали в вертикальный плексигласовый цилиндр (диаметр 20 см, высота 30 см) и проводили видеозапись исследования мышами цилиндра и касание передними лапами стекла в течение 5-15 мин. Контакты с передними лапами отмечали два экспериментатора методом слепой оценки, и впоследствии был проведен расчет (число контактов с правой лапой/общее число контактов). Значение 50% характеризовали как нормальное и соответствующее баллу 1, 80% касаний стекла правой лапой (ипсилатеральной) животного учитывали как нарушение, соответствующее баллу 2, при этом 90% или более касаний стекла правой лапой (ипсилатеральной) животного учитывали как тяжелое нарушение, соответствующее баллу 3. Балльные оценки регистрировали для каждого индивидуального животного, а затем для анализов использовали средние баллы по экспериментальным группам.
Тестирование силы захвата лапы проводили до и после операции ЧМТ. Аномальный захват является показателем нарушения нервно-мышечной функции. В этом тесте мышей удерживали за тело напротив шеста (Ibrahim AG, Raisman G, Li Y (2009) Permanent loss of fore-paw grasping requires complete deprivation of afferent input from a minimum of four dorsal roots of the rmouse brachial plexus. Exp Neurol 215: 142-145). Балльную оценку силы захвата ипсилатеральной и контралатеральной лапой проводили два экспериментатора замаскированным методом с использованием приведенной ниже шкалы силы захвата лапы. По шкале от 1 до 3 баллов 1 балл является нормой, 2 балла означают нарушение, и 3 балла - тяжелое нарушение. Балльные оценки регистрировали для каждого индивидуального животного, а затем для анализов использовали средние баллы по экспериментальным группам.
- 35 045597
Для оценки статистически значимых различий между экспериментальными группами использовали многократные измерения критериев дисперсионного анализа и апостериорных t-критериев Бонферони для каждого момента времени. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Все значения выражали в вид среднего арифметического ± SEM.
Для животных с ЧМТ, которым вводили рилин, наблюдали улучшение восстановления поведения. У мышей, которым вводили рилин, было выявлено незначительное смещение покачивания в день 1, которое разрешалось к дню 2, как видно на фиг. 31. По сравнению с ними мыши, получившие ЧМТ и инъекцию контрольного растворителя или не получившие инъекцию, характеризовались высокой степенью смещения на протяжении всего исследования. Таким образом, введение рилина приводило к различиям восстановления в день 2, при этом у мышей, получавших рилин, наблюдалось улучшение, а у мышей, получавших контрольный растворитель или не получавших инъекцию, улучшение было незначительным. Введение рилина также приводило к улучшению состояния акинезии конечностей к дню 3, как видно на фиг. 32. К дню 5 мыши, получавшие рилин, демонстрировали сходные показатели акинезии конечностей с ложнообработанными животными, тогда как у мышей с ЧМТ, которым вводили контрольный растворитель или не проводили инъекцию, акинезия сохранялась. В тесте захвата лапы у мышей, получавших рилин, наблюдалось стабильное улучшение, как видно на фиг. 33.
Хроническая утрата жизнеспособности при черепно-мозговой травме отчасти связана с неправильной заменой нейрональных клеток во время ее заживления. Было обнаружено, что рилин обеспечивает защиту ГАМК-эргических промежуточных нейронов, которые являются нейронами, экспрессирующими внеклеточный гликопротеин рилин в DG (Shetty, Hippocampal Injury Induced Cognitive and Mood Dysfunction, Altered Neurogenesis and Epilepsy: Can Early Neural Stem Cell Grafting Intervention Provide Protection? Epilepsy Behav. 2014 Sep; 38: 117-24). Эти ГАМК-эргические промежуточные нейроны способствуют миграции нейрональных клеток, образующихся из NCS, в слой гранулярных клеток (Gong, et al., Reelin regulates neuronal progenitor migration in intact and epileptic hippocampus. J Neurosci. 2007;27:1803-1811). He ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, введение рилина или фрагментов рилина может оказывать свое воздействие посредством формирования дендритов, сохранения ГАМК-эргических промежуточных нейронов или комбинации этих путей.
Пример 10.
Дендритные шипики представляют собой небольшие отростки, которые покрывают поверхность дендритов и несут постсинаптические структуры, которые формируют синапсы возбуждения. Аномальная форма или уменьшенное количество дендритных шипиков обнаруживают при ряде когнитивных заболеваний, таких как синдром ломкой X-хромосомы, синдром Вильямса, синдром Ретта, синдром Дауна, синдром Ангельмана и аутизм. На основании уменьшения количества дендритных шипиков можно предположить, что дли развития дендритных структур, которые принципиально важны для интенсивной обработки информации нейронами, требуется конститутивный уровень активации передачи сигнала, опосредованной рилином/рецепторами липопротеинов. Это мнение согласуется с исследованиями, в которых показано, что мыши, гетерозиготные по мутации reeler (HRM), характеризуются сниженной плотностью дендритных шипиков и нарушением выполнения некоторых поведенческих функций научения и памяти. Кроме того, восполнение рилина приводит к восстановлению недостаточности плотности шипиков и связанного с ней когнитивного нарушения. Кроме того, передача сигнала рилина инициирует биохимические пути, вовлеченные в активацию CREB, которые существенны для транскрипции ранних генов памяти. Данный путь является общим для всех упомянутых выше когнитивных расстройств у человека.
Пример 11.
Недавно было показано, что процессинг рилина под действием металлопротеиназы (металлопротеиназ) является существенным для нормального формирования кортикальной пластинки (Jossin, et al., Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol Cell Biol. 2007; 27:7113-7124), хотя конкретный фермент, ответственный за это, неизвестен. Это открытие позволяет предположить, что опосредованный металлопротеиназой процессинг рилина может быть также важен для направленной передачи сигнала рилина в головном мозге взрослого организма. Как tPA, так и MMP-9 являются металлопротеиназами-кандидатами с явно продемонстрированной ролью в регуляции синаптической пластичности и когнитивной функции (Bozdagi, et al., In vivo roles for matrix metalloproteinase-9 in mature hippocampal synaptic physiology and plasticity. J Neurophysiol. 2007; 98:334-344-9; Nagy, et al., Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal latephase long-term potentiation and memory. J Neurosci. 2006; 26:1923-1934; Huang, et al., Mice lacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selective interference with late-phase longterm potentiation in both Schaffer collateral and mossy fiber pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:8699-8704; Pang, P. T., and B. Lu. 2004. Regulation of late-phase LTP and long-term memory in normal and aging hippocampus: role of secreted proteins tPA and BDNF. Ageing Res Rev 3:407-430; Zhuo, M., D. M. Holtzman, Y. Li, H. Osaka, J. DeMaro, M. Jacquin, and G. Bu. 2000. Role of tissue plasminogen activator receptor LRP in hippocampal long- term potentiation. J Neurosci 20:542-549; Baranes, et al., Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron. 1998; 21:813-825).
- 36 045597
Эффективность образования продукта 370 кДа частично зависит от кандидата для расщепляющего рилин фермента tPA. Этот потенциальный механизм регуляции оказывает выраженное влияние на интегрирование сигнальной системы с известными механизмами нейрональной регуляции и координирование ее участия в физиологических процессах, таких как научение и память. Тем не менее рилин расщепляется в конкретных сайтах с получением в результате стабильного паттерна рилиновых фрагментов, легко определяемых количественно в анализе методом Вестерн-блоттинга. Эти фрагменты представляют собой потенциальные сигнальные молекулы, свойства которых уникальны по сравнению с полноразмерным рилином. Рекомбинантный рилин, очищенный из стабильно трансфицированных клеток HEK293, содержит фрагменты такого же размера, как основные фрагменты, обнаруживаемые в гиппокампе.
Кроме того, все данные, касающиеся локализации рилина в головном мозге взрослого организма, получены с использованием антитела, которое распознает участок N-R2. Участок N-R2 присутствует в полноразмерном рилине (N-R8), фрагментах рилина N-R2 и N-R6, но отсутствует в других основных фрагментах. Поэтому для мониторинга изменений образования и локализации продуктов рилина был применен подход 3-эпитопного картирования, как показано в табли. 3, с получением беспрецедентного пространственного разделения.
Таблица 3
Антитела, применяемые в подходе 3-эпитопного картирования, их свойства, источник идентификации и сайт распознавания эпитопа
Антитело | Сайт распознавания | Животноеисточник | Коммерческий источник |
G10 | 164-496 | Ms, mAb | Chemicon, MAB5364 |
G20 | С-конец | Gt, pAb | SCBT, SC-7741 |
CR-50 | 420-450 | Ms, mAb | MBL, D223-3 |
Н-221 | 3239-3460 | Rb, pAb | SCBT, SC-5578 |
AF3820 | 1221-2661 | Gt, pAb | R&D, AF3820 |
R4B | 1810-1825 | Ms, mAb | Jossen, et al·., 2Θ07 |
R5A | 1985-2058 | Ms, mAb | Jossen, et al·., 2007 |
АЬ12 | 3260-3428 | Ms, mAb | de Berkgeyck, et al·., 1998 |
АЬ12 | 3260-3428 | Ms, mAb | de Berkgeyck, et al·., 1998 |
АЬ12 | 3260-3428 | Ms, mAb | de Berkgeyck, et al·., 1998 |
В целях характеризации конкретных фрагментов, образующихся в результате tPA- и MMP-9зависимого процессинга рилина в условиях нормальной синаптической функции и формирования памяти были созданы мутантные конструкции рилина, устойчивого к расщеплению, методом сайтнаправленного мутагенеза, как видно на фиг. 34. Мутанты рилина включают конструкции, устойчивые к расщеплению (Rln-Res) tPA в участке R2-3, MMP-9 в участке R6-7 и обоими ферментами в участках R2-3 и R6-7. Также рассматривали фрагменты, имитирующие расщепление tPA или MMP-9, с резистентным сайтом расщепления или без него. Одна комплементарная конструкция рилина имела идентичную метку с белком Rln-Res; однако она не содержала два измененных сайта расщепления (лабильный к расщеплению рилин; фиг. 34). Был включен фрагмент с меткой, полученный с обоими мутированными сайтами (отрицательная контрольная конструкция), и фрагмент R3-6 с меткой, для которого показано потенциальное связывание с ApoER2 и VLDLR (потенциальный положительный контроль). Эти конструкции рилина субклонируют в экспрессионных векторах млекопитающих, содержащих N-концевые полигистидиновые метки и/или C-концевые метки Myc, что обеспечивает более позднее распознаванием ими экзогенного рилина. Точные сайты расщепления могут быть идентифицированы путем взаимодействия очищенного полноразмерного рилина либо с tPA, либо с MMP-9, и, таким образом, можно выделить полученные в результате фрагменты.
Процессинг рилина осуществляется как tPA, так и MMP-9 с образованием основных фрагментовпродуктов рилина, обнаруживаемых in vivo, как видно на фиг. 35(A)-(C). Как видно, под действием tPA увеличивается количество фрагментов 370 кДа (N-R6) и 80 кДа (R7-8) в бесклеточных условиях, как видно на фиг. 24(A), что указывает на расщепление рилина tPA между R6-R7, как видно на фиг. 27. В результате расщепления рилина плазмином образуется спектр продуктов неизвестной ранее идентичности и специфично сохраняется фрагмент 180 кДа. Применение рекомбинантного tPA на первичных нейронах приводило к полному преобразованию экзогенного полноразмерного рилина в формы фрагментов 370 и 180 кДа и к уменьшению количества внутриклеточного рилина 180 кДа. Кроме того, под действием MMP-9 увеличивалось количество обоих фрагментов 370 кДа (N-R6) и 180 кДа (N-R2), а также фрагмен
- 37 045597 та, находящегося непосредственно ниже фрагмента 180 кДа, как видно на фиг. 24(B) и (C), что было подтверждено ингибированием MMP9, как видно на фиг. 24(D) и (E). Эти результаты, полученные в бесклеточных условиях, подтверждают, что MMP-9 может расщеплять рилин в обоих сайтах расщепления R2-3 и R6-7; однако применение MMP-9 на первичных нейронах привело к специфичному накоплению фрагмента 180 кДа в клетках, а ингибирование MMP-9 в течение 24 часов привело к резкому увеличению количества полноразмерного рилина и уменьшению количества рилина 180 кДа в клетках. Эти результаты позволяют предположить, что в нормальных условиях MMP-9 ответственна за расщепление рилина между R2-R3, как видно на карте фрагментов на фиг. 34. Рассмотренные в совокупности, эти предварительные данные позволяют предположить, что для образования основных фрагментов рилина, обнаруживаемых in vivo, достаточно наличия MMP-9 и tPA. Анализ структур позволил идентифицировать антитела, способные к обнаружению различных фрагментов рилина, как видно на фиг. 36(A) и (B). Процессинг белка рилина в гиппокампе чувствителен к синаптической активности in vitro и in vivo. Также оказалось, что MMP-9 и tPA вовлечены в процесс метаболизма рилина.
Пример 12.
Рилин расщепляется в конкретных сайтах с получением в результате стабильного паттерна рилиновых фрагментов, легко определяемых количественно в анализе методом Вестерн-блоттинга. Эти фрагменты представляют собой потенциальные сигнальные молекулы, свойства которых уникальны по сравнению с полноразмерным рилином. Рекомбинантный рилин, очищенный из стабильно трансфицированных клеток HEK293, содержит фрагменты такого же размера, как основные фрагменты, обнаруживаемые в гиппокампе. Применение комплемента рекомбинантного фрагмента рилина может (1) усиливать синаптическую передачу, способствуя встраиванию рецептора АМПК и усиливая функцию рецептора НМДА, (2) восстанавливать молчащие синапсы, (3) модифицировать морфологию синапсов и (4) усиливать ДВПСП (Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 2007; 97: 2312-2321; Qiu, S., K. M. Korwek, A. R. Pratt-Davis, M. Peters, M. Y. Bergman, and E. J. Weeber. 2006. Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem 85: 228-242).
Был проведен анализ экспрессии рецептора ApoER под действием рилина. Смешанные культуры нейронов гиппокампа и коры головного мозга получали из эмбрионов мыши в дни 18-19 эмбрионального развития (E). Клетки высевали с высокой плотностью (~750 клеток в мм-2) и выращивали в питательной среде Neurobasal (Gibco BRL) с добавлением B27 (Gibco BRL). Клетки пересевали при 80% конфлюэнтности. После 8-кратного пересева клеток в питательную среду добавляли фрагмент рилина hR3-6 в концентрации 5 нмоль/л, и клетки инкубировали с фрагментом рилина в течение 1 часа при 37°С. После инкубации клетки собирали путем трипсинизации, промывали питательной средой и подвергали лизису с использованием лизирующего буфера на основе ДСН-в-меркаптоэтанола. Белки собирали из каждой культуры клеток и наносили 25 мкг на гель с ДСН-ПААГ. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с использованием антитела к ApoER2 (Sigma-Aldrich, LRP8, кроличье антитело к hApoER2).
При обработке клеток GST-RAP (рецептор-ассоциированный белок) показано значительное снижение экспрессии рецептора, как видно на фиг. 37. Следовательно, блокирование способности рилина к связыванию с ApoER2 ведет к снижению экспрессии ApoER2. Однако воздействие на клетки экзогенного рилина привело к повышению экспрессии рецептора ApoER2. Кроме того, в результате обработки нейронов рилином экспрессия ApoER2 возрастала дозозависимым образом, как видно на фиг. 38(A) и (B).
В приведенном выше описании все документы, акты или раскрытая информация не является признанием того, что этот документ, акт или информация, либо любая их комбинация были общедоступными, общеизвестными, составляли часть общих сведений в данной области техники или были известны как актуальные способы решения какой-либо задачи на момент приоритета.
Описания всех цитируемых выше публикаций явным образом в полном объеме включены в настоящий документ посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая из них была индивидуально включена путем ссылки.
Хотя в настоящем документе описаны и проиллюстрированы конкретные варианты осуществления способа лечения неврологических расстройств, специалистам в данной области техники будет очевидно, что возможны вариации и модификации без отклонения от широкого смысла и принципов настоящего изобретения. Должно быть также понятно, что приведенная ниже формула изобретения подразумевает охват всех общих и конкретных признаков изобретения, описанного в настоящем документе, и всех утверждений объема изобретения, в которые в рамках формулировок должны быть указаны как входящие в объем изобретения.
- 38 045597
Organization Applicant
Street :
City :
State :
Country :
PostalCode :
PhoneNumber :
FaxNumber :
EmailAddress :
< 110> OrganizationName : University of South Florida
Application Project < 120> Title : Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders < 130> AppFileReference : 1372.1144 < 140> CurrentAppNumber :
< 141> CurrentFilingDate : -__-__
Earlier Applications -------------------- < 150> PriorAppNumber : 63/370,519 < 151> PriorFilingDate : 2016-08-03
Earlier Applications -------------------- < 150> PriorAppNumber : 62/486,729 < 151> PriorFilingDate : 2017-04-18
Earlier Applications -------------------- < 150> PriorAppNumber : PCT/US2017/045307 < 151> PriorFilingDate : 2017-08-03
Sequence < 213> OrganismName : Homo sapiens < 400> PreSequenceString :
cacgcgtggg ctcggcgggg gcccgctccc aggcccgctc ccgagcccgt tccgctcccg tccgccttct tctcgccttc tctccgcgtg gctcctccgt cccggcgtct ccaaaactga atgagcgagc ggcgcgtagg gcgscggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcatgga gcgcagtggc tgggcccggc agactttcct cctagcgctg ttgctggggg cgacgctgag ggcgcgcgcg gcggctggct attacccccg cttttcgccc ttctttttcc tgtgcaccca ccacggggag ctggaagggg atggggagca gggcgaggtg ctcatttccc tgcatattgc gggcaacccc acctactacg ttccgggaca agaataccat gtgacaattt caacaagcac cttttttgac ggcttgctgg tgacaggact atacacatct acaagtgttc aggcatcaca gagcattgga ggttccagtg ctttcggatt tgggatcatg tctgaccacc agtttggtaa ccagtttatg tgcagtgtgg tagcctctca cgtgagtcac ctgcccacaa ccaacctcag tttcatctgg attgctccac ctgcgggcac aggctgtgtg aatttcatgg ctacagcaac acaccggggc caggttattt tcaaagatgc tttagcccag cagttgtgtg aacaaggagc tccaacagat gtcactgtgc acccacatct agctgaaata catagtgaca gcattatcct gagagatgac tttgactcct accaccaact gcaattaaat ccaaatatat gggttgaatg taacaactgt gagactggag aacagtgtgg cgcgattatg catggcaatg ccgtcacctt ctgtgaacca tatggcccac gagaactgat taccacaggc cttaatacaa caacagcttc tgtcctccaa ttttccattg ggtcaggttc atgtcgcttt agttattcag accccagcat catcgtgtta tatgccaaga ataactctgc ggactggatt cagctagaga aaattagagc cccttccaat gtcagcacaa tcatccatat cctctacctt cctgaggacg ccaaagggga gaatgtccaa tttcagtgga agcaggaaaa tcttcgtgta ggtgaagtgt atgaagcctg ctgggcctta gataacatct tgatcatcaa ttcagctcac agacaagtcg ttttagaaga tagtctcgac ccagtggaca caggcaactg gcttttcttc ccaggagcta cagttaagca tagctgtcag tcagatggga actccattta tttccatgga aatgaaggca gcgagttcaa ttttgccacc accagggatg tagatctttc cacagaagat attcaagagc aatggtcaga agaatttgag agccagccta caggatggga tgtcttggga gctgtcattg gtacagaatg tggaacgata gaatcaggct tatcaatggt cttcctcaaa gatggagaga ggaaattatg cactccatcc atggacacta ccggttatgg gaacctgagg ttttactttg tgatgggagg aatttgtgac cctggaaatt ctcatgaaaa tgacataatc ctgtatgcaa aaattgaagg aagaaaagag catataacac tggataccct ttcctattcc tcatataagg ttccgtcttt ggtttctgtg gtcatcaatc ctgaacttca gactcctgct accaaatttt gtctcaggca aaagaaccat caaggacata ataggaatgt ctgggctgta gactttttcc atgtcttgcc tgttctccct tctacaatgt ctcacatgat acagttttcc atcaatctgg gatgtggaac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
- 39 045597 gcatcagcct cctccttcac tgtctactcc agcactaacc gtgggcaatt acagtgcact ggcatcccag ttaccataac cagtggtaag tgacagctca gagcacgtgc taatgggata aataatctcc gcaaccgtat atctgtgctt tctgggattc tacaggagat aggagcatcc acacatggac cgtccaagaa ttaccatgcc ttggtccagt ggctttggac atgcgatcat agctgccctt ctggcaagaa ttctggatca ggatacttct atgcaacaag catccagtgg ctatctggag cgtgttctca gaagcagaag gccagctttt aatggttaaa agatggagat gttcaagcta gtactctcat tgcaggcaaa aggggacttt caagaccaga tttagatgga catttcagga aaatgtcccc gtacaagata tctctacttc tatcagactt caaaccaaga ctggcatttg tgacctgcca tgggaagcat tcaaactgga aatccaagga tgaaaacata ctttttgcag acagctccag tcctccaacc ccagaattgg gttcagatgg tgtactggcc ctgtgtgtgt gattcttaaa tgcagagagg aggggaagga ccagttttca acaattctcc aacaacgaat aagattcaga tgacttcatt ttttgggccc ggtaacagtg actgaatgct tctgaaaact cggaacacca gataatgttt agacatggtt acattcccaa ttttactcta gccctggttt caatccaggt agagcccctg acttggaaac gtagaactac cattcttccc ttcaacagca taccttggaa tctaaacttg tatatgattc aaccaggtga gaatgccttc agtgagttta gctacccgtt agcatttaca ggcatatgca ccgtccacaa gttattgggg tctctgtact tgggtggact cctgacagca cacctgctag cttccagctg ggggaggact cagatcatcc gattacccta aatgaaacct cgatttgcag aacataggtt gatgctggta ggatgcgaag gaagaatgga ttccgatgga gtgtacatat gtgtgtttct aatcacaatg acaggtgccc aatggccctg gttcaatttt actagaaatg cttcgagagt caggacgcga tcagcccagt tttcaagaca ggtcaagttg ggaaaacctc tttgaaatga tattctctga attggctgtc aagcggatca attcaggcca tcagggtgcc gaccggggct gacgatttca gggaatctga ctaaggatgc cttagattta atcagtggag atacttttca ctctggcaac atcgatggaa agagaagaca tcagcttgga tacctgagat acagtgggtg ggattcgctg atattggccc gcaagtgtga tgtttatttc tccgtggtgc tcaacaaaga ttctccagtt atcagcctgg tcctggagca caggtgatgc agagagaaga ttagtcttga atgttcagcc cctcaagtat agttcagttt agctggagta caagtatgcc cacagtggag tccgctggag ttgggcagca ggtgtgacca ttatgtcaga gagaaattgt tcagcaaggc ttgtccagtt gagaggaggg cagagatgta ctgccaagac atgaccagtg cagttatcaa tgaatcagat tctgtgctgc taactcgaga gtgccaatca tgtcctggtt gaaactccag caagaatcac tccaggagag ccgagccttg gtgacctggg agatgttcga aggttggaac ggaaaaggga atatacaaat aagggcttat tggacttcat agacacctgc gggctttgga aatttgatgg atattgactg gttatgctga gcatgggctg acaatggcaa tgcattacac ctgtctacct actacactgt cttggatgtg ttggtggacc atgggaattt atggtgaaac ttatttcaag tagcaaaaag gaatcacttg tcaatgttcc cttataataa ataatgtaaa attggttttt attttctacc ctgtgctgga gaaccgaata gagacaaaca gtcatgtctc ccctggattt tgaaagcttt tgaagtcagc agggcggcgt cacactgaga tgaaggagtt ttattcatat aaagcagttt tgtatgggct ctttaccaat atactgtggc gcgctatgtg ggtgatggga ctcaaccaac aagttgtcag gagagtcata ccagagctat gtgccccaac ggggtaccaa ttttgagaac aaaaccagaa tgggaaaaga ctacatccag cgtcctcctt cttttcagac cccttgcacc ggcagtcgat tccaacttta gagtgtgtgg cacaccatca tttgaccctg attcagcagt tctggtgaaa agaactaagt cattgttatt cagctcacag tcccagttac atatactgct taggtttgag tggctgtgga agcccggacg tggaagcaaa tgttcagtat gtccttcctg aacggcattt tgatgttctt ctctatagat tctctctatg gacctgggat tagcaagccc ggactggcat ggaaagttca tccactctcc gggggctgat ctcaggacga ctattgtgtt acatcctgac catcaaatct agatctagat taccccagag gcacctgatg cttgccatac cggtaagaaa caaccctgtg ctatcctggt aaccatgggc ccccacctcc acaattcccc ggaccaatcc aaattctgtt tctggcccag ggcagttcca tttggttgtg cagctaatta ctggggagca ttgctgcatt ctcagctatc ggaattcagt attgatgaga cttgtggagg cacgactgga gaaacacaat tgtggccaga cacggcctta gaatttacat gtgcttcttc tacacagctc atgtgcagtg ggcactgaat cagaatggct caagggtgtg cagctggtga ataggcggag cagtacagca ttcagcaaac aggttccgct gacatcatca cctcagaact ttgatgttgg gcaatgatat aaacctggat actgctccag gaaggctgtt gagcccacca ccaaggtctc aaaaacgtgc tgcagtggcc gcacaaggaa gggaagctca acacttaacg gtccctctgg acttcaggca tcaaatgaca gaaccacaga cgatggtggc ataggaatga ttgcaagcca gatactgctc tttcatgtgt ttcagcaact cttgtcaccg atttacacct accatttctc tcctgggcga gggatttgtg cctgttgttc ctttggcctg ggaacatctc tgtacaaata agatctcact gatgaatttt actgcccaaa gaagaaatct atgctcttgg ggtaacatcg gctcctggtc cccacagcac ttcctaacgc ttggaaacat ctggcagagg cttgtgagat ggctctcctc gtgtcttggc catctttcct aatctgttct attcttatga atgagcccag tcagatggtg ttatcatgac tcactcagtc ccctttgttt caatgcagat aatacacccc cctggcacct cagcaagtat cccagaaaac aagacgagtg ggcatggctc gccacccaga gggagtctga gtgtcatctc gttgggacct agagtgcttc acaatggggg ccagatttgt ggtggcagcc ttctgtccga tttatgagaa ctaatgaagg ttggaaaatc atgtgctaca ttcttcttca acccggcttc tgtatcacac ttgcatccag ctccatttgg atggggactg cctgtgtgtc gccctctgtg atggcaaatc acaccaggaa ttacctgcat atgggatact tcatttccat aaccgcaaca atgacagctc actggtatcg tgatattcac cagcatctac cccacagtgt aagagtgtgt cggaaagatt ccaggacccg ttgataatgt atgctggacg ctctgccctc aagtgtatgg taatttttaa caatgtatgt ctattctgtt actttcctca ccaatgctac ggattgttga atacatttga gtctttattg
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5760
5820
5880
5940
6000
6060
6120
- 40 045597 tccatattct agttggtgag atttgagatc attttcaagg cagccacgtc aaccatgcag tgtccgtttc cattgataat tatcaatgga caccaaaaat cttattaatg cctctttttc tgctagattt gagtcaaccc ggagttcctt gaaagcccgt ctacagcccc cttggaagat caagatgccc ccgttacgtg cgctgcctcc tcttggattg tcgctatcat tctgcctctc tccttttgac agacatgtgc gggtggcctg caatcgagct gtgtggagcc agtcactgtg gtgcctgatt aggcattacc tgtgaatatc gccaagacat ctctgctgac cgagcgctcc agacaaaact ctgtgactcc agtgacccat atgtaaggtg cggtgtgagt aagtgtttct acttcctgaa catgcagtgg ccatggagat ctacttgacc acctgactta cgaggacact ggatcttcga gacctcttgc tggaggaatt acacgactac gcagcctttt actggacaac tgatgatgaa agcaggattt gactcacaat taaaattgtg atacactaag ctcttctaac tgtcaacagc tgcaacacag tgaccacgtg gaccggtgcc tcacgacctt ctgggagacc ccatggagac ggatctcact ggacagctgc atacagcgtc tcaaaggggg cattccatta aacgttggct gacttcgggg agctctttat ggctggagga agatggtacc gtctacatcg accaaatgta cctgattttc agtggtggga aatgaagatg gtgcagttct gtgctcctac ttcagcaatt tctggttcta tgggttatcg gatttcacaa gtgtgtggct gtcagcacag tgctcagtca tcatggcacc ctgcaacgga cctccttata aagcagcaga agtggccatg tactgtgatg ccatccagtc gtggcgtcgg gatctaaacc acaccaaaca tggaacctgc cttctccctc gacggcctgg caaaggaccg cctgcagatg tcagtgaatg cctgatggtg gacctgactc tctgaaaaaa tggaattatc cagccatctg agcttagtgg gcaatcgata tgcttaaggg cacactctga tggatgtcct gcactctatt ggtgcaaagt catcgtccca acctggactt atacttcttc gtgatcagca attttgattg ggcacttccc tgtggcaatc gctctctcct gtgggttgtg gatgcaagat agcattggct tcaagctgga ttccgctgga tacattggag atctgcatct cccagttata attcaaggtg tcactgtact cgagcaagca aacagtgacc aacaacggga cacctgaaga ccacccgtga gttcgactga cgacctggca gctccaccga gggaggtcgt agggatttta gtccccagtg tatgtgaccc tcaaagatga aaccatctcg gcttgcgcat tcatgagact agtattctct ccagcaatgt ctcgccttcg atcagattct cccttgatag ctactggtga acgttgccgt cagactcttg cattggtaag tcctggtgtc ccaggtccca catgggcaat ggagatgcat accccgagac agaactggct gaatggctct tcactaatgc accgtaacca tcatggagat ctgatgctaa atcagaacga ttatgctgga ccggccctgt agcactggct tgatgctctg ccactgaagg ttgcccagaa tggtccctca tattctttcc gaaatccggt atttctacct aacagtgcat agactttcct tagaaggtgg ttgggggatc tcctgcaata tctgccggaa tgctccatga ctgaagatgc atggaattgt gtggagcaga atgaagaaaa catcctttca cccgagaact aagccacttc cggattcctg gctccccttt aaagaatcac tccagaaggg aggcttgccc gcgacgagag ttaaagataa gagtcatagg ttaatggctg aaatcatgtt tgagtggccc tcacctggca agattcagct cctaaatgtg tagctcatcc ccttctgctg gcaccacccc gcactttggg ccctgccggc tgaggagatg tggctactca tttcgaaggt aaagtgtgga gttgatgaca gggatgtggt caacggtggc gggcaggtac ctggtggcaa tattggagga taggaaatgg tgccctggtc gaatgaggat ttatgcgatt ggactgtctg agacactttc agccactcgt agataatgtc ccagggaaac ctctcttcca gactgtgaac ccatttcagt tgagttcatc aggtgttctc tttctatgac agagattgcc ctgggccatt caccttcagc cgggaggatc attccatgat tggcagtcat ctggattatg tcaaattcat gtgcttgcct aactaaaggg aaggtttagg gggccctgga ctgtgatccg gaaggaacgc aagtacttgc cactgtgaga ctgggggcgc ggaaggcgtg gatggattac cctcaccaac ggtctctggg aatcaatccc ctggagtttt cctctattgg cattatacag ttgtggtgac gcagctcgta ccagttccat catccagctg agaagaaact caagctctgc cttccaaggt ttttgagtcc aagtggctgt tcagatcagg tgttttgcaa ccacgctgtg tgtcatcgcc atggtgtttg aatgagaaca gcggatccag cccctctgct agcagcacct aagctgcacc tctcagccag tgtaatggac ggtccaacct cagctagaat atcctttcta cgagacctgg aaaggcgttc ctctcgtgga attgccctgg ccgtctgaga aatatttctg ctgcttcacc ttcattgaaa tccttcctac gaattggaat cctaccaatg aacaagtgga ttccgttggc tatatcgggg tgcgtctgtg acccaactca ggagggaaat gggggttgta caattttact ttggaatatt cagtacagta actcgcttcc gacaatgtcc agcgccccag gcctttgaca gattgtacag gatggacggg caattcaaga gtgcagtatt gctgacccaa tggaaaagga ttctatcaga tgcttggaca ggatactcag tttgacagtg actgagtgtg caagcggtta atcggtagtg ctgttggact cagaaataca acaactcgac gtggagcgtg agccaattgg taccctaatg ccaaataaaa ccaggataca cttcattccg cagacccagt gaagccacca cctgaccatg gagaagcaaa agcgggcacg gatgactgct gcaagagtca gggcagctgg caagcagcta attgggagca gacaaggcgg cagcaccagc tttcaaatga ccatcataca tgagactgga accacagcag actacgcagg tttgtggatc tgacatgggc aggggagctg gtaaaataag ctgatagatt gtggaaacaa atttatcaca ctgaccccag gtcttcttca agataccctt atgggcactt gtaatacggt caggaggcac aggccagcac agatagactt actcagtaga tggaatgcag ctagaatcac atcaaccagc atggctgcat atgaacagtg aagacaactt tgagtacagt gtcgattatt tcatgtatgg ctgtcaatgg agcccggatt gctggtggca tcatctcagg taccccagca tgtttatgga tagaaagatt aggtgtatgc tctcagttgg ctactgactt aatgctctgg tcacctaccc agtactcaga actgcagggg ggccaaactg aagaaatcaa gaattcttgc cacaagattt agaacaacat actctaccga tttctgttag ttcgctggtg ctcagtgggc tggacacttt ctgtaaggac agaaggacaa tgatgcagtt taatgctgga gccttccttc tctacaactc tctcctctag gctgggcaat gatactgcac ctgttttcag ccgaggcaaa ccccctacgc ccaagcctct tgtcgcagac tgctgctgca caaaggactt
6180
6240
6300
6360
6420
6480
6540
6600
6660
6720
6780
6840
6900
6960
7020
7080
7140
7200
7260
7320
7380
7440
7500
7560
7620
7680
7740
7800
7860
7920
7980
8040
8100
8160
8220
8280
8340
8400
8460
8520
8580
8640
8700
8760
8820
8880
8940
9000
9060
9120
9180
9240
9300
9360
9420
9480
9540
9600
9660
9720
9780
9840
9900
9960
10020
10080
10140
10200
10260
10320
- 41 045597 cacacaagct cagagagtgt cttacaatgt ccccctggag gcacggatga aaggagtctt actgcgctgg tggcaaccac gccacaatgg aacaggtcat gatcaatggg ctttggacca tgtggaggtc gtcctagtaa gcactcgcaa acaaaattac atgatgaatt tttcacgaca acatgggctc agacatttct acaacagaag acgaaggtca cttaggcgat acccatgaag aatcaaaaag tttatttttt ttcttccaac atgtgatgtg ttgctctcca ttcttttaaa tctcgcacta catctgatat caggaaatat ctgtgaagga cttggtgatt acctgaaagc ccttctcaag accgagtgta caccactttc ccacactgtg aactaatgac aagtgactta tttgctcata agtaaatgtc ttcatgttga tgtgtccgtg aaagttgtga tctgttgtaa tatcagttac agtggcagta ttgacaataa gaaacagttt aacagaaaaa tgaaatttaa gcacaaaaaa tttaagagat tttatgttta aaatggcatt tagcacagta tttaacattc ttggtcacaa agctatttaa gtggactgta tttcagctat gtctcatgtt ttatatgatt aaattatcat tgtttgtcct ttatgtattc tcttctacaa tacaacacat tgaaactgta tttacttgtt atgttgtaat attttgctgc tgaatttggg gctacttata ttctgcagaa aattaattga aatacctatt caagaagata gttgtaaaga tattgtatct cctttaatat actccttaaa aatgtatgtt ggtttagcgt tgttttgtgg ataagaaaaa tgcttgaccc tgaaatattt tctactttaa attgtggatg aagaccctat ctcccacaaa taagttccca tttccttgtc taaagatctt tttttaagtg ttctgtggct gatttactaa cagtaactgc cattttttgt ctgtgataac agagtgattt gtaaaacagt ggttgttttt tcattgtgtt ttcttcgtgg attgtttttt ctgcgggtca tattcatacc ttctgatgaa gttgtacaac accagcaaca ttataatggc cctgtagctc tgaatgctat ttgtgtaact gaaaggttgc actctagggt gaaccaagct ataaaagccc atgcttaaat aaaaattatg tccaaaagcc < 212> Type : DNA < 211> Length : 11580
SequenceName : Full length Reelin SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
ttcagcagta ctgctccagt tcttcttcag tactctcatg atgctggtat gtcctggttt ctggtgaaag aaggctgtta cccggcttct gcaggcaaag gatgcgaagg aaactccaga gaactaagtg agcccaccat gtatcacaca ggggactttg aagaatggac aagaatcacc attgttattc caaggtctct tgcatccagc aagaccagat tccgatggat ccaggagagc agctcacaga aaaacgtgcc tccatttggt ttagatggag tgtacatatc cgagccttgt cccagttact gcagtggcca tggggactgc atttcaggag tgtgtttctg tgacctggga tatactgctg cacaaggaac ctgtgtgtca aatgtcccca atcacaatga gatgttcgat aggtttgagg ggaagctcag ccctctgtgg tacaagataa caggtgccca ggttggaact ggctgtggaa cacttaacga tggcaaatct ctctacttca atggccctgg gaaaagggaa gcccggacgg tccctctgga caccaggaat atcagacttg ttcaatttta tatacaaatt ggaagcaaaa cttcaggcat tacctgcatc aaaccaagaa ctagaaatga agggcttatt gttcagtatt caaatgacaa tgggatactc tggcatttgc ttcgagagtt ggacttcatg tccttcctg < 212> Type : DNA < 211> Length : 729
SequenceName : Reelin Repeat 3
SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
cccttcagca actcccacag tgtacagctc cagtattctc tgaacaatgg caaggactgg catcttgtca ccgaagagtg tgttcctcca accattggct gtctgcatta cacggaaagt tcaatttaca cctcggaaag attccagaat tggaagcgga tcactgtcta ccttccactc tccaccattt ctcccaggac ccggttcaga tggattcagg ccaactacac tgtgggggct gattcctggg cgattgataa tgttgtactg gcctcagggt gcccttggat gtgctcagga cgagggattt gtgatgctgg acgctgtgtg tgtgaccggg gctttggtgg accctattgt gttcctgttg ttcctctgcc ctcgattctt aaagacgatt tcaatgggaa tttacatcct gacctttggc ctgaagtgta tggtgcagag agggggaatc tgaatggtga aaccatcaaa tctggaacat ctctaatttt taaaggggaa ggactaagga tgcttatttc aagagatcta gattgtacaa atacaatgta tgtccagttt tcacttagat ttatagcaaa aagtacccca gagagatctc actctattct gttacaattc tccatcagtg gaggaatcac ttggcacctg atggatgaat tttactttcc tcaaacaacg < 212> Type : DNA < 211> Length : 690
SequenceName : Reelin Repeat 4
SequenceDescription :
10380
10440
10500
10560
10620
10680
10740
10800
10860
10920
10980
11040
11100
11160
11220
11280
11340
11400
11460
11520
11580
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 729
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
690
- 42 045597
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
gatagctcat ccgcggatcc agtgagactg gaattttcaa gggacttcgg ggcgacctgg60 caccttctgc tgcccctctg ctaccacagc agcagccacg tcagctcttt atgctccacc120 gagcaccacc ccagcagcac ctactacgca ggaaccatgc agggctggag gagggaggtc180 gtgcactttg ggaagctgca cctttgtgga tctgtccgtt tcagatggta ccagggattt240 taccctgccg gctctcagcc agtgacatgg gccattgata atgtctacat cggtccccag300 tgtgaggaga tgtgtaatgg acaggggagc tgtatcaatg gaaccaaatg tatatgtgac360 cctggctact caggtccaac ctgtaaaata agcaccaaaa atcctgattt tctcaaagat420 gatttcgaag gtcagctaga atctgataga ttcttattaa tgagtggtgg gaaaccatct480 cgaaagtgtg gaatcctttc tagtggaaac aacctctttt tcaatgaaga tggcttgcgc540 atgttgatga cacgagacct ggatttatca catgctagat ttgtgcagtt cttcatgaga600 ctgggatgtg gtaaaggcgt tcctgacccc aggagtcaac ccgtgctcct acagtattct660 ctcaacggtg gcctctcgtg gagtcttctt caggagttcc ttttcagcaa ttccagc717 < 212> Type : DNA < 211> Length : 717
SequenceName : Reelin Repeat 5
SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
gtcacagact cttgttatgc gattgaattg gaatactcag tagatcttgg attgtcatgg60 cacccattgg taagggactg tctgcctacc aatgtggaat gcagtcgcta tcatctgcaa120 cggatcctgg tgtcagacac tttcaacaag tggactagaa tcactctgcc tctccctcct180 tataccaggt cccaagccac tcgtttccgt tggcatcaac cagctccttt tgacaagcag240 cagacatggg caatagataa tgtctatatc ggggatggct gcatagacat gtgcagtggc300 catgggagat gcatccaggg aaactgcgtc tgtgatgaac agtggggtgg cctgtactgt360 gatgaccccg agacctctct tccaacccaa ctcaaagaca acttcaatcg agctccatcc420 agtcagaact ggctgactgt gaacggaggg aaattgagta cagtgtgtgg agccgtggcg480 tcgggaatgg ctctccattt cagtgggggt tgtagtcgat tattagtcac tgtggatcta540 aacctcacta atgctgagtt catccaattt tacttcatgt atgggtgcct gattacacca600 aacaaccgta accaaggtgt tctcttggaa tattctgtca atggaggcat tacctggaac660 ctgctcatgg agattttcta tgaccagtac agt693 < 212> Type : DNA < 211> Length : 693
SequenceName : Reelin Repeat 6
SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
gaaccacaga tcatttccat tgacctgcca caggacgcga agacacctgc aacggcattt60 cgatggtggc aaccgcaaca tgggaagcat tcagcccagt gggctttgga tgatgttctt120 ataggaatga atgacagctc tcaaactgga tttcaagaca aatttgatgg ctctatagat180 ttgcaagcca actggtatcg aatccaagga ggtcaagttg atattgactg tctctctatg240 gatactgctc tgatattcac tgaaaacata ggaaaacctc gttatgctga gacctgggat300 tttcatgtgt cagcatctac ctttttgcag tttgaaatga gcatgggctg tagcaag357 < 212> Type : DNA < 211> Length : 357
SequenceName : Reelin Repeat Loop Region 3-4
SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
aatatacttt tcatcaatgt tcccttgcca tacactgccc aaaccaatgc tacaagattc60 agactctggc aaccttataa taacggtaag aaagaagaaa tctggattgt tgatgacttc120 attatcgatg gaaataatgt aaacaaccct gtgatgctct tggatacatt tgattttggg180 cccagagaag acaattggtt tttctatcct ggtggtaaca tcggtcttta ttgtccatat240 tcttcaaagg gggcacctga agaagattca gctatggtgt ttgtttcaaa tgaagttggt300 gagcattcca ttaccacccg tgacctaaat gtgaatgaga acaccatcat acaatttgag360 atcaacgttg gctgttcgac t381
- 43 045597 < 212> Type : DNA < 211> Length : 381
SequenceName : Reelin Repeat Loop Region 4-5
SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
aatgtgggca ggtacattgc cctggagata cccttgaaag cccgttctgg ttctactcgc60 cttcgctggt ggcaaccgtc tgagaatggg cacttctaca gcccctgggt tatcgatcag120 attcttattg gaggaaatat ttctggtaat acggtcttgg aagatgattt cacaaccctt180 gatagtagga aatggctgct tcacccagga ggcaccaaga tgcccgtgtg tggctctact240 ggtgatgccc tggtcttcat tgaaaaggcc agcacccgtt acgtggtcag cacagacgtt300 gccgtgaatg aggattcctt cctacagata gacttcgctg cctcctgctc a351 < 212> Type : DNA < 211> Length : 351
SequenceName : Reelin Repeat Loop Region 5-6 SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence <400> PreSequenceString :
aagcttccac catggagcgc agtggctggg cccggcagac tttcctccta gcgctgttgc tgggggcgac gctgagggcg cgcgcgttca gcagtactgc tccagttctt cttcagtact ctcatgatgc tggtatgtcc tggtttctgg tgaaagaagg ctgttacccg gcttctgcag gcaaaggatg cgaaggaaac tccagagaac taagtgagcc caccatgtat cacacagggg actttgaaga atggacaaga atcaccattg ttattccaag gtctcttgca tccagcaaga ccagattccg atggatccag gagagcagct cacagaaaaa cgtgcctcca tttggtttag atggagtgta catatccgag ccttgtccca gttactgcag tggccatggg gactgcattt caggagtgtg tttctgtgac ctgggatata ctgctgcaca aggaacctgt gtgtcaaatg tccccaatca caatgagatg ttcgataggt ttgaggggaa gctcagccct ctgtggtaca agataacagg tgcccaggtt ggaactggct gtggaacact taacgatggc aaatctctct acttcaatgg ccctgggaaa agggaagccc ggacggtccc tctggacacc aggaatatca gacttgttca attttatata caaattggaa gcaaaacttc aggcattacc tgcatcaaac caagaactag aaatgaaggg cttattgttc agtattcaaa tgacaatggg atactctggc atttgcttcg agagttggac ttcatgtcct tcctggaacc acagatcatt tccattgacc tgccacagga cgcgaagaca cctgcaacgg catttcgatg gtggcaaccg caacatggga agcattcagc ccagtgggct ttggatgatg ttcttatagg aatgaatgac agctctcaaa ctggatttca agacaaattt gatggctcta taacccttga tagtaggaaa tggctgcttc acccaggagg caccaagatg cccgtgtgtg gctctactgg tgatgccctg gtcttcattg aaaaggccag cacccgttac gtggtcagca cagacgttgc cgtgaatgag gattccttcc tacagataga cttcgctgcc tcctgctcag tcacagactc ttgttatgcg attgaattgg aatactcagt agatcttgga ttgtcatggc acccattggt aagggactgt ctgcctacca atgtggaatg cagtcgctat catctgcaac ggatcctggt gtcagacact ttcaacaagt ggactagaat cactctgcct ctccctcctt ataccaggtc ccaagccact cgtttccgtt ggcatcaacc agctcctttt gacaagcagc agacatgggc aatagataat gtctatatcg gggatggctg catagacatg tgcagtggcc atgggagatg catccaggga aactgcgtct gtgatgaaca gtggggtggc ctgtactgtg atgaccccga gacctctctt ccaacccaac tcaaagacaa cttcaatcga gctccatcca gtcagaactg gctgactgtg aacggaggga aattgagtac agtgtgtgga gccgtggcgt cgggaatggc tctccatttc agtgggggtt gtagtcgatt attagtcact gtggatctaa acctcactaa tgctgagttc atccaatttt acttcatgta tgggtgcctg attacaccaa acaaccgtaa ccaaggtgtt ctcttggaat attctgtcaa tggaggcatt acctggaacc tgctcatgga gattttctat gaccagtaca gtgattacaa ggatgacgac gataagtgac tcgag
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1895 < 212> Type : DNA < 211> Length : 1895
SequenceName : Reelin Fragment R3 and R6
SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
MERSGWARQT FLLALLLGAT LRARAFSSTA PVLLQYSHDA GMSWFLVKEG CYPASAGKGC60
EGNSRELSEP TMYHTGDFEE WTRITIVIPR SLASSKTRFR WIQESSSQKN VPPFGLDGVY120
ISEPCPSYCS GHGDCISGVC FCDLGYTAAQ GTCVSNVPNH NEMFDRFEGK LSPLWYKITG180
AQVGTGCGTL NDGKSLYFNG PGKREARTVP LDTRNIRLVQ FYIQIGSKTS GITCIKPRTR240
- 44 045597
NEGLIVQYSN DNGILWHLLR ELDFMSFLEP QIISIDLPQD AKTPATAFRW WQPQHGKHSA QWALDDVLIG MNDSSQTGFQ DKFDGSITLD SRKWLLHPGG TKMPVCGSTG DALVFIEKAS TRYVVSTDVA VNEDSFLQID FAASCSVTDS CYAIELEYSV DLGLSWHPLV RDCLPTNVEC SRYHLQRILV SDTFNKWTRI TLPLPPYTRS QATRFRWHQP APFDKQQTWA IDNVYIGDGC IDMCSGHGRC IQGNCVCDEQ WGGLYCDDPE TSLPTQLKDN FNRAPSSQNW LTVNGGKLST VCGAVASGMA LHFSGGCSRL LVTVDLNLTN AEFIQFYFMY GCLITPNNRN QGVLLEYSVN GGITWNLLME IFYDQYS <212> Type : PRT <211> Length : 617
SequenceName : Reelin Protein Fragment R3 and R6 SequenceDescription :
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
aagcttccac catggagcgc agtggctggg cccggcagac tttcctccta gcgctgttgc tgggggcgac gctgagggcg cgcgcgttca gcagtactgc tccagttctt cttcagtact ctcatgatgc tggtatgtcc tggtttctgg tgaaagaagg ctgttacccg gcttctgcag gcaaaggatg cgaaggaaac tccagagaac taagtgagcc caccatgtat cacacagggg actttgaaga atggacaaga atcaccattg ttattccaag gtctcttgca tccagcaaga ccagattccg atggatccag gagagcagct cacagaaaaa cgtgcctcca tttggtttag atggagtgta catatccgag ccttgtccca gttactgcag tggccatggg gactgcattt caggagtgtg tttctgtgac ctgggatata ctgctgcaca aggaacctgt gtgtcaaatg tccccaatca caatgagatg ttcgataggt ttgaggggaa gctcagccct ctgtggtaca agataacagg tgcccaggtt ggaactggct gtggaacact taacgatggc aaatctctct acttcaatgg ccctgggaaa agggaagccc ggacggtccc tctggacacc aggaatatca gacttgttca attttatata caaattggaa gcaaaacttc aggcattacc tgcatcaaac caagaactag aaatgaaggg cttattgttc agtattcaaa tgacaatggg atactctggc atttgcttcg agagttggac ttcatgtcct tcctggaacc acagatcatt tccattgacc tgccacagga cgcgaagaca cctgcaacgg catttcgatg gtggcaaccg caacatggga agcattcagc ccagtgggct ttggatgatg ttcttatagg aatgaatgac agctctcaaa ctggatttca agacaaattt gatggctcta tagatgacaa ttggtttttc tatcctggtg gtaacatcgg tctttattgt ccatattctt caaagggggc acctgaagaa gattcagcta tggtgtttgt ttcaaatgaa gttggtgagc attccattac cacccgtgac ctaaatgtga atgagaacac catcatacaa tttgagatca acgttggctg ttcgactgat agctcatccg cggatccagt gagactggaa ttttcaaggg acttcggggc gacctggcac cttctgctgc ccctctgcta ccacagcagc agccacgtca gctctttatg ctccaccgag caccacccca gcagcaccta ctacgcagga accatgcagg gctggaggag ggaggtcgtg cactttggga agctgcacct ttgtggatct gtccgtttca gatggtacca gggattttac cctgccggct ctcagccagt gacatgggcc attgataatg tctacatcgg tccccagtgt gaggagatgt gtaatggaca ggggagctgt atcaatggaa ccaaatgtat atgtgaccct ggctactcag gtccaacctg taaaataagc accaaaaatc ctgattttct caaagatgat ttcgaaggtc agctagaatc tgatagattc ttattaatga gtggtgggaa accatctcga aagtgtggaa tcctttctag tggaaacaac ctctttttca atgaagatgg cttgcgcatg ttgatgacac gagacctgga tttatcacat gctagatttg tgcagttctt catgagactg ggatgtggta aaggcgttcc tgaccccagg agtcaacccg tgctcctaca gtattctctc aacggtggcc tctcgtggag tcttcttcag gagttccttt tcagcaattc cagcgattac aaggatgacg acgataagtg actcgag <212> Type : DNA < 211> Length : 1937
SequenceName : Reelin Fragment R3 and R5 SequenceDescription :
300
360
420
480
540
600
617
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1937
Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :
MERSGWARQT FLLALLLGAT LRARAFSSTA PVLLQYSHDA GMSWFLVKEG CYPASAGKGC60
EGNSRELSEP TMYHTGDFEE WTRITIVIPR SLASSKTRFR WIQESSSQKN VPPFGLDGVY120
ISEPCPSYCS GHGDCISGVC FCDLGYTAAQ GTCVSNVPNH NEMFDRFEGK LSPLWYKITG180
AQVGTGCGTL NDGKSLYFNG PGKREARTVP LDTRNIRLVQ FYIQIGSKTS GITCIKPRTR240
NEGLIVQYSN DNGILWHLLR ELDFMSFLEP QIISIDLPQD AKTPATAFRW WQPQHGKHSA300
QWALDDVLIG MNDSSQTGFQ DKFDGSIDDN WFFYPGGNIG LYCPYSSKGA PEEDSAMVFV360
SNEVGEHSIT TRDLNVNENT IIQFEINVGC STDSSSADPV RLEFSRDFGA TWHLLLPLCY420
HSSSHVSSLC STEHHPSSTY YAGTMQGWRR EVVHFGKLHL CGSVRFRWYQ GFYPAGSQPV480
TWAIDNVYIG PQCEEMCNGQ GSCINGTKCI CDPGYSGPTC KISTKNPDFL KDDFEGQLES540
DRFLLMSGGK PSRKCGILSS GNNLFFNEDG LRMLMTRDLD LSHARFVQFF MRLGCGKGVP600
DPRSQPVLLQ YSLNGGLSWS LLQEFLFSNS S631 < 212> Type : PRT
- 45 045597 < 211> Length : 631
SequenceName : Reelin Protein Fragment R3 and R5
SequenceDescription :
Claims (13)
1. Вирусный вектор для экспрессии активного рекомбинантного фрагмента белка с рилиновым повтором, включающего два или более рилиновых повтора, содержащих:
рилиновый повтор R3, соединенный с рилиновым повтором, выбранным из R4, R5 и R6, или рилиновый повтор R3, соединенный с рилиновым повтором, выбранным из R4 и R5, или рилиновый повтор R3, соединенный с рилиновыми повторами R4, R5 и R6, где полипептид рилинового повтора R3 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, где полипептид рилинового повтора R4 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, где полипептид рилинового повтора R5 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, и где полипептид рилинового повтора R6 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.
2. Вирусный вектор по п.1, дополнительно содержащий:
петлевой участок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 6, расположенной между рилиновыми повторами R3 и R4, петлевой участок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7, расположенной между рилиновыми повторами R4 и R5, и петлевой участок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, расположенной между рилиновыми повторами R5 и R6.
3. Вирусный вектор для экспрессии активного рекомбинантного слитого белка рилина, включающего два или более рилиновых повтора, содержащих:
рилиновый повтор R4, соединенный с рилиновым повтором, выбранным из R5 и R6, или рилиновый повтор R4, соединенный с рилиновыми повторами R5 и R6, где полипептид рилинового повтора R4 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, где полипептид рилинового повтора R5 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, и где полипептид рилинового повтора R6 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.
4. Вирусный вектор по п.3, включающий рилиновый повтор, состоящий из полипептида с рилиновым повтором R3, который кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.
5. Вирусный вектор по п.3, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 или 11.
6. Вирусный вектор по любому из пп.1, 3, 4 и 5, представляющий собой аденоассоциированный вирусный вектор (AAV).
7. Вирусный вектор по п.6, в котором аденоассоциированный вирусный вектор (AAV) выбран из группы, состоящей из AAV-9, AAV-5, AAV-4 и AAV-1.
8. Применение вирусного вектора по пп.1-7 для индукции активации и передачи сигналов рилинзависимого рецептора ApoER2.
9. Применение вирусного вектора по п.8 для увеличения плотности дендритных корешков, долговременного потенцирования и синаптической пластичности.
10. Применение вирусного вектора по п.8 для лечения заболевания или расстройства нервной системы, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, синдрома Ангельмана, синдрома ломкой X-хромосомы, синдрома Вильяма, синдрома Ретта, синдрома Дауна, аутизма, биполярного расстройства, депрессии, шизофрении или черепно-мозговой травмы.
11. Применение вирусного вектора по п.10, в котором заболевание или расстройство нервной системы вызывает дефицит обучения.
12. Применение вирусного вектора по п.10 для улучшения когнитивной функции.
13. Применение вирусного вектора по пп.1-7 для увеличения димеризации рецептора ApoER2 и фосфорилирования ERK1/2.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/370,519 | 2016-08-03 | ||
US62/486,729 | 2017-04-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045597B1 true EA045597B1 (ru) | 2023-12-11 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20190169246A1 (en) | Reelin compositions for treatment of neurological disorders | |
US10729744B2 (en) | Reelin rescues cognitive function | |
US20220195457A1 (en) | Interneuron-specific therapeutics for normalizing neuronal cell excitability and treating dravet syndrome | |
JP2019513752A (ja) | 神経変性疾患を治療するためのtdp−43のミトコンドリア局在化阻害剤 | |
US20150359849A1 (en) | Methods of increasing neuronal connectivity and/or treating a neurodegenerative condition | |
JP7077343B2 (ja) | 操作された遺伝子を含む発現ベクター | |
EA045597B1 (ru) | Композиции рилина для лечения неврологических расстройств | |
CN106659911A (zh) | 治疗或预防神经退行性病症的组合物和方法 | |
US20090136565A1 (en) | Methods of treating neurological diseases by regulating migration of neuroblasts in the adult nervous system with tenascin-R | |
Shanmugalingam | Exploring novel molecular approaches to promote repair of the damaged nervous system: A role for Neuronal Pentraxin 2 | |
Shahsavani | Evaluating the role of Neuregulin-1β1 in neuroprotection after spinal cord injury | |
Matuszko | Extracellular matrix regulation of GABA-ergic interneurons and schizophrenia | |
Вукојичић | Complement and Microglia Mediate Sensory-Motor Synaptic Loss in Normal Development and in Spinal Muscular Atrophy | |
Mensch | Unraveling the physiopathological actions of the newly discovered Aη peptides in the brain | |
Mottolese | Role of neuroinflammation in the pathophysiology of CDKL5 deficiency disorder | |
Feng et al. | frontiers Frontiers in Cellular Neuroscience REVIEW published: 28 April 2022 | |
Sharifulina et al. | Amyloid Precursor Protein, Alpha-, Beta-and Gamma-Secretases Expression in Penumbra Cells after Photothrombotic Stroke. Evaluation of the Neuroprotective Effect of Secretase Inhibitors | |
Rodemer | Interactions between the axon tip and its environment in regulating neuronal survival and axon regeneration: roles of the CSPG receptor, PTPσ, and delayed axolemmal resealing. | |
Ambroziak | Regulation of NMDA receptor surface distribution in a neuronal model of Huntington’s disease | |
Kiroski | Investigation into the Roles of Ndel1 in the Postnatal Hippocampus | |
Weeber et al. | Reelin rescues congnitive function | |
Johnson | Extracellular Regulation of Glial Cell Functions | |
Njie | Cellular and proteolytic studies of Alzheimer's disease amyloid beta peptide with microglia, stem cells and MMP9 | |
Lampe | Impact of pleiotrophin gene therapy in 6-hydroxydopamine and AAV alpha-synuclein rodent models of Parkinson's disease | |
Phatak | Neuroprotective effects of Brn3b in PC12 cells and retinal ganglion cells under glaucomatous conditions |