EA045597B1 - Композиции рилина для лечения неврологических расстройств - Google Patents

Description

Перекрестная ссылка на смежные заявки

Заявка на данный патент представляет собой обычную заявку предварительной заявки на патент США № 62/370,519, озаглавленной Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders и поданной 3 августа 2016 г., и предварительной заявки на патент США № 62/486,729, озаглавленной Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders и поданной 18 апреля 2017 г., содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Известно, что сигнальная система липопротеиновых рецепторов играет значимую роль в ЦНС взрослого организма, включающую гомеостаз холестерина, клиренс внеклеточных белков и модуляцию формирования памяти, синаптическую передачу, пластичность и созревание посредством активации многочисленных путей передачи сигнала.

Белок внеклеточного матрикса рилин вовлечен в многочисленные неврологические расстройства, включая шизофрению (Guidotti, et al., Decrease in reelin and glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67) expression in schizophrenia and bipolar disorder: a postmortem brain study. Arch. Gen Psychiatry. 2000; 57: 10611069; Chen, et al., Identification of a single nucleotide polymorphism at the 5' promoter region of human reelin gene and association study with schizophrenia. Mol. Psychiatry. 2002; 7: 447-448; Fatemi, et al., Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia. Int. Rev. Neurobiol. 2005; 71: 179-187, Torrey, et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder and major depression in postmortem brains. Biol. Psychiatry. 2005; 57: 252-26), биполярное расстройство (Fatemi, et al., Reduction in Reelin immunoreactivity in hippocampus of subjects with schizophrenia, bipolar disorder and major depression. Mol. Psychiatry. 2000; 5: 654-663; Torrey, et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder and major depression in postmortem brains. Biol. Psychiatry. 2005; 57: 252-260), депрессию (Knable, et al., Molecular abnormalities of the hippocampus in severe psychiatric illness: postmortem findings from the Stanley neuropathology consortium. Mol. Psychiatry. 2004; 9: 609-620; Lussier, et al., Repeated exposure to corticosterone, but not restraint, decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2009; 460: 170-174; Lussier, et al., Reelin as a putative vulnerability factor for depression: examining the depressogenic effects of repeated corticosterone in heterozygous reeler mice. Neuropharmacol. 2011; 60: 1064-1074; Lussier, et al., The progressive development of depression-like behavior in corticosterone-treated rats is paralleled by slowed granule cell maturation and decreased reelin expression in the adult dentate gyrus. Neuropharmacol. 2013; 71C, 174-183; Lussier, et al., Altered GABAergic and glutamatergic activity within the rat hippocampus and amygdala in rats subjected to repeated corticosterone administration but not restraint stress. Neurosci. 2013; 231: 38-48; Fenton, et al., Imipramine protects against the deleterious effects of chronic corticosterone on depression-like behavior, hippocampal reelin expression and neuronal maturation. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.Psychiatry. 2015; 60: 52-59), аутизм (Fatemi, et al., Reelin glycoprotein in autism and schizophrenia. Int. Rev. Neurobiol. 2005; 71: 179-187) и болезнь Альцгеймера (БА) (Hoe, et al., DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor2 trafficking and processing. J. Biol Chem. 2006; 281: 35176-35185; Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol. Aging. 2008; 29: 542-553). В настоящее время в активацию сигнального пути рилина вовлечен запуск событий внутриклеточного каскада, как показано на фиг. 1.

По-видимому, активация сигнального пути рилина направляется протеолизом изолированного полноразмерного внеклеточного рилина, противоположным простой продукции и высвобождению рилина из промежуточных нейронов, например, с нейропептидами или низкомолекулярными трансмиттерами. Показано, что рилин содержит два основных участка расщепления между ЭФР-подобными повторами 23 (R2-3) и повторами 6-7 (R6-7), как видно на фиг. 2 (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521). Эти участки расщепления образуют в результате пять фрагментов большого размера, которые можно обнаружить в головном мозге взрослого и развивающегося организма, см. на фиг. 3 (Jossin, et al., Processing of Reelin by embryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J. Neurosci. 2007; 27: 4243-4252; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). Средний фрагмент R3-6 взаимодействует с рецептором липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНПР) и рецептором ApoE (ApoER2) и считается фрагментом, вовлеченным в инициацию нисходящего сигнального каскада рилина (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521).

Были сделаны многочисленные попытки идентифицировать ферменты, расщепляющими рилин, такие как сериновая протеаза тканевой активатор плазминогена (tPA), матриксные металлопротеиназы (MMP) и ADAM-протеазы - дизинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами (ADAMTS), и функциональную роль этого протеолитического процессинга (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Nagy, et al., Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal late-phase long-term potentiation

- 1 045597 and memory. J. Neurosci. 2006; 26: 1923-1934; Nogi, et al., Structure of a signaling-competent reelin fragment revealed by X-ray crystallography and electron tomography. EMBO J. 2006; 25: 3675-3683; Nakano, et al., The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J. Biol Chem. 2007; 282: 20544-20552; Hisanaga, et al., A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 (ADAMTS-4) cleaves Reelin in an isoform-dependent manner. FEBS Lett. 2012; 586: 3349-3353; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793). Один из эндогенных путей процессинга внеклеточного рилина осуществляется посредством сериновой протеазы тканевого активатора плазминогена (tPA) в головном мозге между R6 и R7 в рилине дикого типа (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). У нокаут-мышей (KO; от англ. knock-out) по tPA протеолиз не наблюдается, что подтверждает роль этой протеазы в независимом от рецептора НМДА (Nметил-D-аспартата), индуцируемом долговременной потенциацией синаптической передачи (ДВПСП) расщеплении рилина (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307), которое блокируется ингибитором серпина El (Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793). Дополнительным подтверждением является инкубация tPA с рилином ex vivo в течение 45 мин с образованием фрагмента NR6 (370 кДа), которое блокировалось ингибитором активатора плазминогена (PAI-1; серпин E1) и диизопропилфторфосфатами (ингибитор сериновых протеаз), но не блокировалось апротинином или CR-50 (антитело, которое связывается с N-концевым участком рилина; D'Arcangelo, et al., Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonal antibody. J. Neurosci. 1997; 17: 23-31; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). Исследования также позволяют предположить участие металлопротеаз меприна α и β в расщеплении рилина между повторами R6 и R7 (Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016; 159: 305-312). Однако ни у нокаут-мышей по tPA (Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307), ни у нокаутмышей по меприну β (Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016; 159: 305-312) не показаны различия в исходных уровнях полноразмерного рилина или фрагментов рилина, что позволяет предположить, что в конститутивные уровни и протеолиз рилина вовлечены комбинации протеаз.

В гиппокампе взрослого организма гликопротеин рилин экспрессируется промежуточными нейронами, расположенными в основном в прикорневом участке зубчатой извилины и в слое stratum lacunosum-moleculare самого гиппокампа. Экспрессирующие ренин клетки могут также находиться в stratum oriens и stratum radiatum областей CA1 и CA3 и ассоциированы с пирамидальными клетками гиппокампа. Для индукции долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП), являющейся формой синаптической пластичности, которая приводит в результате к продолжительному повышению эффективности синаптической передачи, необходима активация рецепторов НМДА (НМДАР) и последующая стимуляция экспрессии и функции рецептора альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовой кислоты (АМПК). Изменения рецепторов АМПК (АМПКР) могут быть достигнуты либо путем усиления фосфорилирования субъединицы, либо путем усиления синтеза субъединицы и миграции в специфичные синаптические участки. Напротив, НМДАР служат в качестве детекторов совпадения и играют основную роль в индукции синаптической пластичности. Для открытия ионных каналов НМДАР требуется связывание глутамата и деполяризация постсинаптической мембраны. Некоторые субъединицы НМДАР, такие как NR1, NR2A и NR2B, также подвергаются модуляторному фосфорилированию в остатках серина/треонина или тирозина. В результате фосфорилирования субъединиц НМДАР осуществляется модулирование как кинетики каналов, так и миграция к синаптическим участкам. Из этого следует, что, если рилин важен для модулирования синаптической пластичности, логично, что НМДАР и АМПКР должны быть его мишенями с учетом их значимости в индукции и экспрессии синаптической пластичности.

Недавно было обнаружено, что молекулы рилина образуют комплексы высокого порядка in vitro и in vivo, такие как Fc-рецептор-ассоциированный белок (RAP; от англ. receptor-associated protein). Это наблюдение было дополнительно уточнено путем демонстрации, что рилин секретируется in vivo в виде гомодимера, связанного дисульфидными связями. Делеция короткого участка, называемого эпитопом CR-50, локализованная на N-конце молекулы, препятствует олигомеризации. Этот мутированный рилин неспособен эффективно индуцировать фосфорилирование Dab1 в первичных нейронах мыши.

Рилин играет активную роль в процессах синаптической пластичности и обучения. Изобретение также включает идентификацию и использование механизмов процессинга белка рилина для усиления и/или репарации когнитивной функции. Например, в настоящем документе раскрыто, что: научение рефлексу ситуативного страха и стимуляция тета-вспышек (tb-стимуляция) вызывают изменения в процессинге рилина; металлопротеиназы, tPA и MMP-9 по-разному участвуют в процессинге рилина при про- 2 045597 цессах синаптической пластичности и научения; восполнение фрагмента комплемента рилина может приводить к усилению ассоциативного и пространственного научения и памяти; а ассоциация фрагментов рилина с Άβ бляшками, его экспрессия и процессинг изменяются в результате связанных с БА мутаций, и при восполнении рилина дефициты ДВПСП, обнаруживаемые в модели мышей Tg2576 AD, могут быть преодолены.

Как только рилин секретируется ГАМК-эргическими промежуточными нейронами во внеклеточное пространство, он связывается с липопротеиновыми рецепторами - рецептором липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНПР) и рецептором аполипопротеина 2 (ApoER2), вызывая их димеризацию (D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859). Димеризованные рецепторы фосфорилируют в остатке тирозина внутриклеточный адаптерный белок Disabled-1 (Dab1) с последующим фосфорилированием остатков тирозина тирозинкиназ семейства src (SFK), подобным Fyn, и фосфорилированием рецептора N-метил-D-аспартата (НМДАР) (D'Arcangelo, et al., Reelin is a secreted glycoprotein recognized by the CR-50 monoclonal antibody. J. Neurosci. 1997; 17: 23-31; D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Niu, et al., Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway. Neuron. 2004; 41: 71-84; Beffert, et al. Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47: 567-579; Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007; 97: 2312-2321; Burrell, et al., (2014). Fyn tyrosine kinase increases Apolipoprotein E receptor 2 levels and phosphorylation. PLoS One 9:e110845; Divekar, et al., Ligandinduced homotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2. J. Biol Chem. 2014; 289: 1589415903).

Возрастание инфлюкса кальция вследствие фосфорилирования НМДАР приводит к деполяризации постсинаптической мембраны, созреванию рецепторов НМДА от подтипа NR2B до подтипа NR2A рецептора и инсерции рецептора а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМПКР) (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007; 97: 2312-2321). Повышение инфлюкса Ca²⁺ и деполяризации клетки приводит к повышению фосфорилирования и синтеза белка цАМФответного элемента активирующего белка (CREB; от англ. cAMP response element-binding protein), что приводит, в конечном счете, к индукции и усилению долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП) и повышению синаптической пластичности, обучения и памяти (Niu, et al., The Reelin signaling pathway promotes dendritic spine development in hippocampal neurons. J. Neurosci. 2008; 28: 1033910348.; Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity and dendritic spine density. Learn. Mem. 2011;18: 558-564; Rogers, et al. Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 386-395). В то же время, фосфорилирование Dab1 приводит в результате к активации фосфатидилинозит-3-киназы (PI3K, от англ. phosphatidylinositol-3-kinase), протеинкиназы В (PKB/Akt) и к модулированию киназы 3 бета гликогенсинтазы (GSK3 β; от англ. Glycogen synthase kinase 3 beta), которая ингибирует фосфорилирование белка Tau (Beffert, et al., Reelin-mediated signaling locally regulates protein kinase B /Akt and glycogen synthase kinase 3 beta. J. Biol Chem. 2007; 277: 49958-49964), а также регуляцию преобразования p35 в p25, который ответственен за активацию CDK5 - другого пути фосфорилирования Tau (Beffert, et al., Reelin and cyclin-dependent kinase 5-dependent signals cooperate in regulating neuronal migration and synaptic transmission. J. Neurosci. 2004; 24: 1897-1906).

Таким образом, активация сигнального пути рилина является полезной мишенью для терапевтических средств против утраты синапсов и нейронов при различных состояниях. Например, показано, что рилин связывается с обоими рецепторами - липопротеинов и белка-предшественника амилоида (APP), и известно, что в ряде биологических моделей БА на мышах он ассоциируется с Ae бляшками (Chin, et al. Reelin depletion in the entorhinal cortex of human amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer's disease. J Neurosci 2007, 27: 2727-2733; Hoareau, et al. 2006; 281: 35176-35185; Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol Aging 2008, 29: 542-553; Hoe, et al. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281: 35176-35185; Miettinen, et al. Reelinimmunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse: effects of APP/PS1 genotype and ovariectomy. J Chem Neuroanat. 2005, 30: 105-1180).

- 3 045597

Кроме того, пути передачи сигнала рилина, по-видимому, особенно восприимчивы к болезни Альцгеймера (БА), потенциально внося вклад в ее патогенез (Hoe, et al. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. 2006, 281: 35176-35185; 281: 35176-35185;

Hoareau, et al., Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes Reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol. Aging. 2008; 29: 542-553).

Аналогично, рилин может оказывать влияние на синаптическую пластичность во взрослом организме. У мышей с нокаутом генов рилина, ApoER2 и ЛПНПР или Disabled-1 (Dab1) проявляется недостаточность синаптической пластичности (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952, Qui, et al., 2006, Beffert, et al., Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47: 567-579). Терапевтическое вмешательство, такое как двусторонние внутрижелудочковые инъекции (ДВИ) рилина, может применяться в качестве терапии и усиливать обучение, память и синаптическую пластичность у мышей дикого типа (Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity and dendritic spine density. Learn. Mem. 2011; 18: 558-564). Также показано, что ДВИ рилина восстанавливают дефициты обучения, памяти и ДВПСП, наблюдаемые у мышей, гетерозиготных по мутации reeler (Rogers, et al. Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 386-395), см. на фиг. 4, и в модели синдрома Ангельмана (Hethorn et al., 2016). Таким образом, восполнение содержания рилина путем введения белка или путем генотерапии геном рилина RELN может быть потенциальным терапевтическим вмешательством при ряде заболеваний.

Как только рилин секретируется ГАМК-эргическими промежуточными нейронами во внеклеточное пространство, он связывается с липопротеиновыми рецепторами - рецептором липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНПР) и рецептором аполипопротеина 2 (ApoER2), как показано на фиг. 1 (D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Weeber, et al. Reelin and Apo E receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955). Взаимодействие с лигандами приводит к димеризации рецепторов и фосфорилированию тирозина внутриклеточного адаптерного белка Dab1 нисходящего пути (Howell, et al., Mouse disabled (mDab1): a Src binding protein implicated in neuronal development. EMBO J. 1997; 16: 121-132; D'Arcangelo, et al., Reelin is a ligand for lipoprotein receptors. Neuron. 1999; 24: 471-479; Hiesberger, et al., Direct binding of Reelin to VLDL receptor and ApoE receptor 2 induces tyrosine phosphorylation of disabled-1 and modulates tau phosphorylation. Neuron. 1999; 24: 481-489; Strasser, et al., (2004). Receptor clustering is involved in Reelin signaling. Mol Cell Biol. 2004; 24: 1378-1386; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Trotter, et al., Dab1 is required for synaptic plasticity and associative learning. J. Neurosci. 2013; 33: 15652-15668-31; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of Reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Divekar, et al., Ligand-induced homotypic and heterotypic clustering of Apolipoprotein E receptor 2. j. Biol Chem. 2014; 289: 15894-15903). Фосфорилирование Dab1 активирует семейство тирозинкиназ Src (SFK), таких как Fyn, которые фосфорилируют Nметил-D-аспартат (НМДА), обеспечивая возможность повышения инфлюкса Ca²⁺ (Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216). Усиление инфлюкса Ca²⁺ обеспечивает возможность для созревания рецепторов НМДА от подтипа NR2B до подтипа NR2A рецептора и инсерции рецептора а-амино-2-гидрокси-3-метил-5-изоксазолпропионовой кислоты (АМПКР) и может вносить вклад в индукцию и усиление долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП; Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol.Chem. 2002; 277, 39944-39952; Beffert, et al., Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron. 2005; 47:567-579; Chen, et al., Reelin modulates NMDA receptor activity in cortical neurons. J. Neurosci. 2005; 25, 8209-8216; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J. Neurophysiol. 2007; 97, 2312-2321). Кроме того, индуцированное Dab1 фосфорилирование может также активировать фосфатидилинозит-3-киназу (PI3K), протеинкиназу B (PKB/Akt), что впоследствии вызывает ингибирование киназы 3 бета гликогенсинтазы (GSK3e) (Beffert, et al., Reelinmediated signaling locally regulates protein kinase B /Akt and glycogen synthase kinase 3 beta. J. Biol Chem. 2002; 277, 49958-49964), в свою очередь, подавляющее гиперфосфорилирование tau (Ohkubo, et al., Apolipoprotein E and Reelin ligands modulate tau phosphorylation through an Apolipoprotein E receptor/disabled1/glycogen synthase kinase-3beta cascade. FASEB J. 2003; 17, 295-297).

Поскольку рилин-положительные клетки обнаруживают в больших количествах в CA1 stratum la- 4 045597 cunosum и ножке гиппокампа, их локализация обладает преимуществом для влияния на обучение и память и на нейрогенез соответственно. Действительно, показано, что рилин усиливает синаптическую пластичность, обучение и память (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 1294312955; Rogers & Weeber, Reelin and ApoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008; 4: 259-270), а также изменяет миграцию вновь образующихся нейронов взрослого организма (Zhao, et al., Balance between neurogenesis and gliogenesis in the adult hippocampus: role for Reelin. Dev. Neurosci. 2007; 29: 84-90; Pujadas, et al., Reelin regulates postnatal neurogenesis and enhances spine hypertrophy and long-term potentiation. J. Neurosci. 2010; 30: 4636-4649.doi; Teixeira, et al., Cell-autonomous inactivation of the Reelin pathway impairs adult neurogenesis in the hippocampus. J. Neurosci. 2012; 32: 12051-12065). В гиппокампе внеклеточный рилин накапливается в stratum lacunosum (Pesold, et al., Cortical bitufted, horizontal and Martinotti cells preferentially express and secrete Reelin into perineuronal nets, non-synaptically modulating gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 3217-3222; Lussier, et al., Repeated exposure to corticosterone, but not restraint, decreases the number of Reelin-positive cells in the adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2009; 460: 170-174), таким образом, его локализация обладает преимуществом для влияния на синаптическую активность CA1 (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol Chem. 2002; 277: 39944-39952; Herz & Chen, Reelin, lipoprotein receptors and synaptic plasticity. Nat. Rev Neurosci. 2006; 7, 850-859; Qiu, et al., Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J. Neurosci. 2006; 26: 12943-12955; Rogers & Weeber, Reelin and ApoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008; 4: 259-270). Эндогенное расщепление рилина в этих участках можно использовать для регуляции действий рилина на эти процессы.

Кроме того, известно, что сигнальная система липопротеиновых рецепторов играет значимую роль в ЦНС взрослого организма, такую как гомеостаз холестерина, клиренс внеклеточных белков, модуляция формирования памяти, синаптическая передача, пластичность и созревание посредством активации многочисленных путей передачи сигнала. Важно, что лиганд липопротеиновых рецепторов аполипопротеин E (apoE) представляет один из наиболее достоверных факторов риска спорадической болезни Альцгеймера (БА) с поздним началом (Hoe HS, Harris DC, Rebeck GW. Multiple pathways of apolipoprotein E signaling in primary neurons. J Neurochem 2005; 93: 145-155; Hoe HS, Freeman J, Rebeck GW. Apolipoprotein E decreases tau kinases and phospho-tau levels in primary neurons. Mol Neurodegener 2006, 1: 18; Hoe HS, Pocivavsek A, Chakraborty G, et al. Apolipoprotein E receptor 2 interactions with the N-methyl-Daspartate receptor. J Biol Chem 2006, 281: 3425-3431). Аналогичным образом, внеклеточный матричный белок рилин может связываться с обоими рецепторами - липопротеинов и белка-предшественника амилоида (APP), и известно, что в ряде биологических моделей БА на мышах он ассоциируется с Ae бляшками (Chin J, Massaro CM, Palop JJ, et al. Reelin depletion in the entorhinal cortex of human amyloid precursor protein transgenic mice and humans with Alzheimer's disease. J Neurosci 2007, 27:2727-2733; Hoareau C, Borrell V, Soriano E, Krebs MO, Prochiantz A, Allinquant B. Amyloid precursor protein cytoplasmic domain antagonizes reelin neurite outgrowth inhibition of hippocampal neurons. Neurobiol Aging 2008, 29: 542-553; Hoe HS, Tran TS, Matsuoka Y, Howell BW, Rebeck GW. DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem 2006, 281:35176-35185; and Miettinen R, Riedel A, Kalesnykas G, et al. Reelin-immunoreactivity in the hippocampal formation of 9-month-old wildtype mouse: effects of APP/PS1 genotype and ovariectomy. J Chem Neuroanat 2005, 30: 105-1180). Накопление Ae может влиять на активацию передачи сигнала рилина и функцию липопротеиновых рецепторов, стимулируя посредством этого патогенез БА и оказывая отрицательное влияние на синаптическую и когнитивную функцию.

Поэтому необходимы специфичные агонисты, действующие на систему липопротеиновых рецепторов аналогично рилину, для применения в качестве терапевтических средств в улучшении когнитивной функции, а также в лечении неврологического заболевания, такого как БА, и других возрастных нейродегенеративных расстройств и неврологических расстройств.

Краткое изложение сущности изобретения

Описанные в настоящем документе композиции и способы в целом относятся к способам влияния на когнитивную функцию и ее усиления посредством повышения содержания рилина и/или предотвращения взаимодействия с ним, а также на передачу клеточных сигналов, инициируемых или поддерживаемых рилином или активацией передачи сигнала рилина.

В настоящем изобретении предложен способ лечения или корректирования заболевания или расстройства нервной системы посредством введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества рекомбинантного фрагмента рилина или фрагмента сплайсинга рилина. В некоторых вариантах рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина представляет собой фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R5 (R3-R5), фрагмент рилинового повтора R3, со

- 5 045597 стыкованный с фрагментом рилинового повтора R5 (R3+R5), фрагмент рилинового повтора R3, фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R6 (R3-R6), фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R6 (R3+R6), где R3 представляет собой повторяющийся участок 3 полноразмерного рилина, R4 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, R5 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, a R6 представляет собой повторяющийся участок 6 полноразмерного рилина. Необязательно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R5, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R5, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка 5 или их комбинации. Альтернативно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R6, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R6, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка 6 или их комбинации. В конкретных вариантах рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина представляет собой фрагмент рилинового повтора R3, фрагмент рилинового повтора R4, фрагмент рилинового повтора R5, фрагмент рилинового повтора R6, фрагмент рилиновых повторов R3-R4, фрагмент рилиновых повторов R3-R5, фрагмент рилинового повтора R3 - повторяющегося участка R6, фрагмент рилиновых повторов R4-R5, фрагмент рилиновых повторов R5-R6, фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R5, фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R6, фрагмент рилинового повтора R4, состыкованный с повтором R6, ли комбинацию вышеупомянутого(ых) фрагмента(ов) рилина или фрагмента(ов) сплайсинга рилина. В некоторых вариантах изобретения заболевание или расстройство нервной системы представляет собой нейродегенеративное заболевание, поражение нейронов, нарушение функции нейронов или инсульт. В конкретных вариантах нарушение функции нейронов выбрано из группы, состоящей из синдрома ломкой X-хромосомы, синдрома Вильямса, синдрома Ретта, синдрома Дауна, синдрома Ангельмана, аутизма, дефицита рилина, биполярного расстройства, депрессии и шизофрении. Альтернативно заболевание или расстройство нервной системы представляет собой поражение нейронов или болезнь Альцгеймера.

Необязательно фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят путем парентеральной инъекции. В конкретных вариантах фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят путем внутриартериальной, внутривенной, внутричерепной или внутрижелудочковой инъекции. В конкретных вариантах изобретения фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят в желудочки головного мозга пациента с двух сторон. В некоторых вариантах фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина вводят до получения концентрации рилина в жидкость ЦНС от около 10 мкмоль/л до около 5 нмоль/л. Возможные концентрации включают 10 мкмоль/л, 15 мкмоль/л, 20 мкмоль/л, 25 мкмоль/л, 30 мкмоль/л, 3 мкмоль/л 40 мкмоль/л 45 мкмоль/л, 50 мкмоль/л, 55 мкмоль/л, 60 мкмоль/л, 65 мкмоль/л, 70 мкмоль/л, 75 мкмоль/л, 80 мкмоль/л, 85 мкмоль/л, 90 мкмоль/л, 100 мкмоль/л, 110 мкмоль/л, 120 мкмоль/л, 130 мкмоль/л, 140 мкмоль/л, 150 мкмоль/л, 160 мкмоль/л, 170 мкмоль/л, 180 мкмоль/л, 190 мкмоль/л, 200 мкмоль/л, 220 мкмоль/л, 225 мкмоль/л, 240 мкмоль/л, 250 мкмоль/л, 270 мкмоль/л, 275 мкмоль/л,280 мкмоль/л, 300 мкмоль/л, 320 мкмоль/л, 325 мкмоль/л, 340 мкмоль/л, 350 мкмоль/л, 370 мкмоль/л,375 мкмоль/л, 380 мкмоль/л, 400 мкмоль/л, 420 мкмоль/л, 425 мкмоль/л, 440 мкмоль/л, 450 мкмоль/л,470 мкмоль/л, 475 мкмоль/л, 480 мкмоль/л, 500 мкмоль/л, 520 мкмоль/л, 525 мкмоль/л, 540 мкмоль/л,550 мкмоль/л, 570 мкмоль/л, 575 мкмоль/л, 580 мкмоль/л, 600 мкмоль/л, 620 мкмоль/л, 625 мкмоль/л,640 мкмоль/л, 650 мкмоль/л, 670 мкмоль/л, 675 мкмоль/л, 680 мкмоль/л, 700 мкмоль/л, 720 мкмоль/л,725 мкмоль/л, 740 мкмоль/л, 750 мкмоль/л, 770 мкмоль/л, 775 мкмоль/л, 780 мкмоль/л, 800 мкмоль/л,820 мкмоль/л, 825 мкмоль/л, 840 мкмоль/л, 850 мкмоль/л, 870 мкмоль/л, 875 мкмоль/л, 880 мкмоль/л,900 мкмоль/л, 920 мкмоль/л, 925 мкмоль/л, 940 мкмоль/л, 950 мкмоль/л, 970 мкмоль/л, 975 мкмоль/л,980 мкмоль/л, 1 нмоль/л, 1,1 нмоль/л, 1,2 нмоль/л, 1,3 нмоль/л, 1,4 нмоль/л, 1,5 нмоль/л, 1,6 нмоль/л,1,7 нмоль/л, 1,8 нмоль/л, 1,9 нмоль/л, 2,0 нмоль/л, 2,1 нмоль/л, 2,2 нмоль/л, 2,3 нмоль/л, 2,4 нмоль/л,2,5 нмоль/л, 2,6 нмоль/л, 2,7 нмоль/л, 2,8 нмоль/л, 2,9 нмоль/л, 3,0 нмоль/л, 3,1 нмоль/л, 3,2 нмоль/л,3,3 нмоль/л, 3,4 нмоль/л, 3,5 нмоль/л, 3,6 нмоль/л, 3,7 нмоль/л, 3,8 нмоль/л, 3,9 нмоль/л, 4,0 нмоль/л,4,1 нмоль/л, 4,2 нмоль/л, 4,3 нмоль/л, 4,4 нмоль/л, 4,5 нмоль/л, 4,6 нмоль/л, 4,7 нмоль/л, 4,8 нмоль/л,4,9 нмоль/л и 5,0 нмоль/л. Например, терапевтическая концентрация может составлять менее 100 нмоль/л, менее 50 нмоль/л, менее 25 нмоль/л, менее 10 нмоль/л или около 5 нмоль/л. Дозировки могут быть рассчитаны на основании распределения белка в организме животного и доступа через гематоэнцефалический барьер. Не имеющим ограничительного характера примером является пример, в котором рилин вводят в количестве 1 мкл композиции 5 нмоль/л на каждые 30-36 г массы тела пациента. Кроме того, лечение можно продолжить, т.е. оно может быть постоянным, либо схема лечения может продолжаться в течение менее 1 года, менее 6 месяцев, менее 3 месяцев, менее 1 месяца, менее 1 недели или около 1 суток.

В некоторых вариантах изобретения конструкцию, образованную из рекомбинантного фрагмента рилина или фрагмента сплайсинга рилина, встраивают в вирусный вектор с образованием вектора рилина, и вектор рилина вводят пациенту путем инъекции. Возможные векторы включают векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV; от англ. adeno-associated virus) AAV9, AAV5, AAV1 и AAV4. Однако другие векторы, особенно любой подходящий вектор AAV, известный в данной области техники, могут быть использованы в изобретении и рассмотрены для такого применения. В конкретных вариантах

- 6 045597 рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина находится под контролем цитомегаловирусного промотора (CMV).

Изобретение также включает композицию, содержащую рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина, который представляет собой фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R5 (R3-R5), фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R5 (R3+R5), фрагмент рилинового повтора R3, фрагмент рилина, образованный из повторов R3-R6 (R3-R6), фрагмент рилинового повтора R3, состыкованный с фрагментом рилинового повтора R6 (R3+R6), где R3 представляет собой повторяющийся участок 3 полноразмерного рилина, R4 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, R5 представляет собой повторяющийся участок 5 полноразмерного рилина, a R6 представляет собой повторяющийся участок 6 полноразмерного рилина. Необязательно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R5, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R5, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка 5 или их комбинации. Альтернативно, где фрагмент сплайсинга рилина представляет собой R3+R6, два повторяющихся участка, т.е. R3 и R6, состыковываются посредством петли повторяющегося участка 3, петли повторяющегося участка б или их комбинации.

В некоторых вариантах композиции рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина интегрирован в конструкцию, образованную из рекомбинантного фрагмента рилина или фрагмента сплайсинга рилина, встроенного в вирусный вектор с образованием вектора рилина, и вектор рилина вводят пациенту путем инъекции. Возможные векторы включают векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV; от англ. adeno-associated virus) AAV9, AAV5, AAV1 и AAV4. Однако другие векторы, особенно любой подходящий вектор AAV, известный в данной области техники, могут быть использованы в изобретении и рассмотрены для такого применения. В конкретных вариантах рекомбинантный фрагмент рилина или фрагмент сплайсинга рилина находится под контролем цитомегаловирусного промотора (CMV).

Вышеупомянутые композиции можно также применять для лечения симптома заболевания или расстройства нервной системы, включающего нейродегенеративные заболевания, нарушения функции нейронов и инсульт. Не имеющие ограничительного характера примеры включают синдром ломкой Xхромосомы, синдром Вильямса, синдром Ретта, синдром Дауна, синдром Ангельмана, аутизм, ишемию, гипоксию, болезнь Альцгеймера, дефицит рилина, биполярное расстройство, депрессию, шизофрению и инсульт.

Конкретные примеры симптомов заболевания или расстройства нервной системы включают недостаточность плотности дендритных шипиков, снижение долговременной потенциации, снижение синаптической пластичности и нарушения ассоциативного научения. Полезные терапевтические композиции и их количества описаны выше.

Вышеупомянутые композиции можно также применять для увеличения плотности дендритных шипиков у субъекта. Полезные терапевтические композиции и их количества описаны выше.

Описанные выше композиции также полезны для повышения синаптической пластичности, обучения или улучшения когнитивной функции. Композиции и количества, которые можно применять для повышения синаптической пластичности, обучения или улучшения когнитивной функции являются такими, как описано выше.

Краткое описание чертежей

Для более полного понимания изобретения следует ссылаться на последующее подробное описание изобретения, рассмотренное в сочетании с сопроводительными чертежами, на которых показано следующее.

На фиг. 1 представлена иллюстрация биохимического пути рилина в синаптической пластичности взрослого организма.

На фиг. 2 представлена иллюстрация, на которой показан протеолиз рилина в головном мозге взрослого организма. Полноразмерный рилин высвобождается во внеклеточное пространство ГАМКергическими промежуточными нейронами в головном мозге взрослого организма. Этот полноразмерный рилин претерпевает ферментативное расщепление между повторами 2-3 (R2-R3), подобными эпидермальному фактору роста (ЭФР) и 6-7 (R6-R7; указаны пунктирными линиями; под действием различных ферментов. Например, показано, что тканевой активатор плазминогена (tPA) меприн α и β расщепляет рилин между R6 и R7 (Kohno, et al., Mechanism and significance of specific proteolytic cleavage of Reelin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009; 380: 93-97; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307; Sato, et al., Determination of cleavage site of Reelin between its sixth and seventh repeat and contribution of meprin metalloproteases to the cleavage. J. Biochem. 2016; 159: 305-312), при этом матриксные металлопротеиназы (MMP)-9 расщепляют рилин между R2 и R3 (Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793). 4; 5-4; Hisanaga, et al., A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 (ADAMTS-4) cleaves Reelin in an isoform- 7 045597 dependent manner. FEBS Lett. 2012; 586: 3349-3353; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS

One. 2012; 7: e47793). В процессинг рилина также потенциально вовлечены другие, еще не идентифицированные протеазы.

На фиг. 3 представлена иллюстрация, на которой показан полноразмерный рилин (450 кДа) и фрагменты рилина, образованные путем расщепления рядом ферментов, приводящего к образованию пяти фрагментов в диапазоне размера 370-80 кДа. Показано, что фрагмент R3-R6 [включенный в полноразмерный рилин (450 кДа), фрагменты 370 кДа, 190 кДа и 270 кДа] связывается с липопротеиновыми рецепторами ApoER2 ЛПОНПР (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521). Показано, что фрагмент N-R2 (180 кДа) связывается с а₃в1-интегринами (Dulabon, et al., Reelin binds alpha3betal integrin and inhibits neuronal migration. Neuron. 2000;27:33-44.), а миграция нейронов нарушается in vivo антителом CR-50 (Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997;94:8196-8201). Показано, что C-концевой участок (R7-C; 80 кДа) вовлечен в секрецию рилина, а также в его правильный фолдинг (de Bergeyck, et al., A truncated Reelin protein is produced but not secreted in the 'Orleans' reeler mutation (Reln[rl-Orl]). Brain Res. Mol. Brain Res. 1997;50:85-90; Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521) и в эффективность перелачи нисходящих сигналов (Nakano, et al., The extremely conserved C-terminal region of Reelin is not necessary for secretion but is required for efficient activation of downstream signaling. J. Biol. Chem. 2007;282:20544-20552).

На фиг. 4 представлен график, показывающий ДВПСП при стимуляции тета-вспышки.

На фиг. 5 представлена последовательность полноразмерного рилина. Сайты распознавания для эндонуклеаз показаны над их соответствующей последовательностью. Повторяющиеся последовательности представлены метками с левой стороны, и повторяющиеся участки выделены. Между каждыми из повторяющихся участков находится петля слияния, которая не выделена.

На фиг. 6 представлена иллюстрация рилин-зависимого рецептора ApoER2, показывающая инактивированный рецептор и димеризованный рецептор, который является активным и флуоресцирует. Эту систему используют в анализе активации рецептора, основанном на количественном определении репортерного гена люциферазы.

На фиг. 7 представлена иллюстрация, на которой показаны фрагменты рилина, образованные путем расщепления рядом ферментов, приводящего в результате к образованию различных фрагментов. Фрагмент R3-R6 сравнивают с фрагментами рилина R3, который содержит только третий участок сплайсинга, R3-4, содержащим участки сплайсинга R3 и R4, состыкованные вместе, R3-R5, который содержит повторяющиеся участки R3, R4 и R5, состыкованные вместе, и фрагментом R5-R6, который включает участок R5, состыкованный с участком R6. Также показаны фрагменты R3+R5 и R3+R6, содержащие участки R3, состыкованные с участком R5 или с участком R6 соответственно.

На фиг. 8 представлена последовательность фрагмента рилина 3+6. Этот фрагмент был образован путем соединения петли 3-4 с петлей 5-6, присоединяя, таким образом, повтор 3 к повтору 6. Участок, соответствующий сигнальному пептиду, выделен темно-серым цветом, и за ним следует повторяющийся участок 3, выделенный светло-серым цветом. Соединительный петлевой участок для 3-4 выделен среднесерым цветом, и за ним следует соединительный петлевой участок 5-6 и повторяющийся участок 6, темно-серым цветом.

На фиг. 9 представлена последовательность фрагмента 3+5 рилина. Этот фрагмент был образован путем соединения петли 3-4 с петлей 4-5, присоединяя, таким образом, повтор 3 к повтору 5. Участок, соответствующий сигнальному пептиду, выделен темно-серым цветом, и за ним следует повторяющийся участок 3, выделенный светло-серым цветом. Соединительный петлевой участок для 3-4 выделен среднесерым цветом, и за ним следует соединительный петлевой участок 4-5 и повторяющийся участок 5, темно-серым цветом.

На фиг. 10 представлен график, показывающий анализ ApoER2 на основе количественного определения репортерного гена люциферазы с использованием фрагментов рилина мыши.

На фиг. 11 представлен график, показывающий анализ ApoER2 на основе количественного определения репортерного гена люциферазы с использованием фрагментов рилина человека.

На фиг. 12 представлен график сравнения анализа ApoER2 на основе количественного определения репортерного гена люциферазы с использованием фрагментов рилина мыши и фрагментов рилина человека.

На фиг. 13(A) представлен блот, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Репрезентативный Вестерн-блоттинг, на котором показан ApoER2 и активность и состояние фосфорилирования протеинкиназы B (AKT) и регулируемой внеклеточными сигналами киназы (ERK; от англ. Extracellular Regulated Kinase). Фосфорилирование ERK представляет собой прямое обнаружение актив- 8 045597 ности ERK и представляет активацию восходящего сигнального пути.

На фиг. 13(B) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Активность ApoER2 измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.

На фиг. 13(C) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Уровень фосфорилирования AKT измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.

На фиг. 13(D) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Общее содержание AKT измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.

На фиг. 13(E) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Уровень фосфорилирования внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.

На фиг. 13(F) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Общее содержание внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.

На фиг. 13(G) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6), и подвергнутая лизису в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином. Отношение количества фосфорилированной внеклеточно регулируемой киназы (ERK) к общему содержанию внеклеточно регулируемой киназы (ERK) определяли и стандартизовали по необработанному образцу (момент времени 0). Состояние фосфорилирования ERK представляет собой прямое обнаружение активности ERK и представляет активацию восходящего сигнального пути. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 5-6.

На фиг. 14(A) представлен блот, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены повторяющиеся участки R3 и R5 (hR3+5) последовательности рилина человека, повторы R3-R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут, и клетки подвергали лизису. Репрезентативный Вестерн-блоттинг был проведен для общей и фосфорилированной внеклеточно регулируемой киназы (ERK).

На фиг. 14(B) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены повторяющиеся участки R3 и R5 (hR3+5) последовательности рилина человека, повторы R3-R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут, и клетки подвергали лизису. Содержание фосфорилированной внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 4.

На фиг. 14(C) представлен график, на котором показана культура первичных нейронов, обработанная 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены повторяющиеся участки R3 и R5 (hR3+5) последовательности рилина человека, повторы R3-R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и

- 9 045597 полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут, и клетки подвергали лизису. Общее содержание внеклеточно регулируемой киназы (ERK) измеряли в различные моменты времени и нормализовали по актину. На всех графиках представлено среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) Объем выборки равен 4.

На фиг. 15 представлен график, показывающий количественные анализы фосфорилирования Dab-1 с использованием полноразмерного рилина.

На фиг. 16 представлен линейный график, показывающий фосфорилирование Dab-1 со временем под действием полноразмерного рилина.

На фиг. 17 представлен график, показывающий количественные анализы фосфорилирования Dab-1 с использованием фрагмента рилина R3-6.

На фиг. 18 представлен линейный график, показывающий фосфорилирование Dab-1 со временем под действием фрагмента рилина R3-6.

На фиг. 19 перфузия Fc-RAP усиливает индукцию ДВПСП в гиппокампе. Срезы гиппокампа перфузировали Fc-RAP (10 мкг/мл), Fc (10 мкг/мл) или контрольной средой. Регистрировали исходные синаптические ответы (f) и потенциация сразу после высокочастотной стимуляции (ВЧС) (J) и до 60 мин после ВЧС (-). Стрелкой показана ДВПСП, индуцированная двумя последовательностями стимуляции 100 Гц длительностью 1 секунда с интервалами 20 с. Горизонтальной линией показано нанесение Fc-RAP, Fc или контрольной среды. Результаты представлены в виде средних арифметических значений ± стандартные ошибки средних арифметических. fEPSP, возбуждающий постсинаптический потенциал поля; Strasser и соавт., 2004.

На фиг. 20(A) представлена электрограмма, показывающая, что рилин усиливает токи НМДАР посредством постсинаптических механизмов. Иллюстрация измерения EPSC_Нмд_А. Линиями представлены: отсутствие обработки, ложная обработка и обработка рилином, и показано, что обработка рилином усиливает функционирование рецептора НМДА посредством кальциевой проводимости.

На фиг. 20(B) представлена электрограмма, показывающая, что рилин усиливает токи НМДАР посредством постсинаптических механизмов. Иллюстрация измерения EPSCнмд_А с AP5. Линиями представлены: отсутствие обработки, ложная обработка и обработка рилином, и показано, что обработка рилином усиливает функционирование рецептора НМДА посредством кальциевой проводимости.

На фиг. 21(A) показан график, показывающий измерение EPSCнмд_А. Толстой серой линией представлено mEPSCнмд_А.

На фиг. 21(B) представлен график, показывающий, что обработка рилином статистически значимо повышает амплитуду mEPSC_НМд_А (заштрихованные круги, до добавления рилина; незаштрихованные круги, после добавления рилина; ***p<0,001; n=18; парный t-критерий). Ложная обработка не оказала влияния [заштрихованные квадраты, до ложной обработки; незаштрихованные квадраты, после ложной обработки; статистически незначимо (сн), p>0,05; n=13; парный t-критерий].

На фиг. 21(С) представлен график, показывающий синаптическую передачу в трех моментах времени, без обработки рилином, с обработкой рилином и составной график их сравнения.

На фиг. 21(D) представлен график, показывающий отсутствие корреляции коэффициентов 1/CV2 и средних арифметических значений коэффициентов EPSCнмд_А (после/до воздействия рилина) на основании регистрации в девяти ячейках (r=0,31; p=0,4; критерий Спирмена).

На фиг. 22(A) представлен Вестерн-блоттинг, показывающий, что активация передачи сигнала рилина приводит к изменению поверхностной экспрессии и общего содержания субъединиц рецептора глутамата. Репрезентативные блоттинги показывают как общее, так и поверхностное содержание GluR1, NR1, NR2A и NR2B.

На фиг. 22(B). Объединенные результаты количественного определения субъединиц рецептора глутамата для 4 экспериментов методом Вестерн-блоттинга. По сравнению с группами с ложной обработкой количество обоих рецепторов GluR1 и NR2A на поверхности статистически значимо увеличивалось [GluR1, F(2,11) =15,56, ***P<0,001; NR2A, F(2,11)=44,9, ***P<0,001], а содержание рецептора NR2B на поверхности статистически значимо уменьшалось [F(2,11)=22,6, ***P<0,001] после хронической обработки рилином.

На фиг. 22(C) - объединенные результаты количественного определения субъединиц рецептора глутамата для 4 экспериментов методом Вестерн-блоттинга. Обработка рилином приводила к статистически значимому увеличению общего содержания GluR1 [F(2,11)=11,2, **P<0,01], NR2A [F(2,14)=9,75, **P<0,01] и уменьшению общего содержания NR2B [F(2,11)=4,1, *P<0,05]. Напротив, ни общее, ни поверхностное содержание NR1 (на B) не наблюдалось.

На фиг. 23(A) представлен график, показывающий влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Дендритные шипики на нейроне дикого типа (ДТ) показаны на увеличенной фотографии репрезентативного первичного дендрита.

На фиг. 23(B) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных

- 10 045597 шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. У мышей HRM количество дендритных шипиков было уменьшено по сравнению с мышами ДТ, но после обработки рилином плотность шипиков восстанавливалась. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением какихлибо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).

На фиг. 23(C) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. У мышей HRM количество дендритных шипиков было уменьшено по сравнению с мышами ДТ, но после обработки рилином плотность шипиков восстанавливалась. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением какихлибо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).

На фиг. 23(D) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Дендритные шипики у нокаут-мышей по рилину встречаются очень редко, но после обработки рилином недостаток дендритных шипиков восполнялся. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением каких-либо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).

На фиг. 23(E) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Дендритные шипики у нокаут-мышей по рилину встречаются очень редко, но после обработки рилином недостаток дендритных шипиков восполнялся. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением каких-либо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).

На фиг. 23(F) представлено изображение, показывающее влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Количественное определение дендритных шипиков проводили с помощью конфокального микроскопа. Дендритные шипики определяли как любой отросток первичного дендрита с исключением каких-либо вторичных дендритов. Дендритные шипики считали и измеряли каждые 50 мкм дендрита. В клетках, обработанных рилином (n=3), количество шипиков статистически значимо увеличивалось по сравнению с ложно обработанными клетками (n=3).

На фиг. 24(A) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность MMP-9 (активная; Калбиохем (Calbiochem), PF140) оказывать влияние на процессинг рилина определяли подвергая рилин (50 нмоль/л) взаимодействию с MMP-9 в различных концентрациях (1-4 мкг/мл) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при 37°С в течение 3 часов. В качестве отрицательного контроля в реакцию включали этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (10 ммоль/л), поскольку она блокирует активность MMP-9. Для Вестерн-блоттинга использовали 1:10 реакционной смеси и гибридизовали с антителом к рилину (G10).

На фиг. 24(B) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность MMP-9 (250 нмоль/л) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Клеточные экстракты белка подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.

На фиг. 24(C) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность MMP-9 (250 нмоль/л) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Экстракты белка супернатанта подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.

На фиг. 24(D) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность ингибитора MMP-9 (25 нмоль/л; Калбиохем 444278) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Клеточные экстракты белка подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.

На фиг. 24(E) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина MMP-9. Способность ингибитора MMP-9 (25 нмоль/л; Калбиохем 444278) оказывать влияние на процессинг рилина в первичных кортикальных нейронах определяли через 24 часа в экстрагированных белках супернатанта. Экстракты белка супернатанта подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.

- 11 045597

На фиг. 25 представлен график, показывающий влияние рилина на плотность дендритных шипиков. Чтобы изучить действие рилина на плотность дендритных шипиков, его постоянно добавляли в первичные культуры нейронов гиппокампа. Содержание рилина в культуре клеток определяли методом Вестерн-блоттинга. Из культуры отбирали образцы в моменты времени 0, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов для определения уровней деградации рилина in vitro. В последнем столбце представлен нативный рилин в концентрации, вводимой в культуру. Рилин присутствовал вплоть до 96 часов после внесения в культуру, и до 72 часов его деградация не начиналась.

На фиг. 26(A) представлен график, показывающий, что восполнение рилина может улучшать ассоциативное научение и пространственную память. Мыши дикого типа получали либо 5 нмоль/л RAP, либо 5 нмоль/л рилина путем двусторонней инъекции в желудочки головного мозга за 3 часа до выработки условного рефлекса в связи с переживанием чувства страха. Через 24 ч после подготовки мышей помещали в условия исследования и измеряли реакцию замирания. Было обнаружено, что RAP ингибирует способность к научению и память, при этом действие рилина приводило к их усилению (RAP n=9, без электроболевого раздражения n=5, без обработки n=7, рилин n=5; p>0,05).

На фиг. 26(B) представлен график, показывающий, что восполнение рилина может улучшать ассоциативное научение и пространственную память. Мышей дикого типа тренировали на поиск скрытой платформы в водном лабиринте Морриса. Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (красные круги, n=4), либо контрольного растворителя (пустые круги, n=6). В день 5 проводили пробное испытание, затем в день 6 мышей обучали находить новое расположение платформы. Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (n=4), либо контрольного растворителя (n=6).

На фиг. 26(C) представлен график, показывающий, что восполнение рилина может улучшать ассоциативное научение и пространственную память. Мышей дикого типа тренировали на поиск скрытой платформы в водном лабиринте Морриса. Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (красные круги, n=4), либо контрольного растворителя (пустые круги, n=6). Изучение латентных периодов индивидуальных испытаний в день 1. (*=p>0,05). Мыши получали однократную инъекцию либо 5 нмоль/л рилина (n=4), либо контрольного растворителя (n=6).

На фиг. 27(A) представляет собой блот, показывающий, что в условиях выработки условного рефлекса ситуативного страха содержание рилина изменяется. У мышей вырабатывали условный рефлекс ситуативного страха в соответствии с протоколом с 3 электроболевыми раздражителями (CFC; от англ. contextual fear conditioning protocol). У мышей, не подвергавшихся электроболевому раздражению (CS), используемых в качестве отрицательного контроля, и у мышей, подвергавшихся электроболевому раздражению в аналогичной ситуации (CS/US), извлекали гиппокамп через 1, 5, 15, 30 и 180 минут после выработки рефлекса, а также через 18 часов после выработки рефлекса (n=4 для каждого момента времени). В гомогенатах гиппокампа определяли рилин с помощью антитела к рилину (G10).

На фиг. 27(B) представляет собой блот, показывающий, что в условиях выработки условного рефлекса ситуативного страха содержание рилина изменяется. У мышей вырабатывали условный рефлекс ситуативного страха в соответствии с протоколом с 3 электроболевыми раздражителями (CFC; от англ. contextual fear conditioning protocol). У мышей, не подвергавшихся электроболевому раздражению (CS), используемых в качестве отрицательного контроля, и у мышей, подвергавшихся электроболевому раздражению в аналогичной ситуации (CS/US), извлекали гиппокамп через 1, 5, 15, 30 и 180 минут после выработки рефлекса, а также через 18 часов после выработки рефлекса (n=4 для каждого момента времени). Проводили количественное определение содержания полноразмерного рилина. Звездочками обозначена статистическая значимость после применения двухстороннего t-критерия, где p<0,5.

На фиг. 28(A) представлен блот, показывающий изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. Анализу методом Вестерн-блоттинга подвергали образцы изолированной коры головного мозга 14-месячных мышей дикого типа, Tg2576 (SweAPP), PS1-FAD (M146L) и 2X (SweAPP x M146L) (n=4). У мышей Tg2576 по сравнению с мышами дикого типа не было выявлено статистически значимых различий по содержанию продуктов рилина 450, 190 и 180 кДа, но у мышей Tg2576 и 2X отмечено статистически значимое увеличение количества неидентифицированных N-концевых последовательностей, распознаваемых антителом G10. В отличие от этого, количество продуктов рилина 450 и 180 кДа статистически значимо увеличивалось у мышей PS1-FAD и 2X (p<0,05).

На фиг. 28(B) представлен блот, показывающий изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. Анализу методом Вестерн-блоттинга подвергали образцы изолированной коры головного мозга 14-месячных мышей дикого типа, PS1-FAD (M146L) и 2X (SweAPP x M146L) (n=4). Отмечено статистически значимое уменьшение содержания Dab1-pTyr220 у мышей Tg2576 и его статистически значимое увеличение у обеих линий мышей PS1-FAD и 2X.

На фиг. 28(C) представлен график, показывающий изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. В результате нанесения рилина (5 нмоль/л) перед стимуляцией возобновлялась способность к восстановлению недостаточности ВЧС-стимулированной ДВПСП в области CA1 мышей Tg2576.

На фиг. 29(A) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На горизонтальных срезах 14-месячных мышей Tg2576 применяли 3- 12 045597 эпитопную стратегию картирования процессинга рилина in vivo. Обнаруживаемые антителом Reelin-CT (G20) фрагменты рилина, содержащие R7-8, были ограничены сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).

На фиг. 29(B) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На горизонтальных срезах 14-месячных мышей Tg2576 применяли 3эпитопную стратегию картирования процессинга рилина in vivo. Обнаруживаемые антителом Reelin-NT фрагменты рилина, содержащие N-R2, были ограничены сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).

На фиг. 29(C) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На горизонтальных срезах 14-месячных мышей Tg2576 применяли 3эпитопную стратегию картирования процессинга рилина in vivo. Обнаруживаемые антителом Reelin-MT (AF3820) фрагменты рилина, содержащие R3-6, были ограничены сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).

На фиг. 29(D) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. Иммунофлуоресцентное изображение горизонтальных срезов 14месячных мышей Tg2576 для антител Reelin-CT (G20) и -MT (AF3820) объединяли, ограничиваясь сердцевиной бляшки с плотной сердцевиной, обнаруживаемой антителом 6E10 (к Άβ).

На фиг. 29(E) представлено изображение, показывающее изменение активации передачи сигнала рилина в моделях БА на мышах. На увеличенном иммунофлуоресцентном изображении 14-месячных мышей Tg2576 показаны фрагменты рилина Reelin-NT (N-R2), окружающие сердцевину бляшки у модельных мышей tg2576. Масштабная полоска=15 мкм.

На фиг. 30. К срезам гиппокампов от 12-месячных мышей Tg2576 применяли индукцию ДВПСП с использованием стандартной двойной последовательности ВЧС 100 Гц. Серию срезов перфузировали рилином 5 нмоль/л. В срезах, обработанных рилином, показано повышение индукции ДВПСП по сравнению с уровнями у мышей дикого типа.

На фиг. 31 представлен график, показывающий, что обработка рилином способствует восстановлению функций при хронической черепно-мозговой травме (ЧМТ). Тесты покачивания приподнятого тела, показывающие смещение покачивания тела на исходном уровне после травматического повреждения головного мозга кортикальным импактором, которое ослаблялось под действием рилина.

На фиг. 32 представлен график, показывающий, что обработка рилином способствует восстановлению функций при хронической ЧМТ. Акинезия конечностей, показывающая утрату произвольных движений конечностей на исходном уровне после травматического повреждения головного мозга кортикальным импактором, которая ослаблялась под действием рилина.

На фиг. 33 представлен график, показывающий, что обработка рилином способствует восстановлению функций при хронической ЧМТ. Захват лапы, показывающий утрату силы конечностей на исходном уровне после травматического повреждения головного мозга кортикальным импактором.

На фиг. 34 представлена иллюстрация некоторых конструкций, используемых в SA2 и SA3, и сайты расщепления рилина. MMP-9 может расщеплять его между участками 2 и 3, но также показано, что она расщепляет его в участке 7 только в реакциях in vitro. tPA может расщеплять его между участками 6 и 7. Предложенные конструкции получены без сайта связывания MMP-9 in vitro с обеими, C- и N-концевыми, метками. Rln-Res=рилин, устойчивый к расщеплению; Rln-Lab = лабильный рилин.

На фиг. 35(A) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина tPA. Способность tPA/плазминогена оказывать влияние на процессинг рилина определяли, подвергая взаимодействию рилин (50 нмоль/л) с tPA (60 мкг/мл), неактивным плазминогеном (18 мкг/мл), tPA и плазминогеном, а также плазмином (активный, 0,5 Ед./мл) в ФСБ в течение 45 минут при 37°С. Реакционные смеси наносили на Вестерн-блоттинг (в соотношении 1:10) и гибридизовали с антителом к рилину (G10, антитело, распознающее N-R2) и другим антителом к рилину (Ab14, антитело, распознающее R7-8).

На фиг. 35(B) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина tPA. Способность tPA оказывать влияние на метаболизм рилина в первичных кортикальных нейронах определяли путем инкубации клеток в свежесобранном супернатанте в течение 24 часов с 70 нмоль/л tPA. Клеточные экстракты белка подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.

На фиг. 35(C) представлен блот, показывающий модулирование процессинга рилина tPA. Способность tPA оказывать влияние на метаболизм рилина в первичных кортикальных нейронах определяли путем инкубации клеток в свежесобранном супернатанте в течение 24 часов с 70 нмоль/л tPA. Экстракты белка супернатанта подвергали анализу методом Вестерн-блоттинга и определяли с помощью G10.

На фиг. 36(A) представлена иллюстрация трехэпитопного картирования. Рилин состоит из Nконцевого участка, за которым следуют электростатический домен CR-50 (светло-серый), Fспондиновый домен (H) и 8 последовательных ЭФР-подобных повторов. Показаны различные антитела, показывающие эпитопный участок структуры рилина для соответствующего антитела.

На фиг. 36(A) представлена иллюстрация трехэпитопного картирования. Антитела, по отдельности распознающие участки рилина N-R2, R3-R6 и R7-R8, можно использовать, чтобы определить распреде- 13 045597 ление полноразмерного рилина и его основных фрагментов.

На фиг. 37 представлен график, показывающий действие RAP на экспрессию рилина и ApoER2.

Сниженная экспрессия ApoER2 связана с применением GST-RAP (рецептор-ассоциированный белок, который связывается со всеми липопротеиновыми рецепторами) в гиппокампе, префронтальной коре и теменной коре головного мозга.

На фиг. 38(A) представлен блот, показывающий, что нанесение hR3-6 приводит к повышению экспрессии ApoEr2 в культурах первичных нейронов. Нейроны (E17, DIV8) обрабатывали hR3-6 в течение 1 ч и гибридизовали с антителом 3326, которое распознает ApoEr2. N=3-4.

На фиг. 38(A) представлен график, показывающий, что нанесение hR3-6 приводит к повышению экспрессии ApoEr2 в культурах первичных нейронов. Концентрации ApoEr2 нормализовали по актину и определяли количественно методом Вестерн-блоттинга.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

При использовании в настоящем документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явным образом не требует иного. Так, например, ссылка на полипептид включает смесь двух или более полипептидов и т. п.

При использовании в настоящем документе около означает приблизительно или почти, и в контексте указанного числового значения или диапазона означает ±15% числа.

При использовании в настоящем документе введение или вводимый используют для описания процесса, в котором пациенту доставляют соединения по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другими соединениями. Композицию можно вводить различными путями, включая среди прочего пероральный, парентеральный (относящийся к внутривенному и внутриартериальному и другим приемлемым парентеральным путям), подоболочечный, внутримышечный, подкожный, толстокишечный, ректальный и интраназальный. Каждое из этих состояний можно успешно лечить с использованием других путей введения соединений по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния. Дозирование соединений и композиций по настоящему изобретению для получения терапевтического или профилактического эффекта определяется в зависимости от обстоятельств пациента, как известно в данной области техники. В настоящем документе дозирование пациента можно осуществлять посредством индивидуальных или унифицированных доз соединений или композиций настоящего документа или посредством комбинированной, или предварительно упакованной, или предварительно включенной в лекарственную форму дозы соединений или композиций. У средней мыши с массой тела 40 г масса головного мозга составляет 0,416 г, а у мыши с массой тела 160 г масса головного мозга составляет 1,02 г, и у мыши с массой тела 250 г масса головного мозга составляет 1,802 г. Средняя масса головного мозга человека составляет 1508 г, что можно использовать для определения количества терапевтического средства, необходимого или полезного для осуществления лечения, описанного в настоящем документе.

Фармацевтические композиции объекта изобретения можно включать в лекарственные формы в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически полезных композиций. Кроме того, используемое в настоящем документе выражение фармацевтически приемлемый носитель означает любой из стандартных фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемый носитель может включать разбавители, адъюванты и инертные вещества, а также носители имплантатов и инертные нетоксичные твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующий материал, который не взаимодействует с активными ингредиентами по изобретению. Примеры включают, но не ограничены ими, фосфатно-солевой буферный раствор, физиологический раствор, воду и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п.), их подходящие смеси и растительные масла. Лекарственные формы описаны в ряде источников, хорошо известных и легко доступных специалистам в данной области техники. Например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19^th ed.) описаны лекарственные формы, которые можно применять в связи с объектом изобретения.

Используемый в настоящем документе термин животное означает многоклеточный эукариотический организм, определяемый классификацией в царство Animalia или Metazoa. Этот термин включает, но не ограничен ими, млекопитающих. Не имеющие ограничительного характера примеры включают грызунов, водных млекопитающих, домашних животных, таких как собаки и кошки, сельскохозяйственные животные, такие как овцы, свиньи, коровы и лошади, и человека. При использовании терминов животное или млекопитающее или их множественного числа их также считают применимыми к любым животным.

Используемое в настоящем документе выражение консервативная замена относится к замене аминокислот другими аминокислотами, обладающими сходными свойствами (например, кислыми, основными, положительно или отрицательно заряженными, полярными или неполярными). В следующей табл. 1 содержатся аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга.

В табл. 1 показаны аминокислоты в соответствии с категориями по функциональным группам, указывающим на консервативные замены. Избыточный триплетный код, кодирующий каждую аминокислоту, приведен для ссылки.

- 14 045597

Таблица 1

Категория	3-буквенная аминокислота	1-буквенная аминокислота		Категория	3-буквенная аминокислота	1-буквенная аминокислота
Неполярные, алифатические	Gly	G	Полярные, незаряженны e	Ser	S
Ala	A	Thr	T
Val	V	Cys	c
Leu	L	Pro	P
Met	M	Asn	N
	iLe	I			Gln	Q
Ароматические	Phe	F	Положительн о заряженные	Lys	К
Tyr	Y	His	H
T rp	w	Arg	R
Отрицательно заряженные	Asp	D
Glu	E

При использовании в настоящем документе консервативная мутация относится к замене нуклеотида на другой нуклеотид, которая не приводит к изменению кодирования аминокислоты, т.е. к изменению избыточной последовательности в вырожденных кодонах, или к замене, приводящей в результате к консервативной замене. Пример избыточности кодонов приведен в табл. 2.

В табл. 2 показан избыточный триплетный код и соответствующие кодируемые аминокислоты.

Таблица 2

	U	C	A	G
U	UUU	Phe	ucu	Ser	UAU	Tyr	UGU	Cys
	UUC	Phe	ucc	Ser	UAC	Tyr	UGC	Cys
	UUA	Leu	UCA	Ser	UAA	END	UGA	END
	UUG	Leu	UCG	Ser	UAG	END	UGG	Trp
C	CUU	Leu	CCU	Pro	CAU	His	CGU	Arg
	CUC	Leu	CCC	Pro	CAC	His	CGC	Arg
	CUA	Leu	CCA	Pro	CAA	Gin	CGA	Arg
	CUG	Leu	CCG	Pro	CAG	Gin	CGG	Arg
A	AUU	lie	ACU	Thr	AAU	Asn	AGU	Ser
	AUC	lie	ACC	Thr	AAC	Asn	AGC	Ser
	AUA	lie	АСА	Thr	AAA	Lys	AGA	Arg
	AUG	Met	ACG	The	AAG	Lys	AGG	Arg
G	GUU	val·	GCU	Ala	GAU	Asp	GGU	Giy
	GUC	val·	GCC	Ala	GAC	Asp	GGC	Giy
	GUA	val·	GCA	Ala	GAA	Glu	GGA	Giy
	GUG	Val·	GCG	Ala	GAG	Giu	GGG	Giy

Таким образом, консервативные мутации кодона UUA включают UUG, CUU, CUC, CUA и CUG.

Используемое в настоящем документе выражение конструкция, образованная из фрагментов рилиновых повторов относится к искусственному белку, образованному из фрагментов, полученных в результате комбинирования повторяющихся участков рилина. Как следует из описания, полноразмерный рилин состоит из участков ДНК или аминокислот (в случае белка), представляющих собой концевые повторы, таких как участки R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8, как видно из аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 3 и в параграфе [0061]. Между этими повторяющимися участками расположены петлевые участки, которые используют при состыковке двух повторяющихся участков.

При использовании в настоящем документе петлевой участок относится к сегменту нуклеиновокислотной последовательности рилина, соответствующей петлевой структуре РНК, которая расположена между двумя повторяющимися участками и соединяет два повторяющихся участка. Термин повторяющийся участок означает сегмент нуклеиново-кислотной последовательности рилина, который образует основное повторяющееся звено. Конкретные повторяющиеся участки раскрыты в тексте описания. В конкретных вариантах осуществления петлевой участок представляет собой структуру, образованную одной нитью нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарные участки, которые фланкируют конкретный однонитевой нуклеотидный участок и гибридизуются таким образом, что однонитевой нуклеотидный участок между комплементарными участками исключается из образования дуплекса или спаривания оснований по Уотсону-Крику.

Используемый в изобретении термин пациент понимают как включающий животное, в частности млекопитающее, и более конкретно человека, получающего или намеренного получать лечение.

Используемый в настоящем документе термин терапевтически эффективное количество означает количество активного соединения или фармацевтического агента, которое вызывает биологический или медицинский ответ в ткани, системе, у животного или у человека, ожидаемый исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом. В отношении нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов эффективное количество содержит количество, достаточное для предотвращения дальнейшей дегенерации или повреждения нейронов, уменьшения симптомов нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов или увеличения плотности дендритов. В некоторых вариантах осуществления эф- 15 045597 фективное количество представляет собой количество, достаточное для задержки развития нейродегенеративного заболевания. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой количество, достаточное для предотвращения или задержки возникновения и/или рецидива нейродегенеративного заболевания. Эффективное количество можно вводить в одной или более доз с интервалом в 2 или более недель в зависимости от потребности или индивидуальной скорости метаболизма рилина.

При использовании в настоящем документе коррекция относится к разрешению основного нейродегенеративного заболевания или повреждения. Например, коррекция болезни Альцгеймера относится к остановке гибели нейронов.

При использовании в настоящем документе лечение или лечащий относится к получению полезных или желательных клинических результатов. Полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены ими, любое одно или более из: смягчения одного или более симптомов, уменьшения степени нейродегенеративного заболевания или повреждения в результате поражения нейронов, стабилизации (т.е. отсутствие ухудшения течения) состояния при нейродегенеративном заболевании или поражении нервной системы, предотвращения или задержки возникновения или рецидива нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов, задержки или замедления прогрессирования заболевания и улучшения состояния при заболевании. В способах по изобретению рассматривают один или более из этих аспектов лечения.

При использовании в настоящем документе поражение нейронов означает повреждение нервной ткани, вызванное внезапной физической травмой в результате какого-либо внешнего условия или условий. Не имеющие ограничительного характера примеры таких внешних условий включают нападение или несчастный случай, перелом, удар или хирургическую процедуру.

Фармацевтически приемлемый компонент является таким, который пригоден для применения у человека и/или животных, не вызывая неоправданных нежелательных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция), соразмерных с обоснованным соотношением пользы и риска.

При использовании в настоящем документе безопасное и эффективное количество относится к количеству компонента, достаточному для получения желательного терапевтического ответа, не вызывающему неоправданных нежелательных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция), соразмерных с обоснованным соотношением пользы и риска.

Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, такой как растворитель, суспендирующий агент или инертное вещество, для доставки рассматриваемого(ых) соединения или соединений животному или человеку. Носитель может быть жидким или твердым и выбран плановым образом для предусмотренного введения. При использовании в настоящем документе фармацевтически приемлемый носитель включает все растворители, дисперсионные среды, инертные вещества, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоидные растворы и т. п. или любое из них. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. В терапевтических композициях рассматривают применение любых обычных сред или агентов за исключением случаев их несовместимости с активным ингредиентом.

Соединения по настоящему изобретению можно включать в лекарственные формы в виде композиций и вводить пациенту, такому как человек, в различных формах, приспособленных к выбранному пути введения, например пероральному или интраперитонеальному, например внутривенному, внутриартериальному или интрацеребральному пути.

Активное соединение можно также вводить интрацеребрально или интраперитонеально, например внутривенно или внутриартериально, путем инфузии или инъекции. Растворы активного соединения или его солей можно готовить в воде или в любом подходящем растворителе, возможно, смешивая с нетоксичным поверхностно-активным веществом (ПАВ). Дисперсии можно также готовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетине и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические дозированные формы, подходящие для инъекции или инфузии, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии, либо стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, которые приспособлены для приготовления стерильных инъекционных или инфузионных растворов или дисперсий непосредственно перед применением. Во всех случаях конечная дозированная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях производства и хранения. Жидкий носитель или инертное вещество может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т. п.), растительные масла, нетоксичные сложные эфиры глицерина и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсий или путем использования ПАВ. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов, например сахаров, буферов или хлорида натрия. Пролонгированной абсорбции инъекционных композиций можно добиться путем использования в композициях агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

- 16 045597

Стерильные инъекционные растворы готовят путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель, при необходимости с несколькими другими ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются технологии вакуумной сушки и сублимационной сушки, в результате которых получают порошок активного ингредиента с добавлением любого дополнительного желаемого ингредиента, представляющего собой растворы, предварительно стерилизованные фильтрованием.

Полезные твердые носители включают тонко измельченные твердые вещества, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, диоксид кремния, оксид алюминия и т. п. Полезные жидкие носители включают воду, спирты или гликоли или смеси воды и спирта/гликоля, в которых можно растворять или диспергировать настоящие соединения в эффективных концентрациях, возможно, с помощью нетоксичных ПАВ.

Полезные дозировки соединений по настоящему изобретению могут быть определены путем сравнения их активности in vitro и активности in vivo в биологических моделях. Способы экстраполяции эффективных дозировок у мышей и других животных на человека известны в данной области техники (патент США № 4,938,949 (Borch и соавт.)).

Соответственно, изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению, как описано выше, с фармацевтически приемлемым носителем или без носителя. Фармацевтические композиции, приспособленные для интравентрикулярного, интрацеребрального или парентерального введения, содержащие количество одного или более соединений, эффективное для лечения нейродегенеративного заболевания или поражения нейронов, являются предпочтительным вариантом осуществления изобретения.

Пример 1.

Рекомбинантные фрагменты рилина были образованы с использованием полноразмерной последовательности рилина человека (Идентификационный № гена: 5649, Национальный центр биотехнологической информации, США, Национальная библиотека медицины, г. Бетезда, штат Мэдисон, США; Комитет по номенклатуре генов человека, графство Кембриджшир, Великобритания, HGNC:HGNC:9957) для определения специфичных участков повторов. Фрагменты были изготовлены коммерческим путем и секвенированы после доставки перед созданием конструкции и продуцированием белка.

Полноразмерный рилин человека (SEQ ID No. 1)

CACGCGTGGGCTCGGCGGGGGCCCGCTCCCAGGCCCGCTCCCGAGCCCGTTCCGCTCCCGTCCG

CCTTCTTCTCGCCTTCTCTCCGCGTGGCTCCTCCGTCCCGGCGTCTCCAAAACTGAATGAGCGA

GCGGCGCGTAGGGCGSCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCATGGAGCGCAGTGGCTG

GGCCCGGCAGACTTTCCTCCTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTGAGGGCGCGCGCGGCGGCT

GGCTATTACCCCCGCTTTTCGCCCTTCTTTTTCCTGTGCACCCACCACGGGGAGCTGGAAGGGG

ATGGGGAGCAGGGCGAGGTGCTCATTTCCCTGCATATTGCGGGCAACCCCACCTACTACGTTCC

GGGACAAGAATACCATGTGACAATTTCAACAAGCACCTTTTTTGACGGCTTGCTGGTGACAGGA

CTATACACATCTACAAGTGTTCAGGCATCACAGAGCATTGGAGGTTCCAGTGCTTTCGGATTTG

GGATCATGTCTGACCACCAGTTTGGTAACCAGTTTATGTGCAGTGTGGTAGCCTCTCACGTGAG

TCACCTGCCCACAACCAACCTCAGTTTCATCTGGATTGCTCCACCTGCGGGCACAGGCTGTGTG

AATTTCATGGCTACAGCAACACACCGGGGCCAGGTTATTTTCAAAGATGCTTTAGCCCAGCAGT

TGTGTGAACAAGGAGCTCCAACAGATGTCACTGTGCACCCACATCTAGCTGAAATACATAGTGA

CAGCATTATCCTGAGAGATGACTTTGACTCCTACCACCAACTGCAATTAAATCCAAATATATGG

GTTGAATGTAACAACTGTGAGACTGGAGAACAGTGTGGCGCGATTATGCATGGCAATGCCGTCA

CCTTCTGTGAACCATATGGCCCACGAGAACTGATTACCACAGGCCTTAATACAACAACAGCTTC

TGTCCTCCAATTTTCCATTGGGTCAGGTTCATGTCGCTTTAGTTATTCAGACCCCAGCATCATC

GTGTTATATGCCAAGAATAACTCTGCGGACTGGATTCAGCTAGAGAAAATTAGAGCCCCTTCCA

ATGTCAGCACAATCATCCATATCCTCTACCTTCCTGAGGACGCCAAAGGGGAGAATGTCCAATT

TCAGTGGAAGCAGGAAAATCTTCGTGTAGGTGAAGTGTATGAAGCCTGCTGGGCCTTAGATAAC

ATCTTGATCATCAATTCAGCTCACAGACAAGTCGTTTTAGAAGATAGTCTCGACCCAGTGGACA

CAGGCAACTGGCTTTTCTTCCCAGGAGCTACAGTTAAGCATAGCTGTCAGTCAGATGGGAACTC

CATTTATTTCCATGGAAATGAAGGCAGCGAGTTCAATTTTGCCACCACCAGGGATGTAGATCTT

TCCACAGAAGATATTCAAGAGCAATGGTCAGAAGAATTTGAGAGCCAGCCTACAGGATGGGATG

TCTTGGGAGCTGTCATTGGTACAGAATGTGGAACGATAGAATCAGGCTTATCAATGGTCTTCCT

CAAAGATGGAGAGAGGAAATTATGCACTCCATCCATGGACACTACCGGTTATGGGAACCTGAGG

TTTTACTTTGTGATGGGAGGAATTTGTGACCCTGGAAATTCTCATGAAAATGACATAATCCTGT

- 17 045597

ATGCAAAAATTGAAGGAAGAAAAGAGCATATAACACTGGATACCCTTTCCTATTCCTCATATAA GGTTCCGTCTTTGGTTTCTGTGGTCATCAATCCTGAACTTCAGACTCCTGCTACCAAATTTTGT CTCAGGCAAAAGAACCATCAAGGACATAATAGGAATGTCTGGGCTGTAGACTTTTTCCATGTCT TGCCTGTTCTCCCTTCTACAATGTCTCACATGATACAGTTTTCCATCAATCTGGGATGTGGAAC GCATCAGCCTGGTAACAGTGTCAGCTTGGAATTTTCTACCAACCATGGGCGCTCCTGGTCCCTC CTTCACACTGAATGCTTACCTGAGATCTGTGCTGGACCCCACCTCCCCCACAGCACTGTCTACT CCTCTGAAAACTACAGTGGGTGGAACCGAATAACAATTCCCCTTCCTAACGCAGCACTAACCCG GAACACCAGGATTCGCTGGAGACAAACAGGACCAATCCTTGGAAACATGTGGGCAATTGATAAT GTTTATATTGGCCCGTCATGTCTCAAATTCTGTTCTGGCAGAGGACAGTGCACTAGACATGGTT GCAAGTGTGACCCTGGATTTTCTGGCCCAGCTTGTGAGATGGCATCCCAGACATTCCCAATGTT TATTTCTGAAAGCTTTGGCAGTTCCAGGCTCTCCTCTTACCATAACTTTTACTCTATCCGTGGT GCTGAAGTCAGCTTTGGTTGTGGTGTCTTGGCCAGTGGTAAGGCCCTGGTTTTCAACAAAGAAG GGCGGCGTCAGCTAATTACATCTTTCCTTGACAGCTCACAATCCAGGTTTCTCCAGTTCACACT GAGACTGGGGAGCAAATCTGTTCTGAGCACGTGCAGAGCCCCTGATCAGCCTGGTGAAGGAGTT TTGCTGCATTATTCTTATGATAATGGGATAACTTGGAAACTCCTGGAGCATTATTCATATCTCA GCTATCATGAGCCCAGAATAATCTCCGTAGAACTACCAGGTGATGCAAAGCAGTTTGGAATTCA GTTCAGATGGTGGCAACCGTATCATTCTTCCCAGAGAGAAGATGTATGGGCTATTGATGAGATT ATCATGACATCTGTGCTTTTCAACAGCATTAGTCTTGACTTTACCAATCTTGTGGAGGTCACTC AGTCTCTGGGATTCTACCTTGGAAATGTTCAGCCATACTGTGGCCACGACTGGACCCTTTGTTT TACAGGAGATTCTAAACTTGCCTCAAGTATGCGCTATGTGGAAACACAATCAATGCAGATAGGA GCATCCTATATGATTCAGTTCAGTTTGGTGATGGGATGTGGCCAGAAATACACCCCACACATGG ACAACCAGGTGAAGCTGGAGTACTCAACCAACCACGGCCTTACCTGGCACCTCGTCCAAGAAGA ATGCCTTCCAAGTATGCCAAGTTGTCAGGAATTTACATCAGCAAGTATTTACCATGCCAGTGAG TTTACACAGTGGAGGAGAGTCATAGTGCTTCTTCCCCAGAAAACTTGGTCCAGTGCTACCCGTT TCCGCTGGAGCCAGAGCTATTACACAGCTCAAGACGAGTGGGCTTTGGACAGCATTTACATTGG GCAGCAGTGCCCCAACATGTGCAGTGGGCATGGCTCATGCGATCATGGCATATGCAGGTGTGAC CAGGGGTACCAAGGCACTGAATGCCACCCAGAAGCTGCCCTTCCGTCCACAATTATGTCAGATT TTGAGAACCAGAATGGCTGGGAGTCTGACTGGCAAGAAGTTATTGGGGGAGAAATTGTAAAACC AGAACAAGGGTGTGGTGTCATCTCTTCTGGATCATCTCTGTACTTCAGCAAGGCTGGGAAAAGA CAGCTGGTGAGTTGGGACCTGGATACTTCTTGGGTGGACTTTGTCCAGTTCTACATCCAGATAG GCGGAGAGAGTGCTTCATGCAACAAGCCTGACAGCAGAGAGGAGGGCGTCCTCCTTCAGTACAG CAACAATGGGGGCATCCAGTGGCACCTGCTAGCAGAGATGTACTTTTCAGACTTCAGCAAACCC

- 18 045597

AGATTTGTCTATCTGGAGCTTCCAGCTGCTGCCAAGACCCCTTGCACCAGGTTCCGCTGGTGGC AGCCCGTGTTCTCAGGGGAGGACTATGACCAGTGGGCAGTCGATGACATCATCATTCTGTCCGA GAAGCAGAAGCAGATCATCCCAGTTATCAATCCAACTTTACCTCAGAACTTTTATGAGAAGCCA GCTTTTGATTACCCTATGAATCAGATGAGTGTGTGGTTGATGTTGGCTAATGAAGGAATGGTTA AAAATGAAACCTTCTGTGCTGCCACACCATCAGCAATGATATTTGGAAAATCAGATGGAGATCG ATTTGCAGTAACTCGAGATTTGACCCTGAAACCTGGATATGTGCTACAGTTCAAGCTAAACATA GGTTGTGCCAATCAATTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGATGCTGGTA TGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCGAAGGAAA CTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGACAAGAATC ACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAGGAGAGCA GCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTTGTCCCAG TTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATATACTGCT GCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTTGAGGGGA AGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAACACTTAA CGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCCTCTGGAC ACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGCATTACCT GCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATGGGATACT CTGGCATTTGCTTCGAGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG

ВВЯЯаДИДДИ1ЯИ81ИДМИ8^

- 19 045597

ATATACTTTTCATCAATGTTCCCTTGCCATACACTGCCCAAACCAATGCTACAAGATTCAGACT CTGGCAACCTTATAATAACGGTAAGAAAGAAGAAATCTGGATTGTTGATGACTTCATTATCGAT GGAAATAATGTAAACAACCCTGTGATGCTCTTGGATACATTTGATTTTGGGCCCAGAGAAGACA ATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAACATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCACC TGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTTGTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCGT GACCTAAATGTGAATGAGAACACCATCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACTGATA GCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACTGGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACCTTCT GCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGCAGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCACCCC AGCAGCACCTACTACGCAGGAACCATGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGGAAGC TGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTTCAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTCAGCC AGTGACATGGGCCATTGATAATGTCTACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGGACAG GGGAGCTGTATCAATGGAACCAAATGTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGTAAAA TAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCTCAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATAGATT CTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCATCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAACCTC TTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCATGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCTAGAT TTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGGATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAACCCGT GCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGTGGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTTCAGC ^jjj^HgAATGTGGGCAGGTACATTGCCCTGGAGATACCCTTGAAAGCCCGTTCTGGTTCTA CTCGCCTTCGCTGGTGGCAACCGTCTGAGAATGGGCACTTCTACAGCCCCTGGGTTATCGATCA GATTCTTATTGGAGGAAATATTTCTGGTAATACGGTCTTGGAAGATGATTTCACAACCCTTGAT AGTAGGAAATGGCTGCTTCACCCAGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATG CCCTGGTCTTCATTGAAAAGGCCAGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGA GG^O^C—”

GAA TTGGAA TA C TCAGTA GA TC TTGGA TTG TCA TGGCACCCA TTGGTAAGGGA C TG TC TGCC TA CCAA TG TGGAA TGCAGTCGC TA TCA TC TGCAACGGA TCCTGGTG TCA GA CA С TTTCAA CAAGTG GACTA GAA TCA CTCTGCCTC TCCCTCCTTA TACCA GG TCCCAAGCCA C TCGTTTCCGTTGGCA T CAACCAGCTCCTTTTGACAAGCAGCAGACA TGGGCAA TAGA TAATGTCTA TA TCGGGGA TGGCT GCA TAGACA TGTGCAGTGGCCA TGGGAGA TGCA TCCAGGGAAACTGCGTCTGTGA TGAACAGTG GGGTGGCCTGTACTGTGATGACCCCGAGACCTCTCTTCCAACCCAACTCAAAGACAACTTCAAT CGAGCTCCA TCCA G TCA GAA CTGGCTGAC TG TGAA CGGA GGGAAA TTGA GTACAG TGTG TGGA G

- 20 045597

CCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTCCATTTCAGTGGGGGTTGTAGTCGATTATTAGTCACTGTGGA TCTAAACCTCACTAATGCTGAGTTCA TCCAA TTTTACTTCA TGTA TGGGTGCCTGA TTACACCA AACAACCGTAACCAAGGTGTTCTCTTGGAATATTCTGTCAATGGAGGCATTACCTGGAACCTGC TCATGGAGATTTTCTATGACCAGTACAGTAAGCCCGGATTTGTGAATATCCTTCTCCCTCCTGA TGCTAAAGAGATTGCCACTCGCTTCCGCTGGTGGCAGCCAAGACATGACGGCCTGGATCAGAAC GACTGGGCCATTGACAATGTCCTCATCTCAGGCTCTGCTGACCAAAGGACCGTTATGCTGGACA CCTTCAGCAGCGCCCCAGTACCCCAGCACGAGCGCTCCCCTGCAGATGCCGGCCCTGTCGGGAG GATCGCCTTTGACATGTTTATGGAAGACAAAACTTCAGTGAATGAGCACTGGCTATTCCATGAT GATTGTACAGTAGAAAGATTCTGTGACTCCCCTGATGGTGTGATGCTCTGTGGCAGTCATGATG GACGGGAGGTGTATGCAGTGACCCATGACCTGACTCCCACTGAAGGCTGGATTATGCAATTCAA GATCTCAGTTGGATGTAAGGTGTCTGAAAAAATTGCCCAGAATCAAATTCATGTGCAGTATTCT ACTGACTTCGGTGTGAGTTGGAATTATCTGGTCCCTCAGTGCTTGCCTGCTGACCCAAAATGCT CTGGAAGTGTTTCTCAGCCATCTGTATTCTTTCCAACTAAAGGGTGGAAAAGGATCACCTACCC ACTTCCTGAAAGCTTAGTGGGAAATCCGGTAAGGTTTAGGTTCTATCAGAAGTACTCAGACATG CAGTGGGCAATCGATAATTTCTACCTGGGCCCTGGATGCTTGGACAACTGCAGGGGCCATGGAG ATTGCTTAAGGGAACAGTGCATCTGTGATCCGGGATACTCAGGGCCAAACTGCTACTTGACCCA CACTCTGAAGACTTTCCTGAAGGAACGCTTTGACAGTGAAGAAATCAAACCTGACTTATGGATG TCCTTAGAAGGTGGAAGTACTTGCACTGAGTGTGGAATTCTTGCCGAGGACACTGCACTCTATT TTGGGGGATCCACTGTGAGACAAGCGGTTACACAAGATTTGGATCTTCGAGGTGCAAAGTTCCT GCAATACTGGGGGCGCATCGGTAGTGAGAACAACATGACCTCTTGCCATCGTCCCATCTGCCGG AAGGAAGGCGTGCTGTTGGACTACTCTACCGATGGAGGAATTACCTGGACTTTGCTCCATGAGA TGGATTACCAGAAATACATTTCTGTTAGACACGACTACATACTTCTTCCTGAAGATGCCCTCAC CAACACAACTCGACTTCGCTGGTGGCAGCCTTTTGTGATCAGCAATGGAATTGTGGTCTCTGGG GTGGAGCGTGCTCAGTGGGCACTGGACAACATTTTGATTGGTGGAGCAGAAATCAATCCCAGCC AATTGGTGGACACTTTTGATGATGAAGGCACTTCCCATGAAGAAAACTGGAGTTTTTACCCTAA TGCTGTAAGGACAGCAGGATTTTGTGGCAATCCATCCTTTCACCTCTATTGGCCAAATAAAAAG AAGGACAAGACTCACAATGCTCTCTCCTCCCGAGAACTCATTATACAGCCAGGATACATGATGC AGTTTAAAATTGTGGTGGGTTGTGAAGCCACTTCTTGTGGTGACCTTCATTCCGTAATGCTGGA ATACACTAAGGATGCAAGATCGGATTCCTGGCAGCTCGTACAGACCCAGTGCCTTCCTTCCTCT TCTAACAGCATTGGCTGCTCCCCTTTCCAGTTCCATGAAGCCACCATCTACAACTCTGTCAACA GCTCAAGCTGGAAAAGAATCACCATCCAGCTGCCTGACCATGTCTCCTCTAGTGCAACACAGTT CCGCTGGATCCAGAAGGGAGAAGAAACTGAGAAGCAAAGCTGGGCAATTGACCACGTGTACATT

- 21 045597

GGAGAGGCTTGCCCCAAGCTCTGCAGCGGGCACGGATACTGCACGACCGGTGCCATCTGCATCT GCGACGAGAGCTTCCAAGGTGATGACTGCTCTGTTTTCAGTCACGACCTTCCCAGTTATATTAA AGATAATTTTGAGTCCGCAAGAGTCACCGAGGCAAACTGGGAGACCATTCAAGGTGGAGTCATA GGAAGTGGCTGTGGGCAGCTGGCCCCCTACGCCCATGGAGACTCACTGTACTTTAATGGCTGTC AGATCAGGCAAGCAGCTACCAAGCCTCTGGATCTCACTCGAGCAAGCAAAATCATGTTTGTTTT GCAAATTGGGAGCATGTCGCAGACGGACAGCTGCAACAGTGACCTGAGTGGCCCCCACGCTGTG GACAAGGCGGTGCTGCTGCAATACAGCGTCAACAACGGGATCACCTGGCATGTCATCGCCCAGC ACCAGCCAAAGGACTTCACACAAGCTCAGAGAGTGTCTTACAATGTCCCCCTGGAGGCACGGAT GAAAGGAGTCTTACTGCGCTGGTGGCAACCACGCCACAATGGAACAGGTCATGATCAATGGGCT TTGGACCATGTGGAGGTCGTCCTAGTAAGCACTCGCAAACAAAATTACATGATGAATTTTTCAC GACAACATGGGCTCAGACATTTCTACAACAGAAGACGAAGGTCACTTAGGCGATACCCATGAAG AATCAAAAAGTTTATTTTTTTTCTTCCAACATGTGATGTGTTGCTCTCCATTCTTTTAAATCTC GCACTACATCTGATATCAGGAAATATCTGTGAAGGACTTGGTGATTACCTGAAAGCCCTTCTCA AGACCGAGTGTACACCACTTTCCCACACTGTGAACTAATGACAAGTGACTTATTTGCTCATAAG TAAATGTCTTCATGTTGATGTGTCCGTGAAAGTTGTGATCTGTTGTAATATCAGTTACAGTGGC AGTATTGACAATAAGAAACAGTTTAACAGAAAAATGAAATTTAAGCACAAAAAATTTAAGAGAT TTTATGTTTAAAATGGCATTTAGCACAGTATTTAACATTCTTGGTCACAAAGCTATTTAAGTGG ACTGTATTTCAGCTATGTCTCATGTTTTATATGATTAAATTATCATTGTTTGTCCTTTATGTAT TCTCTTCTACAATACAACACATTGAAACTGTATTTACTTGTTATGTTGTAATATTTTGCTGCTG AATTTGGGGCTACTTATATTCTGCAGAAAATTAATTGAAATACCTATTCAAGAAGATAGTTGTA AAGATATTGTATCTCCTTTAATATACTCCTTAAAAATGTATGTTGGTTTAGCGTTGTTTTGTGG ataagaaaaatgcttgaccctgaaatattttctactttaaattgtggatgaagaccctatctcc CACAAATAAGTTCCCATTTCCTTGTCTAAAGATCTTTTTTTAAGTGTTCTGTGGCTGATTTACT AACAGTAACTGCCATTTTTTGTCTGTGATAACAGAGTGATTTGTAAAACAGTGGTTGTTTTTTC ATTGTGTTTTCTTCGTGGATTGTTTTTTCTGCGGGTCATATTCATACCTTCTGATGAAGTTGTA CAACACCAGCAACATTATAATGGCCCTGTAGCTCTGAATGCTATTTGTGTAACTGAAAGGTTGC ACTCTAGGGTGAACCAAGCTATAAAAGCCCATGCTTAAATAAAAATTATGTCCAAAAGCC

Карта последовательности, включающая участки рилиновых повторов и некоторые сайты расщепления ферментами, представлена на фиг. 5.

Клетки HEK293 были стабильно трансфицированы полноразмерным геном рилина в векторе pCrl с получением фрагментов для образования рекомбинантного рилина. Полноразмерный рилин встраивали в клетки HEK293, как описано ранее (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol. Chem. 2002; 277: 39944-39952; Sinagra, et al., Reelin, verylow-density lipoprotein receptor, and apolipoprotein E receptor 2 control somatic NMDA receptor composition during hippocampal maturation in vitro. J. Neurosci. 2005; 25: 6127-6136). Как только клетки достигали конфлюэнтности, их выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы и с 0,2% бычьим сывороточным альбумином в течение 2 суток, после чего среду собирали, стерильно фильтровали и концентрировали с помощью устройств для центрифужного фильтрования Centricon Plus80 (Millipore). Рилин подвергали внеклеточному расщеплению в двух сайтах, в результате чего было получено три основных фрагмента: от N-конца до повтора 2 (примерно 180 кДа), центральный фрагмент из повтора 3-6 (примерно 190 кДа) и C-концевой фрагмент, состоящий из повторов 7 и 8 (примерно 80 кДа) (Nakajima, et al., Disruption of hippocampal development in vivo by CR-50 mAb against reelin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 8196-820; de Rouvroit, et al., (1999) Reelin, the extracellular matrix protein deficient in reeler mutant mice, is processed by a metalloproteinase. Exp. Neurol. 1999; 156: 214-217; Utsunomiya-Tate, et al., Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inhibited by the functionblocking CR-50 antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97:9729-9734; Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004 (Jossin, et al., Processing of Reelin by embryonic neurons is important for function in tissue but not in dissociated cultured neurons. J. Neurosci. 2007; 27: 4243-4252; Koie, et al., Cleavage within Reelin repeat 3 regulates the duration and range of the signaling activity of Reelin protein. J. Biol. Chem. 2014; 289: 12922-12930; Krstic, et al., Regulated proteolytic processing of Reelin through interplay of tissue plasminogen activator (tPA), ADAMTS-4, ADAMTS-5 and their modulators. PLoS One. 2012; 7: e47793; Trotter, et al., Extracellular proteolysis of reelin by tissue plasminogen activator following synaptic potentiation. Neuroscience. 2014; 274: 299-307). Кроме того, получили два промежуточных фрагмента: один состоит из фрагмента от N-конца до повтора 6 (приблизительно 370 кДа), а другой состоит из повторов 6-8 (приблизи- 22 045597 тельно 270 кДа) (Jossin, et al., The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 2004; 24: 514-521).

Расщепление полноразмерного рилина проводили, как обсуждалось выше, с образованием липких концов. Для получения рекомбинантного рилина было получено два или более рилиновых фрагмента путем лигирования последовательности ДНК, представляющей собой специфичные рилиновые повторы. Полученные в результате повторяющиеся участки рилина также были секвенированы, чтобы подтвердить, что кодирующие участки сохранены, а рамка считывания находится в правильной ориентации. Рекомбинантные рилиновые белки были получены с использованием стандартных методик и амплифицированы в несущих векторах Bluescript. Рекомбинантную ДНК клонировали в экспрессионном векторе и экспрессировали в культуре клеток HEK293.

Рилиновый повтор 3 (SEQ ID No. 2)

TTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGATGCTGGTATGTCCTGGTTTCTGG

TGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCGAAGGAAACTCCAGAGAACTAAG

TGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGACAAGAATCACCATTGTTATTCCA

AGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAGGAGAGCAGCTCACAGAAAAACG

TGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTTGTCCCAGTTACTGCAGTGGCCA

TGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATATACTGCTGCACAAGGAACCTGT

GTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTTGAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGT

GGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAACACTTAACGATGGCAAATCTCT

CTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCCTCTGGACACCAGGAATATCAGA

CTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGCATTACCTGCATCAAACCAAGAA

CTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATGGGATACTCTGGCATTTGCTTCG

AGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG

Рилиновый повтор 4 (SEQ ID No. 3)

CCCTTCAGCAACTCCCACAGTGTACAGCTCCAGTATTCTCTGAACAATGGCAAGGACTGGCATC

TTGTCACCGAAGAGTGTGTTCCTCCAACCATTGGCTGTCTGCATTACACGGAAAGTTCAATTTA

CACCTCGGAAAGATTCCAGAATTGGAAGCGGATCACTGTCTACCTTCCACTCTCCACCATTTCT

CCCAGGACCCGGTTCAGATGGATTCAGGCCAACTACACTGTGGGGGCTGATTCCTGGGCGATTG

ATAATGTTGTACTGGCCTCAGGGTGCCCTTGGATGTGCTCAGGACGAGGGATTTGTGATGCTGG

ACGCTGTGTGTGTGACCGGGGCTTTGGTGGACCCTATTGTGTTCCTGTTGTTCCTCTGCCCTCG

ATTCTTAAAGACGATTTCAATGGGAATTTACATCCTGACCTTTGGCCTGAAGTGTATGGTGCAG

AGAGGGGGAATCTGAATGGTGAAACCATCAAATCTGGAACATCTCTAATTTTTAAAGGGGAAGG

ACTAAGGATGCTTATTTCAAGAGATCTAGATTGTACAAATACAATGTATGTCCAGTTTTCACTT

AGATTTATAGCAAAAAGTACCCCAGAGAGATCTCACTCTATTCTGTTACAATTCTCCATCAGTG

GAGGAATCACTTGGCACCTGATGGATGAATTTTACTTTCCTCAAACAACG

Рилиновый повтор 5 (SEQ ID No. 4)

GATAGCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACTGGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACC

TTCTGCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGCAGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCA

CCCCAGCAGCACCTACTACGCAGGAACCATGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGG

AAGCTGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTTCAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTC AGCCAGTGACATGGGCCATTGATAATGTCTACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGG

ACAGGGGAGCTGTATCAATGGAACCAAATGTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGT

AAAATAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCTCAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATA

GATTCTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCATCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAA

CCTCTTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCATGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCT

AGATTTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGGATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAAC

CCGTGCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGTGGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTT

CAGCAATTCCAGC

- 23 045597

Рилиновый повтор 6 (SEQ ID No. 5)

GTCACAGACTCTTGTTATGCGATTGAATTGGAATACTCAGTAGATCTTGGATTGTCATGGCACC CATTGGTAAGGGACTGTCTGCCTACCAATGTGGAATGCAGTCGCTATCATCTGCAACGGATCCT GGTGTCAGACACTTTCAACAAGTGGACTAGAATCACTCTGCCTCTCCCTCCTTATACCAGGTCC CAAGCCACTCGTTTCCGTTGGCATCAACCAGCTCCTTTTGACAAGCAGCAGACATGGGCAATAG ATAATGTCTATATCGGGGATGGCTGCATAGACATGTGCAGTGGCCATGGGAGATGCATCCAGGG AAACTGCGTCTGTGATGAACAGTGGGGTGGCCTGTACTGTGATGACCCCGAGACCTCTCTTCCA ACCCAACTCAAAGACAACTTCAATCGAGCTCCATCCAGTCAGAACTGGCTGACTGTGAACGGAG GGAAATTGAGTACAGTGTGTGGAGCCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTCCATTTCAGTGGGGGTTG TAGTCGATTATTAGTCACTGTGGATCTAAACCTCACTAATGCTGAGTTCATCCAATTTTACTTC ATGTATGGGTGCCTGATTACACCAAACAACCGTAACCAAGGTGTTCTCTTGGAATATTCTGTCA ATGGAGGCATTACCTGGAACCTGCTCATGGAGATTTTCTATGACCAGTACAGT

Петлевой участок рилиновых повторов 3-4 (SEQ ID No. 6)

GAACCACAGATCATTTCCATTGACCTGCCACAGGACGCGAAGACACCTGCAACGGCATTTCGAT GGTGGCAACCGCAACATGGGAAGCATTCAGCCCAGTGGGCTTTGGATGATGTTCTTATAGGAAT GAATGACAGCTCTCAAACTGGATTTCAAGACAAATTTGATGGCTCTATAGATTTGCAAGCCAAC TGGTATCGAATCCAAGGAGGTCAAGTTGATATTGACTGTCTCTCTATGGATACTGCTCTGATAT TCACTGAAAACATAGGAAAACCTCGTTATGCTGAGACCTGGGATTTTCATGTGTCAGCATCTAC CTTTTTGCAGTTTGAAATGAGCATGGGCTGTAGCAAG

Петлевой участок рилиновых повторов 4-5 (SEQ ID No. 7)

AATATACTTTTCATCAATGTTCCCTTGCCATACACTGCCCAAACCAATGCTACAAGATTCAGAC TCTGGCAACCTTATAATAACGGTAAGAAAGAAGAAATCTGGATTGTTGATGACTTCATTATCGA TGGAAATAATGTAAACAACCCTGTGATGCTCTTGGATACATTTGATTTTGGGCCCAGAGAAGAC AATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAACATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCAC CTGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTTGTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCG TGACCTAAATGTGAATGAGAACACCATCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACT

Петлевой участок рилиновых повторов 5-6 (SEQ ID No. 8)

AATGTGGGCAGGTACATTGCCCTGGAGATACCCTTGAAAGCCCGTTCTGGTTCTACTCGCCTTC GCTGGTGGCAACCGTCTGAGAATGGGCACTTCTACAGCCCCTGGGTTATCGATCAGATTCTTAT TGGAGGAAATATTTCTGGTAATACGGTCTTGGAAGATGATTTCACAACCCTTGATAGTAGGAAA TGGCTGCTTCACCCAGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATGCCCTGGTCT TCATTGAAAAGGCCAGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGAGGATTCCTT CCTACAGATAGACTTCGCTGCCTCCTGCTCA

Рекомбинантная конструкция гена рилина человека, фрагмент R3, конъюгированный с фрагментом R6, т.е. фрагмент гена рилина R3 + R6 (SEQ ID NO. 9)

AAGCTTCCACC

TTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGAT

GCTGGTATGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCG AAGGAAACTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGAC AAGAATCACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAG GAGAGCAGCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTT GTCCCAGTTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATA TACTGCTGCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTT GAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAA CACTTAACGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCC TCTGGACACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGC ATTACCTGCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATG

GAAC C ACAGAT СATTTC

- 24 045597

CATTGACC^_GCCACAGGACGCGAAGACACCTGCAACGGCATTTCGA^_GGTGGCAACCGCAAC.AT

CTGGATTTCAAGACAAATTTGATGGCTCTATAACCCTTGATAGTAGGAAATGGCTGCTTCACCC

AGGAGGCACCAAGATGCCCGTGTGTGGCTCTACTGGTGATGCCCTGGTCTTCATTGAAAAGGCC

AGCACCCGTTACGTGGTCAGCACAGACGTTGCCGTGAATGAGGATTCCTTCCTACAGATAGACT

TGGA TTGTCA TGGCACCCA TTGGTAAGGGACTGTCTGCCTACCAA TGTGGAA TGCAGTCGCTA T CA TC TGCAACGGA TCC TGGTG TCA GA CA CTTTCAA CAA GTGGAC TA GAA TCACTC TGCCTCTCC CTCCTTATACCAGGTCCCAAGCCACTCGTTTCCGTTGGCATCAACCAGCTCCTTTTGACAAGCA GCAGACA TGGGCAA TAGA TAA TGTCTA TA TCGGGGATGGCTGCATAGACA TGTGCAGTGGCCA T GGGAGATGCATCCAGGGAAACTGCGTCTGTGATGAACAGTGGGGTGGCCTGTACTGTGATGACC CCGAGACCTCTCTTCCAACCCAACTCAAAGACAACTTCAATCGAGCTCCATCCAGTCAGAACTG GCTGACTGTGAACGGAGGGAAATTGAGTACAGTGTGTGGAGCCGTGGCGTCGGGAATGGCTCTC CATTTCAGTGGGGGTTGTAGTCGATTATTAGTCACTGTGGATCTAAACCTCACTAATGCTGAGT TCATCCAATTTTACTTCATGTATGGGTGCCTGATTACACCAAACAACCGTAACCAAGGTGTTCT CTTGGAA TA TTCTGTCAA TGGAGGCA TTACCTGGAACCTGCTCATGGAGA TTTTCTATGACCAG TACAGTGATTACAAGGATGACGACGATAAGTGACTCGAG

Рекомбинантная конструкция белка рилина человека, фрагмент R3, конъюгированный с фрагментом R6, т.е. фрагмент белка рилина R3 + R6 (SEQ ID No. 10)

MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNS RELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSY CSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLND GKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFYIQIGSKTSGITCIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILW HLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQ DKFDGSITLDSRKWLLHPGGTKMPVCGSTGDALVFIEKASTRYWSTDVAVNEDSFLQIDFAAS CSVTDSCYAIELEYSVDLGLSWHPLVRDCLPTNVECSRYHLQRILVSDTFNKWTRITLPLPPYT RSQATRFRWHQPAPFDKQQTWAIDNVYIGDGCIDMCSGHGRCIQGNCVCDEQWGGLYCDDPETS LPTQLKDNFNRAPSSQNWLTVNGGKLSTVCGAVASGMALHFSGGCSRLLVTVDLNLTNAEFIQF YFMYGCLITPNNRNQGVLLEYSVNGGITWNLLMEIFYDQYS * Кодирующие участки отмечены цветом в последовательности ДНК выше, участки простым шрифтом (без модификаций шрифта, таких как подчеркивание, курсив) не транслируются в белок.

Рекомбинантная конструкция гена рилина человека, фрагмент R3 конъюгирован с фрагментом R5, т.е. фрагмент гена рилина R3 + R5 (SEQ ID No. 11)

- 25 045597

ААбСТТССАССМДИМДЭДЖмИсИ

VTTCAGCAGTACTGCTCCAGTTCTTCTTCAGTACTCTCATGAT GCTGGTATGTCCTGGTTTCTGGTGAAAGAAGGCTGTTACCCGGCTTCTGCAGGCAAAGGATGCG AAGGAAACTCCAGAGAACTAAGTGAGCCCACCATGTATCACACAGGGGACTTTGAAGAATGGAC AAGAATCACCATTGTTATTCCAAGGTCTCTTGCATCCAGCAAGACCAGATTCCGATGGATCCAG GAGAGCAGCTCACAGAAAAACGTGCCTCCATTTGGTTTAGATGGAGTGTACATATCCGAGCCTT GTCCCAGTTACTGCAGTGGCCATGGGGACTGCATTTCAGGAGTGTGTTTCTGTGACCTGGGATA TACTGCTGCACAAGGAACCTGTGTGTCAAATGTCCCCAATCACAATGAGATGTTCGATAGGTTT GAGGGGAAGCTCAGCCCTCTGTGGTACAAGATAACAGGTGCCCAGGTTGGAACTGGCTGTGGAA CACTTAACGATGGCAAATCTCTCTACTTCAATGGCCCTGGGAAAAGGGAAGCCCGGACGGTCCC TCTGGACACCAGGAATATCAGACTTGTTCAATTTTATATACAAATTGGAAGCAAAACTTCAGGC ATTACCTGCATCAAACCAAGAACTAGAAATGAAGGGCTTATTGTTCAGTATTCAAATGACAATG GGATACTCTGGCATTTGCTTCGAGAGTTGGACTTCATGTCCTTCCTG .... .

GACAATTGGTTTTTCTATCCTGGTGGTAA

CATCGGTCTTTATTGTCCATATTCTTCAAAGGGGGCACCTGAAGAAGATTCAGCTATGGTGTTT GTTTCAAATGAAGTTGGTGAGCATTCCATTACCACCCGTGACCTAAATGTGAATGAGAACACCA TCATACAATTTGAGATCAACGTTGGCTGTTCGACTGATAGCTCATCCGCGGATCCAGTGAGACT GGAATTTTCAAGGGACTTCGGGGCGACCTGGCACCTTCTGCTGCCCCTCTGCTACCACAGCAGC AGCCACGTCAGCTCTTTATGCTCCACCGAGCACCACCCCAGCAGCACCTACTACGCAGGAACCA TGCAGGGCTGGAGGAGGGAGGTCGTGCACTTTGGGAAGCTGCACCTTTGTGGATCTGTCCGTTT CAGATGGTACCAGGGATTTTACCCTGCCGGCTCTCAGCCAGTGACATGGGCCATTGATAATGTC TACATCGGTCCCCAGTGTGAGGAGATGTGTAATGGACAGGGGAGCTGTATCAATGGAACCAAAT GTATATGTGACCCTGGCTACTCAGGTCCAACCTGTAAAATAAGCACCAAAAATCCTGATTTTCT CAAAGATGATTTCGAAGGTCAGCTAGAATCTGATAGATTCTTATTAATGAGTGGTGGGAAACCA TCTCGAAAGTGTGGAATCCTTTCTAGTGGAAACAACCTCTTTTTCAATGAAGATGGCTTGCGCA TGTTGATGACACGAGACCTGGATTTATCACATGCTAGATTTGTGCAGTTCTTCATGAGACTGGG ATGTGGTAAAGGCGTTCCTGACCCCAGGAGTCAACCCGTGCTCCTACAGTATTCTCTCAACGGT GGCCTCTCGTGGAGTCTTCTTCAGGAGTTCCTTTTCAGCAATTCCAGCGATTACAAGGATGACG ACGATAAGTGACTCGAG

Рекомбинантная конструкция белка рилина человека, фрагмент R3, конъюгированный с фрагментом R5, т.е. фрагмент белка рилина R3 + R5 (SEQ ID No. 12) MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNS RELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSY CSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLND GKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFYIQIGSKTSGITCIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILW HLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQ DKFDGSIDDNWFFYPGGNIGLYCPYSSKGAPEEDSAMVFVSNEVGEHSITTRDLNVNENTIIQF EINVGCSTDSSSADPVRLEFSRDFGATWHLLLPLCYHSSSHVSSLCSTEHHPSSTYYAGTMQGW RREWHFGKLHLCGSVRFRWYQGFYPAGSQPVTWAIDNVYIGPQCEEMCNGQGSCINGTKCICD PGYSGPTCKISTKNPDFLKDDFEGQLESDRFLLMSGGKPSRKCGILSSGNNLFFNEDGLRMLMT RDLDLSHARFVQFFMRLGCGKGVPDPRSQPVLLQYSLNGGLSWSLLQEFLFSNSS * Кодирующие участки отмечены цветом в последовательности ДНК выше, участки простым шрифтом (без модификаций шрифта, таких как подчеркивание, курсив) не транслируются в белок.

Пример 2.

Повторяющиеся участки выделяли из рилина, как показано в примере 1. Участок R3 вырезали с получением липких концов ДНК. Ген рилина инкубировали с ферментами EcoRI и BatXI, и в результате получили эксцизию сегмента около 6300 п. о. Впоследствии вырезанный фрагмент R3 был вставлен в вирусный вектор AAV-9 или AAV-5. Вирусный вектор расщепляли за промотором CMV, если вектор обладал промотором CMV, например pMDLg/pPRE или pAD3000. Однако, где промотор CMV не был расположен в векторе на момент трансфекции, таком как pAdEasy-1, этот промотор присоединяли вместе с фрагментом рилина. Конструкция, содержащая фрагмент рилина и промотор CMV, образована с ком- 26 045597 плементарными концами EcoRI и BatXI. Конструкцию инкубировали с вектором в ферменте, таком как лигаза, с образованием нового вектора, содержащего фрагмент рилина и промотор CMV. Вектор вводили в клетки с получением вирусов, содержащих фрагменты рилина.

Хотя в обсуждаемом выше примере приведен рилин R3, этот способ был использован для получения других вариантов рилина, включающих фрагмент R3-5, фрагмент R3+5 и фрагмент R3+6, описанные в примере 1.

Пример 3.

Фрагменты рилина были образованы, как описано в примере 1. Различные варианты рилина, включающие фрагмент R3-R6, R3+R5 и R3+R6, были исследованы с использованием ApoER2 в качестве генарепортера в количественном определении люциферазы. Однако другие альтернативные варианты сплайсинга, такие как R2 (NR2), R6 (NR6), R3-C и R7-C, также считают полезными аспектами изобретения.

Количественные определения люциферазы проводили, чтобы определить кластеризацию рецептора ApoER2 на основании увеличения испускания света при кластеризации рецептора, как показано на фиг. 6. Субстрат люциферазы растворяли в буфере для люциферазы (1:1), и N-концевую люциферазу конъюгировали с первой серией рецепторных белков ApoER2, а C-концевую люциферазу конъюгировали со второй серией рецепторных белков ApoER2. В каждый аналитический планшет вносили конъюгированный с люциферазой ApoER2, в соотношениях 1:1 (т.е. 50 мкл C-концевой люциферазы на 50 мкл Nконцевой люциферазы). Различные варианты рилина человека, показанные на фиг. 3, 7-9, были исследованы с использованием ApoER2 в качестве гена-репортера. После добавления 5 нмоль/л исследуемого рилина смесь перемешивали в течение 10 мин и определяли излучение света.

Все фрагменты рилина мыши за исключением R5-6 приводили в результате к 2-кратному - 4кратному увеличению испускания света, как показано на фиг. 10. Максимальное усиление светового сигнала при использовании фрагментов рилина человека было 2,5-3-кратным, как показано на фиг. 11. Кроме того, активность большинства фрагментов рилина человека была сопоставимой с наиболее эффективным рилином, показанным на фиг. 10, поскольку для фрагментов R3-5 рилина человека, R3-4 рилина человека и R3+R6 рилина человека была выявлена приблизительно одинаковая или повышенная активность люциферазы по сравнению с фрагментом R3-6. Фрагмент R3+R5 рилина человека характеризовался приблизительно 50%-ной активностью по сравнению с R3-6 или сопоставимой с R3+R6, R3+R5 и R4+R6, как показано на фиг. 10. Как показано на фиг. 12, фрагменты как мыши, так и человека обладали эффективностью при индукции кластеризации рецептора, о чем свидетельствует усиление активации сигнала люциферазы.

Пример 4.

Анализ влияния активации клеточного сигнала и процессинга рилина проводили путем тестирования активации рецептора ApoER. В недавней работе подчеркнута важная роль активации передачи сигнала рилина в нормальном обучении и памяти (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277: 39944-39952), а также в патологических случаях, где эта активация передачи сигнала нарушена. Например, липопротеиновые рецепторы играют роль в когнитивных процессах, и предполагают участие этого семейства рецепторов в патологических процессах, лежащих в основе прогрессирования болезни Альцгеймера (БА). Два основных лиганда этих рецепторов, apoE и рилин, по-видимому, обладают сигнальной способностью, которая может значимо влиять на синаптическую функцию. APC в настоящее время является модулятором-кандидатом активации передачи сигнала рилина, поскольку, по-видимому, обладает структурными группировками, которые связываются с ApoER2 и активируют нисходящие эффекторы. Исследование модулирования активации передачи сигнала рилина под действием APC имеет колоссальное научное и клиническое значения, поскольку может предоставить новые пути терапии.

Был проведен анализ влияния рилина на активацию и пути передачи сигнала рецептора ApoER. Культуру первичных нейронов получали из 17-дневных эмбрионов мышей и выращивали в бессывороточной питательной среде Neurobasal (Gibco BRL) с добавлением B27 (Gibco BRL) и l-глутамина при 37°С в 5% CO₂. Клетки оставляли для созревания в культуре на 8 дней. Культуры клеток обрабатывали 200 мкмоль/л очищенного фрагмента рилина, представляющего собой повторы 3-6 (R3-6). В определенные моменты времени (0, 10, 30, 60, 120 или 240 минут) после обработки рилином клетки подвергали лизису. Общую экспрессию ApoER2, AKT, фосфорилирование AKT, фосфорилирование внеклеточно регулируемой киназы (ERK) и общее содержание внеклеточно регулируемой киназы (ERK) определяли методом Вестерн-блоттинга и стандартизовали по необработанному образцу (момент времени 0). Состояние фосфорилирования ERK представляет собой прямое обнаружение активности ERK и представляет активацию восходящего сигнального пути.

На репрезентативном Вестерн-блоте, показанном на фиг. 13(A), видна относительно стабильная экспрессия ApoER2. При нормализации по актину было обнаружено снижение экспрессии ApoER2 в течение первых 30 минут после воздействия рилина, после чего уровни экспрессии стабилизировались, как видно на фиг. 13(B). Концентрации AKT снижались в течение 60 минут после воздействия рилина, при этом концентрации фосфорилированной AKT возрастали, как видно на фиг. 13(A). Нормализация AKT и pAKT по актину отражала тенденции, наблюдаемые на блоттинге, при этом концентрации AKT снижа- 27 045597 лись в течение 60 минут после воздействия рилина, после чего снова возрастали до уровней до воздействия, как видно на фиг. 13(D). В течение 60 минут после воздействия концентрация фосфорилированной AKT резко возрастала, затем быстро снижалась до уровней до воздействия, как видно на фиг. 13(C). Общее количество ERK, по-видимому, оставалось постоянным на протяжении всего эксперимента, при этом фосфорилированная ERK 1 и 2 была видна через 10 минут и через 240 минут после воздействия рилина, как видно на фиг. 13(A). Тенденции при нормализации ERK и pERK1/2 по актину тенденции, наблюдаемые на блоттинге, совпадали, что свидетельствует о сильном фосфорилировании через 10 минут после воздействия рилина с незначительным вторичном увеличении через 240 минут после воздействия рилина, как видно на фиг. 13(E) и (F). Пиковое отношение количества pERK к общему количеству ERK было обнаружено через 10 минут после воздействия рилина, а затем медленно снижалось на протяжении 120 минут после воздействия рилина и впоследствии незначительно увеличивалось, как видно на фиг. 13(G).

Чтобы подтвердить, что эти результаты не были специфичными для фрагмента рилина (R-3-6), эксперимент с культурой первичных нейронов повторяли с другими фрагментами рилина, как видно на фиг. 14(A). Культуры первичных нейронов обрабатывали 200 мкмоль/л очищенных фрагментов рилина, в которых представлены рилиновые повторы R3 и R5 (hR3+6) последовательности рилина человека, повторы R3 и R6 (hR3-6) человека, повторы R3-6 (R3-6) рилина мыши, последовательность от N-концевого участка до R2 включительно (NR2) рилина мыши и полноразмерный рилин, состоящий из полноразмерной последовательности и всех встречающихся в природе фрагментов (FR). Контроль (ctrl) состоял из необработанных клеток. Рилин инкубировали на клетках в течение 60 минут. Клетки подвергали лизису и ставили Вестерн-блоттинги, как описано выше, для определения общего содержания ERK и содержания фосфорилированной ERK.

На репрезентативном Вестерн-блоте, показанном на фиг. 14(A) показано, что обработка рилином не приводила к отчетливому влиянию на общее содержание ERK. Действительно, нормализация результатов по актину показала, что как рекомбинантные фрагменты рилина человека (hR3+5 и hR3+6), так и полноразмерный рилин приводили к незначительному снижению общего содержания ERK, как видно на фиг. 14(C), при этом фрагмент рилина мыши (R3-6 и NR2) приводили к незначительному увеличению содержания ERK. Однако обработка как рекомбинантными фрагментами рилина человека (hR3+5 и hR3+6), так и полноразмерным рилином вызывала значительное увеличение содержания фосфорилированной ERK1/2, как видно на фиг. 14(B). Фрагмент рилина мыши, образованный из повторов 3-6 (R3-6), показал незначительное увеличение количества фосфорилированной ERK, которое перекрывалось с контролем. Напротив, N-концевой фрагмент (NR2) рилина мыши приводил к уменьшению содержания фосфорилированной ERK. Сравнение содержания фосфорилированной ERK и общего содержания ERK показало, что под действием фрагмента R3-6 мыши фосфорилирование было предварительно эквивалентным общему содержанию ERK (1,15 для R3-6), что согласуется с результатами, показанными на фиг. 13(G). Контрольные культуры с ложной обработкой характеризовались отношением 1,09. N-Концевой фрагмент мыши не запускал фосфорилирование ERK, поскольку ее концентрации составляли около 50% от контрольных (0,53). Фрагменты рилина чеовека (R3+5 и R3+6) подобно полноразмерному рилину (2,5) приводили к фосфорилированию ERK (2,22 и 2 соответственно). Эти результаты показывают, что фрагменты рилина человека оказывают более сильное влияние на активацию передачи сигнала ApoER2, чем фрагменты рилина мыши, и, вероятно, они будут обладать большей действенностью при лечении.

Пример 5.

Анализ влияния рилина на метаболические пути клетки проводили путем тестирования белковмодификаторов рилинового пути. Изменения фрагмента комплемента рилина, по-видимому, коррелируют с изменениями активации нисходящей передачи сигнала рилина, на что указывает фосфорилирование основного компонента нисходящего пути Dab-1.

Анализ фосфорилирования DAB-1 проводили с использованием гена-репортера DAB-1, конъюгированного с ЛПОНПР и ApoEr. Культуру первичных нейронов получали из 17-девных эмбрионов мыши, как обсуждалось выше. Клетки оставляли для созревания в культуре на 8 дней. В лунки планшетов (96луночных, 24 луночных) наносили в виде покрытия раствора 0,1 мг/мл (0,01%) поли-Ь-лизина (разведенного из 1 мг/мл), добавляя в каждую лунку 50 мкл или 100 мкл поли-Ь-лизина. Лунку или лунки инкубировали при 37°С в течение как минимум 1 часа, и раствор удаляли отсасыванием в вакууме или иным путем. Лунки промывали 150 мкл воды. Клетки суспендировали в соотношении 1:10 в питательной среде с высоким содержанием глюкозы и добавляли в лунки планшетов до 80-90% конфлюэнтности (в течение 20-24 часов).

Среду Opti M (без сыворотки, т.е. неполную) и полную питательную среду с высоким содержанием глюкозы нагревали до 37°С. В каждую из двух пробирок типа Эппендорф добавляли среду Opti-M (500 мкл). В первую из двух пробирок типа Эппендорф добавляли ДНК (20 мкл), а во вторую пробирку типа Эппендорф добавляли липфектамин (20 мкл). Содержимое каждой пробирки перемешивали, и два раствора инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. ДНК двух слитых белков ApoER2 и липофектамин смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Смесь для трансфекции добавляли в количестве 10 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащую клет

- 28 045597 ки, и смесь инкубировали.

Спустя 48 часов измеряли активность люциферазы. Фрагмент рилина R3-6 кипятили при 100°С в течение 10 минут и использовали в качестве контроля. Субстрат люциферазы растворяли в буфере для люциферазы (1:1) и добавляли люциферазу в каждый трансфицированный планшет в соотношении 1:1 (т.е. 50 мкл люциферазы на 50 мкл раствора для трансфекции). Смесь перемешивали в течение 10 мин и определяли излучение света.

При связывании с рилином воздействие полноразмерного рилина приводило к воспроизводимому влиянию на Dab-1, вызывая незначительные изменения в состоянии фосфорилирования, как видно на фиг. 15 и 16. Напротив, при приведении в контакт срезов гиппокампа с фрагментом R3-6 показано зависимое от времени влияния на фосфорилирование Dab-1, как видно на фиг. 17 и 18. В обработанных APC моноцитах показано повышенное содержание активного Dab1 (Tyr220-p), Akt Ser473-p и GSK3e Ser9-p. Было обнаружено, что предварительная обработка RAP или нокдаун по гену ApoER2 ослабляет это влияние, при этом ингибиторы EPCR и PAR1 не оказывают никакого влияния. Интересно, что было обнаружено связывание APC с ApoER2 с аффинностью 30 нмоль/л, но не обнаружено связывание с ЛПОНПР. Что касается влияния APC на активацию передачи сигнала ApoER2, было обнаружено, что рецепторассоциированный белок (RAP) блокирует опосредованное APC ингибирование вызванную эндотоксином прокоагулянтную активность тканевого фактора клеток U937.

Недавно было обнаружено, что молекулы рилина образуют комплексы высокого порядка in vitro и in vivo, такие как Fc-рецептор-ассоциированный белок (RAP; от англ. receptor-associated protein). Это наблюдение было дополнительно уточнено путем демонстрации, что рилин секретируется in vivo в виде гомодимера, связанного дисульфидными связями. Делеция короткого участка, называемого эпитопом CR-50, локализованная на N-конце молекулы, препятствует олигомеризации. Этот мутированный рилин неспособен эффективно индуцировать фосфорилирование Dab1 в первичных нейронах мыши. Аналогично, антитело к эпитопу CR-50 антагонизирует функцию рилина in vitro и in vivo.

RAP представляет собой внутриклеточный белок, который может связываться с очень высокой аффинностью с семейством липопротеиновых рецепторов. Слитый белок Fc-RAP представляет собой сконструированный белок, состоящий из двух молекул RAP, соединенных с образованием гантелевидной формы с помощью Fc участка антитела. Вместо связывания ApoER2 и ЛПОНП и их ингибирования FcRAP может вызывать кластеризацию рецептора и активацию ApoER2. Добавление Fc-RAP оказывало такое же действие, как и нанесение рилина, за счет усиления индукции ДВПСП, как видно на фиг. 19. Основное отличие состоит в том, что Fc-RAP, вероятно, связывается со всеми липопротеиновыми рецепторами, а не только с кластерами ApoER2 и ЛПОНП.

Кластеризация ApoER2 и/или ЛПОНП вызывает фосфорилирование Dab1 и нисходящие события, включая активацию SFK и модурирование PKB/ Akt. Кроме того, модулирование долговременной потенциации синаптической передачи (ДВПСП), являющееся одним из биологических эффектов рилина, также имитируется рилин-независимой кластеризацией рецептора. Эти результаты надежно подтверждают, что индуцированная рецептором димеризация или олигомеризация достаточна для фосфорилирования тирозина Dab1 и событий нисходящей передаче сигнала без необходимости в дополнительном сорецепторе, обеспечивающем активность тирозинкиназы. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, это позволяет предположить, что терапевтический потенциал фрагментов рилина осуществляется посредством димеризации соответствующих рецепторов и активации нисходящей передачи сигнала.

Пример 6.

Рилин обладает способностью к потенцированию глутаминергических рецепторов области CA1. В культивируемых нейронах гиппокампа активация передачи сигнала рилина требуется для нормального развития дендритных структур. В отсутствии рилина или внутриклеточного адаптерного белка Dab1 рост дендритов из нейронов останавливался, и сокращалось количестве дендритных ветвей - аналогичный фенотип наблюдали в нейронах, в которых отсутствовали рецепторы рилина apoER2 и ЛПОНПР (Niu, et al., Reelin promotes hippocampal dendrite development through the VLDLR/ApoER2-Dab1 pathway. Neuron. 2004; 41: 71-84). У мышей линии HRM проявляется недостаточность зависимого от гиппокампа, обусловленного научением ситуативного страха, и синаптической пластичности в области CA1 гиппокампа. Считают, что эти поведенческие и физиологические фенотипы HRM отчасти связаны со снижением или ингибированием способности к образованию синаптических связей. Это подтверждается наблюдением, что у мышей HRM уменьшается плотность дендритных шипиков.

Смешанные культуры нейронов гиппокампа и коры головного мозга получали из эмбрионов мыши в дни 18-19 эмбрионального развития (E). Клетки высевали с высокой плотностью (~750 клеток в мм^-2) и выращивали в питательной среде Neurobasal (Gibco BRL) с добавлением B27 (Gibco BRL). Клетки пересевали при 80% конфлюэнтности.

ApoER2 присутствует в постсинапсах и образует функциональный комплекс с НМДАР в области CA1. Образование mEPSC-НМДА проиллюстрировано на фиг. 20(A)-(B) и 21(A)-(D). В ложнообработанных клетках постсинаптический ток возбуждения был незначительным в связи с тем, что рецепторы НМДА (mEPSC_NMDA) не претерпевали статистически значимых изменений по сравнению с моментом времени, предшествующем ложной обработке (p>0,05). Было обнаружено, что воздействие рилина при

- 29 045597 водит к статистически значимому увеличению амплитуды mEPSC_НМд_А (p<0,001).

Чтобы дополнительно подтвердить, что синаптический ответ НМДАР увеличивается в результате постсинаптических действий рилина, проводили анализ коэффициента вариации (CV) вызванного НМДАР синаптического цельноклеточного тока. При нанесении на график отношений 1/CV2 против средних арифметических значений коэффициентов EPSC_НМд_А до и после 30-минутного нанесения рилина в девяти экспериментах, корреляция не наблюдалась, см. фиг. 21(C) и (D). Однако отношения 1/CV2 остаются относительно неизменными при варьирующих коэффициентах EPSC_НМд_А, что подтверждает активацию рилина в CA1 посредством постсинаптического механизма, усиливающую активность НМДАР.

При постоянном воздействии рилина может возрастать компонент синаптического ответа АМПК, что изменяет кинетику EPSC_НМд_А и чувствительность к ифенпродилу. Было исследовано влияние рилина в CA1 на уровни экспрессии субъединиц АМПКР и НМДАР. Как общие, так и поверхностные рецепторы GluR1, NR1, NR2A и NR2B наносили на Вестерн-блоттинг и подвергали гибридизации. Был проведен анализ субъединицы АМПКР GluR1 на поверхности клеток области CA1, экспрессия которой возрастает при созревании в процессе развития, а ее миграция подлежит регулированию в процессе синаптической пластичности.

На фиг. 22(A)-(C) показано, что воздействие рилина приводит к статистически значимому повышению поверхностного содержания GluR1 по сравнению с ложнообработанными группами, что указывает на регулируемую экспрессию и ее поверхностную инсерцию посредством увеличения mEPSC_АМПК и соотношения тока АМПК/НМДА после постоянного воздействия рилина. Изменений поверхностного или общего содержания NR1 не наблюдали. Напротив, уровни общей и поверхностной экспрессии NR2A статистически значимо возрастали под действием рилина по сравнению с ложной обработкой. Кроме того, концентрации как общего, так и поверхностного белка NR2B после обработки рилином статистически значимо снижались. Ложная обработка не оказывала влияния на содержание различных субъединиц рецепторов глутамата по сравнению с необработанными контрольными группами.

Был проведен анализ действий рилина на дендриты гиппокампа. Культуру клеток гиппокампа получали из 6-7-дневных эмбрионов мышей дикого типа, линии HRM и мышей с дефицитом рилина и подвергали воздействию 5 нмоль/л рилина в течение 21 дня. Обработка органотипических культур заключалась в многократном нанесении на клетки 5 нмоль/л рилина или питательной среды нетрансфицированных клеток HEK один раз в 3 дня в течение 21 дня. Клетки культивировали, как описано выше, и вводили в нейрональные клетки флуоресцентный краситель путем применения тока к цельным клеткам с помощью пэтч-пипеток, и после фиксации клетки визуализировали под конфокальным микроскопом.

Дендритные шипики представляют собой небольшие отростки, которые покрывают поверхность дендритов и несут постсинаптические структуры, которые формируют синапсы возбуждения. Аномальную форму или уменьшение количества дендритных шипиков наблюдают при ряде когнитивных заболеваний. На основании уменьшения количества дендритных шипиков можно предположить, что дли развития дендритных структур, которые принципиально важны для интенсивной обработки информации нейронами, требуется конститутивный уровень активации передачи сигнала, опосредованной рилином/рецепторами липопротеинов. Это мнение согласуется с исследованиями, в которых показано, что мыши, гетерозиготные по мутации reeler (HRM), характеризуются сниженной плотностью дендритных шипиков и нарушением выполнения некоторых поведенческих функций научения и памяти.

Фенотип, характеризующийся статистически значимо уменьшенным количеством дендритных шипиков, мог быть скорректирован в результате добавления экзогенного рекомбинантного рилина в культуру клеток. В обработанных рилином клетках HRM показано увеличение плотности дендритных шипиков через 21 день по сравнению с совпадающими по возрасту нейронами культуры дикого типа, как видно на фиг. 23(B). Напротив, при ложной обработке (кондиционированная питательная среда от нестабильно трансфицированных клеток) изменения плотности шипиков не выявлено, как видно на фиг. 23(C). В таком же эксперименте с нокаут-мышами по гену рилина показано, что в результате нанесения рилина плотность дендритных шипиков также восстанавливалась по сравнению с ложнообработанными контролями, как видно на фиг. 23(C) и 23(F). Морфология дендритных шипиков в обоих видах клеток в результате воздействия рилина напоминала морфологию, наблюдаемую в клетках ДТ, как видно на фиг. 23(D), a при количественном определении было выявлено статистически значимое увеличение количества дендритных шипиков в культурах HRM, обработанных рилином, по сравнению с ложнообработанными контролями и сопоставимая плотность дендритных шипиков с уровнями, наблюдаемыми в культурах дикого типа, как видно на фиг. 24(A).

Чтобы удостовериться, что данный протокол нанесения рилина представляет собой хроническое воздействие рилина, и деградация или активное удаление рилина из питательной среды не происходит, авторы изобретения отбирали 15 мкл питательной среды из планшетов с культурами в моменты времени 0, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после нанесения рилина. Анализ этих аликвот методом Вестерн-блоттинга показал отсутствие деградации или уменьшения количества рилина, как видно на фиг. 25. Поэтому увеличение плотности дендритных шипиков связано с присутствием рилина в физиологически значимых количествах в течение всего 21-дневного периода его нанесения.

Пример 7.

- 30 045597

Липопротеиновые рецепторы играют роль в когнитивных процессах, и предполагают участие этого семейства рецепторов в патологических процессах. Два основных лиганда этих рецепторов, apoE и рилин, по-видимому, обладают сигнальной способностью, которая может значимо влиять на синаптическую функцию. У гетерозигот по рилину показана недостаточность как синаптической пластичности, так и когнитивной функции. Снижение экспрессии рилина приблизительно на 50% приводит к недостаточности как синаптической пластичности, так и когнитивной функции (Qiu, et al., Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem. 2006; 85:228242). В недавней работе подчеркнута важная роль активации передачи сигнала рилина в нормальном обучении и памяти (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277: 39944-39952), а также в патологических случаях, где эта активация передачи сигнала нарушена. APC в настоящее время является модулятором-кандидатом активации передачи сигнала рилина, поскольку, по-видимому, обладает структурными группировками, которые связываются с ApoER2 и активируют нисходящие эффекторы.

Чтобы подтвердить влияние рилина на научение и память, мышам с двух сторон вводили антагонист липопротеина RAP (рецептор-ассоциированный белок), который эффективно блокирует связывание рилина с его рецепторами.

Мышей линии C57Bl/6 десятинедельного возраста (n=55, самцы) содержали в обычных условиях (20°С, относительная влажность 50% и 12-часовой цикл света/темноты) и обеспечивали доступ к воде и корму без ограничений. После нормализации в условиях окружающей среды мышей делили на группы получавших холостой препарат (без инъекции) без электроболевого раздражителя, получавших инъекцию RAP с электроболевым раздражителем, получавших холостой препарат (без инъекции) с электроболевым раздражителем и получавших инъекцию рилина с электроболевым раздражителем. Введение рилина животным осуществляли путем инъекции 2 мкл полноразмерного рекомбинантного очищенного белка рилина в концентрации 5 нмоль/л. Через 3 часа после введения проводили выработку условного рефлекса ситуативного страха. Чтобы уменьшить боль и страдания животных на протяжении эксперимента, соблюдали необходимые меры предосторожности. Все исследования проводили сотрудники, не осведомленные об условиях введения веществ. На момент эксперимента масса тела мышей составляла 12-45 г.

Для выполнения двухсторонней инъекции мышам проводили анестезию изофлураном и помещали их в аппарат для стереотаксических операций (Stoelting Co.). Делали сагиттальный надрез в середине черепа, и кожу осторожно оттягивали назад, чтобы расширить отверстие. В черепной коробке просверливали два отверстия, допускающих проход иглы гамильтоновского шприца в желудочки головного мозга (AP -0,35 мм, L ± 0,75 мм и V -2,5 мм от брегмы). Мышам проводили двухстороннюю инъекцию 0,5 мкл холостого контрольного раствора или рилина с получением общей концентрации рилина в полушарии головного мозга 5 нмоль/л со скоростью 1 мкл/мин, как описано ранее (Weeber, et al., Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J. Biol. Chem. 2002;277:3994439952; Rogers, et al., Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 389-395). Затем иглу извлекали, отверстия заклеивали зубным цементом и зашивали надрезы. После операции мышей наблюдали в течение 2 ч в отдельных клетках с теплой подогреваемой подстилкой. Для контроля воспалительных или инъекционных реакций ежедневно измеряли ректальную температуру; любую мышь с температурой 100,5°F или выше подвергали эвтаназии путем вдыхания CO₂. Животных предоставляли 5-дневный восстановительный период. Ранее было показано, что это время оптимально для исследования поведения после внутрижелудочковой инъекции (Rogers, et al., Reelin supplementation enhances cognitive ability, synaptic plasticity, and dendritic spine density. Learn. Memory. 2011; 18: 558-564; Rogers, et al., Reelin supplementation recovers sensorimotor gating, synaptic plasticity and associative learning deficits in the heterozygous reeler mouse. J. Psychopharmacol. 2013; 27: 389-395).

Выработку условного рефлекса ситуативного страха проводили в квадратной звукоизоляционной камере (25x25 см) с полом из проволочной решетки. При тренировке рефлекса мышей помещали в камеру с фоновым белым шумом и давали возможность освоить ее в течение 3 мин, после чего подавали условный раздражитель (звуковой сигнал 90 дБ) в течение 30 с. Через 28 с подавали безусловный раздражитель [слабое (0,5 мА) электроболевое раздражение лап] в течение в общей сложности 2 с. После периода 90 с проводили вторую пару условных/безусловных раздражителей, после чего следовал второй 90-секундный период, общее время составляло 7 мин. Мышей подвергали условиям ситуативного страха через 24 ч после тренировки в той же камере без звукового сигнала в течение 3 мин и проводили оценку реакции замирания. После ситуативного испытания проводили нацеленную выработку рефлекса ситуативного страха, в которой в камере меняли запах, освещение и текстуру пола. Мышей помещали в камеру с измененными условиями и обеспечивали фазу привыкания в течение 3 мин (без звукового сигнала), после чего в течение последних 3 мин испытания подавали условный стимул 90 дБ. Мониторинг поведения осуществляли с помощью программного обеспечения ANY-Maze (Stoelting Co.). Реакцию замирания оценивали как неподвижность в течение по меньшей мере 2 с.

- 31 045597

Мыши, получившие холостую обработку, не получавшие тренировочное электроболевое раздражение лап, проявляли очень незначительную реакцию замирания, при которой лишь около 15% мышей замирали, когда слышали звуковой сигнал. Около 70% мышей, не получавших инъекции, но получавших тренировочный электроболевой раздражитель, замирали, когда слышали звуковой сигнал, и только у мышей, которым вводили рилин, частота замирания превышала 90%, как видно на фиг. 26(A). По сравнению с этими результатами при введении RAP, который ингибирует связывание рилина с его рецепторами, ответ на звуковой сигнал уменьшался на 45% несмотря на тренировку мышей с электроболевым раздражителем. Анализ показал наличие статистически значимого различия ответа у мышей, не получавших препарат, но получавших электроболевой раздражитель, и у мышей, получавших RAP.

Мышей также подвергали тесту в водном лабиринте. Для оценки пространственного научения и памяти использовали водный лабиринт со скрытой платформой. Платформу диаметром 10 см погружали непосредственно под поверхность воды в бассейне диаметром 1,2 м, заполненном непрозрачной водой, достаточно глубоком, чтобы мыши не могли нащупать дно. В помещении по кругу располагали крупные визуальные ориентиры. Мышей помещали в бассейн и давали им возможность плавать в течение максимум 60 с, чтобы найти платформу. Тренировка состояла из пяти дней тренировки, по четыре тренировки в день с интервалом между ними 15 мин. На шестой и восьмой дни платформу перемещали и регистрировали характер плавания каждой мыши в течение 60 с с помощью видеорегистратора с программным обеспечением ANY-Maze (Stoelting Co.) (пробные испытания).

После однократной инъекции рилина в желудочки головного мозга пространственное научение поиску скрытой платформы в водном лабиринте улучшалось, как показано на фиг. 26(B). У мышей, которых повторно тренировали на поиск другого (противоположного) расположения платформы в день 6, улучшенная способность к научению сохранялась по сравнению с мышами, получавшими инъекцию только физиологического раствора. Мыши, получавшие однократную инъекцию рилина за 5 дней до тренировки, показали более короткий латентный период до нахождения платформы в первый день. Латентный период до нахождения платформы статистически значимо сокращался после однократного воздействия тренировочной парадигмы, как показано на фиг. 26(C). У мышей, которых повторно тренировали на поиск другого положения платформы, сохранялись различия между мышами, получавшими инъекции рилина и физиологического раствора. Скорости плавания и другие измерения активности у животных, получавших и не получавших вещество, оставались без изменений. Эти данные убедительно иллюстрируют способность рилина к модулированию научения и формирования памяти in vivo и важность исследований, нацеленных на идентификацию механизмов, контролирующих процессинг белка рилина и последующее модулирование когнитивной функции фрагментами рилина.

Функциональные тесты показали, что сниженные уровни рилина приводят к снижению способности к ассоциативному научению. Влияние дефицита рилина на синаптическую функцию компенсируется при повышении концентрации рилина. Прямая двухсторонняя инфузия рекомбинантного фрагмента рилина в желудочки головного мозга, выполненная за 3 часа до выработки условного рефлекса ситуативного страха, приводила к усилению формирования памяти у мышей дикого типа 3-4-месячного возраста при проведении теста через 24 часа после тренировки, как показано на фиг. 26(A)-(C). Эти результаты демонстрируют потребность в рилине для нормального функционирования памяти и поднимают интересный вопрос о том, может ли усиление активации передачи сигнала рилина улучшить память.

Затем был проведен анализ влияния выработки условного рефлекса ситуативного страха на содержание рилина в организме. У мышей дикого типа вырабатывали условный рефлекс ситуативного страха в соответствии с протоколом с 3 электроболевыми раздражителями (CFC). У мышей, не подвергавшихся электроболевому раздражению (CS), используемых в качестве отрицательного контроля, и у мышей, подвергавшихся электроболевому раздражению в аналогичной ситуации (CS/US), извлекали гиппокамп через 1, 5, 15, 30 и 180 минут после выработки рефлекса, а также через 18 часов после выработки рефлекса (n=4 для каждого момента времени) и проводили анализ гомогенатов гиппокампа с использованием антител к рилину (G10).

При научении ситуативному страху экспрессия рилина и фрагмента комплемента резко изменяется в течение 18 часов после выработки рефлекса ситуативного страха, особенно фрагментов 450 и 180 кДа, как видно на фиг. 27(A) и (B). Кроме того, стимуляция тета-вспышки, доставляемая в побочный путь Шеффера, приводила к статистически значимому повышению экспрессии рилина и расщепления фрагмента через 15 минут после стимуляции, как видно на фиг. 27(A) и (B). Эти результаты показывают, что процессинг рилина с образованием функционально различных фрагментов вовлечен в интеграцию и контроль активации передачи сигнала рилина, ответственной за изменение синаптической пластичности и модулирование научения и памяти.

Пример 8.

Активация передачи сигнала рилина вовлечена в ряд физиологических изменений возбуждающего синапса, а также в нормальную когнитивную функцию млекопитающих. В недавней работе подчеркнута важная роль активации передачи сигнала рилина в нормальном обучении и памяти (Weeber, et al. Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 2002, 277: 39944-39952), а также в патологических случаях, где эта активация передачи сигнала нарушена. APC в

- 32 045597 настоящее время является модулятором-кандидатом активации передачи сигнала рилина, поскольку, повидимому, обладает структурными группировками, которые связываются с ApoER2 и активируют нисходящие эффекторы.

Липопротеиновые рецепторы играют роль в когнитивных процессах, и предполагают участие этого семейства рецепторов в патологических процессах, лежащих в основе прогрессирования болезни Альцгеймера (БА). Два основных лиганда этих рецепторов, apoE и рилин, по-видимому, обладают сигнальной способностью, которая может значимо влиять на синаптическую функцию, непосредственно взаимодействуют с предшественником белка A-бета (APP) и модулируют его метаболизм, а также чувствительны к накоплению Ae. Накопление Ae нарушает активацию передачи сигнала липопротеиновых рецепторов, что в результате сопровождается нарушением когнитивной функции. Кроме того, взаимодействие активации передачи сигнала рилина и/или рецепторов липопротеина приводит к аберрантному метаболизму APP и клиренсу Ae, что, в свою очередь, усиливает накопление Ae и отложение бляшек. Поэтому усиление активации передачи сигнала рилина посредством прямого применения белка рилина иои путем применения генотерапии или конструкций РНК, либо применение других агонистов липопротеиновых рецепторов можно использовать для ослабления Ae-зависимого нарушения когнитивной функции и прогрессирования образования патологических бляшек.

Подтверждение роли протеолиза рилина при заболеваниях человека находят как при нервнопсихических, так и при нейродегенеративных расстройствах. Например, количество фрагмента N-R2 увеличивается у пациентов с БА и лобно-височной деменцией по сравнению с пациентами, не страдающими деменцией (Saez-Valero, et al., Altered levels of cerebrospinal fluid reelin in frontotemporal dementia and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 2003; 72: 132-136; Botella-L0pez, et al. Reelin expression and glycosylation patterns arealtered in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 5573-5578). У пациентов с подтвержденным диагнозом депрессии и биполярного расстройства обнаруживается уменьшение содержания фрагмента N-R2 в образцах крови, при этом у пациентов с шизофренией содержание фрагмента N-R6 увеличивается (Fatemi, et al., Altered levels of Reelin and its isoforms in schizophrenia and mood disorders. Neuroreport. 2001; 12: 3209-3215). Рилин может также играть роль в контроле судорог: в моделях эпилепсии процессинг рилина изменяется (Tinnes, et al., Epileptiform activity interferes with proteolytic processing of Reelin required for dentate granule cell positioning. FASEBJ. 2011; 25: 1002-1013; Tinnes, et al., TIMP-1 inhibits the proteolytic processing of Reelin in experimental epilepsy. FASEBJ. 2013; 27: 2542-2552; Kaneko, et al., Kainic acid-induced golgi complex fragmentation/dispersal shifts the proteolysis of reelin in primary rat neuronal cells: an in vitro model of early stage epilepsy. Mol. Neurobiol. 2016; 53: 1874-1883), которое может быть MMP-зависимыми. Эти различия в содержании фрагментов рилина указывают на значимость содержания рилина и нарушения его протеолитической функции при болезненных состояниях.

Тестирование рилина в трех моделях БА у мышей показано изменение метаболизма рилина в этих моделях (PS1-FAD, SweAPPxPS1 и Tg2576). Мышей дикого типа четырнадцатимесячного возраста (неизмененных однопометных мышей), линий Tg2576 (SweAPP), PS1-FAD (M146L) и 2X (SweAPP x M146L) содержали в нормальных условиях (20°С, относительная влажность 50% и 12-часовой цикл свет/темнота) и предоставляли свободный доступ к корму и воде. После нормализации в условиях окружающей среды извлекали кору головного мозга мышей и проводили Вестерн-блоттинги лизатов для определения различных фрагментов рилина. Метаболизм рилина в трех моделях БА у мышей (PS1-FAD, SweAPPxPS1 и Tg2576) изменяется, как видно на фиг. 28(A). У мышей Tg257б по сравнению с мышами дикого типа не было выявлено статистически значимых различий по содержанию продуктов рилина 450, 190 и 180 кДа, но у мышей Tg2576 и 2X отмечено статистически значимое увеличение количества неидентифицированных N-концевых последовательностей, распознаваемых антителом G10. В отличие от этого, количество продуктов рилина 450 и 180 кДа статистически значимо увеличивалось у мышей PS1FAD и 2X. Эти изменения фрагмента комплемента рилина, по-видимому, коррелируют с изменениями активации нисходящей передачи сигнала рилина. Исследование фосфорилирования основного компонента нисходящего пути Dab-1 в коре головного мозга показало повышенное фосфорилирование DAB-1 у мышей SweAPPXPS1 и PS1-FAD и его статистически значимое снижение у мышей с одиночной мутацией SweAPP (Tg2576), как видно на фиг. 28(B). Эти данные позволяют предположить, что метаболизм рилина особенно чувствителен к изменениям процессинга APP и/или к накоплению Ae.

Изменения состава фрагментов рилина и фосфорилирования Dab-1 у мышей Tg2576 могут свидетельствовать о нарушенной системе активации передачи сигнала рилина - явлении, которое может быть действительно ответственным за недостаточность синаптической пластичности, описанную у этой линии мышей (Mitchell, et al., X11beta rescues memory and long-term potentiation deficits in Alzheimer's disease APPswe Tg2576 mice. Hum Mol Genet. 2009; 18:4492-4500; Kotilinek, et al., Cyclooxygenase-2 inhibition improves amyloid-beta-mediated suppression of memory and synaptic plasticity. Brain. 2008; 131: 651-664; Jacobsen, et al., Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103: 5161-5166).

Чтобы определить влияние экзогенного рилина, свежие гиппокампальные срезы от 8-месячных мышей Tg2576 перфузировали раствором 5 нмоль/л рекомбинантного фрагмента комплемента рилина

- 33 045597

R3-6. Применение фрагмента рилина приводило к восстановлению недостаточности ДВПСП у пожилых мышей Tg2576, как видно на фиг. 28(C), что позволяет предположить, что у этих мышей биохимический и структурный механизм, вовлеченный в активацию передачи сигнала рилина после процессинга белка рилина, не затронут. Кроме того, важно отметить, что в этой модели мыши можно получить нормальные уровни синаптической пластичности. Фрагменты рилина также ассоциированы с бляшками с плотной сердцевиной у пожилых (15-месячных) мышей Tg2576, как видно на фиг. 29(A)-(D). Кроме того, рилин и родственные агонисты липопротеиновых рецепторов могут восстанавливать недостаточность синаптической пластичности и когнитивной функции, возникающую в результате накопления Ae и/или образования патологических бляшек. Рилин восстанавливал недостаточность ДВПСП у 12-месячных мышей модели БА (Tg2576), как видно на фиг. 30.

Эти данные подтверждаются результатами наблюдений, что рилин ассоциирован с Aeсодержащими бляшками, обнаруживаемыми в гиппокампе пожилых мышей дикого типа (Madhusudan, et al., Accumulation of reelin-positive plaques is accompanied by a decline in basal forebrain projection neurons during normal aging. Eur J Neurosci. 2009; 30: 1064-1076; Knuesel, et al., Age-related accumulation of Reelin in amyloidlike deposits. Neurobiol Aging. 2009; 30: 697-716). В свете установленной роли рилина в синаптической функции изменение целостности метаболизма рилина и активации передачи его сигнала играет значительную роль в изменениях научения и памяти, ранее установленных в моделях БА у мышей.

Однократное применение экзогенного рилина неожиданно привело к усилению научения и памяти у взрослых мышей дикого типа по меньшей мере в течение одиннадцати дней. Роль рецепторов липопротеина в клиренсе Ae и идентификация ассоциации рилина с бляшками Ae в модели БА у мышей свидетельствует о том, что важно уделять внимание изучению рилина в качестве терапевтической мишени в этиологии и патогенезе БА, поскольку терапевтическое вмешательство при БА нацелено на удаление Ae и улучшение когнитивной функции.

Поэтому усиление активации передачи сигнала рилина посредством прямого применения белка рилина иои путем применения генотерапии или конструкций РНК, либо применение других агонистов липопротеиновых рецепторов можно использовать для ослабления Ae-зависимого нарушения когнитивной функции и прогрессирования образования патологических бляшек.

Пример 9.

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) может иметь различные источники, например судороги, травму головы, эпилептический статус (ЭС) и ишемию (Shetty & Hattiangady, Prospects of Stem Cell therapy for Temporal Lobe Epilepsy. Stem Cells. 2007; 25: 2396-2407; Ogawa, et al., Ischemia-induced neuronal cell death and stress response. 2007; 9: 573-587; Acharya, et al., Progress in neuroprotective strategies for preventing epilepsy. Prog Neurobiol. 2008: 363-404; Pitkanen, et al., From traumatic brain injury to posttraumatic epilepsy: what animal models tell us about the process and treatment options. Epilepsia. 2009; 50 (Suppl 2):21-9). В течение острой фазы повреждения стволовые клетки нейронов (NSC), расположенные в субгранулярной зоне (SGZ), претерпевают усиленный нейрогенез в стремлении к заживлению повреждения (Parent, et al., Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 1997; 17: 3727-3738; Hattiangady, et al., Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiol Dis. 2004; 17: 473490; Shetty, et al., Hippocampal neurotrophin levels in a kainate model of temporal lobe epilepsy: a lack of correlation between brain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentate mossy fiber sprouting. J Neurochem. 2003; 87: 147-159; Hattiangady, et al., Brain-derived neurotrophic factor, phosphorylated cyclic AMP response element binding protein and neuropeptide Y decline as early as middle age in the dentate gyrus and CA1 and CA3 subfields of the hippocampus. Exp Neurol. 2005;195:353-371). Однако физиологические ответы на эти повреждения не в состоянии улучшить восстановление функций и приводят в результате к недостаточности способности к научению и памяти и к расстройствам настроения (Jorge RE, Acion L, Starkstein SE, Magnotta V. Hippocampal volume and mood disorders after traumatic brain injury. Biol Psychiatry. 2007; 62: 332-338; Potvin, et al., Performance on spatial working memory tasks after dorsal or ventral hippocampal lesions and adjacent damage to the subiculum. Behav Neurosci. 2006; 120: 413-422). Многие хронические проблемы ЧМТ вызваны слабой дифференцировкой нейронов NSC, неправильной миграцией или дифференцировкой нейронов из NSC и слабым или неправильным синаптогенезом на базальных дендритах, вырастающих из нейронов (Sanchez, et al., Synaptic connections of hilar basal dendrites of dentate granule cells in a neonatal hypoxia model of epilepsy. Epilepsia. 2012;53 (Suppl 1):98-108).

Для исследования влияния введения рилина в случае черепно-мозговой травмы (ЧМТ) провели батарею поведенческих тестов моторики, EBST, акинезии передних конечностей и силы захвата лапы.

Мышей линии C57Bl/6 десятинедельного возраста (n=55, самцы) содержали в обычных условиях (20°С, относительная влажность 50% и 12-часовой цикл света/темноты) и обеспечивали доступ к воде и корму без ограничений. После нормализации в условиях окружающей среды мышей повергали ЧМТ, используя контролируемый кортикальный импактор (CCI; Pittsburgh Precision Instruments, Inc, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США). Экспериментальные методики были одобрены комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных. Мышей делили на группы, получавшие холостую обра

- 34 045597 ботку (без ЧМТ) без инъекции, ЧМТ без инъекции, группу с ЧМТ, получавшую ложную обработку путем введения физиологического раствора, и группу с ЧМТ, получавшую рилин. Введение рилина животным осуществляли путем инъекции 2 мкл полноразмерного рекомбинантного очищенного белка рилина в концентрации 5 нмоль/л. Животных, подвергаемых ложной обработке, анестезировали и проводили хирургическую процедуру, но не подвергали воздействию на кору головного мозга. Все поведенческие тесты проводили при световом цикле в одно и то же время во все дни тестирования. Чтобы уменьшить боль и страдания животных на протяжении эксперимента, соблюдали необходимые меры предосторожности. Все исследования проводили сотрудники, не осведомленные об условиях введения веществ. На момент эксперимента масса тела мышей составляла 12-45 г.

Глубокая анестезия была достигнута введение 1-2% изофлурана в смеси оксида азота/кислорода (69/30%) с помощью носовой маски. Всех животных фиксировали в стереотаксической рамке (David Kopf Instruments, г. Туджунга, штат Калифорния, США). Операции по созданию ЧМТ заключались в том, что кожу голову животного надрезали, чтобы обнажить череп, и проводили краниоэктомию. Для проведения краниоэктомии использовали электрическое сверло радиуса около 2,5 мм, с координатами, рассчитанными от +0,2 вперед и -0,2 мм вправо от брегмы (Paxinos & Watson, (2005) The mouse brain in stereotaxic coordinates. 5th ed. San Diego, CA: Academic Press). После краниотомии вызывали повреждение головного мозга в области лобно-височной коры со скоростью 6,0 м/с, достигая глубины 1,0 мм ниже слоя твердых мозговых оболочек и оставляли сверло в головном мозге на 150 миллисекунд (мс). Стержень импактора устанавливали под углом 15° вертикально, сохраняя перпендикулярное положение в отношении тангенциальной плоскости кривизны головного мозга на повреждаемой поверхности.

Датчик линейного переменного смещения (Macrosensors, г. Пеннсаукен, штат Нью-Джерси, США), соединенный с импактором, позволял измерять скорость и длительность для подтверждения единообразия обработки. После операции вводили анальгетик кетопрофен (5 мг кг^-1). Мышей держали под строгим наблюдением.

Тест покачивания приподнятого тела (EBST; от англ. Elevated body swing test) включал удерживание животного за хвост и регистрацию направлений покачивания (Borlongan & Sanberg, (1995) Elevated body swing test: a new behavioral parameter for mice with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism. The Journal of neuroscience 15: 5372-5378). Аппарат для теста состоял из прозрачной плексигласовой коробки (40x40x35,5 см). Животное осторожно брали за основание хвоста и приподнимали за хвост до тех пор, пока его нос не находился на 2 дюйма (5 см) над поверхностью. Направление покачивания, влево или вправо, отмечали, как только голова животного смещалась в сторону приблизительно на 10 градусов от среднего положения тела. После однократной регистрации покачиваний животное снова помещали в плексигласовую коробку и давали ему свободно побегать в течение 30 секунд, после чего выполняли повторное тестирование. Эти этапы повторяли 20 раз для каждого животного. В норме покачивание интактных мышей смещено на 50%, т.е. число покачиваний влево и вправо одинаково. 75% покачивание в одном направлении использовали как критерий нарушения моторики при ЧМТ.

Акинезию передних конечностей исследовали до и после операции ЧМТ у молодых и пожилых мышей с контрольной холостой обработкой, ЧМТ без инъекции, ЧМТ с ложной инъекцией или ЧМТ с инъекцией рилина (Borlongan CV, Hida H, Nishino H (1998) Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport 9:3615-3621). Силу и подвижность ипсилатеральных (со стороны повреждения) и контралатеральных передних лап оценивали в баллах двое экспериментаторов методом слепой оценки, используя приведенную ниже шкалу акинезии передних конечностей. Не подвергавшихся воздействию, подвергавшихся ложному воздействию или мышей с односторонней паркинсонической симптоматикой по отдельности помещали в вертикальный плексигласовый цилиндр (диаметр 20 см, высота 30 см) и проводили видеозапись исследования мышами цилиндра и касание передними лапами стекла в течение 5-15 мин. Контакты с передними лапами отмечали два экспериментатора методом слепой оценки, и впоследствии был проведен расчет (число контактов с правой лапой/общее число контактов). Значение 50% характеризовали как нормальное и соответствующее баллу 1, 80% касаний стекла правой лапой (ипсилатеральной) животного учитывали как нарушение, соответствующее баллу 2, при этом 90% или более касаний стекла правой лапой (ипсилатеральной) животного учитывали как тяжелое нарушение, соответствующее баллу 3. Балльные оценки регистрировали для каждого индивидуального животного, а затем для анализов использовали средние баллы по экспериментальным группам.

Тестирование силы захвата лапы проводили до и после операции ЧМТ. Аномальный захват является показателем нарушения нервно-мышечной функции. В этом тесте мышей удерживали за тело напротив шеста (Ibrahim AG, Raisman G, Li Y (2009) Permanent loss of fore-paw grasping requires complete deprivation of afferent input from a minimum of four dorsal roots of the rmouse brachial plexus. Exp Neurol 215: 142-145). Балльную оценку силы захвата ипсилатеральной и контралатеральной лапой проводили два экспериментатора замаскированным методом с использованием приведенной ниже шкалы силы захвата лапы. По шкале от 1 до 3 баллов 1 балл является нормой, 2 балла означают нарушение, и 3 балла - тяжелое нарушение. Балльные оценки регистрировали для каждого индивидуального животного, а затем для анализов использовали средние баллы по экспериментальным группам.

- 35 045597

Для оценки статистически значимых различий между экспериментальными группами использовали многократные измерения критериев дисперсионного анализа и апостериорных t-критериев Бонферони для каждого момента времени. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Все значения выражали в вид среднего арифметического ± SEM.

Для животных с ЧМТ, которым вводили рилин, наблюдали улучшение восстановления поведения. У мышей, которым вводили рилин, было выявлено незначительное смещение покачивания в день 1, которое разрешалось к дню 2, как видно на фиг. 31. По сравнению с ними мыши, получившие ЧМТ и инъекцию контрольного растворителя или не получившие инъекцию, характеризовались высокой степенью смещения на протяжении всего исследования. Таким образом, введение рилина приводило к различиям восстановления в день 2, при этом у мышей, получавших рилин, наблюдалось улучшение, а у мышей, получавших контрольный растворитель или не получавших инъекцию, улучшение было незначительным. Введение рилина также приводило к улучшению состояния акинезии конечностей к дню 3, как видно на фиг. 32. К дню 5 мыши, получавшие рилин, демонстрировали сходные показатели акинезии конечностей с ложнообработанными животными, тогда как у мышей с ЧМТ, которым вводили контрольный растворитель или не проводили инъекцию, акинезия сохранялась. В тесте захвата лапы у мышей, получавших рилин, наблюдалось стабильное улучшение, как видно на фиг. 33.

Хроническая утрата жизнеспособности при черепно-мозговой травме отчасти связана с неправильной заменой нейрональных клеток во время ее заживления. Было обнаружено, что рилин обеспечивает защиту ГАМК-эргических промежуточных нейронов, которые являются нейронами, экспрессирующими внеклеточный гликопротеин рилин в DG (Shetty, Hippocampal Injury Induced Cognitive and Mood Dysfunction, Altered Neurogenesis and Epilepsy: Can Early Neural Stem Cell Grafting Intervention Provide Protection? Epilepsy Behav. 2014 Sep; 38: 117-24). Эти ГАМК-эргические промежуточные нейроны способствуют миграции нейрональных клеток, образующихся из NCS, в слой гранулярных клеток (Gong, et al., Reelin regulates neuronal progenitor migration in intact and epileptic hippocampus. J Neurosci. 2007;27:1803-1811). He ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, введение рилина или фрагментов рилина может оказывать свое воздействие посредством формирования дендритов, сохранения ГАМК-эргических промежуточных нейронов или комбинации этих путей.

Пример 10.

Дендритные шипики представляют собой небольшие отростки, которые покрывают поверхность дендритов и несут постсинаптические структуры, которые формируют синапсы возбуждения. Аномальная форма или уменьшенное количество дендритных шипиков обнаруживают при ряде когнитивных заболеваний, таких как синдром ломкой X-хромосомы, синдром Вильямса, синдром Ретта, синдром Дауна, синдром Ангельмана и аутизм. На основании уменьшения количества дендритных шипиков можно предположить, что дли развития дендритных структур, которые принципиально важны для интенсивной обработки информации нейронами, требуется конститутивный уровень активации передачи сигнала, опосредованной рилином/рецепторами липопротеинов. Это мнение согласуется с исследованиями, в которых показано, что мыши, гетерозиготные по мутации reeler (HRM), характеризуются сниженной плотностью дендритных шипиков и нарушением выполнения некоторых поведенческих функций научения и памяти. Кроме того, восполнение рилина приводит к восстановлению недостаточности плотности шипиков и связанного с ней когнитивного нарушения. Кроме того, передача сигнала рилина инициирует биохимические пути, вовлеченные в активацию CREB, которые существенны для транскрипции ранних генов памяти. Данный путь является общим для всех упомянутых выше когнитивных расстройств у человека.

Пример 11.

Недавно было показано, что процессинг рилина под действием металлопротеиназы (металлопротеиназ) является существенным для нормального формирования кортикальной пластинки (Jossin, et al., Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol Cell Biol. 2007; 27:7113-7124), хотя конкретный фермент, ответственный за это, неизвестен. Это открытие позволяет предположить, что опосредованный металлопротеиназой процессинг рилина может быть также важен для направленной передачи сигнала рилина в головном мозге взрослого организма. Как tPA, так и MMP-9 являются металлопротеиназами-кандидатами с явно продемонстрированной ролью в регуляции синаптической пластичности и когнитивной функции (Bozdagi, et al., In vivo roles for matrix metalloproteinase-9 in mature hippocampal synaptic physiology and plasticity. J Neurophysiol. 2007; 98:334-344-9; Nagy, et al., Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal latephase long-term potentiation and memory. J Neurosci. 2006; 26:1923-1934; Huang, et al., Mice lacking the gene encoding tissue-type plasminogen activator show a selective interference with late-phase longterm potentiation in both Schaffer collateral and mossy fiber pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:8699-8704; Pang, P. T., and B. Lu. 2004. Regulation of late-phase LTP and long-term memory in normal and aging hippocampus: role of secreted proteins tPA and BDNF. Ageing Res Rev 3:407-430; Zhuo, M., D. M. Holtzman, Y. Li, H. Osaka, J. DeMaro, M. Jacquin, and G. Bu. 2000. Role of tissue plasminogen activator receptor LRP in hippocampal long- term potentiation. J Neurosci 20:542-549; Baranes, et al., Tissue plasminogen activator contributes to the late phase of LTP and to synaptic growth in the hippocampal mossy fiber pathway. Neuron. 1998; 21:813-825).

- 36 045597

Эффективность образования продукта 370 кДа частично зависит от кандидата для расщепляющего рилин фермента tPA. Этот потенциальный механизм регуляции оказывает выраженное влияние на интегрирование сигнальной системы с известными механизмами нейрональной регуляции и координирование ее участия в физиологических процессах, таких как научение и память. Тем не менее рилин расщепляется в конкретных сайтах с получением в результате стабильного паттерна рилиновых фрагментов, легко определяемых количественно в анализе методом Вестерн-блоттинга. Эти фрагменты представляют собой потенциальные сигнальные молекулы, свойства которых уникальны по сравнению с полноразмерным рилином. Рекомбинантный рилин, очищенный из стабильно трансфицированных клеток HEK293, содержит фрагменты такого же размера, как основные фрагменты, обнаруживаемые в гиппокампе.

Кроме того, все данные, касающиеся локализации рилина в головном мозге взрослого организма, получены с использованием антитела, которое распознает участок N-R2. Участок N-R2 присутствует в полноразмерном рилине (N-R8), фрагментах рилина N-R2 и N-R6, но отсутствует в других основных фрагментах. Поэтому для мониторинга изменений образования и локализации продуктов рилина был применен подход 3-эпитопного картирования, как показано в табли. 3, с получением беспрецедентного пространственного разделения.

Таблица 3

Антитела, применяемые в подходе 3-эпитопного картирования, их свойства, источник идентификации и сайт распознавания эпитопа

Антитело	Сайт распознавания	Животноеисточник	Коммерческий источник
G10	164-496	Ms, mAb	Chemicon, MAB5364
G20	С-конец	Gt, pAb	SCBT, SC-7741
CR-50	420-450	Ms, mAb	MBL, D223-3
Н-221	3239-3460	Rb, pAb	SCBT, SC-5578
AF3820	1221-2661	Gt, pAb	R&D, AF3820
R4B	1810-1825	Ms, mAb	Jossen, et al·., 2Θ07
R5A	1985-2058	Ms, mAb	Jossen, et al·., 2007
АЬ12	3260-3428	Ms, mAb	de Berkgeyck, et al·., 1998
АЬ12	3260-3428	Ms, mAb	de Berkgeyck, et al·., 1998
АЬ12	3260-3428	Ms, mAb	de Berkgeyck, et al·., 1998

В целях характеризации конкретных фрагментов, образующихся в результате tPA- и MMP-9зависимого процессинга рилина в условиях нормальной синаптической функции и формирования памяти были созданы мутантные конструкции рилина, устойчивого к расщеплению, методом сайтнаправленного мутагенеза, как видно на фиг. 34. Мутанты рилина включают конструкции, устойчивые к расщеплению (Rln-Res) tPA в участке R2-3, MMP-9 в участке R6-7 и обоими ферментами в участках R2-3 и R6-7. Также рассматривали фрагменты, имитирующие расщепление tPA или MMP-9, с резистентным сайтом расщепления или без него. Одна комплементарная конструкция рилина имела идентичную метку с белком Rln-Res; однако она не содержала два измененных сайта расщепления (лабильный к расщеплению рилин; фиг. 34). Был включен фрагмент с меткой, полученный с обоими мутированными сайтами (отрицательная контрольная конструкция), и фрагмент R3-6 с меткой, для которого показано потенциальное связывание с ApoER2 и VLDLR (потенциальный положительный контроль). Эти конструкции рилина субклонируют в экспрессионных векторах млекопитающих, содержащих N-концевые полигистидиновые метки и/или C-концевые метки Myc, что обеспечивает более позднее распознаванием ими экзогенного рилина. Точные сайты расщепления могут быть идентифицированы путем взаимодействия очищенного полноразмерного рилина либо с tPA, либо с MMP-9, и, таким образом, можно выделить полученные в результате фрагменты.

Процессинг рилина осуществляется как tPA, так и MMP-9 с образованием основных фрагментовпродуктов рилина, обнаруживаемых in vivo, как видно на фиг. 35(A)-(C). Как видно, под действием tPA увеличивается количество фрагментов 370 кДа (N-R6) и 80 кДа (R7-8) в бесклеточных условиях, как видно на фиг. 24(A), что указывает на расщепление рилина tPA между R6-R7, как видно на фиг. 27. В результате расщепления рилина плазмином образуется спектр продуктов неизвестной ранее идентичности и специфично сохраняется фрагмент 180 кДа. Применение рекомбинантного tPA на первичных нейронах приводило к полному преобразованию экзогенного полноразмерного рилина в формы фрагментов 370 и 180 кДа и к уменьшению количества внутриклеточного рилина 180 кДа. Кроме того, под действием MMP-9 увеличивалось количество обоих фрагментов 370 кДа (N-R6) и 180 кДа (N-R2), а также фрагмен

- 37 045597 та, находящегося непосредственно ниже фрагмента 180 кДа, как видно на фиг. 24(B) и (C), что было подтверждено ингибированием MMP9, как видно на фиг. 24(D) и (E). Эти результаты, полученные в бесклеточных условиях, подтверждают, что MMP-9 может расщеплять рилин в обоих сайтах расщепления R2-3 и R6-7; однако применение MMP-9 на первичных нейронах привело к специфичному накоплению фрагмента 180 кДа в клетках, а ингибирование MMP-9 в течение 24 часов привело к резкому увеличению количества полноразмерного рилина и уменьшению количества рилина 180 кДа в клетках. Эти результаты позволяют предположить, что в нормальных условиях MMP-9 ответственна за расщепление рилина между R2-R3, как видно на карте фрагментов на фиг. 34. Рассмотренные в совокупности, эти предварительные данные позволяют предположить, что для образования основных фрагментов рилина, обнаруживаемых in vivo, достаточно наличия MMP-9 и tPA. Анализ структур позволил идентифицировать антитела, способные к обнаружению различных фрагментов рилина, как видно на фиг. 36(A) и (B). Процессинг белка рилина в гиппокампе чувствителен к синаптической активности in vitro и in vivo. Также оказалось, что MMP-9 и tPA вовлечены в процесс метаболизма рилина.

Пример 12.

Рилин расщепляется в конкретных сайтах с получением в результате стабильного паттерна рилиновых фрагментов, легко определяемых количественно в анализе методом Вестерн-блоттинга. Эти фрагменты представляют собой потенциальные сигнальные молекулы, свойства которых уникальны по сравнению с полноразмерным рилином. Рекомбинантный рилин, очищенный из стабильно трансфицированных клеток HEK293, содержит фрагменты такого же размера, как основные фрагменты, обнаруживаемые в гиппокампе. Применение комплемента рекомбинантного фрагмента рилина может (1) усиливать синаптическую передачу, способствуя встраиванию рецептора АМПК и усиливая функцию рецептора НМДА, (2) восстанавливать молчащие синапсы, (3) модифицировать морфологию синапсов и (4) усиливать ДВПСП (Qiu & Weeber, Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 2007; 97: 2312-2321; Qiu, S., K. M. Korwek, A. R. Pratt-Davis, M. Peters, M. Y. Bergman, and E. J. Weeber. 2006. Cognitive disruption and altered hippocampus synaptic function in Reelin haploinsufficient mice. Neurobiol Learn Mem 85: 228-242).

Был проведен анализ экспрессии рецептора ApoER под действием рилина. Смешанные культуры нейронов гиппокампа и коры головного мозга получали из эмбрионов мыши в дни 18-19 эмбрионального развития (E). Клетки высевали с высокой плотностью (~750 клеток в мм^-2) и выращивали в питательной среде Neurobasal (Gibco BRL) с добавлением B27 (Gibco BRL). Клетки пересевали при 80% конфлюэнтности. После 8-кратного пересева клеток в питательную среду добавляли фрагмент рилина hR3-6 в концентрации 5 нмоль/л, и клетки инкубировали с фрагментом рилина в течение 1 часа при 37°С. После инкубации клетки собирали путем трипсинизации, промывали питательной средой и подвергали лизису с использованием лизирующего буфера на основе ДСН-в-меркаптоэтанола. Белки собирали из каждой культуры клеток и наносили 25 мкг на гель с ДСН-ПААГ. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с использованием антитела к ApoER2 (Sigma-Aldrich, LRP8, кроличье антитело к hApoER2).

При обработке клеток GST-RAP (рецептор-ассоциированный белок) показано значительное снижение экспрессии рецептора, как видно на фиг. 37. Следовательно, блокирование способности рилина к связыванию с ApoER2 ведет к снижению экспрессии ApoER2. Однако воздействие на клетки экзогенного рилина привело к повышению экспрессии рецептора ApoER2. Кроме того, в результате обработки нейронов рилином экспрессия ApoER2 возрастала дозозависимым образом, как видно на фиг. 38(A) и (B).

В приведенном выше описании все документы, акты или раскрытая информация не является признанием того, что этот документ, акт или информация, либо любая их комбинация были общедоступными, общеизвестными, составляли часть общих сведений в данной области техники или были известны как актуальные способы решения какой-либо задачи на момент приоритета.

Описания всех цитируемых выше публикаций явным образом в полном объеме включены в настоящий документ посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая из них была индивидуально включена путем ссылки.

Хотя в настоящем документе описаны и проиллюстрированы конкретные варианты осуществления способа лечения неврологических расстройств, специалистам в данной области техники будет очевидно, что возможны вариации и модификации без отклонения от широкого смысла и принципов настоящего изобретения. Должно быть также понятно, что приведенная ниже формула изобретения подразумевает охват всех общих и конкретных признаков изобретения, описанного в настоящем документе, и всех утверждений объема изобретения, в которые в рамках формулировок должны быть указаны как входящие в объем изобретения.

- 38 045597

Organization Applicant

Street :

City :

State :

Country :

PostalCode :

PhoneNumber :

FaxNumber :

EmailAddress :

< 110> OrganizationName : University of South Florida

Application Project < 120> Title : Reelin Compositions for Treatment of Neurological Disorders < 130> AppFileReference : 1372.1144 < 140> CurrentAppNumber :

< 141> CurrentFilingDate : -__-__

Earlier Applications -------------------- < 150> PriorAppNumber : 63/370,519 < 151> PriorFilingDate : 2016-08-03

Earlier Applications -------------------- < 150> PriorAppNumber : 62/486,729 < 151> PriorFilingDate : 2017-04-18

Earlier Applications -------------------- < 150> PriorAppNumber : PCT/US2017/045307 < 151> PriorFilingDate : 2017-08-03

Sequence < 213> OrganismName : Homo sapiens < 400> PreSequenceString :

cacgcgtggg ctcggcgggg gcccgctccc aggcccgctc ccgagcccgt tccgctcccg tccgccttct tctcgccttc tctccgcgtg gctcctccgt cccggcgtct ccaaaactga atgagcgagc ggcgcgtagg gcgscggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcatgga gcgcagtggc tgggcccggc agactttcct cctagcgctg ttgctggggg cgacgctgag ggcgcgcgcg gcggctggct attacccccg cttttcgccc ttctttttcc tgtgcaccca ccacggggag ctggaagggg atggggagca gggcgaggtg ctcatttccc tgcatattgc gggcaacccc acctactacg ttccgggaca agaataccat gtgacaattt caacaagcac cttttttgac ggcttgctgg tgacaggact atacacatct acaagtgttc aggcatcaca gagcattgga ggttccagtg ctttcggatt tgggatcatg tctgaccacc agtttggtaa ccagtttatg tgcagtgtgg tagcctctca cgtgagtcac ctgcccacaa ccaacctcag tttcatctgg attgctccac ctgcgggcac aggctgtgtg aatttcatgg ctacagcaac acaccggggc caggttattt tcaaagatgc tttagcccag cagttgtgtg aacaaggagc tccaacagat gtcactgtgc acccacatct agctgaaata catagtgaca gcattatcct gagagatgac tttgactcct accaccaact gcaattaaat ccaaatatat gggttgaatg taacaactgt gagactggag aacagtgtgg cgcgattatg catggcaatg ccgtcacctt ctgtgaacca tatggcccac gagaactgat taccacaggc cttaatacaa caacagcttc tgtcctccaa ttttccattg ggtcaggttc atgtcgcttt agttattcag accccagcat catcgtgtta tatgccaaga ataactctgc ggactggatt cagctagaga aaattagagc cccttccaat gtcagcacaa tcatccatat cctctacctt cctgaggacg ccaaagggga gaatgtccaa tttcagtgga agcaggaaaa tcttcgtgta ggtgaagtgt atgaagcctg ctgggcctta gataacatct tgatcatcaa ttcagctcac agacaagtcg ttttagaaga tagtctcgac ccagtggaca caggcaactg gcttttcttc ccaggagcta cagttaagca tagctgtcag tcagatggga actccattta tttccatgga aatgaaggca gcgagttcaa ttttgccacc accagggatg tagatctttc cacagaagat attcaagagc aatggtcaga agaatttgag agccagccta caggatggga tgtcttggga gctgtcattg gtacagaatg tggaacgata gaatcaggct tatcaatggt cttcctcaaa gatggagaga ggaaattatg cactccatcc atggacacta ccggttatgg gaacctgagg ttttactttg tgatgggagg aatttgtgac cctggaaatt ctcatgaaaa tgacataatc ctgtatgcaa aaattgaagg aagaaaagag catataacac tggataccct ttcctattcc tcatataagg ttccgtcttt ggtttctgtg gtcatcaatc ctgaacttca gactcctgct accaaatttt gtctcaggca aaagaaccat caaggacata ataggaatgt ctgggctgta gactttttcc atgtcttgcc tgttctccct tctacaatgt ctcacatgat acagttttcc atcaatctgg gatgtggaac

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

- 39 045597 gcatcagcct cctccttcac tgtctactcc agcactaacc gtgggcaatt acagtgcact ggcatcccag ttaccataac cagtggtaag tgacagctca gagcacgtgc taatgggata aataatctcc gcaaccgtat atctgtgctt tctgggattc tacaggagat aggagcatcc acacatggac cgtccaagaa ttaccatgcc ttggtccagt ggctttggac atgcgatcat agctgccctt ctggcaagaa ttctggatca ggatacttct atgcaacaag catccagtgg ctatctggag cgtgttctca gaagcagaag gccagctttt aatggttaaa agatggagat gttcaagcta gtactctcat tgcaggcaaa aggggacttt caagaccaga tttagatgga catttcagga aaatgtcccc gtacaagata tctctacttc tatcagactt caaaccaaga ctggcatttg tgacctgcca tgggaagcat tcaaactgga aatccaagga tgaaaacata ctttttgcag acagctccag tcctccaacc ccagaattgg gttcagatgg tgtactggcc ctgtgtgtgt gattcttaaa tgcagagagg aggggaagga ccagttttca acaattctcc aacaacgaat aagattcaga tgacttcatt ttttgggccc ggtaacagtg actgaatgct tctgaaaact cggaacacca gataatgttt agacatggtt acattcccaa ttttactcta gccctggttt caatccaggt agagcccctg acttggaaac gtagaactac cattcttccc ttcaacagca taccttggaa tctaaacttg tatatgattc aaccaggtga gaatgccttc agtgagttta gctacccgtt agcatttaca ggcatatgca ccgtccacaa gttattgggg tctctgtact tgggtggact cctgacagca cacctgctag cttccagctg ggggaggact cagatcatcc gattacccta aatgaaacct cgatttgcag aacataggtt gatgctggta ggatgcgaag gaagaatgga ttccgatgga gtgtacatat gtgtgtttct aatcacaatg acaggtgccc aatggccctg gttcaatttt actagaaatg cttcgagagt caggacgcga tcagcccagt tttcaagaca ggtcaagttg ggaaaacctc tttgaaatga tattctctga attggctgtc aagcggatca attcaggcca tcagggtgcc gaccggggct gacgatttca gggaatctga ctaaggatgc cttagattta atcagtggag atacttttca ctctggcaac atcgatggaa agagaagaca tcagcttgga tacctgagat acagtgggtg ggattcgctg atattggccc gcaagtgtga tgtttatttc tccgtggtgc tcaacaaaga ttctccagtt atcagcctgg tcctggagca caggtgatgc agagagaaga ttagtcttga atgttcagcc cctcaagtat agttcagttt agctggagta caagtatgcc cacagtggag tccgctggag ttgggcagca ggtgtgacca ttatgtcaga gagaaattgt tcagcaaggc ttgtccagtt gagaggaggg cagagatgta ctgccaagac atgaccagtg cagttatcaa tgaatcagat tctgtgctgc taactcgaga gtgccaatca tgtcctggtt gaaactccag caagaatcac tccaggagag ccgagccttg gtgacctggg agatgttcga aggttggaac ggaaaaggga atatacaaat aagggcttat tggacttcat agacacctgc gggctttgga aatttgatgg atattgactg gttatgctga gcatgggctg acaatggcaa tgcattacac ctgtctacct actacactgt cttggatgtg ttggtggacc atgggaattt atggtgaaac ttatttcaag tagcaaaaag gaatcacttg tcaatgttcc cttataataa ataatgtaaa attggttttt attttctacc ctgtgctgga gaaccgaata gagacaaaca gtcatgtctc ccctggattt tgaaagcttt tgaagtcagc agggcggcgt cacactgaga tgaaggagtt ttattcatat aaagcagttt tgtatgggct ctttaccaat atactgtggc gcgctatgtg ggtgatggga ctcaaccaac aagttgtcag gagagtcata ccagagctat gtgccccaac ggggtaccaa ttttgagaac aaaaccagaa tgggaaaaga ctacatccag cgtcctcctt cttttcagac cccttgcacc ggcagtcgat tccaacttta gagtgtgtgg cacaccatca tttgaccctg attcagcagt tctggtgaaa agaactaagt cattgttatt cagctcacag tcccagttac atatactgct taggtttgag tggctgtgga agcccggacg tggaagcaaa tgttcagtat gtccttcctg aacggcattt tgatgttctt ctctatagat tctctctatg gacctgggat tagcaagccc ggactggcat ggaaagttca tccactctcc gggggctgat ctcaggacga ctattgtgtt acatcctgac catcaaatct agatctagat taccccagag gcacctgatg cttgccatac cggtaagaaa caaccctgtg ctatcctggt aaccatgggc ccccacctcc acaattcccc ggaccaatcc aaattctgtt tctggcccag ggcagttcca tttggttgtg cagctaatta ctggggagca ttgctgcatt ctcagctatc ggaattcagt attgatgaga cttgtggagg cacgactgga gaaacacaat tgtggccaga cacggcctta gaatttacat gtgcttcttc tacacagctc atgtgcagtg ggcactgaat cagaatggct caagggtgtg cagctggtga ataggcggag cagtacagca ttcagcaaac aggttccgct gacatcatca cctcagaact ttgatgttgg gcaatgatat aaacctggat actgctccag gaaggctgtt gagcccacca ccaaggtctc aaaaacgtgc tgcagtggcc gcacaaggaa gggaagctca acacttaacg gtccctctgg acttcaggca tcaaatgaca gaaccacaga cgatggtggc ataggaatga ttgcaagcca gatactgctc tttcatgtgt ttcagcaact cttgtcaccg atttacacct accatttctc tcctgggcga gggatttgtg cctgttgttc ctttggcctg ggaacatctc tgtacaaata agatctcact gatgaatttt actgcccaaa gaagaaatct atgctcttgg ggtaacatcg gctcctggtc cccacagcac ttcctaacgc ttggaaacat ctggcagagg cttgtgagat ggctctcctc gtgtcttggc catctttcct aatctgttct attcttatga atgagcccag tcagatggtg ttatcatgac tcactcagtc ccctttgttt caatgcagat aatacacccc cctggcacct cagcaagtat cccagaaaac aagacgagtg ggcatggctc gccacccaga gggagtctga gtgtcatctc gttgggacct agagtgcttc acaatggggg ccagatttgt ggtggcagcc ttctgtccga tttatgagaa ctaatgaagg ttggaaaatc atgtgctaca ttcttcttca acccggcttc tgtatcacac ttgcatccag ctccatttgg atggggactg cctgtgtgtc gccctctgtg atggcaaatc acaccaggaa ttacctgcat atgggatact tcatttccat aaccgcaaca atgacagctc actggtatcg tgatattcac cagcatctac cccacagtgt aagagtgtgt cggaaagatt ccaggacccg ttgataatgt atgctggacg ctctgccctc aagtgtatgg taatttttaa caatgtatgt ctattctgtt actttcctca ccaatgctac ggattgttga atacatttga gtctttattg

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4680

4740

4800

4860

4920

4980

5040

5100

5160

5220

5280

5340

5400

5460

5520

5580

5640

5700

5760

5820

5880

5940

6000

6060

6120

- 40 045597 tccatattct agttggtgag atttgagatc attttcaagg cagccacgtc aaccatgcag tgtccgtttc cattgataat tatcaatgga caccaaaaat cttattaatg cctctttttc tgctagattt gagtcaaccc ggagttcctt gaaagcccgt ctacagcccc cttggaagat caagatgccc ccgttacgtg cgctgcctcc tcttggattg tcgctatcat tctgcctctc tccttttgac agacatgtgc gggtggcctg caatcgagct gtgtggagcc agtcactgtg gtgcctgatt aggcattacc tgtgaatatc gccaagacat ctctgctgac cgagcgctcc agacaaaact ctgtgactcc agtgacccat atgtaaggtg cggtgtgagt aagtgtttct acttcctgaa catgcagtgg ccatggagat ctacttgacc acctgactta cgaggacact ggatcttcga gacctcttgc tggaggaatt acacgactac gcagcctttt actggacaac tgatgatgaa agcaggattt gactcacaat taaaattgtg atacactaag ctcttctaac tgtcaacagc tgcaacacag tgaccacgtg gaccggtgcc tcacgacctt ctgggagacc ccatggagac ggatctcact ggacagctgc atacagcgtc tcaaaggggg cattccatta aacgttggct gacttcgggg agctctttat ggctggagga agatggtacc gtctacatcg accaaatgta cctgattttc agtggtggga aatgaagatg gtgcagttct gtgctcctac ttcagcaatt tctggttcta tgggttatcg gatttcacaa gtgtgtggct gtcagcacag tgctcagtca tcatggcacc ctgcaacgga cctccttata aagcagcaga agtggccatg tactgtgatg ccatccagtc gtggcgtcgg gatctaaacc acaccaaaca tggaacctgc cttctccctc gacggcctgg caaaggaccg cctgcagatg tcagtgaatg cctgatggtg gacctgactc tctgaaaaaa tggaattatc cagccatctg agcttagtgg gcaatcgata tgcttaaggg cacactctga tggatgtcct gcactctatt ggtgcaaagt catcgtccca acctggactt atacttcttc gtgatcagca attttgattg ggcacttccc tgtggcaatc gctctctcct gtgggttgtg gatgcaagat agcattggct tcaagctgga ttccgctgga tacattggag atctgcatct cccagttata attcaaggtg tcactgtact cgagcaagca aacagtgacc aacaacggga cacctgaaga ccacccgtga gttcgactga cgacctggca gctccaccga gggaggtcgt agggatttta gtccccagtg tatgtgaccc tcaaagatga aaccatctcg gcttgcgcat tcatgagact agtattctct ccagcaatgt ctcgccttcg atcagattct cccttgatag ctactggtga acgttgccgt cagactcttg cattggtaag tcctggtgtc ccaggtccca catgggcaat ggagatgcat accccgagac agaactggct gaatggctct tcactaatgc accgtaacca tcatggagat ctgatgctaa atcagaacga ttatgctgga ccggccctgt agcactggct tgatgctctg ccactgaagg ttgcccagaa tggtccctca tattctttcc gaaatccggt atttctacct aacagtgcat agactttcct tagaaggtgg ttgggggatc tcctgcaata tctgccggaa tgctccatga ctgaagatgc atggaattgt gtggagcaga atgaagaaaa catcctttca cccgagaact aagccacttc cggattcctg gctccccttt aaagaatcac tccagaaggg aggcttgccc gcgacgagag ttaaagataa gagtcatagg ttaatggctg aaatcatgtt tgagtggccc tcacctggca agattcagct cctaaatgtg tagctcatcc ccttctgctg gcaccacccc gcactttggg ccctgccggc tgaggagatg tggctactca tttcgaaggt aaagtgtgga gttgatgaca gggatgtggt caacggtggc gggcaggtac ctggtggcaa tattggagga taggaaatgg tgccctggtc gaatgaggat ttatgcgatt ggactgtctg agacactttc agccactcgt agataatgtc ccagggaaac ctctcttcca gactgtgaac ccatttcagt tgagttcatc aggtgttctc tttctatgac agagattgcc ctgggccatt caccttcagc cgggaggatc attccatgat tggcagtcat ctggattatg tcaaattcat gtgcttgcct aactaaaggg aaggtttagg gggccctgga ctgtgatccg gaaggaacgc aagtacttgc cactgtgaga ctgggggcgc ggaaggcgtg gatggattac cctcaccaac ggtctctggg aatcaatccc ctggagtttt cctctattgg cattatacag ttgtggtgac gcagctcgta ccagttccat catccagctg agaagaaact caagctctgc cttccaaggt ttttgagtcc aagtggctgt tcagatcagg tgttttgcaa ccacgctgtg tgtcatcgcc atggtgtttg aatgagaaca gcggatccag cccctctgct agcagcacct aagctgcacc tctcagccag tgtaatggac ggtccaacct cagctagaat atcctttcta cgagacctgg aaaggcgttc ctctcgtgga attgccctgg ccgtctgaga aatatttctg ctgcttcacc ttcattgaaa tccttcctac gaattggaat cctaccaatg aacaagtgga ttccgttggc tatatcgggg tgcgtctgtg acccaactca ggagggaaat gggggttgta caattttact ttggaatatt cagtacagta actcgcttcc gacaatgtcc agcgccccag gcctttgaca gattgtacag gatggacggg caattcaaga gtgcagtatt gctgacccaa tggaaaagga ttctatcaga tgcttggaca ggatactcag tttgacagtg actgagtgtg caagcggtta atcggtagtg ctgttggact cagaaataca acaactcgac gtggagcgtg agccaattgg taccctaatg ccaaataaaa ccaggataca cttcattccg cagacccagt gaagccacca cctgaccatg gagaagcaaa agcgggcacg gatgactgct gcaagagtca gggcagctgg caagcagcta attgggagca gacaaggcgg cagcaccagc tttcaaatga ccatcataca tgagactgga accacagcag actacgcagg tttgtggatc tgacatgggc aggggagctg gtaaaataag ctgatagatt gtggaaacaa atttatcaca ctgaccccag gtcttcttca agataccctt atgggcactt gtaatacggt caggaggcac aggccagcac agatagactt actcagtaga tggaatgcag ctagaatcac atcaaccagc atggctgcat atgaacagtg aagacaactt tgagtacagt gtcgattatt tcatgtatgg ctgtcaatgg agcccggatt gctggtggca tcatctcagg taccccagca tgtttatgga tagaaagatt aggtgtatgc tctcagttgg ctactgactt aatgctctgg tcacctaccc agtactcaga actgcagggg ggccaaactg aagaaatcaa gaattcttgc cacaagattt agaacaacat actctaccga tttctgttag ttcgctggtg ctcagtgggc tggacacttt ctgtaaggac agaaggacaa tgatgcagtt taatgctgga gccttccttc tctacaactc tctcctctag gctgggcaat gatactgcac ctgttttcag ccgaggcaaa ccccctacgc ccaagcctct tgtcgcagac tgctgctgca caaaggactt

6180

6240

6300

6360

6420

6480

6540

6600

6660

6720

6780

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

9600

9660

9720

9780

9840

9900

9960

10020

10080

10140

10200

10260

10320

- 41 045597 cacacaagct cagagagtgt cttacaatgt ccccctggag gcacggatga aaggagtctt actgcgctgg tggcaaccac gccacaatgg aacaggtcat gatcaatggg ctttggacca tgtggaggtc gtcctagtaa gcactcgcaa acaaaattac atgatgaatt tttcacgaca acatgggctc agacatttct acaacagaag acgaaggtca cttaggcgat acccatgaag aatcaaaaag tttatttttt ttcttccaac atgtgatgtg ttgctctcca ttcttttaaa tctcgcacta catctgatat caggaaatat ctgtgaagga cttggtgatt acctgaaagc ccttctcaag accgagtgta caccactttc ccacactgtg aactaatgac aagtgactta tttgctcata agtaaatgtc ttcatgttga tgtgtccgtg aaagttgtga tctgttgtaa tatcagttac agtggcagta ttgacaataa gaaacagttt aacagaaaaa tgaaatttaa gcacaaaaaa tttaagagat tttatgttta aaatggcatt tagcacagta tttaacattc ttggtcacaa agctatttaa gtggactgta tttcagctat gtctcatgtt ttatatgatt aaattatcat tgtttgtcct ttatgtattc tcttctacaa tacaacacat tgaaactgta tttacttgtt atgttgtaat attttgctgc tgaatttggg gctacttata ttctgcagaa aattaattga aatacctatt caagaagata gttgtaaaga tattgtatct cctttaatat actccttaaa aatgtatgtt ggtttagcgt tgttttgtgg ataagaaaaa tgcttgaccc tgaaatattt tctactttaa attgtggatg aagaccctat ctcccacaaa taagttccca tttccttgtc taaagatctt tttttaagtg ttctgtggct gatttactaa cagtaactgc cattttttgt ctgtgataac agagtgattt gtaaaacagt ggttgttttt tcattgtgtt ttcttcgtgg attgtttttt ctgcgggtca tattcatacc ttctgatgaa gttgtacaac accagcaaca ttataatggc cctgtagctc tgaatgctat ttgtgtaact gaaaggttgc actctagggt gaaccaagct ataaaagccc atgcttaaat aaaaattatg tccaaaagcc < 212> Type : DNA < 211> Length : 11580

SequenceName : Full length Reelin SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

ttcagcagta ctgctccagt tcttcttcag tactctcatg atgctggtat gtcctggttt ctggtgaaag aaggctgtta cccggcttct gcaggcaaag gatgcgaagg aaactccaga gaactaagtg agcccaccat gtatcacaca ggggactttg aagaatggac aagaatcacc attgttattc caaggtctct tgcatccagc aagaccagat tccgatggat ccaggagagc agctcacaga aaaacgtgcc tccatttggt ttagatggag tgtacatatc cgagccttgt cccagttact gcagtggcca tggggactgc atttcaggag tgtgtttctg tgacctggga tatactgctg cacaaggaac ctgtgtgtca aatgtcccca atcacaatga gatgttcgat aggtttgagg ggaagctcag ccctctgtgg tacaagataa caggtgccca ggttggaact ggctgtggaa cacttaacga tggcaaatct ctctacttca atggccctgg gaaaagggaa gcccggacgg tccctctgga caccaggaat atcagacttg ttcaatttta tatacaaatt ggaagcaaaa cttcaggcat tacctgcatc aaaccaagaa ctagaaatga agggcttatt gttcagtatt caaatgacaa tgggatactc tggcatttgc ttcgagagtt ggacttcatg tccttcctg < 212> Type : DNA < 211> Length : 729

SequenceName : Reelin Repeat 3

SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

cccttcagca actcccacag tgtacagctc cagtattctc tgaacaatgg caaggactgg catcttgtca ccgaagagtg tgttcctcca accattggct gtctgcatta cacggaaagt tcaatttaca cctcggaaag attccagaat tggaagcgga tcactgtcta ccttccactc tccaccattt ctcccaggac ccggttcaga tggattcagg ccaactacac tgtgggggct gattcctggg cgattgataa tgttgtactg gcctcagggt gcccttggat gtgctcagga cgagggattt gtgatgctgg acgctgtgtg tgtgaccggg gctttggtgg accctattgt gttcctgttg ttcctctgcc ctcgattctt aaagacgatt tcaatgggaa tttacatcct gacctttggc ctgaagtgta tggtgcagag agggggaatc tgaatggtga aaccatcaaa tctggaacat ctctaatttt taaaggggaa ggactaagga tgcttatttc aagagatcta gattgtacaa atacaatgta tgtccagttt tcacttagat ttatagcaaa aagtacccca gagagatctc actctattct gttacaattc tccatcagtg gaggaatcac ttggcacctg atggatgaat tttactttcc tcaaacaacg < 212> Type : DNA < 211> Length : 690

SequenceName : Reelin Repeat 4

SequenceDescription :

10380

10440

10500

10560

10620

10680

10740

10800

10860

10920

10980

11040

11100

11160

11220

11280

11340

11400

11460

11520

11580

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 729

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

690

- 42 045597

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

gatagctcat ccgcggatcc agtgagactg gaattttcaa gggacttcgg ggcgacctgg60 caccttctgc tgcccctctg ctaccacagc agcagccacg tcagctcttt atgctccacc120 gagcaccacc ccagcagcac ctactacgca ggaaccatgc agggctggag gagggaggtc180 gtgcactttg ggaagctgca cctttgtgga tctgtccgtt tcagatggta ccagggattt240 taccctgccg gctctcagcc agtgacatgg gccattgata atgtctacat cggtccccag300 tgtgaggaga tgtgtaatgg acaggggagc tgtatcaatg gaaccaaatg tatatgtgac360 cctggctact caggtccaac ctgtaaaata agcaccaaaa atcctgattt tctcaaagat420 gatttcgaag gtcagctaga atctgataga ttcttattaa tgagtggtgg gaaaccatct480 cgaaagtgtg gaatcctttc tagtggaaac aacctctttt tcaatgaaga tggcttgcgc540 atgttgatga cacgagacct ggatttatca catgctagat ttgtgcagtt cttcatgaga600 ctgggatgtg gtaaaggcgt tcctgacccc aggagtcaac ccgtgctcct acagtattct660 ctcaacggtg gcctctcgtg gagtcttctt caggagttcc ttttcagcaa ttccagc717 < 212> Type : DNA < 211> Length : 717

SequenceName : Reelin Repeat 5

SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

gtcacagact cttgttatgc gattgaattg gaatactcag tagatcttgg attgtcatgg60 cacccattgg taagggactg tctgcctacc aatgtggaat gcagtcgcta tcatctgcaa120 cggatcctgg tgtcagacac tttcaacaag tggactagaa tcactctgcc tctccctcct180 tataccaggt cccaagccac tcgtttccgt tggcatcaac cagctccttt tgacaagcag240 cagacatggg caatagataa tgtctatatc ggggatggct gcatagacat gtgcagtggc300 catgggagat gcatccaggg aaactgcgtc tgtgatgaac agtggggtgg cctgtactgt360 gatgaccccg agacctctct tccaacccaa ctcaaagaca acttcaatcg agctccatcc420 agtcagaact ggctgactgt gaacggaggg aaattgagta cagtgtgtgg agccgtggcg480 tcgggaatgg ctctccattt cagtgggggt tgtagtcgat tattagtcac tgtggatcta540 aacctcacta atgctgagtt catccaattt tacttcatgt atgggtgcct gattacacca600 aacaaccgta accaaggtgt tctcttggaa tattctgtca atggaggcat tacctggaac660 ctgctcatgg agattttcta tgaccagtac agt693 < 212> Type : DNA < 211> Length : 693

SequenceName : Reelin Repeat 6

SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

gaaccacaga tcatttccat tgacctgcca caggacgcga agacacctgc aacggcattt60 cgatggtggc aaccgcaaca tgggaagcat tcagcccagt gggctttgga tgatgttctt120 ataggaatga atgacagctc tcaaactgga tttcaagaca aatttgatgg ctctatagat180 ttgcaagcca actggtatcg aatccaagga ggtcaagttg atattgactg tctctctatg240 gatactgctc tgatattcac tgaaaacata ggaaaacctc gttatgctga gacctgggat300 tttcatgtgt cagcatctac ctttttgcag tttgaaatga gcatgggctg tagcaag357 < 212> Type : DNA < 211> Length : 357

SequenceName : Reelin Repeat Loop Region 3-4

SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

aatatacttt tcatcaatgt tcccttgcca tacactgccc aaaccaatgc tacaagattc60 agactctggc aaccttataa taacggtaag aaagaagaaa tctggattgt tgatgacttc120 attatcgatg gaaataatgt aaacaaccct gtgatgctct tggatacatt tgattttggg180 cccagagaag acaattggtt tttctatcct ggtggtaaca tcggtcttta ttgtccatat240 tcttcaaagg gggcacctga agaagattca gctatggtgt ttgtttcaaa tgaagttggt300 gagcattcca ttaccacccg tgacctaaat gtgaatgaga acaccatcat acaatttgag360 atcaacgttg gctgttcgac t381

- 43 045597 < 212> Type : DNA < 211> Length : 381

SequenceName : Reelin Repeat Loop Region 4-5

SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

aatgtgggca ggtacattgc cctggagata cccttgaaag cccgttctgg ttctactcgc60 cttcgctggt ggcaaccgtc tgagaatggg cacttctaca gcccctgggt tatcgatcag120 attcttattg gaggaaatat ttctggtaat acggtcttgg aagatgattt cacaaccctt180 gatagtagga aatggctgct tcacccagga ggcaccaaga tgcccgtgtg tggctctact240 ggtgatgccc tggtcttcat tgaaaaggcc agcacccgtt acgtggtcag cacagacgtt300 gccgtgaatg aggattcctt cctacagata gacttcgctg cctcctgctc a351 < 212> Type : DNA < 211> Length : 351

SequenceName : Reelin Repeat Loop Region 5-6 SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence <400> PreSequenceString :

aagcttccac catggagcgc agtggctggg cccggcagac tttcctccta gcgctgttgc tgggggcgac gctgagggcg cgcgcgttca gcagtactgc tccagttctt cttcagtact ctcatgatgc tggtatgtcc tggtttctgg tgaaagaagg ctgttacccg gcttctgcag gcaaaggatg cgaaggaaac tccagagaac taagtgagcc caccatgtat cacacagggg actttgaaga atggacaaga atcaccattg ttattccaag gtctcttgca tccagcaaga ccagattccg atggatccag gagagcagct cacagaaaaa cgtgcctcca tttggtttag atggagtgta catatccgag ccttgtccca gttactgcag tggccatggg gactgcattt caggagtgtg tttctgtgac ctgggatata ctgctgcaca aggaacctgt gtgtcaaatg tccccaatca caatgagatg ttcgataggt ttgaggggaa gctcagccct ctgtggtaca agataacagg tgcccaggtt ggaactggct gtggaacact taacgatggc aaatctctct acttcaatgg ccctgggaaa agggaagccc ggacggtccc tctggacacc aggaatatca gacttgttca attttatata caaattggaa gcaaaacttc aggcattacc tgcatcaaac caagaactag aaatgaaggg cttattgttc agtattcaaa tgacaatggg atactctggc atttgcttcg agagttggac ttcatgtcct tcctggaacc acagatcatt tccattgacc tgccacagga cgcgaagaca cctgcaacgg catttcgatg gtggcaaccg caacatggga agcattcagc ccagtgggct ttggatgatg ttcttatagg aatgaatgac agctctcaaa ctggatttca agacaaattt gatggctcta taacccttga tagtaggaaa tggctgcttc acccaggagg caccaagatg cccgtgtgtg gctctactgg tgatgccctg gtcttcattg aaaaggccag cacccgttac gtggtcagca cagacgttgc cgtgaatgag gattccttcc tacagataga cttcgctgcc tcctgctcag tcacagactc ttgttatgcg attgaattgg aatactcagt agatcttgga ttgtcatggc acccattggt aagggactgt ctgcctacca atgtggaatg cagtcgctat catctgcaac ggatcctggt gtcagacact ttcaacaagt ggactagaat cactctgcct ctccctcctt ataccaggtc ccaagccact cgtttccgtt ggcatcaacc agctcctttt gacaagcagc agacatgggc aatagataat gtctatatcg gggatggctg catagacatg tgcagtggcc atgggagatg catccaggga aactgcgtct gtgatgaaca gtggggtggc ctgtactgtg atgaccccga gacctctctt ccaacccaac tcaaagacaa cttcaatcga gctccatcca gtcagaactg gctgactgtg aacggaggga aattgagtac agtgtgtgga gccgtggcgt cgggaatggc tctccatttc agtgggggtt gtagtcgatt attagtcact gtggatctaa acctcactaa tgctgagttc atccaatttt acttcatgta tgggtgcctg attacaccaa acaaccgtaa ccaaggtgtt ctcttggaat attctgtcaa tggaggcatt acctggaacc tgctcatgga gattttctat gaccagtaca gtgattacaa ggatgacgac gataagtgac tcgag

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1895 < 212> Type : DNA < 211> Length : 1895

SequenceName : Reelin Fragment R3 and R6

SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

MERSGWARQT FLLALLLGAT LRARAFSSTA PVLLQYSHDA GMSWFLVKEG CYPASAGKGC60

EGNSRELSEP TMYHTGDFEE WTRITIVIPR SLASSKTRFR WIQESSSQKN VPPFGLDGVY120

ISEPCPSYCS GHGDCISGVC FCDLGYTAAQ GTCVSNVPNH NEMFDRFEGK LSPLWYKITG180

AQVGTGCGTL NDGKSLYFNG PGKREARTVP LDTRNIRLVQ FYIQIGSKTS GITCIKPRTR240

- 44 045597

NEGLIVQYSN DNGILWHLLR ELDFMSFLEP QIISIDLPQD AKTPATAFRW WQPQHGKHSA QWALDDVLIG MNDSSQTGFQ DKFDGSITLD SRKWLLHPGG TKMPVCGSTG DALVFIEKAS TRYVVSTDVA VNEDSFLQID FAASCSVTDS CYAIELEYSV DLGLSWHPLV RDCLPTNVEC SRYHLQRILV SDTFNKWTRI TLPLPPYTRS QATRFRWHQP APFDKQQTWA IDNVYIGDGC IDMCSGHGRC IQGNCVCDEQ WGGLYCDDPE TSLPTQLKDN FNRAPSSQNW LTVNGGKLST VCGAVASGMA LHFSGGCSRL LVTVDLNLTN AEFIQFYFMY GCLITPNNRN QGVLLEYSVN GGITWNLLME IFYDQYS <212> Type : PRT <211> Length : 617

SequenceName : Reelin Protein Fragment R3 and R6 SequenceDescription :

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

aagcttccac catggagcgc agtggctggg cccggcagac tttcctccta gcgctgttgc tgggggcgac gctgagggcg cgcgcgttca gcagtactgc tccagttctt cttcagtact ctcatgatgc tggtatgtcc tggtttctgg tgaaagaagg ctgttacccg gcttctgcag gcaaaggatg cgaaggaaac tccagagaac taagtgagcc caccatgtat cacacagggg actttgaaga atggacaaga atcaccattg ttattccaag gtctcttgca tccagcaaga ccagattccg atggatccag gagagcagct cacagaaaaa cgtgcctcca tttggtttag atggagtgta catatccgag ccttgtccca gttactgcag tggccatggg gactgcattt caggagtgtg tttctgtgac ctgggatata ctgctgcaca aggaacctgt gtgtcaaatg tccccaatca caatgagatg ttcgataggt ttgaggggaa gctcagccct ctgtggtaca agataacagg tgcccaggtt ggaactggct gtggaacact taacgatggc aaatctctct acttcaatgg ccctgggaaa agggaagccc ggacggtccc tctggacacc aggaatatca gacttgttca attttatata caaattggaa gcaaaacttc aggcattacc tgcatcaaac caagaactag aaatgaaggg cttattgttc agtattcaaa tgacaatggg atactctggc atttgcttcg agagttggac ttcatgtcct tcctggaacc acagatcatt tccattgacc tgccacagga cgcgaagaca cctgcaacgg catttcgatg gtggcaaccg caacatggga agcattcagc ccagtgggct ttggatgatg ttcttatagg aatgaatgac agctctcaaa ctggatttca agacaaattt gatggctcta tagatgacaa ttggtttttc tatcctggtg gtaacatcgg tctttattgt ccatattctt caaagggggc acctgaagaa gattcagcta tggtgtttgt ttcaaatgaa gttggtgagc attccattac cacccgtgac ctaaatgtga atgagaacac catcatacaa tttgagatca acgttggctg ttcgactgat agctcatccg cggatccagt gagactggaa ttttcaaggg acttcggggc gacctggcac cttctgctgc ccctctgcta ccacagcagc agccacgtca gctctttatg ctccaccgag caccacccca gcagcaccta ctacgcagga accatgcagg gctggaggag ggaggtcgtg cactttggga agctgcacct ttgtggatct gtccgtttca gatggtacca gggattttac cctgccggct ctcagccagt gacatgggcc attgataatg tctacatcgg tccccagtgt gaggagatgt gtaatggaca ggggagctgt atcaatggaa ccaaatgtat atgtgaccct ggctactcag gtccaacctg taaaataagc accaaaaatc ctgattttct caaagatgat ttcgaaggtc agctagaatc tgatagattc ttattaatga gtggtgggaa accatctcga aagtgtggaa tcctttctag tggaaacaac ctctttttca atgaagatgg cttgcgcatg ttgatgacac gagacctgga tttatcacat gctagatttg tgcagttctt catgagactg ggatgtggta aaggcgttcc tgaccccagg agtcaacccg tgctcctaca gtattctctc aacggtggcc tctcgtggag tcttcttcag gagttccttt tcagcaattc cagcgattac aaggatgacg acgataagtg actcgag <212> Type : DNA < 211> Length : 1937

SequenceName : Reelin Fragment R3 and R5 SequenceDescription :

300

360

420

480

540

600

617

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1937

Sequence < 213> OrganismName : artificial sequence < 400> PreSequenceString :

MERSGWARQT FLLALLLGAT LRARAFSSTA PVLLQYSHDA GMSWFLVKEG CYPASAGKGC60

EGNSRELSEP TMYHTGDFEE WTRITIVIPR SLASSKTRFR WIQESSSQKN VPPFGLDGVY120

ISEPCPSYCS GHGDCISGVC FCDLGYTAAQ GTCVSNVPNH NEMFDRFEGK LSPLWYKITG180

AQVGTGCGTL NDGKSLYFNG PGKREARTVP LDTRNIRLVQ FYIQIGSKTS GITCIKPRTR240

NEGLIVQYSN DNGILWHLLR ELDFMSFLEP QIISIDLPQD AKTPATAFRW WQPQHGKHSA300

QWALDDVLIG MNDSSQTGFQ DKFDGSIDDN WFFYPGGNIG LYCPYSSKGA PEEDSAMVFV360

SNEVGEHSIT TRDLNVNENT IIQFEINVGC STDSSSADPV RLEFSRDFGA TWHLLLPLCY420

HSSSHVSSLC STEHHPSSTY YAGTMQGWRR EVVHFGKLHL CGSVRFRWYQ GFYPAGSQPV480

TWAIDNVYIG PQCEEMCNGQ GSCINGTKCI CDPGYSGPTC KISTKNPDFL KDDFEGQLES540

DRFLLMSGGK PSRKCGILSS GNNLFFNEDG LRMLMTRDLD LSHARFVQFF MRLGCGKGVP600

DPRSQPVLLQ YSLNGGLSWS LLQEFLFSNS S631 < 212> Type : PRT

- 45 045597 < 211> Length : 631

SequenceName : Reelin Protein Fragment R3 and R5

SequenceDescription :

Claims (13)

1. Вирусный вектор для экспрессии активного рекомбинантного фрагмента белка с рилиновым повтором, включающего два или более рилиновых повтора, содержащих:

рилиновый повтор R3, соединенный с рилиновым повтором, выбранным из R4, R5 и R6, или рилиновый повтор R3, соединенный с рилиновым повтором, выбранным из R4 и R5, или рилиновый повтор R3, соединенный с рилиновыми повторами R4, R5 и R6, где полипептид рилинового повтора R3 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, где полипептид рилинового повтора R4 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, где полипептид рилинового повтора R5 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, и где полипептид рилинового повтора R6 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

2. Вирусный вектор по п.1, дополнительно содержащий:

петлевой участок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 6, расположенной между рилиновыми повторами R3 и R4, петлевой участок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7, расположенной между рилиновыми повторами R4 и R5, и петлевой участок, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, расположенной между рилиновыми повторами R5 и R6.

3. Вирусный вектор для экспрессии активного рекомбинантного слитого белка рилина, включающего два или более рилиновых повтора, содержащих:

рилиновый повтор R4, соединенный с рилиновым повтором, выбранным из R5 и R6, или рилиновый повтор R4, соединенный с рилиновыми повторами R5 и R6, где полипептид рилинового повтора R4 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, где полипептид рилинового повтора R5 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, и где полипептид рилинового повтора R6 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

4. Вирусный вектор по п.3, включающий рилиновый повтор, состоящий из полипептида с рилиновым повтором R3, который кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.

5. Вирусный вектор по п.3, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 или 11.

6. Вирусный вектор по любому из пп.1, 3, 4 и 5, представляющий собой аденоассоциированный вирусный вектор (AAV).

7. Вирусный вектор по п.6, в котором аденоассоциированный вирусный вектор (AAV) выбран из группы, состоящей из AAV-9, AAV-5, AAV-4 и AAV-1.

8. Применение вирусного вектора по пп.1-7 для индукции активации и передачи сигналов рилинзависимого рецептора ApoER2.

9. Применение вирусного вектора по п.8 для увеличения плотности дендритных корешков, долговременного потенцирования и синаптической пластичности.

10. Применение вирусного вектора по п.8 для лечения заболевания или расстройства нервной системы, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, синдрома Ангельмана, синдрома ломкой X-хромосомы, синдрома Вильяма, синдрома Ретта, синдрома Дауна, аутизма, биполярного расстройства, депрессии, шизофрении или черепно-мозговой травмы.

11. Применение вирусного вектора по п.10, в котором заболевание или расстройство нервной системы вызывает дефицит обучения.

12. Применение вирусного вектора по п.10 для улучшения когнитивной функции.

13. Применение вирусного вектора по пп.1-7 для увеличения димеризации рецептора ApoER2 и фосфорилирования ERK1/2.