JP7077343B2 - 操作された遺伝子を含む発現ベクター - Google Patents
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Description
本発明は、概して、てんかん及び類似の神経学的障害の治療に使用され得るカリウムチャネルをコードする操作された遺伝子を伴う方法及び材料に関する。
全世界で6千万人を超える人々がてんかんに罹患している(Ngugi et al., 2010)。最適な治療を受けたとしても、約30%に薬剤療法耐性が残る(Kwan et al., 2011;Picot et al., 2008)。過去20年間の新たな抗てんかん薬剤の開発は、難治性てんかんにほとんど効果がなく、発作の抑制が不十分な人々は、引き続き主要な併存症、社会的排除及び年率0.5~1%のてんかん突然不慮死(SUDEP)を経験する(Devinsky, 2011;Hoppe and Elger, 2011)。手術により難治性てんかん患者が発作から解放されることもあるが、それが適さない症例は、90%を超える。新皮質焦点てんかんは、言語、視覚又は微細運動制御に関与する皮質のエロクエント領域の損傷リスクが高いため、外科的介入が特に不適である(Schuele and Lueders, 2008)。焦点新皮質てんかんの人々は、多くの場合、通常、待期的であるごくわずかな治療の選択肢が残されているにすぎない。したがって、新たな治療を開発する緊急の必要性が存在する。
本発明者らは、予想外にも、組合せにより、コードKv1.1タンパク質の翻訳及び活性の増強並びに細胞内のKCNA1遺伝子発現の検出の改善が可能である、KCNA1遺伝子に対するいくつかの改変を行った。簡潔に述べると、本発明者らは、編集されたカリウムチャネルをコードする操作されたKCNA1遺伝子を含む発現ベクターの設計及び試験を行った。本明細書で実証されるように、本発明の操作されたKCNA1遺伝子は、機能性Kv1.1チャネルを生成すると共に、レンチウイルスベクターにパッケージした場合、ランダム化盲検化前臨床試験でラットに投与したときに発作頻度を有意に低減可能であった。
本発明は、本明細書で明らかにされるプロモーターに作動可能に結合された編集されたKv1.1カリウムチャネルをコードする操作されたKCNA1遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
KCNA1(カリウム電圧ゲートチャネルサブファミリーAメンバー1、KV1.1、HBK1及びRBK1としても知られる遺伝子ID3736)は、ヒトKv1.1カリウムチャネル(カリウム電圧ゲートチャネルサブファミリーAメンバー1としても知られる)をコードするヒト遺伝子である。「野生型KCNA1遺伝子」とは、ヒト細胞に見いだされ、且つヒトKv1.1カリウムチャネルをコードする核酸分子を意味する。KCNA1遺伝子は、コード配列の上流又は下流にレギュラトリー配列を含み得る。野生型KCNA1遺伝子のヌクレオチド配列は、非コード5’及び3’非翻訳領域(5’及び3’UTR)を含めてNCBI参照配列NM_000217.2に提供される。野生型KCNA1遺伝子のコード配列は、NCBI参照配列NM_000217.2の位置1106~2593に対応する配列番号4のヌクレオチド配列を有する。
従来の研究は、ラットにおいて興奮性ニューロンに対する強いバイアスが実証された強いウイルスプロモーター(CMV)を用いてKCNA1の過剰発現を駆動することに依拠した(Wykes et al., 2013)。しかしながら、CMVプロモーターなどの非特異的プロモーターの使用に伴う安全上の問題が存在する。例えば、てんかんの場合、問題は、興奮性ニューロン、例えば介在ニューロン以外の細胞内におけるカリウムチャネル過剰発現の可能性であり、これにより局所興奮性の減衰ではなく増悪によって発作活動を悪化させる可能性がある。したがって、安全性を改善する方法は、Kv1.1カリウムチャネルの発現を特定の細胞型に制限することであろう。しかしながら、特に編集されたKv1.1カリウムチャネルを発現する場合、細胞型特異性を駆動するプロモーターが、インビボで機能的効果を有するのに十分な発現を提供するかは明らかでない。
本発明に使用するのに好ましい発現ベクターは、レンチウイルスベクター又はAAVベクターなどのウイルスベクターである。特に好ましい発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、典型的にはウイルス粒子にアセンブルしたとき、感染のために長いインキュベーション時間を有することにより特徴付けられ、且つ有糸分裂後のニューロンなどの非分裂細胞に感染可能である特別なタイプのレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、一般的には、迅速で安定で且つ空間制限された発現をもたらす(Lundberg et al., 2008)。これは、焦点発作がエロクエント皮質に非常に近い脳領域から生じることの多いてんかんなどの疾患の治療に最適であり得る。加えて、レンチベクターの大きいパッケージング能力によりプロモーター-トランスジーンの組合せの選択肢が増えるため(Kantor et al., 2014)、発現の特異性をさらに増加させることが可能である。
本発明は、レンチウイルス粒子を作製するインビトロ方法も含む。一実施形態では、本方法は、本明細書に記載のレンチウイルスベクターで哺乳動物細胞をトランスデュースし、細胞内で粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質を発現させることと、トランスデュース細胞を培養培地中で培養することであって、それにより細胞が、培地中に放出されるレンチウイルス粒子を生成する、培養することとを含む。適当な哺乳動物細胞の例は、ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞である。
本発明は、本明細書に記載のレンチウイルスベクターと、本明細書に記載の1つ以上のパッケージング及びエンベロープ発現ベクターとを含むキットも提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング発現ベクターは、本明細書に記載のpCMVdR8.74D64Vベクターなどのインテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである。
本明細書に記載のウイルスベクター及びウイルス粒子は、医薬として使用するためのものでもあり得る。例えば、本明細書に記載のウイルス粒子は、遺伝子療法に使用され得る。
本明細書に記載のウイルス粒子は、脳内にウイルス粒子を直接注入するなどのさまざまな方法で対象に送達可能である。例えば、治療は、大脳皮質内、特に新皮質内にウイルス粒子を直接注入することを含み得る。治療は、障害に機能的に関連すると考えられる脳内の位置にウイルス粒子を直接注入することを含み得る。例えば、治療がてんかんを対象とする場合、これは、運動皮質内にウイルス粒子を直接注入することを含み得、治療が慢性疼痛を対象とする場合、これは、後根神経節内にウイルス粒子を直接注入することを含み得、治療がパーキンソン病を対象とする場合、これは、黒質内にウイルス粒子を直接注入することを含み得る。特定の投与方法及び投与部位は、自らの共通一般知識及び当業者に公知の技術を用いて投与技術も選択するであろう医師の自由裁量に委ねられるであろう。
本発明は、細胞内における操作されたKCNA1の存在を確認する方法も提供する。
本発明は、以上に記載の核酸又はベクターを含む細胞も提供する。いくつかの実施形態では、この細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト胎児腎細胞(HEK)293である。
本発明は、本明細書で明らかにされる編集されたKv1.1カリウムチャネルをコードする操作されたKCNA1遺伝子を含む核酸も提供する。核酸に存在する操作されたKCNA1遺伝子及び編集されたKv1.1カリウムチャネルは、発現ベクターに関連して本明細書に記載された所要の特徴及び配列同一性を有し得る。
実施例1 - てんかん遺伝子療法における操作されたカリウムチャネル遺伝子の送達の実証
材料及び方法
分子生物学
標準的サブクローニング技術を用いてレンチウイルストランスファープラスミドを構築した。GeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いてヒト発現に関してKCNA1のコドン最適化を行い、GeneArt(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)を用いて合成した。プラスミドは、すべて使用前に完全にシーケンスした。
S. Hart(UCL Institute of Child Health)の実験室からギフトとしてNeuro-2a細胞を得た。10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Thermo Fisher Scientific)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific)及び1%非必須アミノ酸(Sigma)が補足されたGibco(登録商標)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+GlutaMAX(商標)(Thermo Fisher Scientific)中で細胞を成長させた。37℃の加湿5%CO2雰囲気中で培養物を対数増殖期に維持した。製造業者の説明書に従ってTurboFect(商標)トランスフェクション試薬(Thermo Fisher Scientific)を用いてトランスフェクションを実施した。トランスフェクト細胞を13mmボロシリケートガラスカバースリップ(VWR)上にプレーティングした。UMPLFLN 10×及びLUMPLFLN 40×水浸対物レンズ(オリンパス)を備えたBX51WI固定ステージ直立顕微鏡のチャンバー内にカバースリップを配置した。次の組成(mM単位):140NaCl、4KCl、1.8CaCl2、2MgCl2、10HEPES(pH7.35、オスモル濃度約301mOsm/L)を有する細胞外溶液の静止浴中にカバースリップを液浸した。P-97 Flaming/Brownマイクロピペットプラー(Sutter Instrument Company)を用いて2.0~3.0MΩのチップ抵抗になるようにフィラメント入りボロシリケートガラスマイクロピペット(GC150-F; Warner Instruments)を牽引した。次の組物(mM単位):140KCl、10HEPES、10EGTA(pH7.35、オスモル濃度約291mOsm/L)の細胞内溶液をマイクロピペットに充填した。波長488nmの光で励起される蛍光マーカーdscGFP発現によりトランスフェクト細胞を同定した。全細胞パッチクランプ構成を用いて電圧クランプ下で巨視的電流を記録した。使用した電圧ステッププロトコルは、次の通りであった。すなわち、細胞を-80mVの静止電位に保持し、10mVの増分で+20mVまで行う200msの脱分極ステップにより電流を誘起する。ベースラインに戻す前、-100mVまでの40msの過分極ステップを含めた。WinWCPソフトウェア(J. Dempster, University of Strathclyde)及びAxon Multiclamp 700B増幅器(Molecular Devices)を用いて、データを3kHzでフィルターし、10kHzで取得した。予測成分及び補正成分を80%に調整し、バンド幅を1.2kHzに設定して、全体にわたり直列抵抗補償を利用した。10MΩを超える直列抵抗の細胞を分析から除外した。すべての記録を室温(23~26℃)で行った。+4.1mVであると計算された液界電位は、未補正のままにした。リーク電流は、最小限であり、減算せずにそのままにした。
CMV-KCNA1レンチベクターは、Wykes et al., 2012で使用されるものと等しく、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有する。
実験は、すべてUnited Kingdom Animal (Scientific Procedures) Act 1986に準拠して実施した。成体雄ラット(スプラーグドーリー、ロング-エバンス又はリスターフーデッド、300~400g)を麻酔して定位フレーム(Kopf)に配置した。15ngのTeNT(G. Schiavo(UCL Institute of Neurology)の実験室からのギフト)を100nl min-1の速度において1.0μlの最終体積で右視覚皮質の層5に注入した(座標:ブレグマの側方3mm、後方7mm、軟膜から深さ1.0mm)。ECoGトランスミッター(A3028E、Open Source Instruments、MA、USA)を注入部位の上方に位置決めされた硬膜下頭蓋内記録電極と共に皮下に植え込んだ。参照電極を対側頭蓋骨内に植え込んだ。11又は14日後にレンチウイルスベクターを送達するためにカニューレ(Plastics One)を注入部位の上方に位置決めした。各ラットは、発作焦点に直接注入された最大2.0μlのレンチウイルスの投与を受けた。TeNTが注入された動物を研究継続期間にわたりファラデーケージに個別に収容した。
術後6週間までECoGを連続記録した。Open Source Instrumentsから購入したハードウェア及びソフトウェアを用いてデータを取得した。発作の検出方法は、モデルの特徴付け、パイロット研究及び最終前臨床実験により異なっていた。モデルの特徴付けでは、神経学者による全ECoGデータセットの連続観測により発作を検出した。パイロット研究では、最初にECoGトレースを1sのエポックに分割した。4つのメトリック(パワー、コーストライン、インターミッテンシー及びコヒーレンス)を各エポックで定量し、それらの値を、発作活動を表すものとしてビデオにより検証されたエポックのユーザー管理ライブラリーのものと比較した(Wykes et al., 2012)。対応する値は、発作活動を含有するものとして同定された5つ以上の逐次エポックのすべての例を回収した統合スクリプトに供給した。統合出力中の発作は、すべて実験者により検証された。最終前臨床試験では、各エポックに対して6つのメトリック(パワー、コーストライン、インターミッテンシー、コヒーレンス、アシンメトリー及びリズム)を定量し、統合スクリプトを用いることなく対応する値をすべて発作活動に関してチェックした。この実験の発作回数は、治療に対して盲検化された実験者により実測された。すべてのデータセットに対して、発作の最小持続時間を10sに設定した。
エレクトログラフィー発作の動作相関の評価は、神経学者により行った。5週間の記録から発作をランダムに選択し、ECoGトレースにタイムロックされたトップダウンビデオ映像を用いて関連動作を観察した。
レンチウイルス注入1週間後、最後にラットをナトリウムペントバルビタール(Euthatal、Merial)で麻酔し、低温(4℃)ヘパリン処理PBS(80mg/リットルヘパリンナトリウム塩、Sigma)及び続いてPBS中4%パラホルムアルデヒド(PFA)(Santa Cruz Biotechnology)を経心的に灌流させた。脳を摘出して4℃の4%PFA中でさらに24時間にわたり後固定した。PBS中で洗浄後、振動ミクロトーム(Leica)を用いて脳を70μm冠状切片にスライスした。PBS+0.02%アジ化ナトリウム(Sigma)中4℃でスライスを浮遊貯蔵した。抗体染色では、切片をPBS+0.3%トリトンX-100(Sigma)中で20分間透過化した後、PBS+0.3%トリトンX-100(Sigma)、1%ウシ血清アルブミン(Sigma)及び4%ヤギ血清(Sigma)中で1時間ブロッキングした。PBS+0.3%トリトンX-100及びウサギ抗NeuN(1:750希釈、ab177487、Abcam)、マウス抗GFAP(1:500希釈、MAB3402、Merck Millipore)又はマウス抗GAD67(1:500希釈、MAB5406、Merck Millipore)一次抗体中、4℃で切片を一晩インキュベートした。PBS中で10分間洗浄を3回行った後、PBS+関連Alexa Fluor(登録商標)594コンジュゲート二次抗体(ヤギ抗ウサギ(A-11037、Thermo Fisher Scientific)又はヤギ抗マウス(A-11005、Thermo Fisher Scientific)、両方とも1:750希釈)中、室温でスライスを3時間インキュベートした。PBS中で10分間洗浄をさらに3回行った後、Vectashield(登録商標)HardSet(商標)封入媒体(Vector Laboratories)及びボロシリケートガラスカバースリップ(VWR)を用いて、スライスをプレーンガラス顕微鏡スライド(Thermo Fisher Scientific)上にマウントした。2つの顕微鏡:2.5×、10×及び40×EC Plan-Neofluar非液浸対物レンズを備えたAxio Imager A1蛍光顕微鏡(Axiovision LEソフトウェア)又は40×及び63×EC Plan-Neofluar油浸対物レンズ(Zeiss)を備えた倒立LSM 710共焦点レーザー走査顕微鏡(ZEN 2009ソフトウェア)の1つを用いて明視野画像及び蛍光画像を取得した。共焦点顕微鏡では、dscGFP及びAlexa Fluor(登録商標)594をそれぞれアルゴンの488nm線及び561nm線又はダイオードポンプ固体(DPSS)レーザーで励起した。画像処理は、すべてImageJソフトウェアを用いて実施した。複合画像は、MosaicJ ImageJプラグインを用いてアセンブルした。
治療データ(図3D、7C)の有効性は、動物のランダム効果(自己回帰共分散)と、治療群、週及び治療群と週との間の相互作用の固定効果とを含む一般化対数線形混合モデルを用いて分析した。マンホイットニーU検定を用いて治療前の週の発作回数(図7C)を比較した。ウェルチの一元配置ANOVA及び続いてゲイムス・ハウエル事後検定を用いて+20mVの電流密度(図5Bii)を比較した。
視覚皮質へのTeNTの注入は、離散発作を有する焦点てんかんモデルを生成する
マウスで開発されたモデルから始めて(Mainardi et al., 2012)、本発明者らは、9匹の成体雄スプラーグドーリーラットの視覚皮質へのTeNTの注入により引き起こされる発作のエレクトログラフィー的特徴、時間的進展及び動作相関を特徴付けた。運動皮質へのTeNT注入後に見られる短時間のほぼ連続したてんかん様放電とはきわめて対照的に(Wykes et al., 2012)、視覚皮質への注入は、離散自発発作を生成した(図1A)。発作は、TeNT注入の約4日後に現れ、7~10日間にわたり頻度が増加し、2~3週間でプラトーに達し、5又は6週間後にほとんどの動物で消散した(図1B、C)。各動物が経験した全発作回数は、かなり変動した。平均発作持続時間は、経時的に進展し、最初の週の50s弱からその次の4週の約100sまで増加した(図1D)。タイムロックビデオECoGを利用して、発作のランダムに選択されたサブセットの動作相関を同定した(n=102、図1E)。11例の発作(10.8%)では、記録が中断されたため又は動物がその環境向上材料に入って見えない状態であったため、関連動作は観察不能であった。残りの発作は、すべて観察可能な動作相関を有していた。45例の発作(44.1%)では、これらは、繊細であり、瞬きの繰返し、動揺の急増又は積極的探索動作を含んでいた。19例の発作(18.6%)では、片側運動関与、例えば対側肢の単収縮が観測され、さらなる6例(5.9%)では、両側運動症状が見られた。21例の発作(20.6%)は、完全な両側強直間代発作に発展した。焦点新皮質てんかんのこのモデルは、系統特異的ではなかった。リスターフーデッドラット及びロング-エバンスラットの両方で類似の発作が引き起こされた(図2)。
本発明者らは、EPCモデル(Wykes et al., 2012)で当初使用されたCMV駆動Kv1.1ベクター(CMV-KCNA1)がこうしたより長くより複雑な発作に対して効果を維持するかどうかを求めた。TeNT注入の2週間後、自発発作が確定されてから、動物を2つの群にランダムに分割し、あらかじめ植え込まれたカニューレを介してCMV-KCNA1レンチベクター又は緑色蛍光タンパク質(GFP)のみを発現する対照レンチベクターのいずれかを注入した。ECoG記録をさらに4週間継続した。すでに観測されているように(Wykes et al., 2012)、CMV-KCNA1レンチベクターは、ニューロンの狭い皮質柱内に導入された(図3A)。全発作回数の変動が大きいことを考慮して、2つの治療群間の発作頻度を比較するために、各週に経験した発作回数を治療前の週(ベースライン週(BI))に各動物が経験した数に規格化した。CMV-KCNA1レンチベクターは、治療後の週の規格化発作頻度を有意に低減した(0~3週にわたる一般化対数線形混合モデル、治療×週相互作用効果:F(1,60)=69.499、p<0.001、図3D)。治療効果は、迅速に出現した。2つの治療群の累積1日発作頻度のプロットは、レンチベクター注入の3日以内に発散し始める(図3E)。Kv1.1過剰発現は、発作持続時間に影響を及ぼさなかった(データは示されていない)。
KCNA1遺伝子療法を診療に近づけるために、本発明者らは、新たなレンチウイルストランスファープラスミドを設計した(図5Aii)。発現を興奮性ニューロンにバイアスするために、元のCMV-KCNA1構築物(図5Ai)のCMVプロモーターを1.3kbのヒトCAMK2Aプロモーター(hCAMK2A)で置き換えた(Dittgen et al., 2004;Yaguchi et al., 2013)。KCNA1遺伝子をヒト細胞における発現にコドン最適化し、通常、RNA編集により形成されるI400Vアミノ酸変化を導入するように突然変異させた。I400V置換は、Kv1.1チャネルが不活性化から回復する速度の20倍増加を誘発する(Bhalla et al., 2004)。前臨床評価では、dscGFPレポーター遺伝子をT2Aペプチドにより操作されたカリウムチャネル(EKC)遺伝子に結合させた。これにより、単一プロモーターからの二重タンパク質発現を可能にする。
1)1.2kbの上流DNAに結合されたCAMK2Aの100bpの5’非翻訳領域を含む1.3kbのヒトCAMK2Aプロモーター(hCAMK2A)。類似のサイズのネズミCamk2aプロモーターは、レンチウイルス注入されたラットバレル皮質(Dittgen et al., 2004)及び霊長動物運動皮質(Yaguchi et al., 2013)において錐体ニューロン特異的遺伝子発現を駆動することが示されている。これは、霊長動物の鼻皮質(Lerchner et al., 2014)又は運動皮質(Yaguchi et al., 2013)へのレンチウイルス注入後にグリア内で優先的にトランスジーン発現を駆動することが知られる本発明者らのパイロットベクターのCMVプロモーターとは対照的である。
2)チャネル不活性化性を改変するためにアデニン1998>グアニン点突然変異を有するコドン最適化KCNA1からなる操作されたカリウムチャネル遺伝子。コドン最適化は、Kv1.1発現の増加の利点を超えて有用である。それは、RNA標的化技術によるトランスジーン発現の特異的追跡を可能にする。さもなければ、トランスジェニックKCNA1と内因性KCNA1との識別はできないであろう。蛍光レポータータンパク質のコード配列がやむを得ず欠如したベクターを用いるとき、さらに翻訳パイプラインに沿ってかかる追跡が特に有用であることが証明されるであろう。負の膜電位では、未編集I400を含有するチャネルは、その編集(V400)カウンターパートの約1/20の速度で不活性化から回復する(Bhalla et al., 2004)。不活性化からより速く回復するKv1.1チャネルは、神経系興奮性を弱めると予想されるため、本発明者らは、A1998G点突然変異を意図的に導入することにより本発明者らのコドン最適化KCNA1におけるRNA編集をあらかじめ回避することを決定した。
3)T2AペプチドによりEKCに結合されたきわめて明るいdscGFPレポーター遺伝子。2Aペプチドは、リボソーム媒介翻訳時にペプチド結合形成を障害することにより単一プロモーターからのマルチシストロニック遺伝子発現を可能にする短い(約20アミノ酸)配列である(Szymczak and Vignali, 2005)。重要なこととして、2Aペプチドの両側の遺伝子は、翻訳が同時に行われて1:1の比で発現される。したがって、レポーター発現は、治療トランスジーン発現の非常に信頼できるインジケーターとしての役割を果たす。この構成は、治療及びレポーターのトランスジーンが個別の識別可能なプロモーターの転写制御下に配置された本発明者らのパイロットベクターのものとは対照的である。
EKCレンチベクターの有効性を試験するために、本発明者らは、臨床試験条件を模倣するランダム化盲検化前臨床試験を設計し、低減された発作頻度を主アウトカム尺度として選択した。わずかに低減された効力を有する新たなバッチのTeNTは、より少ない全発作を惹起し、動物福祉を改善した。TeNT注入の11日後、26匹のスプラーグドーリーラットを2群にランダムに分割し、あらかじめ植え込まれたカニューレを介してEKCレンチベクター又はdscGFPのみの対照ベクターのいずれかを注入した。ECoG記録をさらに4週間継続した。発作活動が最高になる時期を捕らえるために、タイムラインをパイロット試験のものから11日後に治療するように変更した(TeNT後2~4週間)。ロバストなてんかんを発生できない動物の交絡した影響を最小限に抑えるために、治療前の週に5回未満の発作を経験した場合には対象を除外した。この基準を非盲検化前に適用して、8匹の動物(6匹のEKC、2匹の対照)の除外を行った。ウイルス注入前の週に遭遇した発作回数に関して治療群間に有意差はなかった(マンホイットニーU検定、p=0.185)。EKC治療は、経時的発作頻度のロバストな減少を生じることが主アウトカム尺度の分析から示唆された(週0~3の一般化対数線形混合モデル、治療×週相互作用効果:F(1,67)=29.704、p<0.001、図7C)。パイロット試験のときと同じように、効果は、記録の継続期間にわたり続き、絶対効果サイズは、対照群で発作が寛解したときにのみ減少した。この場合にも、治療効果は、迅速に出現し、2群の累積1日発作頻度のプロットは、治療2日後に発散し始める(図7D)。
EKC遺伝子療法は、安全性及び診療への移行を改善するように適合化された形態で焦点新皮質発作に有効な新たな治療を提示する。
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模範的操作されたヒトKCNA1遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)
位置400にバリン(下線付き)を含む編集されたヒトKv1.1のアミノ酸配列(配列番号2)
位置400にバリン(下線付き)及び位置379にバリン(太字)の置換を含む編集されたヒトKv1.1のアミノ酸配列(配列番号14)
Claims (35)
- 操作されたKCNA1遺伝子を含む発現ベクターであって、
前記操作されたKCNA1遺伝子が、編集されたKv1.1カリウムチャネルであって、ヒト細胞において当該編集されたKv1.1カリウムチャネルの発現を駆動するのに適したプロモーターに作動可能に結合された編集されたKv1.1カリウムチャネルをコードし、
前記操作されたKCNA1遺伝子が、
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、
発現ベクター。 - 前記プロモーターが、細胞型特異的プロモーターである、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記細胞型特異的プロモーターが、ニューロンに特異的である、請求項2に記載の発現ベクター。
- 前記細胞型特異的プロモーターが、錐体ニューロンに特異的である、請求項2又は3に記載の発現ベクター。
- 前記細胞型特異的プロモーターが、ヒトCAMK2Aプロモーターを含む、請求項2~4のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記ヒトCAMK2Aプロモーターが、
配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、請求項5に記載の発現ベクター。 - ウイルスベクターである、請求項1~6のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項7に記載の発現ベクター。
- 前記レンチウイルスベクターが、配列番号9のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の発現ベクター。
- ウイルス粒子を作製するインビトロ方法であって、
請求項8又は9に記載のレンチウイルスベクターで哺乳動物細胞をトランスデュースし、前記細胞内で粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質を発現させることと、
前記トランスデュースされた細胞が培養培地中に放出されるレンチウイルス粒子を生成するように、前記細胞を前記培地中で培養することと、
を含む方法。 - 粒子形成に必要な前記ウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする1つ以上のウイルスパッケージング発現ベクター及びウイルスエンベロープ発現ベクターで前記哺乳動物細胞をトランスデュースすることを含む、請求項10に記載のインビトロ方法。
- 前記パッケージングタンパク質が、非機能性インテグラーゼ酵素を含み、それにより、前記レンチウイルスベクターが、そのウイルスゲノムを前記細胞のゲノム内に取り込むことができない、請求項10又は11に記載のインビトロ方法。
- 前記培養培地から前記ウイルス粒子を分離することと、任意選択的に、前記ウイルス粒子を濃縮することとをさらに含む、請求項10~12のいずれか1項に記載のインビトロ方法。
- ヒト細胞内で発現を駆動するのに適したプロモーターに作動可能に結合された操作されたKCNA1遺伝子をコードする一本鎖RNA分子を含むウイルス粒子であって、
前記操作された遺伝子が、編集されたKv1.1カリウムチャネルをコードし、
前記操作されたKCNA1遺伝子が、
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、
ウイルス粒子。 - 請求項8又は9に記載の発現ベクターと、細胞内で発現されたとき、粒子形成に必要なウイルスパッケージングタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質をコードする1つ以上のウイルスパッケージング発現ベクター及びウイルスエンベロープ発現ベクターとを含むキット。
- 前記ウイルスパッケージング発現ベクターが、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである、請求項15に記載のキット。
- 神経学的障害の治療に使用するための、請求項14に記載のウイルス粒子を含む医薬組成物。
- 前記神経学的障害が、神経系過興奮性を伴う、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記神経学的障害が、発作障害である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記発作障害が、てんかんである、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記てんかんが、新皮質てんかんである、請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記神経学的障害が、パーキンソン病である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記神経学的障害が、慢性疼痛である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 神経学的障害の治療のための医薬の製造における、請求項14に記載のウイルス粒子の使用。
- 前記神経学的障害が、神経系過興奮性を伴う、請求項24に記載のウイルス粒子の使用。
- 前記神経学的障害が、発作障害である、請求項24に記載のウイルス粒子の使用。
- 前記発作障害が、てんかんである、請求項26に記載のウイルス粒子の使用。
- 前記てんかんが、新皮質てんかんである、請求項27に記載のウイルス粒子の使用。
- 前記神経学的障害が、パーキンソン病である、請求項24に記載のウイルス粒子の使用。
- 前記神経学的障害が、慢性疼痛である、請求項24に記載のウイルス粒子の使用。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項31に記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項32に記載の細胞。
- ヒト胎児腎細胞である、請求項33に記載の細胞。
- 編集されたKv1.1カリウムチャネルをコードする操作されたKCNA1遺伝子を含む核酸であって、
前記操作されたKCNA1遺伝子が、
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は
配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列
を有する、
核酸。
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