JP6590828B2 - 発作の治療における、改変された受容体をコードするベクターとその外因性アゴニストの併用 - Google Patents
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Description
(a)前記患者に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化することにより、発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更、好ましくは抑制される工程と
を含む方法が提供される。
(a)前記哺乳動物に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、哺乳動物の脳内の前記ニューロンにおいて発現される工程と、
(b)前記哺乳動物に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることによりニューロンの興奮性が抑制される工程と
を含む方法が提供される。
(a)前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程と
を含む、改変された受容体をコードするベクター、および前記受容体に対する外因性アゴニストも提供する。
(a)前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程と
を含む、改変された受容体をコードするベクターも提供する。
(a)前記患者に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程と
を含む、外因性アゴニストも提供する。
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現され、
治療が、前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程
を含む、外因性アゴニストも提供する。
上記の通り、人工的なアゴニストによってのみ活性化されるように改変された受容体は、何年にもわたって当技術分野で公知であり、時には、DREADDまたはRASSLと称される。
本発明において使用するための好ましい受容体は、通常は脳に存在しない合成小分子に結合する改変されたGタンパク質共役型受容体(GPCR)である。
種々のベクターのいずれも、RASSL発現細胞を作製するために本発明に従って使用することができる。
本発明では、改変された受容体は、外因性アゴニストが存在することによって活性化される。外因性アゴニスト(またはリガンド、または小分子、この用語は、本明細書では互換的に使用される)は、経口的にまたは非経口的に(例えば全身投与)送達することができ、血液脳関門を透過するものである。リガンドは、一般には脳に存在しない、または改変された受容体を活性化しない十分に低い基底濃度で存在するという点で外因性である。
好ましい実施形態では、発作性障害は、てんかん、例えば、特発性てんかん、症候性てんかんおよび原因不明性てんかんである。本明細書に記載の方法は、てんかん原性の活動をクエンチまたは遮断するために使用することができる。当該方法は、それを必要とする患者の脳または神経組織における発作閾値を上昇させるため、または患者の脳細胞におけるてんかんバーストを低減させるために使用することができる。
大多数のてんかん患者は、てんかん原性病巣によって生じる活動拡散のステレオタイプのパターンを有する。したがって、本発明は、異常な活動が拡散する前にそれを抑止するため、またはその経過の初期に打ち切るために予防的に(例えば、30分前まで)適用することができる。さらに、発作は、多くの場合、群発するので、患者は、所望であれば、群発が開始した時にリガンドを摂取することができる。
「受容体−リガンド結合」、「リガンド結合」および「結合」とは、受容体(例えば、Gタンパク質共役型受容体)とリガンド(例えば、天然のリガンド、(例えば、ペプチドリガンド)または合成リガンド(例えば、合成小分子リガンド))との物理的な相互作用を意味するために本明細書では互換的に使用される。リガンド結合は、当技術分野で公知の種々の方法(例えば、放射標識したリガンドとの会合の検出)によって測定することができる。
本明細書において上記で考察した配列(添付の配列の配列番号1を参照されたい)に由来する機能的バリアントも同様に本発明において利用できることが当業者には理解されよう。
緒言および概要
DREADD(デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体)のウイルスによる発現を使用して、発作病巣におけるニューロン興奮性の局在化された抑止を実現するための複合化学遺伝学的手法を実証した。DREADDを用いて形質導入したニューロンは、原理上は選択的リガンドの非存在下では影響を受けず、形質導入されていないニューロンはリガンドが存在する場合にのみ影響を受け、それにより、それらの性質が恒久的に変更されることが回避される(10)。
Dr.Bryan Roth(University of North Carolina)から提供されたCamk2α−HA−hM4D(Gi)−IRES−mCitrineカセットを含有するアデノ随伴ウイルス血清型5を、UNC Vector Coreから、1ml当たり8×1012感染単位(IU)の濃度で得た。対照実験として、化学遺伝学的サイレンサーhM4Diの代わりに光遺伝学的サイレンサーArchTを発現する同様のウイルス(AAV5−Camk2α−ArchT−GFP)を注射した。
ピクロトキシンまたはピロカルピンによって誘発された中間周波数(IF)振動を、5〜14Hzの範囲の3秒EEGセグメントの高速フーリエ変換を使用することによって検出した(図1dも参照されたい)。3秒ウインドウを1秒工程のトレースに沿って移動させた。IF事象を、5〜14Hzの間のピークの大きさが、活動の全体的な強度に応じて閾値20〜45mVを超える期間と定義した。閾値をCNO/ビヒクル試験の各対応対内で一定に保った。
ピロカルピンに誘導される急性発作の化学遺伝学的サイレンシング
発作活動を改変するDREADDの能力を試験するために、Camk2aプロモーターの下にあるhM4Diをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV5−CaMKIIa−HA−hM4D(Gi)IRES−mCitrine)を、イソフルラン麻酔下にある263〜325gのラットの一次運動野(M1)の前肢領域に注射した。同時に、化学的けいれん薬の投与を可能にするためにテフロンカニューレガイド(Plastics l)を注射部位の上に埋め込み、無線EEG記録のためにM1を覆う活性なリードを伴う皮下トランスミッター(Open Source Instruments, Inc.)を埋め込んだ。トランスミッターによりEEGを512Hzで数週間にわたって継続的にサンプリングした(13)。hM4Diの発現(図4)には、挙動または肢の使用に対する注目すべき影響はなく、これを3〜20週間後に屠殺したすべてのラットについて蛍光顕微鏡によって確認した。
したがって、CNOにより、ピロカルピン誘発性発作が極めて大きく抑止された。しかし、この抗けいれん効果の解釈は、ムスカリン性受容体に対するピロカルピン作用およびhM4Diに対するCNO作用の下流のシグナル伝達カスケードの重複によって潜在的に交絡する(14)。したがって、第2の化学的けいれん薬、GABAA受容体遮断薬ピクロトキシンを試験した。一次運動野へのピクロトキシン注射(100〜600nl、10mM)によっても、電気記録および運動発作が誘導された。これらは、持続時間全体、棘徐波およびIF複合の構成、ならびにピロカルピンによって引き起こされる発作と行動の相関(図2a〜c)で同様であった。軽微な差異として、電気記録バーストは突然スイッチがオンおよびオフになり、「複合棘波」は高周波数で続く多数の(2〜6)棘波を特徴とすることもあった(図2b)。CNOを焦点性ピクロトキシンすぐ後に腹腔内注射によって投与すると、電気記録放電は再度減弱された(図2e、f;ラット5匹における12対の試験)。これは、より重症の運動発作と相関した(図2c)IF活動について特に顕著であった(図2f)。
したがって、CNOを用いたhM4Di活性化は2つの化学的けいれん薬モデルにおいて有効である。CNOを用いたhM4Di活性化により、確立されたてんかんにおける自発性発作も抑止されるであろうか。抗てんかん薬に対する応答が不十分であり、ヒト持続性部分てんかん(17)と類似した慢性てんかんの破傷風毒素モデル(15、16)に目を向けた。このモデルは、高周波数(120〜160Hz)パワーの増加、コーストライン(EEGにおける連続的な点の間の累積的な差異)の増加、および自動事象分類器によって検出することができる(7)高周波数EEG活動の短いバーストの出現を含めた、いくつかのEEG特徴を特徴とする(図3a)。(動物福祉を考慮して破傷風毒素の用量を制限したので、短期実験中に運動発作はめったに起こらなかった。)
この試験では、化学遺伝学を使用して、要望に応じて発作を減弱させることができることが示される。hM4Diを用いた形質導入は、その特異的なリガンドCNOの非存在下ではニューロン興奮性に対して影響を及ぼさず(10〜12)、したがって、この手法では、イオンチャネル、神経伝達物質受容体または神経ペプチドの恒久的な過剰発現を中心に設計された遺伝子療法の理論的なリスクが回避される。効果の持続時間は、ヒトでは7〜8時間であると推定されているCNOの半減期(21)によって規定されるので、その時間的な特異性は光遺伝学のものとは一致しない(参考文献(7〜9))。しかし、化学遺伝学では、発作病巣の近くの形質導入された脳領域に光を送達するための浸潤性の生体適合性デバイスの必要性が回避される。さらに、比較的大きな領域を標的とすることができ、これは光の吸収によって限定されない。代わりに、CNOは、全身投与することができる。
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27 Chen et al "The First Structure- Activity Relationship Studies for Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs". ACS Chem Neurosci. 2015 Jan 27
Claims (15)
- 発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体をコードするベクター、および前記受容体に対する外因性アゴニストを含み、
前記改変された受容体が、Giタンパク質を介してGタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル(GIRK)と共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M 4 であり、前記受容体が(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)前記外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
治療が、
(a)前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現される、工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される、工程と
を含む、医薬組成物。 - 発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体をコードするベクターを含み、
前記改変された受容体が、Giタンパク質を介してGタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル(GIRK)と共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M 4 であり、前記受容体が(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
治療が、
(a)前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現される、工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される、工程と
を含む、医薬組成物。 - 発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体に対する外因性アゴニストを含み、
前記改変された受容体が、Giタンパク質を介してGタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル(GIRK)と共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M 4 であり、前記受容体が(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)前記外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
治療が、
(a)前記患者に、前記改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現される、工程と、
(b)前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される、工程と
を含む、医薬組成物。 - 発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体に対する外因性アゴニストを含み、
前記改変された受容体が、Giタンパク質を介してGタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル(GIRK)と共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M 4 であり、前記受容体が(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)前記外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
前記患者が、前記改変された受容体をコードするベクターを予め投与されており、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現され、
前記治療が、前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される工程を含む、医薬組成物。 - 前記外因性アゴニストが、てんかん発作が前記患者に起きる前30分以内またはてんかん発作が起きた後24時間以内に投与される、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記外因性アゴニストが、(i)自動発作検出機構と共役したデバイスによって、または(ii)EEG分析によって予測される発作に応答して、自動的に投与される、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- トランスジェニック哺乳動物の脳内のニューロンの興奮性を領域特異的かつ時間特異的に選択的に抑制するための方法であって、前記トランスジェニック哺乳動物が非ヒトの疾患モデルであり、
(a)前記哺乳動物に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、Giタンパク質を介してGタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル(GIRK)と共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体M 4 であり、前記受容体が(i)その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、(ii)外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、前記改変された受容体が、前記哺乳動物の脳内の興奮性ニューロンにおいて発現されるように、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされる、工程と、
(b)前記哺乳動物に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が抑制される、工程と
を含む方法。 - 前記改変されたGPCRが、少なくとも113位および/または203位における改変を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記改変されたGPCRが、Y113C/A203G改変を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項1から6及び8から9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなるリストから選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
- 前記神経細胞型に特異的なプロモーターがCaMk2Aプロモーターである、請求項1から6及び8から11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記外因性アゴニストが、合成分子またはその代謝産物であり、100〜1000Daの間の分子量を有する、請求項1から6及び8から12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記外因性アゴニストが、クロザピン−N−オキシドであり、または、
前記外因性アゴニストが、ペルラピンである、請求項1から6及び8から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記クロザピン−N−オキシドが、クロザピンとして投与される、請求項14に記載の医薬組成物。
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