KR20240007846A - Ｒｅｅｌｉｎ을 발현하는 신경세포의 대량생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 전분화능을 갖는 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리한 후, 신경세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법, HES1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물, 상기 본 발명의 방법으로 생산된 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포, 상기 신경세포를 유효성분으로 포함하는 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 및 상기 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포에 신경질환의 치료 후보 약물을 처리한 후, 상기 세포에서 Reelin의 발현 또는 활성 수준을 분석하는 단계를 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법 및 상기 방법으로 생산된 Reelin을 발현하는 신경세포의 용도에 관한 것이다.
Reelin은 세포-세포 상호작용을 제어하여 발달 중인 뇌에서 신경 이동 및 위치 결정 과정을 조절하는데 도움이 되는 세포외 기질 당단백질이다.
Reelin을 발현하는 양성세포는 뇌의 CA1 층 소강 및 문에서 가장 많은 수로 발견되므로, 그들은 학습 및 기억, 및 신경발생, 각각에서 영향을 미치는 주요한 위치에 있다. 실제로 Reelin은 시냅스 가소성 및 학습 및 기억을 향상시키며, 신생 성체 뉴런의 이주를 변경하는 것으로 알려져 있다. 해마에서 세포외 Reelin은 층 소강에서 축적되며 이는 그것을 CA1에서 시냅스 활성에 영향을 미치는 주요 위치에 있도록 한다.
한편, 이러한 Reelin이 결핍되거나 유전자 이상이 발생하면 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증 및 알츠하이머병을 포함하는 다수의 신경장애 질환을 야기할 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, CR 세포는 발달 중인 뇌에서 Reelin의 주요 공급원 역할을 하는 반면, 성인 뇌의 Reelin은 GABA성 개재뉴런의 하위 집단에 의해 생성되며, 이는 Reelin이 발달 중인 뇌와 성인 뇌에서 차등적인 기능을 가질 수 있음을 의미한다. 또한 발달 중인 뇌에서 Reelin은 피질층의 형성뿐만 아니라 신경 이동 및 신호 전달 경로에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, RELN의 돌연변이는 정신분열증 및 자폐증과 같은 신경정신병적 장애를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
따라서 Reelin을 발현하는 신경세포를 생산할 수 있다면 상기와 같이 Reelin의 결핍 또는 기능 이상에 의해 유도되는 신경질환을 효과적으로 치료할 수 있는 세포치료제를 제공할 수 있고, 나아가 새로운 약물을 효과적으로 스크리닝할 수 있을 것으로 기대한다.
그러나 아직까지 Reelin을 발현하는 신경세포를 대량 생산할 수 있는 방법에 대해서는 연구가 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은 Reelin을 발현하는 신경세포를 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 인간유도만능줄기세포를 신경세포로의 분화 초기에 HES1 유전자의 발현을 억제시킨 결과, Reelin을 발현하는 분화된 신경세포가 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
그러므로 본 발명의 목적은 전분화능을 갖는 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리한 후, 신경세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 HES1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 생산된 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포에 신경질환의 치료 후보 약물을 처리한 후, 상기 세포에서 Reelin의 발현 또는 활성 수준을 분석하는 단계를 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전분화능을 갖는 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리한 후, 신경세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HES1 유전자는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HES1 유전자 발현 억제제는 HES1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 microRNA일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 11의 염기서열 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HES1에 대한 shRNA일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC) 또는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 신경세포로의 분화 초기에 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 대량 얻을 수 있는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 HES1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HES1 유전자는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HES1 유전자 발현 억제제는 HES1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 microRNA일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 11의 염기서열 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HES1에 대한 shRNA일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환은 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증, 알츠하이머병 또는 정신분열증일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포에 신경질환의 치료 후보 약물을 처리한 후, 상기 세포에서 Reelin의 발현 또는 활성 수준을 분석하는 단계를 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보 약물 처리 시, Reelin의 발현 또는 활성이 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 후보 약물을 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환을 치료할 수 있는 약물로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환은 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증, 알츠하이머병 또는 정신분열증일 수 있다.
본 발명에 따른 HES1 유전자 발현 억제에 따른 Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법은 전분화능을 갖는 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리하고 신경세포로 분화를 유도하는 경우, 신경세포 분화 초기에 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 대량 생산할 수 있는 효과가 있으므로, 본 발명의 방법으로 생산된 Reelin 발현 신경세포는 Reelin의 결핍 또는 기능 이상으로 발병하는 다양한 신경질환에 대한 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있으며, 나아가 Reelin의 결핍 또는 기능 이상으로 발병하는 신경질환의 새로운 치료제를 스크리닝하는 세포 시스템으로도 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 HES1 유전자의 발현을 억제할 수 있는 후보 shRNA 디자인을 위한 타겟 부위의 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 렌티바이러스를 이용하여 HES1 shRNA을 HEK293T 세포주에 처리한 후, HES1 발현 억제 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(a) 및 HES1 단백질의 발현수준을 그래프로 나타낸 결과(b)이며, 전분화능을 갖는 IMR90 및 253G1 hiPSC 세포주에 HES1 shRNA인 sh3(KD1) 및 sh4(KD2)을 처리한 후, HES1 유전자의 발현수준을 RT-PCR로 분석한 정량값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)를 제조하기 위한 다단계 전기천공(EP) 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)의 구성을 나타낸 것이며 화살표는 이형접합 녹인(KI)을 PCR로 확인하기 위한 프라이머를 나타낸 것이다(a: TUBB3-CRISPR-confirm-F1 및 TUBB3-CRISPR-confirm-R2, b: NGN2-genome-F1 및 NGN2-CRISPR-confirm-R3 (표 3 참조)).
도 5는 본 발명에 따른 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)를 신경세포로 분화 유도 하면서 그리드 배양접시의 동일한 위치에서 신경세포로의 분화 중 연속 촬영한 세포 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 HES1 shRNA가 각각 처리된 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포 및 HES1 shRNA를 처리하지 않은 대조군을 대상으로 신경세포로의 분화 유도 시간에 따른 HES1의 발현수준을 qRT-PCR로 분석한 결과이고(a), 배양접시의 동일 위치에서 G+ 및 R+ 세포에 대한 순차적 이미지를 나타낸 것이고(b), (c)는 (b)의 각 형광표지자의 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 HES1 유전자 발현 억제에 따른 분화된 신경세포의 이동을 분석한 결과 및 Reelin 발현을 나타내는 신경세포를 확인한 결과로서, a는 TBR1+/RELN-(화살표) 및 RELN+/TBR1-(화살촉)을 보이는 이동하는 G+ 세포에 대한 연속적 추적 이미지를 나타낸 것이고, b는 TBR1+/RELN- 및 RELN+ 세포에 대한 이동 매개변수의 통계적 분석을 나타낸 것이며, c는 HES1 유전자 발현 억제 시 신경세포 분화 과정에서(ND8, 11, 13)에서 단위 면적당 G+ 세포수를 비교 분석한 결과이며, d는 c의 세포에서 TBR1+ 및 Reelin+ 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 렌티바이러스를 이용하여 HES1 shRNA을 HEK293T 세포주에 처리한 후, HES1 발현 억제 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과(a) 및 HES1 단백질의 발현수준을 그래프로 나타낸 결과(b)이며, 전분화능을 갖는 IMR90 및 253G1 hiPSC 세포주에 HES1 shRNA인 sh3(KD1) 및 sh4(KD2)을 처리한 후, HES1 유전자의 발현수준을 RT-PCR로 분석한 정량값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)를 제조하기 위한 다단계 전기천공(EP) 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)의 구성을 나타낸 것이며 화살표는 이형접합 녹인(KI)을 PCR로 확인하기 위한 프라이머를 나타낸 것이다(a: TUBB3-CRISPR-confirm-F1 및 TUBB3-CRISPR-confirm-R2, b: NGN2-genome-F1 및 NGN2-CRISPR-confirm-R3 (표 3 참조)).
도 5는 본 발명에 따른 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)를 신경세포로 분화 유도 하면서 그리드 배양접시의 동일한 위치에서 신경세포로의 분화 중 연속 촬영한 세포 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 HES1 shRNA가 각각 처리된 이중 리포터가 도입된 인간 유도만능 줄기세포 및 HES1 shRNA를 처리하지 않은 대조군을 대상으로 신경세포로의 분화 유도 시간에 따른 HES1의 발현수준을 qRT-PCR로 분석한 결과이고(a), 배양접시의 동일 위치에서 G+ 및 R+ 세포에 대한 순차적 이미지를 나타낸 것이고(b), (c)는 (b)의 각 형광표지자의 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 HES1 유전자 발현 억제에 따른 분화된 신경세포의 이동을 분석한 결과 및 Reelin 발현을 나타내는 신경세포를 확인한 결과로서, a는 TBR1+/RELN-(화살표) 및 RELN+/TBR1-(화살촉)을 보이는 이동하는 G+ 세포에 대한 연속적 추적 이미지를 나타낸 것이고, b는 TBR1+/RELN- 및 RELN+ 세포에 대한 이동 매개변수의 통계적 분석을 나타낸 것이며, c는 HES1 유전자 발현 억제 시 신경세포 분화 과정에서(ND8, 11, 13)에서 단위 면적당 G+ 세포수를 비교 분석한 결과이며, d는 c의 세포에서 TBR1+ 및 Reelin+ 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 Reelin을 발현하는 신경세포를 대량 생산할 수 있는 방법을 제공함에 특징이 있다.
앞서 기술한 바와 같이, Reelin은 뇌의 피질층 형성뿐만 아니라 신경 이동 및 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, Reelin이 결핍되거나 기능 이상이 발생하면 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증 및 알츠하이머병을 포함하는 다양한 신경장애 질환이 발병한다.
따라서 Reelin을 발현하는 신경세포를 다수 확보할 수 있다면 상기와 같은 신경장애 질환, 즉 신경질환의 치료 또는 치료제를 발굴하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
이에 본 발명자들은 Reelin을 발현하는 신경세포를 대량 생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 전분화능을 갖는 줄기세포에서 HES1 유전자의 발현을 억제시킨 후, 신경세포로의 분화를 유도한 경우, Reelin을 발현하는 신경세포를 빠른 시간 안에 대량으로 얻을 수 있음을 확인하였다.
전사인자인 HES1(Hairy and enhancer of split)은 7개의 HES 패밀리 유전자 중 하나로서, 핵 단백질을 암호화하며 전사를 억제하는 것으로 알려져 있다. HES1 단백질은 표준 인핸서 박스(E-box)가 아닌 N-박스 프로모터 영역에 결합하는 헬릭스 방해 단백질을 포함하는 특정 유형의 기본 도메인을 가지고 있으며, 배발생에서 세포 증식 및 분화에 영향을 미치는 전사 억제인자로 알려져 있다.
한편, HES1 유전자를 억제할 경우, 신경세포 분화 과정에서 Reelin을 발현하는 신경세포를 대량 얻을 수 있다는 내용에 대해서는 지금까지 전혀 알려진 바가 없다.
이와 관련하여 본 발명의 일실시예에서는, 전분화능을 갖는 이중 리포터가 표지된 인간 유도만능 줄기세포를 HES1 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염시켜 HES1 유전자의 발현을 억제시킨 후, 신경세포로 분화를 유도한 결과, 신경세포 분화 초기 단계에서 Reelin을 발현하는 신경세포를 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 전분화능을 갖는 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리한 후, 신경세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법을 제공할 수 있다.
여기서 상기 HES1 유전자는 NCBI gene bank에서 NM_005524 human HES1으로 등재된 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 HES1 유전자 발현 억제제는 HES1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 microRNA일 수 있다. 또한 HES1 단백질을 구성하는 아미노산 서열은 서열번호 15에 나타내었다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, HES1 유전자 발현 억제제로서, HES1 유전자의 다양한 타겟 부위에서 유전자 발현을 억제할 수 있도록 다수의 shRNA를 디자인하여 제조하였고, 제조한 각 shRNA를 HEK 293T 세포에 도입하여 HES1 유전자의 발현 억제 수준을 분석하였는데, 제조한 모든 shRNA가 HES1 유전자를 억제할 수 있는 것은 아닌 것으로 확인되었다.
따라서 shRNA를 이용하여 HES1 유전자 발현 억제를 유도하는 경우에는, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 shRNA 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 shRNA을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 무한 증식(자가재생산능; self-renewal)을 할 수 있고, 개체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 특성을 가진 세포로서, 배아줄기세포(embryonic stem cell), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 등을 포함한다.
인간 전분화능 줄기세포는 인간 초기 배아의 배반포(blastocyst)나 상배엽(epiblast) 등에서 미분화 상태로 존재하는 인간 배아줄기세포 및 분화가 끝난 인간 세포, 예를 들어 생식세포, 체세포 또는 전구세포 등을 역분화시켜 전분화능을 가지도록 한 인간 유도만능줄기세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 인간 유도만능 줄기세포에 유전자 편집기술인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 형광 단백질인 EGFP가 표지된 신경전구세포 특이 유전자인 NGN2 및 형광 단백질인 TagRFP가 표지된 신경세포(뉴런) 특이 유전자인 TUBB3를 녹인(knock-in)시킨 인간 유도만능 줄기세포를 이용하였다.
본 발명에서 사용한 2개의 리포터 형광 단백질을 발현하는 이중 리포터 인간 유도만능 줄기세포의 제조는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
구체적으로, 인간 유도만능 줄기세포에 유전자 편집기술인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 신경전구세포 특이 유전자인 NGN2 및 신경세포(뉴런) 특이 유전자인 TUBB3를 녹인(knock-in) 시켰으며, 이때 상기 NGN2에는 형광 단백질인 TagRFP를 표지하였고, 상기 TUBB3에는 다른 형광 단백질인 EGFP를 표지하였다.
따라서 각 유전자에 표지된 형광 단백질의 발현에 따른 형광 분석을 통해, 인간 유도만능 줄기세포로부터 신경세포로의 분화 과정을 각 단계별로 시각적으로 확인할 수 있고, 나아가 신경세포의 이동 과정도 시각적으로 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 이중 리포터 인간 유도만능 줄기세포의 제조방법은 다음과 같이 4차에 걸친 전기천공을 통해 제조할 수 있는데, 바람직하게는, (1) TUBB3 유전자의 5’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열, P2A 염기서열, 형광단백질 EGFP를 코딩하는 염기서열 및 TUBB3 유전자의 3’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열이 플록스화된(floxed) EF1a-Puro 카세트가 있는 pENTR-DMD-도너 벡터로 삽입된 도너 DNA 벡터; Cas9 발현 벡터; 및 sgRNA 발현 벡터;를 전기천공으로 인간 유도만능 줄기세포에 형질감염시키는 단계(1차 전기천공); (2) CAG-Cre 및 CAG-RFP를 전기천공으로 상기 (1) 단계의 형질감염된 인간 유도만능 줄기세포에 도입하여 Cre 재조합에 의해 플록스화된(floxed) EF1a-Puro 카세트를 제거하는 단계(2차 전기천공); (3) NGN2 유전자의 5’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열, P2A 염기서열, 형광단백질 TagRFP를 코딩하는 염기서열 및 NGN2 유전자의 3’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열이 플록스화된(floxed) EF1a-Puro 카세트가 있는 pENTR-DMD-도너 벡터로 삽입된 도너 DNA 벡터; Cas9 발현 벡터; 및 sgRNA 발현 벡터;를 전기천공으로 상기 (2)단계의 플록스화된(floxed) EF1a-Puro 카세트가 제거된 인간 유도만능 줄기세포에 형질감염시키는 단계(3차 전기천공); 및 (4) CAG-Cre 및 CAG-RFP를 전기천공으로 상기 (3) 단계의 형질감염된 인간 유도만능 줄기세포에 도입하여 Cre 재조합에 의해 플록스화된(floxed) EF1a-Puro 카세트를 제거하는 단계(4차 전기천공);를 포함하며, 이때 상기 P2A 및 EGFP가 연결된 염기서열은 TUBB3 유전자의 정지코돈(stop codon) 앞에 위치되도록 삽입되고, 상기 P2A 및 TagRFP가 연결된 염기서열은 NGN2 유전자의 정지코돈(stop codon) 앞에 위치되도록 삽입되도록 한다.
상기에서 TUBB3 유전자의 5’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 P2A 염기서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 형광단백질 EGFP를 코딩하는 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이며, 상기 TUBB3 유전자의 3’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 Cre 재조합 효소 인식부위인 loxP 염기서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 2차 천공에 의해 인간 유도만능 줄기세포에 녹인된 TUBB3 유전자의 5’ 상동성 암(arm), P2A, 형광단백질 EGFP, loxP 및 TUBB3 유전자의 3’ 상동성 암(arm)이 순차적으로 연결된 염기서열은 서열번호 9의 염기서열로 나타내었다.
또한 상기에서 NGN2 유전자의 5’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고, P2A 염기서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 형광단백질 TagRFP를 코딩하는 염기서열은 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것이며, NGN2 유전자의 3’ 상동성 암(arm)을 코딩하는 염기서열은 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것이고, Cre 재조합 효소 인식부위인 loxP 염기서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 4차 천공에 의해 인간 유도만능 줄기세포에 녹인된 NGN2 유전자의 5’ 상동성 암(arm), P2A, 형광단백질 TagRFP, loxP 및 NGN2 유전자의 3’ 상동성 암(arm)이 순차적으로 연결된 염기서열은 서열번호 10의 염기서열로 나타내었다.
본 발명에서 상기 인간 신경세포 분화 및 이동을 분석하기 위한 마커 유전자로서, NGN2 및 TUBB3 유전자를 선택하여 사용하였는데, 상기 NGN2 유전자는 외배엽 세포의 신경세포 운명을 지정할 수 있는 신경 특이적 기본 나선 고리 나선(bHLH) 전사 인자를 암호화하고 발달 중인 중추 및 말초 신경계 내의 신경 전구 세포에서 발현되는 특징이 있고, 포유동물 뇌의 신경전구세포에서 특이적 발현을 보일 뿐만 아니라 다른 세포 유형에서 과발현될 때 신경 운명을 유도하는 강력한 재프로그래밍 기능을 가지고 있다. 이에 본 발명에서는 줄기세포로부터 신경세포로의 분화 과정에서 신경전구세포의 특성을 확인하기 위한 용도로 NGN2 유전자를 인간 유도만능 줄기세포에 녹인시켰고, 이때 NGN2 유전자의 발현 확인을 시각적으로 확인하기 위하여 형광 표지자로서 TagRFP 유전자를 표지시켰다.
또한, 상기 TUBB3 유전자는 베타 튜불린 단백질 패밀리의 클래스 III 구성원을 인코딩하는 유전자로서, 베타 튜불린은 이종이량체화되고 미세소관을 형성하기 위해 조립되는 두 가지 핵심 단백질 패밀리(알파 및 베타 튜불린) 중 하나이다. TUBB3 단백질은 주로 뉴런에서 발현되며 신경발생 및 축삭 유도와 유지에 관여하는 것으로 알려져 있고, 유사분열 또는 세포분화 후 뉴런의 마커로 사용할 수 있다. 이에 본 발명에서는 줄기세포로부터 신경세포로의 분화 과정에서 분화된 신경세포의 특성을 확인하기 위한 마커로서 TUBB3 유전자를 인간 유도만능 줄기세포에 녹인시켰고, 이때 NGN2 유전자의 발현 확인을 시각적으로 확인하기 위하여 형광 표지자로서 EGFP 유전자를 표지시켰다.
본 발명에 따른 이중 리포터 인간 유도만능 줄기세포(dual-reporter hiPSCs)의 제조는 크리스퍼-카스9(CRISPR-CAS9) 유전자 가위 및 Cre 재조합 반응을 다단계 전기천공을 통해 수행하였다.
본 발명에 있어서, 상기 신경전구세포 또는 신경세포의 마커 유전자 및 형광 단백질 유전자 서열의 인간 유도만능 줄기세포로의 삽입은 크리스퍼-카스9(CRISPR-CAS9) 유전자 가위를 이용하는 것을 포함하며, 이를 통해 5'에서 3' 방향으로 상기 마커 유전자 서열, 자가 절단 펩티드 P2A의 염기서열 및 형광단백질 유전자 서열을 포함하는 삽입서열이 상동 의존성 복구(Homology dependent repair) 또는 비상동 말단 연결 매개 녹인(non-homologous end joining mediated knock-in) 기작 등을 통해 인간 유도만능 줄기세포의 게놈 내 타겟 부위로 삽입될 수 있으며, 상기 삽입 서열의 구조가 이것으로 한정되는 것은 아니다.
상기 "유전자 가위"는 하나 이상(예컨대, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 게놈 내 상기 삽입 서열이 녹인(Konck-in)될 타겟의 특정 핵산서열(표적 서열)을 인식하여 소정의 부위를 절단하는 기능적 단위체를 의미하는 것으로, 표적 특이적 엔도뉴클레아제 시스템으로도 불리우며, (i) 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 (ii) 특정 표적 핵산 서열을 인식하는 핵산 분자(DNA 또는 RNA) 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 포함할 수 있다.
또한 상기 엔도뉴클레아제는 단일가닥 및/또는 이중가닥의 특정 유전자 부위를 절단하는 활성을 가지며, 특정 표적 핵산 서열을 인식하는 핵산 분자와 함께 작용하여 특정 표적 유전자 서열을 절단할 수 있는 모든 표적 특이적 엔도뉴클레아제들 중에서 선택될 수 있다. 예컨대, 본 발명에서는 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RNA-guided endonuclease, RGEN; 예컨대, Cas 단백질 (예컨대, Cas9 등), Cpf1, 등)을 사용하였다.
또한 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는 원핵 세포, 및/또는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포 (예컨대, 진핵세포)의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 단일나선 절단 (nick) 또는 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킬 수 있다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라, 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 생성시킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동재조합(homologous recombination) 또는 비상동 재접합(non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선될 수 있는데, 이 과정에 목적하는 변이(유전자 전부 또는 일부의 치환, 결실, 삽입 등)를 표적 위치에 도입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적특이적 엔도뉴클레아제는 CRISPR에서 유래한 RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RGEN)일 수 있다. 이 경우, 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제 시스템은, (1) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 (2) 표적 핵산 서열과 혼성화 가능한 (또는 상보적 핵산 서열을 갖는) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 것일 수 있다.
또한, "가이드 RNA (guide RNA)"는 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제를 유전체 DNA의 특정 표적 부위로 안내하는 역할을 하는데, 앞서 설명한 게놈 내 타겟 부위의 특정 핵산 서열 (이하, 표적 핵산 서열 또는 표적서열)에 혼성화 가능한 표적화 서열을 포함하는 RNA를 의미하며, 생체 외 (in vitro) 또는 생체 (또는 세포) 내에서 Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 RNA-가이드 엔도뉴클레아제와 결합하여 이를 목적 유전자 (또는 목적 유전자 내의 표적 부위)로 인도하는 역할을 한다. 상기 가이드 RNA는 RNA 형태 또는 이를 암호화하는 DNA 형태로 엔도뉴클레아제와 결합되거나 (리보핵산단백질 (RNP) 형태), 결합되지 않은 상태로 숙주 세포에 도입될 수 있다.
또한, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA는 생체(세포) 외에서 결합되어 리보핵산-단백질 복합체를 형성(RNA-Guided Engineered Nuclease)하여 리보핵산 단백질(RNP) 형태로 세포 내에 도입되거나, 이들의 암호화 핵산분자 또는 DNA가 각각 별개의 플라스미드 또는 함께 하나의 플라스미드를 통하여 세포 내로 도입된 후 발현되어 세포 내에서 리보핵산 단백질을 형성하여 작용할 수 있다.
상기 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성할 수 있는 단백질이다.
또한 상기 방법에서 본 발명자들은 Cre 재조합(cre-loxP 시스템)을 이용하여 플록스화된(floxed) EF1a-Puro 카세트를 제거하는 단계를 수행하였다.
Cre는 Cre 재조합 효소를 의미하며, LoxP 염기서열을 인식하여 재조합을 일으키는 효소로서, Cre는 LoxP 사이에 특정 유전자가 삽입된 구조체에 작용하여 LoxP 사이의 특정 유전자를 제거할 수 있다.
본 발명자들은 형광 표지된 NGN2 및 TUBB3 유전자 서열의 인간 유도만능 줄기세포 게놈 내로의 적절한 타겟 부위로서, 형광 표지된 NGN2(NEUROG2) 유전자 서열은 형광 리포터 단백질인 TagRFP를 코딩하는 염기서열과 NGN2 유전자 서열이 융합된 형태로 인간 유도만능 줄기세포의 4번 염색체로 녹인시켰고, 또한 형광 표지된 TUBB3(Tubulin β-III) 유전자 서열은 형광 리포터 단백질인 EGFP를 코딩하는 염기서열과 TUBB3 유전자 서열이 융합된 형태로 인간 유도만능 줄기세포의 16번 염색체로 녹인시켰다.
또한 본 발명에서 형광 표지된 NGN2 및 TUBB3 유전자 서열의 녹인 대상이 되는 인간 유도만능 줄기세포는 삼배엽층(three germ layers)으로의 전분화능 및 신경계통 분화 효율이 우수한 것으로 알려진 인간 유도만능 줄기세포인 RPChiPS771 세포주를 사용하였다.
상기 기술된 방법을 통해 본 발명자들은 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 리포터가 표지된 인간 유도만능 줄기세포를 수득할 수 있었고, 이렇게 제조된 이중 리포터가 표지된 인간 유도만능 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리하여 HES1 유전자를 넉다운 시킨 후, 신경세포의 분화를 유도하여 Reelin을 발현하는 신경세포를 대량 생산할 수 있었다.
특히, 본 발명에서는 신경세포로의 분화 초기에 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 대량 얻을 수 있음을 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, HES1 유전자 발현을 억제시킨 이중 리포터 인간 유도만능 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하면서 시간 별 Reelin 발현 양성을 나타내는 세포수를 분석한 결과, 분화 초기인 ND 8일째가 ND 11 및 ND 13일에 비해 Reelin 발현 양성을 보이는 분화된 신경세포가 훨씬 많은 것으로 나타났다.
또한 본 발명은 HES1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 억제제로는 이에 제한되지는 않으나, HES1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 microRNA일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 11의 염기서열 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HES1에 대한 shRNA일 수 있다.
상기 억제제가 shRNA인 경우, 상기 shRNA는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터 모두 사용 가능하다.
바이러스 운반 메카니즘은 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 렌티바이러스 시스템을 이용하였다.
비-바이러스성 운반 메카니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙틴, 양이온성 표면 양친매물질 및 이의 조합물을 포함할 수 있다.
HES1 발현을 억제하는 shRNA는 벡터 내에 포함된 형태로 전달된 세포에서 적절히 전사되기 위하여 적어도 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 프로모터는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든지 무방하다. 또한, HES1 발현을 억제하는 shRNA의 효율적인 전사를 위하여 필요에 따라 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer), 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자를 비롯한 조절서열을 추가로 포함할 수도 있다.
상기 "작동 가능하게 연결된"이란 핵산 서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 임의의 핵산서열이 작동 가능하게 연결된 경우는 임의의 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 본 발명에 있어서, 임의의 전사 조절서열이 shRNA의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 전사 조절서열이 상기 shRNA와 작동 가능하게 연결되어 있다고 말한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 제공할 수 있으며, 나아가 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공할 수 있다.
상기 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환은 이에 제한되는 것으로 아니나, 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증, 알츠하이머병 또는 정신분열증을 포함할 수 있다.
상기 "세포치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.
본 발명의 세포치료제를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서의 세포치료제 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다.
“치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)”은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포는 체중 kg당 1×106 내지 5×107 세포수의 세포치료제가 포함될 수 있다.
나아가 본 발명은 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포에 신경질환의 치료 후보 약물을 처리한 후, 상기 세포에서 Reelin의 발현 또는 활성 수준을 분석하는 단계를 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 후보 약물 처리 시, Reelin의 발현 또는 활성이 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 후보 약물을 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환을 치료할 수 있는 약물로 판정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험방법 및 재료>
인간 유도만능 줄기세포주(hiPSC)
본 실험에서 사용된 hiPSC 세포주(RPChiPS771, ReproCELL, Japan)는 이전 Iwashita et al., 에 의해 2019에 보고된 세포주를 사용하였다. 즉, 본 발명에서 사용한 hiPSC는 자가 복제 RNA 재프로그래밍 방법으로 제조된 것으로, 상기 hiPSC는 기존의 다른 hiPSC 계통(1231A3, 1383D2, 1383D6, CiRA, Kyoto University)에 비해 삼배엽층(three germ layers)으로의 전분화능 및 신경계통 분화 효율이 더 우수하다는 것을 qRT-PCR로 확인되었다.
신경분화(Neural differentiation)
hiPSC의 증식(expansion) 및 신경세포로의 분화는 이전에 알려진 방법(Espuny-Camacho et al., 2013)에서 일부 수정한 방법으로 진행하였다. 구체적으로, hiPSC는 Vitronectin XF(Stemcell Technologies, 07180, Canada)로 코팅된 멀티 웰 플레이트에서 StemFit Basic 04 배지(Ajinomoto, AJ200B, 일본)로 배양하였다. 신경세포로의 분화를 위해, 세포를 Y-27632(ROCK 억제제; 10μM)를 포함하는 StemFit Basic 04 배지를 이용하여 Vitronectin XF가 코팅된 6웰 플레이트에 6.0 x 104개(세포/웰) 세포수로 신경분화 유도 이틀 전에 분주하고 배양하였다. 신경 세포분화 유도 시작일("ND 0"로 정의)에, 배지를 N2(R&D Systems, AR009, USA), B27(Gibco, 17054-044, USA) 및 Noggin(ND 0~16, 100 ng/ml, R&D Systems, 6057-NG-100, USA)이 보충된 신경 분화 배지로 교체하였고, 2일마다 배지를 교체하였다. ND 4일째 또는 5일째에 세포를 0.5mM EDTA(Invitrogen, 15575-038, USA)로 희석한 TrypLE Select CTS(Gibco, A12859-01, USA)를 사용하여 6 웰 플레이트에 2.0 x 105개 세포/웰의 세포밀도로 분주하였다. 배지는 2일마다 교체하였고, Y-27632는 2일 동안 배지에 포함되도록 하였으며, noggin은 ND 16일까지 첨가되도록 하였다. DAPT는 ND 11일째에 5 μM의 농도로 배지에 첨가하였다. hiPSC에서의 해당 유전자의 발현 분석은 하기 표 1의 프라이머 세트를 사용하여 qRT-PCR로 분석하였다.
KI(Knock-In) 구조물 제조를 위한 클로닝
CRISPR RGEN 방법(Bae et al., 2014)을 이용하여 NGN2 또는 TUBB3 코딩 서열의 종결코돈 근처에 있는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 타겟 부위의 후보를 찾고 분석하는데 사용하였다. TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP KI 구조물을 위한 타겟 부위로 3개 및 5개의 표적부위가 각각 선택되었고, TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP의 제조를 위해 사용된 sgRNA 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
DNA-코딩 sgRNA 서열을 발현벡터 내로 클로닝하기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드(sgRNA 표적 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 sgRNA 스캐폴드 sgRNA를 포함하는 역방향 프라이머)를 공지된 방법(Li et al., 2016)에 따라 디자인하였다. 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후, PCR 단편을 pHL-H1-ccdB-mEF1α-RiH(Addgene ID: 60601)에 클로닝하였다. 여기서 TUBB3 녹인을 위한 sgRNA 염기서열은 상기 표의 G4를 사용하였고, NGN2 녹인을 위한 sgRNA 염기서열은 상기 표의 T1 및 T5를 각각 사용하였다.
도너 DNA 구조물을 위해, P2A-TagRFP, P2A-EGFP, NGN2 및 TUBB3 유전자의 5' 및 3' 상동성 암(arm) 유전자를 야생형 hiPSC 유래 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 수득하였고, In-Fusion 시스템(Takara, 639648 Japan)을 이용하여 floxed EF1a-Puro 카세트가 있는 pENTR-DMD-도너 벡터(Addgene ID:60605)로 라이게이션하였다. P2A-TagRFP 및 P2A-EGFP 카세트는 NGN2 또는 TUBB3 유전자의 코딩서열에서 정지코돈 바로 앞에 삽입되도록 하였다. KI(Knock-In) 구조물 제조에 사용된 프라이머 및 벡터는 하기 표 3에 나타내었다.
전기천공법(Electroporation; EP)
이중 리포터 세포주 제조를 위해, DNA 구조물을 hiPSC 세포로 순차적으로 전기천공(EP) 하였다(도 3). 1번째 과정(1ST EP)을 통해 TUBB3EGFP KI 세포를 확립하였다. Cas9 발현 플라스미드(Addgene ID: 60599)(Li et al., 2016), sgRNA 발현 및 도너 플라스미드는 이전에 설명한 조건(전압 125V의 전압 및 5ms의 전기천공 펄스 폭)에서 NEPA21 전기천공기(Nepagene, Japan)를 사용하여 1.0 x 106 hiPSC로 공동 형질감염시켰다. EP 수행 후, 세포의 아팝토시스 방지를 위해 Y-27632를 함유하는 배지로 옮겼다. 도너 DNA 서열을 보유하는 세포의 선택을 위해 퓨로마이신(Sigma, P9620, USA, 배지 중 250ng/ml)을 EP 후 2 내지 5일 투여하였다. 계대배양 후, 작은 콜로니가 형성될 때까지 저밀도 세포배양(6-웰 접시에 웰에 300개 세포수)을 수행하였고, 단일 콜로니를 24웰 플레이트로 옮겼다. 세포 증식(확장) 후, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 유전자형 분석을 통해 KI 후보 클론을 선택하였다. 이후 2번째 과정(2nd EP)으로 CAG-Cre 및 CAG-RFP(Shitamukai et al., 2011)을 이용하여 Cre 재조합에 의해 플록스화된 퓨로마이신 카세트를 제거하였다. 저밀도 세포 배양 후, 프라이머 세트를 이용한 유전형 분석으로 Cre 플라스미드 기능에 의해 퓨로마이신 카세트가 제거된 RFP 양성 클론을 선택하였다. 그런 뒤, 3번째 과정(3rd EP)을 수행하였는데, 즉 sgRNA 및 도너 DNA 서열로 상기 기술된 첫 번째 과정을 수행하여 NGN2TagRFP KI 세포를 제조하였다. 2개의 독립적인 클론(T1 및 T5)은 4개의 클론을 대상으로 신경세포 유도 후 선택되었고, 다음으로 4번째 과정(4th EP)을 수행하였는데, Cre 플라스미드에 의해 퓨로마이신 카세트를 제거하였다. 모든 클론은 이형접합의(heterozygous) KI 세포였고, 특정 프라이머 세트를 사용하여 해당 게놈 유전자좌를 시퀀싱하여 성공적인 게놈 편집을 확인하였다. 또한 핵형(karyotypes)의 확인은 Samkwang Medical Laboratory(대한민국)에서 수행하였다.
면역염색법(Immunostaining)
커버 유리에서 배양된 세포를 4% PFA로 10분 동안 고정시켰다. 고정된 샘플은 0.5 x Triton X-100을 함유한 PBS로 10분 동안 투과화한 다음, 실온에서 1시간 동안 차단 용액(PBS 중 2% BSA)으로 반응시켰다. 이어서, 샘플을 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새도록 블럭킹 용액에 희석된 1차 항체로 반응시켰고, PBS로 세척 후, 형광색소가 결합된 이차 항체 및 DAPI를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 샘플을 마운팅 매질(Invitrogen, P36961, USA)로 마운팅시키고 공초점 현미경(Leica, SP8, Germany)으로 관찰하였다. 사용한 항체는 하기 표 4에 나타내었다.
세포의 이미징 분석
신경세포로의 분화과정 동안 형광 리포터의 일시적인 발현을 기록하기 위해 격자선이 있는 유리 바닥 접시(IWAKI, 3922-035, 일본)에 배양된 세포들을 대상으로 EGFP 및 TagRFP의 스냅샷 이미징을 수행하였다. 격자선을 랜드마크로 사용하여 공초점 현미경의 명시야 하에서 연속된 날짜에 같은 위치에 있는 세포를 확인할 수 있었다. 세포분열의 실시간 영상화 분석은 격자선이 없는 유리 바닥 접시(Nunc, 150682, USA)를 사용하였다. 현미경 이미징 분석 시, 세포의 생존환경을 유지하기 위해 배양챔버(LCI, Stage-top Incubator System TC, Korea)를 5% CO2 및 37°C로 설정하였고, 세포는 이미지화되지 않을 때 기존의 CO2 배양기에서 배양하였다. 형광 리포터를 발현하는 세포의 세포분열 및 이동의 추적은 공초점 현미경(Leica, SP8, Germany)을 사용하여 배양 챔버에서 10-15분 간격으로 12-15시간 동안 시간 경과에 따른 이미징을 획득하였다.
이미지 분석
EGFP 및 TagRFP의 형광강도는 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/download.html)를 사용하여 정량화하였다. 백그라운드 도구로 배경을 제거하고 롤링 볼 반경 매개변수를 배경의 일부가 아닌 셀 크기 이상으로 설정하였다. 임계값은 관심 구성요소와 배경의 구별을 위해 조정하였다. 강도는 임계값 이미지를 기반으로 자동으로 측정하였다. 분화 세포의 Sholl 분석은 이전에 설명한 대로 ImageJ의 Simple Neurite Tracer(SNT) 기능을 사용하여 수행하였다(Binley et al., 2014). 추적 이미지를 사용하여 Sholl 분석을 수행했고 체세포를 중심으로 3.5μm 간격으로 동심원 고리를 적용하였다.
세포이동 분석
신경세포로의 분화동안 세포이동의 시간 경과기록은 Imaris 소프트웨어(Oxford Instruments, x64 9.0.2, UK)를 사용하여 분석하였다. Spot 도구를 사용하여 셀을 스팟으로 표시하고 각 셀의 이동을 시간 경과에 따라 자동으로 추적하였다. 필터 유형의 경우 "스팟 분류 품질"을 선택하고 하한 임계값 매개변수는 8.00으로 설정하였다. 자동회귀 모션 알고리즘은 MaxDistance에 대해 20μm, MaxGapSize 설정에 대해 3μm를 사용하여 선택하였다. 트랙 직진도(TS) 및 트랙 속도 최대값(TSM)의 통계 값은 세포이동 패턴의 특성화에 이용하였다.
HES1의 넉다운(Knock down)
인간 HES1에 대한 표적 서열을 포함하는 하기의 올리고를 siRNA-h7SKneo 플라스미드(InvivoGen, USA)의 BbsI 부위에 삽입하였다.
대조군 스크램블: 서열번호 13
ACCTC-GGGTTGTTACtTAAGTCCTgGA-TCAAGAG-TCTAGGACTTAGGTAACATCC-TT,
KD1(HES1-shRNA 3): 서열번호 11
ACCTC-GAtCATGCgCTgTATTTGTAT-TCAAGAG-ATACAAATATAGTGCATGGTCTT,
KD2(HES1-shRNA 4): 서열번호 12
ACCTC-GCgTCTGgGCgCAGAAAGTCA-TCAAGAGTGACTTTCTGTGCTCAGATGC-TT
5' 쪽에 ACCTC를, 3' 쪽에 TT를 추가하여 제한효소 부위를 생성하였고, 중앙에 TCAAGAG 서열을 추가하여 짧은 머리핀에 대한 루프를 생성하였다.
복제 과정에서 돌연변이의 방지를 위해 3개의 점 돌연변이(상기 서열에서 소문자로 표시됨)를 삽입하였다. h7SK 프로모터와 인서트(h7SK-shRNA)를 모두 포함하는 서열을 PGK-neo-pA를 포함하는 CSII 벡터로 클로닝 하였다.
모든 h7SK-shRNA는 PGK-neo-pA를 포함하는 CSII 벡터에서 3' 측으로 삽입하였다. HES1 넉다운(KD)용 렌티바이러스 생산을 위해, HEK293T 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10cm 접시에 3.0 x 106개 세포)이 보충된 DMEM/F12에 배양하였다. 이후 배양된 HEK293T 세포에 KD 구축물을 포함하는 CSII 벡터(8.4㎍), psPAX2(6.2㎍) 및 pMD2.G(2.6μg)를 렌티바이러스 패키징을 위해 PEI MAX(Polysciences, 24765, USA)를 이용하여 공동 형질감염시켰다. 형질감염 8시간 후에 forskolin(Wako, 067-02191, Japan, 10μM)을 포함하는 배지로 교체하였다. 이후 렌티바이러스를 함유하는 배지를 형질감염 54시간 후에 수집하고, 0.45μm 필터로 여과한 후, 원심분리로 농축시켰다. 적정을 위해 12웰 플레이트 웰에서 5.0 x 104 HEK293T 세포에 렌티바이러스를 연속 희석액으로 감염시켰다. 감염 4일 후 게놈 DNA를 추출하고 qRT-PCR로 역가를 측정하였다(Barczak et al., 2015). TUBB3EGFP/NGN2TagRFP 이중 리포터가 도입된 hiPSC 세포는 해리 후 MOI 1에서 렌티바이러스로 감염시켰고, 4-6일 후 24시간 동안 250㎍/ml G418(Roche, 4727878001, Switzerland)로 형질감염된 세포를 선택하였다.
통계분석
통계분석은 Prism(GraphPad Software)을 사용하였다. 두 그룹 간의 차이는 양측 스튜던트 t 테스트로 분석하였고, 두 그룹 이상의 차이는 ANOVA와 Tukey 테스트로 분석하였다. 차이는 p 값 <0.05(* p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001)에 대해 유의한 값으로 간주하였고, 모든 오차 막대는 S.E.M으로 나타내었다. qRT-PCR 분석의 경우 각 지점은 3번 반응한 평균값으로 나타내었다.
<실시예 1>
HES1 유전자 발현 넉다운(Knock down)을 위한 shRNA 선별
본 발명자들은 HES1 유전자의 발현을 넉다운시킬 수 있는 가장 효과적인 shRNA 제작을 위해, HES1 유전자 서열을 토대로 7개의 shRNA를 각각 제작하였고, HES1 유전자 서열에서 각 shRNA가 타겟팅하는 부위를 도 1에 나타내었다.
이후 제작된 shRNA는 렌티바이러스(lentivirus) 기반 shRNA(lentiviral-based shRNA) 이므로 세포에 감염시키기 위한 벡터를 제조하였고, HEK293T 세포에 처리하여 각 shRNA에 대한 HES1 유전자 넉다운 효과를 분석하였다.
그 결과, 7개의 서로 다른 염기서열로 이루어진 shRNA 중에서 sh3 및 sh4의 shRNA가 가장 효과적으로 HES1 유전자의 발현을 억제시키는 것으로 나타났다(도 2a, 2b). 또한 IMR90 세포주 및 253G1 hiPSC 세포주에서도 sh3 및 sh4 shRNA 처리에 따른 HES1 유전자의 발현이 대조군 shRNA 처리에 비해 월등하게 억제되는 것으로 나타났다(도 2c).
이에 본 발명자들은 HES1-shRNA 3(sh3)을 KD1으로 명명하였고, HES1-shRNA 4(sh4)를 KD2로 명명하였으며, 하기 실시예에서는 KD1 및 KD2의 shRNA을 이용하여 실험을 진행하였다.
KD1(HES1-shRNA 3): 서열번호 11
ACCTC-GAtCATGCgCTgTATTTGTAT-TCAAGAG-ATACAAATATAGTGCATGGTCTT,
KD2(HES1-shRNA 4): 서열번호 12
ACCTC-GCgTCTGgGCgCAGAAAGTCA-TCAAGAGTGACTTTCTGTGCTCAGATGC-TT
<실시예 2>
HES1 shRNA 처리에 의한 신경세포 분화의 가속화 확인
HES1 유전자의 넉다운이 신경세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 신경전구세포의 마커인 NGN2 및 분화된 신경세포의 마커인 TUBB3가 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포에 상기 실시예 1에서 선정한 HES1-shRNA 3(KD1) 및 HES1-shRNA 4(KD1)를 각각 처리한 후, 인간 유도만능 줄기세포에서 신경세포로의 분화 정도를 분석하였다. 이때 상기 NGN2 및 TUBB3은 형광단백질인 TagRFP 및 EGFP가 각각 표지되도록 하였고, 이들 형광단백질의 발현에 따른 형광분석을 통해 신경전구세포의 양상 및 분화된 신경세포의 양상을 분석하였다.
<2-1> TUBB3
EGFP
및 NGN2
TagRFP
이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포의 제조
이중 리포터가 표지된 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)를 제조하기 위해, CRISPR-Cas9 게놈 편집 및 Cre-재조합의 다단계 전기천공(EP)법을 수행하였으며(도 3), 단일 가이드(sg) RNA 및 상동성 암(homology arms)은 각각 TUBB3 및 NGN2의 정지 코돈 근처 부위에 자가 절단 펩티드 P2A를 포함하는 EGFP 및 TagRFP의 코딩서열이 추가되도록 설계하였다(도 4 및 표 3). 숙주(host) hiPSC의 경우, 4개의 hiPSC 계통 중에서 삼배엽층(three germ layers)으로 분화하고 피질 뉴런의 생성능을 갖는 RNA 기반 재프로그래밍된 RPChiPS771 세포주를 사용하였다. 또한, NGN2(T1 및 T5로 명명)에 대한 서로 다른 sgRNA 표적 부위를 갖는 클론 중에서 정상 핵형 및 전분화능을 확인한 후, TUBB3EGFP/NGN2TagRFP 이형 접합 KI(konck-in) 클론을 선택하였다. 이후 2차원 배양법(Espuny-Camacho et al., 2013)을 이용하여 신경세포의 피질세포로의 분화를 유도하였고 마커 유전자(HES1, NGN2, TBR2 및 TUBB3)의 전사체 수준을 분석하여 게놈 변형이 신경세포의 분화에 영향을 미치는지를 분석하였다. 또한, 본 발명에서 제조한 이중 리포터가 표지된 hiPSC 세포 및 부모세포 (WT hiPSC)로부터 유래된 세포의 신경 유도 프로파일을 비교하였고, 신경세포로의 분화유도 기간 별 각 마커 유전자들의 발현수준을 분석하였다.
그 결과, 본 발명에서 제조한 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 동안, 분화된 신경세포는 신경세포 마커인 TUBB3가 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 확인은 TUBB3에 표지된 EGFP 형광단백질의 발현(G+)으로 알 수 있었다. 또한, 신경전구세포의 마커인 NGN2는 분화 유도 20~24(ND20~ND24)일에서 발현의 정점을 찍고 이후 감소하는 것을 확인할 수 있었는데 이러한 확인은 NGN2에 표지된 TagRFP 형광단백질의 발현(R+)으로 알 수 있었다(도 5).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 상기 방법으로 제조한 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포를 이용하여 HES1 유전자 넉다운이 신경세포의 분화에 미치는 영향을 분석하였다.
<2-2> HES1 유전자 넉다운에 의한 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포의 신경 분화에 미치는 영향분석
HES1 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스로 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포를 감염시킨 후, 살아있는 세포의 신경분화를 모니터링하면서 HES1 유전자 넉다운에 따른 신경세포로의 분화 정도를 EGFP 및 TagRFP이 발현 양상을 통해 분석하였다. 이때 대조군으로는 HES1 shRNA를 처리하지 않은 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포를 이용하였다.
그 결과, 미분화 상태(ND 0) 및 신경세포 분화 4일째(ND 4) HES1 유전자의 mRNA 수준을 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과, 미분화 및 분화 4일째 모두 대조군에 비해 HES1 shRNA을 처리한 군에서 HES1 mRNA의 수준이 월등히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 6a).
또한, 신경세포 분화를 유도하는 동안 EGFP 및 TagRFP의 발현 강도를 분석한 결과, HES1 유전자를 넉다운시킨 경우, 대조군에 비해 EGFP 형광을 나타내는 G+ 세포집단 및 TagRFP 형광을 나타내는 R+ 세포집단 모두에서 형광강도의 증가가 더 높은 것으로 나타났고, 특히 HES1 유전자를 넉다운시킨 경우, 분화된 신경세포의 마커인 TUBB3 발현을 표지한 EGFP 형광 강도가 분화 초기 시점부터 빠르게 증가하는 것으로 나타났다(도 6b, 6c).
따라서 이러한 결과를 통해 HES1 유전자의 발현을 억제시키면 신경세포의 분화 속도를 증진시킬 수 있음을 알 수 있었고, 단시간 안에 분화된 신경세포를 대량 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
HES1 유전자 억제에 따른 Reelin 발현 신경세포의 대량생산 확인
본 발명자들은 TUBB3EGFP 및 NGN2TagRFP 이중 표지된 인간 유도만능 줄기세포에 HES1 shRNA 처리로 HES1 유전자 발현을 억제시킨 후, 분화된 신경세포에서 Reelin 발현을 보이는 세포의 비율을 대조군(HES1 shRNA 처리하지 않은 군)과 비교 분석하였다.
그 결과, HES1 유전자 발현 억제에 의한 신경세포 분화 초기의 세포 이동 양상을 분석한 결과, 신경세포의 이동 속도 및 직진 이동이 대조군에 비해 증가한 것으로 나타났다(도 7a, 7b). 또한, 대조군과 HES1 유전자 발현이 억제된 인간 유도만능 줄기세포에서 신경 분화 초기 EGFP(+) 양상을 보이는 세포수를 분석한 결과, 대조군에 비해 HES1 유전자 발현이 억제된 군에서 뉴런 마커인 TUBB3가 발현된 EGFP(+) 세포수가 월등히 증가한 것으로 나타났고(도 7c), EGFP(+) 양상을 보이는 세포에서 Reelin 유전자 발현 양상을 분석한 결과, 신경세포 분화 초기에 Reelin 유전자를 발현하는 신경세포가 가장 많은 것으로 나타났다(도 7d). 구체적으로 Reelin 유전자를 발현하는 분화된 신경세포는 신경세포 분화 유도 11일(ND 11) 및 13일(ND 13)에 비해 더 빠른 시기인 8일(ND 8)에 가장 많은 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 신경세포로 분화 유도 시, HES1 유전자의 발현을 억제시키면 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 빠른 시간 안에 대량 얻을 수 있음을 알 수 있었고, 이러한 방법으로 생산된 Reelin 발현 신경세포는 Reelin의 결핍 또는 기능이상에 의해 유발되는 각종 뇌질환 또는 신경질환의 치료를 위한 세포치료제로 사용할 수 있으며, 약물을 스크리닝 하는 용도로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (16)
- 전분화능을 갖는 줄기세포에 HES1 유전자 발현 억제제를 처리한 후, 신경세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는,
Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법. - 제1항에 있어서,
상기 HES1 유전자는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법. - 제1항에 있어서,
상기 HES1 유전자 발현 억제제는 HES1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 microRNA인 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법. - 제3항에 있어서,
상기 shRNA는 서열번호 11의 염기서열 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HES1에 대한 shRNA인 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법. - 제1항에 있어서,
상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC) 또는 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)인 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 신경세포로의 분화 초기에 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 대량 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포의 대량생산방법. - HES1 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 HES1 유전자는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 HES1 유전자 발현 억제제는 HES1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 microRNA인 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 shRNA는 서열번호 11의 염기서열 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HES1에 대한 shRNA인 것을 특징으로 하는, Reelin을 발현하는 신경세포 분화 촉진용 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포.
- 제11항의 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포를 유효성분으로 포함하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 예방 또는 치료용 세포치료제.
- 제12항에 있어서,
상기 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환은 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증, 알츠하이머병 또는 정신분열증인 것을 특징으로 하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 예방 또는 치료용 세포치료제. - 제11항의 Reelin을 발현하는 분화된 신경세포에 신경질환의 치료 후보 약물을 처리한 후, 상기 세포에서 Reelin의 발현 또는 활성 수준을 분석하는 단계를 포함하는,
Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법. - 제14항에 있어서,
상기 후보 약물 처리 시, Reelin의 발현 또는 활성이 후보 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 후보 약물을 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환을 치료할 수 있는 약물로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법. - 제14항에 있어서,
상기 Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환은 조현병, 양극성 장애, 우울증, 자폐증, 알츠하이머병 또는 정신분열증인 것을 특징으로 하는, Reelin 결핍 또는 기능 이상으로 유발되는 신경질환의 약물을 스크리닝 하는 방법.
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