CN110709073B - 神经生长促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明的神经生长促进剂含有氨基的氢原子可以经取代基取代的缬氨酸。关于本发明的神经生长促进剂，促进干细胞分化为神经细胞及神经细胞中的神经突起的形成的效果强，并且活性成分不易被消化酶分解。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经生长促进剂。
背景技术
关于人脑中的信息传输，是由神经细胞经由突触而连接成网眼状的网络来进行的。然而，据说成人的该神经细胞每天有10万个以上在消失，而这成为引发阿尔茨海默型痴呆症等中枢神经系统疾病的原因之一。因此，需要查明这种疾病的原因并确立治疗法或予防法。
阿尔茨海默型痴呆症的原因还未完全阐明，但倾向于致病物质为β淀粉样蛋白等的假设。若β淀粉样蛋白在脑内凝聚，则作为淀粉样蛋白斑点而沉积，之后神经细胞死亡。因此，在至今为止的研究中，提出针对β淀粉样蛋白产生酶即β-分泌酶或γ-分泌酶的缓蚀剂或者提出使用了淀粉样蛋白等的抗原或抗体的免疫疗法的情况较多。但是，这些缓蚀剂或疗法被指出存在未获得充分的效果或者具有副作用等问题。
另一方面，还进行将神经营养因子用作阿尔茨海默病的治疗药物的研究。神经营养因子(neurotrophin)是促进神经细胞的生存、分化及再生的物质的总称，且鉴定各种各样的营养因子(例如，参考非专利文献1。)。其中，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)因其为针对与阿尔茨海默病的病理状况相关的前脑基底核胆碱能神经细胞(basalfore-brain cholinergic neuron；BFCN)的神经营养因子而受到瞩目，且积极地对其进行研究(例如，参考非专利文献2、非专利文献3。)。即，阿尔茨海默病为病因不明且没有有效的治疗方法的痴呆疾病，但已知在该患者的脑中，BFCN发生了显著的障碍(细胞数量的减少、细胞体的萎缩、神经突起的变性)。并且，BFCN为与记忆或学习能力相关的神经传导径路，且阿尔茨海默病的痴呆病理状况与该神经传导径路的障碍高度吻合。因此，作为阿尔茨海默病的病因之一，可想到NGF的缺乏，并且也尝试将神经营养因子用作阿尔茨海默病的治疗药物。例如，若对诱发了BFCN的死亡的试验对象动物供给NGF，则得到了神经细胞死亡被抑制等结果(例如，参考非专利文献4、非专利文献5。)。并且，有如下内容的报告，即，在轻度认知障碍(MCI)患者或初期的阿尔茨海默病患者中，前脑基底部的NGF受体(TrkA)免疫阳性细胞数量与认知功能测试的成绩相关(参考非专利文献6。)
以往技术文献
非专利文献
非专利文献1：Drug News Perspect,15,290-298(2002)
非专利文献2：The EMBO Journal,4,1389,(1985)
非专利文献3：Reviews of Physiology,Biochemistry and Pharmacology,109,145(1987)
非专利文献4：Neurobiology of Aging,9,689-690(1988)
非专利文献5：Journal of Neuroscience,5,866(1985)
非专利文献6：Journal of Comparative Neurology,427,19-30(2000)
发明内容
发明要解决的技术课题
如上述，尝试将NGF用作阿尔茨海默病的治疗药物。但是，NGF为高分子的蛋白质且在消化管内被蛋白质分解酶分解，因此即使以口服来摄取也不会到达脑中。并且，即使供给到静脉内也无法通过血脑屏障，因此不会到达脑中。因此，为了从外部供给NGF而在脑中显现其神经分化促进作用或神经生长作用，只能直接向脑实质内或者脑室内供给NGF，存在患者的负担大等问题。
因此，为了解决这种以往技术的问题，本发明人等将提供一种具有神经分化促进作用和神经突起形成作用且活性成分不易被消化酶分解而能够通过血脑屏障的药剂作为课题进行了研究。
用于解决技术课题的手段
为了解决上述课题，本发明人等着眼于氨基酸来作为能够期待生理活性和耐酶性的低分子化合物，并调查它们对神经细胞的作用，其结果，发现尤其在缬氨酸中确认到神经突起的形成及促进神经分化的作用而作为神经生长促进剂有用。本发明是基于这些见解而提出的，具体具有以下结构。
[1]一种神经生长促进剂，其含有氨基的氢原子可以经取代基取代的缬氨酸。
[2]根据[1]所述的神经生长促进剂，其进一步含有氨基的氢原子可以经取代基取代的蛋氨酸。
发明效果
本发明中所使用的缬氨酸具有形成神经突起的作用和促进干细胞分化为神经细胞的作用，且作为神经生长促进剂有用。并且，缬氨酸为低分子化合物，因此不易被消化酶分解而能够通过血脑屏障。因此，例如即使在以口服来摄取含有缬氨酸的神经生长促进剂的情况下，缬氨酸也能够以维持结构的状态到达脑内且在脑内显现其活性。
附图说明
图1是表示PC12细胞中的神经突起形成率的Bt2cAMP浓度依赖性的图表。
图2是表示分别将0.02μg/mL或0.2μg/mL的L-缬氨酸溶液、L-亮氨酸溶液及L-异亮氨酸溶液添加到添加了Bt2cAMP的PC12细胞的RPMI-1640培养基中并进行培养时的神经突起形成率的图表。
图3是表示分别将0.02μg/mL的L-缬氨酸溶液、L-亮氨酸溶液及L-异亮氨酸溶液添加到添加了Bt2cAMP的PC12细胞的Nutrient Mixture(营养混合物)F-12Ham培养基中并进行培养时的神经突起形成率的图表。
图4是表示分别将0.2μM或2μM的L-缬氨酸溶液及N-乙酰基-L-缬氨酸溶液添加到添加了Bt2cAMP的PC12细胞的RPMI-1640培养基中并进行培养时的神经突起形成率的图表。
图5是表示分别将0.2μM、2μM或20μM的L-蛋氨酸溶液及D-蛋氨酸溶液添加到添加了Bt2cAMP的PC12细胞的RPMI-1640培养基中并进行培养时的神经突起形成率的图表。
图6是表示分别将0.2μM的L-缬氨酸溶液、L-蛋氨酸溶液及L-缬氨酸和L-蛋氨酸的混合物的溶液添加到添加了Bt2cAMP的PC12细胞的RPMI-1640培养基中并进行培养时的神经突起形成率的图表。
图7是未将NGF及L-缬氨酸添加到培养基中而进行培养的PC12细胞(比对样本1)、将NGF添加到培养基中并进行培养的PC12细胞(比对样本2)及将NGF和L-缬氨酸添加到培养基中并进行培养的PC12细胞(样本1)的相位对比照片及荧光染色图像。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。以下所记载的构成要件的说明是根据代表性实施方式和具体例而进行的，但本发明并不限定于这些实施方式。另外，在本说明书中使用“～”表示的数值范围是指将记载于“～”前后的数值作为下限值及上限值而包括的范围。
本发明的神经生长促进剂的特征在于，含有氨基的氢原子可以经取代基取代的缬氨酸。以下的说明中，有时将氨基的氢原子经取代基取代的缬氨酸称为“N取代缬氨酸”，将N取代缬氨酸和未经取代的缬氨酸统称为“N取代或未经取代的缬氨酸”。
缬氨酸为下述式所表示的化合物，且为氨基与α位的碳键合而得的α-氨基酸，并且为具有分支结构的支链氨基酸(BCAA)。
[化学式1]
缬氨酸为人必需的氨基酸之一，已知在生体内中用作能量源，并且具有促进骨骼肌的蛋白质合成且抑制蛋白质分解的作用。另一方面，本发明人等对缬氨酸的生理活性进一步进行研究，其结果，确认到促进干细胞分化为神经细胞的作用(神经分化促进作用)和形成神经突起的作用(神经突起形成作用)，从而明确了缬氨酸作为神经生长促进剂发挥优异的功能。并且，人的消化酶大致分为碳水化合物分解酶、蛋白质分解酶及脂肪分解酶，但缬氨酸不被任何酶分解而以原来的结构被肠管吸收。并且，被肠管吸收并进入到血液中的缬氨酸能够通过血脑屏障。因此，例如即使在以口服来摄取含有缬氨酸的神经生长促进剂的情况下，缬氨酸也能够以维持结构的状态到达脑内且在脑内有效地显现其活性。
本发明中所使用的N取代或未经取代的缬氨酸优选为游离氨基酸。在缬氨酸作为蛋白质或肽的结构单元存在的情况下，缬氨酸以其氨基与其他氨基酸的羧基进行脱水缩合而形成肽键，且其羧基进一步与其他氨基酸的氨基进行脱水缩合而形成肽键的形式存在。
N取代或未经取代的缬氨酸可以为L体也可以为D体，还可以作为L体和D体的混合物包含于神经生长促进剂中，但优选神经生长促进剂所包含的N取代或未经取代的缬氨酸的总量中超过50mol％为L体，更优选超过70mol％为L体，进一步优选超过80mol％为L体，最优选神经生长促进剂所包含的所有的N取代或未经取代的缬氨酸为L体。
本发明中所使用的N取代或未经取代的缬氨酸可以为被合成的缬氨酸，也可以为从天然物质提取的缬氨酸。作为缬氨酸的合成法，能够举出氨作用于α-溴代异戊酸的方法、使用了斯特雷克反应的合成法及使用了微生物的基于氨基酸发酵的合成法。并且，关于从天然物质中缬氨酸的提取，能够利用机械性的天然物质的破碎或匀浆、基于酶或酸、碱的加水分解、各种分离纯化法等来进行。
并且，本发明中的N取代缬氨酸中，经取代基取代的氢原子可以为构成氨基的2个氢原子中的1个也可以为2个，但优选为1个。氨基的2个氢原子经取代基取代时，该2个取代基可以相同也可以不同。取代基的种类并无特别限定，例如能够举出烷基、酰基。关于烷基，其碳原子数优选为1～10，更优选为1～6，例如能够从1～3的范围内进行选择。关于酰基，其碳原子数优选为2～10，更优选为2～6，例如能够从1～3的范围内进行选择，且能够采用乙酰基等。
以下中，例示出氨基的氢原子经取代基取代的缬氨酸(N取代缬氨酸)的具体例。但是，本发明中能够使用的N取代缬氨酸不应被该具体例做限定性解释。
[化学式2]
N-乙酰基-L-缬氨酸
关于本发明的神经生长促进剂中的缬氨酸，可以仅由未经取代的缬氨酸构成，也可以仅由N取代缬氨酸构成，还可以包含未经取代的缬氨酸和N取代缬氨酸这两个。在神经生长促进剂含有N取代缬氨酸的情况下，该N取代缬氨酸可以全部相同，也可以为两种以上的组合。
本发明的神经生长促进剂可以仅由N取代或未经取代的缬氨酸构成，也可以包含除了N取代或未经取代的缬氨酸以外的成分(其他成分)。作为能够用于神经生长促进剂的其他成分的优选例，能够举出蛋氨酸。通过组合使用N取代或未经取代的缬氨酸与蛋氨酸，与仅使用N取代或未经取代的缬氨酸的情况相比，能够加强神经生长促进作用。蛋氨酸为下述式所表示的化合物，可以为L体也可以为D体，还可以作为L体和D体的混合物包含于神经生长促进剂中。
[化学式3]
并且，与N取代或未经取代的缬氨酸组合来使用的蛋氨酸可以为氨基的氢原子经取代基取代的蛋氨酸，但从加强神经生长促进作用的观点考虑，优选为未经取代，更优选组合使用未经取代的蛋氨酸与未经取代的缬氨酸。其中，在氨基经取代基取代的蛋氨酸(以下，有时称为“N取代蛋氨酸”)中，经取代基取代的氢原子可以为构成氨基的2个氢原子中的1个也可以为2个，但优选为1个。氨基的2个氢原子经取代基取代时，该2个取代基可以相同也可以不同。关于取代基的优选范围和具体例，能够参考上述N取代缬氨酸中的取代氨基的氢原子的取代基的优选范围和具体例。
以下中，例示出氨基的氢原子经取代基取代的蛋氨酸(N取代蛋氨酸)的具体例。但是，本发明中能够使用的N取代蛋氨酸不应被该具体例做限定性解释。
[化学式4]
N-乙酰基-L-蛋氨酸
在本发明的神经生长促进剂含有缬氨酸和蛋氨酸(无论是哪一个，氨基的氢原子均可以经取代基取代)的情况下，缬氨酸的含量相对于缬氨酸和蛋氨酸的总量优选为1重量％以上，更优选为10重量％以上，进一步优选为30重量％以上。并且，优选为99重量％以下，更优选为90重量％以下，进一步优选为70重量％以下。
并且，例如在从天然物质中提取N取代或未经取代的缬氨酸的情况下，本发明的神经生长促进剂中，除了N取代或未经取代的缬氨酸以外还可以包含来自该天然物质的成分。并且，本发明的神经生长促进剂中，除了N取代或未经取代的缬氨酸以外也能够含有各种成分。例如，在神经生长促进剂中含有赋形剂时，成型变得容易，并且能够在不改变N取代或未经取代的缬氨酸的含量的情况下增加神经生长促进剂以改善处理性。作为赋形剂并无特别限定，但优选糊精。基于赋形剂的稀释倍率以质量比计优选为2～10倍，更优选为2～7倍，进一步优选为3～5倍。
并且，在神经生长促进剂包含除了N取代或未经取代的缬氨酸以外的成分的情况下，神经生长促进剂中的N取代或未经取代的缬氨酸的含量相对于神经生长促进剂的总质量优选为0.01质量％以上，更优选为0.1质量％以上，进一步优选为1质量％以上。并且，例如还能够设为50质量％以上、90质量％以上及99质量％以上。
本发明的神经生长促进剂具有促进干细胞分化为神经细胞的作用(神经分化促进作用)和在神经细胞中形成神经突起的作用(神经突起形成作用)，尤其能够有效地促进被二丁酰cAMP(Bt2cAMP：Dibutyryladenosine 3’,5’-cyclic monophosphate(二丁酰腺苷3',5'-单磷酸))诱导的神经突起的形成及被神经生长因子(NGF)诱导的神经分化。
因此，在以口服来摄取本发明的神经生长促进剂且被肠管吸收其成分的情况下，无论末梢还是中枢，在所到达的神经系统中，均有效地促进干细胞分化为神经细胞及神经突起的形成，且有助于因神经突起的变性或损伤而受损的神经回路的重建。由此，能够有效地缓解由神经变性疾病或神经损伤引起的认知功能或运动功能障碍。其中，本发明的神经生长促进剂具有如下优点：因为使用作为生物成分的缬氨酸或作为缬氨酸诱导体的N取代缬氨酸，因此安全性高，并且因为缬氨酸及大部分的N取代缬氨酸不被消化酶分解，因此容易用作以口服来摄取的内服剂等。
并且，本发明的神经生长促进剂具有促进在培养基中进行培养的干细胞分化为神经细胞的作用。因此，本发明的神经生长促进剂在利用iPS细胞等多能干细胞和神经前体细胞的再生医疗领域中，也能够作为促进这些干细胞分化为神经细胞的分化促进剂而有效地使用。由此，能够高效地由干细胞生产神经细胞，并能够对提高与再生医疗相关的各种产业的生产效率及降低成本做出巨大贡献。
本发明的神经生长促进剂的使用量根据作为对象的障碍而不同，但例如优选以如下使用量使用。
例如，在将本发明的神经生长促进剂作为内服药来口服给药的情况下，其供给量优选为80～2000mg/成人标准体重/天，适合1天分2～3次来供给。
并且，在将本发明的神经生长促进剂添加到培养多能干细胞和神经前体细胞的培养基中的情况下，其添加量相对于总量以质量比率计优选为0.1质量％以上，更优选为0.2质量％以上，进一步优选为0.2～1.0质量％。并且，作为N取代或未经取代的缬氨酸的添加量以干燥重量计优选为0.03质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.05～0.25质量％。
[神经生长促进剂的用途]
如上所述，本发明的神经生长促进剂具有神经生长促进作用，并且具有促进如多能干细胞或神经前体细胞那样的干细胞分化为神经细胞的作用。
因此，本发明的神经生长促进剂能够对人等动物进行供给来有效地用作缓解由其神经变性疾病或神经损伤引起的功能障碍的内服剂。在作为内服剂的神经生长促进剂中，除了上述分解产物和赋形剂以外也能够根据需要含有各种成分。例如，能够根据需要含有维生素、蔬菜粉末、矿物质、酵母提取物、着色剂、增稠剂等。这些成分的种类并没有特别限制，在能够充分发挥作为目标的功能的范围内适当调节含量。
并且，本发明的神经生长促进剂在利用iPS细胞等多能干细胞和神经前体细胞的再生医疗领域中，能够添加到培养基和细胞的稀释液中而优选地用作促进这些干细胞分化为神经细胞的分化促进剂。添加神经生长促进剂的培养基可以为液体(肉汤)培养基、半流动培养基、固态(琼脂)培养基中的任一种，其组成也并无特别限制。并且，关于稀释液，能够适用于通常用作生理盐水等细胞的稀释液的稀释液中的任一种。
实施例
以下举出实施例来对本发明进行进一步具体的说明。关于以下实施例所示的材料、比例及操作等，只要不脱离本发明的主旨则能够进行适当变更。从而，本发明的范围并不被以下所示的具体例做限定性解释。
[神经生长促进剂的溶液的制备]
如下所示，制备了L-缬氨酸(神经生长促进剂1)的溶液和L-亮氨酸溶液及L-异亮氨酸溶液。下述中示出各氨基酸的结构。如下述式所示，与L-缬氨酸同样地，L-亮氨酸及L-异亮氨酸为具有分支结构的支链氨基酸。
[化学式5]
(制备例1)使用了RPMI-1640的L-缬氨酸溶液的制备
将L-缬氨酸溶解到培养基(Sigma-Aldrich Co.LLC制造，RPMI-1640)中来制备了0.4μg/mL的L-缬氨酸溶液及4μg/mL的L-缬氨酸溶液。
(制备例2)使用了Nutrient Mixture F-12 Ham的L-缬氨酸溶液的制备
将L-缬氨酸溶解到培养基(Sigma-Aldrich Co.LLC制造，Nutrient Mixture F-12Ham)中来制备了0.4μg/mL的L-缬氨酸溶液。
(比较制备例1)使用了RPMI-1640的L-亮氨酸溶液及L-异亮氨酸溶液的制备
使用L-亮氨酸或L-异亮氨酸来代替L-缬氨酸，除此以外，以与制备例1相同的方式制备了0.4μg/mL的L-亮氨酸溶液及4μg/mL的L-亮氨酸溶液，以及0.4μg/mL的L-异亮氨酸溶液及4μg/mL的L-异亮氨酸溶液。
(比较制备例2)使用了Nutrient Mixture F-12Ham的L-亮氨酸溶液、L-异亮氨酸溶液的制备
使用L-亮氨酸或L-异亮氨酸来代替L-缬氨酸，除此以外，以与制备例1相同的方式制备了0.4μg/mL的L-亮氨酸溶液及0.4μg/mL的L-异亮氨酸溶液。
[神经突起形成作用及神经分化促进作用的评价]
将从理化学研究所生物资源中心获得的来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的PC12细胞用于试验对象，且评价了在各制备例中所制备的L-缬氨酸溶液的神经突起形成作用及神经分化促进作用。已知若使Bt2cAMP(Dibutyryladenosine 3’,5’-cyclicmonophosphate)或NGF起作用，则PC12细胞停止增殖而生长神经纤维来延伸交感神经节神经元那样的树突(dendrite)。其中，将L-缬氨酸导入到该Bt2cAMP诱导性神经突起形成步骤及NGF诱导性神经分化步骤中，并评价该神经突起形成作用及神经分化促进作用，并且与L-亮氨酸及L-异亮氨酸的作用进行了比较。
其中，关于PC12细胞，使用含有10％马血清(已灭活)、5％胎牛血清(已灭活)、100U/mL的青霉素G及100μg/mL的链霉素的RPMI-1640培养基，在5％CO2气相下，利用37℃的培养箱进行培养，且将融合70％左右的细胞在基本培养基中进行剥离并使用于实验。以下中，将与该PC12细胞的培养中所使用的培养基相同组成的培养基称为“基本培养基”。
(a)添加到培养基中的Bt2cAMP的浓度的研究
作为预备实验，在下述实验(b)中研究了添加到培养基中的Bt2cAMP的适当浓度。
首先，使PC12细胞浮游在基本培养基中，充分悬浮以成为单细胞。将该PC12细胞的悬浮液以4.0×103细胞/95μL/孔播种到已涂层胶原蛋白的96孔板上，在5％CO2气相下且在37℃下培养了24小时。培养后，以Bt2cAMP浓度成为0.25mM、0.5mM、1.0mM或1.25mM的方式向各孔内的培养基各添加5μL的各种DulbeccoPBS(-)(Dulbecco磷酸盐缓冲生理盐水(不含Ca、Mg))，进一步培养了24小时，其中所述各种DulbeccoPBS(-)含有5mM、10mM、20mM或25mM的Bt2cAMP。培养后，去除各孔内的培养基，且向各孔内各分配100μL的含有1％戊二醛的磷酸盐缓冲液(0.1M、pH7.2)，静置20分钟，固定了细胞。接着，从各孔内去除含有戊二醛的磷酸盐缓冲液，且向各孔内各分配100μL的Giemsa染色液，静置2～3分钟来进行了染色。染色后，从各孔内去除Giemsa染色液，且将所染色的孔内的样品利用超纯水清洗了2次之后，使其干燥。
利用显微镜观察经以上处理的各孔内的样品，将神经突起以细胞体长径的2倍以上的长度形成的细胞判定为阳性，且将(进行了阳性或阴性的判定的总细胞数量)阳性细胞数量相对于总细胞数量的百分率作为神经突起形成率来求出。其中，对每1孔的300～400个细胞进行了阳性或阴性的判定。
并且，向孔内的培养基中添加了5μL的不含有Bt2cAMP的DulbeccoPBS(-)来代替含有Bt2cAMP的DulbeccoPBS(-)，除此以外，以相同的方式进行培养、基于戊二醛的固定及Giemsa染色，观察染色后的样品并求出了神经突起形成率。
将神经突起形成率的Bt2cAMP浓度依赖性示于图1。另外，图1中的神经突起形成率以±SD表示，SD是以相同的方式进行的3次实验的标准偏差。下述实验(b)中所测定的图2、图3、图4的神经突起形成率的表示也与此相同。
如图1所示，在培养基的Bt2cAMP浓度为1.0mM时，神经突起形成率成为最大值19.5％。下述实验(b)中，将Bt2cAMP作为用于形成神经突起的诱导剂来使用，因此设为将使神经突起形成率成为最大的浓度(1.0mM)的1/2的浓度(0.5mM)作为培养基的Bt2cAMP浓度来采用。
(b)对Bt2cAMP诱导性神经突起形成的作用的评价
以与上述预备实验相同的方式将PC12细胞的悬浮液以4.0×103细胞/90μL/孔播种到已涂层胶原蛋白的96孔板上，在5％CO2气相下且在37℃下培养了24小时。培养后，分别向各孔内各添加5μL的含有10mM的Bt2cAMP的DulbeccoPBS(-)和在制备例1或制备例2中所制备的L-缬氨酸溶液，进一步培养了24小时。此时，各孔内的培养基中的Bt2cAMP浓度分别为0.5mM。之后，以与上述预备实验相同的方式进行基于戊二醛的细胞固定及Giemsa染色，观察染色后的样品并求出了神经突起形成率。
并且，分别向各孔内的培养基各添加5μL的比较制备例1、比较制备例2中所制备的L-亮氨酸溶液、L-异亮氨酸溶液、RPMI-1640培养基及Nutrient Mixture F-12 Ham培养基来代替L-缬氨酸溶液，除此以外，以相同的方式进行培养、基于戊二醛的细胞固定及Giemsa染色，观察染色后的样品并求出了神经突起形成率。
将相对于添加到RPMI-1640培养基或Nutrient Mixture F-12 Ham培养基中的氨基酸浓度绘制了各样品的神经突起形成率的图表示于图2、图3。图2是使用了制备例1、比较制备例1中所制备的溶液(将各支链氨基酸溶解到RPMI-1640培养基中来制备的溶液)的情况下的图表，图3是使用了制备例2、比较制备例2中所制备的溶液(将各支链氨基酸溶解到Nutrient Mixture F-12 Ham培养基中来制备的溶液)的情况下的图表。
根据图2、图3，可知通过向培养基添加微量的L-缬氨酸，明显地促进神经突起形成。另一方面，向培养基添加L-亮氨酸和L-异亮氨酸的系统中，未确认到这样的神经突起形成促进作用。由此表明，缬氨酸的神经突起形成作用不是由支链氨基酸引起的，而是为缬氨酸特有的作用。
并且，关于D-缬氨酸及N-乙酰基-L-缬氨酸，也以与上述相同的方式评价了对Bt2cAMP诱导性神经突起形成的作用，其结果，能够确认到与L-缬氨酸相等的神经突起形成促进作用(图4)。
而且，关于除了支链氨基酸以外的氨基酸，以与上述相同的方式调查了针对Bt2cAMP诱导性神经突起形成的作用，其结果，在天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸或脯氨酸中，即使将添加到RPMI-1640培养基中的各氨基酸的浓度提高至200μM，也未确认到神经突起形成率的明显的变化。另一方面，向培养基添加L-蛋氨酸或D-蛋氨酸的系统中，在20μM的高浓度下确认到神经突起形成促进作用(图5)。
因此，接着为了调查将缬氨酸和蛋氨酸一同添加到培养基中的效果，以与上述相同的方式向播种到孔板上并进行培养的PC12细胞的RPMI-1640培养基中添加Bt2cAMP，进而分别添加L-缬氨酸溶液、L-蛋氨酸溶液或以1:1混合了L-缬氨酸和L-蛋氨酸而得的混合物的溶液并进行培养，调查了神经突起形成率。在使用了L-缬氨酸溶液或L-蛋氨酸溶液的系统中，添加到RPMI-1640培养基中的氨基酸的浓度设为0.2μM，在使用了L-缬氨酸和L-蛋氨酸的混合物的溶液的系统中，将L-缬氨酸和L-蛋氨酸的各浓度设为0.1μM，合计设为0.2μM。将所测定的神经突起形成率示于图6。
如图6所示，通过将L-缬氨酸和L-蛋氨酸一同添加到培养基中，确认到比将各自的氨基酸单独添加到培养基中的情况更强的神经突起形成促进作用。由此可知，通过一同添加缬氨酸和蛋氨酸而能够协同提高神经突起形成促进作用。并且，还可知在一同添加缬氨酸和蛋氨酸的情况下，从加强作用的观点而言，优选组合未经取代的缬氨酸和未经取代的蛋氨酸。
(c)对NGF诱导性神经分化的作用的评价
将神经丝用作神经分化标记，利用免疫荧光染色法对其进行染色，由此评价了L-缬氨酸的神经分化促进作用。
使PC12细胞浮游在基本培养基中，充分悬浮以成为单细胞，制备成1.4×104细胞/mL。将该PC12细胞的悬浮液以5.0×103细胞/360μL/孔播种到进行了胶原蛋白涂层的8孔腔室载玻片上，在5％CO2气相下，利用37℃的企业培养箱培养了24小时。培养后，分别向各孔内各分配20μL的含有200ng/mL的NGF的DulbeccoPBS(-)(NGF溶液)和含有4μg/mL的L-缬氨酸的RPMI-1640培养基(制备例1中所制备的L-缬氨酸溶液)，进一步培养了48小时。培养后，去除各孔内的培养基，利用PBS(-)(磷酸盐缓冲生理盐水(Ca、Mg不含))进行清洗之后，向各孔内分配4％甲醛溶液并处理了30分钟之后，利用PBS(-)进行了3次3分钟的清洗。接着，向各孔内分配含有0.4％的TritonX-100(Sigma-Aldrich Co.LLC制造)的PBS(-)，处理了30分钟之后，利用PBS(-)进行了清洗。
接着，向各孔内分配含有2.5％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS(-)并处理了1小时之后，向各孔内分配利用含有2.5％的BSA的PBS(-)稀释了200倍而得的1次抗体(Sigma-Aldrich Co.LLC制造，Anti-neurofilament 200 IgG fraction of antiserum)并在室温下处理2小时，利用含有0.05％的Tween20(ATTO Corporation制造)的PBS(-)进行了3次3分钟的清洗。接着，向各孔内分配利用含有2.5％的BSA的PBS(-)稀释了200倍而得的2次抗体(Sigma-Aldrich Co.LLC制造，Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibodyproduced in goat)，在室温下处理了1小时之后，利用含有0.05％的Tween 20的PBS(-)进行了3次3分钟的清洗。利用核染色封入剂(Cosmo Bio Co.,Ltd.制造，DAPI-Fluoromount-G)封入经以上处理的各孔内的样品，盖上盖玻片并修整四角，由此制作了样本1。并且，使用DulbeccoPBS(-)来代替NGF溶液，且使用RPMI-1640培养基来代替L-缬氨酸溶液，除此以外，以与上述相同的工序进行了培养及免疫荧光染色来制作比对样本1，使用RPMI-1640培养基来代替L-缬氨酸溶液，除此以外，以与上述相同的工序进行了培养及免疫荧光染色来制作了比对样本2。
使用共聚焦激光显微镜(Olympus Corporation制造，FLUOVIEWFV10i)观察所制作的各样本的荧光染色图像并拍摄了照片。将所拍摄的照片示于图7。图7中，从左计第1列的照片为样本的相位对比照片。从左计第2列的照片为在激发波长359nm且检测波长461nm所拍摄的DAPI荧光染色图像，看起来亮的部位相当于细胞核。从左计第3列的照片为在激发波长495nm且检测波长519nm所拍摄的FITC荧光染色图像，看起来亮的部位相当于神经丝。并且，从左计第4列的照片为合成了从左计第2列的照片和第3列的照片而成的照片。
若比较向培养基添加了NGF和L-缬氨酸的样本1与向培养基添加NGF而未添加L-缬氨酸的比对样本2的各FITC荧光染色图像，则样本1的荧光染色图像相较于比对样本2的荧光染色图像存在更多看起来亮的部位，从而可知显现有很多神经丝。由此可知，通过添加培养基的缬氨酸，促进由干细胞的神经分化。
产业上的可利用性
根据本发明，能够以低成本提供能够有效地促进干细胞向神经细胞的分化及神经细胞中的神经突起的形成，并且活性成分不易被消化酶分解的神经生长促进剂。因此，若使用本发明的神经生长促进剂，则能够提供能够缓解由神经变性疾病或神经损伤引起的认知功能障碍或运动功能障碍的平价的内服剂。因此，本发明在产业上的可利用性高。
Claims (2)
1.一种组合物在制造神经生长促进剂中的用途，所述组合物仅含有未经取代的游离缬氨酸和N取代的游离缬氨酸中的一者或两者作为活性成分，
所述N取代的游离缬氨酸中，构成氨基的2个氢原子中的1个或2个被选自碳原子数为1～3的烷基和碳原子数为1～3的酰基中的取代基取代，氨基的2个氢原子被取代基取代时，该2个取代基相同或不同。
2.一种组合物在制造神经生长促进剂中的用途，所述组合物仅含有未经取代的游离缬氨酸和N取代的游离缬氨酸中的一者或两者与未经取代的游离蛋氨酸和N取代的游离蛋氨酸中的一者或两者的组合作为活性成分，
所述N取代的游离缬氨酸中，构成氨基的2个氢原子中的1个或2个被选自碳原子数为1～3的烷基和碳原子数为1～3的酰基中的取代基取代，氨基的2个氢原子被取代基取代时，该2个取代基相同或不同，
所述N取代的游离蛋氨酸中，构成氨基的2个氢原子中的1个或2个被选自碳原子数为1～3的烷基和碳原子数为1～3的酰基中的取代基取代，氨基的2个氢原子被取代基取代时，该2个取代基相同或不同。
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