JP6263201B2 - コラーゲン合成能を有する新規なペプチド及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ペプチド及びその使用に関し、さらに詳細には、コラーゲン合成能を有する新規なペプチド及びその使用に関する。
人は、年を取りながら皮膚老化が起こるが、その代表的な症状がしわ（Ｗｒｉｎｋｌｅ）である。しわは、年を表わす１つの現象であって、しわが生じる代表的な原因は、皮膚の真皮でマトリックスを形成するコラーゲンの分解に起因する。皮膚のコラーゲンは、老化が進行することによって生成が低下する。
コラーゲン合成を促進する従来の物質としては、レチノイド（ＲＥ３６０６８）、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ベツリン酸（ＪＰ８−２０８４２４）、野生ヤマノイモ抽出物（大韓民国公開特許第２００９−００５５０７９号）等が知られている。
このような従来のコラーゲン合成増進剤は、その効率が低いか、組換えタンパク質としてコストが高く、天然抽出物の場合、再現性が低いという短所があった。
本発明は、前記問題点を含む多様な問題点を解決するためのものであって、比較的コストが低く、効果的にコラーゲン合成を増進させることによって、皮膚老化軽減又はしわ改善用の化粧料組成物もしくは創傷治療剤等として使用可能な新規なペプチド及びその使用を提供することを目的とする。しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。
本発明の一態様によれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドを有効成分として含む、皮膚老化軽減用組成物が提供される。
本発明の他の一態様によれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列（ＹＩＧＳＲ）を含むペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｇｒｏｕｐ）が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含む、しわ改善用化粧料組成物が提供される。
本発明の他の一態様によれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含有する、創傷治療剤が提供される。
本発明の他の一態様によれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含有する、皮膚充填剤が提供される。
本発明の他の一態様によれば、薬学的に有効な量の配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を、創傷を有する個体に投与する段階を含む、創傷治療方法が提供される。
本発明の他の一態様によれば、創傷治療に利用するための、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体が提供される。
本発明の他の一態様によれば、しわ改善用化粧料組成物の製造おける、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体の使用が提供される。
前記のようになされた本発明の一実施形態によれば、コラーゲン合成能を有する新規なペプチドを実現することができる。もちろん、このような効果によって、本発明の範囲が限定されるものではない。
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明の一態様によれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含む、皮膚老化軽減用組成物が提供される。
本発明の一実施形態に係る配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドは、コラーゲンの発現を転写レベルで調節し、処理量及び処理時間依存的にＩ型コラーゲンの生成を増加させる効果をもたらす。この際、前記配列番号１で表わされるＹＩＧＳＲペプチドは、１０３〜１０４ｎＭの低濃度でＩ型コラーゲンの生成を有意に増加させ、前記ペプチド誘導体であるＰａｌ−ＹＩＧＳＲは、５０〜１００μＭの高濃度でも、Ｉ型コラーゲンの生成を有意に増加させる効果をもたらすことを特徴とする。また、このようなコラーゲン生成増加効果は、コラーゲンを分解するＭＭＰ−１加水分解酵素発現の抑制によるものではなく、ラミニン受容体の下位シグナル伝達機構であるＦＡＫ、Ｐｙｋ２、及びＥＲＫのリン酸化によるものである。したがって、Ｉ型コラーゲン含量の減少によって促進される皮膚老化を軽減させる組成物として利用され得る。
前記皮膚老化軽減用組成物は、化粧料組成物の形態で提供され得る。
本発明の一実施形態に係るペプチドが、化粧料組成物に使用される場合、その剤形において、特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、パック、ゲル、又は皮膚粘着タイプ化粧料の剤形を有する化粧料組成物であり、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、又は噴霧剤のような経皮投与型剤形であり得る。
本発明の組成物は、化粧品製造に通常使用される適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含み得る。化粧品の剤形によって適切に選択され、ワセリン、流動パラフィン、ゲル化炭化水素（別名：プラスチベース）等の炭化水素類；中鎖脂肪酸トリグリセリド、ラード、ハードペット、カカオ脂等の動植物性オイル；セタノール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸アルコール及び脂肪酸、並びにこれらのエステル類；マクロゴール（ポリエチレングリコール）、１，３−ブチレングリコール、グリセロール、ゼラチン、白糖、糖アルコール等の水溶性基剤；グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤；アクリル酸エステル、アルギン酸ナトリウム等の粘着剤；液化石油ガス、二酸化炭素等の噴射剤；パラオキシ安息香酸エステル類等の防腐剤等が挙げられる。
本発明の他の態様によれば、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含む、しわ改善用化粧料組成物が提供される。
この際、配列番号１でアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドは、１０３〜１０４ｎＭの低濃度でＩ型コラーゲンの生成を有意に増加させる効果をもたらす。
本発明の他の態様によれば、前記配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含有する、創傷治療用薬学的組成物が提供される。
もともと、ＹＩＧＳＲペプチドは、ラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）等のコラーゲン結合タンパク質によく保存された部位であって、コラーゲン結合モチーフとして知られている。前記ＹＩＧＳＲペプチドは、白血病細胞の成長を抑制する等（Ｙｏｓｈｉｄａｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０（１２）：１８９８−１９０４）、抗癌剤としての可能性が報告された（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ，４８：９８９−９９６）。しかし、前記ＹＩＧＳＲペプチドのコラーゲン合成能に対しては報告されたことがなく、本発明者らは、コラーゲン合成能を増進させるペプチドを探すために鋭意努力した結果、ＹＩＧＳＲペプチド及びそのパルミトイル化誘導体であるＹＩＧＳＲペプチドが向上したコラーゲン合成を有することを確認することによって、本発明を完成した。
本発明の組成物におけるＹＩＧＳＲペプチドの有効量は、患者の患部の種類、適用部位、処理回数、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類等によって変わる。使用量は、特に限定されるものではないが、１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。前記１日量は、１日に１回、又は適当な間隔を置いて１日に２〜３回に分けて投与してもよく、数日間隔で間欠投与してもよい。
本発明の組成物において、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体は、組成物の総重量に対して０．１〜１００重量％で含有され得る。
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含み得る。また、薬学組成物の製造には、固体又は液体の製剤用添加物を使用することができる。製剤用添加物としては、有機又は無機のうちいずれのものでもよい。
薬剤学上、許容される担体としては、その剤形によって異なるが、ワセリン、流動パラフィン、ゲル化炭化水素（別名：プラスチベース）等の炭化水素類；中鎖脂肪酸トリグリセリド、ラード、ハードペット、カカオ脂等の動植物性オイル；セタノール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸アルコール及び脂肪酸、並びにこれらのエステル類；マクロゴール（ポリエチレングリコール）、１，３−ブチレングリコール、グリセロール、ゼラチン、白糖、糖アルコール等の水溶性基剤；グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤；アクリル酸エステル、アルギン酸ナトリウム等の粘着剤；液化石油ガス、二酸化炭素等の噴射剤；パラオキシ安息香酸エステル類等の防腐剤等が挙げられ、本発明の外用剤は、これらを使って通常の方法によって製造することができる。また、これら以外にも、安定剤、香料、着色剤、ｐＨ調整剤、希釈剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤等を必要に応じて配合することもできる。本発明の外用剤は、通常の方法によって局所創傷部に塗布されて使用され得る。
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、白糖、ブドウ糖、トウモロコシ澱粉（ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ）、澱粉、タルク、ソルビット、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。着色剤としては、通常医薬品に添加することが許可されているものであれば、いずれも使用することができる。これらの錠剤、顆粒剤は、糖衣、ゼラチンコーティング、その他の必要に応じて適切にコーティングすることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤等を添加することができる。
本発明の薬学的組成物は、当業者に通常製造されるいずれの剤形でも製造され（例：文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）、製剤の形態は、特に限定されるものではないが、望ましくは、外用剤であり得る。本発明の外用剤には、シート剤、液状塗布剤、噴霧剤、ローション剤、クリーム剤、パップ剤、粉剤、浸透パッド剤、噴霧剤、水和ゲルを含んだゲル剤、ペースト剤、リニメント剤、軟膏剤、エアロゾル、粉末剤、懸濁液剤、経皮吸収剤等の通常の外用剤の形態が含まれ得る。これら剤形は、あらゆる製薬化学に一般的に公知の処方書である文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２（Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記述されている。
本発明の一例として、前記組成物を皮膚又は創傷部位に直接適用可能である。すなわち、創傷部位に散布され得る。シートの形態である場合は、創傷部位に塗布するが、この際、塗布した部位に適切に包帯をして創傷を保護しながら、活性成分の治療効果の減少を防止する。包帯は、販売されているか、通常知られているいずれのものも使用可能である。市販の包帯の例としては、コムピール（Ｃｏｍｐｅｅｌ）、デュオダーム（Ｄｕｏｄｅｒｍ）、テガダーム（Ｔａｇａｄｅｒｍ）、及びオブサイト（Ｏｐｓｉｔｅ）が挙げられる。また、これら以外にも、安定剤、香料、着色剤、ｐＨ調整剤、希釈剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤等を必要に応じて配合することもできる。
また、本発明による薬学的組成物は、通常の絆創膏の創傷剥離カバーのような固体支持体上に粘着されて使用される。本発明の様態として、固体支持体を先に粘着層で被覆して、固体支持体におけるペプチド誘導体の付着を向上させる。粘着剤の例としては、ポリアクリル酸及びシアノアクリル酸が含まれ得る。
このような形態の剤形は、市販されているものが多く、例としては、穿孔されたプラスチックフィルム形態の非付着性創傷剥離カバーを有する絆創膏（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ Ｌｔｄ．）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎの薄いストリップ（ｓｔｒｉｐ）、パッチ（ｐａｔｃｈ）、スポット（ｓｐｏｔ）、可塑性ストリップ形態のバンドエイド（ＢＡＮＤ−ＡＩＤ）；Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ Ｃｏ．（Ｋｅｎｄａｌｌ）のキュリティキュラド（Ｃｕｒｉｔｙ ＣＵＲＡＤ）、アウチレス（Ｏｕｃｈｌｅｓｓ）絆創膏；及びＡｍｅｒｉｃａｎ ＷｈｉｔｅＣｒｏｓｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のスティックタイト（ＳＴＩＫ−ＴＩＴＥ）弾性ストリップ等が挙げられる。
本発明の一例として、本発明に係る組成物は、前記ペプチド誘導体と生理食塩水とを一定の体積比で混合し、液状塗布剤の形態で剤形化され得る。本発明の一例として、本発明による薬学組成物は、前記本発明のペプチド誘導体と水溶性軟膏基剤とを混合し、これに生理食塩水を添加して軟膏剤の形態で剤形化され得る。
しかし、本発明の薬剤学的組成物の前記使用量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度、創傷の種類、適用部位、処理回数、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類等の多様な関連因子に照らして決定されるものであるため、前記有効量は、如何なる側面でも、本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。
本発明のさらに他の態様によれば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドを有効成分として含む皮膚充填剤が提供される。
「皮膚充填剤（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ）」又は「フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）」は、皮膚組織と類似した成分であって、特定部位に挿入されて軟部組織を拡張させることによって、しわ改善や輪郭矯正等に使用される物質を意味する。軟組織拡張には、注射可能な物質としてコラーゲンがよく使用される。また、タンパク質、脂肪、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリアルコール、及びカルボキシメチルセルロース、デキストランのようなその他のポリマーを含む、多様な他の物質が注射用皮膚充填物として使用されてきた。コラーゲンを主成分とする皮膚充填剤としては、豚コラーゲンを主成分とするＥＶＯＬＥＮＣＥ３０（ＣｏｌＢａｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社の皮膚充填剤の商標名）、牛コラーゲンを主成分とするＺｙｄｅｒｍやＺｙｐｌａｓｔ（以上、Ｉｎａｍｅｄ社の皮膚充填剤の商標名）、ヒトコラーゲンを主成分とするＣｏｓｍｏＤｅｒｍやＣｏｓｍｏＰｌａｓｔ（以上、Ｉｎａｍｅｄ社の皮膚充填剤の商標名）等が知られている。ヒアルロン酸を主成分とするものとしては、Ｒｏｆｉｌａｎ（Ｒｏｆｉｌ／Ｐｈｉｌｏｄｅｒｍ社の皮膚充填剤の商標名）、Ｐｅｒｌａｎｅ、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（以上、Ｍｅｄｉｃｉｓ／Ｑ−Ｍｅｄ ＡＢ社の皮膚充填剤の商標名）、Ｔｅｏｓｙａｌ（Ｔｅｏｘａｎｅ ＳＡ社の皮膚充填剤の商標名）、Ｓｕｒｇｉｄｅｒｍ（Ｃｏｒｎｅａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ社の皮膚充填剤の商標名）等がある。本発明の一実施形態に係る皮膚充填剤は、公知の皮膚充填剤に本発明の一実施形態に係るペプチドを適量積載するか、前記ペプチドを皮膚充填剤の骨格となる高分子に共有結合又は非共有結合によって結合させることで製造可能である。
本発明の他の一態様によれば、薬学的に有効な量の配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドを、創傷を有する個体に投与する段階を含む創傷治療方法が提供される。
前記創傷に係る個体は、ヒトを除いた哺乳動物であり得る。
本発明の他の一態様によれば、創傷治療に利用するための、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドが提供される。
本発明の他の一態様によれば、しわ改善用化粧料組成物の製造における、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチドの使用が提供される。
以下、実施例、実験例、及び製造例により本発明を詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例、実験例、及び製造例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として実現されるものであって、以下の実施例、実験例、及び製造例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範囲を十分に理解させるために提供されるものである。
実施例１：ＹＩＧＳＲの製造
ＹＩＧＳＲペプチド（配列番号１）をペプチド製造会社（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）に依頼して製造した。
ＹＩＧＳＲペプチド（配列番号１）をペプチド製造会社（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）に依頼して製造した。
実施例２：ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ＹＩＧＳＲの製造
前記実施例１のＹＩＧＳＲペプチド（配列番号１）のＮ末端にパルミトイル基が付着されたペプチド誘導体（Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲ、分子量：８４６）を、ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅを用いて、実施例１の方法と同じ方法で製造した（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）。
前記実施例１のＹＩＧＳＲペプチド（配列番号１）のＮ末端にパルミトイル基が付着されたペプチド誘導体（Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲ、分子量：８４６）を、ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅを用いて、実施例１の方法と同じ方法で製造した（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）。
比較例１：Ｐａｌ−ＲＧＤの製造
パルミトイル基がＮ末端に付着されたＲＧＤペプチドを、ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅを用いて、前記実施例１と同じ方法で製造した。ＲＧＤは、インテグリン結合活性を有したペプチドであって、細胞付着剤等として使用されている物質である。
パルミトイル基がＮ末端に付着されたＲＧＤペプチドを、ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅを用いて、前記実施例１と同じ方法で製造した。ＲＧＤは、インテグリン結合活性を有したペプチドであって、細胞付着剤等として使用されている物質である。
比較例２：ｏｌｅｙｌ−ＹＩＧＳＲの製造
パルミトイル基の代わりにオレイル基がＮ末端に付加されたＹＩＧＳＲペプチドを、ｏｌｅｙｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅを用いて、前記実施例１と同じ方法で製造した。
パルミトイル基の代わりにオレイル基がＮ末端に付加されたＹＩＧＳＲペプチドを、ｏｌｅｙｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅを用いて、前記実施例１と同じ方法で製造した。
実施例３：Ｈｓ２７細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞であるＨｓ２７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、米国）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ社、米国）を用いて、湿度９５％、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。前記Ｈｓ２７細胞は、５〜２０世代継代培養された細胞を利用し、ペプチドを処理する前にＦＢＳが含まれていないＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、処理した。
ヒト皮膚線維芽細胞であるＨｓ２７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、米国）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ社、米国）を用いて、湿度９５％、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。前記Ｈｓ２７細胞は、５〜２０世代継代培養された細胞を利用し、ペプチドを処理する前にＦＢＳが含まれていないＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、処理した。
実験例１：ＹＩＧＳＲペプチドによるＩ型コラーゲン発現の変化分析
１−１：ウエスタンブロットを利用したＹＩＧＳＲペプチドによるＩ型コラーゲン発現の変化分析
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドの皮膚線維芽細胞に対する影響を確認するために、まず、前記実施例１のペプチドで濃度別にＨｓ２７細胞を処理した後、Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）タンパク質の発現レベルをウエスタンブロット分析により確認した。
１−１：ウエスタンブロットを利用したＹＩＧＳＲペプチドによるＩ型コラーゲン発現の変化分析
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドの皮膚線維芽細胞に対する影響を確認するために、まず、前記実施例１のペプチドで濃度別にＨｓ２７細胞を処理した後、Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）タンパク質の発現レベルをウエスタンブロット分析により確認した。
各濃度（０、１０−２、１０−１、１、１０、１０２、１０３、１０４、及び１０５ｎＭ）のペプチドで２４時間、前記実施例３のＨｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した。その後、処理された細胞を溶解緩衝液［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４］で超音波粉砕した後、遠心分離して上澄み液を分離して、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）で定量した。同量のタンパク質を５×試料緩衝液と混合して、９５℃で５分間加熱した後、６〜１５％濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で電気泳動した後、ニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）膜に吸着させた。抗−Ｉ型コラーゲン１次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、米国）及び抗−アクチン１次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、米国）を、５％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ）を含むＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有トリス緩衝食塩水、ｐＨ７．６）に希釈して１６時間反応させた後、ＴＢＳＴで１０分間６回洗浄した。その後、抗−マウスラビットペルオキシダーゼ−結合２次抗体（ＫＰＬ社、米国）で処理し、室温で１時間反応させた後、再びＴＢＳＴで１０分間６回洗浄し、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国）で発色させて確認した。また、ウエスタンブロット分析イメージを濃度分析（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｙｌｓｉｓ）で定量的に比較し、イメージＪプログラム（Ｖｅｒ１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を利用した。
その結果、図１に示されるように、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドにより、処理量依存的にＩ型コラーゲンタンパク質の発現が顕著に増加し、１０３ｎＭ ＹＩＧＳＲペプチド濃度でコラーゲン生成が最大となった。また、未処理のＨｓ２７細胞のＩ型コラーゲンの発現レベルと比較すると、Ｉ型コラーゲンが１０３ｎＭ ＹＩＧＳＲペプチドで処理した場合に６倍以上増加した。
引き続き、本発明者は、ＹＩＧＳＲペプチド処理時間によるコラーゲン生成レベルをウエスタンブロット分析により確認した。１μＭ ＹＩＧＳＲペプチドで０、０．５、６、１２、及び２４時間、前記実施例１のＨｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、処理された細胞について前記同様にウエスタンブロット分析を行った。また、ウエスタンブロット分析イメージについて、イメージＪプログラム（Ｖｅｒ１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて定量的に発現量を比較した。
その結果、図１Ｂに示されるように、ＹＩＧＳＲペプチドによる処理時間が長くなるほど、Ｈｓ２７細胞でＩ型コラーゲンの発現が増加し、２４時間処理した場合、ＹＩＧＳＲペプチドで未処理のＨｓ２７細胞に比べて、Ｉ型コラーゲンの発現レベルが約５倍程度増加した。
１−２：定量的ＲＴ−ＰＣＲを利用したＹＩＧＳＲペプチドによるＩ型コラーゲン発現の変化分析
引き続き、本発明者は、ＹＩＧＳＲペプチドのＩ型コラーゲン生成に及ぼす影響をｍＲＮＡレベルで確認した。各濃度（０、１０、１０２、１０３、１０４、及び１０５ｎＭ）のペプチドで２４時間、前記実施例３のＨｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、処理された細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ社、米国）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡ １μｇをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー及び白血病ウイルス逆転写酵素を用いて逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ＰＣＲを行った。その後、前記ＰＣＲ増幅産物８μｌ、２×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｍＩプリミックスＥｘＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社、日本）１０μｌ、１μＭの順方向及び逆方向プライマー混合物２μｌを混合し、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＰＣＲをＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。この際、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ条件は、９５℃で１分間加熱した後、９５℃で１５秒（変性）、６０℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で３０秒（増幅）を４０サイクル繰り返して増幅させた。そして、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍから提供された変性曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡを確認するために使用したプライマーは、以下の通りである。
引き続き、本発明者は、ＹＩＧＳＲペプチドのＩ型コラーゲン生成に及ぼす影響をｍＲＮＡレベルで確認した。各濃度（０、１０、１０２、１０３、１０４、及び１０５ｎＭ）のペプチドで２４時間、前記実施例３のＨｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、処理された細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ社、米国）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、前記抽出されたＲＮＡ １μｇをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー及び白血病ウイルス逆転写酵素を用いて逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ＰＣＲを行った。その後、前記ＰＣＲ増幅産物８μｌ、２×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｍＩプリミックスＥｘＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社、日本）１０μｌ、１μＭの順方向及び逆方向プライマー混合物２μｌを混合し、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＰＣＲをＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。この際、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ条件は、９５℃で１分間加熱した後、９５℃で１５秒（変性）、６０℃で１５秒（アニーリング）、７２℃で３０秒（増幅）を４０サイクル繰り返して増幅させた。そして、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍから提供された変性曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡを確認するために使用したプライマーは、以下の通りである。
順方向プライマー：５′−ＧＡＡＣＧＣＧＴＧＴＣＡＴＣＣＣＴＴＧＴ−３′（配列番号２）；及び
逆方向プライマー：５′−ＧＡＡＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ−３′（配列番号３）。
逆方向プライマー：５′−ＧＡＡＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ−３′（配列番号３）。
その結果、図１Ｃに示されるように、Ｉ型コラーゲンタンパク質の発現レベルと類似した傾向を示し、１０３ｎＭ ＹＩＧＳＲペプチドで処理した場合、Ｉ型コラーゲンのｍＲＮＡレベルが最も高かった（図１Ｃ参照）。前記結果は、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドが転写レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ）でＩ型コラーゲンを調節するということを立証するものである。
実験例２：ＹＩＧＳＲペプチドによる細胞生存率の変化分析
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドの細胞生存に及ぼす影響を確認するために、ペプチド処理濃度及び処理時間による細胞生存率をＭＴＴ分析により確認した。
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドの細胞生存に及ぼす影響を確認するために、ペプチド処理濃度及び処理時間による細胞生存率をＭＴＴ分析により確認した。
前記実施例３のＨｓ２７細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０４細胞の比率で播種した後、２４時間培養し、その後、血清が含まれていない培地で２４時間さらに培養した。そして、実施例１のＹＩＧＳＲペプチドを０、１０、１０２、１０３、１０４、及び１０５ｎＭの濃度で処理し、２４時間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳに溶解した０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈｉ社、米国）を添加し、３７℃で３時間、ＣＯ２細胞培養器で反応させた。その後、前記ＭＴＴ溶液を除去し、１００μｌ ＤＭＳＯ溶液をそれぞれのウェルに添加し、前記プレートを１０分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）し、５４０ｎｍで溶液の吸光度を測定した。
その結果、図２Ａに示されるように、実施例１のＹＩＧＳＲペプチドで未処理の対照群と比較した場合、ＹＩＧＳＲペプチドを処理した細胞の生存率は有意な差を示さず、ＹＩＧＳＲペプチド処理量依存的な細胞生存率の差も観察されなかった。
引き続き、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドの処理時間による細胞生存率を分析した。前記実施例２のＨｓ２７細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０４細胞の比率で播種した後、２４時間培養し、その後、血清が含まれていない培地で２４時間さらに培養した。そして、実施例１のＹＩＧＳＲペプチドを１０３ｎＭの濃度で処理し、０時間、０．１時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間培養し、細胞生存率を分析した。
その結果、図２Ｂに示されるように、実施例１のＹＩＧＳＲペプチドを１μＭで処理し、Ｈｓ２７細胞の生存率を２４時間観察した場合も、未処理の場合と有意な差を示さなかった（図２Ｂ参照）。このような結果は、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドが細胞生存に影響を及ぼさずに、転写レベルでＩ型コラーゲンの発現を調節するということを立証するものである。
実験例３：ＹＩＧＳＲペプチドによるＭＭＰ−１発現の変化分析
ＭＭＰ−１は、コラーゲンを分解するタンパク質分解酵素としてよく知られている。これにより、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現増加が、ＭＭＰ−１の発現減少によるものであるか否かを確認するために、ＹＩＧＳＲペプチド処理時間によるＭＭＰ−１発現レベルをウエスタンブロット分析により確認した。前記実施例２のＨｓ２７細胞を培養しながら、血清が含まれていない培地で２４時間さらに培養した後、実施例１のＹＩＧＳＲペプチドを１０３ｎＭの濃度で処理し、０時間、０．１時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間培養した。その後、前記細胞について実験例１の記載と同じ条件でウエスタンブロットを行い、この際、１次抗体としてＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を利用した。また、ウエスタンブロット分析イメージについて、イメージＪプログラム（Ｖｅｒ１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて定量的に発現量を比較した。
ＭＭＰ−１は、コラーゲンを分解するタンパク質分解酵素としてよく知られている。これにより、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現増加が、ＭＭＰ−１の発現減少によるものであるか否かを確認するために、ＹＩＧＳＲペプチド処理時間によるＭＭＰ−１発現レベルをウエスタンブロット分析により確認した。前記実施例２のＨｓ２７細胞を培養しながら、血清が含まれていない培地で２４時間さらに培養した後、実施例１のＹＩＧＳＲペプチドを１０３ｎＭの濃度で処理し、０時間、０．１時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間培養した。その後、前記細胞について実験例１の記載と同じ条件でウエスタンブロットを行い、この際、１次抗体としてＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を利用した。また、ウエスタンブロット分析イメージについて、イメージＪプログラム（Ｖｅｒ１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて定量的に発現量を比較した。
その結果、図３に示されるように、ＹＩＧＳＲペプチドの処理時間によってＭＭＰ−１タンパク質の発現レベルに有意な差は観察されなかった（図３参照）。
これは、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドの処理による細胞内コラーゲン発現の増加が、ＭＭＰ−１発現減少によるものではなく、Ｉ型コラーゲン遺伝子発現を増加させるシグナル伝逹プロセスが活性化されることによって誘導されたものであるということを立証するものである。
実験例４：ＹＩＧＳＲペプチドによるＦＡＫ、Ｐｙｋ２、及びＥＲＫのリン酸化レベルの変化分析
Ｉ型コラーゲン発現を調節するシグナル伝達プロセスを解明するために、本発明者は、ラミニン受容体の下位シグナル伝達機構に焦点を合わせた。ＹＩＧＳＲペプチドは、ラミニン受容体と結合して細胞内シグナルを伝達することが知られており、例えば、このような細胞内シグナル伝逹としては、ＦＡＫ及びＰｙｋ２のリン酸化が知られている。ＦＡＫは、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）リン酸化酵素であって、細胞の付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）及び延展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）プロセスに関与することが知られている（Ｊ．Ｔ．Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：５６０６−５６１３，２０００）。ＦＡＫは、細胞間の局所付着（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）に関与し、細胞移動及び生存に重要な役割を担うことが知られている（Ｊ．Ｌ．Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５８：６９０−６９２，１９９２）。Ｐｙｋ２は、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＭＡＰリン酸化酵素シグナル伝達機構プロセスを通じて細胞延展及び移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に重要な役割を担うことが知られている（Ｈ．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：５４４１−５４４７，２００２）。これにより、本発明者は、ＹＩＧＳＲペプチド処理時間によるＦＡＫ、ｐｙＫ２、及びＥＲＫのリン酸化レベルをウエスタンブロット分析により観察した。ウエスタンブロット分析は、前記実験例１の条件と同様に行い、１次抗体としてＦＡＫ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ｐｙｋ２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｙｋ２（Ｔｙｒ４０２、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ＥＲＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｃａｍ社、米国）を利用した。
Ｉ型コラーゲン発現を調節するシグナル伝達プロセスを解明するために、本発明者は、ラミニン受容体の下位シグナル伝達機構に焦点を合わせた。ＹＩＧＳＲペプチドは、ラミニン受容体と結合して細胞内シグナルを伝達することが知られており、例えば、このような細胞内シグナル伝逹としては、ＦＡＫ及びＰｙｋ２のリン酸化が知られている。ＦＡＫは、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）リン酸化酵素であって、細胞の付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）及び延展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）プロセスに関与することが知られている（Ｊ．Ｔ．Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：５６０６−５６１３，２０００）。ＦＡＫは、細胞間の局所付着（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）に関与し、細胞移動及び生存に重要な役割を担うことが知られている（Ｊ．Ｌ．Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５８：６９０−６９２，１９９２）。Ｐｙｋ２は、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＭＡＰリン酸化酵素シグナル伝達機構プロセスを通じて細胞延展及び移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に重要な役割を担うことが知られている（Ｈ．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：５４４１−５４４７，２００２）。これにより、本発明者は、ＹＩＧＳＲペプチド処理時間によるＦＡＫ、ｐｙＫ２、及びＥＲＫのリン酸化レベルをウエスタンブロット分析により観察した。ウエスタンブロット分析は、前記実験例１の条件と同様に行い、１次抗体としてＦＡＫ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ｐｙｋ２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｙｋ２（Ｔｙｒ４０２、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、ＥＲＫ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｃａｍ社、米国）を利用した。
その結果、図４Ａに示されるように、ＦＡＫのリン酸化（Ｔｙｒ３９７）がＹＩＧＳＲペプチド処理時間によって顕著に増加する傾向を示し、ＦＡＫのリン酸化レベルは、０．１時間（６分）で増加し始めて、２４時間までリン酸化が持続した。また、このようなタンパク質発現レベルを濃度分析により定量的に比較した場合、ＹＩＧＳＲペプチド処理によって未処理の場合と比べて、約２倍程度増加し、このようなリン酸化レベルは、処理２４時間まで保持された（図４Ｂ参照）。
また、Ｐｙｋ２リン酸化（Ｔｙｒ４０２）は、ＦＡＫのリン酸化よりも遅い時点であるＹＩＧＳＲペプチド処理６時間後から増加が観察され、濃度分析を比較した結果、１２時間処理した場合には、未処理の場合と比べて、約１．５倍程度リン酸化が増加した（図４Ａ及び図４Ｂ参照）。
また、ＭＡＰＫ／ＥＲＫの場合、リン酸化レベルがＹＩＧＳＲペプチドの処理後直ちに急激に、未処理の場合に比べて約２．５倍増加し、このようなリン酸化増加が２４時間まで増加した（図４Ａ及び図４Ｂ参照）。
前記結果は、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドが、Ｈｓ２７ヒト皮膚線維芽細胞でＦＡＫ、Ｐｙｋ２、及びＥＲＫを含む下位シグナル伝達機構によりラミニン受容体のリン酸化を誘導するということを立証するものである。
実験例５：ＦＡＫ及びＭＥＫ抑制剤によるＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲン発現の変化分析
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現が、ＦＡＫ及びＭＡＰＫによって媒介されるか否かを確認するために、ＦＡＫ及びＭＥＫ抑制剤を利用した。
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現が、ＦＡＫ及びＭＡＰＫによって媒介されるか否かを確認するために、ＦＡＫ及びＭＥＫ抑制剤を利用した。
前記実施例３のＨｓ２７細胞を２４ウェルプレートで培養しながら、前記細胞を２４時間血清がない状態で培養した。その後、前記細胞を、１μＭのＦＡＫ特異的抑制剤ＰＦ５７３２２８（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、英国）で２４時間処理した。この際、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドによるＩ型コラーゲンの発現誘導が、ＦＡＫによって媒介されるか否かを確認するために、１μＭ ＹＩＧＳＲペプチドで共に処理し、又は未処理で、Ｉ型コラーゲンの発現をウエスタンブロット分析により分析した。
その結果、図５Ａに示されるように、ＦＡＫ抑制剤であるＰＦ５７３２２８で処理した場合に、ＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現が顕著に抑制された。このような結果は、ＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現がＦＡＫ活性によって媒介されるということを立証するものである（図５Ａ参照）。
また、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達機構が、ＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現に関連しているかを確認するために、Ｈｓ２７細胞にＹＩＧＳＲペプチドとＭＡＰＫ／ＥＲＫ特異的な抑制剤であるＰＤ９８０５９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）とを処理し、前記ＦＡＫ抑制剤処理の実験と同じ条件で実験を行った。
その結果、図５Ｂに示されるように、ＭＥＫ抑制剤であるＰＤ９８０５９で処理した場合に、ＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現が顕著に抑制された（図５Ｂ参照）。すなわち、前記結果は、ＹＩＧＳＲペプチドによって誘導されるＩ型コラーゲンの発現が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達機構によって媒介されるということを立証するものである（図５Ｂ参照）。
実験例６：Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲペプチドによるコラーゲン合成及びＥＲＫリン酸化分析
前記実施例１及び実施例２、及び比較例２で製造したペプチド誘導体で培養中のＨｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、前記細胞でのＩ型コラーゲン発現量を免疫ブロッティング分析法で測定した。前記Ｈｓ２７皮膚線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ社、米国）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ社、米国）を用いて、湿度９５％、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。各濃度（０μＭ、２μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び１００μＭ）のペプチドで２４時間、あるいは１００μＭのペプチドで各時間（０時間、０．５時間、６時間、１２時間、及び２４時間）、前記Ｈｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、処理された細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で超音波粉砕した後、遠心分離して上澄み液を分離して、ブラッドフォード法で定量した。同量のタンパク質を５×試料緩衝液に混合して、９５℃で５分間加熱した後、６〜１５％濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、ニトロセルロース膜に吸着させた。抗−Ｉ型コラーゲン１次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、米国）、抗−リン酸化−ＥＲＫ１次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、及び抗−アクチン１次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、米国）を、５％スキームミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有トリス緩衝食塩水、ｐＨ７．６）に希釈して、１６時間反応させた後、ＴＢＳＴで１０分間６回洗浄した。その後、抗−マウスラビットペルオキシダーゼ−結合２次抗体（ＫＰＬ社、米国）で処理し、室温で１時間反応させた後、再びＴＢＳＴで１０分間６回洗浄し、ＥＣＬ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国）で発色させて確認した。
前記実施例１及び実施例２、及び比較例２で製造したペプチド誘導体で培養中のＨｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、前記細胞でのＩ型コラーゲン発現量を免疫ブロッティング分析法で測定した。前記Ｈｓ２７皮膚線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ社、米国）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ社、米国）を用いて、湿度９５％、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。各濃度（０μＭ、２μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び１００μＭ）のペプチドで２４時間、あるいは１００μＭのペプチドで各時間（０時間、０．５時間、６時間、１２時間、及び２４時間）、前記Ｈｓ２７皮膚線維芽細胞を処理した後、処理された細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で超音波粉砕した後、遠心分離して上澄み液を分離して、ブラッドフォード法で定量した。同量のタンパク質を５×試料緩衝液に混合して、９５℃で５分間加熱した後、６〜１５％濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、ニトロセルロース膜に吸着させた。抗−Ｉ型コラーゲン１次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、米国）、抗−リン酸化−ＥＲＫ１次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国）、及び抗−アクチン１次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、米国）を、５％スキームミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有トリス緩衝食塩水、ｐＨ７．６）に希釈して、１６時間反応させた後、ＴＢＳＴで１０分間６回洗浄した。その後、抗−マウスラビットペルオキシダーゼ−結合２次抗体（ＫＰＬ社、米国）で処理し、室温で１時間反応させた後、再びＴＢＳＴで１０分間６回洗浄し、ＥＣＬ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国）で発色させて確認した。
その結果、皮膚線維芽細胞においてＰａｌ−ＹＩＧＳＲがコラーゲン生成に及ぼす影響は、濃度が増加するほど、コラーゲン合成量が増加し、露出時間が増加するほど、コラーゲン合成量が増加する態様を示した（図６）。ＹＩＧＳＲも、Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲよりはその程度が弱いが、コラーゲン合成を増加させた。しかし、ｏｌｅｙｌ−ＹＩＧＳＲの場合には、コラーゲン合成の程度において、対照群と大きな差がなかった（図７）。
それだけではなく、皮膚線維芽細胞においてＰａｌ−ＹＩＧＳＲによるＥＲＫリン酸化誘導も、観察することができた（図８）。しかし、ＹＩＧＳＲ及びｏｌｅｙｌ−ＹＩＧＳＲの場合、ＥＲＫリン酸化に及ぼす影響が微小であった。
実験例７：パルミトイル基の影響分析
本発明者らは、Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲによるコラーゲン合成増加が純粋にパルミトイル基による影響であるか否かを確認するために、細胞付着能が知られているＲＧＤペプチドを用いて実験を行った。
本発明者らは、Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲによるコラーゲン合成増加が純粋にパルミトイル基による影響であるか否かを確認するために、細胞付着能が知られているＲＧＤペプチドを用いて実験を行った。
具体的には、比較例１で製造したＰａｌ−ＲＧＤペプチドとパルミトイル基が付着されていないＲＧＤペプチドとを用いて、前記実験例１と同様に実験を行った。
その結果、ＲＧＤペプチド及びＰａｌ−ＲＧＤペプチドはいずれもコラーゲン合成の程度において、対照群と大きな差がなかった（図１０）。これは、本発明のペプチド誘導体によるコラーゲン合成増加が、単にパルミトイル基自体の機能によるものではないことを示唆するものである。
実験例８：Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲペプチドによる細胞増殖の測定
前記Ｈｓ２７皮膚線維芽細胞を２４ウェル培養容器に４０，０００個ずつ播種した後、５％のＣＯ２、３７℃下で２４時間培養して、細胞を培養容器の底に付着させた。翌日、ＦＢＳを含んだ培地に交換して、再び２４時間を培養した後、前記実施例１及び実施例２、そして、比較例１及び比較例２のペプチド誘導体で濃度別に処理し、再び７２時間培養して、クリスタルバイオレット法（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ａｓｓａｙ）で細胞の増殖を測定した。
前記Ｈｓ２７皮膚線維芽細胞を２４ウェル培養容器に４０，０００個ずつ播種した後、５％のＣＯ２、３７℃下で２４時間培養して、細胞を培養容器の底に付着させた。翌日、ＦＢＳを含んだ培地に交換して、再び２４時間を培養した後、前記実施例１及び実施例２、そして、比較例１及び比較例２のペプチド誘導体で濃度別に処理し、再び７２時間培養して、クリスタルバイオレット法（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ａｓｓａｙ）で細胞の増殖を測定した。
具体的には、まず、それぞれのウェルの培地を除去した後、１ウェル当たり５００ｍｌの０．１％クリスタルバイオレット溶液を添加して５分間染色した後、クリスタルバイオレット溶液を除去し、３次蒸留水でウェルが清浄になるまで４回洗浄した。洗浄される蒸留水が清浄になれば、蒸留水を除去し、９５％エタノールを１ｍｌ添加して２０分間撹拌しながら、細胞に染色されたクリスタルバイオレットを溶解する。この溶液を９６ウェル容器に２００ｍｌずつ分注し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５９０ｎｍで吸光度を測定した後、試験物質で処理していない群を対照群として、相対的な細胞増殖を計算した。
その結果、Ｐａｌ−ＹＩＧＳＲは、０．５〜５０μＭ濃度範囲で細胞増殖が示され、特に、１００μＭ及び５００μＭ濃度範囲で、それぞれ１３％及び２３％の細胞増殖を示した（図９）。
前述のように、本発明の一実施形態に係るＰａｌ−ＹＩＧＳＲペプチド誘導体は、培養した皮膚線維芽細胞でＩ型コラーゲン生成を増加させ、線維芽細胞の増殖を促進したが、これは、今後、抗老化及び傷再生製剤開発時に、本発明のペプチド誘導体が、有効物質として使用され得るということを立証するものである。
製造例
製造例１：注射液剤
ＹＩＧＳＲペプチド誘導体１０ｍｇを含有する注射液剤は、次のような方法で製造した。
製造例１：注射液剤
ＹＩＧＳＲペプチド誘導体１０ｍｇを含有する注射液剤は、次のような方法で製造した。
ＹＩＧＳＲペプチド誘導体１０ｍｇ、塩化ナトリウム０．６ｇを精製水に溶解して１００ｍｌとした。この溶液を０．２μｍフィルターでフィルタリングして滅菌した。
前記注射液剤の構成成分は、以下の通りである。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
塩化ナトリウム ０．６
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
塩化ナトリウム ０．６
製造例２：柔軟化粧水（スキンローション）
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する柔軟化粧水を通常の方法によって製造した。
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する柔軟化粧水を通常の方法によって製造した。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
ブチレングリコール ２．０
プロピレングリコール ２．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
ＰＥＧ−１２ノニルフェニルエーテル ０．２
ポリソルベート８０ ０．４
エタノール １０．０
トリエタノールアミン ０．１
防腐剤、色素、香料 適量
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
ブチレングリコール ２．０
プロピレングリコール ２．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
ＰＥＧ−１２ノニルフェニルエーテル ０．２
ポリソルベート８０ ０．４
エタノール １０．０
トリエタノールアミン ０．１
防腐剤、色素、香料 適量
製造例３：栄養化粧水（ミルクローション）
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する栄養化粧水を通常の方法によって製造した。
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する栄養化粧水を通常の方法によって製造した。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
蜜蝋 ４．０
ポリソルベート６０ １．５
セスキオレイン酸ソルビタン １．５
流動パラフィン ０．５
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ５．０
グリセリン ３．０
ブチレングリコール ３．０
プロピレングリコール ３．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
トリエタノールアミン ０．２
防腐剤、色素、香料 適量
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
蜜蝋 ４．０
ポリソルベート６０ １．５
セスキオレイン酸ソルビタン １．５
流動パラフィン ０．５
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ５．０
グリセリン ３．０
ブチレングリコール ３．０
プロピレングリコール ３．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
トリエタノールアミン ０．２
防腐剤、色素、香料 適量
製造例４：栄養クリーム
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する栄養クリームを通常の方法によって製造した。
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する栄養クリームを通常の方法によって製造した。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
蜜蝋 １０．０
ポリソルベート６０ １．５
ＰＥＧ−６０硬化ヒマシ油 ２．０
セスキオレイン酸ソルビタン ０．５
流動パラフィン １０．０
スクアラン ５．０
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ５．０
グリセリン ５．０
ブチレングリコール ３．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．２
防腐剤、色素、香料 適量
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
蜜蝋 １０．０
ポリソルベート６０ １．５
ＰＥＧ−６０硬化ヒマシ油 ２．０
セスキオレイン酸ソルビタン ０．５
流動パラフィン １０．０
スクアラン ５．０
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ５．０
グリセリン ５．０
ブチレングリコール ３．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．２
防腐剤、色素、香料 適量
製造例５：マッサージクリーム
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有するマッサージクリームを通常の方法によって製造した。
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有するマッサージクリームを通常の方法によって製造した。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
蜜蝋 １０．０
ポリソルベート６０ １．５
ＰＥＧ−６０硬化ヒマシ油 ２．０
セスキオレイン酸ソルビタン ０．８
流動パラフィン ４０．０
スクアラン ５．０
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ４．０
グリセリン ５．０
ブチレングリコール ３．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．２
防腐剤、色素、香料 適量
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
蜜蝋 １０．０
ポリソルベート６０ １．５
ＰＥＧ−６０硬化ヒマシ油 ２．０
セスキオレイン酸ソルビタン ０．８
流動パラフィン ４０．０
スクアラン ５．０
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ４．０
グリセリン ５．０
ブチレングリコール ３．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．２
防腐剤、色素、香料 適量
製造例６：パック
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有するパックを通常の方法によって製造した。
以下のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有するパックを通常の方法によって製造した。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
ポリビニルアルコール １３．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
グリセリン ５．０
アラントイン ０．１
エタノール ６．０
ＰＥＧ−１２ノニルフェニルエーテル ０．３
ポリソルベート６０ ０．３
防腐剤、色素、香料 適量
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
ポリビニルアルコール １３．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
グリセリン ５．０
アラントイン ０．１
エタノール ６．０
ＰＥＧ−１２ノニルフェニルエーテル ０．３
ポリソルベート６０ ０．３
防腐剤、色素、香料 適量
製造例７：皮膚充填剤
以下の表のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する皮膚充填剤を通常の方法によって製造した。
以下の表のように、ＹＩＧＳＲペプチドを含有する皮膚充填剤を通常の方法によって製造した。
成分 含量（重量％）
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
ヒトコラーゲン ３．５
塩化カリウム（ＫＣｌ） ０．０２
第一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４） ０．０２４
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ０．８
第二リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４） ０．１１４５
防腐剤 適量
精製水 １００になるまで
ＹＩＧＳＲペプチド ０．０１
ヒトコラーゲン ３．５
塩化カリウム（ＫＣｌ） ０．０２
第一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４） ０．０２４
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ０．８
第二リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４） ０．１１４５
防腐剤 適量
前記実施例、実験例、及び製造例を参考にして本発明を説明したが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他の実施形態が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。
本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドは、転写レベルでＩ型コラーゲンの生成を増加させ、細胞の生存率に影響を及ぼさず、Ｉ型コラーゲンタンパク質を分解させるＭＭＰ−１タンパク質加水分解酵素の発現を減少させないことを確認することによって、コラーゲン生成を誘導することができるということを立証した。したがって、本発明の一実施形態に係るＹＩＧＳＲペプチドは、コラーゲン減少によって誘発される皮膚老化及びしわ改善用の化粧料組成物、並びに創傷治療用薬学的組成物として有用に使用される。
配列番号１は、本発明の一実施形態に係るコラーゲン合成能がある配列を意味する。
配列番号２は、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ増幅のための順方向プライマーを意味する。
配列番号３は、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ増幅のための逆方向プライマーを意味する。
Claims (3)
- 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含む、皮膚老化軽減用組成物。
- 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含む、しわ改善用化粧料組成物。
- 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するＹＩＧＳＲペプチド、又は前記ペプチドのＮ末端にパルミトイル基が付加されたペプチド誘導体を有効成分として含む、皮膚充填剤。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2013/000122 WO2014109417A1 (ko) | 2013-01-08 | 2013-01-08 | 콜라겐 합성능이 있는 신규 펩타이드 및 그의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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