ITRM20070119A1 - Udo del ngf per la preparazione di mendicamenti per la cura della gliosi reattiva - Google Patents
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Description
"USO DEL NGF PER LA PREPARAZIONE DI MEDICAMENTI PER LA CURA DELLA GLIOSI REATTIVA"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda l'uso del NGF per la preparazione di un medicamento per la cura e/o la prevenzione della gliosi reattiva e metodi terapeutici per la cura e/o la prevenzione della gliosi reattiva mediante somministrazione di NGF.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
Gli astrociti costituiscono una delle componenti principali della glia, e sono le cellule più abbondanti nel Sistema Nervoso Centrale (SNC); il loro rapporto numerico rispetto alle cellule nervose aumenta con la maggiore complessità del SNC.
Le cellule gliali, per circa un secolo sono state oggetto di scarsa attenzione nell'ambito delle neuroscienze. Gli studi condotti nell'ultimo decennio hanno evidenziato un ruolo chiave di questi elementi nell'ambito sia di processi fisiologici che patologici. Le cellule gliali, inoltre, sia nel sistema nervoso in fase di sviluppo che in quello maturo, giocano un ruolo centrale nella formazione, nel mantenimento e nel funzionamento delle sinapsi.
Nel cervello adulto, gli astrociti partecipano alla propagazione dell'impulso nervoso rilasciando trasmettitori (gliotrasmissione) quali glutammato, ADP, D-serina ed eicosanoidi, in grado di modulare l'attività sinaptica. Mediante il rilascio di tali sostanze, gli astrociti esercitano inoltre differenti effetti sui neuroni adiacenti, sulla stessa glia e sui vasi sanguigni. Le cellule gliali, infatti, esprimono un pool di recettori, trasportatori e canali ionici, mediante i quali possono ricevere ed integrare i messaggi neuronali e modulare l'efficienza delle sinapsi. Pertanto si può affermare che la glia partecipa attivamente al funzionamento del cervello. Per lungo tempo gli astrociti sono stati erroneamente considerati quali cellule di supporto. E' stato recentemente riconosciuto che gli astrociti sono organizzati in territori separati ma formanti un sincizio e che sono elementi di comunicazione nel cervello in grado di generare vari segnali regolatori e avere una funzione di interfaccia e di connessione tra neuroni e tra neuroni e vasi. Queste scoperte hanno portato al concetto della "sinapsi tripartita". Questo tipo di contatto occupa una posizione privilegiata nel sistema nervoso centrale all'interfaccia tra capillari e neuroni. Risulta coinvolto nel metabolismo cerebrale e può pertanto essere responsabile dei cambiamenti nel flusso sanguigno cerebrale, un indice indiretto dell'attività corticale registrabile mediante tecniche di imaging funzionale (fMRI).
Numerosi dati provano il ruolo specifico ed essenziale degli astrociti oltre che nelle normali funzioni cerebrali anche nello sviluppo e nella progressione dei processi neurodegenerativi. Gli astrociti, sono disposti in maniera ordinata e ciascuna cellula copre un ben delineato territorio, collocati in modo da consentire interazioni locali. Gli astrociti prendono contatto con il microcircolo sanguigno e possono contattare diversi neuroni, numerose fibre nervose e centinaia o migliaia di sinapsi. A seguito di un danno o di un insulto a carico del SNC, si determina una risposta gliale nota come gliosì reattiva, caratterizzata da ipertrofia cellulare, aumento dell'espressione delle proteine del citoscheletro quali la vimentina e la GFAP (proteina gliale fibrillare acida), regolazione positiva delle proteine dei filamenti intermedi (IF), riespressione della nestina e nella prima settimana anche divisione cellulare (Okada, S. et al, 2006), fattori che partecipano alla formazione della rete di IF. E' riportato in letteratura (Bushong et al 2002, 2004) che nella gliosi reattiva, la rete di IF diventa molto prominente in particolare nei processi principali e nel soma degli astrociti e ciò è accompagnato dall'espressione alterata di numerose proteine (Eddleston and Mucke 1993, Hernandez et al 2002),
Le cellule subiscono quindi cambiamenti morfologici e metabolici. Il processo di attivazione degli astrociti è a tutt'oggi piuttosto enigmatico ma viene oramai riconosciuto come una reazione della glia, con caratteristiche funzionali e strutturali ben precise. Astrociti attivati sono presenti in varie condizioni patologiche del sistema nervoso centrale quali infarto, trauma, crescita tumorale o malattie neurodegenerative quali morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattie da triplette, sclerosi laterale amiotrofica, sclerosi multipla.
La gliosi quindi, a seconda della regione in cui insorge, sembrerebbe alla base dello sviluppo di numerose patologie dai disordini neurodegenerativi (gliosi cerebellare nella Atassia Spino Cerebellare di tipo 1 - SCA1 - , gliosi mesencefalica-striataìe nel Morbo di Parkinson, corticale nel Morbo di Alzheimer), al dolore neuropatico. Le cellule girali ipertrofiche e attivate possono così determinare una sorta di compressione del parenchima circostante inducendone una sofferenza e, in concomitanza alla disregolazione delle proteine sopra indicate, creare un substrato per lo sviluppo di patologie.
La gliosi, oltre a favorire l'insorgenza delle patologie neurodegenerative e ad inibire la rigenerazione del SNC, è anche coinvolta nel dolore neuropatico associato a traumi a carico del SNC. Numerosissime pubblicazioni scientifiche riportano prove sempre più evidenti del fatto che la gliosi a livello del midollo spinale è responsabile dell'insorgenza e della persistenza del dolore patologico legato ad infiammazioni, neuropatìe e attivazione immunitaria spinale. E' stato in effetti dimostrato in modelli sperimentali, che la gliosì reattiva è necessaria a creare stati di dolore patologico in animali da laboratorio.
L'insorgenza di gliosi a seguito di un trauma al SNC sembra avere, nella fase acuta successiva al trauma, un effetto reattivo - protettivo, ma successivamente agisce negativamente limitando la rigenerazione e la funzionalità del SNC.
Inoltre, è stato anche riportato che nel cervello senescente, è presente una leggera e progressiva gliosi reattiva, che sembra essere uno dei fattori che inibisce la neurogenesi negli anziani.
Nonostante l'evidente importanza patologica della gliosi, non sono ancora noti trattamenti terapeutici che possano indurre la reversione di tale fenomeno. Esistono delle sostanze in grado di inibire l'attivazione della glia ma non sono utilizzabili a livello farmacologico.
Come è anche riportato nel lavoro di Watkins e Maier, (Nature reviews, 2, 2003, 973-85), la glia costituisce un nuovo target farmacologico e appare quindi auspicabile, dati i molteplici effetti della gliosi, identificare sostanze e/o farmaci in grado di combattere tale processo in maniera preventiva e/o curativa, ed evitare quindi l'insorgere delle patologie ad essa correlate.
Sono riportati in letteratura studi con risultati estremamente discordanti sull'uso dell'NGF per combattere il dolore nervoso post traumatico. In numerosi lavori anche molto recenti, il ruolo dell'NGF rimane controverso (Sah et al, Nature reviews 2003, 2. 460-72) in quanto la sua somministrazione sembra addirittura indurre la comparsa del dolore neuropatico {allodinia ed iperalgesia) . Infatti è stato riportato che la somministrazione di NGF induce iperalgesia termica e che la somministrazione di un antagonista del recettore del NGF, ALE-0540, riduce l'allodinia meccanica secondo un meccanismo dose-dipendente. Altri studi riportano che l'infusione cronica intratecale di anti-NGF ha effetti minimi sull'allodinia in modelli di dolore neuropatico. Secondo altri studi l'NGF ripristina l'effetto analgesico degli oppioidi nel danno da costrizione cronica. In ogni caso, nonostante i risultati estremamente discordi per quanto riguarda il ruolo dell'NGF nell'induzione del dolore neuropatico non sono riportati casi in letteratura dimostranti l'effetto modulatorio dell'NGF sulla gliosi reattiva descritta come fenomeno centrale anche nei processi di dolore cronico.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Nella presente invenzione è stato scoperto che l'NGF o sostanze che ne mimino la funzione, quando somministrate nel sito della lesione, sono in grado non solo di prevenire la comparsa della gliosi reattiva, ma addirittura di revertire tale processo, ripristinando una glia non più ipertrofica, evitando o addirittura facendo scomparire le patologie correlate alla gliosi nel compartimento interessato.
E' quindi oggetto dell'invenzione l'uso dell'NGF, o di suoi frammenti o derivati funzionalmente attivi, cioè agonisti completi o parziali dell'NGF, o di sostanze che ne mimino la funzione (agonisti), per la preparazione di medicamenti per la prevenzione e/o il trattamento della gliosi reattiva.
E' anche oggetto dell'invenzione un metodo terapeutico che comprende la somministrazione in dosi farmaceuticamente efficaci, di NGF o di suoi derivati o frammenti funzionalmente attivi, cioè agonisti o parzialmente agonisti dell'NGF, o di sostanze che ne mimino la funzione (agonisti), nel o in prossimità della lesione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
La figura la rappresenta tre reperti istopatologici di midollo spinale provenienti, nell'ordine da sinistra a destra, da animali resi neuropatici mediante costrizione del nervo sciatico, trattati come descritto nell'esempio 2, con NGF, ACSF, e, in ultimo, animali sani di controllo sui quali è stata effettuata l'analisi dell'espressione del marcatore di gliosi reattiva, GFAP.
L'istogramma sotto riportato rappresenta la rispettiva quantizzazione della determinazione del marcatore, i valori per l'animale trattato con NGF sono simili ai valori misurati sull'animale di controllo sano, indicando che l'NGF inibisce la comparsa di gliosi reattiva.
La figura lb rappresenta tre reperti istopatologici di midollo spinale provenienti, nell'ordine da sinistra a destra, da animali resi neuropatici mediante costrizione del nervo sciatico, trattati come descritto nell'esempio 2, con NGF, ACSF, e, in ultimo, animali sani di controllo sui quali è stata effettuata l'analisi dell'espressione del marcatore rappresentativo del numero di astrociti, SlOOp.
L'istogramma sotto riportato rappresenta la rispettiva quantizzazione della determinazione del marcatore, i valori nei tre casi sono paragonabili
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Secondo l'invenzione, l'NGF o suoi frammenti o derivati farmacologicamente attivi come agonisti dell'NGF, possono essere utilizzati per la regressione e/o la prevenzione della gliosi reattiva e per la preparazione di medicamenti atti a tale scopo. Poiché la gliosi reattiva è una fenomeno che precede l'insorgenza della malattia, l'NGF può essere utilizzato per la prevenzione dell'insorgenza delle malattie che seguono la gliosi. Tali patologie includono: infarto, danni da trauma, crescita tumorale o malattie neurodegenerative quali morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattie da triplette, sclerosi laterale amiotrofica, sclerosi multipla e dolore neuropatico. Nei casi in cui la gliosi sia il processo necessario e sufficiente per lo sviluppo di sintomi associati ad altre patologie, l'NGF può essere utilizzato anche per la cura di dette manifestazioni .
Esso può essere utilizzato per uso umano o animale.
Per uso umano, può essere utilizzato, NGF murino o NGF ricombinante umano (rhNGF) o possono essere utilizzati frammenti o derivati funzionalmente equivalenti attivi di NGF o sostanze che ne mimino la funzione. Come derivati funzionalmente equivalenti si intendono molecole in grado di promuovere almeno una delle risposte biologiche normalmente associate al NGF. Ad esempio composti in grado di supportare almeno una delle risposte biochimiche o morfologiche del NGF quali l'interazione con propri recettori, e/o l'attivazione del recettore trkA (autofosforilazione) , sopravvivenza neuronaie, o la crescita dei neuriti sono definiti agonisti del NGF. Per funzionalmente equivalenti [attivi] si intendono frammenti o derivati dell'NGF che mantengano la funzione fisiologica dell'NGF e che possano quindi sostituirsi alla molecola nativa.
Come NGF ricombinante può essere utilizzato, ai fini della realizzazione dell'invenzione, il beta rhNGF descritto nella domanda di brevetto PCT/IB2005/053159 avente le seguenti caratteristiche .
Il beta rhNGF descritto in tale domanda di brevetto, ed idoneo all'attuazione dell'invenzione, presenta attività biologiche paragonabili a quelle presentate da uguali dosi di mNGF 2.5S almeno nei seguenti saggi:
a. valutazione della differenziazione di cellule PC12 di feocromocitoma in neuroni sympathetic-like indotta da incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S;
b. valutazione della sopravvivenza e della differenziazione di gangli delle radici dorsali (DRG) espiantati da embrioni di pollo di 7-9gg e/o dei gangli simpatici paravertebrali espiantati da embrioni di pollo di 10-12gg dopo incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S;
c. valutazione della fosforilazione del recettore ad alta affinità trkA indotta su cellule PC12 da beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da uguali quantità di mNGF 2,5S; e
d. valutazione dell'induzione di ipertrofia di gangli cervicali superiori e dell'induzione della degranulazione di mastociti, della regolazione del livello di Sostanza P e del livello di espressione del recettore ad alta affinità trkA su tessuti cutanei in topi neonati trattati con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, con uguali quantità di mNGF 2,5S.
Dette attività biologiche, dovranno essere superiori al 76% di quelle presentate da uguali dosi di mNGF 2.5S in tutti i saggi sopra descritti. In particolare, nel saggio d. che rappresenta l'attività in vivo della molecola dell'invenzione, detta attività sarà vantaggiosamente compresa tra l'80 ad il 100% del mNGH 2.5S utilizzato come riferimento .
In una forma di realizzazione particolarmente vantaggiosa detta attività sarà compresa tra il 90 ed il 100% in tutti i saggi sopra descritti.
Ai fini dell'invenzione i saggi suddetti potranno essere realizzati secondo tutte le modalità note al tecnico del ramo purché siano sempre effettuati utilizzando uguali quantità e/o concentrazioni (ad esempio espresse in Molarità) dì beta rhNGF dell'invenzione e mNGF 2,5S.
Il beta rhNGF avente le proprietà sopra indicate ed idoneo alla realizzazione della presente invenzione può essere preparato secondo un procedimento che comprende i seguenti passaggi: i) la costruzione di un vettore di espressione idoneo ad espressione in cellule di mammifero e comprendente una sequenza di cDNA codificante per l'esone 3 del gene NGF umano, detta sequenza di cDNA includente una sequenza codificante la catena beta del NGF umano maturo {120 aa), una sequenza codificante la prosequenza della catena beta del NGF umano (103 aa) ed una sequenza codificante la sequenza segnale della catena beta del NGF umano {18 aa);
ii) la trasformazione di cellule di mammifero con detto vettore;
iii) la selezione di cloni cellulari in grado di secernere beta rhNGF avente attività biologiche superiori al 76% di quelle date dalla subunità 2.5S dell'NGF murino nativo nei seguenti saggi:
a. valutazione della differenziazione di cellule PC12 di feocromocitoma in neuroni sympathetic-like indotta da incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S;
b. valutazione della sopravvivenza e della differenziazione di gangli delle radici dorsali (DRG) espiantati da embrioni di pollo di 7-9gg e/o dei gangli simpatici paravertebrali espiantati da embrioni di pollo di 10-12gg dopo incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,53;
c. valutazione della fosforilazione del recettore ad alta affinità trkA indotta su cellule PC12 da beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da uguali quantità di mNGF 2,5S;
d. valutazione dell'induzione di ipertrofia di gangli cervicali superiori e dell'induzione della degranulazìone di mastociti, della regolazione del livello di sostanza P e del livello di espressione del recettore ad alta affinità trkA su tessuti cutanei in topi neonati trattati con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, con uguali quantità di mNGF 2,5S;
iv) messa in coltura delle cellule selezionate al punto iii) e recupero di detto beta rhNGF direttamente dal terreno di coltura cellulare.
Viene qui fornita una breve indicazione delle abbreviazioni utilizzate nel corso di questa descrizione:
rhNGF= Nerve Growth Factor ricombinante umano, (recombinant human Nerve Growth Factor);
mNGF= Nerve Growth Factor murino (murine 2.5S NGF or beta-NGF);
trkA= recettore NGF ad alta affinità (high affinity NGF receptor);
DRG= Gangli delle radici dorsali (Dorsal Root Ganglia);
SCG= Ganglio Cervicale Superiore (Superior Cervical Ganglion);
SP== Sostanza P.
Neuroni sympathetic-lik:e= cellule che presentano alcune caratteristiche dei neuroni simpatici quali processi neuritici simili a quelli dei neuroni simpatici, ed alcuni neurotrasmettitori quali dopamina e noreprinefrina.
L'analisi dell'attività biologica in vitro può essere effettuata utilizzando le cellule PC12 di feocromocitoma (Greene LA & Tischler AS, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73: 2424-2428, 1976). Dette cellule rappresentano il sistema neuronaie in vitro comunemente usato per analizzare la trasduzione del segnale dell'NGF e le risposte biochimiche e morfologiche indotte da questo fattore neurotrofico.
Un altro sistema neuronaie è costituito sia dai gangli delle radici dorsali (DRG) preparati da embrioni di pollo di 7, 8 o9 gg, sia i gangli simpatici paravertebrali preparati da embrioni di pollo di 10, 11 ol2 gg.
Il saggio al punto a. potrà essere effettuato valutando la differenziazione delle cellule PC12 sopra menzionate in neuroni sympathetic-like con formazione di lunghi processi neuritici. La differenziazione può essere, ad esempio, espressa come percentuale del numero di cellule con processi neuritici in un certo lasso di tempo o in termini di efficacia di differenziazione sempre in un determinato arco di tempo paragonata ad un sistema di controllo. Nella presente invenzione è stato usato come controllo positivo, ovvero di maggiore attività NGF al 100%, l'attività del mNGF 2.5S nelle stesse condizioni sperimentali.
La risposta di differenziazione può essere indotta dopo incubazione delle cellule con concentrazioni di beta rhNGF, o di mNGF 2.53, comprese tra 1 e 100 ng/ml, in particolare, tra 5 e 20 ng/ml, e può essere rilevata dopo un tempo che varia tra le 8 e le 48 ore in particolare per un tempo compreso tra le 16 e le 24 ore.
In una ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione il saggio al punto b. potrà essere effettuato su espianti di gangli delle radici dorsali (DRG) preparati da embrioni di pollo di 7-9gg e/o su espianti di gangli simpatici paravertebrali di embrioni di pollo di 10-12gg, valutando la sopravvivenza e differenziazione di detti espianti in presenza di concentrazioni di rhNGF, o di mNGF 2.5S, comprese tra 1 e 100 ng/ml e dopo un periodo di incubazione compreso tra 24-48 hr. La differenziazione e sopravvivenza possono essere mantenute in presenza delle suddette concentrazioni di rhNGF fino a 2-3 settimane circa.
Il saggio al punto c. potrà essere effettuato valutando la fosforilazione del recettore ad alta affinità trkA mediante esperimenti di immunoprecipitazione . Il picco di attivazione del recettore si può osservare in tempi brevi che variano tra 1 e 10 min, ma in particolare dopo 5 min., ed a concentrazioni di rhNGF, o di mNGF 2.5S, comprese tra 1 e 100 ng/ml, potranno ad esempio essere utilizzate concentrazioni di 5-10 ng/ml.
L'attività biologica del rhNGF in oggetto è analizzabile sia nel terreno di coltura condizionato delle cellule che producono rhNGF opportunamente diluito nel terreno di coltura delle cellule PC12 o dei gangli a dare le concentrazioni finali desiderate, sia nel terreno dei sistemi di produzione in media o larga scala in modo da verificare che l'attività biologica del rhNGF prodotto in detti sistemi rimanga paragonabile, nelle modalità sopra indicate, a quelle del mNGF 2.5S. Idonei sistemi di produzione in media o larga scala possono essere, ad esempio, sistemi di produzione in commercio quali MiniPERM® (Greiner Bio-One, Germany), Roller Bottles o qualsiasi altro sistema di bioreattore noto al tecnico del settore per la produzione in media o larga scala di proteine ricombinanti in cellule di mammifero che crescono in adesione.
Per il saggio al punto d. concernente l'attività biologica in vivo, si possono utilizzare topi neonati. Iniettando in parallelo beta rhNGF o 2.5S NGF murino a dosi uguali, normalmente di circa 5 Dg/gr di peso corporeo per 5 gg consecutivi si può successivamente valutare l'attività biologica della neurotrofina ricombinante prodotta su: gangli cervicali superiori (ipertrofia) e tessuto cutaneo nel punto di iniezione (attivazione dei mastociti e regolazione dei livelli di Sostanza P e trkA).
Per quanto riguarda l'ipertrofia dei gangli SCG si potrà effettuare un'analisi istologica paragonando l'effetto del beta rhNGF utilizzato a quello della neurotrofina raurina mediante tecniche di fissazione e colorazione dei preparati standard, ben note al tecnico del settore, quali ad esempio colorazione con blu di toluidina.
Per realizzare il hrNGF descritto nella domanda di brevetto sopra citata, il cDNA di interesse può essere clonato mediante tecniche standard di PCR utilizzando, ad esempio primers, ottenibili con programmi standard, in grado di amplificare la regione di interesse (esone 3) utilizzando sequenze dell'NGF umano pubblicate, per disegnare i primers. Successivamente, il cDNA di interesse (esone 3 del gene umano NGF, pubblicato in letteratura, es. Ullrich et al., Nature 303: B21-825, 1983) può essere inserito in vettori che permettano di verificare l'esattezza della sequenza inserita che dovrà comprendere la sequenza codificante i 120 aa del NGF umano maturo, la sequenza codificante i 103 aa della prosequenza presenti nel proNGF umano, e la sequenza codificante per i 18 aa della sequenza segnale del NGF nativo umano. Detto cDNA potrà essere successivamente subclonato in un vettore idoneo.
Il vettore può essere un qualsiasi vettore noto in letteratura e/o in commercio in grado di fare esprimere la proteina in esso codificata in cellule di mammifero. Tra questi: il vettore pTRE (Sistema TetOff, Clontech) o un qualsiasi altro vettore contenente un promotore forte regolabile, tra cui ad esempio i vettori della serie pT-REx (Invitrogen). La scelta di un vettore contenente un promotore forte, come ad esempio il promotore CMV, offre il vantaggio di garantire un'elevata produzione della proteina di interesse in cellule eucariotiche . In particolare, un vettore tetraciclina regolabile, garantisce livelli di espressione massimi ben maggiori rispetto a quelli ottenibili con un vettore contenente un promotore CMV costitutivo. Ad esempio, il vettore pTRE (Sistema TetOff, Clontech) contiene, a monte del promotore minimo CMV, sette repeats di una sequenza tetO a cui si lega la proteina regolatrice tTA codificata dal plasmide regolatore pTet-Off (Gossen M & Bujard H, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551, 1992). Questo sistema di regolazione garantisce livelli di espressione della proteina ricombinante superiori anche rispetto ad altri sistemi di espressione inducibili contenenti oltre al promotore, regioni enhancer che rispondono a metalli pesanti o ormoni steroidei.
Altri possibili vettori adatti per l'espressione in cellule di mammifero includono il sistema RheoSwitch (NewEngland BioLabs), vettori inducibili da macrolidi, quali pTRIDENT, pDuoRex, pMF189, pMF229 (Weber W et al., Biotechnol. Bioeng.
80: 691, 2002}, vettori inducibili da ecdisone quali il pEGSH (Stratagene).
In una forma di realizzazione dell'invenzione il costrutto amplificato sopra descritto potrà essere subclonato in un vettore pTRE, (Sistema TetOff, Clontech), a valle del promotore pCMV presente nel vettore commerciale, generando il costrutto pTRE-hNGF.
Le cellule di mammifero per il clonaggio potranno appartenere a qualsiasi linea cellulare di mammifero, nota al tecnico del ramo, che sia idonea alla produzione di proteine umane. Tra queste a mero scopo esemplificativo e non limitante, sono le cellule HeLa, MEF, CHO, COS, BHK, HEK293, VERO cells, W138 e MDCK celi lines, oppure fibroblasti - L929, fibroblasti 3T3, o altre linee cellulari stabilizzate di mammifero. Qualunque sia il sistema cellulare utilizzato, le cellule devono essere comunque modificate geneticamente ad esprimere costitutivamente, oltre al vettore plasmidico contenente il cDNA del NGF umano, anche la proteina regolatrice richiesta dal sistema di induzione scelto. La trasformazione delle cellule di mammifero con l'idoneo vettore di espressione come sopra indicato potrà essere effettuata con uno qualsiasi dei metodi di trasformazione noti al tecnico del settore, quale ad esempio, elettroporazione, trasfezione mediante il metodo di precipitazione con calcio-fosfato o complessi liposomiali .
La selezione delle cellule idonee potrà essere effettuata verificando la abbondante presenza di beta rhNGF nel terreno di coltura, e saggiando detto beta rhNGF con i saggi sopra indicati. In questo modo, i cloni ottenuti potranno essere selezionati in base alle caratteristiche del beta rhNGF prodotto ed in base alla loro capacità di secernere detto beta rhNGF.
Il beta rhNGF descritto nel brevetto sopra citato, potrà essere recuperato, secondo il procedimento di produzione dell'invenzione, direttamente dal terreno di coltura cellulare senza che debbano avvenire estrazioni da cellule e quindi limitando enormemente la possibilità di contaminazione della proteina da parte di materiale cellulare tra cui, ad esempio, forme non processate di NGF. La proteina così ottenuta potrà essere, all'occorrenza, purificata mediante tecniche standard note all'esperto del settore.
Come derivato o frammento dell'NGF, possono essere utilizzati, ad esempio, i peptidi descritti nella domanda di brevetto europeo N° 05012643.2.
Detti peptidi, aventi una struttura caratterizzata dalla presenza di due anse costrette in struttura ciclica dalla presenza di legami covalenti tra le catene amminoacidiche laterali in cui le sequenze amminoacidiche della prima e della seconda ansa di dette molecole sono, rispettivamente, sostanzialmente omologhe a quelle dell'ansa 1 (loopl, residui 29-38) e dell'ansa 4 (loop 4, residui 92 e 97) dell'NGF.
Detti peptidi possono essere rappresentati dalla formula
(Xaa)n- AAl-(Yaa)m-AA2-L-AA3-{Zaa)m-AA4
In cui:
AAl ed AA2 sono scelti nel gruppo comprendente Cys, Asp, Giu, Lys, Orn, Pen o Dap e sono legati mediante legami ammidici o S-S tra le funzioni chimiche nelle loro catene laterali;
ΑΆ3 ed AA4 scelti nel gruppo comprendente Cys, Asp, Giu, Lys, Orn, Pen o Dap e sono legati mediante legami ammidici o S-S tra le funzioni chimiche nelle loro catene laterali;
L è una sequenza linker formata da 2-4 residui amminoacidici, un linker organico, o una sequenza mista formata da residui amminoacidici e da un linker organico;
(Yaa)m è una sequenza amminoacidica formata da 4 -8 residui;
{.Zaa)m è una sequenza amminoacidica formata da 4 -8 residui
(Xaa)n è una sequenza amminoacidica in cui n è un numero intero tra 0 e 22.
Ai fini della realizzazione della presente invenzione, L può essere la sequenza TGA. Un esempio di linker organico idoneo è il gruppo dioxoetilene.
(Yaa)m può essere una sequenza omologa a quella dell'ansa 1 (residui 29-38) dell'NGF, come, ad esempio, la sequenza TDIKGK.
(Zaa)m può essere una sequenza omologa a quella dell'ansa 4 (residui 92 - 97) dell'NGF, come, ad esempio, la sequenza DGKQ.
Quando diverso da zero, (Xaa)n può rappresentare un omologo della sequenza del gruppo N-terminale dell' NGF, ad esempio la sequenza HPIFHRGEFSVADSVSVWVGD.
I peptidi sopra indicati possono essere liberi o acetilati in posizione N-terminale, possono essere in forma libera carbossilica o in forma ammidìca nella posizione C-terminale e possono essere aggiunti in posizione terminale uno, due o più residui amminoacidici.
La posizione della prima e della seconda ansa lungo la catena polipeptidica può anche essere invertita. Detti peptidi possono essere anche una forma dimerica di quelli descritti nella formula sovrastante, in questo caso sarà presente un legame covalente tra i peptidi monomerici.
Per la realizzazione della presente domanda di brevetto, il NGF o suo frammento o derivato avente funzione di agonista dell'NGF, viene formulato in una composizione idonea alla somministrazione nel compartimento o nei pressi del compartimento girale di interesse.
Esso può essere somministrato per via topica, sottocutanea, endovenosa, intraventrico.lare, intratecale, intranasale, mediante aereosol o mediante collirio oftalmico per gliosi che interessino il sistema nervoso centrale, in quanto è stato dimostrato che l'NGF somministrato mediante aereosol è in grado di superare la barriera ematoencefalica, mediante liposomì, o anche per terapia genica mediante l'immissione di cellule idonee trasformate in modo da esprimere detta molecola. Il NGF può anche essere somministrato coniugato ad anticorpi quali un anticorpo diretto contro il recettore della transferrina (OX-26), abbondantemente espresso sulla barriera ematoencefalica ed in grado di mediarne il passaggio.
Per la somministrazione per via topica, sottocutanea, endovenosa, intraventricolare, intratecale, intranasale o per areosol, mediante collirio oftalmico, il NGF o i suoi derivati sopra indicati potranno essere preparati mediante formulazioni standard note al tecnico del settore in dosaggi farmacologicamente efficaci con idonei eccipienti .
I metodi di preparazione di formulazioni come quelle sopra indicate sono noti e disponibili in letteratura e non è necessario fornire ulteriori indicazioni per la loro realizzazione. Per ciascuna di queste vie di somministrazione sono anche riportati in letteratura esempi che si riferiscono precisamente a preparati comprendenti NGF. Anche per la somministrazione intratecale sono noti sistemi quali la pompa per la infusione di baclofen idonei a tale tipo di somministrazione.
Per quanto riguarda la terapia genica possono essere utilizzate cellule quali fibroblasti, cellule staminali ed altre cellule idonee geneticamente modificate in modo da esprimere NGF. Può essere ad esempio utilizzato un sistema di espressione regolabile in vivo utilizzando un promotore regolato da tetraciclina (sistema "tetoff") come quello sopra descritto.
Per la somministrazione mediante liposomi possono essere realizzati liposomi contenenti NGF come quelli descritti da Xie et al. 2005, (J. Control release 105.1-2, ppl06-119).
La somministrazione deve essere effettuata in modo da fornire una dose farmacologicamente efficace della molecola.
Per quanto riguarda il dosaggio è ipotizzabile una dose proporzionale al peso a causa della diversità del volume di distribuzione del farmaco tra animale e uomo. Il dosaggio inoltre varia anche a seconda del mezzo di somministrazione utilizzato, in quanto varia la farmacocinetica (metabolizzazione del farmaco).
I seguenti esempi hanno lo scopo di illustrare l'invenzione in maniera non limitativa e di dimostrare l'effetto dell'NGF sulla gliosi reattiva .
ESEMPI;
Esempio 1.
Evidenza della presenza di gliosi reattiva risultante in neuropatia periferica in ratti.
Sono stati effettuati gli esperimenti su ratti maschi Sprague Dawley {250-300 g). I ratti sono stati trattati in modo da indurre loro una costrizione del nervo sciatico con conseguente neuropatia periferica.
La presenza di gliosi reattiva è stata misurata valutando l'espressione "in situ" della GFAP. Gli animali profondamente anestetizzati sono stati perfusi per via cardiaca con soluzione salina (TRIS HC1 0,1M, EDTA 10 mM) seguita da paraformaldeide al 4% addizionata con glutaraldeide 0,1 % in 0,01 M tampone fosfato (PB), pH 7.4, a 4°C. I midolli spinali rimossi a postfissati per due ore nello stesso fissativo, equilibrati in una soluzione di saccarosio al 30% in PB e crioconservati in isopentano raffreddato con ghiaccio secco. Sezioni seriali ottenute al criostato, spesse 25 micron venivano prima trattate con siero normale al 10% in PB addizionato con Triton® allo 0, 25% per 1 ora. Successivamente le sezioni venivano fatte reagire con un anticorpo anti-GFAP (1:1000, Sigma, Milano, Italia), seguito da un anticorpo secondario biotinilato specifico, evidenziato con il sistema Vectastain ® (Vector Labs, Inc., Burlingame, CA, USA), fatto reagire con 3,3_-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Sigma, 0.5 mg/ml Tris-HCl) e perossido di idrogeno allo 0.01%. Le sezioni montate su vetrini sono state studiate ad un microscopio luce Zeiss Axioskope 2 connesso ad una camera digitale ad elevata risoluzione (C4742-95, Hamamatsu Photonics, Italia). L'analisi densitometrica della espressione della GFAP nel corno dorsale del midollo spinale è stasa effettuata utilizzando un sistema di analisi di immagine computerizzato (MCID 7.0; Imaging Res. Inc, Canada). Il valore esprimeva l'area totale positiva quale percentuale relativa dell' area scandita. I valori medi sono stati ottenuti da cinque sezioni del midollo spinale randomizzate per ciascun animale, e confrontate con i valori di gruppi di controllo. I dati sono stati esportati e convertiti in un istogramma di distribuzione di frequenza utilizzando il programma Sigma-Plot 8.0 program (SPSS Erkrath Germany). Il gruppo NGF è stato confrontato al gruppo di controllo con un paired t-test.
La sensibilità meccanica degli animali (test per l'allodinia) è stata valutata misurando il tempo di risposta di retrazione della zampa posteriore alla stimolazione con filamento di von Frey. La sensibilità termica degli animali (test per l'iperalgesia) è stata valutata misurando il tempo di latenza alla retrazione dalla fonte termica dolorosa secondo il metodo del Piantar test .
Esempio 2.
Presenza o meno di qliosi reattiva in ratti con neuropatia periferica trattati con NGF o con solo ACSF.
A ratti con neuropatia periferica, sette giorni dopo il danno è stata impiantato un sistema osmotico Alzet 2001® (Alza Corp., Cupertino, CA, USA). Il sistema conteneva una soluzione di fluido cerebro spinale artificiale (ACSF) contenete lmg/ml di albumina serica di ratto e beta-NGF ricombinante di ratto alla concentrazione di 125 ng/microlitro. La pompa osmotica rilasciava il contenuto al tasso di lmicrolitro/ora per sette giorni. In tal modo si produceva una infusione intratecale pari a 125 ng/ora. Il sistema era connesso ad un catetere PE 10, il catetere era inserito nello spazio subaracnoideo sino all'altezza del rigonfiamento lombare.
Sono stati trattati anche ratti in parallelo con lo stesso sistema ma con somministrazione unicamente di ACSF detti ratti del gruppo ACSF.
La sensibilità meccanica degli animali (test per l'allodinia) è stata valutata misurando il tempo di risposta di retrazione della zampa posteriore alla stimolazione con filamento di von Frey. La sensibilità termica degli animali (test per l'iperalgesia) è stata valutata misurando il tempo di latenza alla retrazione dalla fonte termica dolorosa secondo il metodo del Piantar test.
Dopo 7 giorni dall'induzione del danno e al momento del trattamento con NGF o con solo ACSF la gliosi raggiungeva la sua massima espressione. Dopo 14 giorni dall'induzione del danno e sette giorni dopo trattamento con NGF o con solo ACSF (i dati ottenuti sono riportati in Figura la), i ratti appartenenti al gruppo ACSF mostravano nel corno dorsale del midollo spinale una marcata gliosi rivelata da una reazione intensa per la GFAP (2,345 ± 0,16) quando paragonata alla reazione modesta osservata nei ratti del gruppo NGF (1,365 ± 0,16) che non mostrava quindi alcuna differenza con un gruppo di ratti di controllo CTR (1,44 ± 0,15).
La marcata gliosi trovata nel corno dorsale del midollo spinale del gruppo ACSF è dovuta a trasformazione degli astrociti dal tipo protoplasmatico a quello fibrillare, reazione conseguente più all'ipertrofia delle singole cellule che ad un aumento significativo del numero totale di cellule gliali, come mostrato dall'analisi dell'espressione di S100β (i dati ottenuti sono riportati in Figura lb). Infatti, nel gruppo ACSF, l'espressione di S100β è solo leggermente maggiore rispetto a quella del gruppo trattato con NGF e del gruppo di CTR (rispettivamente, 1,945 ± 0,15 e 1,82 ± 0,23 e 1,56 ± 0,2).
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso del NGF o di suoi frammenti o derivati funzionalmente attivi equivalenti al NGF, o di agonisti del NGF, per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione della gliosi reattiva.
- 2. Uso, secondo la rivendicazione 1, in cui detto NGF è Beta rhNGF caratterizzato dal fatto di presentare attività biologiche superiori al 76% di quelle date dalla subunità 2.5S dell'NGF murino nativo nei seguenti saggi: a. valutazione della differenziazione di cellule PC12 di feocromocitoma in neuroni sympathetic-like indotta da incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S; b. valutazione della sopravvivenza e della differenziazione di gangli delle radici dorsali (DRG) espiantati da embrioni di pollo di 7-9gg e/o dei gangli simpatici paravertebrali espiantati da embrioni di pollo di 10-12gg dopo incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S; c. valutazione della fosforilazione del recettore ad alta affinità trkA indotta su cellule PC12 da beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da uguali quantità di mNGF 2,5S; e d. valutazione dell'induzione di ipertrofia di gangli cervicali superiori, dell'induzione della degranulazione di mastociti, della regolazione del livello di sostanza P e del livello di espressione del recettore ad alta affinità trkA su tessuti cutanei in topi neonati trattati con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, con uguali quantità di mNGF 2,5S.
- 3. Uso, secondo la rivendicazione 1, in cui detti derivati del NGF aventi attività di agonista del NGF sono peptidi sono rappresentati dalla seguente formula : (Xaa)n- AA1-(Yaa)m-AA2-L-AA3-(Zaa)m-AA4 In cui: AAl ed AA2 sono scelti nel gruppo comprendente Cys, Asp, Glu, Lys, Orn, Pen o Dap e sono legati mediante legami ammidici o S-S tra le funzioni chimiche nelle loro catene laterali; AA3 ed AA4 scelti nel gruppo comprendente Cys, Asp, Giu, Lys, Orn, Pen o Dap e sono legati mediante legami ammidici o S-S tra le funzioni chimiche nelle loro catene laterali; L è una sequenza linker formata da 2-4 residui amminoacidici, un linker organico, o una sequenza mista formata da residui amminoacidici e da un linker organico; (Yaa)m è una sequenza amminoacidica formata da 4 -8 residui; (Zaa)m è una sequenza amminoacidica formata da 4 -8 residui (Xaa)n è una sequenza amminoacidica in cui n è un numero intero tra 0 e 22 ed in cui detti peptidi hanno una struttura caratterizzata dalla presenza di due anse costrette in struttura ciclica dalla presenza di legami covalenti tra le catene amminoacìdiche laterali in cui le sequenze amminoacìdiche della prima e della seconda ansa di dette molecole sono, rispettivamente, sostanzialmente omologhe a quelle dell'ansa 1 (residui 29-38) e dell'ansa 4 (residui 92 e 97) dell'NGF.
- 4. Uso secondo le rivendicazioni da 1 a 3 in cui detto medicamento è idoneo alla somministrazione per via per via topica, sottocutanea, endovenosa, intraventricolare, intratecale, intranasale, mediante collirio oftalmico, mediante aereosol , mediante liposomi o mediante terapia genica.
- 5. NGF o di suoi frammenti o derivati funzionalmente attivi equivalenti al NGF, o di agonisti del NGF, per uso nella cura e/o nella prevenzione della gliosi reattiva.
- 6. Metodo terapeutico per la cura e/o la prevenzione della gliosi reattiva, comprendente la somministrazione di dosi farmacologicamente efficaci di NGF o di suoi frammenti o derivati funzionalmente attivi equivalenti al NGF, o di agonisti del NGF.
- 7. Metodo, secondo la rivendicazione 6 in cui detto NGF è Beta rhNGF caratterizzato dal fatto di presentare attività biologiche superiori al 76% di quelle date dalla subunità 2.5S dell'NGF murino nativo nei seguenti saggi: a. valutazione della differenziazione di cellule PC12 di feocromocitoma in neuroni sympathetic-like indotta da incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S; b. valutazione della sopravvivenza e della differenziazione di gangli delle radici dorsali (DRG) espiantati da embrioni di pollo di 7-9gg e/o dei gangli simpatici paravertebrali espiantati da embrioni di pollo di 10-12gg dopo incubazione con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da incubazione con uguali quantità di mNGF 2,5S; c. valutazione della fosforilazione del recettore ad alta affinità trkA indotta su cellule PC12 da beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, da uguali quantità di mNGF 2,5S e; d. valutazione dell'induzione di ipertrofia di gangli cervicali superiori, dell'induzione della degranulazione di mastociti, della regolazione del livello di sostanza P e del livello di espressione del recettore ad alta affinità trkA su tessuti cutanei in topi neonati trattati con beta rhNGF dell'invenzione e, come confronto, con uguali quantità di mNGF 2,5S.
- 8 . Metodo, secondo la rivendicazione 6 in cui detti derivati del NGF aventi attività di agonista del NGF sono peptidi aventi una struttura caratterizzata dalla presenza di due anse costrette in struttura ciclica dalla presenza di legami covalenti tra le catene amminoacidiche laterali in cui le sequenze amminoacidiche della prima e della seconda ansa di dette molecole sono, rispettivamente, sostanzialmente omologhe a quelle dell'ansa 1 (loopl, residui 29-38) e dell'ansa 4 (loop 4, residui 92 e 97) dell'NGF. Detti peptidi possono essere rappresentati dalla formula (Xaa)n- AA1-(Yaa)m-AA2-L-AA3-(Zaa)m-AA4 In cui: AAl ed AA2 sono scelti nel gruppo comprendente Cys, Asp, Giu, Lys, Orn, Pen o Dap e sono legati mediante legami ammidici o S-S tra le funzioni chimiche nelle loro catene laterali; AA3 ed AA4 scelti nel gruppo comprendente Cys, Asp, Glu, Lys, Orn, Pen o Dap e sono legati mediante legami ammidici o S-S tra le funzioni chimiche nelle loro catene laterali; L è una sequenza linker formata da 2-4 residui amminoacidici, un linker organico, o una sequenza mista formata da residui amminoacidici e da un linker organico; (Yaa)m è una sequenza amminoacidica formata da 4 -8 residui; (Zaa)m è una sequenza amminoacidica formata da 4 -8 residui (Xaa)n è una sequenza amminoacidica in cui n è un numero intero tra 0 e 22 ed in cui detti peptidi hanno una struttura caratterizzata dalla presenza di due anse costrette in struttura ciclica dalla presenza di legami covalenti tra le catene amminoacidiche laterali in cui le sequenze amminoacidiche della prima e della seconda ansa di dette molecole sono, rispettivamente, sostanzialmente omologhe a quelle dell'ansa 1 {residui 29-38) e dell'ansa 4 {residui 92 e 97) dell'NGF.
- 9. Metodo, secondo la rivendicazione 7 in cui detto NGF o suoi frammenti o derivati funzionalmente attivi equivalenti al NGF, o agonistì del NGF vengono somministrati per via topica, sottocutanea, endovenosa, intraventricolare, intratecale, intranasale, mediante collirio oftalmico, mediante aereosol , mediante liposomi o mediante terapia genica.
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