ES2380055T3 - Modulación de la actividad de neurotrofinas; método de escrutinio - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para escrutar en búsqueda de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vpsp a) proporcionar un ensayo para medir la unión de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, b) añadir el compuesto que va a ser evaluado al ensayo, y c) determinar la cantidad de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina ligada al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, y d) comparar la cantidad determinada en la etapa c) con una cantidad medida en ausencia del compuesto que va a ser evaluado, e) en donde una diferencia entre las dos cantidades identifica un compuesto que altera la unión de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

Description

Modulación de la actividad de neurotrofinas; método de escrutinio.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para realizar el escrutinio de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

Antecedentes de la invención

La familia de las neurotrofinas

Las neurotrofinas son hormonas peptídicas diméricas. El primer miembro de la familia de las neurotrofinas que se descubrió fue el factor de crecimiento de nervios (NGF, del inglés “nerve growth factor”), que desempeña un papel importante en procesos tales como el desarrollo de neuronas sensoriales y simpáticas en el sistema nervioso periférico (Levi-Montalcini, R. y Angeleeti, P.U., Physiol. Rev. 48, 534-569 (1968)). El siguiente miembro de la familia de las neurotrofinas que se aisló fue el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, del inglés “brain-derived neurotrophic factor”), también denominado neurotrofina-2 (NT-2), la secuencia fue publicada por Leibrock, J. y col. en 1989 (Nature 341, 149-152). En 1990 varios grupos identificaron un factor neurotrófico denominado originalmente factor neuronal (NF), ahora denominado neurotrofina-3 (NT-3) (Ernfors y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 54545458 (1990); Hohn y col., Nature 344, 339; Maisonpierre y col., Science 247, 1446; Rosenthal y col., Neuron 4, 767; Jones y Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8060-8064; Kaisho y col., FEBS Lett. 266, 187). A continuación se añadieron las neurotrofinas 4 y 5 a la familia (Neuron 6, 845-858 (1991); Berkmeier, L.R. y col., Neuron 7, 857-866 (1991); Ip y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3060-3064 (1992)).

Receptores de la familia de neurotrofinas

De modo similar a otros factores de crecimiento polipeptídicos, las neurotrofinas afectan a sus células diana mediante interacciones con receptores de la superficie celular. Según el conocimiento que se tiene actualmente, las neurotrofinas se unen a dos tipos de receptores discretos que pueden distinguirse farmacológicamente: los receptores de neurotrofina Trk y p75NTR. El p75NTR es un miembro de la familia de receptores de Fas/factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés “tumour necrosis factor”), y puede interactuar con todos los miembros mamíferos de la familia de las neurotrofinas con afinidades iguales (Rodriguez-Tebar y col. 1990, Neuron 4: 487-492; Barker y Murphy, 1992, Mol. Cell. Biochem. 100: 1-15). Las células que expresan TrkA, un receptor de tirosina quinasa identificado originalmente como oncogén humano (Mltin-Zanca y col., Nature 319: 743-748) se une únicamente a NGF y exhibe una cinética de disociación significativamente más lenta (Jing y col. 1992, Neurol. 9: 1067-1079; Loeb y Greene, 1993, Neuroscience 13: 2919-2929). El BDNF se une al receptor TrkB únicamente, pero la NT-3 puede unirse a los tres receptores Trk (A, B y C), mostrando preferencia por el TrkC. Las NT 4/5 se pueden unir a TrkA y a TrkB (Ip y col., PNAS 89: 3060-3064; Klein y col. Neuron 9: 947-956). La NT-7 no interacciona con el TrkB o el TrkC pero sin embargo puede inducir la fosforilación de tirosina del TrkA, lo que indica una especificidad de receptor similar a la del NGF (Nilsson y col., FEBS Lett (1998) 13 Marzo; 424(3): 285-90). La NT-6 recombinante purificada también presenta un espectro de acciones similares al NGF pero con una menor potencia (Gotz y col., Nature (1994) 17 Noviembre; 372(6503): 266-9).

Familia de neurotrofinas: proteínas precursoras

La biología de la familia de las neurotrofinas es compleja: las neurotrofinas se sintetizan intracelularmente como proteínas precursoras de 30-35 kDa, que contienen un péptido señal y posiciones de glicosilación. Durante el procesado, las proteínas precursoras también son divididas en una posición de ruptura básica por acción de la serina proteasa dependiente de calcio furina y otros miembros de la familia de las prohormona convertasas, dentro del aparato de Golgi. La parte N-terminal de esta ruptura es la neurotrofina madura de 118-120 aminoácidos y una producto C-terminal de 12-14 kDa biológicamente activo (Seidah y col., Biochem. J. (1996) 314: 951-960).

Funciones clínicamente relevantes de la familia de las neurotrofinas

Las neurotrofinas presentan interés clínico porque desempeñan un papel importante en la supervivencia y diferenciación de células neuronales (Thoenen 1991, Trends Neurosci. 14: 165-170; Raffioni y col. 1991, Ann. Rev. Biochem. 62: 823-850; Chao, 1992, Neuron 9: 583-593; Barbacid 1993, Oncogene 8: 2033-2042). Los receptores Trk transmiten señales que promocionan la supervivencia neuronal, mientras que el p75NTR puede inducir la apoptosis neuronal así como la supervivencia neuronal que depende de cualquier co-expresión de TrkA (Miller y col., Cell. Mol. Life Sci. 58: 1045-1053 (2001)). Ciertamente, se ha demostrado que la activación de receptores TrkA puede negar el efecto pro-apoptótico del p75NTR (Yoon y col., J. Neurosci. (1998) 18: 3273-3281).

Es probable que los pro-péptidos de las neurotrofinas desempeñen importante funciones biológicas: al menos una proteína precursora de neurotrofina (proNGF) y su producto procesado proteolíticamente y la contrapartida madura (NGF) activan diferencialmente respuestas celulares pro- y anti-apoptóticas a través de la activación preferencial de los receptores p75NTR y Trk, respectivamente (presentando la pro-NGF una mayor afinidad por los receptores p75NTR y una menor afinidad por los receptores Trk que las formas maduras de NGF). De hecho, se ha demostrado que la pro-NGF induce la apoptosis dependiente de p75NTR en neuronas cultivadas con una activación mínima de la diferenciación o la supervivencia mediada por TrkA (Lee y col., Science (2001), 294: 1945-1948).

Además, las neurotrofinas presentan interés clínico porque se sabe que se produce simultáneamente una regulación al alza de neurotrofinas y un aumento de la expresión de p75NTR en condiciones patológicas e inflamatorias, especialmente tras una lesión nerviosa y daño en el sistema vascular. De hecho, Soilu-Hanninen y col. han demostrado que las funciones apoptóticas del p75NTR están implicadas directamente en la apoptosis inducida por una lesión (Soilu-Hanninen y col., J. Neurosci. 19: 4824-4838 (1999)). Recientemente, también se ha demostrado que la pro-NGF induce la muerte mediada por p75 de oligodendrocitos después de una lesión de médula espinal (Beatty y col., Neuron (2002), vol. 39, pág. 375-386).

Se ha presentado la hipótesis de que la carencia de factores neurotróficos es la responsable de la degeneración de poblaciones neuronales selectivas, ya que se produce en la enfermedad de Parkinson, en la enfermedad de Alzheimer y en la esclerosis lateral amiotrófica, y que la aplicación del correspondiente factor neurotrófico podría prevenir la degeneración neuronal [Appel, S.H., “A unifying hypothesis for the cause of amyotrophic lateral sclerosis, parkinsonism, and Alzheimer’s disease”, Ann. Neurol. 10: 499-505 (1981)]. En particular, como el NGF es un factor trófico para la población de neuronas colinérgicas basales del cerebro anterior que se degeneran en la enfermedad de Alzheimer, se ha especulado con que el NGF puede ser útil en el tratamiento de esta enfermedad.

Otra razón para el interés en los mecanismos de terapia con neurotrofinas es que los estudios realizados han proporcionado evidencias sólidas sobre la implicación de las neurotrofinas en la depresión y la acción antidepresiva (Duman y col., Arch Gen Psychiatry (1997) 54: 597-606); por ejemplo la infusión de BDNF en el hipocampo ha producido un efecto antidepresivo en dos modelos de comportamiento de la depresión (Shirayama y col. (2002), J Neurosci 22(8): 3251-3261).

La familia de receptores con dominio Vps10p

La sortilina (o NTR-3 ó GP95) es un receptor de membrana de tipo I que se expresa en una serie de tejidos, incluyendo el cerebro, la espina dorsal, los testículos y el músculo esqueletal (Petersen y col., J. Biol. Chem., 272: 3599-3605 (1997); Herman-Borgmeyer y col., Mol. Brain Res., 65: 216-219 (1999)). La sortilina pertenece a una familia de receptores que comprenden sortilina, SorLA (Jacobsen y col., J. Biol. Chem., 271: 31379-31383 (1996)), SorCS1, SorCS2 y SorCS3. Todos los receptores de esta familia comparten la característica estructural de un dominio N-terminal de aproximadamente 600 aminoácidos con una fuerte semejanza con los dos dominios que constituyen la porción luminal del receptor de clasificación de levadura Vps10p (Marcusson, E.G. y col., Cell, 77: 579-586 (1994)). El dominio Vps10p comprende un segmento C-terminal que contiene 10 cisteínas conservadas y un pro-péptido N-terminal de 40-80 aminoácidos.

En la sortilina, el propéptido exhibe una elevada afinidad de unión con el receptor totalmente procesado. La prevención de la ruptura del propéptido inhibe esencialmente la unión de ligando a sortilina, lo que indica que el propéptido dificulta estéricamente que los ligandos ganen acceso a sus sitios de unión sobre el receptor (Petersen y col., EMBO J., 18: 595-604, 1999).

Se han conseguido algunos progresos en el entendimiento de la función de esta familia: existen evidencias que sugieren que la sortilina contiene al menos estructuras YXXc y de dileucina, que conforman señales potentes para la clasificación de endosomas de Golgi (Nielsen y col., EMBO 20(9): 2180-2190). Es probable que los otros miembros de la familia también puedan ser útiles en una función de “clasificación” similar, no inferior porque exhiben todos homología con Vsp10p, el receptor de clasificación para carboxipeptidasa Y (CPY) en levaduras. Sólo una pequeña proporción de los receptores de sortilina están presentes sobre la superficie celular (Mazella y col., J. Biol. Chem. (1998) 273, 26273-26276; Morris y col. J. Biol. Chem. (1998) 273: 3582-3587), aunque la expresión sobre la membrana superficial puede regularse al alza mediante estímulos que incluyen insulina en adipocitos 3T3-L1 (Morris y col. J. Biol. Chem. (1998) 273: 35823587) y neurotensina en neuronas embriónicas (Chabry y col., J. Biol. Chem. (1993), 286: 17138-17144).

Modulación de la actividad de neurotrofinas: estado del arte actual

Ciertamente, el entendimiento actual de las funciones biológicas de las neurotrofinas hace de la familia de las neurotrofinas una diana atractiva para la intervención terapéutica, y se conocen algunos métodos para la modulación de la actividad de neurotrofinas:

1) El documento US 6.417.159 describe un método para potenciar el efecto de una neurotrofina con análogos de p75NTR367-379.

2) El documento US 6.300.327 describe composiciones y métodos para la potenciación de la actividad de las neurotrofinas.

3) El documento US 6.291.247 describe métodos para realizar escrutinios de factores que alteren la conformación de las neurotrofinas y reduzcan la actividad biológica de las neurotrofinas.

4) El documento US 5.516.772 describe derivados de K-252 que potencian la actividad inducida por neurotrofinas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para realizar el escrutinio de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

Descripción de las figuras

Figura 1: ejemplos de receptores con dominio Vps10p. Se indica su composición estructural.

Figura 2: caracterización de la unión de NGF a p75, TrkA y sortilina, determinada mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (BIAcore). Se midió la unión de NGF 50-500 nM a 91,5 fmol/mm2 de proteína quimérica p75-IgG-Fc inmovilizada (panel superior), a 66 fmol/mm2 de TrkA-IgG-Fc inmovilizada (panel del medio) y a 51 fmol/mm2 de dominio extracelular de sortilina purificada (panel inferior). Se registraron las tasas de arranque (on) y apagado (off)

– de 100 a 600 segundos y de 600 a 1000 segundos, respectivamente – y se calcularon los valores Kd de unión de NGF correspondientes a ~ 1 nM para p75, ~ 2 nM para TrkA y ~ 87 nM para sortilina.

El NGF murino maduro procedía de Austral Biologicals (San Ramon, CA), las quimeras de receptor de neurotrofina p75 humano/Fc y de TrkA humano/Fc eran de R&D Systems (Oxon, R.U.). La sortilina humana se produjo en células CHO transfectadas de forma estable y purificadas como se ha descrito previamente (Munck Petersen y col., EMBO

J. (1999) 18: 595-604).

Figura 3: caracterización de la unión de pro-NGF a p75, TrkA y sortilina determinada mediante análisis de plasmón superficial (BIAcore). Se midió la unión de pro-NGF 25-500 nM a 91,5 fmol/mm2 de proteína quimérica p75-IgG-Fc inmovilizada (panel superior), a 66 fmol/mm2 de TrkA-IgG-Fc inmovilizada (panel del medio) y a 51 fmol/mm2 de dominio extracelular de sortilina purificada (panel inferior). Se registraron las tasas de arranque (on) y apagado (off)

– de 100 a 600 segundos y de 600 a 1000 segundos, respectivamente – y se calcularon los valores Kd correspondientes a unión de pro-NGF a ~ 12 nM para p75, ~ 15 nM para TrkA y ~ 5 nM para sortilina.

El pro-NGF humano fue producido y purificado en E. coli tal como se ha descrito (Rattenholl y col., Eur. J. Biochem. (2001) 268: 3296-3303). El resto de reactivos fueron como se ha descrito en la leyenda de la figura 2.

Figura 4: caracterización de la unión del propéptido de pro-NGF a p75, TrkA y sortilina determinada mediante análisis de plasmón superficial (BIAcore). Se midió la unión de propéptido 25-500 nM a 91,5 fmol/mm2 de proteína quimérica p75-IgG-Fc inmovilizada (panel superior), a 66 fmol/mm2 de TrkA-IgG-Fc inmovilizada (panel del medio) y a 51 fmol/mm2 de dominio extracelular de sortilina purificada (panel inferior). Se registraron las tasas de arranque (on) y apagado (off) – de 100 a 600 segundos y de 600 a 1000 segundos, respectivamente – y se calcularon los valores Kd correspondiente a propéptido de pro-NGF correspondientes a ~ 87 nM para sortilina. No se produjo unión detectable con p75 y TrkA.

El propéptido de NGF humano expresado en E. coli fue suministrado por Elisabeth Schwarz, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle/Saale, Alemania. El resto de reactivos fueron como se ha descrito en las leyendas de las figuras 2 y 3.

Figura 5: inhibición de la unión de pro-NGF a sortilina inmovilizada por neurotensina determinada mediante análisis BIAcore. La unión de pro-NGF 200 nM a 51 fmol/mm2 de sortilina inmovilizada se inhibe en ~45% después de una inyección conjunta con neurotensina 10 μM. La unión de neurotensina sola se muestra a modo de comparación.

La neurotensina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todos los demás productos fueron como se ha indicado anteriormente.

Figura 6: inhibición de la unión de pro-NGF a sortilina inmovilizada por RAP (proteína asociada a receptor), el propéptido de pro-NGF y el pro-péptido de sortilina. Los inhibidores se pre-ligaron a sortilina y después se realizó una inyección conjunta con pro-NGF 200 nM. Se han corregido las líneas base correspondientes a las señales obtenidas en presencia de cada uno de los inhibidores. La unión a pro-NGF máxima se mide sin pre-incubación con los respectivos inhibidores. La unión de pro-NGF 200 nM a 51 fmol/mm2 de sortilina inmovilizada se inhibe en ~65% por RAP 10 μM, en ~85% por 5 μM del propéptido de pro-NGF y en ~65% por 5 μM del propéptido de sortilina.

Figura 7: la caracterización de la unión de pro-BDNF y BDNF a sortilina purificada determinada mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore). Se produjo pro-BDNF de rata en células 293 tal como se describe en Lee, R., Kermani, P., Teng, K.K. y Hempstead, B.L. “Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins”. Science 294, 1945-1948 (2001) y se purificó a partir del medio acondicionado. El BDNF humano recombinante maduro procedía de Promega (#G1491) y el pro-dominio de BDNF humano fusionado a GST (glutationa S-transferasa) se produjo en

E. coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad glutationa-sefarosa. La unión de pro-BDNF 5-500 nM (panel superior), del pro-dominio de pro-BDNF (una proteína de fusión con GST, panel del medio) o de BDNF (panel inferior) se midió a 94 fmol/mm2 de dominio extracelular de sortilina purificada inmovilizada. El experimento se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito en las figuras 2-4. Se registraron las tasas de arranque (on) y apagado (off) – de 100 a 600 segundos y de 600 a 10000 segundos, respectivamente – y se calcularon los valores Kd correspondientes a la unión de ligando a ~3 nM para pro-BDNF, ~58 nM para el pro-dominio de GST de pro-BDNF y ~40 nM para BDNF maduro.

Otras preparaciones de BDNF maduro han mostrado valores de Kd para la unión de ligando a 10 nM.

Descripción de las secuencias

SEC ID Nº 1: secuencia de sortilina

SEC ID Nº 2: secuencia de SorLA

SEC ID Nº 3: secuencia de SorCS1

SEC ID Nº 4: secuencia de SorCS3

SEC ID Nº 5: secuencia de SorCS2

SEC ID Nº 6: secuencia de NGF

SEC ID Nº 7: secuencia de BDNF

SEC ID Nº 8: secuencia de neurotrofina-3

SEC ID Nº 9: secuencia de neurotrofina-4

SEC ID Nº 10: secuencia de neurotensina

SEC ID Nº 11: secuencia de neuromedina

SEC ID Nº 12: péptido asociado a receptor (RAP)

SEC ID Nº 13: pro-neurotensina/pro-neuromedina

Descripción detallada de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Definiciones

El término “unión” tal como se emplea en la presente memoria se refiere a la atracción o unión temporal o de mayor duración entre dos o más restos funcionales uno con el otro, mediada por fuerzas físicas tales como, por ejemplo, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas, interacciones dipolo-dipolo y enlaces de hidrógeno. La expresión “interacción hidrofóbica” tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier interacción que se produce entre componentes esencialmente no polares (hidrofóbicos) localizados dentro de sus respectivos alcances de atracción en un entorno polar (por ejemplo, agua). Tal como se usa en la presente memoria, el alcance de atracción está en una escala de aproximadamente 100 nm. Un tipo particular de interacción hidrofóbica es la ejercida por “fuerzas de Van der Waals”, es decir, las fuerzas de atracción entre moléculas no polares que se deben a mecánica cuántica. Las fuerzas de Van der Waals generalmente se asocian con momentos dipolares puntuales inducidos por moléculas colindantes y que implican cambios en la distribución electrónica. El término “enlace de hidrógeno” tal como se usa aquí se refiere a una fuerza de atracción, o un puente, que puede producirse entre un átomo de hidrógeno que está enlazado covalentemente a un átomo electronegativo, por ejemplo oxígeno, azufre o nitrógeno, y otro átomo electronegativo. El enlace de hidrógeno se puede dar entre un átomo de hidrógeno de una primera molécula y un átomo electronegativo de una segunda molécula (enlace de hidrógeno intermolecular). También se puede producir entre un átomo de hidrógeno y un átomo electronegativo que estén ambos contenidos en la misma molécula (enlace de hidrógeno intramolecular). La expresión “interacción electrostática” tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier interacción que se produce entre componentes cargados, moléculas o iones, debido a fuerzas de atracción que aparecen cuando componentes de carga eléctrica opuesta se ven atraídos entre ellos. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación: interacciones iónicas, interacciones covalentes, interacciones entre un ion y un dipolo (ion y molécula polar), interacciones entre dos dipolos (cargas parciales de moléculas polares), enlaces de hidrógeno y enlaces de dispersión de London (dipolos inducidos de moléculas polarizables). Por tanto, por ejemplo, “interacción iónica” o “interacción electrostática” se refieren a la atracción entre una primera molécula cargada positivamente y una segunda molécula cargada negativamente. Las interacciones iónicas o electrostáticas incluyen, por ejemplo, la atracción entre un agente bioactivo cargado negativamente (ejemplo relevante en esta invención). La expresión “interacción dipolo-dipolo” tal como se usa aquí se refiere a la atracción que se puede producir entre dos o más moléculas polares. Así, “interacción dipolo-dipolo” se refiere a la atracción del extremo no cargado parcialmente positivo de una primera molécula polar con el extremo no cargado parcialmente negativo de una segunda molécula polar. Las “interacciones dipolo-dipolo” también se refieren a enlaces de hidrógeno intermoleculares.

Equivalentes funcionales y variantes de polinucleótidos que codifican un modulador de la actividad de neurotrofina y polipéptidos que comprenden dicho modulador de actividad de neurotrofina: en la presente memoria “equivalentes funcionales” y “variantes” se usan indistintamente. En una realización preferida de la invención también se proporcionan variantes de modulador de actividad de neurotrofina y variantes de fragmentos del mismo. Cuando son polipéptidos, las variantes se determinan en base a su grado de identidad o a su homología con una secuencia de aminoácidos predeterminada, siendo dicha secuencia de aminoácidos predeterminada una de SEC ID Nº: modulador de actividad de neurotrofina, o, cuando la variante es un fragmento, un fragmento de las secuencias de aminoácido mencionadas anteriormente, respectivamente.

Por consiguiente, las variantes preferiblemente presentan al menos un 75% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 80% de identidad de secuencia, tal como al menos un 85% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 90% de identidad de secuencia, tal como al menos un 91% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 91% de identidad de secuencia, tal como al menos un 92% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 93% de identidad de secuencia, tal como al menos un 94% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 95% de identidad de secuencia, tal como al menos un 96% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos un 97% de identidad de secuencia, tal como al menos un 98% de identidad de secuencia, por ejemplo un 99% de identidad de secuencia con la secuencia predeterminada.

La identidad de secuencia se determina en una realización utilizando fragmentos de péptidos de modulador de actividad de neurotrofina que comprenden al menos 25 aminoácidos contiguos y que tienen una secuencia de aminoácidos que al idéntica en al menos un 80%, tal como un 85%, por ejemplo un 90%, tal como un 95%, por ejemplo un 99%, a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 8, respectivamente, en donde el porcentaje de identidad se determina mediante los algoritmos GAP, BESTFIT

o FASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics versión 7.0, usando los pesos de hueco por defecto.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: “secuencia predeterminada”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” y “identidad sustancial”.

Una “secuencia predeterminada” es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia de mayor tamaño, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADN de longitud completa o de un gen dado en un listado de secuencias, tal como una secuencia de polinucleótido de SEC ID Nº: 1, o puede comprender una secuencia de ADN o génica completa. Generalmente, una secuencia predeterminada tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud, y a menudo al menos 50 nucleótidos de longitud.

Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótido completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se llevan a cabo típicamente comparando las secuencias de los dos polinucleótidos en una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en donde una secuencia de polinucleótido se puede comparar con una secuencia predeterminada de al menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido de la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia predeterminada (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis) o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, el que resulta en el mayor porcentaje de homología de la ventana de comparación) generado por los diversos métodos.

La expresión “identidad de secuencia” significa que las dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, en una base nucleótido a nucleótido) en la ventana de comparación. La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las se da una base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U ó I) en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar lugar al porcentaje de identidad de secuencia. El término “identidad sustancial” tal como se usa en la presente memoria denota una característica de una secuencia de polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos del 90 al 95 por ciento de identidad de secuencia, más habitualmente al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia predeterminada en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente en una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia predeterminada con la secuencia de polinucleótido que puede incluir eliminaciones o adiciones que sumen un 20 por ciento o menos de la secuencia predeterminada en la ventana de comparación. La secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia de mayor tamaño, por ejemplo, un segmento de la secuencia de polinucleótido de longitud completa SEC ID Nº: 1 presentada en la presente memoria.

Según se aplica a polipéptidos, un grado de identidad de secuencias de aminoácido es función del número de aminoácidos idénticos en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácido. Un grado de homología o de similitud de secuencias de aminoácidos es función del número de aminoácidos, es decir, está relacionado con la estructura, en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos.

Una secuencia “no relacionada” o “no homóloga” comparte menos del 40% de identidad, aunque preferiblemente menos del 25% de identidad, con una de las secuencias de polipéptido de modulador de actividad de neurotrofina de la presente invención. El término “identidad sustancial” significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas de manera óptima, mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, un 99 por ciento de identidad de secuencia). Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la posibilidad de intercambiar residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina y isolucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas de hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amidas es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalalina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

Adicionalmente, también se determinan las variantes en base a un número predeterminado de sustituciones conservativas de aminoácidos tal como se define en la presente memoria más adelante. Tal como se usa aquí, la sustitución conservativa de aminoácidos se refiere a la sustitución de un aminoácido (dentro de un grupo de aminoácidos predeterminado) por otro aminoácido (dentro del mismo grupo), en donde los aminoácidos exhiben características similares o sustancialmente similares.

Dentro del significado de la expresión “sustitución conservativa de aminoácidos”, tal como se aplica aquí, un aminoácido puede ser sustituido por otro dentro de los grupos de aminoácidos indicados aquí a continuación:

i.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr y Cys).

ii.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro y Met).

iii.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (Gly, Ala, Val, Leu, Ile).

iv.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro).

v.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (Phe, Tyr, Trp).

vi.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (Asp, Glu).

vii.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (Lys, Arg, His).

viii.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida (Asn, Gln).

ix.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxi (Ser, Thr).

x.

Aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (Cys, Met).

xi.

Aminoácidos neutros ligeramente hidrofóbicos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr).

xii.

Aminoácidos ácidos hidrofílicos (Gln, Asn, Glu, Asp), y

xiii. Aminoácidos ácidos hidrofóbicos (Leu, Ile, Val).

Por consiguiente, una variante o un fragmento de la misma según la invención puede comprender, dentro de la misma variante de la secuencia o fragmentos de la misma, o entre diferentes variantes de la secuencia o fragmentos de la misma, al menos una sustitución, tal como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente unas respecto a las otras.

Es evidente a partir de la anterior descripción que la misma variante o fragmento de la misma puede comprender más de una sustitución conservativa de aminoácido de entre más de un grupo de aminoácidos conservativos tal como se ha definido aquí anteriormente.

La adición o eliminación de al menos un aminoácido puede ser una adición o eliminación de entre preferiblemente 2 y 250 aminoácidos, tal como entre 10 y 20 aminoácidos, por ejemplo entre 20 y 30 aminoácidos, tal como entre 40 y 50 aminoácidos. Sin embargo, dentro de la presente invención también se contemplan adiciones o eliminaciones de más de 50 aminoácidos, tal como adiciones de 50 a 100 aminoácidos, la adición de 100 a 150 aminoácidos, la adición de 150-250 aminoácidos. La eliminación y/o la adición pueden – independientemente una de la otra – ser una eliminación y/o una adición dentro de la secuencia y/o al final de la secuencia.

Los fragmentos de polipéptido de acuerdo con la invención, incluyendo cualquier equivalente funcional de los mismos, pueden comprender en una realización mendos de 250 residuos de aminoácido, tal como menos de 240 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 225 residuos de aminoácido, tal como menos de 200 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 180 residuos de aminoácidos, tal como menos de 160 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 150 residuos de aminoácido, tal como menos de 140 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 130 residuos de aminoácido, tal como menos de 120 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 110 residuos de aminoácido, tal como menos de 100 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 90 residuos de aminoácido, tal como menos de 85 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 80 residuos de aminoácido, tal como menos de 75 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 70 residuos de aminoácido, tal como menos de 65 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 60 residuos de aminoácido, tal como menos de 55 residuos de aminoácido, por ejemplo menos de 50 residuos de aminoácido.

“Equivalencia funcional”, tal como se usa en la presente memoria, se establece de acuerdo con una realización preferida mediante una referencia a la funcionalidad correspondiente de un fragmento predeterminado de la secuencia.

Debe entenderse que las variantes o equivalentes funcionales de un modulador de actividad de neurotrofina presentan secuencias de aminoácidos que difieren gradualmente de la secuencia de modulador de actividad de neurotrofina predeterminada preferida, así como el número y el alcance de las inserciones, eliminaciones y sustituciones que incluyen un aumento de las sustituciones conservativas. Esta diferencia se mide como una reducción en la homología entre la secuencia predeterminada y el fragmento o equivalente funcional.

Todos los fragmentos o equivalentes funcionales de la SEC ID Nº: modulador de actividad de neurotrofina se incluyen dentro del alcance de esta invención, independientemente del grado de homología que muestren con respecto a sus respectivas secuencias de modulador de actividad de neurotrofina predeterminado descrito aquí. La razón para esto es que algunas regiones del modulador de actividad de neurotrofina tienen mayor probabilidad de ser fácilmente mutables, o capaces de ser completamente eliminados, sin ningún efecto significativo sobre la actividad de unión del fragmento resultante.

Una variante funcional obtenida mediante sustitución puede presentar claramente alguna forma o grado de actividad de modulador de actividad de neurotrofina nativa, y aún así ser menos homóloga, si se sustituyen los residuos que contienen cadenas laterales de aminoácido funcionalmente similares. En este sentido, funcionalmente similar se refiere a características dominantes de las cadenas laterales, tal como ser hidrofóbicas, básicas, neutras o ácidas, o la presencia o ausencia de masa estérica. Por consiguiente, en una realización de la invención, el grado de identidad no es una medida principal de que un fragmento sea una variante o equivalente funcional de un fragmento predeterminado preferido de acuerdo con la presente invención.

La homología entre secuencias de aminoácidos puede calcularse usando matrices de puntuación bien conocidas tales como una cualquiera de BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 y BLOSUM 90.

Los fragmentos que comparten homología con fragmentos de la SEC ID Nº: 1-13, respectivamente, deben considerarse dentro del alcance de la presente invención cuando tienen preferiblemente al menos aproximadamente un 90 por ciento de homología, por ejemplo al menos un 92 por ciento de homología, tal como al menos un 94 por ciento de homología, por ejemplo al menos un 95 por ciento de homología, tal como al menos un 96 por ciento de homología, por ejemplo al menos un 97 por ciento de homología, tal como al menos un 98 por ciento de homología, por ejemplo al menos un 99 por ciento de homología con respecto a dichas secuencias de fragmento predeterminadas, respectivamente. De acuerdo con una realización de la invención, los porcentajes de homología se refieren a porcentajes de identidad.

Otros factores adicionales que pueden tomarse en consideración para determinar la equivalencia funcional según el significado usado en la presente memoria son: i) la capacidad de antisueros para detectar un fragmento de modulador de actividad de neurotrofina de acuerdo con la presente invención, o ii) la capacidad del fragmento de modulador de actividad de neurotrofina funcionalmente equivalente para competir con el correspondiente modulador de actividad de neurotrofina en un ensayo. Un método para determinar una secuencia de aminoácidos inmunogénicamente activos dentro de una secuencia de aminoácidos conocida ha sido descrito por Geysen en la Patente de EE.UU. nº 5.595.915.

Un método adicional adecuadamente adaptable para determinar la estructura y las relaciones de función de fragmentos peptídicos se describe en la Patente de EE.UU. nº 6.013.478. Asimismo, los especialistas en la técnica también conocen los métodos para evaluar la unión de una secuencia de aminoácidos a un resto receptor.

Además de las sustituciones conservativas introducidas en cualquier posición de un modulador de actividad de neurotrofina predeterminado preferido, o de un fragmento del mismo, también puede ser deseable introducir sustituciones no conservativas en una cualquiera, o en más de una, de las posiciones de dicho modulador de actividad de neurotrofina.

Una sustitución no conservativa que conduce a la formulación de un fragmento funcionalmente equivalente de modulador de actividad de neurotrofina, por ejemplo, i) diferiría sustancialmente en polaridad, por ejemplo un residuo con una cadena lateral no polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe o Met) sustituido por un residuo con una cadena lateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn o Gln, o por un aminoácido cargado tal como Asp, Glu, Arg

o Lys, o sustituyendo un residuo cargado o polar por uno no polar; y/o ii) diferiría sustancialmente en su efecto sobre la orientación de la cadena principal del polipéptido, tal como la sustitución de o por Pro o Gly por otro residuo; y/o iii) diferiría sustancialmente en la carga eléctrica, por ejemplo una sustitución de un residuo cargado negativamente tal como Glu o Asp por un residuo cargado positivamente tal como Lys, His o Arg (y viceversa); y/o iv) diferiría sustancialmente en la masa estérica, por ejemplo la sustitución de un residuo voluminosos tal como His, Trp, Phe o Tyr por otro que tenga una cadena lateral menor, por ejemplo Ala, Gly o Ser (y viceversa).

Las variantes obtenidas mediante sustitución de aminoácidos pueden prepararse, en una realización preferida, en base a los valores de hidrofobicidad e hidrofilicidad y a la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, que incluyen la carga, el tamaño y otros similares. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos que toman en consideración varias de las anteriores características son bien conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Además de las variantes descritas en la presente memoria, se pueden formular variantes estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura de la variante y así dichos compuestos también pueden usarse de la misma manera que las variantes de la invención. Esto puede lograrse mediante técnicas de modelización y diseño químico conocidas por los especialistas en la técnica. Se debe entender que todas las construcciones estéricamente similares son abarcadas por el alcance de la presente invención.

En la presente memoria también se describen variantes funcionales que comprenden aminoácidos sustituidos que presentan valores hidrofílicos o índices hidropáticos que están en el intervalo de ±4,9, por ejemplo dentro del intervalo de ±4,7, tal como dentro del intervalo de ±4,5, por ejemplo dentro del intervalo de ±4,3, tal como dentro del intervalo de ±4,1, por ejemplo dentro del intervalo de ±3,9, tal como dentro del intervalo de ±3,7, por ejemplo dentro del intervalo de ±3,5, tal como dentro del intervalo de ±3,3, por ejemplo dentro del intervalo de ±3,1, tal como dentro del intervalo de ±2,9, por ejemplo dentro del intervalo de ±2,7, tal como dentro del intervalo de ±2,5, por ejemplo dentro del intervalo de ±2,3, tal como dentro del intervalo de ±2,1, por ejemplo dentro del intervalo de ±2,0, tal como dentro del intervalo de ±1,8, por ejemplo dentro del intervalo de ±1,6, tal como dentro del intervalo de ±1,5, por ejemplo dentro del intervalo de ±1,4, tal como dentro del intervalo de ±1,3, por ejemplo dentro del intervalo de ±1,2, tal como dentro del intervalo de ±1,1, por ejemplo dentro del intervalo de ±1,0, tal como dentro del intervalo de ±0,9, por ejemplo dentro del intervalo de ±0,8, tal como dentro del intervalo de ±0,7, por ejemplo dentro del intervalo de ±0,6, tal como dentro del intervalo de ±0,5, por ejemplo dentro del intervalo de ±0,4, tal como dentro del intervalo de ±0,3, por ejemplo dentro del intervalo de ±0,25, tal como dentro del intervalo de ±0,2 del valor del aminoácido que ha sustituido.

La importancia de los índices hidrofílico e hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína es bien conocida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, y Hopp, Patente de EE.UU. Nº 4.554.101).

Los valores de índice hidropático de los aminoácidos tal como se usan en la presente memoria son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5) (Kyte y Doolittle, 1982).

Los valores de hidrofilicidad de aminoácidos son: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ±0,1); glutamato (+3,0 ±0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4) (Patente de EE.UU. nº 4.554.101).

Además de los compuestos de peptidilo descritos aquí, se pueden formular compuestos estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura peptídica y dichos compuestos también pueden ser usados de la misma manera que los péptidos descritos en la presente memoria. Esto se puede lograr empleando técnicas de modelización y de diseño de productos químicos conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear la esterificación y otras alquilaciones para modificar el extremo amino de, por ejemplo, una cadena peptídica principal de di-arginina, para imitar una estructura de tetrapéptido.

Los péptidos con alquilaciones N-terminales y esterificaciones C-terminales también son contemplados dentro del alcance de la presente invención. Los equivalentes funcionales también comprenden conjugados glicosilados y covalentes o agregados formados con los mismos, o con otros, fragmentos de modulador de actividad de neurotrofina y/o moléculas de modulador de actividad de neurotrofina, incluyendo los dímeros o restos funcionales químicos no relacionados. Dichos equivalentes funcionales se preparan mediante unión de funcionalidades a grupos presentes en el fragmento, que incluyen uno o ambos extremos N y C, empleando medios conocidos en la técnica.

Por tanto, los equivalentes funcionales pueden comprender fragmentos conjugados a ésteres o amidas alifáticos o de acilo de los extremos carboxilo, alquilaminas o residuos que contengan cadenas laterales de carboxilo, por ejemplo, conjugados a alquilaminas en residuos de ácido aspártico; derivados de O-acilo de residuos que contengan grupos hidroxilo y derivados de N-acilo de los aminoácidos amino-terminales o de residuos que contengan grupos amino, por ejemplo conjugados con fMet-Leu-Phe o proteínas inmunogénicas. Los derivados de los grupos acilo se seleccionan del grupo de los restos funcionales alquilo (que incluyen alquilos C3 a C10 normales), formando con ello especies de alcanoilo, y compuestos carbocíclicos o heterocíclicos, formando con ello especies de aroilo. Los grupos reactivos preferiblemente son compuestos difuncionales conocidos per se para su uso en reticulación de proteínas a matrices insolubles a través de grupos laterales reactivos.

Los equivalentes funcionales covalentes o agregativos y los derivados de los mismos son útiles como reactivos en inmunoensayos o para procedimientos de purificación por afinidad. Por ejemplo, un fragmento de modulador de actividad de neurotrofina de acuerdo con la presente invención puede insolubilizarse mediante enlace covalente a Sefarosa activada con bromuro de cianógeno empleando métodos conocidos per se, o adsorberse en superficies de poliolefinas, con reticulación de glutaraldehído o no, para su uso en un ensayo o en una purificación de anticuerpos de modulador de actividad de anti-neurotrofina o en receptores de la superficie celular. Los fragmentos también pueden marcarse con un grupo detectable, por ejemplo, pueden ser radioyodados mediante el procedimiento de cloramina T, ligados covalentemente a quelatos de tierras raras o conjugados a otro resto fluorescente para su uso, por ejemplo, en ensayos diagnósticos.

La mutagénesis de un fragmento predeterminado preferido de modulador de actividad de neurotrofina puede llevarse a cabo haciendo inserciones de aminoácidos, normalmente en el orden de 1 a 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 5 residuos de aminoácidos, o eliminaciones aproximadamente entre 1 y 10 residuos, tal como aproximadamente entre 2 y 5 residuos.

En una realización el fragmento de modulador de actividad de neurotrofina se sintetiza mediante síntesis automatizada. Se puede emplear cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, tal como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente los aminoácidos a una cadena de aminoácidos creciente (véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963).

El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente a partir de suministradores tales como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, California, y puede operarse de forma general según las instrucciones del fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación de sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier fragmento de modulador de actividad de neurotrofina de acuerdo con la presente invención. Debe entenderse que las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier sub-combinación de las mismas pueden combinarse para alcanzar una secuencia final de un equivalente funcional. Debe entenderse que las inserciones incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxi-terminales, por ejemplo con una proteína o un vehículo hidrofóbico o inmunogénico tal como cualquier polipéptido o estructura soporte capaz de actuar como vehículo.

También se proporcionan oligómeros, que incluyen dímeros que incluyen homodímeros y heterodímeros, de fragmentos de modulador de actividad de neurotrofina de acuerdo con la invención y caen dentro del alcance de la invención. Los equivalentes funcionales y las variantes de modulador de actividad de neurotrofina se pueden producir como homodímeros o heterodímeros con otras secuencias de aminoácido o con secuencias nativas de modulador de actividad de neurotrofina. Los heterodímeros incluyen dímeros que contienen fragmentos de modulador de actividad de neurotrofina inmunorreactivos, así como fragmentos de modulador de actividad de neurotrofina que no necesitan tener o ejercer actividad biológica alguna.

Los fragmentos de modulador de actividad de neurotrofina pueden sintetizarse tanto in vitro como in vivo. El método para la síntesis in vitro es bien conocido, y los métodos que son adecuados o adecuadamente adaptables a la síntesis in vivo de modulador de actividad de neurotrofina también se describen en la técnica anterior. Cuando se sintetizan in vivo, una célula hospedante se transforma con vectores que contienen ADN que codifica modulador de actividad de neurotrofina o un fragmento del mismo. Un vector se define como una construcción de ácido nucleico replicable. Los vectores se usan para mediar en la expresión de modulador de actividad de neurotrofina. Un vector de expresión es una construcción de ADN replicable en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento predeterminado de modulador de actividad de neurotrofina, o cualquier equivalente funcional del mismo que pueda expresarse in vivo, es ligado operativamente a secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la expresión del fragmento o equivalente en un hospedante adecuado. Dichas secuencias de control son bien conocidas en la técnica.

Los cultivos de células derivadas de organismos multicelulares representan células hospedantes preferidas. En principio, cualquier cultivo de células eucarióticas superiores es factible, tanto de cultivos de vertebrados como de invertebrados. Los ejemplos de líneas celulares de hospedante útiles son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y líneas celulares WI38, BHK, COS-7, 293 y MDCK. Las células hospedantes preferidas son células eucarióticas que se sabe que sintetizan modulador de actividad de neurotrofina endógeno. Los cultivos de dichas células pueden aislarse y usarse como fuente del fragmento, o usarse en métodos terapéuticos de tratamiento, que incluyen métodos terapéuticos dirigidos a promocionar o inhibir un estado de crecimiento, o a métodos diagnósticos llevados a cabo en un organismo humano o animal.

Agente farmacéutico: los términos “agente farmacéutico” o “fármaco” o “medicamento” se refieren a cualquier agente terapéutico o profiláctico que puede usarse en el tratamiento (que incluye la prevención, el diagnóstico, el alivio o la cura) de un malestar, aflicción, afección, enfermedad o lesión en un paciente. Los determinantes genéticos útiles terapéuticamente, péptidos, polipéptidos y polinucleótidos pueden incluirse dentro del significado del término producto farmacéutico o fármaco. Tal como se define aquí, un “agente terapéutico”, “agente farmacéutico” o “fármaco” o “medicamento” es un tipo de agente bioactivo.

El término “agente bioactivo” tal como se emplea en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia que pueda usarse en relación con una aplicación que sea terapéutica o diagnóstica, tal como por ejemplo en métodos para diagnosticar la presencia o ausencia de una enfermedad en un paciente y/o métodos para el tratamiento de una enfermedad en un paciente. “Agente bioactivo” se refiere a sustancias que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo. Los agentes bioactivos pueden ser neutros o estar cargados negativa o positivamente. Los agentes bioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, profármacos, agentes de diagnóstico, agentes terapéuticos, agentes farmacéuticos, fármacos, agentes de aporte de oxígeno, sustitutos sanguíneos, moléculas orgánicas sintéticas, polipéptidos, péptidos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides y determinantes genéticos, que incluyen nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.

Tratamiento: el término “tratamiento” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un método que implica una terapia que incluye la cirugía de una afección clínica en un individuo que incluye un organismo humano o animal. La terapia puede ser profiláctica, paliativa o curativa.

ARN antisentido: una molécula de ARN capaz de causar el silenciamiento de un gen mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.

ADN antisentido: una molécula de ADN capaz de causar el silenciamiento de un gen mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.

SiRNA: “ARN de interferencia pequeña” (del inglés “small interfering RNA”) es una molécula de ARN de cadena doble corta (a menudo, aunque sin restricción, de menos de 30 nucleótidos de longitud) capaz de causar el silenciamiento específico de un gen en células de mamífero.

“Silenciamiento” de un gen: un proceso que conduce a una expresión reducida de genes endógenos. El silenciamiento génico preferiblemente resulta de la reducción post-transcripcional de la expresión génica.

Regulación al alza de la expresión: un proceso que conduce a un aumento de la expresión de genes, preferiblemente de genes endógenos.

In vitro/in vivo: los términos se usan con su significado normal.

“Polipéptido”, tal como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos. “Oligopéptidos” se define aquí como polipéptidos que tienen una longitud no superior a 100 aminoácidos. El término “polipéptido” también pretende incluir proteínas, es decir biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, éstos pueden formar complejos, estar unidos covalentemente o pueden estar unidos no covalentemente. Los polipéptidos de una proteína pueden estar glicosilados y/o lipidados y/o comprender grupos prostéticos.

“Polinucleótido”, tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende al menos dos ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden existir de forma natural o pueden ser modificados, tal como ácidos nucleicos cerrados (LNA, del inglés “locked nucleic acids”), o ácidos nucleicos peptídicos (PNA, del inglés “peptide nucleic acids”). Polinucleótido, tal como se usa aquí, generalmente pertenece a:

i) un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación predeterminada, o

ii) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos predeterminada, o

iii) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por polinucleótidos (i) o (ii), en donde dicho fragmento tiene al menos una actividad predeterminada como la especificada en la presente memoria; y

iv) un polinucleótido cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones severas con un polinucleótido como el definido en una cualquiera de (i), (ii) y (iii), y que codifica un polipéptido, o un fragmento del mismo, que tiene al menos una actividad predeterminada como la especificada en la presente memoria; y

v) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que está degenerada respecto a la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos (iii) o (iv);

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

Un “anticuerpo purificado” es un anticuerpo en el que al menos el 60 por ciento de su peso está libre de polipéptidos y moléculas orgánicas naturales con las que se asocia de forma natural. Preferiblemente, la preparación comprende anticuerpo en una cantidad de al menos el 75 por ciento en peso, más preferiblemente de al menos el 90 por ciento en peso, y aún más preferiblemente de al menos el 99 por ciento en peso.

Descripción detallada

Los presentes inventores han identificado que las neurotrofinas se unen a receptores de la familia de receptores con dominio Vps10p. Por consiguiente, la presente invención se refiere a la modulación de la actividad de al menos una neurotrofina.

Sin pretender establecer una teoría, se cree que la familia de receptores con dominio Vps10p está implicada en uno

o más de los siguientes mecanismos relativos a las neurotrofinas:

-

Transporte retrógrado, que incluye la captación de pro-neurotrofina, neurotrofina y p75.

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Transporte dentro de mecanismos biosintéticos, que incluyen la clasificación de pro-neurotrofina y transporte desde la red de Golgi.

-

Liberación de neurotrofinas.

-

Señalización, que incluye la modulación del transporte celular y la señalización mediante formación de complejos ternarios con p75 y neurotrofina o pro-neurotrofina.

Receptores de la familia de receptores con dominio Vps10p

La expresión “receptor de la familia Vps10p” se refiere a una familia de receptores que se caracteriza por tener un dominio de Vps10p N-terminal; dicha familia con dominio Vps10p comprende SorLA, sortilina, SorCS-1, SorCS-2 ó SorCS-3, véase la Figura 1. En una realización de la presente invención, se puede usar cualquiera de los receptores de la familia con dominio Vps10p; más preferiblemente, el receptor comprende el dominio Vps10p, el módulo 10CC, un segmento de transmembrana, así como un segmento citoplásmico que media en la clasificación celular y en la internalización, así como en la unión de adaptadores citoplásmicos que afectan a la señalización celular. En particular, el receptor usado es sortilina.

Neurotrofinas/pro-neurotrofinas

El término “neurotrofina” tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier miembro de la familia de las neurotrofinas, comprendiendo dicha familia de neurotrofinas el factor de crecimiento neural (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina-3 (NT-3) y la neurotrofina-4/5 (NT-4/5). En una realización de la presente invención, se puede usar cualquier miembro de la familia de las neurotrofinas; sin embargo, se prefiere que la neurotrofina sea NGF o BDNF.

El término “pro-neurotrofina” tal como se usa en la presente memoria se puede referirá a cualquier pro-péptido de la familia de las neurotrofinas, comprendiendo dicha familia de pro-péptidos pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT-3 y pro-NT4/5. En una realización de la presente invención se puede usar cualquier pro-neurotrofina, sin embargo se prefiere que la pro-neurotrofina sea pro-NGF o pro-BDNF.

Modulación de la actividad de neurotrofina

Las expresiones “actividad mediada por neurotrofina”, “actividad de una neurotrofina” o “actividad de neurotrofina” se refieren a una actividad biológica que normalmente se ve promovida, tanto directa como indirectamente, en presencia de una neurotrofina o una pro-neurotrofina. Las actividades de neurotrofina incluyen, aunque sin restricción, supervivencia neuronal, diferenciación neuronal que incluye el proceso de formación y el sobrecrecimiento de neuritas, cambios bioquímicos tales como inducción enzimática, implicación en la depresión y acción antidepresiva, implicación en acelerar el crecimiento del proceso nervioso, e implicación en disminuir la movilidad celular general. Se ha propuesto la hipótesis de que la carencia de factores neurotróficos es responsable de la degeneración de poblaciones neuronales selectivas, ya que se produce en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica.

Las actividades de las pro-neurotrofinas incluyen, aunque sin limitación, la activación diferencial de respuestas celulares tanto pro-apoptóticas como anti-apoptóticas, a través de la activación preferencial de receptores p75NTR o TrkA, respectivamente.

En las realizaciones preferidas, una o más de dichas actividades de la(s) neurotrofina(s) y/o pro-neurotrofina(s) son moduladas directa o indirectamente mediante la administración de un agente a un animal.

Los términos “modulación” o “modulado” se refieren a cualquier cambio o cambios en la actividad biológica de un agente bioactivo, por ejemplo una neurotrofina. En una realización de la presente invención, dicha modulación de la actividad de una neurotrofina es una disminución de la actividad de neurotrofina; sin embargo, la modulación puede igualmente ser un aumento de la actividad de la neurotrofina.

Agentes capaces de modular la actividad

En una realización preferida, el agente es capaz de unirse a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p o a una neurotrofina y/o pro-neurotrofina, interfiriendo con ello en la actividad de una neurotrofina, bien directamente o bien indirectamente.

En una realización igualmente preferida, el agente es capaz de modular la expresión de un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

El agente capaz de exhibir uno o más de los efectos mencionados anteriormente puede ser cualquier tipo de agente, por ejemplo el agente puede seleccionarse del grupo que comprende proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN antisentido, ADN antisentido, SiRNA, otros polinucleótidos o moléculas orgánicas. En una realización preferida el agente es un anticuerpo o un polipéptido, y en el caso más preferible el agente es un polipéptido.

En una realización, el agente es capaz de inhibir la unión de una neurotrofina o pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p. Dicha inhibición puede, por ejemplo, deberse a la unión del agente con la neurotrofina y/o la pro-neurotrofina y/o el receptor.

En una realización, el agente es capaz de unirse a la neurotrofina y/o pro-neurotrofina, tal como un receptor soluble de la familia de receptores con dominio Vps10p o un fragmento o una variante del mismo, siendo capaz dicho fragmento o variante de unirse a dicha neurotrofina. En particular, el receptor soluble es un receptor de sortilina soluble, o un fragmento o una variante del mismo. Cualquier fragmento o variante capaz de unirse a una neurotrofina y/o a una pro-neurotrofina queda incluido dentro de la presente memoria. En particular, un fragmento es un péptido que comprende una secuencia que corresponde a la estructura 10CC de la familia de receptores con dominio Vps10p que tiene la secuencia SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 612-740, o un fragmento o variante de la misma.

En otra realización el agente es capaz de unirse al receptor. El agente se puede unir a cualquier parte del receptor relevante para la inhibición de la unión de la neurotrofina. Por consiguiente, el agente puede ser capaz de inhibir la unión de dicha neurotrofina o de dicha pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p mediante la unión a una parte extracelular del receptor, a una parte intracelular del receptor o a un segmento de la parte transmembrana del receptor.

Un ejemplo del agente es un anticuerpo dirigido contra una parte extracelular del receptor. En una realización aún más preferida, el anticuerpo está purificado. En la realización preferida en la que el agente es un anticuerpo dirigido contra una parte extracelular del receptor, el anticuerpo está dirigido preferiblemente contra un péptido que comprende una secuencia que corresponde a la estructura 10CC de la familia de receptores con dominio Vps10p que tiene la secuencia SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 612-740 o un fragmento o una variante de la misma. En particular, el anticuerpo debería estar dirigido contra una posición dentro de dicha estructura de tal modo que el anticuerpo bloquee estéricamente la unión de la neurotrofina y/o la pro-neurotrofina con el receptor.

En otra realización adicional, el agente es un péptido que comprende una secuencia que tiene la SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 34-77 correspondiente a la parte de la secuencia pro-Sortilina que se une a sortilina o a un fragmento o variante de la misma, siendo capaz dicho péptido de unirse al receptor. El fragmento del mismo preferiblemente comprende la SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 50-70, más preferiblemente la SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 55-61 (GVSWGLR).

En otra realización preferida, el agente se selecciona de una o más de las siguientes secuencias: SEC ID Nº: 2 residuos de aminoácido 29-81 correspondientes a la pro-parte de SorLa, o un fragmento o variante de la misma. En particular, un fragmento o variante de la misma debería comprender una secuencia correspondiente a la secuencia SEC ID Nº: 2 residuos de aminoácido 47-66.

En otra realización preferida adicional, el agente es un péptido que comprende una o más de las siguientes secuencias o un fragmento o variante de las mismas: SEC ID Nº: 6 residuos de aminoácidos 19-121 (pro-parte de NGF), SEC ID Nº: 7 residuos de aminoácido 19-127 (pro-parte de BDNF); SEC ID Nº: 8 residuos de aminoácido 17124 (pro-parte de neurotrofina-3, NT-3), SEC ID Nº: 9 residuos de aminoácido 25-80 (pro-parte de neurotrofina-4, NT-4) o un fragmento o variante de las mismas, siendo capaz dicho péptido de unirse al receptor. El agente es incluso más preferiblemente un péptido que comprende una secuencia de unión de receptor de sortilina de pro-NGF

o un fragmento o variante de la misma. El agente en otra realización preferida puede ser un péptido que comprende la secuencia SEC ID Nº: 6 residuos de aminoácido 19-121 (la secuencia de la pro-parte de NGF) o un fragmento o variante de la misma, siendo dicho péptido capaz de unirse al receptor.

En otra realización preferida, el agente puede ser de forma preferible un péptido que presenta la secuencia de SEC ID Nº: 13, la secuencia correspondiente a la pro-neurotensina/pro-neuromedina, la SEC ID Nº: 10 (la secuencia de la neurotensina), la SEC ID Nº: 11 (la secuencia de la neuromedina) o un fragmento o una variante de las mismas, siendo dicho péptido capaz de unirse al receptor.

En otra realización preferida, el agente puede ser de forma preferible un péptido que tiene la secuencia SEC ID Nº: 13, la secuencia correspondiente a la pro-neurotensina/pro-neuromedina, SEC ID Nº: 10 (la secuencia de la neurotensina), SEC ID Nº: 11 (la secuencia de la neuromedina) o un fragmento o una variante de las mismas, siendo dicho péptido capaz de unirse al receptor.

En otra realización preferida, el agente puede ser un péptido que comprende una variante de NGF o un fragmento de unión a receptor de sortilina de la misma. Más preferiblemente, dicho péptido que comprende una variante de NGF o un fragmento de unión a receptor de sortilina de la misma es capaz de unirse a sortilina y de estimular la actividad del receptor de sortilina. Incluso más preferiblemente, dicho péptido que comprende una variante de NGF o un fragmento de unión a receptor de sortilina de la misma comprende una o más de las secuencias descritas en la patente de EE.UU. nº 6.333.310, o un fragmento o variante de las mismas (secuencias correspondientes a variantes de NGF).

En otra realización adicional, el agente deriva de RAP natural (proteína asociada a receptor natural), tal como un fragmento o una variante de RAP. La RAP (proteína asociada a receptor) es una proteína celular que comprende aproximadamente 300 aminoácidos, que en una realización preferida presenta la secuencia mostrada en: XM_003315, Gene: AH006949 correspondiente a la SEC ID Nº: 12. En una realización preferida el agente derivado de RAP es un péptido que comprende un dominio funcional mínimo que tiene como mucho 104 aminoácidos, preferiblemente entre 20 y 60 aminoácidos. En particular, son dominios de proteína funcional mínimos. Estos péptidos presentan como mucho 104 aminoácidos, preferiblemente entre 20 y 60 aminoácidos. Un dominio preferido corresponde a las posiciones de aminoácido 219-323 de la RAP.

En otra realización preferida, el agente es capaz de unirse a una parte intracelular del receptor y/o a la parte transmembrana de un receptor de la familia de receptores con dominio Vsp10p. En particular, el agente puede ser capaz de unirse a la parte citoplásmica del receptor de la familia de receptores con dominio Vsp10p, tal como a una parte de la sortilina correspondiente a la SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 779-831 o a un fragmento de una variante de la misma. Más preferiblemente, el agente es capaz de unirse a la parte citoplásmica del receptor de la familia de receptores con dominio Vsp10p, tal como a una parte de la sortilina que corresponde a la SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 779-831 o un fragmento de una variante de la misma. Más preferiblemente, el agente es capaz de unirse a la parte citoplásmica del receptor de la familia de receptores con dominio Vsp10p, tal como a una parte de la sortilina correspondiente a la SEC ID Nº: 1 residuos de aminoácido 792-794 (YSVL) o residuos de aminoácido 821-831 (HDDSDEDLLE) o un fragmento de una variante de la misma.

En particular, la unión de un agente a las partes intracelulares o de transmembrana del receptor puede conducir a la modulación de la actividad de la neurotrofina y/o la pro-neurotrofina a través de la modulación del transporte de al menos una neurotrofina y/o pro-neurotrofina hacia fuera, hacia dentro o en el interior de células que expresan el receptor de la familia de receptores con dominio Vsp10p, tal como se discute más adelante.

En otra realización preferida, el agente es capaz de modular la expresión de un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p y con ello interferir en la actividad de al menos una neurotrofina. La modulación puede ser bien una inhibición o bien una estimulación de la expresión. Los métodos preferidos para modular la expresión del receptor incluyen, aunque sin restricción:

(i)Bloquear o inhibir la actividad de los productos de traducción de uno o más genes de receptor con dominio Vps10p y/o uno o más derivados de los mismos, mediante la inhibición la traducción de ARNm o la activación transcripcional usando ácidos nucleicos antisentido.

(ii) Desactivar el ARNm mediante ribozimas dirigidas a los ARNms que codifican uno o más genes de receptor con dominio Vps10p y/o uno o más derivados de los mismos.

(iii) Inhibición de los productos de traducción presentes intracelularmente de los genes de receptor con dominio Vps10p mediante la administración de moléculas que imitan dianas de los productos de traducción de uno o más genes de receptor con dominio Vps10p y/o uno o más derivados de los mismos, compitiendo con ello con sus dianas naturales.

(iv)

Estimular la expresión de uno o más genes de receptor con dominio Vps10p y/o uno o más derivados de los mismos, por ejemplo en una realización preferida, se administra un agente a las células in vitro o in vivo. Dicho agente puede actuar específicamente o no específicamente. También es posible activar genes responsables de un crecimiento adicional de tejido diferenciado mediante la introducción de uno o más genes de receptor con dominio Vps10p y/o uno o más derivados de los mismos en las respectivas células y tejidos mediante terapia génica. Para este propósito, las respectivas secuencias de ácido nucleico pueden ponerse bajo el control de un promotor más fuerte, que opcionalmente se puede activar y desactivar con la administración de un estímulo a la célula/tejido.

(v)

Estimular la expresión de uno o más genes de receptor con dominio Vps10p y/o uno o más derivados de los mismos mediante la administración directa a la respectiva célula/tejido de un producto de traducción, bien un péptido o bien una proteína, que derive de uno o más genes de receptor con dominio vps10p y/o uno o más derivados de los mismos. Debido al bajo peso molecular de cualquiera de los productos de traducción mencionados, dichos péptidos/proteínas pueden aplicarse fácilmente a la célula, por ejemplo usando sistemas de administración por encapsulación.

El cambio en el nivel de expresión del receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p puede determinarse usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, que incluyen, aunque sin restricción: sistemas o microsistemas de ADN (Brazma y Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (análisis en serie de expresión génica) (Madden y col., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (amplificación de enzimas de restricción de ADNcs digeridos) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análisis de expresión génica total) (Sutcliffe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 1976-81), sistemas de proteínas y proteómica (Celis y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut y col., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciamiento de etiqueta de secuencia expresada (EST) (Celis y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson y col., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huella dactilar de ARN sustractiva (SuRF) (Fuchs y col., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson y col., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonación sustractiva, pantalla diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli y col., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) y métodos de espectrometría de masas (revisados en To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).

Métodos para tratar una enfermedad o trastorno

Los agentes identificados de acuerdo al método de la presente invención son considerados útiles para la promoción del desarrollo, el mantenimiento o la regeneración de neuronas in vitro e in vivo, incluyendo neuronas centrales (cerebro y espina dorsal), periféricas (neuronas simpáticas, parasimpáticas, sensoriales y entéricas) y motoras. Por consiguiente, dichos agentes se pueden utilizar en métodos para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos neurológicos. En una realización preferida, las formulaciones están destinadas a la administración a un paciente para tratar trastornos neurales. Por “trastornos neurales” se entiende aquí trastornos del sistema nervioso central o periférico que estén asociados a una degeneración o daño neuronal. Los ejemplos específicos de trastornos neurales incluyen, aunque sin limitación, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la corea de Huntington, la apoplejía, ELA, neuropatías periféricas y otras afecciones que se caracterizan por necrosis o pérdida de neuronas, tanto de neuronas centrales como periféricas o motoras, además de tratar nervios dañados debido a un trauma, disfunción o lesión renal, disfunción o lesión pancreática, disfunción o lesión pulmonar, lesión en tejidos adiposos y efectos tóxicos de agentes quimioterapéuticos usados para tratar un cáncer o el SIDA. Por ejemplo, las neuropatías periféricas asociadas a determinadas afecciones, tales como las neuropatías asociadas a la diabetes, el SIDA o la quimioterapia pueden tratarse usando las formulaciones de la presente invención.

Por ejemplo, los agentes identificados de acuerdo al método de la invención se pueden usar para promocionar la supervivencia o el crecimiento de neuronas motoras que estén dañadas por un trauma o una cirugía. Asimismo, dichos agentes pueden usarse para tratar trastornos motoneuronales, tales como la esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), la parálisis de Bell y diversas afecciones que incluyen atrofia o parálisis muscular espinal. Dichos agentes también pueden usarse para tratar trastornos neurodegenerativos humanos, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis múltiple, la corea de Huntington, el síndrome de Down, la sordera nerviosa y la enfermedad de Meniere. Dichos agentes pueden usarse como potenciadores cognitivos, para potenciar el aprendizaje particularmente en demencias o traumas. La enfermedad de Alzheimer, que ha sido identificada por el National Institue of Aging como responsable de más del 50% de las demencias en personas mayores, también es la cuarta o quinta causa de muerte en estadounidenses por encima de los 65 años de edad. Cuatro millones de estadounidense, el 40% de los estadounidenses por encima de 85 años de edad (el segmento de mayor crecimiento en la población de EE.UU.), padece la enfermedad de Alzheimer. El veinticinco por ciento de todos los pacientes con enfermedad de Parkinson también padecen una demencia de tipo enfermedad de Alzheimer. Y en aproximadamente el 15% de los pacientes con demencia, la enfermedad de Alzheimer y la demencia multi-infarto coexisten. La tercera causa más común de demencia, tras la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular, es la pérdida cognitiva debida a una enfermedad cerebral orgánica relacionada directamente con el alcoholismo, que se da en aproximadamente el 10% de los alcohólicos. Sin embargo, la anormalidad más consistente para la enfermedad de Alzheimer, así como para la demencia vascular y la pérdida cognitiva debida a enfermedad cerebral orgánica relacionada con el alcoholismo, es la degeneración del sistema colinérgico procedente del cerebro anterior basal (BF, del inglés “basal forebrain”) y dirigida al códex y al hipocampo (Bigl y col. en Brain Cholinergic Systems, M. Steriade y D. Biesold, eds., Oxford University Press, Oxford, pág. 364386 (1990)). Y existe una serie de otros sistemas neurotransmisores afectados por la enfermedad de Alzheimer (Davies Med. Res. Rev. 3: 221 (1983)). Sin embargo, la pérdida cognitiva, relacionada por ejemplo con la degeneración del sistema neurotransmisor colinérgico, no está limitada a individuos que padecen demencia. También se ha observado en adultos por lo demás sanos y en ratas. Los estudios que comparan el grado de pérdida de capacidad de aprendizaje con el grado de reducción del flujo sanguíneo cerebral cortical en ratas maduras demuestran una buena correlación (Berman y col. Neurobiol. Aging 9: 691 (1988)). En el alcoholismo crónico la enfermedad cerebral orgánica resultante, como la enfermedad de Alzheimer o el envejecimiento normal, también se caracteriza por reducciones difusas del flujo sanguíneo cerebral cortical en aquellas regiones del cerebro en las que surgen las neuronas colinérgicas (cerebro anterior basal) y en las que se proyectan (córtex cerebral) (Lofti y col., Cerebrovasc. and Brain Metab. Rev 1: 2 (1989)).

“Neuropatía periférica” se refiere a un trastorno que afecta al sistema nervioso periférico, que se manifiesta a menudo como una combinación de disfunciones neurales motoras, sensoriales, sensorimotoras o autónomas. La amplia variedad de morfologías exhibidas por las neuropatías periféricas pueden atribuirse cada una de forma inequívoca a un igualmente amplio número de causas. Por ejemplo, las neuropatías periféricas pueden adquirirse genéticamente, pueden resultar de una enfermedad sistémica o pueden estar inducidas por un agente tóxico. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, neuropatía periférica diabética, neuropatía sensorimotora distal o neuropatías autónomas tales como movilidad reducida del tracto gastrointestinal o atonía de la vejiga urinaria. Los ejemplos de neuropatías asociadas a enfermedades sistémicas incluyen el síndrome post-polio o la neuropatía asociada a SIDA; los ejemplos de neuropatías hereditarias incluyen la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacrómica, el síndrome de Down, la enfermedad de Fabry y el síndrome de Dejerine-Sottas; y los ejemplos de neuropatías causadas por un agente tóxico incluyen aquellas causadas por el tratamiento con un agente quimioterapéutico tal como vincristina, cisplatino, metotrexato o 3’-azido-3’-desoxitimidina. Otras enfermedades neurales que podrían beneficiarse del tratamiento con uno o más agentes identificados de acuerdo al método de la presente invención incluyen la depresión y la manía.

Métodos para determinar un compuesto que altera la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p

La presente invención comprende un método in vitro para escrutar un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, comprendiendo dicho método de forma preferible las etapas de:

a) proporcionar un ensayo para medir la unión de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p,

b) añadir el compuesto que va a ser evaluado al ensayo, y

c) determinar la cantidad de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina ligada al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, y

d) comparar la cantidad determinada en la etapa c) con la cantidad medida en ausencia del compuesto que está siendo evaluado,

e) en donde una diferencia en las dos cantidades identifica un compuesto que altera la unión de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

En una realización preferida de este método de escrutinio de la presente invención, la neurotrofina se selecciona entre NGF, BDNF, NT-3 o NT-4/5. Incluso más preferiblemente, la neurotrofina es NGF o BDNF. La pro-neurotrofina puede seleccionarse entre pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT-3 o pro-NT-4/5. Más preferiblemente, la pro-neurotrofina es pro-NGF o pro-BDNF. En una realización preferida de este método de escrutinio, el receptor se selecciona entre SorLa, Sortilina, SorCS1, SorCS3 o SorCS2. Incluso más preferiblemente, el receptor es sortilina. En otra realización del método de escrutinio de la presente invención, la neurotrofina y/o pro-neurotrofina es capaz de unirse a una parte extracelular del receptor. En una realización de la presente invención, el receptor puede ser un receptor expresado en una célula, dentro de la membrana plasmática y/o presente sobre una membrana plasmática. La célula usada en el método de escrutinio de la presente invención puede ser seleccionada de forma preferible a partir de cultivos primarios de células neuronales, de líneas celulares derivadas de neuronas, de células transfectadas capaces de expresar receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, de neuronas periféricas y de neuronas centrales. Preferiblemente, las células son líneas celulares inmortalizadas.

Los ensayos que pueden usarse para medir la unión de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p son bien conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen, aunque sin restricción, ensayos de dos híbridos de levadura, métodos de unión competitiva, tales como RIAs, ELISAs, y otros similares. Otros ensayos son la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), la resonancia de plasmón superficial (Biacore), los ensayos de transferencia Western, la inmunohistoquímica. Los resultados de los estudios de unión pueden analizarse usando cualquier representación gráfica convencional de los datos de unión, tal como el análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci., 51: 660-672 [1949]; Goodwin y col., Cell,

73: 447-456 [1993]), y otros similares.

Un método para determinar el efecto de un agente sobre la actividad de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas en células que presentan un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p

Se proporciona un método para determinar el efecto de un agente sobre la actividad de neurotrofinas y/o proneurotrofinas en células que presentan un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p. Dicho método comprende las etapas de:

a) administrar dicho agente a un mamífero que expresa el receptor,

b) medir la actividad de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas en dicho mamífero,

c) comparar la medida de la etapa b) con una medida obtenida en ausencia del compuesto que está siendo evaluado,

d) en donde la diferencia entre las dos medidas identifica el efecto de dicho agente sobre la actividad de neurotrofinas sobre células que presentan receptores de la familia de receptores con dominio Vps10.

El mamífero puede expresar el receptor de forma natural o puede estar transfectado con el gen natural del receptor.

La actividad de dicha neurotrofina y/o pro-neurotrofinas en dicho mamífero pueden medirse mediante uno o más de las siguientes medidas:

a) medir el nivel de expresión de un gen diana de respuesta a neurotrofina, tal como ARNm o proteína en tejidos del mamífero,

b) medir el nivel de expresión de un receptor tal como se ha definido en la presente memoria, como ARNm o proteína en tejidos del mamífero,

c) medir la unión o el transporte mediados por el receptor de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas ligadas al receptor,

d) medir la captación de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas al interior de células de dicho mamífero,

e) medir la transducción de señal de dicho receptor o de un receptor relacionado en células de dicho mamífero.

El receptor relacionado puede ser el receptor p75 o el receptor TrkA.

En una realización preferida de dicho método, el método además comprende la administración de dicho agente a un mamífero que carezca de la expresión de dicho receptor. Dicho mamífero que carece de expresión de dicho receptor puede carecer únicamente de la expresión de dicho receptor en uno o más tejidos seleccionados, y/o puede presentar un nivel reducido de expresión de dicho receptor.

Los métodos para medir la expresión de ARNm o proteína del receptor en los tejidos del mamífero son bien conocidos por los especialistas en la técnica y se han descrito con anterioridad. Los métodos para medir la unión o el transporte mediados por receptor de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas ligadas al receptor también son conocidos por los especialistas en la técnica: dichos métodos incluyen, aunque sin restricción, el escrutinio de dos híbridos de levadura, el escrutinio de RTM de Biacore, la reticulación UV y la inmunoprecipitación.

Los métodos para medir la captación de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas en células de un mamífero también son bien conocidos por los especialistas en la técnica: dichos métodos incluyen, aunque sin restricción, un método en el que la captación de neurotrofina/pro-neurotrofina se mide en células que presentan el receptor y en células que no presentan el receptor. La neurotrofina/pro-neurotrofina está preferiblemente marcada, por ejemplo radioactivamente

o fluorescentemente.

Un método para modular el transporte de al menos una neurotrofina y/o pro-neurotrofina en o hacia el interior de una neurona de un animal

En otra realización descrita en la presente memoria, se proporciona un método para modular el transporte de al menos una neurotrofina y/o pro-neurotrofina fuera de, o hacia el interior de una línea celular o neurona de un animal, comprendiendo dicho método la administración a dicho animal de una cantidad suficiente de un agente capaz de unirse a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p. Dicha modulación puede comprender un aumento del transporte anterógrado de la neurotrofina y/o pro-neurotrofina en la neurona. La modulación puede comprender de forma alternativa un descenso del transporte anterógrado de la neurotrofina y/o la pro-neurotrofina en la neurona. En otra realización preferida, la modulación comprende un aumento del transporte retrógrado de la neurotrofina y/o pro-neurotrofina en la neurona. En otra realización preferida, la modulación comprende un descenso del transporte retrógrado de la neurotrofina y/o pro-neurotrofina en la neurona. La modulación puede llevarse a cabo mediante el agente discutido en la presente memoria.

Receptor soluble

En otro aspecto adicional, la especificación se refiere a un receptor soluble de la familia de receptores con dominio Vps10p o un fragmento o una variante del mismo, siendo dicho fragmento o variante capaz de unirse a dicha neurotrofina. En particular, el receptor soluble es un receptor de sortilina soluble, o un fragmento o una variante del mismo. Además, la invención se refiere al uso del receptor soluble. Por ejemplo, el receptor soluble puede usarse para modular la actividad de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas, usadas para modular la actividad de otros receptores tales como p75 y TrkA. En otra realización, el receptor soluble puede usarse para propósitos diagnósticos en relación a las neurotrofinas y pro-neurotrofinas, en particular en relación a NGF y pro-NGF.

Además de lo anterior, la especificación se refiere a la expresión de un receptor como el definido en la presente memoria, así como al aislamiento y purificación del mismo, llevándose a cabo dichos métodos mediante métodos estandarizados.

Adicionalmente, la especificación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un receptor soluble de la familia de receptores con dominio Vps10p o un fragmento o una variante del mismo.

Ejemplos

Unión a los receptores

Todos los datos proporcionados en las Figuras 2-7 se han obtenido mediante medidas de resonancia de plasmón superficial (análisis BIAcore).

LISTA DE SECUENCIAS SEC ID Nº 1: Secuencia de sortilina

>sp|Q99523|SORT_HUMAN Precursor de sortilina (Glucoproteína 95) (Gp95) (Receptor 3 de neurotensina) (NT3) (100 kDa receptor NT) Homo sapiens (Humano)

10 SEC ID Nº 2: Secuencia de SorLA

>sp|Q92673|SORL_HUMAN Precursor del receptor relacionado con sortilina (Receptor relacionado con la proteína sortilina que contiene repeticiones de LDLR de clase A) (SorLA) (SorLA-1) (Receptor de lipoproteína de baja

SEC ID Nº 3: Secuencia de SorCS1

>tr|Q8WY21| Receptor SorCS con dominio VPS10-Homo sapiens (Humano)

SEC ID Nº 4: Secuencia de SorCS3

Ab028982 Sortilina 3 humana

Referencia de EMBO 20. nº 9 pág. 2180-2190, 2001: descripción de mRNA para receptores cerebrales de la familia Vps10p

5 SEC ID Nº 5: Secuencia de SorCS2

Ab037750 SorCS2 humano/sortilina 4

Referencia de EMBO 20. nº 9 pág. 2180-2190, 2001: descripción de mRNA para receptores cerebrales de la familia 10 Vps10p, relacionado con sortilina y SorLa

SEC ID Nº 6: Secuencia de NGF

>sp|P01138|NGF_HUMAN Precursor del factor de crecimiento de nervios beta (beta-NGF) РHomo sapiens (Humano). Se̱al del p̩ptido subrayada, parte del prop̩ptido en negrita y cursiva:

>gi|114900|sp|P23560|BDNF_HUMAN Precursor del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)

SEC ID Nº 8: Secuencia de neurotrofina 3

>gi|128581|sp|P20783|NT3_HUMAN Precursor de neurotrofina 3 (NT-3) (Factor neurotrófico) (HDNF) (Factor de 20 crecimiento de nervios 2) (NGF-2)

SEC ID Nº 9: Secuencia de neurotrofina 4

>gi|462741|sp|P34130|NT5_HUMAN Precursor de neurotrofina 5 (NT-5) (Factor neutrófico 5) (Neurotrofina 4) (NT-4) (Factor neutrófico 4)

10 SEC ID Nº 10: Secuencia de neurotensina SEQ ID NO 10: neurotensin sequence

qlyenkprrp yil

15 SEC ID Nº 11: Secuencia de neuromedina SEQ ID NO 11: neuromedin sequence

ipyil

20 SEQ ID NO 12: Receptor associated peptide (RAP) SEC ID Nº 13: pro-neurotensina/pro-neuromedina

25 >gi|2828196|sp|P30990|NEUT_HUMAN Precursor de neurotensina/neuromedina N [contiene: neuromedina N grande (NmN-125); Neuromedina N (NmN)(NN); Neurotensina (NT); Péptido de cola]

LISTA DE SECUENCIAS

5 <110> Aarhus University

<120> Modulación de la actividad de neurotrofinas

<130> P70PC00

<160> 13

<170> PatentIn versión 3.1 15 <210> 1

<211> 831

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 1

<210> 2

<211> 2214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 1168

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1222

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 907

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 241

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 246

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 257

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11 10 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 357

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 170

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES
2. 1.- Un método in vitro para escrutar en búsqueda de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p 5 a) proporcionar un ensayo para medir la unión de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la

   familia de receptores con dominio Vps10p, b) añadir el compuesto que va a ser evaluado al ensayo, y c) determinar la cantidad de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina ligada al receptor de la familia de

   receptores con dominio Vps10p, y 10 d) comparar la cantidad determinada en la etapa c) con una cantidad medida en ausencia del compuesto que va a ser evaluado, e) en donde una diferencia entre las dos cantidades identifica un compuesto que altera la unión de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p. 2.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pro-neurotrofina se selecciona entre pro-NGF o pro15 BDNF, pro-NT-3 o pro-NT-4/5. 3.-El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el receptor se selecciona entre SorLa, Sortilina, SorCS1, SorCS3 o SorCS2.