KR20070004561A - 분지형 펩티드 친양매성 화합물들, 그들의 관련된 에피토프화합물들 및 자가조립된 구조들 - Google Patents

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사무엘 아이. 스터프
무스타파 오. 굴러
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노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

하나 이상의 에피토프 서열들을 결합하기 위한 펜던트 아미노기를 제공하는 하나 이상의 잔기들을 포함하는 분지형 펩티드 친양매성 화합물들, 증강된 에피토프 제시를 위한 그와 같은 화합물들 및 관련된 조성물들이 개시된다.
펩티드 친양매성 화합물, 분지형 펩티드 친양매성 화합물, 펜던트 아미노기, 에피토프 화합물들, 원통형 미셀

Description

분지형 펩티드 친양매성 화합물들, 그들의 관련된 에피토프 화합물들 및 자가조립된 구조들{Branched peptide amphiphiles, related epitope compounds and self assembled structures thereof}
본 출원은 2003년 12월 5일에 제출된 미국특허출원 제60/527,442호로부터 우선권의 이익을 주장하며, 그 기초출원은 원용에 의해 전체가 본원에 포함된다.
미국 정부는 에너지부로부터 노스웨스턴 대학교에 제공된 그랜트 제DE-FG02-00ER54810호에 따라 본 발명에 대해 일정 권리들을 갖는다.
본 발명은 하나 이상의 에피토프 서열들을 결합하기 위한 펜던트 아미노기를 제공하는 하나 이상의 잔기들을 포함하는 분지형 펩티드 친양매성 화합물들(branched peptide amphiphiles), 증강된 에피토프 제시를 위한 그와 같은 화합물들 및 관련된 조성물들에 관한 것이다.
생물학에서 리간드들 및 수용체들간 분자적 인식(molecular recognition)은 에피토프들의 적합한 제시를 요구한다. 세포외 매트릭스에서 세포 유착 리간드(cellular adhesion ligand)들은 세포 증식, 분화 및 정상적인 대사 활성들의 유지에 영향을 미치는, 세포 유착 및 부착(attachment)에서 핵심적인 역할을 수행한다. 최근에, 재생 의학 또는 표적 화학요법(targeted chemotherapy)에서 중요한 생 물학적 사건들을 유발하기 위해, 인위적인 에피토프들로 세포 구조들을 닮은 스카폴드들(scaffolds)을 설계하는 것이 주목받고 있다. 이와 같은 인위적인 세포 스카폴드들 상의 신호들의 분포 및 구조적 제시에 있어서의 변화들에 따른 세포 반응에서의 차이점들이 보고되었다. 예를 들면, 세포 유착 리간드들 간의 나노단위의 분리(nanoscale separation)를 변화시키면 신호들의 인식 및 뒤이은 세포들의 증식을 개선시킨다는 것이 발견되었다.
생물질들(biomaterials)을 합성하기 위해 이용되는 다양한 방법들 중에서, 자가조립은 세포들을 캡슐화(encapsulate)하고 인 시투(in situ)로 조립될 수 있는 분자들의 용액들로부터 스카폴드들(scaffolds)을 형성하기 위해 특별히 매력적인 도구이다.
전술된 바에 비추어 볼 때, 본 발명의 목적은 생물학적으로 활성인 에피토프들의 전달 및 제시를 위한 분자적 아키텍쳐를 제공하고, 이에 의해 앞서 약술된 사항들을 포함한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 다양한 문제들을 해소하는 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 본 발명의 하나 이상의 양태들이 일부 목적들을 충족시키며, 하나 이상의 다른 양태들은 또 다른 일부 목적들을 충족시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 각각의 목적이 그의 모든 측면들에서 본 발명의 모든 양태에 동등하게 적용될 수는 없을 것이다. 따라서, 다음의 목적들은 본 발명의 하나의 양태에 대해 선택적으로 고려될 수 있다.
본 발명의 목적은 광범위한 생활성(bioactive) 에피토프들의 구조적 제시를 위해 자가-조립될 수 있는 화합물들 및 관련된 조성물들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에피토프 제시 및 대응되는 신호 인식을 증강시키는 화합물들을 포함하는 분자적 구조들을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 에피토프들/세포 유착 리간드들의 분리를 위한 3차원 구조를 갖는 광범위한 친양매성 펩티드 화합물들로서, 에피토프들/세포 유착 리간드들의 제시 및 전달을 위해, 생리적 조건들에서 자가-조립될 수 있는 것인 화합물들을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 목적들, 특징들, 잇점들 및 장점들은 본 요약 및 이하에서 상세하게 설명되는 일부 구체예들에서 명확할 것이며, 다양한 친양매성 화합물들, 자가-조립 기법들 및 펩티드 합성에 관한 지식을 가진 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 용이하게 파악할 것이다. 그와 같은 목적들, 특징들, 잇점들 및 장점들은 수반된 실시예들, 데이터들, 도면들 및 그로부터 유추될 수 있는 합리적인 추론들과 합쳐져, 단독으로 또는 본 명세서에 포함된 참고문헌들과 함께 고려될 때 상기로부터 명확할 것이다.
부분적으로, 본 발명은 비-선형적 펩티드 친양매성 화합물을 포함할 수 있다. 그와 같은 화합물은 펜던트 아미노 기(pendant amino group)를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 펩티드 성분을 포함한다. 아미노 기는 펩티드 성분의 길이 또는 종축에 대해 비선형적인 성분에 직접 연결 또는 결합될 수 있다. 그와 같은 화합물에 친양매성을 제공하면서, 펩티드 성분은 소수성 성분에 직접 연결 또는 결합된다. 이하에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 전술된 아미노산 잔기는 천연 아미노산 또는 비-천연(non-naturally occurring) 아미노산일 수 있다. 마찬가지로, 펜던트 아미노 기는 펩티드 성분으로의 포함 전 또는 후에 또 다른 작용기로부터 유래될 수 있다. 또한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에 의해 이해될 바와 같이, 그와 같은 펜던트 부분(pendancy)은 화합물에 분지형 또는 비-선형 구성(configuration)을 제공하기 위해 또 다른 성분에 직접 연결 또는 결합되는 것이 작용적으로 가능한 임의의 기를 포함할 수 있다. 여하튼, 일부 구체예들에서, 그와 같은 잔기는 라이신을 포함한, 이에 한정되지 않는 수개의 천연 아미노산들 중 하나일 수 있다.
둘 이상의 그와 같은 잔기들의 포함은 하나 이상의 생활성 에피토프 서열들을 펩티드 성분에 결합시키기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 서열들은 2003년 2월 18일에 제출되어 공동-계류 중인 출원 제10/368,517호(국제특허공개 제03/070749호) 및 2004년 12월 6일에 본 출원과 함께 제출되어 공동 계류 중인 "성장 인자 전달을 위한 자가-조립되는 펩티드 친양매성 화합물들 및 관련 방법들(Self Assembling Peptide Amphiphiles and Related Methods for Growth Factor Delivery)"이라는 명칭의 출원으로 그 전체가 원용에 의해 본 출원에 포함된 상기 출원들에서 제공된 것과 같은 서열들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 그와 같은 서열들은 예를 들면, 세포 증식, 분화 및/또는 그들의 대사, 생체모방의(biomimetic) 변형들 및/또는 다양한 성장 인자들 및/또는 관련된 형태형성(morphogenetic) 단백질들, 펩티드들 또는 다른 연관된 분자적 성분들과 상호작용하는 결합 서열들과 관련된 공지된 및/또는 이용가능한 세포 유착 리간드들로부터 선택될 수 있고, 공지된 파지 표시 방법들(phage display processes)을 통해 확인될 수 있는 바와 같은 결합 서열들은 전술된 공동-계류 중인, 공동-제출된 출원들에 기재된 서열들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이하에서 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명이 속하는 분야에서 공지되는 바와 같이 배열되고 및/또는 구성된(예를 들면, 더 분지된 구성 또는 고리형 구성에서) 그와 같은 에피토프 서열들은 본 발명의 친양매성 화합물의 펩티드 성분과 그의 N-말단 또는 그 부근에서 직접 연결 또는 결합될 수 있다. 그와 같은 잔기가 라이신 또는 또 다른 그와 같은 천연 아미노산인지 여부에 관계없이, 에피토프 수 및 정체(identity)는 그와 같은 잔기들 및 이용가능한, 펜던트 화학적 작용에 따라 변할 수 있다. 마찬가지로, 펩티드 성분의 길이 또는 서열은 원하는 유연성(flexibility), 전하 및/또는 분자간 인력 또는 결합 능력에 따라 변할 수 있다. 그와 같은 화합물들의 소수성 성분은 또한 결과물인 친양매성에 의해서만 한정되며 변할 수 있고(예를 들면, ~C6-~C22 포화 또는 불포화된, 알킬 또는 치환된 알킬 등) 그와 같은 화합물들의 연관된 시스템들에 영향을 미칠 수 있다.
이하에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명은 분지형 펩티드 친양매성 화합물들(PAs)에 관한 것이나, 그의 구체예들은 생리적 pH 조건들 하에서 나노섬유들(nanofibers)로 자가조립될 수 있다. 예를 들면, pH 7.4 인산 완충액의 첨가 및 염기성 조건들에서, 아니면 생리적 조건들 하에서, 그와 같은 분지형 펩티드 서열을 갖는 PA들은 자기-지지형(self-supporting) 겔 시료들을 형성하는 원통형 미셀들(micelles)로 자가조립된다. 그와 같은 분지형 펩티드 서열을 갖는 PA들은 자가조립된 나노섬유들의 표면들 상에 생물학적으로 활성인 펩티드 서열의 보다 양호한 노출을 가져올 수 있다. 분지형 펩티드 성분을 갖는 펩티드 친양매성 화합물들은 또한 하나의 펩티드 친양매성 화합물로부터 복수 개의 에피토프들의 제시를 허용할 수 있다. 그와 같은 생물학적으로 활성인 펩티드 에피토프들의 예들은 Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS), Pro-His-Ser-Arg-Asn(PHSRN), Ile-Lys-Val-Ala-Val(KVAV), 및 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 서열들을 포함한다. 그와 같은 펩티드 서열들 또는 에피토프들은 그와 같은 화합물들 또는 조립체들에 세포 유착 활성 또는 세포 수용체 결합 특성들을 부여하기 위해 그러나 이에 한정되지 않고 이용될 수 있다.
본 발명의 일구체예는 자가조립되면, 세포 유착을 촉진하는 상승적인(synergistic) 서열(들)을 갖는 나노섬유 구성의 주변부에 하나 이상의 에피토프들을 배치하는, 에피토프를 갖는 분지형 펩티드 친양매성 화합물들 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예는 분지형 PA 화합물 상에 하나 이상의 생물학적 작용기의 존재를 포함할 수 있다. 어떠한 이론에도 구속되지 않으면서, 분지화(branching)는 조립체의 표면 상의 기(들) 및/또는 에피토프(들)에 대한 보다 우수한 접근 및 제시를 가능하게 하는 것으로 생각된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 조직 치유(repair) 또는 골 성장의 그러나 이에 한정되지 않는 목적으로 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들의 세포적 투여(cellular administration)를 포함하는 치료 방법을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 펩티드 친양매성 화합물들은 투여 전에 자가조립되거나, 또는 세포 접촉 또는 세포적 환경으로의 투여시 또는 그 후에 자가조립된다. 한정 없이, 분지형 펩티드 부분을 갖는 펩티드 친양매성 화합물을 포함하는 자가조립된 나노섬유들은 치료법의 일부로서 세포 시료 또는 포유류/환자의 세포 또는 조직 부위로 전달될 수 있는 미셀의 소수성 성분 또는 미셀의 표면에 있는 하나 이상의 에피토프들과 연관된 세포들 또는 치료제 또는 조성물을 포함할 수 있다. 그와 같은 구체예들은 다양한 세포들 및/또는 항염제 화합물들(anti-inflammatory compounds), 화학요법제들, 및 그들의 조합들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치료제들을 캡슐화하고, 그들의 에피토프들에 결합하거나, 그렇지 않으면 제시한다.
분지형 펩티드 서열을 포함하는 펩티드 친양매성 화합물들은 그들의 원하는 기능들에 따라 상이한 에피토프들을 선택하여 의약적 응용들에서 이용될 수 있다. 이 펩티드 친양매성 화합물들로부터 제조된 자가조립된 물질들은 조직 이식, 체외 또는 체내에서의 재건성 조직 성장, 또는 조직 성장을 위한 스카폴딩으로서 이용될 수 있다. 분지형 펩티드 서열을 갖는 펩티드 친양매성 화합물들의 친양매성(amphiphilic character)은 나노 섬유들의 핵심부에 소수성 약물들을 캡슐화(봉입)하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 분광학적 프로브의 용도를 위해, Gd 복합체형성형 DOTA 분자(Gd complexing DOTA molecule)가 체외 또는 체내에서의 조직들 또는 세포들의 자기공명영상 연구들(magnetic resonance imaging studies)을 위해 나노섬유들의 에피토프들 중 하나로서 부착될 수 있다.
부분적으로, 본 발명의 구체예들의 다른 양태들, 특징들, 잇점들 및 장점들이 하기의 설명, 첨부된 청구항들 및 도면들로부터 명확해질 것이다:
도 1은 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들 (1), (2), 및 (3)의 분자 구조들의 예시를 포함한다;
도 2는 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들 (4) 및 (5)의 분자 구조들의 예시를 포함한다;
도 3 및 도 4는 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들 (6) 및 (7)의 분자 구조들의 예시를 포함한다;
도 5는 친양매성 구조들 8-10을 제공하고; 및
도 6 및 도 7은 대표적인 펩티드 친양매성 화합물들의 합성을 개략적으로 도시한다.
특정 구체예들의 상세한 설명
본 발명의 구체예들은 미셀들을 형성하기 위해 자가조립될 수 있는 분지형 펩티드 서열을 갖는 펩티드 친양매성 화합물을 포함한다. 그와 같은 미셀들은 원통형 섬유들 또는 나노섬유들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 개시되는 자가조립된 구조들은 나노섬유들이나, 본 발명은 임의의 자가조립된 구조를 포함하며 본 발명은 나노섬유들에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 펩티드 친양매성 화합물들은 다양한 작용기들이 결합(coupling) 또는 화학적으로 결합될 수 있는 하나 이상의 가지를 가질 수 있다. 이 작용기들 또는 에피토프들은 생물학적으로 활성일 수 있고 아미노산류, 세포 유 착 펩티드 서열, 펩티드류, 파지 표시 방법으로부터 유래된 펩티드류 및 단백질 서열들, 형광 프로브, 방사성 프로브, 자기 프로브(magnetic probe), 및 이들의 조합들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 도 1-4에서 실시예에 의해서 예시된 바와 같이, 분지형 펩티드 성분을 갖는 펩티드 친양매성 화합물들은: 라이신(K)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 분지성 아미노산(branching amino acid)에 연결된 하나 이상의 펩티드류 또는 아미노산 잔기들을 갖는 화합물들(예를 들면, PA6); 라이신(K)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 분지성 아미노산에 연결된 에피토프 및 곁사슬 펩티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 화합물들(예를 들면, PA1, PA4 및 PA7); 라이신(K)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 분지성 아미노산에 연결된 두 개 이상의 동일한 에피토프를 갖는 화합물들(예를 들면, PA2); 및 라이신(K)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 분지성 아미노산에 연결된 복수 개의 에피토프들을 갖는 화합물들(예를 들면, PA3 및 PA5);를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단지 예시로서, 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물(7)은 C16 알킬 사슬일 수 있는, 소수성 성분 및 분지된 펩티드 성분을 가진다. 펩티드 성분은 도 4에 도시된 바와 같이 분지성 아미노산 잔기인 라이신(K) 및 에피토프(DOTA-KG-RGDS-K)를 포함한다:
PA7에서, 펩티드 성분(K-LLL-AAA-(K))은 소수성 성분에 라이신을 갖는 C-말단 부위에서 결합된다. 펩티드 성분은 분지성 아미노산(예를 들면, K)을 통해 그 성분에 결합된 두 개 이상의 비-선형 성분들을 가질 수 있다. 펩티드 가지들 중 하나 또는 양자 모두는 아미노산류, 세포 유착 서열, 펩티드, 파지 표시 방법으로부터 유래된 펩티드 및 단백질 서열들, 형광 프로브, 자기 프로브 또는 이들의 조합들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 생물학적으로 활성인 에피토프를 포함할 수 있다.
자가조립된 나노섬유들에서 분지형 펩티드 서열을 갖는 펩티드 친양매성 화합물들의 존재는 분지형 펩티드 상의 에피토프들의 외부 분자들에 대한 보다 양호한 노출, 접근가능성(accessibility), 또는 이용가능성(availability)을 제공할 수 있다. 이 접근가능성은 조직 재생, 조직 이식물들을 위한 스카폴드들, 세포 인식 및 재건성 외과 수술들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 생물의학적 응용들을 위해 중요한 잇점들을 가질 수 있다.
본 발명의 분지형 펩티드(1)에서 하나의 RGDS 서열의 제시는 자가조립된 나노섬유들의 주변부에 있는 보다 용이하게 인식될 수 있는 에피토프로 설계된 본 발명의 생물학적으로 활성인 펩티드 친양매성 화합물들의 비-한정적인 실시예이다. 종래 기술의 선형 PA는 단 하나의 에피토프만 포함할 수 있다. 본 발명의 분지형 시스템들에서, 생물학적 활성을 개선하기 위해 하나 이상의 에피토프가 이용될 수 있다. 이 목적을 위해, 도 1에서 (PA3)에 의한 실시예 및 도 2에서 PA5에 의한 실시예에 대해 도시된 바와 같이, 세포 유착성 에피토프들의 상승적인 서열들이 또한 동일한 PA 상에서 합성될 수 있다. 현재, 산성 또는 염기성 조건들에서 이온들의 첨가 또는 pH의 변화는 전통적인 PA 나노섬유들을 형성하기 위해 이용되는 방법들 이다. 본 발명의 분지형 PA들은 중성 pH 및 염기성 조건들 하에서 유리하게는 나노섬유들 및 자기-지지형 겔들을 형성한다. 생리적 pH에서 나노섬유 형성은 그와 같은 펩티드 친양매성 화합물들의 대부분의 생물학적 응용들을 위해 바람직한 특성이다. 고체상 합성을 통해 이 분지형 PA들에 복수 개의 작용기들이 부착될 수 있다.
형광 프로브들은 라이신 아미노산들의 유리 아민 기들에 부착될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들로부터 제조된 나노섬유들의 친수성 표면에 있는 유리 아민기는 다른 이온 감지 프로브들을 위해 이용가능할 것이다. DOTA 분지형 PA7은 이 종류의 펩티드 친양매성 화합물의 하나의 예에 불과하다. 분지형 PA7 상의 Gd 복합체형성형 DOTA 모이어티(moiety)는 자기공명 영상 응용들을 위해 유용한 이완(relaxation) 연구들일 수 있다.
다양한 작용제들(agents) 또는 시약들이 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물을 자가조립하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 작용제들은 상보적인 전하를 띤 펩티드 친양매성 화합물들, 산류 또는 염기류, 다가 이온류, 탈수제류 및 그들의 조합들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 분지형 PA들은 생리적 pH 또는 염기성 조건들에서, 또는 이에 도달되면, 나노섬유들 및 자기-지지형 겔들을 형성한다.
다른 펩티드류에 결합하는데 유용한 펜던트 아미노 기들을 갖는 아미노산류는 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들의 분지형 구조를 합성하기 위해 이용될 수 있다. 하나 이상의 그와 같은 잔기들이 복수 개의 분지 부위들(branching sites)을 생성하기 위해 펩티드 성분에 포함될 수 있다. 도 1의 펩티드 친양매성 화합물은 펩티드 친양매성 화합물들의 백본 상에 RGDS-K 에피토프로의 가지를 형성하는 분지형 아미노산인 라이신 및 또 다른 라이신 아미노산(K-)을 갖는다. 하나 이상의 가지가 적합한 경우, 펩티드 친양매성 화합물(2)에 대해 도 1에 도시된 바와 같이 각각 펜던트 곁사슬 및/또는 아미노기를 갖는, 복수 개의 아미노산들이 이용될 수 있다. 라이신은 그의 화학적 성질을 변형하기 위해 이용될 수 있는 두 개의 기능적인(functional) 아민기들을 갖기 때문에, 본 발명에서 펩티드 친양매성 화합물들의 가지들을 합성하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 라이신에 한정되지 않으며, 펩티드들의 고체상 합성을 위해 아민기들 또는 다른 유용한 작용기들로 전환될 수 있는 둘 이상의 작용기들을 갖는 다른 아미노산들이 분지성 아미노산으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산들 및 베타 또는 감마 아미노산과 같은 비-천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아민 곁사슬들을 갖는 아미노산이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 분지형 아미노산들은 하나 이상의 알파 및 엡실론 아민 곁그룹들(side groups)을 형성하기 위해 변형될 수 있는 것으로 선택된다. 이 알파 및 엡실론 아민 곁그룹들은 가지들의 펩티드 합성을 지속하기 위해 이용될 수 있다. 직교형 보호기들(orthogonal protecting groups)이 하나 이상의 아민 곁그룹들 상에서 이용되어 그들 상에서 독립적으로 상이한 화학적 성질이 발휘될 수 있게 할 수 있다. 예를 들면, 소수성 성분을 부착시키기 위해, 알파 아민 보호를 손상시키지 않으면서, 직교형 보호기 전략이 이용될 수 있다. 이 경우, 엡실론 아민 보고는 제거되고 알킬 사슬은 탈보호화된 아미노산에 결합된다.
가지형성(분지)은 복수 개의 선택된 분지성 아미노산을 이용하는 것에 의해 증가될 수 있다. 예를 들면, 하나의 분지성 라이신은 2 개의 활성인 분지 부위들을 제공할 수 있고 추가적인 2 개의 라이신들은 4개의 활성인 분지 부위들을 제공하고, 추가적인 4개의 라이신들은 8개의 활성인 분지 부위들을 제공할 수 있다.
라이신 잔기(들)의 알파 및 엡실론 보호는 가지 설계에 따라 선택하였다. 두 개의 상이한 가지들을 원하는 경우, 라이신 곁사슬의 보호를 위해 Mtt 기를 이용했다. 제1 가지를 성장시키기 위해, Mtt 보호를 제거하지 않으면서, Fmoc 기를 제거했다. 제1 가지 서열의 완료 후에, 마지막 아미노산은 Mtt 분리(cleaving) 조건들에 내성인 Boc 보호를 갖는 것으로 선택했다. 그 후, PA의 제2 가지를 성장시키기 위해 Mtt를 제거하였다. 두 개의 유사한 가지들을 원하는 경우, Fmoc 곁사슬로 보호되는 라이신이 PA를 제조하기 위해 이용되었다. 두 개의 Fmoc 기들은 모두 피페리딘 용액에 의해 제거되었고, PA의 두 개의 가지들이 동시에 제조되었다.
분지형 PA들 및 그들의 자가조립된 미셀들이 조직 공학, 조직 재건, 합성 백신 설계, 약물 전달, 자기공명 영상 및 센서 응용들에서 이용될 수 있다. 이 PA들의 친양매성은 또한 하나의 벽으로 둘러싸인 탄소 나노튜브들(single walled carbon nanotubes)을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 도 3에 도시된 바와 같이, 분지형 PA6는 소수성 약물 또는 다른 치료용 분자들을 캡슐화하기 위해 이용될 수 있다. 분지형 펩티드 부분을 갖는 펩티드 친양매성 화합물을 포함하는 자가조립된 나노섬유들은 또한 미셀의 핵심부에, 또는 미셀의 표면 상에 있는 하나 이상의 에피토프들에 결합된, 치료법의 일부로서 세포 시료 또는 세포들이나 조직을 포함하는 환자 상의 부위에 전달될 세포 또는 치료용 조성물을 포함할 수 있다. 나노섬유들이 미리 형태가 형성된(pre-molded) 또는 미리 형성된(pre-formed) 스카폴드인 경우, 나노섬유들은 세포 시료 또는 세포들이나 조직을 포함하는 환자의 부위로 치료법의 일부로서 전달될 다양한 세포들 및/또는 항염제성 화합물들, 화학요법용 화합물들, 및 이들의 조합들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 치료용 조성물을 캡슐화하거나 또는 그들의 에피토프들에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 PA 화합물들은 특정 구체예들에서 일반적으로 소수성 알킬 성분 및 분지형 펩티드 성분을 포함할 수 있다. 분지형 펩티드 성분은 그 성분 내의 아미노산 잔기들의 배열 및 선택에 의해 하전된 기들, 에피토프들, 및 생물학적 신호들을 포함할 수 있다. 친수성 아미노산들은 하전될 수 있고 수성 환경에서 용해도(a degree of solubility)를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 수성 환경에서, 그와 같은 펩티드 친양매성 화합물들은 소수성 성분들은 그 중앙을 향하여 배향되고, 전반적으로 친수성인 기능적인 분지형 펩티드는 그 주변 표면을 따라 노출되어 있는 원통형 미셀들 또는 나노섬유들로 자가조립되는 능력을 갖는다. 분지형 펩티드 성분은 소수성 성분에 비해 벌키(bulky)하여, PA화합물은 전체적으로 원뿔인 형태를 띤다. 이론에 구속되지 않기를 바라며, 세그먼트들의 소수성 및 친수성 배열뿐 아니라 형태가 PA 자가-조립에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 분지형 펩티드 기들이 섬유의 길이를 따라 노출되어, 생활성 에피토프 또는 생물학적 신호가 환경에 제시될 수 있다.
PA 화합물의 강건성(robustness)을 증강시키기 위해, 펩티드 성분은 도 3의PA(6)에서 도시된 바와 같이, 라이신(도시된 바와 같음) 또는 알라닌 및/또는 글리 신과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다른 아미노산들에 결합된 하나 이상의 시스테인 잔기들을 포함할 수 있다. 조립되면, 인접한 시스테인 잔기들의 S-H 리간드들은 안정한 디술피트 결합 형성이 가능하도록 충분히 인접하며; 요오드 또는 산소와 같은 산화적 조건들에 대한 노출은 디술피드 결합 형성 및 섬유들의 가교(cross-linking)를 가져온다. 그와 같은 PA들의 하나의 다용도성(versatile) 특징은 가역적인 가교이다. PA 섬유들은 디티올트레이톨(DTT)과 같은 환원제를 이용하여 분해될 수 있다. 그렇지 않으면, PA는 자가조립되어, 의학적 용도를 위한 개조성(adaptibility)을 개선할 수 있다.
소수성 성분은 알킬 모이어티 또는 친양매성 화합물 기능을 제공하기 위해 사용될 수 있는 다른 구조와 같은, 그러나, 이에 한정되지 않는 탄화수소일 수 있다. 그와 같은 모이어티의 크기는 변할 수 있으나, 특정 구체예들에서 그 길이는 C6 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 펩티드 친양매성 화합물의 이 성분은 PA 분자의 원뿔형 분자 형태의 가느다란(slender) 부분을 형성한다. 소수성 및 펩티드 친양매성 화합물로 자가조립될 수 있게 하는 형태를 제공하는 트리아세틸렌과 같은 다른 화학적 작용기들이 또한 이용될 수 있다. 소수성 성분은 전술된 바와 같이, 펩티드 성분에 공유적으로 연결 또는 결합된다.
분지형 PA 화합물의 펩티드 성분은 전술된 바와 같이, 가교가 필요한 경우, 시스테인 잔기들을 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 알라닌, 세린, 또는 루이신과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다른 아미노산들이 이 영역에서 이용될 수 있다(예를 들면, 본 명세서에서 보다 상세하게 기재된 SLSL 또는 AAAA). 그와 같은 시스테인-불포함 성분들(cysteine-free component)은 환경이 가교 형성을 조절하기에 보다 어려울 수 있는 경우인 인-시투(in situ) 생물학적 응용들에 보다 적합할 수 있다. 그 시스템에 대한 SLSL 변형은 나노섬유들의 보다 느린 조립을 가져올 것으로 예상된다. 이론에 의해 구속되지 않으면서, 벌키한 루이신 곁사슬들은 섬유에 채워지는데 보다 많은 시간을 필요로 할 것으로 생각된다. 느려진 자가조립은 또한 나노섬유들의 지연된 형성을 갖는 것이 유리할 수 있는, 수술실(operating room)과 같은 기능적인 인 시투(in situ) 환경에서 보다 많은 적용들을 가질 수 있다. 펩티드 성분은 또한 구조적 유연성을 부여하기 위해 글리신과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다.
펩티드 성분은 라이신, 세린, 인산화된 세린, 디아미노프로피온산, 디아미노부티르산 및 아스파르트산과 같은 하전된 또는 친수성 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산을 포함할 수 있고-선택된 아미노산은 도 3에 도시된 PA6와 같은 하전된 펩티드 친양매성 화합물을 제공할 수 있다. 생리적 pH에 근접한 환경에서, 그와 같은 하전된 펩티드-친양매성 화합물은 양으로 또는 음으로 하전될 수 있다. 펩티드 성분은 PA 화합물의 상대적으로 벌키하고, 하전된 세그먼트로, 원뿔형 분자 형상의 가장 넓은 영역에 하나 이상의 가지들을 제공한다.
상이한 PA 화합물들의 혼합물들의 자가-조립은 또한 다양한 길이 및/또는 아미노산 서열의 대응하는 펩티드 성분들의 조립된 나노섬유의 길이를 따라 상이한 아미노산 서열들의 제시를 가능하게 할 수 있다. 또한, 상이한 크기들의 분지형 펩티드 친양매성 화합물들, 또는 상이한 크기들의 분지형 펩티드 친양매성 화합물들 및 충전제 펩티드 친양매성 화합물들(filler peptide amphiphiles)의 혼합물들, 또는 이들의 조합들은 자가조립된 나노섬유들 또는 미셀들의 표면들 상에 돌출된 펩티드 친양매성 화합물들을 갖는 나노섬유들 또는 미셀들을 형성하기 위해 자가조립될 수 있다.
다양한 펩티드 친양매성 화합물들 및 본 발명의 분지형 PA들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 공지된 제조 기법들을 이용하여 합성될 수 있으며, 상기 기법들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 2002년 11월 14일에 제출되어 공동-계류 중인 공개 출원 제10/294,114호(국제특허공개 제03/054146호)에 개시된 것들과 역시 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된, Stupp 등(예를 들면, J.D.Hartgerink, E.Beniash and S.I.Stupp, Science 294, 1683-1688, 2001 참조)에 의해 최초로 개시된 기법들의 변형들을 포함한다. 이와 같은 참고문헌들에 개시된 합성 방법들(synthetic schemes)은 본 발명에 적용될 수 있다. 펩티드 친양매성 화합물들은 그들의 완전히 프로톤화된(protonated) 형태, 부분적으로 프로톤화된 형태 또는 산 부가 염(acid addition salt) 또는 염기 부가 염(basic addition salt)일 수 있다. 일반적으로, 그와 같은 펩티드 친양매성 화합물들은 펩티드의 N-말단에서 또는 그 부근에서 소수성 테일의 첨가를 포함하는 표준 고체상 펩티드 화학(standard solid-phase peptide chemistry)에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 합성 방법들의 변형들은 원하는 친양매성 조성물 또는 펩티드 서열에 따라 공지된 절차들 및 합성 기법들 또는 그들의 간단한(straight-forward) 변형들을 이용하여, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 공지되거나 이들이 알고 있는 바와 같이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 소수성 테일이 키랄 탄소 상의 아민기가 아닌, 라이신 아미노산의 펜던트 사슬 상의 아민기에 결합된다.
다음의 비-한정적인 실시예들 및 데이터는 연관된 하나 이상의 생활성 에피토프 서열들을 갖는 다양한 분지형 펩티드 친양매성 화합물들의 자가조립을 포함한 본 발명의 화합물들, 시스템들 및/또는 방법들과 관련된 다양한 양태들 및 특징들을 예시하며, 그와 같은 화합물들은 본 명세서에 기재된 합성 방법 및 원용에 의해 본 명세서에 포함된 공동-계류 중인 출원들에 기재된 합성 방법들을 통해 이용가능하다. 종래 기술과 비교할 때, 본 발명의 화합물들, 시스템들 및/또는 방법들은 놀랍고 예기치 못한 것이며, 그들과 대비된다. 본 발명의 유용성은 여러가지 친양매성 펩티드 화합물들, 그들과 함께 이용될 수 있는 분지형 구성들 및/또는 에피토프 서열들의 이용을 통해 예시되나, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들은 본 발명의 범위에 속하는, 다양한 다른 펩티드 화합물들 및 그들에 결합된 에피토프로 유사한 결과들이 얻어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1
본 실시예는 분지형 펩티드 세그먼트를 포함하는 펩티드 친양매성 화합물들의 제조를 설명한다. (도 6 및 도 7과 함께 전술된 본 명세서에 포함된 출원들 및 그에 제공된 합성관련 세부 사항들을 참조한다.) 모든 펩티드들은 Fmoc 고체상 펩 티드 합성(Fmoc SPPS) 프로토콜에 의해 합성하였다. Fmoc, Boc 및 4-메틸트리틸(Mtt)에 의해 보호되는 아미노산들(Fmoc, Boc and 4-Methyltrityl(Mtt) protected amino acids), MBHA 링크 아미드 수지 및 HBTU는 NovaBiochem으로부터 구매하였다. 나머지 화학물질들은 Fischer 또는 Aldrich로부터 구매하였고, 제공되는 데로 이용하였다. 펩티드들은 MBHA 링크 아미드 수지 상에서 제조하였다. 아미노산 결합들(couplings)은 4 당량의 Fmoc 보호된 아미노산, 3.95 당량의 HBTU 및 6 당량의 DIEA로 4시간 동안 수행하였다.
Fmoc 탈보호화(deprotection)는 30% 피페리딘/DMF 용액으로 10분간 수행하였다. Mtt 제거는 TIS의 존재 하에 1% TFA/디클로로메탄 용액으로 5분간 수행하였다. 수지로부터 펩티드들의 분리(cleavage)는 97.5:2.5의 비율의 TFA:TIS 혼합물로 3시간 동안 수행하였다. 회전식 증발(rotary evaporation)에 의해 과량의 TFA를 제거하였다. 남은 점성의 펩티드 용액은 차가운 에테르로 분말화하고(triturate) 결과물인 백색 산물을 진공 하에 건조시켰다. PA들은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석기(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry: MALDI-TOF MS) 및/또는 전자분무 이온화 질량 분석기(Electrospray Ionization Mass Spectrometry:ESI-MS)에 의해 그 특징을 파악하였다.
투과 전자현미경(TEM) 시료들을 다공성 탄소(holey carbon)로 코팅된 TEM 그리드 상에서 PA들의 1 중량% 겔로 제조하였다. 네가티브 염색은 2% 포스포텅스트산 용액(phosphotungstic acid solution)으로 수행하였다. TEM을 위한 PA들의 1 중량% 겔들은 2 중량%의 PA 수용액과 인산 완충액(pH=7.4)을 일대 일로 혼합하여 제조하였다.
먼저, 수지를 DMF에서 30분간 팽창시키고, 수지 상의 Fmoc 보호 기(protecting group)를 30% 피페리딘/DMF 용액에 의해 제거하였다. 그 후, Fmoc-Lys(Mtt)-OH를 수지에 결합시켰다. 라이신 곁사슬 보호기인, Mtt는 Fmoc 보호를 분리하지 않으면서, 1%TFA/디클로로메탄 용액으로 제거하였다. 팔미트산(C16 알킬 사슬)을 아미노산 결합 시약들(amino acid coupling reagents)로 수지에 결합시켰다. 팔미트산의 결합 완료 후, Fmoc는 피페리딘 용액으로 제거하고 PA의 막대(rod) 부분인 아미노산들을 동일한 방법으로 결합시켰다(Fmoc SPPS).
PA의 가지들을 합성하기 위해 라이신을 선택했다. 가지 설계에 따라 라이신의 알파 및 엡실론 아민 보호를 선택했다. 두 개의 상이한 가지들을 원하는 경우, 라이신 곁사슬 보호를 위해 Mtt 기를 이용하였다. 제1 사슬을 성장시키기 위해, Mtt 보호를 제거하지 않으면서, Fmoc 기를 제거했다. 제1 사슬 서열의 완료 후에, Mtt 분리 조건들에 내성인 Boc 보호를 갖는 마지막 아미노산을 선택했다. 그 후, PA의 제2 사슬을 성장시키기 위해 Mtt를 제거했다. 두 개의 유사한 가지들을 원하는 경우, PA를 제조하기 위해 Fmoc 곁사슬 보호 라이신을 이용했다. 두 개의 Fmoc 기들을 모두 피페리딘 용액에 의해 제거하고, PA의 두 개의 가지들을 동시에 제조했다.
실시예 2
이하에 기재되는 일련의 분자들은 벌키하고, 입체적으로 방해된(sterically hindered) 펩티드 구조를 이용하여 나노섬유 상의 수용체들에 대한 에피토프들의 접근가능성을 증가시키도록 설계된, 신규한 분지형 PA 아키텍쳐를 예시한다. 대표적인, 비-한정적인 분자들은 라이신 덴드론 모이어티(lysine dendron moiety)들을 포함하고, 본 명세서에 포함된 종류의 다른 선형 PA들과 유사하게, 나노섬유들의 네트워크에 의해 형성된 수용성 겔들을 형성하기 위해 자가조립된다. 도 5에 도시된 바와 같이, 분자들은 포화된 16개의 탄소원자들로 구성된 알킬 세그먼트로 이어지는 펩티드 서열 KXXXAAAK (X=G 또는 L)을 포함하고, 덴드론 가지는 라이신 잔기에서 도입된다. 친양매성 자가-조립에서 보다 통상적으로 관찰되는 바와 같은 구형 미셀들보다는 원통형 나노섬유들과 같은 확장된 구조들로의 집합화를 선호하는 수소-결합된 β-쉬트 형성을 촉진하기 위해 알라닌, 글리신 및 루이신 잔기들을 이용하였다. 공지된 생물학적 에피토프 RGDS는 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 세포외 단백질들의 세포 결합 도메인들에 존재하며 하나 이상의 생활성 펩티드들의 그와 같은 PA 시스템들로의 포함을 예시하기 위해 이용되었다. RGDS 에피토프는 인테그린 수용체들에 결합되는 것으로 알려져 있고, 이 분자적 인식 사건(event)은 세포들의 세포외 매트릭스로의 유착 및 그에 뒤이은 신호전달의 복잡한 캐스캐이드(cascade)에서 핵심적인 역할을 수행한다.
본 발명의 분지형 PA들에서의 에피토프 이용가능성과 비교하기 위해 선형 펩티드 구조를 갖는 분자(8)을 합성하였다. 비대칭적인 분지형 분자들(9A 및 9B)을 생성하여, 자가조립 후 생활성 펩티드 서열의 구조적 제시를 변경하기 위해 라이신 잔기를 도입했다. 9A 및 9B에 유사한 방식으로 대칭형 가지들을 도입하고 하나의 PA 분자에 의한 복수 개의 에피토프들의 제시를 조사하기 위해 10A 및 lOB를 합성하였다. 또한, 분자들(9 및 10)에서, 에피토프의 구조적 접근가능성에 대한 소수성 곁사슬의 영향을 글리신 잔기(R=H)를 루이신(R=이소부틸) 잔기로 교환하여 연구하였다. 에피토프들의 인식 및 이용가능성을 조사하기 위해, 각 PA 상의 RGDS 서열을 비오틴 기로 종결시키고, 비오틴 접근가능성을 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 아비딘 분자의 결합을 이용하여 조사하였다. 아비딘은 단백질 하나당 4개의 비오틴 결합 부위들을 가져서, 비오틴에 대해 매우 높은 친화도를 갖는 것으로 알려져 있다. 제시되는 비오틴 모이어티들의 수를 변화시켜 단일층(monolayer)들의 표면 이용가능성을 조사하기 위해 이전에 이 결합 친화도가 연구되었다. 형광발색단(fluorophore)과 아비딘의 비오틴 결합 부위에 있는 아미노산 잔기들간의 상호작용들이 형광의 소광(quenching)을 유발한다. 따라서, 비오틴이 부착된(biotinylated) PA와 형광 표지된 아비딘의 결합은 소광 상호작용들을 약화시켜 상당한 형광의 회복을 가져올 것이다.
실시예 3
고체상 펩티드 합성(SPPS)을 이용하여 분지형 PA들을 제조하였다. 펩티드 세그먼트의 분지화(branching)는 직교성 보호기의 화학적 성질을 이용하여 달성하였다(Bourel, L.; Carion, 0.; Masse, H.G.; Melnyk, O.J. Peptide Sci . 2000, 45, 488-496; and Aletras, A.; Barlos, K.; Gatos, D. Koutsogianni, S.; Mamos, P.J. Peptide Protein Res . 1995, 6, 264-270. 참조). 펩티들의 설계를 제어하기 위해 라이신 잔기들 상의 아민들 상에 있는 Fmoc, Boc 및 4-메틸 트리틸(Mtt) 보호기들을 이용하였고, 이는 각각의 이 보호기들이 독립적으로 조작될 수 있기 때문이다. Fmoc 보호된 아민들을 이용하여 아미노산들을 펩티드에 결합시키고, Boc 보호기들을 이용하여 라이신 가지들을 차단(block)하며, 선택적인 탈보호화 및 비대칭적인 가지들의 성장을 위해 Mtt를 이용하였다. 유연한 4개의 탄소들로 구성된 링커(flexible four-carbon linker) 때문에 에피토프의 배열상 자유(conformational freedom)를 증강시키기 위해, RGDS 에피토프를 라이신 잔기의 ε아민에 결합시켰다. PA들에 대한 비오틴 부착은 비오틴을 펩티드 서열의 말단에 비오틴을 결합하는 것에 의해 SPSS를 통해 수행(biotinylation)하였다.
실시예 4
모든 PA들은 pH 4에서 물에 용해되고 pH가 약 6.5보다 높아지면, 0.5 중량%를 초과하는 농도들에서 자기-지지형 겔들을 형성하였다. 겔 형성은 pH 변화들에 따라 완전히 가역적인 것으로 파악되었다. 투과 전자현미경(TEM), 원자 현미경(AFM), FT-IR 및 원편광 이색성 분광분석(CD spectroscopy)을 이용하여 분지형 PA 분자들의 자가조립의 특징을 파악하였다. pH 7.4에서 자가조립된 PA8 내지 PA10의 TEM 사진들은 7±1 nm의 직경 및 수백 나노미터 내지 수 마이크로미터 범위의 길이를 갖는 균일하고, 높은 장경비(aspect ratio)의 나노구조들의 형성을 보여주었다. 모든 PA들의 동결건조된 겔들의 FT-IR은 3280-3285 cm-1에서의 N-H 신장 피크들(stretching peaks)에 근거하여, 펩티들 간의 수소 결합을 나타낸다. 1628- 1632cm- 1 에서 아미드 I 피크들은 1650-1675cm-1 범위에서의 피크들에 의해 표시되는, 일부 α-헬릭스 및 랜덤 코일 배열(conformation)들을 갖는, 펩티드 2차 구조에 대한 현저하게 β-쉬트 같은 특성과 일치한다. 또한, va(CH2)의 약 2932에서 약 2921cm-1로의 이동(shift)은 팔미트산 소수성 세그먼트에서 고도의 정렬화(ordering)을 나타낸다. 자가조립된 PA들로부터의 원편광 이색성 분광분석 결과들은 α-헬릭스 및 랜덤 코일 배열들로부터의 작은 기여들뿐 아니라, β-쉬트들의 현저한 존재에 대한 지문(signature)으로 해석될 수 있는, 200과 230nm 사이에서 넓은 피크(nπ* 변화)를 보였다. IR 및 CD 결과들은 β-쉬트 특징을 갖는 수소결합된 PA들의 고도로 정렬된 조립체로, 나노섬유들 내에 고밀도로 채워진 분자들을 가져오게 되는 구조와 일치했다.
실시예 5
FITC-아비딘과의 결합의 영향을 조사하기 위해 비오틴이 부착된 PA들의 희석된 시료들을 pH7.4에서 제조하였다. 흥미롭게도, 선형 PA8에 비해, 비오틴이 부착된 분지형 PA들에 대한 FITC-아비딘의 결합시 형광 발광에 있어서 상당한 증가를 관찰했다. 이 결과는 TEM에 의해 관찰된 구조적 유사성에도 불구하고, FITC-아비딘은 선형 분자들로 제조된 나노섬유들에 비해 분지형 분자들로 제조된 나노섬유들의 표면 상에 있는 비오틴에 대해 보다 높은 접근 가능성을 갖는다는 것을 보여준다. 선형 PA 시스템들에서, 고밀도의(dense) 수소 결합은 나노섬유들의 표면 상에 에피 토프들의 보다 조밀한 패킹을 가져오고, 따라서, FITC-아비딘의 비오틴에 대한 결합을 방해하여, 형광 발광의 보다 낮은 회복을 초래할 수 있다. 그러나, 입체적으로 방해되는 분지형 시스템들에서, 비오틴의 아비딘 수용체에 대한 증가된 이용가능성은 섬유 표면 상에서 분자들의 보다 덜 효과적인 패킹을 의미할 수 있다. 또한, PA 구조 상에 소수성 곁사슬들의 포함은 에피토프들의 이용가능성도 변화시켰다. 9B 및 10B에서의 비오틴 이용가능성은 각각 9A 및 10A에서보다 훨씬 더 높았다. 따라서, 이 분자들에서 소수성 곁사슬들은 또한 조립체에서 패킹의 속성 및 결과적으로 에피토프의 이용가능성에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 6
대조구(control)로서, 동일한 조건들 하에서 PA8 및 9B의 비오틴이 부착되지 않은 시료들(non-biotinylated versions)을 제조하고, FITC-아비딘으로 테스트하였다. FITC-아비딘의 형광에서 유의한 변화가 관찰되지 않았고, 이는 증가된 형광은 PA에 대한 아비딘의 비-특이적 결합 때문이 아니라는 것을 의미한다. 이 결과들은 나노섬유들의 주변부에 위치한 에피토프의 이용가능성에 대한 분지화 및 소수성 곁사슬들의 제안된 효과를 확인한다. 나노섬유들 상의 RGDS 에피토프 제시의 구조적 차이들이 펩티드 친양매성 나노섬유들을 갖는 배양된 세포들에 의한 이 펩티드 서열의 보다 복잡한 인식에 유사한 방식으로 영향을 미치는지 여부를 정립하기 위한 생물학적 실험이 진행 중이다.
실시예 7
본 명세서에 포함된 전술된 참고 문헌들에서 기재되고 제공된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 친양매성 화합물들은 관례(convention)에 따른 역전된 구조적 극성(a structural polarity reversed according to convention)을 제공하기 위해 제조될 수 있다. 비교하자면, 고체상 합성은 통상적으로 펩티드 세그먼트들이 C-말단으로부터 N-말단으로 합성될 것을 요구한다. 그 결과, 그와 같은 화합물들은 유리 N-말단을 알킬 모이어티로 캡핑하는 것에 의해 제조되어, C-말단에 유리 산 또는 아미드 기를 갖는 화합물들이 된다. 이와 대조적으로, 생활성 또는 합성적 유연성과 관계된 목적을 위해, 유리 N-말단을 갖는 펩티드 친양매성 화합물을 제공하는 것을 원할 수 있다. 따라서, C-말단에 또는 그 부근에 소수성 성분의 도입을 허용하고 분지화 및 에피토프 결합에 영향을 주는 하나 이상의 펜던트 작용기들을 제공하는 합성 경로를 고안했다. 도 6 및 도 7은 그와 같은 합성적 변형들을 개략적으로 도시한다. 도 6을 참조하면, 펩티드 성장 전에, 직교형 보호기들을 이용하여 소수성 성분(예를 들면, 알킬 모이어티)을 첨가한다. 도 7을 참조하면, 조화되는 보호/탈보호 전략들은 선택적인 에피토프(예를 들면, RGDS) 결합뿐 아니라 하나 이상의 라이신 잔기들에서 가지의 형성을 가능하게 하여, 대응되는 미셀 구성의 펩티드 주변부에서 아민 종료(amine termination)를 제공한다.
* * *
전술된 바와 같이, 분지형 펩티드 친양매성 분자들에 의해 형성된 원통형 나노구조들은 고밀도의 표면 결합 부위들을 제시한다. 그와 같은 분자들의 분지형 공유성 아키텍쳐(branched covalent architecture)는 탐색성 단백질 수용체(probing protein receptor)에 대한 결합 부위들의 보다 높은 접근가능성을 가져오며, 이는 생물학 및 의학을 위한 합성 나노스케일 물질들(nanoscale materials)에서 생활성의 초분자 설계(supramolecular design)에 유용한 발견이다.

Claims (30)

  1. 펜던트 아미노기를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 성분을 포함하는 비-선형 펩티드 친양매성 화합물(non-linear peptide amphiphile compound)로서, 상기 아미노기는 상기 펩티드 성분에 대해 비-선형인 성분에 결합되고, 상기 펩티드 성분은 소수성 성분에 결합되는 것인 비-선형 펩티드 친양매성 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 잔기는 천연 아미노산인 것인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아미노산은 라이신인 것인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 둘 이상의 라이신 잔기들을 포함하는 것인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비-선형 성분은 생활성(bioactive) 에피토프 서열을 포함하는 것인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에피토프 서열은 RDGS, PHSRN, IKVAV, YIGSR 및 파지 표지 방법(phage display process)의 인식 산물(recognition product)로부터 선택 되는 것인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 두 개의 라이신 잔기들 각각은 상기 에피토프 서열들 중 하나에 결합되는 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 알라닌, 글리신, 루이신, 시스테인 및 세린으로부터 선택되는 잔기들을 포함하는 것인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 소수성 성분은 약 C6 내지 약 C22 범위의 알킬 모이어티를 포함하는 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 알킬 모이어티는 상기 펩티드 성분의 C-말단 부근에서 라이신 잔기에 결합되는 것인 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 둘 이상의 라이신 잔기들을 포함하고, 상기 잔기들 중 하나 이상은 RDGS, PHSRN, IKVAV, YIGSR 및 파지 표지 방법의 인식 산물로부터 선택되는 생활성 에피토프 서열에 결합되는 것인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 서열들 중 하나 이상은 분광분석용 프로브 성 분(spectroscopic probe component)에 결합되는 것인 화합물.
  13. 제11항에 있어서, 미셀 구성(micellar configuration)으로 조립된 것인 화합물.
  14. 펩티드 성분, 상기 펩티드 성분에 결합된 소수성 성분을 포함하는 비-선형 펩티드 친양매성 화합물을 포함하는 시스템으로서, 상기 펩티드 성분은 생활성 에피토프 서열에 결합된 펜던트 아미노기를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 화합물은 유체 매질(fluid medium)에 있는 것인 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 잔기는 천연 아미노산인 것인 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 아미노산은 라이신인 것인 시스템.
  17. 제14항에 있어서, 상기 에피토프 서열은 RDGS, PHSRN, IKVAV, YIGSR 및 파지 표지 방법의 인식 산물로부터 선택되는 것인 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 소수성 성분은 상기 펩티드 성분에 달려있는(pendant) 아미노기에 결합되는 것인 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 알라린, 글리신, 및 루이신으로부터 선택되는 잔기들을 포함하는 것인 시스템.
  20. 제17항에 있어서, 상기 매질은 생리적 pH에 있으며, 상기 시스템은 상기 화합물들의 조립체를 포함하는 것인 시스템.
  21. 생물학적으로 활성인 에피토프 서열을 제시하기 위해 펩티드 친양매성 화합물의 펜던트 아미노기를 이용하는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수 개의 펩티드 친양매성 화합물로서, 각각의 상기 화합물은 소수성 성분 및 펩티드 성분을 포함하고, 상기 화합물들 중 하나 이상은 펜던트 아미노기를 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 복수 개의 펩티드 친양매성 화합물들을 제공하는 단계; 및
    상기 아미노기에 생물학적으로 활성인 에피토프 서열을 결합시키는 단계;를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 그의 N-말단 부근에 라이신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 에피토프 서열은 RDGS, PHSRN, IKVAV, YIGSR 및 파지 표지 방법의 인식 산물로부터 선택되는 것인 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 펩티드 성분의 N-말단은 두 개의 라이신 잔기들을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 각각의 상기 잔기는 RDGS, PHSRN, IKVAV, YIGSR 및 파지 표지 방법의 인식 산물로부터 선택되는 에피토프 서열에 결합되는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 화합물들은 수성 매질에 있고, 상기 매질의 pH는 상기 화합물들을 원통형 미셀로 조립하기 위해 조정되는 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 하나 이상의 상기 화합물들은 둘 이상의 라이신 잔기들을 포함하는 펩티드 성분을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 각각의 상기 잔기는 RDGS, PHSRN, IKVAV, YIGSR 및 파지 표지 방법의 인식 산물로부터 선택되는 에피토프 서열에 결합되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 잔기들 중 하나는 RDGS 에피토프에 결합되고 상기 잔기들 중 하나는 PHSRN 에피토프에 결합되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 화합물들은 수성 매질에 있고 상기 매질에서 시약을 이용하여 조립되는 것인 방법.
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