DE60129736T2

DE60129736T2 - Neue aggrecanase

Info

Publication number: DE60129736T2
Application number: DE60129736T
Authority: DE
Inventors: Noboru Tsukuba YAMAJI; Kouichi Tsukuba NISHIMURA; Kunitake Tsukuba ABE
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2000-12-18
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: ES2288909T3; EP1344821A1; AU2002222658A1; EP1344821B9; US20030185828A1; US7094590B2; JP3800175B2; US7193073B2; DE60129736D1; JPWO2002050258A1; EP1344821B1; EP1344821A4; ATE368735T1; WO2002050258A1; US20060078957A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Aggrecanase.
Stand der Technik
Gelenkerkrankungen sind Erkrankungen, die einen Schaden und eine Degeneration am Gelenkknorpel als Hauptkrankheitszustände zeigen. Obwohl eine Erkrankung mit einer besonders häufigen Anzahl an Patienten unter den Gelenkerkrankungen die Osteoarthritis (OA) (Elders M. J., J. Rheumatol., 27, Suppl., 60, 6-8, 2000) ist, werden analgetische anti-entzündliche Arzneimittel und Hyaluronsäurepräparationen in dem gegenwärtigen therapeutischen Verfahren lediglich als symptomatische Therapie zum Zweck der Erleichterung von Schmerzen verwendet, die die Degeneration des Knorpels und die Zerstörung des subchondralen Knorpels begleiten, so dass nicht gesagt werden kann, dass sie ausreichende therapeutische Wirkungen ausüben (Dieppe P., Scand. J. Rheumatol., 29, 279-281, 2000).
Gelenkknorpel ist ein Gewebe, das im wesentlichen aus Typ II-Collagen und Aggrecan besteht, wobei es sich um ein knorpelspezifisches Proteoglycan handelt und Abbau und Degeneration von beiden werden bei Gelenkerkrankungen beobachtet. Aufgrund dieser Tatsache wird es seit langem betrachtet, dass eine Kontrolle des Abbaus und der Degeneration dieser extrazellulären Matrixkomponenten zu einer Behandlung von Gelenkerkrankungen führen würde, so dass positiv Versuche unternommen wurden, um mit dem Abbau verbundene Proteasen (Collagenase und Aggrecanase) zu identifizieren und ihre Inhibitoren einem Screening zu unterwerfen und sie als Medikamente zu entwickeln.
Als Proteasen mit Collagenase-Aktivitäten wurden die Matrixmetalloproteasen (MMP1, MMP8, MMP13, MMP14 und ähnliche) identifiziert und ihre selektiven Inhibitoren wurden entdeckt. Trotz der Versuche, eine große Anzahl von MMP-Inhibitoren mit eine Collagenase-Inhibitionsaktivität als Therapeutika für Gelenkerkrankungen einschließlich OA und rheumatoider Arthritis (RA) zu entwickeln, wurden MMP-Inhibitoren, die für diese Erkrankungen als Indikation zu verwenden wären, noch nicht auf den Markt gebracht (Greenwald R. A., Ann. New York Acad. Sci., 878, 413-419, 1999). Unter diesen Umständen wurde die Aufmerksamkeit auf eine Aggrecanase gerichtet, die selektiv Aggrecan degradiert, wobei es sich um einen anderen hauet-konstituierenden Bestandteil von Gelenkknorpel handelt.
Eine mit Gelenkerkrankungen in Beziehung stehende Rolle des Enzyms Aggrecanase, das Aggrecan an der Stelle zwischen Glu373 und Ala374 spaltet, ergab sich durch die Berichte von Sandy et al. und Lohmander et al., die berichteten, dass alle der hauptsächlich verdauten Aggrecanfragmente, die in der Synovialflüssigkeit von menschlichen Arthritis-Patienten angetroffen werden, durch eine Spaltung an der Aggrecanase-Verdaustelle erzeugt wurden (Sandy J.D. et al., J. Clin. Invest., 89, 1512-1516, 1992; Lohmander L.S. et al., Arthritis Rheum., 36, 1214-1222, 1993). Andererseits war bekannt, dass bei einem in vitro-Explantat-Kultursystem von Gelenkknorpel ein Abbau von Aggrecan zunächst durch eine IL-1-Induktion auftritt und dass dann ein Abbau von Typ II-Collagen beschleunigt wird (Dingle L.T. et al., Ann. Rheum. Dis., 34, 303-311, 1975; Cawston T.E. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 215, 377-385, 1995; Kozaci L.D. et al., Arthritis Rheum., 40, 164-174, 1997). Es wurde berichtet, dass der Aggrecan-Abbau die Präzedenz über den Typ II-Collagenabbau in einem Maus-Arthritismodell annimmt (van Meurs J.B. et al., Arthritis Rheum., 42, 1128-1139, 1999). Diese Berichte legen eine Möglichkeit nahe, dass der Typ II-Collagenabbau durch Inhibition des davor stattfindenden Aggrecan-Abbaus kontrolliert werden kann.
Obwohl biochemische Merkmale zeigen, dass es sich um eine Metalloprotease handelt, die auf der Außenseite der Zellen lokalisiert ist, dass Zuckerketten zu einer Substraterkennung beitragen und dass eine Aktivität durch IL-1, TNF oder Retinsäure induziert wird, verblieb die Aggrecanase nichtsdestotrotz als Auslöser von Gelenkerkrankungen lange Zeit nicht identifiziert. Kürzlich wurde über ADAMTS4 (Aggrecanase-11; Tortorella M. D. et al., Science, 284, 1664-1666, 1999) und ADAMTS11 (Aggrecanase-2; Abbaszade I. et al., J. Biol. Chem., 274, 23443-23450, 1999) als Proteasen mit Aggrecanase-Aktivität berichtet. Die Genexpressionen dieser Proteasen sind in menschlichem OA-Knorpel jedoch nicht erhöht und werden nicht durch IL-1, TNF oder Retinsäure induziert (es ist bekannt, dass diese Verbindungen die Aggrecanase-Aktivität in einem Explantat-Kultursystem von menschlichem artikulärem Knorpel des Knies induzieren) und so wurde die Gegenwart einer anderen Protease in Bezug auf Gelenkerkrankungen vorgeschlagen (Flannery C. R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 260, 318-322, 1999).
Zusätzlich wurden kürzlich chromosomale Loki identifiziert, in denen genetische Faktoren, die zu OA in Bezug stehen, lokalisiert sind (ein OA-Empfänglichkeitslokus), in Übereinstimmung mit genetischen Forschungen an Patienten, die an OA leiden oder Familien mit einer starken Familienhistorie von OA. Beispielsweise wurde von 11q (Chapman K. et al., Am. J. Hum. Genet., 65, 167-174, 1999), 4q12-4q21.2, 6q21.1-6q22.1, 16p13.1-16q12.1, und 16q21-16q23 (Loughlin J. et al., Am. J. Hum. Genet., 65, 1795-1798, 1999) berichtet, dass sie OA-Empfänglichkeitsloki sind.
WO 03/027282 A offenbart Proteine, die zur S-Familie gehören, nämlich ADAMTS-15, -16, -17, -18 und -19.
Offenbarung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen Aggrecanase, die für Gelenkerkrankungen auslösend ist, die als Screeningmittel für ein Mittel zur Behandlung von Gelenkerkrankungen nützlich ist, ein neues Polynukleotid, codierend die Aggrecanase und ein geeignetes Screeningsystem zum Erhalt einer Substanz, die als Mittel zur Behandlung von Gelenkerkrankungen nützlich ist.
Mit dem Ziel der Lösung der oben erwähnten Probleme haben die vorliegenden Erfinder intensive Studien durchgeführt und im Ergebnis ein Gen erhalten, dass eine Aggrecanase codiert [d.h. MDTS8 (Metalloprotease und Desintegrin mit Thrombospondin Typ-1 repeats 8)], die für Gelenkerkrankungen auslösend ist und das Aggrecanaseprotein exprimiert. Die Erfinder zeigten, dass das Protein eine Aggrecanase-Aktivität ausübt, dass die Expression des Proteins durch Differenzierung in Knorpelzellen induziert wird und dass die chromosomale Stellung von MDTS8 sich in dem Lokus befindet, der als ein OA (eine der Gelenkerkrankungen) -Empfänglichkeitslokus identifiziert wurde und haben so bestätigt, dass das Polypeptid der gegenwärtigen Erfindung eine Aggrecanase ist, die Gelenkerkrankungen auslösen kann und als Screeningmittel für ein Mittel zur Behandlung von Gelenkerkrankungen nützlich ist. Weiterhin haben die Erfinder ein Verfahren zum Nachweis etabliert, ob eine zu testende Verbindung eine Aggrecanase-Aktivität inhibiert, die für Gelenkerkrankungen auslösend ist, wobei dieses Protein verwendet wird oder nicht und ein Verfahren, um ein Mittel zur Behandlung von Gelenkerkrankungen unter Verwendung des Nachweisverfahrens einem Screening zu unterwerfen.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung:

[1] Ein Polypeptid, das eine Aggrecanase-Aktivität aufweist und (1) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder (2) eine Aminosäuresequenz, in der 1 bis 10 Aminosäuren deletiert, substituiert und/oder in der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 inseriert sind, umfaßt.
[2] Polypeptid gemäß Punkt (1), umfassend die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 und Aggrecanase-Aktivität aufweisend.
[3] Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit einer 90%igen oder höheren Homologie mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2, das Aggrecanase-Aktivität aufweist.
[4] Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2.
[5] Polynukleotid, codierend als Polypeptid gemäß irgendeinem der Punkte [1] bis [4].
[6] Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Punkt [5].
[7] Zelle, transfiziert mit dem Expressionsvektor gemäß Punkt [6].
[8] Verfahren zum Nachweisen, ob eine Verbindung, die getestet werden soll, die Aggrecanase-Aktivität eines Polypeptid gemäß irgendeinem der Punkte [1] bis [4] inhibiert, umfassend die Schritte: Inkontaktbringen des Polypeptids(1), eines Substratpolypeptids(2), das in der Lage ist, durch Aggrecanase verdaut zu werden, und (3) der zu testenden Verbindung und Analysieren des Verdaus des Substratpolypeptids.
[9] Verfahren zum Durchmustern nach einer Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Punkte [1] bis [4] inhibiert, umfassend die Schritte: Nachweisen durch das Verfahren gemäß Punkt [8] und Auswählen einer Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität inhibiert.
[10] Verfahren zum Durchmustern nach einer Substanz, wobei die Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen dient, durch das Verfahren gemäß Punkt [9].
[11] Antikörper oder Fragment davon, der an das Polypeptid gemäß irgendeinem der Punkte [1] bis [4] bindet.

Die Bezeichnung "Aggrecan", wie hier verwendet, bedeutet ein Proteoglycan, das in einer extrazellulären Matrix eines artikulären Knorpels lokalisiert ist und besteht aus einem Kernprotein, umfassend zwei sphärische Domänen (G1 und G2) am N-Terminus, einer Glycosaminoglycan-Bindungsregion und einer sphärischen Domäne (G3) am C-Terminus und Chondroitinsulfat und Glycosaminoglycankeratansulfat, die das Kernprotein modifizieren.
Die Bezeichnung "Aggrecanase-Aktivität", wie hier verwendet, bedeutet eine Aktivität zum selektiven Verdau von menschlichem Aggrecan, das in artikulärem Knorpel zwischen dem 373ten Glutaminsäurerest und dem 374ten Alaninrest (hiernach bezeichnet als "zwischen G1u³⁷³-Ala³⁷⁴") vorliegt.
Die Bezeichnung "Aggrecanase", wie hier verwendet, bedeutet eine Metalloprotease, die die Aggrecanase-Aktivität ausübt. Die Aggrecanase hat allgemein eine Zinkbindungs-Konsensussequenz [d.h. His-Glu-Xaa-Xaa-His (Xaa bedeutet eine willkürliche Aminosäure); die Sequenz von SEQ ID NO: 24].
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Detail hiernach erklärt.
[1] Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet

(1) ein Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
(2) ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, das außerdem die Aggrecanase-Aktivität ausübt;
(3) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin 1 bis 10 Aminosäuren deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, an ein oder mehr Positionen in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und das die Aggrecanase-Aktivität ausübt (hiernach bezeichnet als ein variationsfunktionales Äquivalent); und
(4) ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 90% oder mehr Homologie mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und das die Aggrecanase-Aktivität ausübt (hiernach bezeichnet als homologes Polypeptid).

Unter den Polypeptiden (1) bis (4) als Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid bevorzugt, umfassend eine Aminosäuresequenz, deren Expression durch Differenzierung zu Knorpelzellen induziert wird.
(1) Das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2
Als Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 besonders bevorzugt. Das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 übt die Aggrecanase-Aktivität aus und ist eine neue menschliche Aggrecanase, bestehend aus 1221 Aminosäureresten. Wie in Beispiel 5 dargestellt, wird die Expression des Polypeptids durch Differenzierung in Knorpelzellen induziert. Wie weiter in Beispiel 6 dargestellt, ist das Gen davon auf einem Chromosom lokalisiert, das zu Osteoarthritis (OA) in Beziehung steht und es wird so betrachtet, dass das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 eine Aggrecanase ist, die für Gelenkerkrankungen auslösend wirkt.
(2) Das Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, das außerdem die Aggrecanase-Aktivität ausübt
Das "Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, das außerdem die Aggrecanase-Aktivität ausübt" als Polypeptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet beispielsweise das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und ein Polypeptid, worin eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zugefügt wurde (d.h. ein Fusionspolypeptid mit einer Aminosäuresequenz, worin eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zugefügt wurde).
Als Markersequenz kann eine Sequenz zur einfachen Durchführung der Bestätigung der Polypeptidexpression, Bestätigung der intrazellulären Lokalisierung davon, Reinigung davon oder ähnliches verwendet werden. Als Sequenz können beispielsweise ein FLAG-tag, ein Hexahistidin-tag (d.h. ein His-tag), ein Hämagglutinin-tag oder ein myc-Epitop erwähnt werden.
Das Verfahren zur Bestätigung, ob oder nicht ein Polypeptid, das getestet werden soll, die "Aggrecanase-Aktivität", wie hier verwendet, ausübt (hiernach manchmal bezeichnet als "Verfahren zur Bestätigung der Aggrecanase-Aktivität") ist nicht besonders begrenzt. Es kann z.B. dadurch bestätigt werden, dass das zu testende Polypeptid (wie beispielsweise Zellen, ein Gewebekulturüberstand oder ein Gewebeextrakt, enthaltend das Test-Polypeptid oder eine gereinigte oder teilweise gereinigte Präparation des Test-Polypeptids) mit einem Substrat von Aggrecanase (wie beispielsweise menschlichem Aggrecan) in einem geeigneten Puffer [wie beispielsweise 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7,4)] kontaktiert wird und dann analysiert wird, ob das Substrat an der Spaltungsstelle (beispielsweise zwischen G1u³⁷³-Ala³⁷⁴ in menschlichem Aggrecan) verdaut wird oder nicht, vorzugsweise durch ein Verfahren, wie im Beispiel 4 beschrieben.
Das Substrat der Aggrecanase ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um ein Polypeptid handelt, das mit Aggrecanase verdaut werden kann (hiernach bezeichnet als Substratpolypeptid), aber es kann beispielsweise Aggrecan erwähnt werden, das vom Menschen oder anderen Tieren abstammt, ein Fragment von Aggrecan (ein Fragment, das durch Aggrecanase verdaut werden kann) oder ein Fusionspolypeptid von Aggrecan oder dem Fragment davon mit einer geeigneten Markersequenz (wie beispielsweise einem FLAG-tag, einem His-tag, eine Hämagglutinin-tag oder einem myc-Epitop, vorzugsweise einem FLAG-tag oder einem His-tag) (ein Fusionspolypeptid, das mit Aggrecanase verdaut werden kann). Genauer gesagt können beispielsweise gereinigte Aggrecane von menschlichen oder anderen tierischen Knorpelgeweben, rekombinante Aggrecane (wie beispielsweise ein rekombinantes Aggrecan, das durch Zugabe eines FLAG-tags zum N-Terminus und eines His-tags zum C-Terminus von Aggrecan bzw. einem Fragment davon erhalten wird), kommerziell erhältliche Aggrecane (SEIKAGAKU CORPORATION) oder Teil-Polypeptide dieser Aggrecane verwendet werden.
Als Analyseverfahren, ob oder nicht das Substratpolypeptid durch die Aggrecanase-Aktivität verdaut wird, können beispielsweise ein Verfahren erwähnt werden, wobei ein Polypeptidfragment analysiert wird, das durch Verdau des Substratpolypeptids mit dem Test-Polypeptid erzeugt wurde (wie z.B. ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart des Polypeptidfragments oder ein Verfahren zur Messung einer Menge des erzeugten Polypeptidfragments) oder ein Verfahren zur Analyse des Substratpolypeptids, vermindert durch den Verdau (beispielsweise ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart des Substratpolypeptids oder ein Verfahren zur Messung einer Menge des verminderten Substratpolypeptids).
Beispielsweise ist im Fall der Verwendung von menschlichem Aggrecan als Substratpolypeptid ein Verfahren zur Analyse eines Polypeptidfragments, erzeugt durch Verdau von Aggrecan zwischen Glu³⁷³-Ala³⁷⁴ nicht besonders begrenzt, jedoch kann beispielsweise ein Verfahren zur Bestimmung einer N-Terminussequenz oder einer C-Terminussequenz des verdauten Fragments durch ein konventionelles Verfahren oder in noch besserer Weise immunologische Verfahren, wie beispielsweise ELISA (enzymgebundener Immuno-Solvent-Assay) oder ein Western-Blot-Verfahren unter Verwendung eines Anti-neo-Epitop-Antikörpers (Hughes C. E. et al., Biochem. J., 305, 799-804, 1995), der spezifisch eine Asn³⁶⁹-Ile^370_Thr³⁷¹-Gly³⁷²-Glu³⁷³-Sequenz (die Sequenz von SEQ ID NO: 25) am C-Terminus oder eine Ala³⁷⁴-Arg³⁷⁵-Gly³⁷⁶-Ser³⁷⁷-Val³⁷⁸-Sequenz (die Sequenz von SEQ ID NO: 26) am N-Terminus, erzeugt durch Verdau von Aggrecan zwischen Glu³⁷³-Ala³⁷⁴ erkennt, verwendet werden. Die immunologischen Verfahren wie ELISA oder Western-Blot können gemäß beispielsweise Migita, S., Konda, S., Honjo, T, Hamaoka, T., "Men-eki Jikken Sousa Hou (Methods in Immulogical Experiments) I,II'', Nanko-do, 1995 durchgeführt werden.
Im Fall einer Verwendung von menschlichem Aggrecan als Substratpolypeptid ist weiterhin das Verfahren zur Analyse von menschlichem Aggrecan, vermindert durch Verdau von Aggrecan zwischen Glu³⁷³-Ala³⁷⁴, nicht besonders begrenzt, jedoch kann beispielsweise ein Western-Blot unter Verwendung eines anti-menschlichen Aggrecan-Antikörpers verwendet werden.
Weiterhin kann im Fall der Verwendung des rekombinanten Aggrecans, erhalten durch Zugabe eines FLAG-tags zum N-Terminus und eines His-tags zum C-Terminus von Aggrecan bzw. einem Fragment davon, ein ELISA oder ein Western-Blot unter Verwendung eines anti-FLAG-tag-Antikörpers und/oder eines anti-His-tag-Antikörpers als Verfahren zur Analyse der Verminderung von rekombinantem Aggrecan durch Verdau von Aggrecan zwischen Glu³⁷³-Ala³⁷⁴ verwendet werden.
(3) Das variationsfunktionelle Äquivalent
Das variationsfunktionelle Äquivalent der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solang es sich um ein Polypeptid handelt, umfassend eine Aminosäuresequenz, worin vorzugsweise 1 bis 10, noch bevorzugter 1 bis 7, besonders bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren deletiert, substituiert und/oder inseriert sind, an ein oder mehr Positionen in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und das die Aggrecanase-Aktivität ausübt (bevorzugt weiterhin umfassend eine Aminosäuresequenz, deren Expression durch Differenzierung in Knorpelzellen induziert wird). Weiterhin ist der Ursprung des variationsfunktionellen Äquivalents nicht auf einen Menschen begrenzt.
Das variationsfunktionelle Äquivalent der vorliegenden Erfindung beinhaltet beispielsweise menschliche Variationen des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und variationsfunktionelle Äquivalente, abstammend von anderen Organismen als einem Menschen (wie beispielsweise Maus, Ratte, Hamster oder Hund) und weiter Polypeptide, erhalten durch künstliche Modifikation dieser nativen Polypeptide (d.h. menschliche Variationen oder variationsfunktionelle Äquivalente, die von anderen Organismen als einem Menschen abstammen) oder des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, durch genetische Manipulationsverfahren. Die Bezeichnung "Variation", wie hier verwendet, bedeutet einen individuellen Unterschied zwischen denselben Polypeptiden in derselben Art oder einen Unterschied zwischen homologen Polypeptiden etlicher Arten.
Menschliche Variationen des Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder variationsfunktionelle Äquivalente, abstammend von anderen Organismen als einem Menschen, können von dem Fachmann auf dem Gebiet gemäß den Informationen einer Rasensequenz (beispielsweise der Rasensequenz von SEQ ID NO: 1) eines Polynukleotids, codierend das Polypeptid, besteht aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, erhalten werden. In diesem Zusammenhang können die genetischen Manipulationsverfahren allgemein gemäß den bekannten Verfahren durchgeführt werden (beispielsweise, Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989).
Beispielsweise werden eine geeignete Sonde oder geeignete Primer gemäß den Informationen einer Rasensequenz eines Polynukleotids, codierend das Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, ent worfen. Ein Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahren (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) oder ein Hybridisierungsverfahren wird unter Verwendung einer Probe (beispielsweise Gesamt-RNA oder einer mRNA-Fraktion, einer cDNA-Bibliothek oder einer Phagen-Bibliothek) durchgeführt, hergestellt aus einem Organismus (beispielsweise einem Säuger, wie einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Hamster oder einem Hund) von Interesse und der Primer oder der Sonde zum Erhalt eines Polynukleotids, codierend das Polypeptid. Ein gewünschtes Polypeptid kann durch Expression des resultierenden Polynukleotids in einem geeigneten Expressionssystem und Bestätigung, dass das exprimierte Polypeptid die Aggrecanase-Aktivität ausübt, beispielsweise durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren, erhalten werden.
Weiterhin kann das Polypeptid, das künstlich durch genetische Manipulationsverfahren modifiziert wurde, beispielsweise durch das folgende Verfahren erhalten werden. Ein Gen, das das Polypeptid codiert, wird durch ein konventionelles Verfahren, wie beispielsweise eine ortsgerichtete Mutagenese (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984) erhalten. Ein gewünschtes Polypeptid kann erhalten werden, indem das resultierende Polynukleotid in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird und bestätigt wird, dass das exprimierte Polypeptid die Aggrecanase-Aktivität ausübt, beispielsweise durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren.
Das variationsfunktionelle Äquivalent der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Fusionspolypeptid, das die Aggrecanase-Aktivität ausübt und eine Aminosäuresequenz aufweist, worin ein oder eine Vielzahl von Aminosäuren an ein oder mehr Stellungen in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind und eine geeignete Markersequenz oder ähnliches dem N-Terminus und/oder dem C-Terminus davon zugefügt ist.
Weiterhin wird als variationsfunktionelles Äquivalent der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid bevorzugt, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, worin vorzugsweise 1 bis 10, noch bevorzugter 1 bis 7, besonders bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren an einer oder mehreren Positionen in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert, substituiert und/oder inseriert sind und das die Aggrecanase-Aktivität ausübt und ein Polypeptid, das weiterhin eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Expression durch Differenzierung in Knorpelzellen induziert wird, wird besonders bevorzugt.
(4) Das homologe Polypeptid
Das homologe Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von 90% oder mehr Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 handelt, das die Aggrecanase-Aktivität ausübt. Das homologe Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann eine Aminosäuresequenz mit vorzugsweise einer 95%igen oder höheren Homologie, noch bevorzugter einer 98%igen oder höheren Homologie, besonders bevorzugt einer 99%igen oder höheren Homologie in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweisen. Als homologes Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz mit einer 90%igen oder höheren Homologie (vorzugsweise einer 95%igen oder höheren Homologie, noch bevorzugter einer 98%igen oder höheren Homologie, besonders bevorzugt einer 99%igen oder höheren Homologie), das die Aggrecanase-Aktivität ausübt, bevorzugt.
Weiterhin wird als homologes Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid besonders bevorzugt, das die Aggrecanase-Aktivität ausübt und eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Expression durch Differenzierung in Knorpelzellen induziert wird.
Die Bezeichnung "Homologie", wie hier verwendet, bedeutet einen Wert, der durch eine BLAST [Basic local alignment search tool; Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)]-Suche erhalten wird. Die Homologie in der Aminosäuresequenz kann durch einen BLAST-Suchalgorithmus berechnet werden. Genauer gesagt kann sie unter Verwendung eines b12seq-Programms (Tatiana A. Tatusova und Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) in einem BLAST-Package (sgi32bit Edition, Version 2.0.12; erhalten von NCBI) gemäß einem Defaultparameter berechnet werden. Als paarweise Ausrichtungsparameter wird ein Programm "blastp" verwendet. Weiterhin werden "0" als Gap Insertions-Kostenwert, "0" als A Gap-Elongations-Kostenwert, "SEG" als Filter für eine Such-Sequenz und "BLOSUM62" als Matrix verwendet.
[2] Das Polynukleotid der gegenwärtigen Erfindung
Das Polynukleotid der gegenwärtigen Erfindung ist nicht besonders begrenzt, solange es das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Als Polynukleotid der gegenwärtigen Erfindung können beispielsweise ein Polynukleotid erwähnt werden, umfassend die Basensequenz von SEQ ID NO: 1. Ein solches Polynukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 wird besonders bevorzugt. In diesem Zusammenhang beinhaltet die Bezeichnung "Polynukleotid" sowohl DNA als auch RNA.
Ein Verfahren zur Erzeugung des Polynukleotids der gegenwärtigen Erfindung ist nicht besonders begrenzt, aber es können beispielsweise (1) ein Verfahren unter Verwendung von PCR, (2) ein Verfahren unter Verwendung konventioneller genetischer Manipulationstechniken (d.h. ein Verfahren zur Selektion einer Transformante, umfassend eine gewünschte cDNA von Stämmen, transformiert mit einer cDNA-Bibliothek) oder (3) ein chemisches Syntheseverfahren erwähnt werden. Diese Verfahren werden in dieser Reihenfolge hiernach erklärt.
Bei dem Verfahren unter Verwendung von PCR gemäß Punkt (1) kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch das folgende Verfahren erzeugt werden.
mRNA wird aus menschlichen Zellen oder Gewebe extrahiert, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können. Ein Primerpaar, zwischen dem die Gesamtlängen-mRNA, korrespondierend zu dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder eine Teilregion der mRNA lokalisiert ist, wird auf der Basis der Rasensequenz eines Polynukleotids, codierend das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, synthetisiert. Gesamtlängen-cDNA, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Teil der cDNA kann durch Durchführung einer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung von extrahierter mRNA als Matrize erhalten werden.
Genauer gesagt wird Gesamt-RNA, enthaltend mRNA, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, durch ein bekanntes Verfahren aus Zellen oder Geweben extrahiert, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können. Als Extraktionsverfahren können beispielsweise ein Guanidinthiocyanat-Heißphenolverfahren, ein Guanidin-Thiocyanat-Guanidin-Hydrochlorid-Verfahren oder ein Guanidin-Thiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahren erwähnt werden. Das Guanidin-Thiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahren wird vorzugsweise verwendet. Die Zellen oder das Gewebe, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können, können beispielsweise durch ein Northern-Blot-Verfahren unter Verwendung eines Polynukleotids oder eines Teils davon, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder durch ein Western-Blot-Verfahren unter Verwendung eines Antikörpers, der für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch ist, identifiziert werden.
Als nächstes wird die extrahierte mRNA gereinigt. Die Reinigung der mRNA kann gemäß konventionellen Verfahren geschehen. Beispielsweise kann die mRNA durch Adsorption und Flution unter Verwendung einer Oligo(dT)-Cellulosesäule gereinigt werden. Die mRNA kann weiterhin durch beispiels weise eine Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, falls nötig, fraktioniert werden. Alternativ kann kommerziell erhältliche extrahierte und gereinigte mRNA ohne Durchführung der Extraktion der mRNA verwendet werden.
Als Nächstes wird eine Erststrang-cDNA durch Durchführung einer Reversen Transkriptasereaktion der gereinigten mRNA in Gegenwart eines Zufallsprimers, eines Oligo-dT-Primers und/oder eines üblichen Primers synthetisiert. Diese Synthese kann gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden. Die resultierende Erststrang-cDNA wird einer POP unter Verwendung von zwei Primern unterworfen, zwischen denen ein Gesamtlänge oder eine Teilregion des Polynukleotids von Interesse lokalisiert ist, wodurch die cDNA von Interesse amplifiziert wird. Die resultierende DNA wird beispielsweise durch eine Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Das DNA-Fragment von Interesse kann erhalten werden, indem ein Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen und eine darauffolgende Ligation, falls nötig, durchgeführt wird.
Bei dem Verfahren unter Verwendung konventioneller genetischer Manipulationstechniken gemäß Punkt (2) kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch das folgende Verfahren erzeugt werden.
Zunächst wird eine einzelsträngige cDNA durch Verwendung der Reversen Transkriptase von mRNA, hergestellt durch das oben erwähnte PCR-Verfahren als Matrize, synthetisiert und dann wird eine doppelsträngige cDNA aus der einzelsträngigen cDNA synthetisiert. Als ein solches Verfahren können beispielsweise ein S1-Nukleaseverfahren (Efstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), ein Land-Verfahren (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981), ein O. Joon Yoo-Verfahren (Yoo, O. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983) und ein Okayama-Berg-Verfahren (Okayama, H. und Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982) erwähnt werden.
Als nächstes wird ein rekombinantes Plasmid, umfassend die doppelsträngige cDNA, hergestellt und in einen Escherichia coli-Stamm, wie beispielsweise DH 5α, HB101 oder JM109 eingeführt, wodurch der Stamm transformiert wird. Eine Transformante wird unter Verwendung einer Arzneimittelresistenz gegen beispielsweise Tetracyclin, Ampicillin oder Kanamycin als Marker selektiert. Wenn die Wirtszelle E. coli ist, kann die Transformation der Wirtszelle beispielsweise durch das Verfahren von Hanahan (Hanahan, D. J., Mol. Biol., 166, 557-580, 1983) durchgeführt werden; nämlich ein Verfahren, worin rekombinante DNA zu kompetenten Zellen zugefügt wird, hergestellt in Gegenwart von CaCl₂, MgCl₂ oder RbCl. Weiterhin kann als Vektor, bei dem es sich nicht um ein Plasmid handelt, ein Phagenvektor, wie beispielsweise ein lambda-System, verwendet werden.
Als Verfahren zur Selektion einer Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse aus den resultierenden Transformanten, können verschiedene Verfahren, wie beispielsweise (i) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde, (ii) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer Sonde, hergestellt durch PCR, (iii) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder (iv) ein Verfahren zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines selektiven Hybridisierungs-Translationssystems verwendet werden.
Beim Verfahren gemäß Punkt (i) zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Ein Oligonukleotid, das zu der Gesamtheit oder einem Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung korrespondiert, wird synthetisiert (in diesem Fall kann es sich um entweder eine Nukleotidsequenz handeln, die die Kodonverwendung mit in die Betrachtung einbezieht oder um eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen als Kombination möglicher Nukleotidsequenzen und im letzteren Fall kann ihre Zahl durch den Einschluss von Inosin reduziert werden) und dieses Oligonukleotid wird als Sonde verwendet (markiert mit ³²P oder ³³P) und es wird mit einem Nitrocellulosefilter oder einem Polyamidfilter, worauf DNAs der Transformanten denaturiert und fixiert sind hybridisiert, um die resultierenden positiven Stämme einem Screening zu unterwerfen und sie zu selektieren.
Bei dem Verfahren gemäß Punkt (ii) zum Screening einer Transformante unter Verwendung einer Sonde, die durch PCR erzeugt wurde, können die Transformanten, die die cDNA von Interesse enthalten, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Oligonukleotide eines Sinn-Primers und eines Antisinn-Primers, korrespondierend zum einem Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, werden synthetisiert und ein DNA-Fragment, codierend die Gesamtheit oder einen Teil des Polypeptids von Interesse, wird durch Durchführen einer PCR unter Verwendung von diesen Primern in Kombination amplifiziert. Als bei diesem Verfahren verwendete Matrizen-DNA kann eine cDNA, die durch eine reverse Transkriptionsreaktion aus mRNA von Zellen, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können, synthetisiert wird oder genomische DNA verwendet werden. Das resultierende DNA-Fragment wird mit ³²P oder ³³P markiert und eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird selektiert, indem eine Koloniehybridisierung oder eine Plaquehybridisierung unter Verwendung von diesem Fragment als Sonde durchgeführt wird.
Beim Verfahren gemäß Punkt (iii) zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines Antikörpers kann die Transformante, enthaltend die cDNA von Interesse, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Zunächst wird eine cDNA in einen Expressionsvektor integriert und Polypeptide werden in einem Kulturüberstand, in die Zellen oder auf die Zelloberfläche der Transformanten erzeugt. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird durch Nachweis eines Stamms selektiert, der das gewünschte Polypeptid erzeugt, wobei ein Antikörper gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird sowie ein zweiter Antikörper gegen den ersten Antikörper.
Bei dem Verfahren gemäß Punkt (iv) zum Screening einer Transformante unter Verwendung eines selektiven Hybridisierungs-Translationssystems kann die Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, beispielsweise durch das folgende Verfahren selektiert werden.
Zunächst wird eine cDNA, die von jeder Transformante erhalten wird, auf beispielsweise ein Nitrocellulosefilter geblottet und mit mRNA hybridisiert, die aus Zellen hergestellt wurde, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen können und dann wird die an die cDNA gebundene mRNA dissoziiert und gewonnen. Die gewonnene mRNA wird in ein Polypeptid in einem geeigneten Polypeptidtranslationssystem translatiert, beispielsweise durch Injektion in Xenopus-Oozyten oder ein zellfreies System, wie beispielsweise ein Kaninchen-Retikulozytenlysat oder Weizenkeimlinge. Eine Transformante, die die cDNA von Interesse enthält, wird selektiert, indem sie durch die Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird.
Ein Verfahren zum Sammeln des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung aus der resultierenden Transformante von Interesse kann gemäß bekannten Verfahren durchgeführt werden (beispielsweise, Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). Beispielsweise kann es durchgeführt werden, indem eine Fraktion, die zu der Plasmid-DNA korrespondiert, aus den Zellen abgetrennt wird und Ausschneiden der cDNA-Region aus der Plasmid-DNA.
Bei dem chemischen Syntheseverfahren gemäß Punkt (3) kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beispielsweise erzeugt werden, indem DNA-Fragmente, die durch ein chemisches Syntheseverfahren erzeugt wurden, gebunden werden. Jede DNA kann unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers [beispielsweise, Oligo 1000M DNA-Synthetisierer (Beckman) oder eines 394-DNA/RNA-Synthetisierers (Applied Biosystems)] synthetisiert werden.
Weiterhin kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung durch eine Nukleinsäure-chemische Synthese gemäß einem konventionellen Verfahren, wie beispielsweise einem Phosphittriesterverfahren (Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 1984), basierend auf den Informationen hinsichtlich des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. In diesem Zusammenhang sind Kodons für jede Aminosäure bekannt und können optional durch konventionelle Verfahren gewählt und bestimmt werden, beispielsweise indem man die Kodonverwendung von jedem zu verwendenden Wirt mit in die Betrachtung einbezieht (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Weiterhin kann eine Teilmodifikation von Kodons dieser Rasensequenzen gemäß einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise einer ortsgerichteten Mutagenese, die einen Primer verwendet, umfassend ein synthetisches Oligonukleotid, das eine gewünschte Modifikation codiert (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).
Die Bestimmung der DNA-Sequenzen, die durch die oben erwähnten Verfahren erhalten wurden, kann beispielsweise durch das chemisches Modifikationsverfahren von Maxam-Gilbert durchgeführt werden (Maxam, A. M. und Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) oder durch ein Dideoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren (Messing, J. und Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).
[3] Der Expressionsvektor und die Zelle der vorliegenden Erfindung
Ein isoliertes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung wird in eine geeignete Vektor-DNA reintegriert und eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle kann durch den resultierenden Expressionsvektor transfiziert werden. Weiterhin ist es möglich, das Polynukleotid in einer gewünschten Wirtszelle zu exprimieren, indem ein geeigneter Promotor und eine Sequenz, die zu der Genexpression in dem Vektor in Beziehung steht, eingeführt wird.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor ist nicht besonders begrenzt, solange er das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Abs Expressionsvektor kann beispielsweise ein Vektor erwähnt werden, erhalten durch Einführung des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung in einen bekannten Expressionsvektor, der in geeigneter Weise gemäß der zu verwendenden Wirtszelle gewählt wurde.
Die erfindungsgemäße Zelle ist nicht besonders begrenzt, solange sie mit dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transfiziert ist und das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Zelle der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine Zelle sein, worin das Polynukleotid in ein Chromosom einer Wirtszelle integriert ist oder eine Zelle, die das Polynukleotid als Expressionsvektor enthält, umfassend das Polynukleotid. Weiterhin kann die Zelle der vorliegenden Erfindung eine Zelle sein, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert oder eine Zelle, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht exprimiert. Die Zelle der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Transfektion einer gewünschten Wirtszelle mit dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
In den eukaryontischen Wirtszellen sind beispielsweise Zellen von Wirbeltieren, Insekten und Hefe beinhaltet. Als Wirbeltierzellen können beispielsweise Simian-COS-Zellen (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), ein Dihydrofolat-Reduktase-defekter Stamm einer chinesischen Hamster-Ovarzelle (CHO) (Urlaub, G. und Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), eine von menschlichen embryonalen Nieren abstammende HEK293-Zelle oder eine 293-EBNA-Zelle (Invitrogen), erhalten durch Einführung eines EBNA-1-Gens des Epstein-Barr-Virus in eine HEK293-Zelle, erwähnt werden.
Als Expressionsvektor für eine Wirbeltierzelle kann ein Vektor, der einen Promotor enthält, der stromaufwärts vom zu exprimierenden Gen positioniert ist, außerdem eine RNA-Spleißstelle, eine Polyadenylierungsstelle, eine Transkriptions-Terminationssequenz und ähnliches allgemein verwendet werden. Der Vektor kann weiterhin einen Replikationsursprung, falls nötig, enthalten. Als Expressionsvektor können beispielsweise pSV2dhfr, enthaltend einen SV40 frühen Promotor (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS, enthaltend einen menschlichen Elongationsfaktorpromotor (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18,5322, 1990) oder pCEP4, enthaltend einen Zytomegalievirus-Promotor (Invitrogen) erwähnt werden.
Wenn die 293-EBNA-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann beispielsweise pCEP4 (Invitrogen), enthaltend einen Replikationsursprung von Epstein-Barr-Virus, das dazu in der Lage ist, eine autonome Replikation in der 293-EBNA-Zelle durchzuführen, als Expressionsvektor verwendet werden.
Wenn eine COS-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann ein Vektor, der einen SV40-Replikationsursprung aufweist, eine autonome Replikation in der COS-Zelle durchführen kann und einen Transkriptionspromotor, ein Transkriptions-Terminationssignal und eine RNA-Spleiß-Stelle aufweist, als Expressionsvektor verwendet werden. Als Vektor können beispielsweise pME18S (Maruyama, K. und Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. und Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), oder pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987) erwähnt werden.
Der Expressionsvektor kann in COS-Zellen beispielsweise durch ein DEAE-Dextranverfahren (Luthman, H. und Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), ein Calciumphosphat-DNA-Co-Präzipitationsverfahren (Graham, F. L. und van der Ed, A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), ein Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzes (beispielsweise, FuGENE^TM6 Transfection Reagent; Boehringer Mannheim) oder ein Elektroporationsverfahren (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982) eingebaut werden.
Wenn die CHO-Zelle als Wirtszelle verwendet wird, kann eine transfizierte Zelle, die dazu in der Lage ist, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung stabil zu erzeugen, erhalten werden, indem eine Co-Transfektion eines Expressionsvektors, umfassend das Polynukleotid, das das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, zusammen mit einem Vektor, der ein neogen exprimieren kann, das als G418-Resistenzmarker dient, wie beispielsweise pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) oder pSV2-neo (Southern, P. J. und Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341,1982) durchgeführt wird und Selektion einer G418 resistenten Kolonie.
Die erfindungsgemäße Zelle kann gemäß einem konventionellen Verfahren kultiviert werden [beispielsweise "Shin Seikagaku Jikken Koza 18, Saibou Baiyou Gijyutsu (Japanese Biochemical Society)", Tokyo Kagaku Dojin, 1990] und das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird außerhalb der Zellen erzeugt. Als bei der Kultivierung zu verwendendes Medium kann ein Medium, das üblicherweise für eine gewünschte Wirtszelle verwendet wird, in geeigneter Weise selektiert werden. Im Fall der COS-Zelle kann beispielsweise ein Medium, wie beispielsweise ein RPMI-1640-Medium oder ein Dulbecco's modifiziertes Eagle's-Minimal-Essential-Medium (DMEM) verwendet werden, indem es mit einer Serumkomponente wie fötalem Rinderserum (FBS), falls nötig, supplementiert wird. Im Fall der 293-EBNA-Zelle kann ein Medium wie Dulbecco's modifiziertes Eagle's-Minimal-Essential-Medium (DMEM) mit einer Serumkomponente wie fötalem Rinderserum (FBS) und G418 verwendet werden.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das außerhalb der Zelle der vorliegenden Erfindung durch Kultivierung der Zellen erzeugt wird, kann daraus durch verschiedene bekannte Abtrenntechniken abgetrennt und gereinigt werden [Okada, M. und Miyazaki K., "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Jyo.Ge (Revision, Notebook for Protein Experiments)", Yodo-sha 1999], wobei man sich der physikalischen, chemischen und ähnlicher Eigenschaften des Polypeptids bedient. Genauer gesagt kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch Behandlung einer Kulturflüssigkeit, enthaltend das erfindungsgemäße Polypeptid mit einer üblicherweise verwendeten Behandlung gereinigt werden, beispielsweise einer Behandlung mit einem Proteinpräzipitanz, Ultrafiltration, verschiedenen Flüssigchromatographietechniken wie einer Molekularsiebchromatographie (Gelfiltration), Absorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Dialyse oder einer Kombination daraus.
Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid als Fusionsprotein mit einer Markersequenz in Frame exprimiert wird, kann eine Identifizierung der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, seine Reinigung oder ähnliches einfach durchgeführt werden. Als Markersequenz können beispielsweise ein FLAG tag, ein Hexahistidin-tag, ein Hämagglutinin-tag, oder ein myc-Epitop erwähnt werden. Weiterhin kann durch Insertion einer spezifischen Aminosäuresequenz, erkannt von einer Protease, wie einer Enterokinase, Faktor Xa oder Thrombin zwischen der Markersequenz und dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, die Markersequenz durch die Protease entfernt werden.
[4] Nachweisverfahren und Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung
Es ist möglich, nachzuweisen, ob oder nicht eine zu testende Verbindung die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, wobei das Polypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Weiterhin ist es unter Verwendung dieses Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung möglich, eine Substanz einem Screening zu unterwerfen, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist ein Protein, dessen Expression durch Differenzierung zu Knorpelzellen, wie beschrieben in Beispiel 5, in duziert wird und das Gen davon ist auf einem Chromosom lokalisiert, das zu Osteoarthritis (OA) in Bezug steht, wie beschrieben in Beispiel 6 und so wird es betrachtet, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Aggrecanase ist, die für Gelenkerkrankungen auslösend ist. Daher ist eine Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, als Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen nützlich. Weiterhin kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung per se als Mittel für ein Screening auf eine Substanz verwendet werden, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert oder einer Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen (insbesondere eines Mittels zur Behandlung von Osteoarthritis).
Zu testende Verbindungen, die auf das Nachweisverfahren und das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, sind nicht besonders begrenzt, jedoch können beispielsweise verschiedene bekannte Verbindungen (einschließlich Peptide), die in chemischen Bibliotheken registriert sind, Verbindungen, erhalten durch Kombinationschemieverfahren (Terrett, N. K. et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) oder durch konventionelle Syntheseverfahren oder Zufallspeptide, hergestellt durch Verwendung eines Phagen-Displayverfahrens (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) oder ähnliche, erwähnt werden. Diese bekannten Verbindungen beinhalten Verbindungen (einschließlich Peptide), von denen es bekannt ist, dass sie eine Aktivität zur Inhibition der Metalloprotease ausüben, von denen jedoch nicht bekannt ist, ob sie die Aggrecanase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids inhibieren. Zusätzlich können Kulturüberstände von Mikroorganismen, natürliche von Pflanzen oder marinen Organismen abstammende Komponenten oder Tiergewebsextrakte als Testverbindungen für das Screening verwendet werden. Weiterhin können Verbindungen (einschließlich Peptide), die durch chemische oder biologische Modifikation von Verbindungen (einschließlich Peptiden) erhalten wurden, selektiert durch das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung kann durch ein ähnliches Verfahren wie das oben erwähnte Verfahren zur Bestätigung der Aggrecanase-Aktivität durchgeführt werden, außer dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das Substratpolypeptid und die Testverbindung miteinander kontaktiert werden anstelle eines Kontaktierens des Testpolypeptids mit dem Substratpolypeptid. Bei dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung ist es nämlich möglich nachzuweisen, ob oder nicht die Testverbindung die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, indem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das Substratpolypeptid und das Testpolypeptid miteinander kontaktiert werden und indem analysiert wird, ob oder nicht das Substratpolypeptid durch die Aggrecanase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids in Gegenwart der Testverbindung (oder durch Analyse des Grads des Verdaus) verdaut wird. Wenn das Substratpolypeptid durch die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung nicht verdaut wird oder der Verdaugrad sich vermindert ist es möglich zu bestätigen, dass die Testverbindung die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert.
Als Substratpolypeptid, das bei dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann das Substratpolypeptid, das bereits früher für das Verfahren zur Bestätigung der Aggrecanase-Aktivität beschrieben wurde, verwendet werden.
Bei dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung können als Verfahren zur Analyse, ob oder nicht das Substratpolypeptid durch die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verdaut wird, die vorher beschriebenen Verfahren im Hinblick auf ein Verfahren zur Bestätigung der Aggrecanase-Aktivität verwendet werden. Als solche Verfahren können beispielsweise ein Verfahren zur Analyse eines Polypeptidfragments, erzeugt durch Verdau des Substratpolypeptids durch die Aggrecanase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids (wie ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart des Polypeptidfragments oder ein Verfahren zur Messung einer Menge des erzeugten Polypeptidfragments) oder ein Verfahren zur Analyse des Substratpolypeptids, vermindert durch den Verdau (wie ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart des Substratpolypeptids oder ein Verfahren zur Messung einer Menge des verminderten Substratpolypeptids) erwähnt werden.
Bei den Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Substanz zu selektieren, die die Aggrecanase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids inhibiert oder eine Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen auf der Basis von Ergebnissen, die dadurch erhalten werden, indem nachgewiesen wird, ob oder nicht die Testverbindung die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, wobei das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Genauer gesagt wird beispielsweise, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das Substratpolypeptid und das Testpolypeptid miteinander kontaktiert werden, eine Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert oder eine Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen auf der Basis der Gegenwart oder des Grads des Verdaus des Substrat polypeptids in Gegenwart der Testverbindung selektiert. Wenn das Substratpolypeptid durch die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung nicht verdaut wird oder sich der Grad des Verdaus vermindert, ist es möglich zu bestätigen, dass die Testverbindung eine Substanz ist, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert oder eine Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen.
[5] Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen der vorliegenden Erfindung
Die Beschreibung beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen, umfassend eine Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der gegenwärtigen Erfindung, selektiert durch das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung, inhibiert als Wirkstoff.
Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen, umfassend die Schritte des Nachweises – in einem Qualitätskontrolltest einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen – ob oder nicht die pharmazeutische Zusammensetzung die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung und Herstellung eines Medikaments.
Weiterhin beschreibt die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen, bestehend aus einem Schritt der Herstellung eines Medikaments unter Verwendung einer Substanz, die durch das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, umfassend den Nachweisschritt.
Die Präparation, enthaltend eine Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff enthält, kann unter Verwendung von Trägern, Füllstoffen und/oder anderen Additiven hergestellt werden, die üblicherweise für die Herstellung von Medikamenten verwendet werden, und zwar gemäß dem Wirkstoff.
Beispiele für die Verabreichung beinhalten eine orale Verabreichung durch Tabletten, Pillen, Kapseln, Körner, feine Körner, Pulver, orale Lösungen und ähnliches und eine parenterale Verabreichung durch Injektionen (z.B. intravenös, intramuskulär oder ähnliches), Suppositorien, transdermale Präparationen, transmukosale Absorptionspräparationen und ähnliche. Insbesondere wird im Fall von Peptiden, die im Magen verdaut werden, eine parenterale Verabreichung, wie eine intravenöse Injektion oder ähnliches oder Präparationstechniken, worin das Polypeptid nicht verdaut wird, wie z.B. die in der WO 95/28963 offenbarte Präparationstechnik bevorzugt.
In der festen Zusammensetzung zur Verwendung bei der oralen Verabreichung können die einen oder mehr Wirkstoffe mindestens mit einem inerten Verdünnungsmittel wie Laktose, Mannit, Glucose, mikrokristalliner Cellulose, Hydroxypropylcellulose, Stärke, Polyvinylpyrrolidon oder Aluminium-Magnesium-Silicat vermischt werden. Auf dem üblichen Weg kann die Zusammensetzung andere Additive als das inerte Verdünnungsmittel enthalten, wie beispielsweise ein Gleitmittel, ein Desintegrationsmittel, einen Stabilisator oder ein löslich machendes oder die Lösung unterstützendes Mittel. Falls nötig, können die Tabletten oder Pillen mit einer Zuckerbeschichtung oder einem Film einer gastrischen oder enterischen Substanz beschichtet sein.
Die flüssige Zusammensetzung für die orale Verabreichung kann beispielsweise Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere beinhalten und kann ein allgemein verwendetes inertes Verdünnungsmittel wie gereinigtes Wasser oder Ethylalkohol enthalten. Die Zusammensetzung kann weitere Additive außer dem inerten Verdünnungsmittel wie Benetzungsmittel, Suspendiermittel, Süßmittel, Geschmacksstoffe oder Antiseptika enthalten.
Die Injektionen für die parenterale Verabreichung können aseptische wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen beinhalten. Beispiele für das Verdünnungsmittel zur Verwendung in den wässrigen Lösungen und Suspensionen beinhalten destilliertes Wasser für die Injektionsverwendung und physiologische Salzlösungen. Beispiele für das Verdünnungsmittel zur Verwendung in den nicht-wässrigen Lösungen und Suspensionen beinhalten Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl (z.B. Olivenöl), Alkohole (z.B. Ethanol), Polysorbat 80 und ähnliche. Eine solche Zusammensetzung kann weiterhin ein Benetzungsmittel, einen Emulgator, ein Dispersionsmittel, einen Stabilisator, ein löslich machendes oder die Lösung unterstützendes Mittel, ein Antiseptikum oder ähnliches enthalten. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien rückhaltenden Filter, Vermischen mit einem Germizid oder Bestrahlung sterilisiert werden. Alternativ können sie verwendet werden, indem sie zunächst in sterile feste Zusammensetzungen formuliert werden und sie dann in einem sterilen Wasser oder einem anderen sterilen Lösungsmittel für die Injektionsverwendung vor ihrer Verwendung gelöst werden.
Über die Dosis ist optional entschieden, indem die Stärke von jedem Wirkstoff, gewählt durch das vorher erwähnte Screeningverfahren oder Symp tome, Alter, Geschlecht oder ähnliches von jedem Patienten, an den verabreicht wird, mit in die Betrachtung einbezogen werden.
Beispielsweise beträgt die übliche Dosis für einen Erwachsenen (60 kg Gewicht) im Fall der oralen Verabreichung ungefähr 0,01 bis 1.000 mg, vorzugsweise 0,01 bis 100 mg pro Tag. Im Fall der parenteralen Verabreichung liegt die übliche Dosis bei ungefähr 0,01 bis 1.000 mg, vorzugsweise 0,01 bis 100 mg pro Tag in Form einer Injektion vor.
[6] Der Antikörper und das Fragment davon der vorliegenden Erfindung
Ein Antikörper, wie beispielsweise ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung reagiert, kann durch direkte Verabreichung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines Fragments davon an verschiedene Tiere erhalten werden. Alternativ kann er durch ein DNA-Vakzin-Verfahren (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; oder Donnelly, J. J. et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996) erhalten werden, wobei ein Plasmid verwendet wird, in das ein Polynukleotid, codierend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, inseriert ist.
Der polyklonale Antikörper kann aus einem Serum oder Eiern eines Tiers, wie beispielsweise einem Kaninchen, einer Ratte, einer Ziege oder einem Huhn erzeugt werden, wobei das Tier durch das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon, emulgiert in einem geeigneten Adjuvans (beispielsweise Freund's komplettem Adjuvans) durch intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Verabreichung immunisiert und sensibilisiert ist. Der polyklonale Antikörper kann aus dem resultierenden Serum oder Eiern gemäß konventionellen Verfahren für die Polypeptidisolierung und Reinigung getrennt und gereinigt werden. Beispiele für die Trennungs- und Reinigungsverfahren beinhalten beispielsweise eine Zentrifugaltrennung, Dialyse, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder chromatographische Verfahren unter Verwendung von beispielsweise DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein A-Agarose und ähnliche.
Der monoklonale Antikörper kann einfach durch den Fachmann auf dem Gebiet erzeugt werden, gemäß beispielsweise dem Zellfusionsverfahren von Köhler und Milstein (Köhler, G. und Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975).
Eine Maus wird intraperitoneal, subkutan oder intravenös etliche Male in einem Intervall von einigen Wochen durch wiederholte Inokulation von Emulsionen immunisiert, worin das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon in einem geeigneten Adjuvans wie Freund's komplettem Ad juvans, emulgiert ist. Milzzellen werden nach der endgültigen Immunisierung entfernt und dann mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen.
Als Myelomzelle zum Erhalt eines Hybridoms kann eine Myelomzelle mit einem Marker, wie z.B. einer Defizienz in der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase oder Thymidinkinase (beispielsweise die Maus-Myelom-Zelllinie, P3x63Ag8.U1) verwendet werden. Als Fusionsmittel kann Polyethylenglycol verwendet werden. Als Medium zur Herstellung von Hybridomen kann beispielsweise ein üblicherweise verwendetes Medium wie Eagle's-Minimal-Essenzialmedium, ein Dulbecco-modifiziertes-Minimal-Essenzialmedium oder ein RPMI-1640-Medium verwendet werden, in dem auf geeignete Weise 10 bis 30% eines fötalen Rinderserums zugefügt werden. Die fusionierten Stämme können durch ein HAT-Selektionsverfahren selektiert werden. Ein Kulturüberstand der Hybridome wird durch ein wohl bekanntes Verfahren, wie beispielsweise ein ELISA-Verfahren oder ein immunhistologisches Verfahren einem Screening unterworfen, um Hybridomklone zu selektieren, die den Antikörper von Interesse sezernieren. Die Monoklonalität des gewählten Hybridoms wird durch Wiederholung von Subklonierungen durch ein limitierendes Verdünnungsverfahren garantiert. Antikörper in einer Menge, die gereinigt werden kann, werden durch Kultivierung des resultierenden Hybridoms für 2 bis 4 Tage in einem Medium oder auch in der Peritonealhöhle einer Pristanvorbehandelten Maus vom BALG/c-Stamm für 10 bis 20 Tage erzeugt.
Die resultierenden monoklonalen Antikörper im Kulturüberstand oder Aszites können durch konventionelle Polypeptid-Isolations- und Reinigungsverfahren abgetrennt und gereinigt werden. Beispiele für Abtrennungs- und Reinigungsverfahren beinhalten beispielsweise eine Zentrifugalabtrennung, Dialyse, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder chromatographische Verfahren unter Verwendung von beispielsweise DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein A-Agarose und ähnliche.
Weiterhin können die monoklonalen Antikörper oder die Antikörperfragmente, enthaltend einen Teil davon, durch Insertion der Gesamtheit oder eines Teils eines Gens, codierend den monoklonalen Antikörper in einen Expressionsvektor und Einführung des resultierenden Expressionsvektors in geeignete Wirtszellen (wie beispielsweise E. coli, Hefe oder tierische Zellen) erzeugt werden.
Antikörperfragmente, die einen aktiven Teil des Antikörpers umfassen, wie beispielsweise F(ab')₂, Fab, Fab' oder Fv, können durch ein konventionelles Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Verdau der abgetrennten und gereinigten Antikörper (einschließlich polyklonaler und mo noklonaler Antikörper) mit einer Protease wie Pepsin oder Papain und Abtrennung und Reinigung der resultierenden Fragmente durch Standard-Polypeptidisolierung und Reinigungsverfahren.
Weiterhin kann ein Antikörper, der mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung reagiert, in Form eines einzelkettigen Fv oder Fab gemäß einem Verfahren von Clackson et al. oder einem Verfahren von Zebedee et al. (Clackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; oder Zebedee, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992) erhalten werden. Weiterhin kann ein humanisierter Antikörper erhalten werden, indem eine transgene Maus immunisiert wird, worin Maus-Antikörpergene durch menschliche Antikörpergene substituiert sind (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1994).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele illustriert, jedoch ist sie nicht durch diese begrenzt. Die Verfahren wurden gemäß den bekannten Verfahren durchgeführt (Sambrook, J., et al., "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), wenn dies nicht anders angegeben ist.
Beispiel 1: Herstellung eines Expressionsvektors mit einem zum C-Terminus zugefügt FLAG
Ein Expressionsvektor pCEP4d, worin die Epstein-Barr-Virus EBNA1-Expressionseinheit entfernt war, wird durch Verdau des Plasmids pCEP4 (hergestellt von Invitrogen) mit den Restriktionsenzymen ClaI und NsiI konstruiert, dann mit glatten Enden versehen und selbst ligiert. Der resultierende Expressionsvektor pCEP4d wurde mit den Restriktionsenzymen NheI und BamHI verdaut und das resultierende DNA-Fragment mit ungefähr 7,7 kbp wurde aus Agarosegel extrahiert, wozu doppelsträngiges Oligonukleotid, hergestellt durch Annealing des Oligonukleotids, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 7 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 8 inseriert wurde, um den Expressionsvektor pCEP4d-FLAG zu konstruieren. Die Rasensequenz des resultierenden Expressionsvektors wurde analysiert um zu bestätigen, dass die gewünschte Sequenz beinhaltet war.
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei der Expressionsvektor pCEP4d-FLAG als Matrize und das Oligonukleotid, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 9 und dasjenige, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 10 als Primer und PyroBest DNA-Polymerase (PyroBest^TM; hergestellt von Takarashuzo) verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde eine Zyklusreaktion, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 30 Sekunden, bei 55°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 30 Sekunden 15mal wiederholt. Danach wurde eine Verlängerungsreaktion für 7 Minuten bei 72°C durchgeführt.
Ein resultierendes DNA-Fragment mit ungefähr 0,4 kbp wurde mit einem Restriktionsenzym SpeI verdaut und in den Expressionsvektor pCEP4d-FLAG (etwa 7,7 kbp) inseriert, der mit XbaI verdaut worden war, um einen Expressionsvektor pCEP4dE2-FLAG zu erhalten. In dem resultierenden Expressionsvektor pCEP4dE2-FLAG waren die XbaI-Erkennungssequenz, die NheI-Erkennungssequenz, die NotI-Erkennungssequenz und die BamHI-Erkennungssequenz und das FLAG tag vom Promotor zur stromabwärts gelegenen Seite hin angeordnet.
Beispiel 2: Klonierung des Gesamtlängen-ORF-Gens des neuen Aggrecanasegens MDTS8
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 3 (mit einer XbaI-Erkennungssequenz und einer Kozak-Sequenz, zugefügt zum 5'-Terminus) und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 4 (mit einer NotI-Erkennungssequenz, zugefügt zum 5'-Terminus) als Primer verwendet wurde, eine menschliche Plazenta-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready TM cDNA; hergestellt von Clontech) als Matrize und DNA-Polymerase (TakaRa LA Tag^TM; hergestellt von Takara-shuzo) als DNA-Polymerase. Für die PCR wurde zunächst eine thermische Denaturierungsreaktion für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen bei 98°C für 10 Sekunden und 68°C für 3 Minuten 45mal wiederholt. Danach wurde eine Verlängerungsreaktion für 7 Minuten bei 68°C durchgeführt.
Ein resultierendes PCR-Produkt, ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,3 kbp (mit der XbaI-Erkennungssequenz und der Kozak-Sequenz, zugefügt zum 5'-Terminus und der NotI Erkennungssequenz, zugefügt zum 3'-Terminus) wurde in ein Plasmid PCR2.1 (hergestellt von Invitrogen) zum Erhalt eines Klons pMDTS8Cys subkloniert.
Das resultierende Plasmid pMDTS8Cys wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und NotI verdaut und ein resultierendes DNA-Fragment mit ungefähr 2,3 kbp wurde in die XbaI- und NotI-Stelle des Plasmids pCEP4dE2-FLAG, konstruiert in Beispiel 1 inseriert, um ein Plasmid pCEPdE2-MDTS8Cys-FLAG zu erhalten.
Das resultierende Plasmid pCEPdE2-MDTS8Cys-FLAG wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und NotI verdaut, um ein DNA-Fragment mit ungefähr 8,3 kbp (hiernach bezeichnet als DNA-Fragment A) zu erhalten. Weiterhin wurde das resultierende Plasmid pCEPdE2-MDTS8Cys-FLAG mit den Restriktions enzymen KpnI und SpeI verdaut, um ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,5 kbp zu erhalten (hiernach bezeichnet als DNA-Fragment B).
Die wie oben beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, außer dass eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 5 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 6 (mit einer NotI-Erkennungssequenz, zugefügt zum 5'-Terminus) als Primer verwendet wurden, anstelle der Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 3 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 4. Ein resultierendes PCR-Produkt, ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,5 kbp (mit der NotI-Erkennungssequenz, zugefügt zum 3'-Terminus), wurde in das Plasmid PCR2.1 (hergestellt von Invitrogen) zum Erhalt eines Klons pMDTS8-3H subkloniert. Der resultierende Klon pMDTS8-3H wurde mit den Restriktionsenzymen SpeI und NotI verdaut, um ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,5 kbp zu erhalten (hiernach bezeichnet als DNA-Fragment C).
Das obige DNA-Fragment A, das obige DNA-Fragment B und das obige DNA-Fragment C wurden ligiert, um ein Plasmid pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG herzustellen. Das resultierende Plasmid pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG enthält ein Gen, bestehend aus der 1ten bis 3663ten Base der Basensequenz von SEQ ID NO: 1, d.h. der Basensequenz des neuen Aggrecanasegens MDTS8. Ein Polypeptid mit der 1ten bis 1221ten Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23, zugefügt zum C-Terminus kann aus einer tierischen Zelle als Wirt exprimiert werden.
Beispiel 3: Expression von MDTS8 Gesamtlängenprotein (MDTSBFull)
Ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz (FuGENE^TM6-Transfektionsreagenz, hergestellt von Boehringer Mannheim) wurde gemäß dem beigefügten Protokoll verwendet, um das Plasmid pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG, hergestellt in Beispiel 2 oder das Plasmid pCEP4dE2-FLAG als Kontrolle in eine HEK293-EBNA-Zelle, hergestellt von Invitrogen, einzuführen.
Die Existenz des gewünschten Proteins in einem Überstand einer Kultur, die 1 bis 2 Tage nach Einführung des Plasmids erhalten wurde, wurde durch einen Western-Blot unter Verwendung eines Antikörpers (Maus-anti-FLAG-monoklonaler Antikörper M2; hergestellt von Sigma) gegen das FLAG tag, zugefügt zum C-Terminus, bestätigt. Genauer gesagt wurde der Kulturüberstand auf einem SDS/10% bis 20% Acrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt; dieses war hergestellt von Daiichi Pure Chemicals und auf eine Polyvinylidendifluorid-(PVDF)-Membran durch eine Blot-Vorrichtung übertragen. Zu der resultierenden PVDF-Membran wurde ein Blockierungsmittel (Block-ace, hergestellt von Dainippon Pharmaceutical) zugefügt, um eine Blockierung durchzuführen. Dann wurden die Produkte auf der Membran sukzessiv mit dem Maus-anti-FLAG monoklonalen Antikörper M2 und einem Kaninchen-anti-Maus-IgG polyklonalen Antikörper umgesetzt, markiert mit Meerrettichperoxidase (hergestellt von Zymed oder TAGO). Alternativ wurden die Produkte auf der Membran nach dem Blockieren sukzessiv mit einem biotinylierten Antikörper M2 (hergestellt von Sigma) und Streptoavidin, markiert mit Meerrettichperoxidase (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) umgesetzt. Nach der Reaktion wurde eine Expression des gewünschten Proteins durch ein kommerziell erhältliches Western-Blot-Nachweissystem (ECL Western Blotting Detecting System; hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) bestätigt.
Ein anscheinendes Molekulargewicht des nachgewiesenen Proteins auf der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) lag bei ungefähr 120 bis 140 kDa.
Beispiel 4: Bestätigung der Aggrecanase-Aktivität von MDTS8 Gesamtlängen-Protein
(1) Herstellung von rekombinantem Aggrecan G1G2
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 11, hergestellt auf der Basis der Gensequenz eines bekannten menschlichen Aggrecans (Doege K., et al., Biochem. Soc. Trans., 18, 200-202, 1990) und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 12 als Primer, eine menschliche Plazenta-cDNA-Bibliothek (Marathon-Ready^TM cDNA; hergestellt von Clontech) als Matrize und eine PyroBest^TM DNA-Polymerase (hergestellt von Takarashuzo) als DNA-Polymerase verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst für 1 Minute bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen für 10 Sekunden bei 98°C und 2 Minuten bei 68°C 40mal wiederholt. Danach wurde eine Verlängerungsreaktion für 7 Minuten bei 68°C durchgeführt.
Ein resultierendes PCR-Produkt, ein DNA-Fragment, wurde mit einem Restriktionsenzym, BamHI, verdaut und das resultierende DNA-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Plasmids pCEP-SigFla inseriert, um ein Expressionsplasmid pCEP-rAgg zur Expression eines Proteins herzustellen (hiernach bezeichnet als rekombinantes G1G2), enthaltend eine globuläre Domäne 1 – globuläre Domäne 2 des menschlichen Aggrecans und ein FLAG tag, zugefügt zum N-Terminus des globulären Domäne 1 – der globulären Domäne 2 und ein His tag, zugefügt zum C-Terminus der globulären Domäne 1 – globulären Domäne 2. Das Plasmid pCEP-SigFla war ein Expressionsvektor, hergestellt durch Inser tion eines doppelsträngigen Oligonukleotids, hergestellt durch Annealing des Oligonukleotids, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 13 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 14, in die HindIII- und XhoI-Stelle des Plasmids pCEP4d, wie hergestellt in Beispiel 1. Das Plasmid pCEP-SigFla enthielt eine sekretorische Signalsequenz (Guan X-M., et al., J. Biol. Chem., 267, 21995-21998, 1992), die von Hämaglutinin eines Influenzavirus abstammte, eine FLAG tag-Sequenz und eine BamHI-Erkennungssequenz in dieser Reihenfolge vom Promotor zur stromabwärts gelegenen Seite hin.
Ein resultierendes Expressionsplasmid pCEP-rAgg wurde in die HEK293-EBNA-Zelle eingeführt und die Transformante 3 bis 7 Tage kultiviert, um das gewünschte Protein zu exprimieren, d.h. das rekombinante Aggrecan G1G2. Das gewünschte Protein wurde aus dem Kulturüberstand durch eine Affinitätschromatographie gereinigt, wobei man sich des FLAG tags bediente, das an den N-Terminus angehaftet war. Genauer gesagt wurde der Kulturüberstand auf M2-Agarose (hergestellt von Sigma), gepackt in eine Säule aufgebracht, mit 20 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4)/150 mmol/l Natriumchlorid (hiernach als TBS bezeichnet) gewaschen, durch 0,1 mol/l Glycinhydrochlorid (pH 3,0) eluiert zur Fraktionierung und direkt mit 1 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert.
(2) Nachweis der Aggrecanase-Aktivität
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde das Plasmid pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG, hergestellt in Beispiel 2, und das Plasmid pCEPdE2-FLAG, hergestellt in Beispiel 1, als Kontrolle in eine HEK293-EBNA-Zelle (hergestellt von Invitrogen) eingeführt. Dann wurde 16 Stunden nach der Plasmideinführung ein Medium durch ein serumfreies Medium ersetzt. Die Kultivierung wurde 34 Stunden fortgesetzt und daraufhin wurde ein Kulturüberstand gewonnen.
Der resultierende Kulturüberstand wurde mit dem rekombinanten G1G2, hergestellt in Beispiel 4(1) vermischt und bei 37°C über Nacht umgesetzt. Danach wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, eine SDS-PAGE, ein Transfer auf eine PVDF-Membran und eine Blockierung durchgeführt. Dann wurden die Produkte auf der PVDF-Membran sukzessiv mit dem Maus-monoklonalen-Antikörper BC-3 (Hughes C.E., et al., Biochemical J., 305, 799-804, 1995), der ein Aggrecanase-neo-Epitop erkennen kann und einem Ziegen-anti-Maus IgG-polyklonalen Antikörper, markiert mit Peroxidase (hergestellt von TAGO) umgesetzt. Daraufhin wurde ein Western-Blot-Nachweissystem (ECL Western-Blotting Detecting System; hergestellt von Amersham Pharmacia) für den Nachweis verwendet.
Es ergab sich, dass wenn der Kulturüberstand der HEK293-EBNA-Zelle, transfiziert mit dem Plasmid pCEPdE2-FLAG (Kontrolle) mit dem rekombinanten G1G2 umgesetzt wurde, kein Abbauprodukt, das mit dem Anti-Aggrecanase-neo-Epitop-Antikörper reaktiv war, nachgewiesen wurde, während solche Abbauprodukte nachgewiesen wurden, wenn der Kulturüberstand der HEK293-EBNA-Zelle, transfiziert mit dem Plasmid pCEPdE2-MDTS8Full-FLAG mit dem rekombinanten G1G2 umgesetzt wurde.
Das vorliegende Beispiel zeigt, dass MDTS8 eine Aggrecanase-Aktivität hat.
Beispiel 5: Induktion der MDTS8 mRNA-Expression, begleitet von einer Differenzierung in Knorpelzellen
(1) Differenzierungsinduktion von Mesenchym-Stammzellen zu Knorpelzellen
Es ist bekannt, dass eine menschliche Mesenchym-Stammzelle in eine Knorpelzelle differenziert wird, wenn sie unter einem Spheroidpellet mit Stimulierung von TGF-β3 oder ähnlichem kultiviert wird (Pittenger M. F., et al., Science, 284, 143-147, 1999).
Normale menschliche Mesenchym-Stammzellen (hergestellt von Bio Whittaker) wurden in einem menschlichen Mesenchym-Stammzellen-Proliferations-Mediumkit (hergestellt von Bio Whittaker) zum Erhalt von 5 × 10⁵ Zellen kultiviert. Dann wurden 2,5 × 10⁵ Zellen mit einem inkompletten Chondrogenese-Induktionsmedium [DMEM-high Glucose (hergestellt von LIFE TECHNOLOGIES), 1 mmol/l Natriumpyruvat (hergestellt von LIFE TECHNOLOGIES), 0,35 mmol/l Prolin (hergestellt von LIFE TECHNOLOGIES), 0,1 μmol/l Dexamethason (hergestellt von Sigma), 0,17 mmol/l Ascorbinsäure-2-phosphat (hergestellt von Sigma) und ITS+1 Culture Supplement (hergestellt von Sigma)] gewaschen und in 500 μl eines kompletten Chondrogenese-Induktionsmediums [ein inkomplettes Knorpel-Differenzierungs-Induktionsmedium, enthaltend 0,01 μg/ml TGF-β3 (hergestellt von Sigma)], suspendiert. Dann wurde die Suspension in ein Polypropylenröhrchen übertragen und bei 150 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Das resultierende Zellpellet wurde so wie es war in einen Zelle-Kultivierungsapparat platziert und kultiviert. Die Kultivierung wurde 2 Wochen fortgesetzt, während das Medium auf ein vollständiges Knorpel-Differenzierungs-Induktionsmedium alle 3 oder 4 Tage geändert wurde, so dass die Zellen sich zu Knorpelzellen differenzierten.
(2) Bestätigung der Differenzierung zu Knorpelzellen
Eine Gesamt-RNA wurde von jedem von undifferenzierten menschlichen Mesenchym-Stammstellen und Zellen hergestellt, die zu einer Differenzierung induziert wurden und zwar durch ein kommerziell erhältliches Gesamt-RNA-Reinigungsreagenz (ISOGEN; hergestellt von Nippon Gene). Die resultierende Gesamt-RNA wurde mit DNase (hergestellt von Nippon Gene) 15 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die resultierende DNase-behandelte Gesamt-RNA (0,5 μg) wurde in cDNA durch ein Superscript first-strand system (für RT-PCR; hergestellt von LIFE TECHNOLOGIES) umgewandelt.
Die Differenzierung von den menschlichen Mesenchymalstammzellen zu Knorpelzellen durch Differenzierungs-Induktionsbehandlung, wie in Beispiel 5(1) offenbart, wurde durch einen deutlichen Anstieg einer Expression von mRNAs von Collagen Typ II und Collagen Typ IX, spezifisch in Knorpelzellen exprimiert, bestätigt, wenn die Differenzierungs-Induktion fortschritt. Noch genauer gesagt wurde eine quantitative PCR unter Verwendung eines Sequenzdetektors (Prism7700 Sequence Detector; hergestellt von Applied Biosystems) verwendet, um eine existierende Menge zu messen und einen Vergleich anzustellen. Für Collagen Typ II wurde eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 15 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 16 als Primerset verwendet und für Collagen Typ IX eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 17 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 18. Ein kommerziell erhältliches PCR-Reagenz (SYBR Green PCR core reagent; hergestellt von Applied Biosystems) wurde verwendet, um die PCR durchzuführen. Bei der PCR wurde eine anfängliche Denaturierungsreaktion für 10 Minuten bei 95°C durchgeführt. Dann wurde eine Zyklusreaktion, bestehend aus Behandlungen bei 94°C für 15 Sekunden, bei 60°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 60 Sekunden 45mal wiederholt.
Weiterhin wurde eine PCR durchgeführt, wobei menschliche genomische DNA als Matrize und das Primerset wie oben unter denselben Bedingungen verwendet wurden, um eine Standardkurve zur Berechnung einer exprimierten mRNA-Menge zu erhalten. Eine PCR wurde durchgeführt, wobei die cDNA wie oben und menschliche genomische DNA als Matrizen verwendet wurden und das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 21 und das Oligonukleotid, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 22 als Primersatz unter denselben Bedingungen um eine Menge an exprimierter menschlicher Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (g3pdh) als inneren Standard zu berechnen. Die existierenden Mengen an mRNAs von Collagen Typ II und Typ IX wurden auf der Basis der bestimmten Werte für G3PDH verändert.
(3) Expression des MDTS8-Gens in Knorpelzellen
Das Oligonukleotid, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 19 und das Oligonukleotid, bestehend aus der Rasensequenz von SEQ ID NO: 20 wurden auf der Basis der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 als Primersatz zur Messung einer mRNA-Menge des neuen Aggrecanasegens MDTS8 entworfen. Eine PCR wurde unter Verwendung des obigen Primersatzes, cDNA (korrespondierend zu 5 ng von Gesamt-RNA), hergestellt in Beispiel 5(2) als Matrize und einer DNA-Polymerase (TaKaRa LA Tag^TM; hergestellt von Takara-shuzo) durchgeführt. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen für 10 Sekunden bei 98°C, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute 40mal wiederholt.
Eine PCR wurde durchgeführt, um die Expression des G3PDH-Gens zu überwachen, wobei eine Kombination des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 21 und des Oligonukleotids, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 22 als Primersatz, cDNA (korrespondierend zu 5 ng Gesamt-RNA), hergestellt in Beispiel 5(2) als Matrize und eine DNA-Polymerase (TaKaRa LA Tag^TM, hergestellt von Takara-shuzo) verwendet wurden. Bei der PCR wurde eine thermische Denaturierungsreaktion zunächst für 2 Minuten bei 94°C durchgeführt. Dann wurde ein Zyklus, bestehend aus Behandlungen für 10 Sekunden bei 98°C, 30 Sekunden bei 60°C und 1 Minute bei 72°C 30mal wiederholt.
Es ergab sich, dass eine substanzielle Veränderung der Expression des G3PDH-Gens, begleitet von einer Differenzierung in Knorpelzellen, nicht beobachtet wurde, während mRNA des neuen Aggrecanasegens MDTS8 der vorliegenden Erfindung in den menschlichen Mesenchymal-Stammzellen vor der Differenzierung nicht nachgewiesen wurde, jedoch als Bande von ungefähr 0,33 kbp in den Knorpelzellen nachgewiesen wurde. Dies zeigt, dass mRNA des neuen Aggrecanasegens MDTS8 der vorliegenden Erfindung in Knorpelzellen exprimiert wird.
Beispiel 6: Chromosomenkartierung des neuen Aggrecanasegens MDTS8
Eine BLAST-Suche wurde in der GenBank für die Gensequenz des Gesamtlängen-ORF des neuen Aggrecanasegens, bestehend aus der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 der vorliegenden Erfindung als Suchsequenz durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass die BAC-Klone AC026498, AC025284, AC010548 und AC009139 Teilsequenzen von MDTS8 enthalten und ein Teil von mindestens 24 Exons in jedem der Klone vorliegt.
Dann wurde bestätigt, dass die vier obigen Klone auf dem Chromosom 16q lokalisiert waren, und zwar durch die öffentliche Datenbank (Human Genome Reconstruction Project; http://hgrep.ims.u-tokyo.ac.jp/cgibin/HTG_tool/view.cgi?layer=top), etabliert von The Institute of Medical Science, The University of Tokyo and RIKEN und im Netz veröffentlicht. Weiterhin wurde auch bestätigt, dass die vier obigen Klone die Genmarker WI-22533, stSG3069, SGC32952 und stSG62732 enthalten, die auf dem Chromosom 16q lokalisiert sind.
Darauffolgend wurde eine detailliertere Chromosomenkartierung durchgeführt, wobei die Marker WI-22533, stSG3069, SGC32952 und stSG62732, lokalisiert auf dem Chromosom 16q, verwendet wurden. Genauer gesagt wurde nach den obigen vier Genmarkern in anderen öffentlichen Datenbanken gesucht (The Genome Database; http://www.gdb.org/). Es wurde festgestellt, dass jeder der vier Marker auf 16q22.3-23.1 der physikalischen Karte der Chromosomen lokalisiert war und so ist MDTS8 auf 16q22.3-23.1 lokalisiert. Daher wird deutlich, dass die chromosomale Position von MDTS8 zu einer Region gehört, die als OA-Empfänglichkeitslokus, d.h. einer Gelenkerkrankung, spezifiziert ist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist eine neue Aggrecanase, die Gelenkerkrankungen auslöst (insbesondere OA) und so ist eine Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung inhibiert, als Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen nützlich.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Polypeptid kann ein geeignetes Screeningsystem für ein Mittel zur Behandlung von Gelenkerkrankungen bereitgestellt werden. Durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann nämlich eine Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen durch Selektion einer Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids inhibiert, einem Screening unterworfen werden.
Weiterhin kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen durch Herstellung eines Medikaments unter Verwendung einer Substanz, gewählt durch das Screeningverfahren, als Wirkstoff und einem Träger, einem Füllstoff und/oder anderen Additiven erzeugt werden.
Das Nachweisverfahren des vorliegenden Verfahrens kann nicht nur zum Screening einer Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen verwendet werden, sondern auch für einen Qualitätskontrolltest einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkerkrankungen kann nämlich erzeugt werden, indem nachgewiesen wird, ob oder nicht eine zu testende Verbindung die Aggrecanase-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids inhibiert, und zwar durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung und dann durch Herstellung eines Medikaments unter Verwendung der resultierenden Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität inhibiert.
Weiterhin können das Polynukleotid, der Expressionsvektor, die Zelle und der Antikörper der vorliegenden Erfindung für die Erzeugung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
Freier Text im Sequenzprotokoll
Die Merkmale "künstliche Sequenz" werden in dem Zahlenidentifikator <223> im Sequenzprotokoll beschrieben. Genauer gesagt ist jede der Basensequenzen von SEQ ID NO: 3-6 und 9-12 eine künstlich synthetisierte Primersequenz. Alle Basensequenzen von SEQ ID NO: 7, 8, 13 und 14 sind künstlich synthetisierte Linkersequenzen. Die Basensequenz von SEQ ID NO: 23 ist eine künstlich synthetisierte Sequenz, die eine Restriktionsenzym NotI-Erkennungsstellensequenz und eine FLAG tag-Sequenz enthält.
Wie oben wird die vorliegende Erfindung im Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen erklärt, jedoch sind Modifikationen und Verbesserungen, die dem Fachmann auf dem Gebiet naheliegen, im Umfang der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, das Aggrecanase-Aktivität aufweist und (1) die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 oder (2) eine Aminosäuresequenz, in der 1 bis 10 Aminosäuren deletiert, substituiert und/oder in der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 inseriert sind, umfaßt.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 und Aggrecanase-Aktivität aufweisend.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit einer 90%igen oder größer Homologie mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2, das Aggrecanase-Aktivität aufweist.
Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2.
Polynukleotid, codierend as Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Anspruch 5.
Zelle, transfiziert mit dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 6.
Verfahren zum Nachweisen, ob eine Verbindung, die getestet werden soll, die Aggrecanase-Aktivität eines Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 inhibiert, umfassend die Schritte: Inkontaktbringen (1) des Polypeptids, (2) eines Substratpolypeptids, das in der Lage ist, durch Aggrecanase verdaut zu werden, und (3) der zu testenden Verbindung und Analysieren des Verdaus des Substratpolypeptids.
Verfahren zum Durchmustern nach einer Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 inhibiert, umfassend die Schritte: Nachweisen durch das Verfahren gemäß Anspruch 8 und Auswählen einer Substanz, die die Aggrecanase-Aktivität inhibiert.
Verfahren zum Durchmustern nach einer Substanz gemäß Anspruch 9, wobei die Substanz zur Behandlung von Gelenkerkrankungen dient.
Antikörper oder Fragment davon, der an das Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 bindet.