KR101939323B1 - 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 가지는 피부투과성 단백질 및 그의 용도 - Google Patents
탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 가지는 피부투과성 단백질 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 탈모방지 및 발모촉진 효과를 가지는 피부투과성 단백질 혼합 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 섬유아세포 성장인자 (Basic Fibroblast Growth Factor, FGF2) 재조합 단백질 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 재조합 단백질과 섬유아세포 성장인자9 (Fibroblast Growth Factor, FGF9) 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 재조합 단백질과 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 재조합 단백질과 티오레독신 (Thioredoxin1, TRX1) 및 PEP-1 펩타이드가 결합된 재조합 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물이 세포 및 피부 내로 탁월하게 투과되며, 우수한 발모 촉진 효과를 보이는 것을 이용함으로써, 재조합 단백질 조성물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 화장료 조성물 및 약학 조성물로써 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 증진된 발모 촉진 효과를 보이는 피부투과성 단백질을 유효성분으로 함유하는 탈모방지용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
PTD (Protein transduction domain)는 5~30 개의 아미노산 서열로 이루어져 있고, 투과하고자 하는 분자와의 융합이 간편하고 안정적이며 융합 분자에 영향을 끼치지 않아 각광받고 있다.
PTD는 생물학적 분자들이 통과하지 못하는 세포투과를 할 수 있는데 이는 세포막의 글라이코사미노클라이칸 (glycosaminoglycan, GAG)을 통해 세포 내로 들어갈 수 있으며, 엔도사이토시스 경로를 통해 유입될 수 있다. 기존의 전달체 (예컨대, 리포좀, 폴리머 등)보다 PTD의 중요한 장점은 치료 목적이나 진단용으로 세포 내에 전달하고자 할 때 낮은 독성과 치료에 대한 면역거부반응이 적고, 고농도의 처리 방법에 따른 문제점을 단계적인 처리기법으로 개선할 수 있는 이점을 지니고 있는 것이다.
탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 일반적으로 두피의 성모 (굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다.
탈모의 원인은 다양하다. 대머리의 발생에는 유전적 원인과 남성 호르몬인 안드로겐 (androgen)이 중요한 인자로 생각되고 있으며, 여성형 탈모에서도 일부는 남성형 탈모와 같은 경로로 일어나는 것으로 추정되고 있으나 임상적으로 그 양상에 차이가 있다. 원형 탈모증은 자가 면역 질환으로 생각되고 있으며, 휴지기 탈모증은 내분비질환, 영양 결핍, 약물 사용, 출산, 발열, 수술 등의 심한 신체적, 정신적 스트레스 후 발생하는 일시적인 탈모로, 모발의 일부가 생장 기간을 다 채우지 못하고 휴지기 상태로 이행하여 탈락되어 발생한다.
이러한 탈모를 치료하기 위해 많은 연구가 진행되고 있지만, 그럼에도 불구하고, 지금까지 오직 두 개의 약물 (피나스테라이드 (finasteride) 및 미녹시딜 (minoxidil))만이 탈모 치료를 위해 FDA (Food and Drug Administration)에서 인가되었다.
지금까지 탈모를 방지하여 주고 발모 촉진 및 모발 생장에 효과를 가지고 있다고 알려져 있는 미녹시딜 (minoxidil)이나 트리코사카라이드 (trichosaccharide) 등의 제제들의 경우, 뚜렷한 효능의 부재 및 인체 안정성, 피부자극 유발 등의 부작용 문제가 대두되고 있어 안전성 및 효능이 확보된 조성물 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 합성 화합물이 아닌 생물학적 소재인 단백질 또는 펩타이드를 이용하여 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 가지는 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자9 (Fibroblast Growth Factor, FGF9)가 결합된 재조합 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자 (Basic Fibroblast Growth Factor, FGF2)가 결합된 재조합 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 결합된 재조합 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 피부투과성 단백질 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 피부투과성 단백질 조성물은, 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 티오레독신 (Thioredoxin1, TRX1)이 결합된 재조합 단백질을 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 피부투과성 단백질 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 피부투과성 단백질 조성물은 바람직하게 ATP-민감성 칼륨이온 채널 오프너 (ATP-sensitive K+-channel opener)로 작용할 수 있다.
또한, 본 발명의 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 피부투과성 단백질 조성물은 바람직하게 PGE2 생성능이 있는 것일 수 있다.
본 발명에서 개발한 피부투과성 단백질은 모유두 세포 (Dermal papilla cells) 증식에 더욱 효과적이므로, 발모 촉진 효과를 가지는 탈모 방지용 화장품 조성물 및 약학 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 Clone A21 Cells)에 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2를 농도별로 처리하여 세포증식 효과를 정성적으로 확인한 현미경 사진이다.
도 2는 인간 혈관내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC Cells)에 PEP1-VEGF를 농도별로 처리하여 세포증식 효과를 정성적으로 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 모유두 세포 (Dermal papilla cells)에서의 미녹시딜 및 PEP1-FGF1 대비 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF의 생체외 (in vitro) 효능을 비교한 WST Assay 결과이다.
도 4는 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 cells)에서의 재조합 단백질 혼합제제의 세포 증식 활성 안정성을 평가한 WST Assay 결과이다.
도 5는 모유두 세포 (Dermal papila cells)에서의 재조합 단백질 혼합제제의 세포 증식 활성 안정성을 평가한 WST Assay 결과이다.
도 6은 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 양성 대조군 미녹시딜 (minoxidil)의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 7은 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 PEP1-FGF2 및 PEP1-FGF9의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 8은 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에서의 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-VEGF (PEP1-VEGF)의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 9는 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 K+-channel 차단제 처리 전, 후 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-FGF2 (PEP1-FGF2) 및 PEP1-FGF9 (PEP1-FGF9)의 K+-channel 오프너로서의 효능을 비교한 결과이다.
도 10은 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에서의 K+-channel 차단제 처리 전, 후 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-VEGF (PEP1-VEGF)의 K+-channel 오프너로서의 효능을 비교한 결과이다.
도 11은 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 Clone A21 Cells)에서의 양성 대조군 미녹시딜 (minoxidil) 대비, SP1-HSI 구성 조성물 단일 및 혼합물 형태의 PGE2 생성 효과를 나타낸 결과이다.
도 12는 SP1-HSI 및 미녹시딜 (minoxidil)의 모발주기 조절 인자들의 발현 변화를 분석 비교한 결과이다. (SP1-HSI는 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF 및 PEP1-TRX1이 모두 포함된 재조합 단백질들의 혼합 조성물을 지칭한다.)
도 13은 SP1-HSI 및 미녹시딜 (minoxidil)이 세포주기 (cell cycle)에 미치는 영향을 비교한 결과이다. (SP1-HSI는 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF 및 PEP1-TRX1이 모두 포함된 재조합 단백질들의 혼합 조성물을 지칭한다.)
도 14는 PEP1-FGF2와 FITC-DDBD 혼합물의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
도 15는 PEP1-GFP와 GFP 단백질의 세포 투과력을 비교한 결과이다.
도 16은 PEP1-GFP와 GFP 단백질의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
도 17은 세포투과성 펩타이드-FITC 혼합물의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
도 18은 인공피부의 기능적인 조건 확인 결과이다.
도 19는 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위한 6-well 인공피부 라벨링이다.
도 20은 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위해 배양액을 채운 24-well 인공피부 라벨링이다.
도 21은 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위해, SP1-HSI처리 후 사후배양에 필요한 6-well 인공피부 라벨링이다.
도 22는 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행한 플레이트 (Plate) 모식도이다. (BLK=blank, isopropanol/ NC=negative control, 음성대조군/ PC= positive control,양성대조군)
도 2는 인간 혈관내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC Cells)에 PEP1-VEGF를 농도별로 처리하여 세포증식 효과를 정성적으로 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 모유두 세포 (Dermal papilla cells)에서의 미녹시딜 및 PEP1-FGF1 대비 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF의 생체외 (in vitro) 효능을 비교한 WST Assay 결과이다.
도 4는 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 cells)에서의 재조합 단백질 혼합제제의 세포 증식 활성 안정성을 평가한 WST Assay 결과이다.
도 5는 모유두 세포 (Dermal papila cells)에서의 재조합 단백질 혼합제제의 세포 증식 활성 안정성을 평가한 WST Assay 결과이다.
도 6은 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 양성 대조군 미녹시딜 (minoxidil)의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 7은 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 PEP1-FGF2 및 PEP1-FGF9의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 8은 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에서의 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-VEGF (PEP1-VEGF)의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 9는 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 K+-channel 차단제 처리 전, 후 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-FGF2 (PEP1-FGF2) 및 PEP1-FGF9 (PEP1-FGF9)의 K+-channel 오프너로서의 효능을 비교한 결과이다.
도 10은 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에서의 K+-channel 차단제 처리 전, 후 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-VEGF (PEP1-VEGF)의 K+-channel 오프너로서의 효능을 비교한 결과이다.
도 11은 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 Clone A21 Cells)에서의 양성 대조군 미녹시딜 (minoxidil) 대비, SP1-HSI 구성 조성물 단일 및 혼합물 형태의 PGE2 생성 효과를 나타낸 결과이다.
도 12는 SP1-HSI 및 미녹시딜 (minoxidil)의 모발주기 조절 인자들의 발현 변화를 분석 비교한 결과이다. (SP1-HSI는 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF 및 PEP1-TRX1이 모두 포함된 재조합 단백질들의 혼합 조성물을 지칭한다.)
도 13은 SP1-HSI 및 미녹시딜 (minoxidil)이 세포주기 (cell cycle)에 미치는 영향을 비교한 결과이다. (SP1-HSI는 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF 및 PEP1-TRX1이 모두 포함된 재조합 단백질들의 혼합 조성물을 지칭한다.)
도 14는 PEP1-FGF2와 FITC-DDBD 혼합물의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
도 15는 PEP1-GFP와 GFP 단백질의 세포 투과력을 비교한 결과이다.
도 16은 PEP1-GFP와 GFP 단백질의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
도 17은 세포투과성 펩타이드-FITC 혼합물의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
도 18은 인공피부의 기능적인 조건 확인 결과이다.
도 19는 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위한 6-well 인공피부 라벨링이다.
도 20은 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위해 배양액을 채운 24-well 인공피부 라벨링이다.
도 21은 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위해, SP1-HSI처리 후 사후배양에 필요한 6-well 인공피부 라벨링이다.
도 22는 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행한 플레이트 (Plate) 모식도이다. (BLK=blank, isopropanol/ NC=negative control, 음성대조군/ PC= positive control,양성대조군)
본 발명의 설명을 개진하기 전, 본 발명에 사용되는 용어에 대한 설명을 간략히 기재한 후, 본 발명을 설명하고자 한다.
'PEP1-FGF9'이란 PEP1 (서열번호 1)과 섬유아세포 성장인자9 (Fibroblast Growth Factor, FGF9, 서열번호 2)가 결합된 재조합 단백질이다. 이는 재조합 벡터 pET15-(PEP1-FGF9)를 E. coli Rosetta-gami 2 (DE3) 세포 내로 형질전환시켜 제조할 수 있다.
'PEP1-FGF2'란 PEP1과 섬유아세포 성장인자 (Basic Fibroblast Growth Factor, FGF2, 서열번호 3)가 결합된 재조합 단백질이다. 이는 재조합 벡터 pET21-(PEP1-FGF2)를 E. coli Rosetta-gami 2 (DE3) 세포 내로 형질전환시켜 제조할 수 있다.
'PEP1-VEGF'란 PEP1과 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF, 서열번호 4)가 결합된 재조합 단백질이다. 이는 재조합 벡터 pET15-(PEP1-VEGF)를 E. coli BL21 (DE3) 세포 내로 형질전환시켜 제조할 수 있다.
'PEP1-TRX1'이란 PEP1과 티오레독신 (Thioredoxin1, TRX1, 서열번호 5)이 결합된 재조합 단백질이다. 이는 재조합 벡터 pET15-(PEP1-TRX1)를 E. coli Rosetta-gami 2 (DE3) 세포 내로 형질전환시켜 제조할 수 있다.
마지막으로, 'SP1-HSI'이란 상기의 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF 및 PEP1-TRX1이 모두 포함된 재조합 단백질 조성물을 지칭한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자9 (Fibroblast Growth Factor, FGF9)가 결합된 재조합 단백질; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자 (Basic Fibroblast Growth Factor, FGF2)가 결합된 재조합 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 결합된 재조합 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 피부투과성 단백질 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 피부투과성 단백질 조성물은, 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 티오레독신 (Thioredoxin1, TRX1)이 결합된 재조합 단백질을 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 피부투과성 단백질 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.
PEP1은 본 발명자가 개발한 PTD의 하나로, PTD는 생물학적 분자들이 통과하지 못하는 세포투과를 할 수 있는데, 이는 세포막의 글라이코사미노클라이칸 (glycosaminoglycan, GAG)을 통해 세포 내로 들어갈 수 있으며, 엔도사이토시스 경로를 통해 유입될 수 있다. 기존의 전달체 (예컨대, 리포좀, 폴리머 등)보다 PTD의 중요한 장점은 치료 목적이나 진단용으로 세포 내에 전달하고자 할 때 낮은 독성과 치료에 대한 면역거부반응이 적고, 고농도의 처리 방법에 따른 문제점을 단계적인 처리기법으로 개선할 수 있는 이점을 지니고 있는 것이다.
또한, 본 발명의 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 피부투과성 단백질 조성물은 바람직하게 ATP-민감성 칼륨이온 채널 오프너 (ATP-sensitive K+-channel opener)로 작용할 수 있다.
또한, 본 발명의 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 있어서, 상기 피부투과성 단백질 조성물은 바람직하게 PGE2 생성능이 있는 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 바람직하게 두피에 적용 가능한 것일 수 있는데, 일예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 또는 반고체 형태로 피부에 적용될 수도 있다. 다만, 반드시 이와 같은 제형에 한정되는 것은 아니고 탈모를 방지하거나 발모를 촉진할 수 있는 그 어떤 형태의 제형으로도 구현 가능하다.
한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 바람직하게는 상기 단백질 또는 단백질 조성물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로, 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테를 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 드라가칸트 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 약학 조성물을 제공하는데, 약학조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제 (SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제 (SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약학 조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분인 단백질의 양을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
본 발명에서는 미녹시딜과 본 발명의 피부투과성 단백질 조성물의 효능을 비교하였는데, 미녹시딜은 탈모치료제 중 FDA 승인을 받은 2개의 약물 중 하나로, ATP-민감성 칼륨이온 채널 오프너 작용하여 육모를 촉진시킬 수 있다. 그러나, 모든 탈모인에 효과가 있는 것이 아니고, 남성의 경우 약 40% 만이 효과를 본다는 점, 탈모 면적이 넓으면 효과가 떨어진다는 점, 찐득찐득해서 머리 스타일링에 상당히 애로사항이 있다는 등의 문제점을 가지고 있다. 하지만, 본 발명은 피부투과성이 현저하며, 미녹시딜보다 모유두세포의 증식효능이 뛰어난 장점을 가지고 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
실시예
1: 본 발명에서 제조한 재조합 단백질의 세포 증식 및 정성적 활성도 측정]
본 발명에서 제조한 PEP1-FGF9과 PEP1-FGF2에 의한 세포 증식 효과를 정성적으로 확인하기 위하여 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 Clone A21 cells)에 대해 각각의 정제된 단백질을 농도별로 처리하여 세포의 성장 상태를 현미경으로 관찰하였다. 자세한 방법으로는, 10% BCS 배지가 2 ml씩 담겨 있는 6 well plate에 마우스 섬유아세포를 105개/well로 넣고 24시간 배양 후, 무혈청 배지로 옮겨 20시간 정도 스타베이션 (Starvation)을 주었다. 그 후, PEP1-FGF9, PEP1-FGF2 단백질을 최대 0, 1, 10, 100 ng/ml 농도로 각 well에 첨가한 후 24시간 추가 배양 뒤에 각 well을 현미경으로 관찰하여 세포 증식 정도를 확인하였다 (도 1). 도 1은 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 Clone A21 Cells)에 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2를 농도별로 처리하여 세포증식 효과를 정성적으로 확인한 현미경 사진이다.
PEP1-VEGF에 의한 세포 증식 효과를 정성적으로 확인하기 위하여 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에 대해 각각의 정제된 단백질을 농도별로 처리하여 세포의 성장 상태를 현미경으로 관찰하였다. 자세한 방법으로는, 성장 배지 (Growth media)가 2 ml씩 담겨 있는 6 well plate에 인간 혈관내피세포를 105개/well로 넣고 24시간 배양 후, 무보충물 배지로 옮겨 20시간 정도 스타베이션을 주었다. 그 후, PEP1-VEGF 단백질을 최대 0, 1, 10, 100 ng/ml 농도로 각 well에 첨가한 후 24시간 추가 배양 뒤에 각 well을 현미경으로 관찰하여 세포 증식 정도를 확인하였다 (도 2). 도 2는 인간 혈관내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC Cells)에 PEP1-VEGF를 농도별로 처리하여 세포증식 효과를 정성적으로 확인한 현미경 사진이다.
실험 결과, PEP1-FGF9과 PEP1-FGF2, PEP1-VEGF 모두가 농도 의존적으로 세포증식에 효과를 보임을 확인하였다.
[실시예 2: 재조합 단백질의 모유두 세포 성장 활성도 측정 (모유두 세포 (Dermal papilla cells)의 성장 효능 평가]
모낭에서의 모유두 세포(dermal papilla cells)는 모낭의 형성, 재생 및 모발의 성장에서 중요한 역할을 한다. 특히 모발주기에서 성장기로의 유도 및 유지에 모유두 세포(dermal papilla cells)의 성장 증식이 필요하다. 본 실험에서는 인간 모낭 모유두 세포 (Human hair follicle dermal papilla cells)를 사용하여 실험하였다.
인간 모낭 모유두 세포 (Human hair follicle dermal papilla cells)에서의 정량적 효능 평가를 위하여, 인간 모낭 모유두 세포 (Human hair follicle dermal papilla cells)를 10% FBS를 넣은 DMEM (Dulbecco's Modifide Eagle's Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5%, CO2 항온기에서 배양하고 3일에 한번 씩 계대하여 필요한 세포주를 확보하였다.
모유두 세포를 5ⅹ103 cells/ml을 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후, 무혈청 DMEM배지로 교환하여 다시 24시간 배양한 다음 시료 (PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF)를 농도별 (10 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml, 1000ng/ml, 5000 ng/ml)로 처리하였다.
양성 대조군으로 메커니즘의 차이는 있지만 발모효능이 있는 의약품인 미녹시딜 (minoxidil(시판 발모제)) 1 μM를 사용하였다. 또한, 본 발명과 다른 성장인자인 FGF1을 사용한 PEP1-FGF1를 5 ppm처리하고, 72시간 동안 배양한 후 WST assay로 측정하였다 (도 3). 도 3은 모유두 세포 (Dermal papilla cells)에서의 미녹시딜 및 PEP1-FGF1 대비, 본 발명 PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF의 생체외 (in vitro) 효능을 비교한 WST Assay 결과이다.
실험 결과, 음성 대조군 (Control)과 대비하여 미녹시딜은 123% 정도 증가하였고, PEP1-FGF1은 125% 정도의 증식을 보였으며, PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF은 미녹시딜에 대비하여 농도 의존적으로 유의성(P<0.05) 있게 증가하였다. 특히, PEP1-FGF2와 PEP1-FGF9는 PEP1-VEGF에 비하여 증식 효능이 좋았으며, 대조군에 비하여 500 ng/ml에서 최대 160%까지 증식하였다.
[실시예 3: 재조합 단백질 혼합 조성물의 안정성 평가]
(1)
Balb
/c 3T3 cells에서의 재조합 단백질 혼합물의 증식 효능 평가
PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF, PEP1-TRX1의 단백질을 혼합 제제화하였을 경우, 각각의 단백질들이 혼합에 의한 효능 안정성에 문제가 없는지를 평가하였다. 자세한 방법으로는, 10% BCS의 DMEM media (생장 배지)를 100 ul씩 96 well plate에 준비한 후, 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 clone A31 cells)를 104개/well 넣고, 24시간 배양 후, 무혈청 배지로 옮겨 20시간 정도 스타베이션을 주었다. 그 후, 단백질을 최대 10 ng/ml 농도로 희석하여 준비하여 각 well에 넣어서 24시간 처리하였다. 최종 측정 방법은 WST assay (Takara, Otsu, Shiga, Japan) 제품을 이용하여 450nm 흡광도에서 분석한 결과이다 (도 4). 도 4는 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 cells)에서의 재조합 단백질 혼합제제의 세포 증식 활성 안정성을 평가한 WST Assay 결과이다.
실험 결과, 음성 대조군에 비하여 PEP1-FGF9 단독은 1.6배, Complex2 (PEP1-FGF9+PEP1-VEGF)는 1.72 배, Complex3 (PEP1-FGF9+PEP1-TRX1)는 1.75배로 활성이 높게 나타났다. 또한, Complex1 (PEP1-FGF9+PEP1-FGF2)과 SP1-HSI (PEP1-FGF9+PEP1-FGF2+PEP1-VEGF+PEP1-TRX1)는 혼합된 PEP1-FGF9 및 PEP1-FGF2의 효능이 더해져 시너지 효과를 보였으며, 그 활성에 있어, Complex1은 음성 대조군에 비해 2.68배, SP1-HSI는 2.79배 활성이 높게 나타났다.
결론적으로, PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF, PEP1-TRX1을 혼합하여 제제화함에 있어서 각각의 원료들의 효능 안정성에 문제가 없음이 증명되었다.
(2)
모유두
세포(Dermal papilla cells)에서 재조합 단백질 혼합물의 증식 효능 평가
PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF, PEP1-TRX1의 단백질을 혼합 제제화 하였을 경우 각각의 원료들이 혼합에 의해 모유두 세포에서 효능 안정성에 문제가 없는지를 평가하였다. 10% FBS의 DMEM media (생장 배지) 100 ul씩과 모유두 세포 5ⅹ103 cells/ml를 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후, 무혈청 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 배양한 다음, 시료 (PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF, PEP1-TRX1의 단백질)를 5 μg/ml의 농도로 처리하고 72시간 동안 배양한 후, 세포의 성장률을 WST assay로 비교 측정하였다 (도 5). 도 5는 모유두 세포 (Dermal papila cells)에서 재조합 단백질 혼합제제의 세포 증식 활성 안정성을 평가한 WST Assay 결과이다.
실험 결과, 음성대조군에 비해 PEP1-FGF9은 1.79배, Complex1 (PEP1-FGF9+PEP1-FGF2) 1.75배, Complex2 (PEP1-FGF9+PEP1-VEGF) 1.92배, Complex3 (PEP1-FGF9+PEP1-TRX1) 1.86배, SP1-HSI (PEP1-FGF9+PEP1-FGF2+PEP1-VEGF+PEP1-TRX1) 1.8배로 모유두 세포 증식 효능을 보였으며, 각 시료들에서 비슷한 결과를 관찰할 수 있었다.
결론적으로, PEP1-FGF9, PEP1-FGF2, PEP1-VEGF, PEP1-TRX1를 혼합하여 제제화함에 있어서 각각의 원료들의 생체외 (in vitro) 효능 안정성에 문제가 없음이 증명되었다.
[실시예 4: 재조합 단백질들의 탈모 방지 작용 기전 검증]
(1) ATP-민감성 칼륨이온 채널 오프너 (ATP-sensitive K+-channel opener) 작용 평가
미녹시딜은 ATP-sensitive K+-channel 오프너 (opener)로 작용하여 유사분열촉진 (mitogenic) 효과를 나타내며, 육모효능이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 ATP-sensitive K+-channel 차단제에 의하여 그 효능이 차단된다고 알려져 있다. ATP-sensitive K+-channel의 오프너로 작용하는 물질은 섬유아세포 (NIH3T3 fibroblast cells) 및 인간 혈관내피세포 (HUVEC cells)에서 유사분열촉진 효과를 나타내어 섬유아세포의 성장증식이 촉진됨이 알려져 있으며, 이와 같은 효능은 ATP-sensitive K+-channel의 차단제인 툴부타미드 (tolbutamide) 및 글리벤클라미드 (glibenclamide) 등에 의하여 차단된다. 이 실험에서는 차단제로 툴부타미드를 사용하여 실험하였다.
본 실험에서는 재조합 단백질인 PEP1-FGF2, PEP1-FGF9, PEP1-VEGF 및 재조합 단백질 혼합제제인 SP1-HSI가 오프너로 작용하는지 섬유아세포와 인간 혈관내피세포를 이용하여 조사하였다.
섬유아세포를 10% 우아혈청 (bovine calf serum (BCS; Gibco Inc, NY, USA))이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하며, 3일마다 계대배양하였다. 섬유아세포의 증식은 다음과 같이 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 섬유아세포 1.0×10⁴ cells/mL를 96 well plate에 넣고 1.5% BCS DMEM 배지로 24시간 배양한 다음 시료들을 여러 농도로 처리하며 양성 대조군인 미녹시딜 (MXD: Sigma, MO, USA)의 농도가 75 μM 의 농도가 되게 처리한다. 4일 동안 배양한 후, 50 μL의 MTT (Sigma, MO, USA; 2 mg/mL)를 첨가하고 4 시간 동안 반응시켰다. 상층액은 제거하고 DMSO 200 μL을 가하여 침전물을 용해시킨 후, microplate reader (Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 각 시료군의 평균 흡광도 값을 구하고, 대조군은 흡광도 값과 비교하여 증식정도를 조사하였다.
실험 결과, 양성 대조 물질로 사용된 미녹시딜의 경우 대조군에 비하여 섬유아세포와 인간 혈관내피세포의 증식이 유의성 있게 증가하였으며, 툴부타미드에 의하여 그 효능이 차단되지만, 미녹시딜의 농도를 높여주면 다시 증식에 도움을 주는 것으로 나타났다. 이를 통해, 미녹시딜이 ATP-sensitive K+-channel 오프너의 역할을 하는 것을 추론할 수 있었다 (도 6). 도 6은 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 양성 대조군 미녹시딜 (minoxidil)의 ATP-민감성 칼륨이온 채널 오프너 작용을 확인한 결과이다.
실험군인 SP1-HSI의 구성 원료 PEP1-FGF2, PEP1-FGF9, PEP1-VEGF에서도 세포증식에 영향을 주어 양성대조물질인 미녹시딜과 마찬가지로 K+-channel 오프너의 역할을 하는 것으로 확인하였고, 미녹시딜에 비하여 최대 2배가량 높은 경향을 보였다 (도 7, 도 8, 도 9, 도 10).
도 7은 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 PEP1-FGF2 및 PEP1-FGF9의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이고, 도 8은 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에서의 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-VEGF (PEP1-VEGF)의 ATP-sensitive K+-channel opener 작용을 확인한 결과이다.
도 9는 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblast cells)에서의 K+-channel 차단제 처리 전, 후 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-FGF2 (PEP1-FGF2) 및 PEP1-FGF9 (PEP1-FGF9)의 K+-channel 오프너로서의 효능을 비교한 결과이며, 도 10은 인간 혈관내피세포 (HUVEC Cells)에서의 K+-channel 차단제 처리 전, 후 미녹시딜 (minoxidil)과 PEP1-VEGF (PEP1-VEGF)의 K+-channel 오프너로서의 효능을 비교한 결과이다.
결론적으로, SP1-HSI를 구성하는 재조합 단백질로서 PEP1-FGF2, PEP1-FGF9, PEP1-VEGF 각 원료는 ATP-sensitive K+-channel 오프너로 작용하여 발모 효능에 도움을 줄 수 있다는 것이 증명되었다.
(2) Balb/c 3T3 세포주에서 PGE₂생성 효과
프로스타글린딘 E₂ (Prostaglandin E₂(PGE₂))는 모발 성장에 있어서 중요한 분자로 작용함이 보고되었다. PGE₂ 유사체 (analogue)인 비프로스톨 (viprostol)은 인간의 모발 성장을 증가시킨다는 보고 내용을 근거로 PGE₂생성 효과를 검증하였다.
마우스 섬유아세포를 10% BCS와 100 U/ml 페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 베지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 배양된 마우스 섬유아세포를 DMEM 배지를 이용하여 1×104 cells/mL로 조절한 후 5% CO₂항온기에서 18시간 후, 배지를 제거하고 배지에 녹여진 다양한 시료를 농도별로 처리하여 배양하였다. 상등액을 수거하여 상등액에 포함된 PGE₂의 양을 human PGE₂ enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)kit에 따라 반응을 시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 미녹시딜을 양성 대조군으로 사용하여 활성을 비교하였다 (표 1, 도 11). 도 11은 마우스 섬유아세포 (Balb/c 3T3 Clone A21 Cells)에서의 양성 대조군 미녹시딜 (minoxidil) 대비, SP1-HSI 구성 조성물 단일 및 혼합물 형태의 PGE2 생성 효과를 나타낸 결과이다.
[표 1]
시료별 PGE2 생성량 비교
SP1-HSI 및 SP1-HSI를 구성하는 각각의 재조합 단백질에 의한 PEG2 생성효과를 탐색한 결과, 농도 의존적으로 모두 증가한 경향을 보여주었으며, SP1-HSI의 조성물 중에 PEP1-FGF2가 PGE₂의 생성을 가장 많이 촉진한다는 사실을 알 수 있었고, PEP1-VEGF와 PEP1-TRX1은 미비하게 증가하였다.
하지만, 양성 대조군으로서 미녹시딜에 비하여 4종 조성물의 PGE₂의 생성 효능이 높았으며, 4종의 조성물의 혼합물인 SP1-HSI가 PGE2생성을 제일 많이 증가시켰다.
(3)모발주기 조절 인자들의 발현 변화 분석
육모효능을 나타내는 미녹시딜은 인간 모유두세포 (Human hair follicle dermal papilla cell)에서 베타-액틴 경로 (β-catenin pathway)를 활성화하여 모발이 성장기를 유지하는 효과를 나타낸다. 베타-액틴 경로의 활성화는 세포주기 조절인자들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그렇다면, 재조합 단백질 혼합물인 SP1-HSI도 인간 모유두세포에서 미녹시딜에 준하는 효과가 있는지를 확인하기 위해 베타-액틴 경로와 세포주기에 관여하는 단백질 발현 변화를 확인하였다.
인간 모유두세포 (1×105 cells/mL)를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 60 mm 접시 (dish)에 4 ml을 씨딩 (seeding)하여 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 0% FBS DMEM 을 이용하여 베타-액틴 경로를 확인하는 실험은 16시간 동안, 세포주기를 확인하는 실험은 24 시간 동안 스타베이션을 진행하였다. SP1-HSI를 10 ng/ml, 미녹시딜을 10 μM 농도로 처리한 후, 베타-액틴 경로를 확인하는 실험은 30분간 배양하고, 세포주기를 확인하는 실험은 24시간 동안 배양하였다. 각각의 실험조건에 해당하는 처리시간 후, 세포를 PBS로 2~3회 세척한 다음 세포 스크레이퍼 (cell scraper)를 이용하여 세포를 모아 15,000 rpm에서 3분간 원심분리한 뒤 PBS를 제거하였다. 50 μl의 라이시스 버퍼 (lysis buffer)를 첨가하여 용해 (lysis) 시킨 후 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질의 농도는 BSA를 표준물질로 사용하여 BCA 단백질 어세이 키트 (Protein Assay Kit)로 정량한 후, 20~30 μg의 용해물 (lysate)을 10% mini gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyarylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하여 니트로셀룰로오스막 (nitrocellulose membrane)에 BIO-RAD 세미 드라이 트랜스퍼 (semi dry transfer)를 이용하여 2.5A로 20분 동안 트랜스퍼 (transfer)하였다. 트랜스퍼 후, 5% BSA 또는 5% 스킴 밀크 TBS-T(0.1% tween20)를 이용하여 막 억제 (membrane blocking)를 상온에서 1시간 실시하고. 단백질 발현을 확인하기 위한 1차 항체로는 Rabbit-polyclonal anti-phospho-β-catenin (Ser552, 1:1000), Rabbit-polyclonal anti-βcatenin (1:1000), Rabbit-polyclonal anti-phospho-Akt (1:1000), Rabbit-polyclonal anti-Akt (Ser473, 1:1000), Rabbit-polyclonal anti-phospho-Erk1/2 (1:1000), Rabbit-polyclonal anti-Erk1/2 (1:1000), Rabbit-polyclonal anti-phospho-Rb (Ser807/811, 1:1000), Rabbit-polyclonal anti-Rb (1:1000), Rabbit-polyclonal anti-CDK4 (1:1000), Rabbit-polyclonal anti-cyclinD1 (1:1000) Mouse-monoclonal anti-tubulin (1:5000)를 사용하였으며, 각각의 항체들은 5% BSA 또는 5% 스킴 밀크 TBS-T(0.1% tween20)에 희석하여 사용하였으며, 항체 반응은 4℃에서 오버나잇 (overnight)을 실시하였다. 2차 항체로는 겨자무과산화효소 (horse radish peroxidase (HRP))가 결합된 anti-rabbit IgG 또는 anti-mouse IgG를 5% BSA 또는 5% 스킴 밀크 TBS-T(0.1% tween20) 용액에 희석 (1:2000 또는 1:10000)하여 상온에서 1시간 실시하고 단백질 발현은 ECL 용액으로 반응시켜 Fuji LAS-4000을 사용하여 확인하였다 (도 12). 도 12는 SP1-HSI 및 미녹시딜 (minoxidil)의 모발주기 조절 인자들의 발현 변화를 분석 비교한 결과이다.
베타-액틴의 세린552 (serine552)의 인산화 (phosphorylation(p-β-catenin Ser552))를 확인한 결과, 음성대조군에 비해 SP1-HSI를 처리한 군의 포스포-베타-액틴 (p-β-catenin)의 발현이 크게 증가한 것을 확인할 수 있으며, 양성대조군인 미녹시딜을 처리한 군과도 비슷하게 인산화가 일어난 것으로 확인하였다. 베타-액틴의 하향 스트림 (down stream)에 있는 p-Akt와 p-Erk1/2의 발현 또한 대조군과 비교하여 SP1-HSI 처리 시 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 미녹시딜에 준하는 발현량을 관찰할 수 있었다. Erk1/2의 인산화 (p-Erk 1/2)를 최종 확인함으로써, SP1-HSI 처리시, 인간 모유두 세포의 인산화 반응이 증가하는 것을 유추할 수 있었다.
SP1-HSI가 세포 증식을 증가시키는 것을 베타-액틴 시그널 (β-catenin signaling)을 통해 확인하였는데, 세포주기마커의 발현변화를 확인함으로써, SP1- HSI가 세포주기 진행에 직접적인 영향을 미치는지 한 번 더 확인하였다 (도 13). 도 13은 SP1-HSI 및 미녹시딜 (minoxidil)이 세포주기 (cell cycle)에 미치는 영향을 비교한 결과이다.
세포주기가 진행될 때 G1기와 S기 사이에 인산화되는 Rb 단백질의 발현을 확인한 결과, SP1-HSI처리 시 Rb(ser807/811)의 인산화(p-RB 807/811)가 현저히 증가됨을 확인할 수 있었으며, G1기와 S기에 발현이 증가하는 또 다른 마커로서 CDK4/cyclinD1의 발현 또한 증가됨을 관찰하였고, 양성대조군인 미녹시딜과 비슷하게 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 세포 수준에서 SP1-HSI는 미녹시딜과 비슷한 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
[
실시예
5: 세포투과성
펩타이드
-
FGF2
혼합물의 피부 투과 분석]
DDBD처럼 작은 분자량의 펩타이드 뿐만 아니라, 분자량이 큰 단백질을 이용하여 피부투과를 통한 생리활성이 증대됨을 확인하고자, FGF2 (Fibroblast growth factor-2, 염기성섬유아세포성장인자)를 이용하였다. FGF2는 피부를 구성하는 각질형성세포와 섬유아세포를 자극하여 피부의 재생과 건강한 피부 상태로 회복시켜준다고 알려져 있으나, 고분자 친수성 물질이기 때문에 피부 내 투과가 어렵다.
조직 염색을 통한 FGF2의 피부 투과성 분석을 위해서, 돼지 피부 (Porcine skin)를 이용한 프란츠셀 (Franz cell)에 동일한 양 (500 ㎍)의 FGF2와 PEP1-FGF2를 처리하였다. 24시간 뒤에 프란츠셀 사이에 있는 돼지피부를 꺼내어 증류수에 세척한 뒤, 조직염색과정을 진행하였다. 도너 세포 (Donor cell)에 노출된 돼지피부 부위를 절단한 뒤에 10% 버퍼리드 포르말린 (buffered formalin)에서 고정시킨 뒤 파라핀 블록 (paraffin block)을 제조하였으며, 마이크로톰 (Microtome)을 이용하여 7 μm로 조직을 구분 (section)하였다. 그 후, 슬라이드 위에 조직을 마운팅 (mounting)한 다음 파라핀을 제거하고, 수화과정을 거친 후 조직 절편을 30분간 블락킹 (blocking)하였다. 블락킹이 끝난 조직에 anti-FGF2 antibody (Cell signaling, green)를 처리하여 4℃에서 18시간 반응시켰다. 다음날, PBST로 씻어준 다음 Alexa Fluor 488 2차 항체를 상온에서 2시간 처리하고, PBST로 다시 한번 씻어주었다. 이후, 조직 절편은 PBS에 1/5000으로 희석된 핵 염색 시약 (DAPI)을 넣고, 빛이 차단된 상태에서 10분간 염색한 후 PBS로 3회 세척하였다. 마운팅 한 뒤, 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여 분석하였다 (도 14). 도 14는 PEP1-FGF2와 FITC-DDBD 혼합물의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
실험 결과, FGF2는 돼지 피부 조직 내로 전혀 전달되지 않음에 반해, PEP1-FGF2는 효율적인 피부 전달 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.
[실시예 6: 세포 및 피부 투과성 GFP 단백질의 세포 투과 분석]
본 실시예에서는 이러한 융합 단백질이 얼마나 세포 및 피부에 전달될 수 있는지의 전달 능력을 용이하게 분석하기 위하여, 전달하고자 하는 목적 단백질 (cargo)로서 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescence Protein, GFP)을 선택하였다.
본 실험예에서는 상기 실험예에서 정제된 일반 GFP 단백질과 세포투과성 PEP1 펩타이드에 GFP 가 연결된 재조합 단백질의 세포 투과 능력을 비교하고자, 사람유래피부각질세포 (HaCaT cells)에서 GFP 녹색 형광을 이용한 세포 내 투과를 관찰하였다.
사람유래피부각질세포는 배양용 슬라이드에서 24시간동안 배양하였다. 그 후, 배양 배지를 제거 한 후 HBSS로 3회 세척 후 GFP 및 세포투과성 GFP 단백질 (PEP1-GFP)을 세포에 처리하였다. 세포에 처리 시, 각각의 단백질의 농도가 10 mM이 되도록 스톡 (stock)을 만들어 배지에 1/10로 희석하여 최종 10 uM이 되도록 처리한 후, 2시간 동안 배양하였다. 2시간 뒤, 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세포를 세척한 후 냉각 메탄올을 이용하여 10분간 -20℃에서 세포를 고정하였다. 세포는 PBS로 충분히 세척한 뒤, PBS에 1/5000로 희석된 핵 염색 시약 (DAPI)을 넣고 빛이 차단된 상태에서 10분간 염색시켰다. PBS로 충분히 세척하고, 마운팅 한 뒤 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여 분석하였다 (도 15). 도 15는 PEP1-GFP와 GFP 단백질의 세포 투과력을 비교한 결과이다.
실험 결과, PEP1-GFP 단백질 처리 그룹의 세포 내 녹색 형광이 더 밝게 보이는 것으로 보아, 세포 내 투과 효과를 크게 향상시켜줌을 알 수 있었다.
[실시예 7: 세포 및 피부 투과성 GFP 단백질의 피부 투과 분석]
세포뿐만 아니라 피부에서도 PEP1 펩타이드에 의해 GFP 단백질의 투과가 향상되는지 알아보기 위해, 프란츠 셀 (Franz cell, 직경 9 mm)을 이용하였다.
셀의 상단과 하단 사이에 돼지 피부 (0.7 mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 그 상단에 50 uM GFP 단백질을 300 ul 처리하였다. 24시간 후, 돼지 피부를 빼낸 뒤 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 크라이오 몰드 (cryo mold)에 OCT 임베딩된 매트릭스 (Cell Path Ltd., UK)를 처리하여 조직을 -70 °C에서 동결하였다. 동결 조직은 cryotome (HM520, Germany)을 이용하여 -20 °C에서 7 μm의 두께로 크로스 섹션 (cross-section)하여 절편 슬라이드를 제작하였다. 피부 세포의 핵을 염색하기 위하여 슬라이드 글라스에 고정시킨 조직 절편은 PBS에 1/5000으로 희석된 핵 염색 시약 (DAPI)를 넣고, 빛이 차단된 상태에서 10분간 염색한 후 PBS로 3회 세척하였다. 마운팅 한 뒤 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여 분석 하였다 (도 16). 도 16은 PEP1-GFP와 GFP 단백질의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
실험 결과, GFP는 돼지 피부 조직 내로 전혀 전달되지 않음에 반해, PEP1-GFP는 피부 내로 효율적으로 전달이 가능함을 확인할 수 있었다.
[실시예 8: 세포투과성 펩타이드-FITC 혼합물의 피부 투과 분석]
피부에서 PEP1 펩타이드와 비공유 결합 상태에서 FITC의 투과가 향상되는지 알아보기 위해, 프란츠 셀 (Franz cell, 직경 9 mm)을 이용하였다.
FITC와 세포투과성 펩타이드 (PEP1)를 붕사 버퍼 (borax buffer(pH 8.0))에 녹여 준비하였다. FITC와 PEP1을 최종 100 uM 몰 비에 따라 처리하고자 하는 농도로 만들어주었다. 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 프란츠 셀 상단에 200 ul 처리하였다. 24시간 후, 돼지 피부를 빼낸 뒤 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 크라이오 몰드에 OCT 임베딩된 매트릭스 (Cell Path Ltd., UK)를 처리하여 조직을 -70 °C에서 동결하였다. 동결 조직은 cryotome(HM520, Germany)을 이용하여 -20 °C에서 7 μm의 두께로 크로스섹션하여 절편 슬라이드를 제작하였다. 피부세포의 핵을 염색하기 위하여, 슬라이드 글라스에 고정시킨 조직 절편은 PBS에 1/5000으로 희석된 핵 염색 시약 (DAPI)를 넣고, 빛이 차단된 상태에서 10 분간 염색한 후 PBS로 3회 세척하였다. 마운팅 한 뒤 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 이용하여 분석하였다 (도 17). 도 17은 세포투과성 펩타이드-FITC 혼합물의 피부 투과력을 비교한 결과이다.
실험 결과, FITC는 돼지 피부 각질층에만 있는 반면, 본 발명의 PEP1-FITC 혼합물은 피부 내로 효율 적으로 전달이 가능함을 확인할 수 있었다.
[실시예 9: 세포투과성 단백질 조성물인 SP1-HSI의 인체피부모델(인공피부)을 이용한 피부 자극 시험 (피부 안전성 실험)]
세포투과성 단백질 조성물인 SP1-HSI을 인체피부모델(인공피부)에 처리하였을 시, 피부자극 반응을 평가하기 위하여, DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, Gibco)를 음성대조물질로, 이미 피부자극을 갖는 물질로 알려진 5 % SDS (Sodium dodecyl sulfate, Sigma-Aldrich)를 양성대조물질로 하여 시험물질과 함께 인체피부모델(인공피부)에 처리하였다. 양성대조물질 SDS는 수용성이므로 DPBS에 5% 농도로 용해하여 사용하였으며, 피부에서 PEP1 펩타이드와 비공유 결합 상태에서 FITC의 투과가 향상되는지를 알아보기 위해, 프란츠 셀 (Franz cell, 직경 9 mm)을 이용하였다.
인공피부 입수 시 확인한 외관상태 및 보관상태와 제공받은 CoA (Certificate of Analysis) 상의 생존율 (음성대조군 처리 시 세포생존율), 장벽 기능 (기준물질인 Triton X-100을 1% 처리 시, 세포생존율을 50%까지 감소시키는데 필요한 노출 시간, 조직학적 형태 (다층의 각질층을 포함한 인체 표피와 유사한 구조)가 허용범위를 만족하여 본 시험의 인공피부로 활용하였다 (도 18). 도 18은 인공피부의 기능적인 조건 확인 결과이다.
(1) SP1-HSI의 MTT 환원 가능성 확인
MTT 시험법은 색도 측정을 기반으로 하기 때문에 시험물질을 조직에 처리하기에 앞서 시험물질 (SP1-HSI)을 MTT 혼합액과 반응시켜 SP1-HSI와 MTT 혼합액간의 비특이적인 반응여부를 파악하였다.
1 mg/ml 농도의 MTT 혼합액 300 μl로 24 well plate의 각 well을 채운 후, SP1-HSI을 넣고 혼합하였다. 이때 음성대조군으로 증류수를 사용하였다. 음성대조군으로 PBS가 아닌 증류수를 사용하는 이유는 PBS에 포함된 성분들이 MTT의 환원을 일으킬 가능성을 배제하기 위함이다. 이후, 37℃ 조건의 배양기에서 3시간 (±5분) 동안 차광상태로 반응시킨 뒤, MTT 반응을 육안 판정하였다.
실험결과, 육안 관찰 시 MTT 혼합액의 색이 음성대조군과 다른 색을 띠지 않았으므로, 시험물질 (SP1-HSI)이 MTT와 반응하지 않는 것으로 확인되었다.
(2) MTT 시험법을 이용한 피부자극 측정
MTT 시험법은 검증된 정량법으로 본 실험에서 인공피부의 생존율을 측정하는데 이용되며 이 방법은 3차원 조직 구조에서 사용하기에 적합하다. 인공피부를 MTT 혼합액에 3시간 동안 놓아두면 생존한 조직은 MTT를 청색의 포르마잔 (Formazan)으로 바꾼다. 이후, 석출된 청색의 포르마잔 생성물을 이소프로판올 (Daejung chemicals, CAS No. 67-63-0)을 이용하여 추출하였다. 포마르잔의 농도는 570 nm 파장에서의 흡광도 값으로 정하였다.
인공피부와 배양액을 실험실로 입고하고 외관점검을 통해 이상 여부를 판단한 뒤 이상이 없어 70% 에탄올을 분무하여 멸균처리하였고 클린벤치 내에서 외부 포장을 제거하였다. 6 well plate에 입고한 인공피부의 수량과 동일한 수의 well을 라벨링하고 배양액 (growth medium) 1 ml을 미리 채워두었다. well은 A1부터 오늘쪽 방향으로 사용하였다 (도 19). 도 19는 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위한 6-well 인공피부 라벨링이다.
입고 시, 아가로스 겔 (Agarose gel)로 고정된 상태의 인공피부를 핀셋으로 조심스럽게 들어올리고 용기에 남아 있는 아가로스 겔을 종이타올 등을 이용해 제거한 후, 상기 준비된 6 well plat (도 19)의 각 well로 인공피부를 옮기고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 시험물질 처리 전까지 사전 배양하였다.
배양액 (Maintenance Medium)을 채운 새로운 24 well plate를 준비하였다. 이때 음성대조군, 양성대조군, 시험물질을 각각 3개의 인공피부에 처리하므로 (three replicate) A1~A3은 음성대조군용 (DPBS)으로, B1~B3은 양성대조군 (5% SDS)용으로, C1~C3은 시험물질 (SP1-HSI)용으로 배정하여 라벨링하며 A~C행의 4~6번 well과 D행의 1~6번 well은 사용하지 않았다 (도 20). 도 20은 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위해 배양액을 채운 24-well 인공피부 라벨링이다.
새롭게 준비한 24 well plate의 각 well에 인공피부를 옮기고 음성대조군, 양성대조군 및 시험물질 16±0.5 μl를 상온에서 42분간 처리하였다. 시험물질 분취 및 처리시에는 나일론 메쉬 (nylon mesh)를 함께 처리하여 시험물질이 인공피부에 고르게 도포될 수 있도록 하였다. 시험물질을 42분 동안 처리한 후, 조직별로 25 ml의 DPBS를 이용하여 인공피부 용기 내부를 채우고 비우는 방법으로 인공피부를 세척하였다.
6 well plate에 시험물질 처리 후, 사후배양이 필요한 인공피부와 동일한 수의 well을 라벨링하고 배양액 (growth medium) 2 ml를 미리 채워두었다. well은 A1부터 오른쪽 방향으로 사용하였다 (도 21). 도 21은 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행하기 위해, SP1-HSI처리 후 사후배양에 필요한 6-well 인공피부 라벨링이다.
배양액을 채워둔 6 well plate의 각 well에 세척한 인공피부를 옮겨 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 42시간 동안 배양하였다. 새로운 24 well plate에 300 μl의 MTT 용액을 채워 준비하고 각 well에 인공피부를 옮긴 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 3시간 동안 배양하여 포마르잔 생성을 유도하였다.
새로운 24 well plate에 800 μl의 이소프로판올 (isopropanol)을 채워 준비하고 각 well에 인공피부를 옮긴 후, 조직용기 내부에 700 μl의 이소프로판올을 채웠다. 그 후, 실링필름 (sealing film)으로 봉인하고 150 rpm으로 설정한 플레이트 믹서 (SHO-1D, 대한과학, EE-C-10)를 이용하여 실온에서 2시간 동안 포마르잔을 추출하였다.
새로운 96 well plate의 A2~A7의 6개 well에 이소프로판올을 200 μl씩 넣어 blank로 사용하였다 (6회 반복검증). 핀셋을 이용하여 조직용기를 들어올리고, 팁을 이용하여 인공피부와 인공피부 용기의 바닥을 뚫어주었다. 포마르잔 결정을 완전히 녹이고 균질화하기 위해 3회 이상 파이펫팅하였다.
추출된 용액 200 μl씩을 각 3개의 well에 옮겼다 (한개의 조직당 3개의 well을 할당하고, 매 조직마다 3회 반복검증. 총 9개 well). 음성대조군은 B2~B10에, 양성대조군은 C2~C10에, 시험물질은 D2~D10에 각각 분주하였다 (도 22). 도 22는 인체피부모델인 인공피부를 이용한 피부자극시험 절차를 수행한 플레이트 (Plate) 모식도이다 (BLK=blank, isopropanol/ NC=negative control, 음성대조군/ PC= positive control,양성대조군).
96 well plate를 microplate reader (Epoch, BioT다 EE-A-01)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 양성대조군, 시험물질의 흡광도를 음성대조군과 비교하여 평균 생존율을 계산한 후, 피부자극 정도를 판단하였다.
데이터 허용범위는 음성대조군의 3개 인체피부모델(인공피부)의 흡광도 평균값은 0.8에서 3.0 범위여야 하며 인체피부모델(인공피부) 간 표준편차는 18% 이하여야 한다. 양성대조군의 흡광도 평균값은 음성대조군의 40% 미만이어야 하며 인체피부모델(인공피부) 간 표준편차는 18% 이하여야 한다.
음성대조군인 DPBS를 처리한 인체피부모델(인공피부)의 흡광도 (ODNCraw)와 양성대조군인 SDS를 처리한 인체피부모델(인공피부)의 흡광도 (ODPCraw), 시험물질을 처리한 인체피부모델(인공피부)의 흡광도 (ODTTraw)를 이소프로판올의 흡광도 (ODblank)로 보정한 ODNC (ODNC= ODNCraw - ODblank), ODPC (ODPC= ODPCraw - ODblank), ODTT (ODTT= ODTTraw - ODblank)의 평균값을 계산하였다.
또한, 음성대조군의 생존율을 100%로 하여 양성대조군과 SP1-HSI의 생존율을 계산하였다. 인공피부를 착색시키지 않고 MTT와 반응하지 않는 시험물질이므로 화학적 착색에 의한 비특이적 착색 (NSS1%) 및 MTT 대사변환 참값 (TODCT2), 비특이적 MTT 환원 (NSMTT3%) 및 MTT 대사변환 참값 (TODTT4), 착색 시험물질이 처리된 MTT 대사변환 참값인 TODCTT5와 이에 따른 상대생존율은 계산하지 않았다.
시험물질의 자극 가능성은 UN GHS와 EU CLP (Category 2: irritant of "No category"; UN, 2009; EU, 2008)에 따라서 결정하였다. 본 시험에서 시험물질의 자극 가능성은 시험물질이 처리된 조직의 세포생존율 평균 및 표준편차를 구하고 통계학적 방법은 사용하지 않았다.
또한, 음성대조군의 세포생존율 평균을 조직이 100% 생존했을 때의 값으로 전제하여 각 시험물질의 세포생존율 평균을 계산하였다. 세포생존율이 50%보다 작거나 같은 경우, 시험물질이 피부에 자극을 일으킨다고 판단하였다 (표 2).
[표 2]
자극 척도의 예측 정의표
실험결과, SP1-HSI는 횐색파우더 형태로 SP1-HSI로 인해 인공피부의 비특이적 착색의 가능성이 없는 것으로 나타났다. 또한, SP1-HSI 처리 및 세척, 사후배양 42시간 후 MTT 시험법을 이용하여 측정한 흡광도 및 세포 생존율을 측정한 결과, 114.988%의 세포생존율을 나타냈다 (표 3).
[표 3]
시험물질 (SP1-HSI)을 처리한 인체피부모델(인공피부)의 흡광도 및 세포생존율
결론적으로. 인체피부모델인 인공피부에 본 발명의 SP1-HSI를 처리한 후, MTT 시험법을 이용하여 세포생존율을 측정한 결과, 114.988%의 세포생존율을 나타내는 것으로 보아, SP1-HSI는 자극 척도 예측 결과에 따라, 비자극 물질임을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에서 개발한 피부투과성 단백질 조성물은 미녹시딜보다 모유두 세포에서의 증식 효과가 뛰어나고, 피부 투과성이 우수한 피부투과성 단백질 조성물로써, 발모 촉진 효과를 가지는 탈모방지용 화장품 조성물 및 약학 조성물로써 유용하게 이용될 수 있는 가능성을 가진다 할 것이다.
<110> BioCeltran
<120> Novel transdermal protein composition for preventing hair loss
and promoting hair growth and the use thereof
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<170> KoPatentIn 3.0
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<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Pro Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val
1 5 10 15
Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu Leu
20 25 30
Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro
35 40 45
Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln
50 55 60
Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe
85 90 95
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100 105 110
Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
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Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser
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100 105
Claims (8)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자9 (Fibroblast Growth Factor, FGF9)가 결합된 재조합 단백질;
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 섬유아세포 성장인자 (Basic Fibroblast Growth Factor, FGF2)가 결합된 재조합 단백질;
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 결합된 재조합 단백질; 및
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PEP-1 펩타이드와 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 티오레독신 (Thioredoxin1, TRX1)이 결합된 재조합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부투과성 단백질 조성물.
- 삭제
- 제1항의 피부투과성 단백질 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 피부투과성 단백질 조성물은,
ATP-민감성 칼륨이온 채널 오프너 (ATP-sensitive K+-channel opener)로 작용하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 피부투과성 단백질 조성물은,
PGE2 생성능이 있는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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| KR20140018624A (ko) * | 2012-08-02 | 2014-02-13 | (주)애드바이오텍 | 모발 생장 촉진용 조성물 |
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2017
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Patent Citations (2)
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| Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol.80(3):584-590(2016) * |
| 대한민국 공개특허 제10-2014-0122380호 (공개일자: 2014.10.20)에는, "TCTP-PTD를 포함하는 유전자 전달체"가 기재되어 있다. |
| 대한민국 등록특허 제10-15582220000호 (등록일자: 2015.10.01)에는, 사이클로필린 A (CypA) 단백질, CypA 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 CypA 단백질 발현 재조합 벡터를 포함하는 탈모 방지 및 발모 개선용 조성물"이 기재되어 있다. |
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