KR102533223B1 - 아토피 피부염 개선 또는 예방용 펩타이드 및 이를 포함하는 경피 흡수가 개선된 화장료 조성물 - Google Patents

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Abstract

아토피 피부염 개선 또는 예방 효과를 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 경피흡수 개선용 리포좀 화장료 조성물이 개시된다. 일실시예에 따른 펩타이드는 기존의 펩타이드 대비 우수한 항염 활성을 나타내며, 일실시예에 따른 화장료 조성물은 우수한 안정성과 경피 흡수 개선 효과를 나타낸다.

Description

아토피 피부염 개선 또는 예방용 펩타이드 및 이를 포함하는 경피 흡수가 개선된 화장료 조성물{Peptide for improving or preventing atopic dermatitis and cosmetic composition with improved percutaneous absorption comprising the same}
아래 실시예들은 아토피 피부염 개선 또는 예방용 펩타이드 및 이를 포함하는 경피 흡수가 개선된 화장료 조성물 기술에 관한 것이다.
아토피성 피부염(Atopic dermatitis)은 전 세계적으로 널리 분포하는 질환이며 5세 이하의 모든 어린이 중 3~5%가 이 질환을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다.
대개 아토피성 피부염은 영,유아기, 특히 생후 2개월 전후에 시작되는데 이 중 90% 이상이 5세 전에 아토피성 피부염 증상을 보이며, 이는 유전인자와 환경인자가 관여하여 발병하는 면역성질환이다.
아토피성 피부염은 만성적으로 건조하며 소양감이 심하고 반복적으로 재발되며 각종 자극에 의해 쉽게 피부염이 유발된다. 많은 경우에는 1~2주 간격으로 반복적으로 악화되며 적절한 관리를 하지 않으면 삼출을 동반한 홍반성 발진의 아급성 병변, 가죽과 같이 두꺼워진 태선화(lichennification)의 만성병변으로 진행된다.
아토피성 피부염에 대하여 병리학적 검사에서의 소견(조직검사 소견)은 병변의 단계에 따라 다르지만 대체로 만성이 되면 표피가 두꺼워지고 여러 면역반응에 관여하는 세포의 침윤이 관찰된다. 특히 면역 반응을 담당하는 비장 세포(splenocyte)가 증가되어 있으며, 비정상적으로 증가된 항원제시 능력을 가진다. 또한, 아토피성 피부염에 의해 비만세포의 수는 증가되므로 탈과립상태(degranulation)를 나타낸다.
아토피성 피부염 환자의 80~90%는 혈청 면역글로불린E(Immunoglobulin E)가 증가되는데, 알러지성 비염이나 천식 같은 호흡기 아토피가 동반되어 있는 경우에는 특히 혈청 면역글로불린E(Immunoglobulin E)의 수치가 높게 나타난다.
또한, 약 87% 아토피성 피부염 환자에서 피부반응검사 혹은 RAST(radioallergosorbent test) 검사에서 여러 가지 음식과 흡입 알러젠(allergen)에 대한 특이 면역글로불린E가 양성으로 관찰되어지며, 만약 혈청 면역글로불린E가 증가된 경우, 아토피성 피부염과 같은 알러지성 질환일 가능성이 높은 것으로 진단된다.
최근에 이와 같은 여러 종류의 알러지성 질환의 증가로 이에 대한 연구가 활발히 진행되어 급진적인 면역학의 발전으로 알러지성 질환의 원인 규명 및 치료를 위한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 그 중요성에 비하여 아직까지 충분히 알러지성 질환을 치료할 수 있는 약물의 개발이 미비한 실정이다.
특히, 현재까지 아토피성 피부염에는 면역요법과 약물요법이 시행되고 있으나 그 원인을 아직 확실히 규명하지 못하고 있으며, 특별한 치료제가 없어 증상이 심각한 경우 스테로이드제제(부신피질호르몬제)를 사용하지만 단기간의 임상 증상 완화에만 효과가 있고, 다시 수일 내에 증상이 유발되는 정도의 효과가 대부분이다. 스테로이드제제의 국소적 투여가 장기간 계속되면 부신 기능의 저하를 초래하여 여러 가지 부신피질호르몬제에 의한 부작용이 나타나게 되어 계속적으로 사용하기에 부적절한 치료방법이다.
아토피성 피부염 환자를 위한 적절한 치료제가 없으므로 많은 경우에서 체질개선과 민간요법, 한방치료에 의존하여 임상증상의 완화와 치료효과를 기대하고 있으나 아직까지 장기적으로 부작용이 없이 사용할 수 있는 치료제가 개발되지 못하고 있는 실정이다.
이에, 새로운 아토피성 피부염 치료제의 개발이 필요하며, 관련 선행기술로는 한국공개특허 제10-2013-0013693(창포 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 예방 및 개선용 외용 조성물)과 한국등록특허 제10-1056475호(산초유를 함유하는 아토피성 피부 개선용 화장품 조성물)에 관한 것이 공지되어 있다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 우수한 아토피 피부염 개선 또는 예방용 펩타이드를 개발하였고, 이를 포함하는 우수한 경피 흡수용 리포좀 화장료 조성물을 개발하고 우수한 효과를 확인하여 발명을 완성하였다.
하나의 과제로서 본원은 피부 항염 활성이 우수한 펩타이드로서 아토피 피부염 개선 또는 예방에 적합한 펩타이드를 제공하고자 한다. 다른 하나의 과제로서 본원은 상기 펩타이드를 포함하며 안정성이 높고 경피흡수가 개선된 리포좀 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 유효성분을 0.5 내지 5.0 중량% 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 유효성분, 인지질, 및 세라마이드를 포함하는 유상과 올레산, 아미노산, 및 아데노신을 포함하는 수상의 혼합을 통해 리포좀이 형성된 제형일 수 있다. 상기 아미노산은 히스티딘 또는 라이신을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 수상은 정제수, EDTA을 추가로 포함하며, 상기 유상은 에탄올, 글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 스테아르산, 및 디부틸하이드록시톨루엔을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 EDTA는 0.03 내지 0.07 중량부, 상기 올레산은 0.1 내지 0.4 중량부, 상기 아미노산은 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 아데노신은 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 에탄올은 8 내지 12 중량부, 상기 글리세린은 25 내지 35 중량부, 상기 1,3-부틸렌 글리콜은 8 내지 12 중량부, 상기 유효성분은 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 인지질은 2.5 내지 3.5 중량부, 상기 세라마이드는 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 스테아르산은 0.2 내지 0.4 중량부, 상기 디부틸하이드록시톨루엔은 0.03 내지 0.07 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
일실시예에 따른 장치는 하드웨어와 결합되어 상술한 방법들 중 어느 하나의 항의 방법을 실행시키기 위하여 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램에 의해 제어될 수 있다.
실시예에 따른 펩타이드는 피부염 예방 또는 개선 활성이 우수하다. 상기 펩타이드를 포함하는 리포좀 화장료 조성물인 처방예는 보관 안정성이 높고 경피흡수가 개선된 결과를 나타낸다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예들에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 실시예들은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.
제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이런 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 도시된 것이며, 본 발명이 도시된 구성의 크기 및 두께에 반드시 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본원에 따른 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물 또는 외용제는 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물 또는 외용제는 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다
상기 화장료 조성물 또는 외용제가 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물 또는 외용제가 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물 또는 외용제가 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 펩타이드는 화장료 조성물 대신 약용 피부 외용제로도 사용가능하며, 이 경우 아토피 피부염 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제는 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.
본원에 따른 리포좀 화장료 조성물은 수상 및 유상의 혼합과 교반에 의해 나노 리포좀의 현탁액으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 수상을 먼저 혼합하여 70 내지 90℃의 온도로 가온하여 2,500 내지 3,500rpm으로 5 내지 30분 교반하여 냉각한 후, 유상을 혼합하여 실온에서 2,500 내지 3,500rpm으로 5 내지 30분 교반한 후, 이후 수상과 유상을 혼합한 후 500 내지 1,500 rpm으로 5 내지 30분 교반한 후, 상기 혼합액을 Microfluidizer (MF)를 이용하여 800 내지 1,200bar에서 3회 이상 순환하여 나노리포좀의 현탁액으로 제조될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예: 펩타이드의 제조
9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하는 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 이용하여 펩타이드를 합성하였다. N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N,N-디아이소프로필카보 디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다[참고문헌 : Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc-solid phase peptide synthesis', Oxford].
합성된 펩타이드를 C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters Associates, USA)를 이용하여 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 μM, Waters Co, USA)을 이용하였다.
상기 방법에 따라 합성된 펩타이드는 하기 표 1과 같다.
구분 서열 비고
실시예 AFPGHYPSCV 서열번호 1
한편, 비교예로서 공지된 서열번호 2 (AFPG)의 펩타이드를 사용하였다.
실험예 1: 항염 효과
인간의 표피 케라티노사이트 세포를 이용하여 실시예 및 비교예의 항염 효과를 실험하였다. 피부의 만성적인 염증과 여러 암 생성과의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 케라티노사이트는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다.
본 실험은 피부 표피 케라티노사이트(human keratinocyte, HaCaT) 세포주와 UVB 램프를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의해 발현하는 대표적인 싸이토카인인 Interleukin-1a(IL-1a), Interleukin-1b(IL-1b)와 Interleukin 6(IL-6) mRNA 발현양을 평가함으로써 펩타이드의 염증 억제 효과를 확인하였다.
(1) 세포주 및 세포배양
실험에 사용된 세포주는 Human Keratinocyte의 일종인 HaCaT 세포를 사용하였다 HaCaT 세포는 37°C, 5% CO2의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). HaCaT 세포는 100 cm2플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃5% CO2의 조건에서 계대배양하였다.
(2) UVB 자극에 의한 피부 염증 관련 유전자의 mRNA 억제효능
Human Keratinocyte (HaCaT)세포를 6*105cells/well 농도로 60mm 접시에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃5% CO2의 조건에서 24 시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 항염효능 시료를 농도 별로 만들어 4시간 전처리 하였다.. 각 well plate에 PBS 3㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 100mJ/cm2 UVB를 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1ββInterleukin 6(IL-6) mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1ββInterleukin 6(IL-6)의 primer sequence는 표7과 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 56℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에 로딩하여 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. Densitometer로 수치화한 mRNA량은 gapdh수치로 나누어 정량 하였다.
유전자 이름 Forward primer (5'→3')
Reverse primer (5'→3')
IL-1α CTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC CTA GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C
IL-1β TGG AGA ACA CCA CTT GTT GCT CCA AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC CAG G
IL-6 GCC TTC GGT CCA GTT GCC TT GCA GAA TGA GAT GAG TTG TC
GAPDH CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG
[표 2]에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 다음 표 3에 기재하였다.
IL-1α IL-1β IL-6
실시예 1ppm 67% 79% 74%
실시예 2ppm 75% 86% 89%
비교예 1ppm 38% 47% 34%
비교예 2ppm 45% 61% 45%
상기와 같이 실험한 결과 실시예 및 비교예 모두 농도의존적으로 염증을 완화시켰으나, 실시예에서 보다 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
처방예 1 내지 4: 리포좀 화장료 조성물의 제조
본 발명의 실시예가 화장료 조성물로서 경피 흡수가 잘되며 안정적인 처방예를 구현하고자 리포좀 화장료 조성물을 제조하였다. 표 5와 같은 조성의 수상을 혼합한 후 80℃로 가온하여10분간 교반한 후 (3,000rpm) 냉각하였다. 하기의 표 5의 조성의 유상을 혼합한 후 실온에서 10분간 교반하였다(3,000rpm). 수상과 유상의 혼합하고 20분간 교반하였다(1,500rpm). 상기 혼합액을 Microfluidizer (MF)를 이용하여 1000bar에서 3회 순환하여 나노 리포좀 현탁액을 얻었다. 이후 표 4에 기재된 방부제를 첨가한 후 10분간 교반하였다(500rpm).
성분 (중량%) 처방예 1 처방예 2 처방예 3 처방예 4
수상 정제수 To 100 To 100 To 100 To 100
EDTA-2NA 0.05 0.05 0.05 0.05
올레산 0.2 0.3 0.2 0
아미노산 히스티딘 1 라이신 1 0 히스티딘 1
아데노신 1 1 1 1
유상 에탄올 10 10 10 10
글리세린 30 30 30 30
1,3-부틸렌글리콜 10 10 10 10
실시예 펩타이드 1 1 1 1
인지질 3 3 3 3
세라마이드 1 1 1 1
스테아르산 0.3 0.2 0.3 0.5
MCT oil 3 3 3 3
디부틸하이드록시톨루엔 0.05 0.05 0.05 0.05
방부제 SHD-62(1,2-Hexanediol) 1 1 1 1
실험예 2: 처방예의 입도 분석 및 안정성 시험
본 실험에서 입도분석은 일반 광학현미경으로는 확인되지 않는 나노 사이즈의 다중층 리포좀이 실제 어느 정도의 크기와 입도분포를 갖는지를 확인하기 위하여 광산란(Light scattering)법을 이용한 입도분석기(Particle size analyzer)로서 독일 Sympatec사의 Helos 모델장비를 이용하여 분석하였다. 안정성 시험은 5℃, 25℃, 45℃, 및 cycle로 1개월간 성상의 변화를 확인하였다.
[표 5]에서 육안 관찰한 결과를 광산란법을 이용한 입도분석장비를 이용하여 분석하여 검증하였다. 투명도 : ◎투명), ○반투명), △반투명 - 탁함), × (유백색)
처방예 1 처방예 2 처방예 3 처방예 4
입자 크기(초기) 101nm 113nm 464nm 2534nm
투명도(초기)
입자크키 (45℃1개월) 98nm 157nm 678nm 578nm
투명도
(45℃개월)
◎(
입자크키
(5℃개월)
143nm 163nm 845nm 분리
투명도
(5℃1개월)
입자크키
(Cyc,1개월)
137nm 184nm 913nm 분리
투명도
(Cyc, 1개월)
◎(
입자크키
(25℃1개월)
110nm 121nm 364nm 754nm
투명도
(25℃1개월)
◎(
이상과 같이 처방예 1 내지 3은 입자의 캡슐화가 안정한 반면, 처방예 4에서는 성상이 탁해지는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 처방예 1 내지 3을 대상으로 추가 실험을 진행하였다.
실험예 3: 리포좀의 피부투과 시험
본 발명의 리포좀 현탁액의 경피흡수율을 측정하기 위해, 생체 외 피부흡수시험 가이드라인(식품의약품안전처)을 따라 진행하였다. 생체 외 피부 흡수시험방법은 시험물질이 피부를 통과하는 것을 확인하는 것으로 피부 표면에 시험물질을 도포 혹은 적용하여 일정한 시간 이후 피부 안쪽 용액저장소에 이동한 양을 측정하는 방법으로, 인간 또는 다른 종의 다세포 동물의 피부, 또는 인공피부를 사용할 수 있다. 특히 인공 피부를 사용하는 경우 시험물질에 대하여 반복 측정이 가능하며 실험 동물을 사용하지 않고 노출 조건에 대한 연구가 가능하다. 생체 외 피부흡수시험은 물질의 조성에 따른 피부 흡수와 투과를 비교할 수 있어, 인체 내 피부흡수에 의한 위험성 평가 등에 유용한 모델로 사용할 수 있다.
본 실험예에서는, 밀리포아(미국)사의 경피흡수시험용 인공 Membrane Strat-M을 사용하여, Franz-Diffusion Cell and System (LOGAN사 미국)에 장착하여 실험하였다.  Franz-Diffusion Cell은 비폐색(non-occluded) 조건으로 공여 챔버(donor chamber)를 파라 필름(para film)으로 밀봉하지 않은 상태로 유지하였다.
각 시험물질을 용매와 혼합하여 공여 챔버에 로딩(loading)하고 일정 시간 이후에 멤브레인 및 Reservoir에 있는 액체를 채취하여 펩타이드 성분을 분석하여 시험물질의 피부 투과율을 확인하였다. 또한, 피부에 남아 있는 잔존량을 측정하였다. 처방예 1 내지 3의 100g을 각각 상기 인공피부에 처리하여, 2시간 이후에 피부 투과 정도를 측정하였다. 전체 펩타이드 함량 (1g)을 기준으로 검출된 펩타이드의 중량%로 표시하였다.
처방예 1 처방예 2 처방예 3
피부 5% 7% 35%
멤브레인 21% 13% 5%
Reservoir 25 24% 2%
상기와 같이 처방예 1 및 2를 사용한 경우에는 멤브레인 및 Reservoir로 유의미하게 피부 흡수가 나타난 반면, 처방예 3에서는 피부에 많은 펩타이드가 잔존하고 있는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 처방예 1 및 2가 적합한 제형으로 고안되었다.
<110> HAN, DOSOOK <120> Peptide for improving or preventing atopic dermatitis and cosmetic composition with improved percutaneous absorption comprising the same <130> P22196 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for cosmetic <400> 1 Ala Phe Pro Gly His Tyr Pro Ser Cys Val 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for cosmetic <400> 2 Ala Phe Pro Gly 1 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-1alpha <400> 3 ctctctgaat cagaaatcct tctatc 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-1alpha <400> 4 ctagtcaaat ttcactgctt catcc 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-1beta <400> 5 tggagaacac cacttgttgc tcca 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-1beta <400> 6 aaacagatga agtgctcctt ccagg 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-6 <400> 7 gccttcggtc cagttgcctt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-6 <400> 8 gcagaatgag atgagttgtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of GADPH <400> 9 caaaagggtc atcatctctg 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of GADPH <400> 10 cctgcttcac caccttct 18

Claims (3)

  1. 서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 0.5 내지 5.0 중량% 포함하는, IL-1a, IL-1b 및 IL-6 억제에 의한 아토피 피부염 개선 또는 예방용 화장료 조성물로서,
    상기 화장료 조성물은 상기 유효성분, 인지질, 및 세라마이드를 포함하는 유상과 올레산, 아미노산, 및 아데노신을 포함하는 수상의 혼합을 통해 리포좀이 형성된 제형으로서, 상기 아미노산은 히스티딘 또는 라이신을 포함하는 것인, 아토피 피부염 개선 또는 예방용 화장료 조성물.


  2. 삭제
  3. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20100019632A (ko) * 2008-08-11 2010-02-19 (주)바이오에프디엔씨 신규한 인간 베타 디펜신 유사 항균 펩타이드 및 이의 아토피 피부염 개선 소재로서의 활용
KR20140005110A (ko) * 2012-07-03 2014-01-14 일양약품주식회사 신규한 펩타이드 및 이의 용도
KR20220001541A (ko) * 2020-06-29 2022-01-06 군산대학교산학협력단 전복에서 유래한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 예방, 개선 또는 치료용 조성물

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