KR102533208B1

KR102533208B1 - 노화방지용 펩타이드 및 이를 포함하는 경피 흡수가 개선된 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102533208B1
Application number: KR1020220056120A
Authority: KR
Inventors: 한도숙
Original assignee: 한도숙
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2023-05-15
Anticipated expiration: 2042-05-06

Abstract

노화방지 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 경피흡수 개선용 리포좀 화장료 조성물이 개시된다. 일실시예에 따른 펩타이드는 기존의 펩타이드 대비 우수한 노화방지 활성을 나타내며, 일실시예에 따른 화장료 조성물은 우수한 안정성과 경피 흡수 개선 효과를 나타낸다.

Description

노화방지용 펩타이드 및 이를 포함하는 경피 흡수가 개선된 화장료 조성물{Peptide for wrinkle improvement and cosmetic composition with improved percutaneous absorption comprising the same}

아래 실시예들은 노화방지용 펩타이드 및 이를 포함하는 경피 흡수가 개선된 화장료 조성물 기술에 관한 것이다.

인체의 피부는 신체 외부를 덮고 있는 하나의 막으로, 유해한 환경요소로부터 신체를 보호하는 동시에 외적 미적기능을 담당한다. 이러한 피부는 노화가 진행됨에 따라 피부 면역력이 저하됨과 동시에 피부 탄력 감소, 피부색 변화, 피부주름 형성 등의 외형적인 변형도 수반된다. 피부 노화 과정은 내인성 노화와 외인성 노화로 분류되며 내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 자연적으로 일어나는 자연 노화로, 주로 유전적인 요인으로 나타나는 노화 현상으로서 인위적인 조절이 어렵다. 반면, 외인성 노화의 경우 자외선과 같은 환경적 요인에 의해 영향을 받는 노화 현상으로 인위적인 조절을 통한 예방이 가능하다. 따라서 외인성 노화를 중심으로 피부노화 방지 및 피부 주름 예방을 위한 기능성 소재 발굴 연구가 활발히 이루어지고 있다.

외인성 노화를 일으키는 환경적 요인에는 자외선 노출, 대기오염, 스트레스 등이 있으며, 이러한 유해환경에 계속하여 노출이 되면 체내의 활성산소(oxygen free radical)가 증가되고, 진피의 결합 조직인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 등이 파괴되어 주름이 생성된다. 특히, 외인성 노화를 일으키는 다양한 요인들 중 가장 높은 비중을 차지하는 요인은 반복적인 자외선의 노출이다. 자외선(UV)은 320∼400nm 파장의 자외선 A(UVA)와 290∼320nm 파장의 자외선 B(UVB), 200∼290nm파장의 자외선 C(UVC)로 분류되며, 이 중 자외선 B(UVB)가 피부에 가장 많은 영향을 주어 광노화를 일으키는 외인성 노화의 주된 요인으로 보고되고 있다.

콜라겐은 피부의 진피를 구성하고 있는 주요한 성분으로 이 중 typeⅠ콜라겐이 전체의 80% 차지하고 있다. 자외선에 피부가 장시간 노출될 경우 피부 내 활성산소가 다량 생성되고, 이로 인하여 콜라겐 합성이 저하되거나 분해가 되는 현상이 일어나, 결국 피부 탄력이 감소하고 주름이 생성된다. 따라서, 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 및 치료를 위한 신소재를 발굴하는데 있어 콜라겐 합성을 촉진시키는 물질을 찾는 것이 좋은 전략이 될 수 있다.

현재 피부 노화 예방 및 치료제로 주로 사용되고 있는 레티노인산은 지용성의 물성으로 인하여 피부 흡수력이 낮은 단점으로 인하여, 진피 내 콜라겐 합성의 증진기능 효과를 크게 기대하기 어렵고 피부 자극성이 있으며, 또한 생체 내에서의 빠른 효소분해로 인한 안전성 및 안정성 문제가 대두되고 있다. 따라서 외피로부터의 흡수력이 우수하며 생체 내에서의 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 기능이 극대화되고, 피부 안전성이 향상된 새로운 피부 노화 방지 및 예방 소재의 개발이 요구되고 있다.

최근에는 피부 노화 방지 및 피부 주름 예방 기능성 성분으로 펩타이드가 주목받고 있다. 펩타이드는 화장품, 식료품, 의약품 등 여러 연구영역에서 주목받는 소재로서, 20개의 필수 아미노산 중 약 2∼50개가 아미드 결합(amide bond)을 통해 연결되어 있는 중합체이다. 펩타이드는 단백질보다 그 크기와 구조는 단순하나 생체 내 단백질과의 상호작용이 매우 커 생체 내 대사과정 등에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, 펩타이드는 그 자체가 생체내 존재하는 물질일 뿐만 아니라 생체 내에 유입되어도 일정 기간 활성을 띈 다음 아미노산으로 분해되기 때문에 기존의 다른 소재보다 안전성이 매우 뛰어나며 단백질의 구성 성분으로서 피부 재생 활성에도 도움을 주는 소재이다.

한편, 세포막은 인지질이 주성분으로 되어 있어 세포막보다 크기가 큰 물질의 제한을 받고 있는데, 최근 세포막 구멍보다 큰 HIV 바이러스가 세포막을 급격하게 투과할 수 있는 것은 HIV 바이러스가 약물전달용 펩티드(Trans Activating Transcription, Tat-Peptide)를 만들어내어 세포막을 투과하는 것을 응용하는 노력이 진행되고 있다. Tat-Peptide는 86개의 아미노산으로 구성되어 있고 약물전달을 나타내는 핵심 아미노산 배열은 47번~57번 아미노산인 [YGRKKRRQRRR이다. 이중 양이온 성질을 갖는 아르기닌(Arg)가 6개가 가장 큰 핵심 아미노산으로 알려져 있다.

피부의 구조는 표피, 진피, 피하지방으로 구분되며, 표피는 바깥쪽부터 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 지저층으로 구분됨. 죽은 세포로 구성된 각질층은 두께가 약 15μm에 불과하지만 납작하고 케라틴화된 세포층 15~30개가 쌓여 있고 밀도가 1.4 g/cm²이어서 약물의 피부투과에 대한 속도결정 단계에 작용한다고 알려져 있다. 반면 각질층의 밑에 존재하는 표피층과 진피로의 약물확산은 각질층에 비하여 상대적으로 용이하고, 진피에 위치하는 모세혈관의 혈류속도도 충분히 빠른 싱크조건으로 작용하므로 각질층을 통과하는 것이 경피 약물전달시스템이 극복해야 한 가장 큰 장벽이다.

경피흡수의 경로로는 3가지로 구분되는데, 이 경로는 첫 번째는 모공 등의 피부 부속기관, 두 번째는 죽은 피부각질세포를 직접 통과하는 세포를 통한 투과(transcellualr), 마지막으로는 피부각질세포 사이의 비교적 지질층을 통과하는 세포간 투과(intercellular)임. 피부 부속기관은 피부 표면적의 0.1%을 차지하여 전체의 약물흡수에 기여하는 바가 매우 적고, 각질세포는 거의 결정구조인 케라틴이 가득 채워져 있으므로 세포내를 통한 약물의 확산이동도 일어나기 어렵기 때문에 일반적으로 세포간 경로가 가장 주된 약물흡수경로로 이용되고 또한 약물투과에 대한 장벽으로 작용하므로 약물의 투과속도나 양은 세포간 지질에 대한 약물의 분배계수에 의해 크게 좌우된다.

경피약물전달을 위한 많은 연구가 진행되었고, 세포간지질의 70nm내외의 크기를 통과하기 위하여 입자크기는 미세화 또는 나노입자화 연구, 세포간지질과 유사한 리포좀 구조, 생체전환 프로드러그를 이용하는 방법, 전기적 퍼텐셀 등에 의한 물리적인 방법, 피부약물대사 억제제 동시투여방법 등이 제시되어 경피약물전달이 어느 정도 개선되었지만 아직 만족할 만한 기술은 존재하지 않는다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 우수한 노화방지용 펩타이드를 개발하였고, 이를 포함하는 우수한 경피 흡수용 리포좀 화장료 조성물을 개발하고 우수한 효과를 확인하여 발명을 완성하였다.

하나의 과제로서 본원은 피부 노화방지 활성이 우수한 펩타이드를 제공하고자 한다. 다른 하나의 과제로서 본원은 상기 펩타이드를 포함하며 안정성이 높고 경피흡수가 개선된 리포좀 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

일 실시예에 따르면, 상기 유효성분을 0.5 내지 5.0 중량% 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 상기 유효성분, 인지질, 및 세라마이드를 포함하는 유상과 올레산, 아미노산, 및 아데노신을 포함하는 수상의 혼합을 통해 리포좀이 형성된 제형일 수 있다. 상기 아미노산은 히스티딘 또는 라이신을 포함하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 수상은 정제수, EDTA을 추가로 포함하며, 상기 유상은 에탄올, 글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 스테아르산, 및 디부틸하이드록시톨루엔을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 EDTA는 0.03 내지 0.07 중량부, 상기 올레산은 0.1 내지 0.4 중량부, 상기 아미노산은 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 아데노신은 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 에탄올은 8 내지 12 중량부, 상기 글리세린은 25 내지 35 중량부, 상기 1,3-부틸렌 글리콜은 8 내지 12 중량부, 상기 유효성분은 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 인지질은 2.5 내지 3.5 중량부, 상기 세라마이드는 0.8 내지 1.2 중량부, 상기 스테아르산은 0.2 내지 0.4 중량부, 상기 디부틸하이드록시톨루엔은 0.03 내지 0.07 중량부를 포함하는 것일 수 있다.

일실시예에 따른 장치는 하드웨어와 결합되어 상술한 방법들 중 어느 하나의 항의 방법을 실행시키기 위하여 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램에 의해 제어될 수 있다.

실시예에 따른 펩타이드는 피부 노화방지 활성이 우수하다. 상기 펩타이드를 포함하는 리포좀 화장료 조성물인 처방예는 보관 안정성이 높고 경피흡수가 개선된 결과를 나타낸다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예들에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 실시예들은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이런 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.

구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 도시된 것이며, 본 발명이 도시된 구성의 크기 및 두께에 반드시 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.

본원에 따른 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제는 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제는 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제는 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

본원에 따른 리포좀 화장료 조성물은 수상 및 유상의 혼합과 교반에 의해 나노 리포좀의 현탁액으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 수상을 먼저 혼합하여 70 내지 90℃의 온도로 가온하여 2,500 내지 3,500rpm으로 5 내지 30분 교반하여 냉각한 후, 유상을 혼합하여 실온에서 2,500 내지 3,500rpm으로 5 내지 30분 교반한 후, 이후 수상과 유상을 혼합한 후 500 내지 1,500 rpm으로 5 내지 30분 교반한 후, 상기 혼합액을 Microfluidizer (MF)를 이용하여 800 내지 1,200bar에서 3회 이상 순환하여 나노리포좀의 현탁액으로 제조될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예: 펩타이드의 제조

9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하는 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 이용하여 펩타이드를 합성하였다. N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N,N-디아이소프로필카보 디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다[참고문헌 : Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc-solid phase peptide synthesis', Oxford].

합성된 펩타이드를 C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters Associates, USA)를 이용하여 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 μM, Waters Co, USA)을 이용하였다.

상기 방법에 따라 합성된 펩타이드는 하기 표 1과 같다.

구분	서열	비고
실시예	GHKLPSYSCV	서열번호 1

한편, 비교예로서 공지된 서열번호 2 (GHK)의 펩타이드를 사용하였다.

실험예 1: 노화방지 효과

인간의 진피 세포를 이용하여 실시예의 펩타이드의 노화방지 효과를 실험하였다.

피부가 노화가 진행되거나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면서 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가함에 따라 콜라겐 합성이 감소하기 때문이다. 따라서 MMP-1과 같은 콜라겐 분해효소의 생합성양을 감소시키는 것으로 노화를 방지할 수 있다.

본 실험은 피부 섬유아세포종(human skin fibroblast, Hs68) 세포주와 펩타이드를 이용한　in　vitro　assay계를 확립하여 MMP-1의 생합성 양과 mRNA 발현양을 평가함으로서 펩타이드의 피부 노화 방지 효과를 확인하였고, 피부 섬유아세포종(human skin fibroblst, Hs68) 세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한　in　vitro　assay계를 확립하여 자외선 조사에 의한 노화에 미치는 펩타이드의 활성을 측정함으로써 노화방지 개선 효과를 측정하였다.

(1) 세포주 및 세포배양

실험에 사용된 세포주는 human skin fibroblast Hs68세포(ATCC, USA)를 사용하였다. Hs68 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). Hs68 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.

(2 ) 세포　생존률　측정

Hs68 (Human skin fibroblast)를 1*10⁴　cells/well 농도로 96 well plate에 분주하여 37℃5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하고 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양하였다. 배양상등액을 제거하고 무혈청배지 100㎕와 MTT용액 (3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5디페닐테트라졸리움브로마이드)(5mg/㎖)을 각각 10㎕씩 넣고 3시간 동안 배양 후 배지를 제거한다. 각 well 에 100㎕ 의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)용액을 첨가하고 포마젠(Formazan)을 용해시킨 후 마이크로 플레이트 판독기(Microplate reader, Tecan)을 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 1과 같이 세포 생존률(%)을 환산하였다.

[수학식1]

세포 생존률(%) = (S_p)/S_c×100

S_s: 시료를 처리한 군의 흡광도

S_c: 시료를 처리하지 않은 군의 흡광도

아래의 표2는 펩타이드를 1.5ppm, 2ppm 처리한 후 세포독성 실험한 결과를 나타낸 것이다.

	세포 생존률(%)
	1.5 ppm	2.0 ppm
실시예	97	96
비교예	95	95

상기 표 2에서 보이는 것과 같이 실시예 및 비교예 모두 세포 독성이 없고 안전한 원료임을 확인하였다.

(3) 펩타이드의　UVA　/　UVB　조사에 의한　MMP　-1 생성 억제 효과

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 50 mJ/cm²자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 3과 같이 MMP-1 생성 억제율(%)을 환산하였다.

[수학식3]

MMP-1 생성 억제율(%) = [(M_u-M_s)/( M_u　-M_c)]×100

M_c: 컨트롤군의 흡광도

M_u: UVA 또는 UVB를 조사한 군의 흡광도

M_S: UVA또는 UVB 조사 후 시료를 처리한 군의 흡광도

아래의 표4는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 UVA 조사 자극에 의해 증가한 MMP-1 생성에 대해 펩타이드의 MMP-1 생성 억제능을 시험한 결과를 나타낸 표이다. 각 펩타이드의 처리 농도는 1,5ppm 및 2ppm 이다.

	MMP-1 억제율(%)
	1.5ppm	2.0ppm
실시예	67%	72%
비교예	38%	41%

실시예 및 비교예 모두 농도 의존적으로 MMP-1 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다. 실시예의 경우 비교예 보다 높은 MMP-1억제율을 갖는 것으로 나타났다.

처방예 1 내지 4: 리포좀 화장료 조성물의 제조

본 발명의 실시예가 화장료 조성물로서 경피 흡수가 잘되며 안정적인 처방예를 구현하고자 리포좀 화장료 조성물을 제조하였다. 표 5와 같은 조성의 수상을 혼합한 후 80℃로 가온하여10분간 교반한 후 (3,000rpm) 냉각하였다. 하기의 표 5의 조성의 유상을 혼합한 후 실온에서 10분간 교반하였다(3,000rpm). 수상과 유상의 혼합하고 20분간 교반하였다(1,500rpm). 상기 혼합액을 Microfluidizer (MF)를 이용하여 1000bar에서 3회 순환하여 나노 리포좀 현탁액을 얻었다. 이후 표 4에 기재된 방부제를 첨가한 후 10분간 교반하였다(500rpm).

	성분 (중량%)	처방예 1	처방예 2	처방예 3	처방예 4
수상	정제수	To 100	To 100	To 100	To 100
	EDTA-2NA	0.05	0.05	0.05	0.05
	올레산	0.2	0.3	0.2	0
	아미노산	히스티딘 1	라이신 1	0	히스티딘 1
	아데노신	1	1	1	1
유상	에탄올	10	10	10	10
	글리세린	30	30	30	30
	1,3-부틸렌글리콜	10	10	10	10
	실시예 펩타이드	1	1	1	1
	인지질	3	3	3	3
	세라마이드	1	1	1	1
	스테아르산	0.3	0.2	0.3	0.5
	MCT oil	3	3	3	3
	디부틸하이드록시톨루엔	0.05	0.05	0.05	0.05
방부제	SHD-62(1,2-Hexanediol)	1	1	1	1

실험예 2: 처방예의 입도 분석 및 안정성 시험

본 실험에서 입도분석은 일반 광학현미경으로는 확인되지 않는 나노 사이즈의 다중층 리포좀이 실제 어느 정도의 크기와 입도분포를 갖는지를 확인하기 위하여 광산란(Light scattering)법을 이용한 입도분석기(Particle size analyzer)로서 독일 Sympatec사의 Helos 모델장비를 이용하여 분석하였다. 안정성 시험은 5℃, 25℃, 45℃, 및 cycle로 1개월간 성상의 변화를 확인하였다.

[표 5]에서 육안 관찰한 결과를 광산란법을 이용한 입도분석장비를 이용하여 분석하여 검증하였다. 투명도 : ◎투명), ○반투명), △반투명 - 탁함), × (유백색)

	처방예 1	처방예 2	처방예 3	처방예 4
입자 크기(초기)	101nm	113nm	464nm	2534nm
투명도(초기)	◎	◎	◎	○
입자크키 (45℃1개월)	98nm	157nm	678nm	578nm
투명도 (45℃개월)	◎(	◎	◎	○
입자크키 (5℃개월)	143nm	163nm	845nm	분리
투명도 (5℃1개월)	◎	◎	◎	△
입자크키 (Cyc,1개월)	137nm	184nm	913nm	분리
투명도 (Cyc, 1개월)	◎(	◎	◎	△
입자크키 (25℃1개월)	110nm	121nm	364nm	754nm
투명도 (25℃1개월)	◎(	◎	◎	○

이상과 같이 처방예 1 내지 3은 입자의 캡슐화가 안정한 반면, 처방예 4에서는 성상이 탁해지는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 처방예 1 내지 3을 대상으로 추가 실험을 진행하였다.

실험예 3: 리포좀의 피부투과 시험

본 발명의 리포좀 현탁액의 경피흡수율을 측정하기 위해, 생체 외 피부흡수시험 가이드라인(식품의약품안전처)을 따라 진행하였다. 생체 외 피부 흡수시험방법은 시험물질이 피부를 통과하는 것을 확인하는 것으로 피부 표면에 시험물질을 도포 혹은 적용하여 일정한 시간 이후 피부 안쪽 용액저장소에 이동한 양을 측정하는 방법으로, 인간 또는 다른 종의 다세포 동물의 피부, 또는 인공피부를 사용할 수 있다. 특히 인공 피부를 사용하는 경우 시험물질에 대하여 반복 측정이 가능하며 실험 동물을 사용하지 않고 노출 조건에 대한 연구가 가능하다. 생체 외 피부흡수시험은 물질의 조성에 따른 피부 흡수와 투과를 비교할 수 있어, 인체 내 피부흡수에 의한 위험성 평가 등에 유용한 모델로 사용할 수 있다.

본 실험예에서는, 밀리포아(미국)사의 경피흡수시험용 인공 Membrane Strat-M을 사용하여, Franz-Diffusion Cell and System (LOGAN사 미국)에 장착하여 실험하였다.　 Franz-Diffusion Cell은 비폐색(non-occluded) 조건으로 공여 챔버(donor chamber)를 파라 필름(para film)으로 밀봉하지 않은 상태로 유지하였다.

각 시험물질을 용매와 혼합하여 공여 챔버에 로딩(loading)하고 일정 시간 이후에 멤브레인 및 Reservoir에 있는 액체를 채취하여 펩타이드 성분을 분석하여 시험물질의 피부 투과율을 확인하였다. 또한, 피부에 남아 있는 잔존량을 측정하였다. 처방예 1 내지 3의 100g을 각각 상기 인공피부에 처리하여, 2시간 이후에 피부 투과 정도를 측정하였다. 전체 펩타이드 함량 (1g)을 기준으로 검출된 펩타이드의 중량%로 표시하였다.

	처방예 1	처방예 2	처방예 3
피부	5%	7%	35%
멤브레인	21%	13%	5%
Reservoir	25	24%	2%

상기와 같이 처방예 1 및 2를 사용한 경우에는 멤브레인 및 Reservoir로 유의미하게 피부 흡수가 나타난 반면, 처방예 3에서는 피부에 많은 펩타이드가 잔존하고 있는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 처방예 1 및 2가 적합한 제형으로 고안되었다.

<110> HAN, DOSOOK <120> Peptide for wrinkle improvement and cosmetic composition with improved percutaneous absorption comprising the same <130> P22195 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for cosmetic <400> 1 Gly His Lys Leu Pro Ser Tyr Ser Cys Val 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for cosmetic <400> 2 Gly His Lys 1

Claims

서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 0.5 내지 5.0 중량% 포함하는, MMP-1 억제에 의한 노화방지용 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 상기 유효성분, 인지질, 및 세라마이드를 포함하는 유상과 올레산, 아미노산, 및 아데노신을 포함하는 수상의 혼합을 통해 리포좀이 형성된 제형으로서, 상기 아미노산은 히스티딘 또는 라이신을 포함하는 것인, 노화방지용 화장료 조성물.
삭제
삭제