KR101987354B1

KR101987354B1 - 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 노화 줄기세포의 역노화용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101987354B1
Application number: KR1020170121017A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 정해용; 김동오; 김미정; 변재은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2019-06-10
Also published as: WO2018056706A1; KR20180032506A

Abstract

본 발명은 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 역노화용 약학적 조성물에 관한 것으로, TXNIP 유래 펩타이드는 노령의 조혈모세포(HSC)를 이용하여 경쟁적 이식을 실시한 생쥐에서 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비하여 노령 HSC의 생착을 증가시키고, 계열편향 경향을 감소시켰으며, LT-HSC(long-term HSC) 비율을 감소시키고, p38 및 ROS를 억제하는 것을 확인함으로써 노화된 HSC의 특징이 억제되는 것을 확인하였고, TXNIP 유래 펩타이드의 투여가 급성 백혈구 감소증 모델에서 노령 생쥐의 백혈구 증식을 어린 생쥐 수준으로 증진시키는 것을 확인하였으며, 또한 TXNIP 유래 펩타이드가 노령의 HSC에서 Cdc42의 극화 현상을 회복 시키고, 노화관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 감소시키며, HSC의 귀소(homing)를 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 TXNIP 유래 펩타이드는 조혈줄기세포의 역노화용 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 노화 줄기세포의 역노화용 조성물 및 이의 용도{Composition comprising peptide derived from thioredoxin-interacting protein or polynucleotide encoding the peptide for rejuvenation of stem cell}

본 발명은 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 노화 줄기세포의 역노화용 약학적 조성물에 관한 것이다.

노화는 살아있는 organism에서 일생을 통하여 일어나는 자연적인 현상이며, 대부분의 노년층이 노화-관련 질병(aging-associated disease)으로 고통받고 있다. 이러한 노화-관련 질병을 치료하기 위해서는 줄기세포를 다시 젊게(rejuvenation)하는 방법이 있다. 최근 줄기세포의 노화와 관련한 연구가 진행되고 있으며, 줄기세포를 다시 젊게 하는 방법들이 보고되고 있다.

줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)와 성체 줄기세포(adult stem cells)로 나뉘는데, 배아 줄기세포는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력(pluripotent)이 있는 반면, 성체 줄기세포는 발생과정이 끝난 성인 또는 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 태반에서 얻어지는 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정된다(multipotent). 이러한 성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충한다. 줄기세포가 늙게 되면, 조직이 늙게 되며 항상성을 유지하는 기능이 떨어지게 되어 조직의 재생이 감소하게 된다.

조혈줄기세포(조혈모세포, hematopoietic stem cell, HSC)는 대표적인 성체줄기세포로, 모든 종류의 혈구세포로 분화 가능하여 일생 동안 혈구를 제공한다. 조혈줄기세포는 일생 동안 혈액을 만들며 높은 turn over를 나타낸다. 조혈줄기세포가 늙게 되면 면역기능이 떨어지고 노화관련 질병이 일어나게 된다.

HSC는 분화 단계에 따라 여러 종류의 조혈전구세포로 분화되며 HSC의 분화계층도에서 가장 상위에 위치한 것은 LT-HSC(long-term HSC)로, 자가복제능을 가지고 체내에 존재하는 모든 혈액세포로 분화 가능하며 영구적으로 조혈계를 보충하도록 조혈작용을 지속한다. ST-HSC(short-term HSC)는 자가복제능을 가지고 체내에 존재하는 모든 혈액세포로 분화하는 능력을 가지지만 LT-HSC와 달리 조혈작용 지속기간이 짧고, MPP(multipotent progenitor)는 체내에 존재하는 모든 혈액세포로 분화하는 능력을 가지나, LT-HSC, LT-HSC와 달리 자가복제능을 가지지 않는다. 즉, LT-HSC, ST-HSC, MPP의 순으로 줄기세포로서의 자가복제능이 감소하며 더 분화된 세포라고 할 수 있다. 이 3종류의 조혈전구세포는 Lineage를 발현하지 않고 Sca1 및 c-Kit를 발현하는 특징이 있어(Lineage^-Sca1⁺c-kit⁺) 다른 단계의 HSC 구분 가능하며, LSK 세포라고 통칭한다. 또한, MPP가 더 분화하면 골수성 전구세포인 CMP(common myeloid progenitor)와 림프구성 전구세포인 CLP(common lymphoid progenitor)로 분화하고, CMP는 다시 MEP(megakeryocyte-erythroid progenitor)와 GMP(granulocyte-monocyte progenitor)로 분화한 뒤, 최종적으로 적혈구, 거대세포, 호산구 등의 골수성세포로 분화하며, CLP는 B 세포, T 세포, NK 세포 등의 림프구성세포로 분화한다.

그러나 성체줄기세포의 경우 신체의 노화에 따라 줄기세포 역시 노화되며, 그들의 기능적 활성이나 항상성이 유지되지 못하는 문제가 발생한다. 노화된 HSC의 특징으로는 LT-HSC가 증가하고, B세포가 감소하며 Myeloid가 증가하는 계열편향(lineage skewing)이 나타나며, ROS가 증가하는 것으로 알려져 있다(Florian 등, 2012, Cell stem cell, 10, 520-530; Montecino-Rodriguez 등, 2013, The Journal of clinical investigation, 123, 958-965). HSC가 노화하면 혈구세포의 생산이 저하되기 때문에 면역기능의 저하로 이어지며, 각종 질병을 야기할 수 있다. 따라서 노화한 HSC를 역노화 시켜 자가복제능과 조혈작용을 유지시킬 수 있다면, 건강한 면역계의 기반이 될 것이며 나아가 질병의 치료 또는 예방에도 큰 도움이 될 것으로 예상된다.

여러 연구에서, 늙은 생쥐는 조혈시스템에서 커다란 변화가 일어난다는 것이 보고되었다. CD34^-/Flk2^-/LSK(Lineage^-/C-kit/⁺Sca-1⁺) 세포(LT-HSC)가 증가하고, lineage skewing(계열편향)이 일어나며, 활성산소(ROS)가 증가하고, 말초혈관에서 백혈구가 감소한다. HSC가 늙으면 미토콘드리아 DNA 손상, ROS 및 p38 증가, DNA 손상, telomere shortening, epigenetic alteration, Cdc 42 polarity(극성)의 손실, Wnt-5a 증가, 복제 스트레스 등이 일어난다. 최근 Cdc42 활성을 억제하여 HSC를 젊게 하는 방법이 보고가 되었다.

티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)은 티오레독신(thioredoxin)의 억제자로써, 세포주기의 진행을 막기 때문에 종양 억제자로도 알려져 있으며(Han 등., 2003, Oncogene, 22, 4035-4046), 활성산소에 대한 저항성을 증가시켜 활성산소 관련 질환 치료제로서 용도가 개시되어 있다(WO013159879). 또한, TXNIP와 조혈작용의 관계에 대해서는 TXNIP가 p38 및 JNK의 감소에 의해 증가하여 적혈구의 최종분화를 유도하는 것이 보고되어 있고(Gasiorek J.등 2015, Experimental Hematology, 43, 393-403) TXNIP의 knockout 생쥐에서 조혈줄기세포의 수가 감소 된 것이 보고되어 있으나, TXNIP의 줄기세포 역노화 기능에 대해서는 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 노화된 HSC의 기능을 회복시킬 수 있는 방법을 찾고자 노력하던 중 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, 이하 TXNIP라고 한다) 유래 펩타이드가 노령의 HSC를 경쟁적으로 이식(competitively transplantation)했을 때, TXNIP를 처리하지 않은 대조군에 비하여 노령 HSC의 생착을 증가시키고, Myeloid가 증가하고 B 세포가 감소하는 계열편향 경향을 감소시켰으며, LT-HSC 비율을 감소시키고, p38 활성 및 ROS를 감소시키는 것을 확인하였고, 또한 급성 백혈구 감소증 모델에서 TXNIP 유래 펩타이드의 투여가 노령 생쥐의 백혈구 증식을 어린 생쥐 수준으로 증진시키는 것을 확인하였고, 또한 노화된 HSC에서 Cdc42의 극화 현상을 회복하고, 노화관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 감소시키며, HSC의 귀소(homing)를 증가시키는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 티오레독신 결합단백질 (Thioredoxin-interacting protein, 이하 TXNIP라 한다)이 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)과 상호작용하여 HSC의 노화를 조절하는 것을 발견 하였다. 특히 TXNIP-p38상호작용 모티프 펩타이드가 p38의 활성을 억제하여 활성산소종(Reactive oxygen species, 이하 ROS라고 한다)을 감소시키며 in vivo와 in vitro에서 노화된 HSC를 젊은 HSC로 변환시키는 것을 확인하였으며, 상기 펩타이드를 노화관련 질병의 예방 및 치료제로 사용할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 유래 펩타이드 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 역노화용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드와 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드의 융합펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 역노화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포 노화억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 노인성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 줄기세포 노화 억제용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

1) 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)이 결손된 줄기세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및

2) 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 하기 a 내지 d로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 특징을 나타내는 피검물질을 선별하는 단계;

a. p16, p19, p21 또는 Wnt5a 유전자의 발현 또는 활성 감소;

b. p38의 인산화 감소;

c. 활성산소(Reactive oxygen species; ROS) 수준 감소; 및

d. Cdc42(Cell division control protein 42 homolog)의 극성(polarity) 증가.

또한, 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 건강기능식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 노인성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 노인성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 노인성 질환의 치료에 사용하기 위한 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서, 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 유래 펩타이드가 노령의 HSC를 경쟁적으로 이식(competitively transplantation)했을 때, 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비하여 노령 HSC의 생착을 증가시키고, 계열편향 경향을 감소시켰으며, LT-HSC 비율을 감소시키고, p38 활성 및 ROS를 감소시키는 것을 확인하였고, TXNIP 유래 펩타이드의 투여가 급성 백혈구 감소증 모델에서 노령 생쥐의 백혈구 증식을 어린 생쥐 수준으로 증진시키는 것을 확인하였으며, 또한 노화된 HSC에서 Cdc42의 극화 현상을 회복하고, 노화관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 감소시키며, HSC의 귀소(homing)를 증가시키는 것을 확인함으로써, 상기 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 조혈줄기세포의 역노화용 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TXNIP(thioredoxin interacting protein)유래 펩타이드와 p38의 상호결합을 통한 p38의 억제효과를 나타낸 도이다. 도 1A는 GST-TXNIP-T와 p38의 GST-full down 분석을 나타낸 도이고, 도 1B는 GST-TXNIP-T처리에 의한 p38의 인산화효소 활성 억제효과를 in vitro kinase assay 방법을 통하여 p38의 기질(substrate) 단백질인 ATF-2의 인산화 감소를 통해 보여주는 도이며, 도 1C는 TXNIP 유래 펩타이드(TN12, TN13, TN14, TN15)와 p38의 GST-full down 분석을 나타낸 도이고, 도 1D는 TN13과 p38의 결합부위를 나타낸 도이다.
도 2는 TAT-TN13의 p38과 상호결합에 의한 활성 조절을 나타낸 도이다. 도 2A는 isothermal titration calorimetry (ITC) 분석을 통하여 TAT-TN13과 p38의 상호작용을 보여주고 있으며, 도 2B에서는 대조군으로 TAT가 p38과 결합하지 않음을 보여주고 있으며, 도 2C는 노화된 골수 세포에서 TAT-TN13의 p38 활성 및 p38의 기질(substrate) 단백질인 ATF-2 인산화 억제효과를 나타낸 도이다.
도 3은 TXNIP knockout (TXNIP^-/-) 생쥐의 골수세포 노화를 나타낸 도이다. 도 3A는 골수를 구성하는 세포들에서 TXNIP의 mRNA 발현을 확인한 도이고, 도 3B는 12개월 된 생쥐에서 TXNIP가 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC) 비율에 미치는 영향을 보여주는 대표적인 도로 TXNIP^+/+및 TXNIP^-/-골수에서 LT-HSC, ST-HSC, MPP 비율을 유세포 분석으로 확인한 도이고, 도 3C는 다양한 연령에서 LT-HSC, ST-HSC, MPP 비율을 유세포 분석으로 확인한 도이다.
도 4는 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)에서 HSC 노화 지표인 ROS(A) 또는 p16(B), p19(C), p21(D) 또는 Wnt5a(E) mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 5는 TXNIP의 조혈모세포 노화 방지효과를 나타낸 도이다. 도 5A는 급성 백혈구 감소증 유도 후 혈액 내 백혈구 수의 변화를 나타낸 도이고, 도 5B는 급성 백혈구 감소증 유도 후 생존율을 나타낸 도이며, 도 5C 내지 G는 TXNIP^+/+및 TXNIP^-/-에서 경쟁적 이식 후 말초혈액(C) 및 골수(D)에서 이식된 세포의 생착, 계열편향(E), LSK(Lin^-/Sca-1⁺/c-Kit⁺)세포의 구성(F), 활성산소(G)를 확인한 도이다.
도 6은 TXNIP과 p38 인산화효소의 상호작용을 나타낸 도이다. 도 6A는 골수세포에서 p38 동형단백질들의 mRNA 발현을 확인한 도이고, 도 6B 내지 D는 TXNIP^+/+및 TXNIP^-/-에서 p-p38 발현을 유세포분석(B), 면역형광염색(C), 웨스턴블랏(D)으로 확인한 도이며, 도 6E는 LT-HSC의 연령에 따른 TXNIP의 발현을 면역형광염색으로 확인한 도이다.
도 7은 TXNIP과 p38 인산화효소의 상호결합과 결합부위를 나타낸 도이다. 도 7A는 TXNIP 항체를 이용한 면역침강법 분석으로 TXNIP와 p38이 상호결합하고 있음을 나타낸 도이고, 도 7B는 in situ proximity ligation(PLA) 결과를 통하여 HSC에서 TXNIP와 p38이 결합하고 있음을 나타낸 도이며, 도 7C는 활성산소에 의한 TXNIP 및 p-p38(p38 인산화)의 발현변화를 나타낸 도이며, 도 7D는 HSC에서 연령 및 활성산소에 의한 p38과 TXNIP의 상호작용을 나타낸 in situ PLA 결과이고, 도 7E는 활성산소에 의한 TXNIP와 p38의 상호작용 증가가 p38 인산화 능력 결핍(kinase dead)과 관계없음을 확인한 GST-full down 결과이며 도 7F 내지 G는 TXNIP와 p38의 상호 결합에 필수적인 TXNIP(F) 및 p38(G)의 아미노산 잔기를 확인한 도이다.
도 8은 TAT-TN13의 p38 인산화효소의 활성 억제효과를 나타낸 도이다. 도 8A는 노화된 HSC에 TAT-TN13 펩타이드를 처리하였을 경우 p38의 인산화가 감소되는 것을 보여주는 도이며, 도 8B 내지 C는 p38을 인산화시키는 MKK3(C) 및 MKK6 (D)와 p38의 결합작용이 TAT-TN13 펩타이드에 의해 감소되는 것을 보여주고 있으며, 도 8D는 노화된 골수에 TAT-TN13 펩타이드를 처리하였을 때 p38과 TXNIP의 상호결합이 감소되는 것을 면역침강법을 통하여 확인한 도이다.
도 9는 p38 인산화효소의 활성 억제에 의한 조혈모세포의 노화 방지효과를 나타낸 도이다. 도 9A는 경쟁적 이식 후 말초혈액에서 CD45.2⁺의 생착을 나타낸 도이고, 도 9B는 경쟁적 이식 후 계열편향을 분석한 도이며, 도 9C는 골수세포에서 LSK(Lin^-/Sca-1⁺/c-Kit⁺) 세포의 구성을 나타낸 도이고, 도 9D는 p-p38의 발현을 나타낸 도이며, 도 9E는 활성산소 변화를 나타낸 도이고, 도 9F는 2개월과 12개월 령 생쥐의 계열편향을 비교한 도이며, 도 9G는 급성 백혈구 감소증 유도 후 생존율을 나타낸 도이다.
도 10은 TXNIP 유래 펩타이드 TAT-TN13의 in vitro에서 p38 인산화효소의 억제에 의한 조혈모세포 역노화 효과를 나타낸 도이다. 도 10A 내지 H는 노화된 조혈모세포에 TAT-TN13을 처리한 뒤 p-p38 발현(A), 활성산소 수준(B), Cdc42의 극성(C)을 나타낸 도이고, p16(D), p19(E), p21(F), Wnt5a(G) mRNA 발현을 나타낸 도이며, in vivo에서 조혈모세포의 단기 귀소 분석(H)을 나타낸 도이다.
도 11은 플라스미드 유전자에서 발현하는 TXNIP 유래 펩타이드 TN13의 in vivo에서 HSC 역노화 효과를 나타낸 도이다. 도 11A 내지 E는 TN13 펩타이드를 형질 도입한 CD45.2⁺조혈줄기세포를 경쟁적 이식한 뒤 말초혈액에서 이식세포의 생착(A), 계열편향(B) 및 골수세포에서 LSK(Lin^-/Sca-1⁺/c-Kit⁺) 세포의 구성(C), p-p38 발현(D), 활성산소 수준(E)을 나타낸 도이다.
도 12는 TXNIP 유래 펩타이드 TAT-TN13의 in vivo에서 HSC 역노화 효과를 나타낸 도이다. 도 12A 내지 E는 TAT-TN13 펩타이드를 in vitro에서 처리한 노령의 CD45.2⁺조혈줄기세포를 경쟁적 이식한 뒤 말초혈액에서 이식세포의 생착(A), 계열편향(B) 및 골수세포에서 LSK(Lin^-/Sca-1⁺/c-Kit⁺) 세포의 구성(C), p-p38 발현(D), 활성산소 수준(E)을 나타낸 도이며, 도 12F는 급성 백혈구 감소증 유도 후 TAT-TN13 처리에 의한 백혈구 수 변화를 나타낸 도이다.
도 13은 p38 MAPK에 결합하는 TXNIP(thioredoxin interacting protein)유래 펩타이드 단편인 TN13의 골수 세포내 p38 MAPK 활성 억제를 Western blot을 통해 확인한 도이다.
도 14는 TN13 투여 농도에 따라 LPS로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포가 분비하는 염증성 cytokine의 생성 양을 측정한 결과로 (A) IL-1β 사이토카인 생성 양 (B) IL-6 사이토카인 생성 양 (C) TNF-α 사이토카인 생성 양의 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 TN13 펩타이드 처리에 의해 p38 MAPK 활성을 효과적으로 억제함으로써 염증조절 전사인자인 NF-kB (p65)와 c-Jun의 활성억제 또한 야기시킴을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 TN13 펩타이드 처리에 의한 LPS로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포에서 효과적으로 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 억제하는 결과를 나타내는 도이다.
도 17은 TN13 펩타이드 처리에 의한 대식세포에서의 NO 생성을 억제한 결과를 나타내는 도이다.
도 18은 TN13 펩타이드 처리에 의한 파골세포 분화 억제를 보여주기 위하여 TRAP(tartrateresistant acid phosphatase) 용액으로 염색하여 M-CSF와 RANKL에 의한 성숙한 파골세포로 분화한 결과를 나타내는 것으로 (A) 대식세포 주인 Raw 264.7 세포에서 성숙한 파골세포로의 분화 (B) 마우스 골수 유래 파골세포 전구체에서 성숙한 파골세포로의 분화 결과를 나타내는 도이다.
도 19의 (A)는 마우스를 이용한 에스트로겐 결핍성의 난소적출 골다공증 모델을 이용한 실험의 실험 스케쥴을 나타내며, (B)는 위 실험 모델의 대퇴골 내부의 3차원적 영상으로 골다공증을 유발하지 않은 Sham군, 골다공증 유발후 Vehicle(OVX)을 투여한 군, 및 골다공증 유발후 TN13을 투여한 군의 영상을 나타내는 도이다.
도 20은 마우스를 이용한 에스트로겐 결핍성의 난소적출 골다공증 모델에서 좌측 대퇴골의 조직 표본에서 조직 형태학적 검사를 수치로 나타내는 것으로 각각 (A) 소주골의 골밀도. (B) 소주골의 수. (C) 골표면. (D) 골부피/총부피. (E) 골표면/총부피를 확인한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드를 제공한다. 바람직하게 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)의 일부 서열로 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 결합하여 상호작용을 하는 펩타이드 서열이다. 본원 발명에 의해서 p38과 상호작용 할 수 있는 티오레독신 결합단백질의 서열이 최초로 확인되었으며, 해당 서열을 통해 항노화, 줄기세포의 노화 억제, 백혈구 증식, 노화 관련 유전자의 감소와 같은 작용 효과를 가진다. 이러한 작용효과를 통해 노인성 질환의 예방 및 치료가 가능하며, 줄기세포의 노화를 억제하며, 역노화 작용을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드와 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드의 융합펩타이드를 제공한다. 바람직하게 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드의 융합펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드는 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 유래 펩타이드일 수 있다.

본 발명에 사용된 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 동물, 식물, 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 인간 유래 티오레독신 결합단백질인 것이 바람직하나, 인간 유래 티오레독신 결합단백질과 동등한 활성을 가지는 이종 유래 단백질일 수 있다.

상기 단백질에는 추가적으로 인산화, 아세틸화, 메틸화, 당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며, 다른 단백질과 결합할 수 있으나, 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다.

상기 TAT 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 또는 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 말단에 결합하는 것이 바람직하고, 상기 말단은 아미노 말단(5' 말단, N-말단) 또는 카복시 말단(3'말단, C-말단) 중 어느 것이라도 가능하나, 아미노 말단(5' 말단, N-말단)인 것이 가장 바람직하다.

상기 티오레독신 결합단백질은 서열번호 1로 기재되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 티오레독신 결합단백질을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다.

상기 티오레독신 결합단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게 역노화용 조성물에서 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

바람직하게 줄기세포 노화억제용 조성물에서 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

바람직하게 노인성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에서 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

상기 노인성 질환은 치매, 고혈압, 파킨슨병, 당뇨, 백내장, 골다공증, 뇌졸중, 치주질환 및 퇴행성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 노인성 질환은 골다공증, 또는 퇴행성 관절염이다.

또한, 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 염증이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증 질환으로는 예를 들어, 염증 및 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 동맥 경화, 또는 퇴행성 질환 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 티오레독신 결합 단백질 유래 펩타이드는 N 말단에 서열번호 9로 기재되는 TAT 펩타이드가 결합된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 42 내지 45로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호로 기재되는 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington'sPharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명에서, TXNIP^-/- 생쥐를 이용하여 TXNIP의 HSC(hematopoietic stem cell, 조혈모세포)의 노화에서 기능을 규명하였다. TXNIP^-/-HSC의 노화는 활성산소종(ROS) 또는 p38 활성에 의해서 일어나는데, 본 발명은 TXNIP가 p38과 결합하여 p38의 활성을 억제함으로써 HSC의 노화를 억제하고, 노화된 HSC를 역노화 시키는 것을 밝혔다. 또한 TXNIP 유래 TN13 펩타이드와, TAT-TN13 펩타이드를 제작하여 p38을 억제하며 HSC의 노화를 억제하는 것을 확인하여 줄기세포를 젊게 역노화 시킴으로써 노인성 질환 예방 및 노화 억제용 조성물로써 유용하게 사용할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 4개의 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)의 도메인 단편을 제작하여 이 펩타이드가 p38과 결합하는 것을 확인하였고(도 1 참조), 세포 내 침투 효율을 높이기 위하여 상기 TXNIP 도메인 단편 TN13에 HIV TAT 형질도입 도메인 서열을 결합시킨 융합 펩타이드를 제작하여 p38과 결합하여 p38의 활성을 억제하는 것을 확인하였으며(도 2 참조), TXNIP knockout 생쥐에서 말초 및 골수의 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)를 유세포 분석하여 HSC가 노화된 것을 확인하고(도 3 참조) 노화관련 유전자 p16, p19, p21 및 Wnt5a 발현, p38 인산화 및 활성산소 수준이 증가하며(도 4 참조), 조혈작용이 억제되는 것을 확인하여(도 5 참조) TXNIP가 노화를 방지하는 효과가 있음을 제시하였다. 또한, TXNIP가 p38과 결합하여 상호작용 하며 산화스트레스가 상기 TXNIP가 p38의 상호작용을 증진시키는 것을 확인하였고(도 6 및 도 7 참조) TXNIP^-/-/p38^AF/+ 생쥐(TXNIP knockout/p38 불활성화)를 이용하여 p38의 억제에 의해 HSC의 노화가 억제되며(도 8 참조), TXNIP 유래 펩타이드가 p38과 도킹함으로써 p38의 활성을 억제하는 것을 확인하고(도 9 참조) TAT-TN13 융합 펩타이드를 in vitro에서 노화된 HSC에 처리하여 Cdc42의 극화 현상을 회복 시키고(도 10C 참조), 노화관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 감소시키며(도 10D-G 참조), HSC의 귀소(homing)를 증가시키고(도 10H 참조), in vivo에서 노령의 생쥐에 TN13 펩타이드 또는 TAT-13 펩타이드를 처리하여 HSC를 역노화시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 11 및 도 12 참조).

따라서, TXNIP는 p38과 상호작용하여 활성을 억제함으로써 HSC의 노화를 방지하고 노화된 HSC를 역노화 시키는 효과가 있으며, TXNIP 유래 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 노화 줄기세포 역노화용 약학적 조성물, 줄기세포 노화억제용 조성물, 노인성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은

2) 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 하기 a 내지 d로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 특징을 나타내는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 줄기세포 노화 억제용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

a. p16, p19, p21 또는 Wnt5a 유전자의 발현 또는 활성 감소;

b. p38의 인산화 감소;

c. 활성산소(Reactive oxygen species; ROS) 수준 감소; 및

d. Cdc42(Cell division control protein 42 homolog)의 극성(polarity) 증가.

본 발명의 구체적인 실시예에서 TXNIP 유래 펩타이드가 노령의 HSC에서 TXNIP 유래 펩타이드가 노령의 HSC에서 Cdc42의 극화 현상을 회복 시키고(도 10C 참조), 노화관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 감소시키며(도 10D-G 참조), HSC의 귀소(homing)를 증가시키는 것을 확인함으로써(도 10H 참조), 본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드를 이용하여 줄기세포 노화 억제용 약물의 스크리닝 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 배제하는 의미로 사용된 것이 아니다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등) 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연 화장수가 있다. 또한, 본 발명의 광나무 및 원추리 추출물을 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형으로 적용될 수 있다.

본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 노인성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

본 발명은 노인성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 바람직하게 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

본 발명은 노인성 질환의 치료에 사용하기 위한 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

본 발명은 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 염증 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

본 발명은 염증 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 바람직하게 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

본 발명은 염증 질환의 치료에 사용하기 위한 티오레독신 결합단백질 또는 p38 MAPK와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게 티오레독신 결합단백질(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 또는 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)와 상호작용하는 티오레독신 결합단백질 유래 펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 펩타이드이며, 보다 바람직하게 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드를 더 포함하는 융합펩타이드이다.

본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.

단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

티오레독신 결합단백질 ( Thioredoxin - interacting protein , TXNIP ) 유래 펩타 이드 제조

<1-1> GST - TXNIP -T 제작

in - vitro에서 TXNIP와 p38의 상호작용을 확인하기 위한 p38의 인산화 효소 활성을 억제하는 TXNIP 컨스트럭트(construct), GST-TXNIP-T를 제작하였다.

구체적으로, p38의 인산화 효소 활성을 억제하는 TXNIP 컨스트럭트(construct)를 제조하기 위하여 GST와 융합된 TXNIP의 150-317번째 아미노산 단편(GST-TXNIP-T; 서열번호 1) 및 His가 표지된 p38 단백질을 제작하였고, GST-full down 분석 및 western blot으로 p38과 상호결합을 확인하였다. 대장균에서 발현된 재조합 단백질, GST, GST-TXNIP(150-317) 그리고 His-p38을 친화성 크로마토그라피(affinity chromatography) 방법으로 정제하였다. Cell lysis 용액 (500 ul)이 들어 있는 1.5 ml tube에 각 5 ug의 단백질을 GST + His-p38 또는 GST-TXNIP(150-317) + His-p38로 희석 후 GST-4B bead를 20 ul 넣고 4℃에서 2시간 반응한 다음, lysis 용액 1 ml로 3번 bead를 세척하였다. 세척된 bead에서 상층액을 모두 제거하고 lysis 용액과 5X SDS sample 용액을 넣고 3분간 100℃에서 가열하고 SDS-PAGE gel에 전기영동 후 western blot을 수행하였다. 1차 항체는 -His를 사용하고 2차 항체는 HRP가 붙어 있는 항체를 이용하여 ECL 용액을 통하여 감광하여 His-p38a가 GST-TXNIP(150-317)에 선택적으로 결합하는 것을 확인하였으며 GST를 확인하기 위하여 1차 항체 α-GST를 사용하여 상기와 같이 감광하여 상대적인 양을 확인하였다.

그 결과, GST-TXNIP-T가 p38과 결합하고(도 1의 A), p38의 하위 신호전달분자인 ATF-2의 인산화(p-ATF-2)를 억제(도 1의 B)하는 것을 확인함으로써, GST-TXNIP-T가 p38의 인산화 효소 활성을 억제하는 것을 확인하였다.

<1-2> 4가지의 TXNIP의 도메인 단편을 제작

또한 본 발명자들은 표 1에 나타낸 바와 같이 p38과 상호결합하는 4가지의 TXNIP의 도메인 단편을 제작하였고(TN12; 서열번호 2, TN13; 서열번호 3, TN14; 서열번호 4, 및 TN15; 서열번호 5), 이들 중 TN13이 P38과 가장 강하게 결합하는 것을 GST-full down 분석으로 확인하였다(도 1의 C). TN13은 p38과 결합한다고 알려진 MKK6(서열번호 6), MKK3b(서열번호 7) 및 MEF2A(서열번호 8)와 마찬가지로 P38의 도킹 부위(docking region)와 결합하는 것을 확인하였다(도 1의 D).

[표 1]

<1-3> 펩타이드의 침투효율을 증가시키기 위한 TAT-TN13의 제작

또한 본 발명자들은 합성된 단백질을 세포 안으로 효율적으로 전달하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 TN13의 N-말단에 HIV TAT 형질도입 도메인 시퀀스(transduction domain sequence, 서열번호 9)를 결합시키고, 펩타이드의 침투효율을 확인하기 위하여 TAT 시퀀스의 말단에 FITC를 결합시킨 TAT-TN13 펩타이드를 제작하였다. Isothermal titration calorimetry(ITC)으로 상기 TAT-TN13펩타이드가 P38과 결합하는 것을 확인하고(도 2의 A 및 B), TAT-TN13이 p38과 ATF-2 인산화(p-p38 및 p-ATF-2)를 억제하는 것을 웨스턴블랏으로 확인함으로써(도 2의 C), TAT-TN13이 p38의 인산화효소 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

[실시예 2]

TXNIP와 p38의 변이체 제작

TXNIP와 p38의 상호작용 확인을 위해 TXNIP와 p38의 변이체를 제작하였다. 사람 TXNIP(NM_006472.5, 서열번호10) 또는 p38α(NM_139012, 서열번호 11)을 주형으로 하여 표 2의 프라이머를 이용하여 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 실시하였고, FLAG-CMV vector를 이용하여 세포 내로 도입시켰다.

[표 2]

<실험예 1> TXNIP ^-/- HSC의 노화

<1-1> TXNIP ^-/- 의 HSC 세포 구성 확인

조혈모세포(Hematopoietic stem cells, HSC)에서 TXNIP의 기능을 확인하기 위하여, 골수(bone marrow, BM) 및 골수를 구성하는 아집단들[Lin⁺, Lin^-, MPP(multipotent progenitor), ST-HSC(short-term HSC), LT-HSC(long-term HSC), CLP(common lymphoid progenitor), CMP(common myeloid progenitor), GMP(granulocyte-monocyte progenitor) 또는 MEP(megakeryocyte-erythroid progenitor)에서 quantitative polymerase chain reaction(qPCR)으로 TXNIP의 mRNA 발현을 확인하였다. 세포의 총 RNA는 RNeasy Micro Kit(Qiagen)을 이용하여 분리하였고, quantitative real-time PCR은 SYBR Premix ExTaq(Takara Bio)와 Thermal Cycler Dice Real-Time System TP800 instrument (Takara Bio)를 이용하여 수행하였다. 유전자 단편의 증폭을 위한 프라이머는 표 3에 나타내었다.

[표 3]

그 결과, LT-HSC에서 TXNIP의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다(도 3A).

또한, TXNIP가 HSC의 노화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 TXNIP^+/+(wild type) 및 TXNIP^-/-(TXNIP konckout) 생쥐의 말초혈액에서 유세포분석법을 실시하여 백혈구의 분포를 분석하였다. 유세포 분석을 위하여 생쥐의 대퇴골(femurs), 경골(tibias), 관골(hipbones) 또는 견갑골(shoulder bones)을 분쇄하여 골수세포를 추출한 뒤, 2% fetal bovine serum(FBS)를 함유한 RPMI1640배지에 현탁하였다. 배양된 골수세포는 FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 유세포 분석하였고, FACSAria cell sorter(BD Biosciences)를 이용하여 세포를 분리하였다. 유세포 분석 또는 세포 분리를 위해 세포 표면 표지자 또는 계열 표지자(lineage marker)로서 다음의 항체를 사용하였다: 항-CD11b-biotin(clone M1/70, BD biosciences), 항-Gr-1-biotin(clone RB6-8C5, BD biosciences), 항-B220-biotin(clone RA3-6B2, BD biosciences), 항-NK1.1-biotin(clone PK136, BD biosciences), 항-CD2-biotin (RM2-5) 항-TER119-biotin(BD biosciences), 항-Streptavidin-APC-eFluor780(eBiosciences), 항-c-kit-PE(clone 2B8, BD biosciences), 항-c-kit-PE-Cy7(clone 2B8, BD biosciences), 항-Sca-1-PE-Cy7/PE/BV421(clone D7, BD biosciences), 항-Sca-1-APC(clone D7, eBiosciences), 항-CD34-FITC/Alexa Fluor647/PE(clone RAM34, BD biosciences), 항-CD135-APC/BV421(clone A2F10.1, BD biosciences), 항-CD135-PE-Cy7(clone A2F10.1, eBiosciences), 항-CD45.1 eFluor450(clone A20, eBiosciences) 또는 항-CD45.2-V500(clone 104, BD biosciences). 말초혈액 분석을 위해서 항-B220-PE(clone RA3-6B2, BD biosciences), 항-CD3e-APC-efluor780(clone 17A2, eBiosciences), 항-CD3e-BV421/PE-Cy7(clone 17A2, 145-2C11, BD biosciences), 항-Gr-1-Alexa Fluor 488/eFluor 660(clone RB6-8C5, eBiosciences), 항-CD11b-PE-Cyanine7(clone M1/70, eBiosciences) 또는 항-CD45.2-APC(clone 104, BD biosciences)를 사용하였다. 또한, Lineage^-/Sca-1⁺/c-kit⁺(LSK) 세포 준비를 위해서 MACS 정제 방법을 사용하였고, TXNIP 또는 p-p38의 세포내 염색을 위해서 항-TXNIP(clone D5F3E, Cell Signaling), 항-rabbit IgG Alexa Fluor 647 (Life technology) 또는 항-phospho-p38-APC(clone 4NIT4KK, eBiosciences)을 이용하였다.

LT-HSC는 최상위 혈액-줄기세포로, 자가복제능을 가지고 체내에 존재하는 모든 혈액세포로 분화 가능하며 영구적으로 조혈계를 보충하도록 조혈작용을 지속한다. ST-HSC는 자가복제능을 가지고 체내에 존재하는 모든 혈액세포로 분화하는 능력을 가지지만 LT-HSC와 달리 조혈작용 지속기간이 짧고, MPP는 체내에 존재하는 모든 혈액세포로 분화하는 능력을 가지나, LT-HSC, ST-HSC와 달리 자가복제능을 가지지 않는다. 즉, LT-HSC, ST-HSC, MPP의 순으로 줄기세포로서의 자가복제능이 감소하며 더 분화된 세포라고 할 수 있다.

정상 쥐의 경우 연령이 증가할수록 LT-HSC의 수가 증가하며 LSK(Lin(lineage)^-/Sca-1⁺/c-kit⁺)내 LT-HSC의 비율이 증가하고, MPP의 비율은 감소하는 패턴을 갖는데, TXNIP^-/-생쥐의 유세포 분석 결과 TXNIP^+/+에 비하여 LT-HSC의 비율이 증가하였고(12개월령, 도 3B), LSK(Lin(lineage)^-/Sca-1⁺/c-kit⁺)세포들 즉, LT-HSC, ST-HSC, MPP, 중 12개월령 TXNIP^-/-생쥐의 LT-HSC의 비율이 24개월령의 TXNIP^+/+와 유사한 수준으로 증가되고 MPP의 비율이 유사하게 감소되어, TXNIP^-/-의 HSC가 조기 노화되어 있는 것을 확인하였다(도 3C).

<1-2> TXNIP ^-/- 의 HSC 노화 인자 발현 확인

TXNIP가 HSC의 노화관련 인자의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여, TXNIP^-/-생쥐의 HSC에서, 노화에 의해 증가한다고 알려진 활성산소(reactive oxygene species, ROS) 수준을 측정하고 노화 관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 mRNA발현을 qPCR을 이용하여 확인하였다. 활성산소의 측정을 위해 골수세포를 추출 즉시 세포표면표지자로 염색한 뒤, 활성산소 특이적 프로브 CM-DCF-DA(Molecular Probes/Thermofisher Scientific) 또는 Dihydroethidium(DHE, Molecular Probes/ ThermoFisher Scientific)와 반응한 뒤 FACSCanto II (BD Biosciences)를 이용하여 유세포 분석 하였다.

그 결과, 12개월령 TXNIP^-/-생쥐의 HSC에서 대조군(TXNIP^+/+)에 비하여활성산소가 증가하였고(도 4A), p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현이 이미 노화가 진행된 24개월령 TXNIP^+/+ HSC와 유사하게 증가한 것을 확인하였다(도 4B 내지 E). 따라서, 상기 결과들은 TXNIP의 유전적 결손이 HSC의 노화의 원인임을 제시한다.

<1-3> TXNIP ^-/- 의 조혈작용 억제 확인

조혈작용(hematopoiesis)에 있어 TXNIP의 역할을 확인하기 위하여, 혈액을 순환하는 세포를 표적으로 하여 급성 백혈구 감소증을 유도하는 5-FU(5-fluoracil, 150mg/kg)를 TXNIP^+/+ 및 TXNIP^-/- 생쥐에 투여하고 17일간 혈액 내의 백혈구 수를 확인하였다.

그 결과, TXNIP^+/+ 및 TXNIP^-/- 생쥐 모두 백혈구 수가 점차 감소하여 6일에 최저숫자를 보였고, TXNIP^+/+ 생쥐는 14일 만에 백혈구가 정상상태로 회복된 반면, TXNIP^-/- 생쥐는 회복되지 못하고 17일에는 모든 TXNIP^-/- 생쥐가 사망했다(도 5A, B).

또한, HSC의 세포 자체내의 기능(autonomous function)을 확인하고자, 경쟁적 이식 분석(competitive transplantation assay)을 실시하였다. 경쟁적 골수 이식 분석을 위해서 어린 생쥐(young, 2개월령)(CD45.2⁺)로부터 골수세포를 추출하고, LT-HSC를 분리하였다. 400-500개의 LT-HSC를 1 x 10⁶ 내지 1.5 x 10⁶개의 경쟁자 골수세포(CD45.1⁺)와 혼합하여 치명적으로 방사능 조사된(lethally irradiated, 9Gy) 6 내지 8주령의 유사유전자계열 수여체(congenic recipient, CD45.1⁺) 생쥐의 꼬리정맥에 주입하였다. 16주 후, 생착된 LT-HSC 증식은 꼬리정맥으로부터 얻은 말초혈액 또는 골수 세포를 유세포분석 하였다. 또한 LT-HSC의 활성산소 수준을 확인하기 위하여, 골수세포를 추출 즉시 세포표면표지자로 염색한 뒤, 활성산소 특이적 프로브 CM-DCF-DA(Molecular Probes/Thermofisher Scientific) 또는 Dihydroethidium(DHE, Molecular Probes/ ThermoFisher Scientific)와 배양한 뒤 FACSCanto II (BD Biosciences)를 이용하여 유세포분석 하였다.

그 결과, TXNIP^-/- 생쥐로부터 유래된 HSC를 이식받은 수여체의 말초혈액 및 골수에서 CD45.2⁺ HSC의 생착이 현저하게 감소했다(도 5C, D). 상기 실험과 같이 노령의 HSC를 어린 공여체에 이식했을 때, B 림프구의 생착이 억제되고 myeloid 계열로 분화되는 경향을 계열편향(lineage skewing)이라고 하며, HSC 노화의 지표로알려져 있다. 상기의 경쟁적 이식에서 HSC의 계열편향을 유세포분석을 이용하여 확인한 결과 TXNIP^-/-생쥐의 HSC에서 유래한 CD45.2⁺세포가 TXNIP^+/+의CD45.2⁺세포에 비하여, B 림프구(B220⁺) 및 T 림프구(CD3⁺)로의 분화가 감소하고 myleoid로의 분화가 증가하는 것을 관찰하여, TXNIP^-/-의 HSC가 노화되었음을 확인하였다(도 5E). 또한, TXNIP^-/- 생쥐의 HSC에서 유래한 세포가 TXNIP^+/+에 비해 CD45.2⁺LSK 세포 중 MPP가 감소하고 LT-HSC가 증가한 것을 확인하였고(도 5F), TXNIP^-/- 생쥐의 HSC에서 유래한 LT-HSC에서 활성산소가 증가되어(도 5G), 상기 결과로부터 TXNIP는 조혈작용의 조절자이며 TXNIP의 결손은 HSC를 노화시키는 것을 알 수 있다.

< 실험예 2> TNXIP ^-/- HSC에서 p38의 활성화 확인

p38은 산화스트레스에 의해 유발되는 세포신호경로 및 HSC의 노화 관련 유전자 발현에 매우 중요한 역할 하는 효소로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 HSC의 노화와 p38의 연관관계를 알아보기 위하여, 골수(bone marrow, BM) 및 골수를 구성하는 아집단에서 p38 동형(isoform: α,β, γ 및 δ)의 mRNA 발현을 확인했다.

그 결과, 상기 4가지 p38 동형들 중 p38α가 주요하게 발현되며, LT-HSC에서 가장 우세하게 발현하는 것을 확인하였다(도 6A).

또한, HSC 노화에 있어서 p38과 TXNIP의 관계를 알아보기 위하여 TXNIP^+/+ 및 TXNIP^-/- 생쥐에서 연령별(2, 12 및 24개월) p38 활성을 확인하였다. 면역형광염색을 위해 골수 세포로 분리된 LT-HSC를 fibronectin이 코팅되어있는 커버글라스에 떨어뜨려 4℃에서 10분간 반응시킨 후 접착시키고 0.2% Triton X-100 용액으로 막에 구멍을 뚫은 후 5% BSA가 들어 있는 PBS에서 30분간 blocking하고 항-p38 또는 항-TXNIP 1차 항체를 처리하여 상온에서 1시간으로 반응하고 3회 5분씩 PBS로 세척 후, 2차 항체, Alexa Fluor 647 또는 Alexa Fluor 488를 처리하여 상온에서 1시간 반응한 후 5분씩 3회 세척후 슬라이드 글라스 위에 DAPI가 포함된 마운팅 용액을 넣고 고정한 후 공초점 현미경으로 이미지를 확인하였다.

그 결과, p38 단백질의 인산화(p-p38)가 연령의 증가와 TXNIP의 감소(TXNIP^-/-)에 의해 증가되는 것을 유세포분석(도 6B), 면역형광염색(도 6C), western blot(도 6D)으로 확인하였다. 또한, LT-HSC에서 TXNIP의 발현이 2개월에 비하여 24개월에 증가되어 있는 것을 확인함으로써(도 6E), 상기 결과로부터 HSC에서 TXNIP와 p38이 노화와 연관되어 있음을 제시하였다.

< 실험예 3> HSC에서 TXNIP와 p38의 직접 상호작용 확인

또한 본 실험자들은 TXNIP가 p38의 상호작용에 의하여 p38의 활성을 조절하는지 확인하기 위하여 면역침강법(immunoprecipitation) 및 in situ proximity ligation(PLA) 분석을 실시하였다. in situ PLA 분석을 위해서 HSC에 H₂O₂를 처리하고 파이브로넥틴이 코팅된 커버슬립에 뿌려 4에서 10분간 반응시켜 고정시켰다. TXNIP와 p38의 in situ 결합은 Duolink assay kit(Sigma)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였으며, TXNIP 항체(MBL) 및 p38항체(Cell signaling)를 이용하여 염색하고, LSM510 confocal microscope(Carl Zeiss)로 이미지를 얻었다. 면역침강법은 골수세포를 분리하여 세포 lysis 용액으로 세포를 파쇄하고 고속원심분리를 수행하여 상층액을 분리하고 단백질의 농도를 측정하여 500 ug/500 ul의 농도로 희석한 다음 항-TXNIP 항체를 10 ug /500 ul 농도로 넣은 다음, 1차 항체에 결합이 가능한 protein A agarose bead를 20 ul 넣어 4℃에서 4시간 반응시킨 다음 1 ml의 lysis 용액으로 3회 세척 후 모든 lysis 용액을 제거하고 다시 lysis 용액 25 ul와 5X SDS sample 용액을 넣고 100℃에서 3분간 끓인 후 SDS-PAGE gel에 전기영동 후 웨스턴블랏을 수행하였다.

그 결과, 면역침강법 결과로부터 TXNIP와 p38이 상호결합하고 있는 것을 확인하였고(도 7A), PLA 결과로부터 TXNIP와 p38이 상호결합하고 있는 것을 확인하였다(도 7B).

또한, TXNIP와 p38의 상호작용에 미치는 활성산소(ROS)의 영향을 조사하고자, H₂O₂를 처리한 뒤 웨스턴 블랏으로 TXNIP와 p-p38의 발현을 확인하였고, in situ PLA 분석을 실시하여 TXNIP와 p38의 결합을 확인하였다.

그 결과, 골수세포에서 TXNIP는 H₂O₂(0.5 mM)에 의해 매우 빨리 증가하여 15분에 최대로 발현된 후 이후 점차 감소하고, p-p38은 H₂O₂(0.5 mM)에 의해 증가하여 60분까지 유지되었다(도 7C). 또한 in situ PLA 분석에서 어린 HSC에 H₂O₂를 처리하면 노령의 HSC 수준으로 PLA 신호가 증가하여, TXNIP과 p38의 상호작용이 증가하는 것을 확인하였다(도 7D). 또한, TXNIP와 p38을 과발현한 HEK293T 세포에서 GST-full down 분석을 실시하여 H₂O₂(0.5 또는 1 mM)의 처리에 의해 TXNIP와 p38의 결합이 증가하고 이러한 결합의 증가는 p38의 인산화 활성과는 관련이 없는 것을 확인하였고, 이러한 결과를 통하여 산화스트레스가 TXNIP와 p38의 상호작용을 증진시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 7E).

다음으로, TXNIP-p38 상호결합의 필수 아미노산 잔기를 조사하기 위하여 잠재적 결합 도메인(docking domain)으로 생각되는 TXNIP의 소수성 잔기에 <실시예 2>의 방법으로 4가지의 위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 만들고, GST-full down 분석으로 p38과의 결합을 확인하였다.

그 결과, L290 및 L292 잔기의 위치 지정 돌연변이체가 p38과의 결합이 완전히 감소하여(도 7F), TXNIP의 L290 및 L292가 p38과의 상호결합에 중요함을 알 수 있다. 또한, p38의 모든 결합 도메인 변이체는 TXNIP와 상호결합이 감소하는 것으로 나타났다(도 7G). 상기 결과는 TXNIP이 p38과 직접 결합함으로써 HSC의 p38의 활성을 조절하는 것을 제시한다.

< 실험예 4> in vivo에서 p38의 활성을 억제하고 ROS를 감소시켜 HSC의 역노화 확인

본 발명자들 노화한 HSC의 회춘에 있어 p38의 역할을 조사하기 위하여 TXNIP^-/-/p38^AF/+ 생쥐(TXNIP knockout/p38 불활성화) 또는 p38 억제제인 SB203580을 투여한 생쥐를 이용하여 경쟁적 이식을 실시하였고, 말초 혈관에서 CD45.2⁺ LT-HSC의 생착을 분석하였다.

그 결과, 어린 TXNIP^-/-(TXNIP^-/-2M)에서 노화의 특징(즉 LT-HSC 생착감소, 계열편향 분석 결과 B 림프구 및 T 림프구가 감소 및 myeloid 증가)를 확인하였으나 p38의 활성억제(TXNIP^-/-/p38^AF/+ 또는 TXNIP^-/-/SB)에 노화의 특징이 억제되는 것을 확인하였다(도 9A. B). 아울러, 경쟁적 이식 후 CD45.2⁺ LSK세포의 구성을 분석한 결과, TXNIP^-/-/p38^AF/+ 또는 TXNIP^-/-/SB 에서, LT-HSC가 감소하고 MPP가 증가 하며(도 9C), p38 활성과 활성산소 수준이 낮은 것을 확인함으로써(도 9D, E), p38의 억제가 조혈모세포의 노화를 방지한다는 것을 증명하였다.

또한, 2개월 및 12개월령의 TXNIP^+/+, TXNIP^+/+/p38^AF/+,TXNIP^-/- 및 TXNIP^-/-/p38^AF/+생쥐의 말초혈액에서 백혈구 분포를 분석한 결과, 12개월의 TXNIP^-/-생쥐에서 노화한 계열편향이 나타나지만, 12개월령 TXNIP^-/-/p38^AF/+생쥐에서 TXNIP^+/+생쥐 수준으로 회복된 것을 확인하였다(도 9F).

아울러, 5-FU를 투여하여 급성 백혈구 감소증을 유도하였을 때, TXNIP^-/-생쥐의 생존률이 점차 감소하여 18일 이후 모두 사망하였고 p38의 활성 억제가 TXNIP^-/-생쥐의 생존률을 현저히 증가시키는 것을 확인하여(도 9G), 상기 결과로부터 p38이 HSC를 노화시키며, p38의 활성 억제가 HSC의 회춘를 유도한다는 것을 제시한다.

< 실험예 5> TNXIP 유래 펩타이드의 p38 활성 억제 확인

노화된 골수세포 또는 HSC 에서 TAT-TN13 펩타이드의 P38의 인산화 억제효과를 확인한 결과, TAT-TN13 펩타이드의 농도 의존적으로 p-P38 및 p-ATF2의 발현이 억제되어, TAT-TN13 펩타이드가 효과적으로 P38 인산화 효소의 활성을 저해함을 확인하였다(도8A).

TAT-TN13 펩타이드의 p38 억제 기전을 조사하기 위하여, p38과 결합하는 또 다른 p38의 상위 인산화효소 MKK3 또는 MKK6를 과발현하고 TAT-TN13 펩타이드를 처리하고 p38 단백질과 GST-full down 분석을 실시한 결과, TAT-TN13 펩타이드에 의해 p38과 MKK3 또는 p38과 MKK6의 결합이 저해되는 것을 확인하였다(도 8B, C).

상기 결과는 TAT-TN13 펩타이드가 MKK3 및 MKK6와 p38 도킹부위를 공유하며, p38과 상호결합을 통해 상위 인산화 효소와의 결합을 방해함으로써, p38인산화 효소의 활성을 억제함을 의미한다. 또한 도 8D에 나타난 것과 같이 TAT-TN13 펩타이드를 처리하지 않은 군에서 TXNIP의 면역침강에 의해 p38 단백질을 확인할 수 있는 반면, TAT-TN13 10 uM을 처리한 경우 p38 단백질 침강이 현저히 저해되어 TAT-TN13 펩타이드와 TXNIP가 경쟁적으로 p38과 결합하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 TXNIP가 p38과 직접 결합하여 활성을 억제한다는 것을 알 수 있다.

< 실험예 6> in vitro 에서 TAT -TN13로 인한 HSC의 역노화 확인

TAT-TN13를 이용한 p38의 억제가 노화된 HSC를 다시 젊은 단계로 되돌릴 수 있는지 확인하고자, 노화된 HSC에 10uM의 TAT-TN13를 16시간 동안 처리하였다.

그 결과, TAT-TN13이 노화된 HSC에서 p38 억제제(SB203580) 처리와 비슷한 수준으로 p-p38과(도 10A), 활성산소를(도 10B) 억제하는 것을 확인하였다.

Florian 등에 따르면, Cdc42의 극성(polarity)은 HSC의 나이를 나타내는 표지자 이며(노화되면 polarity 잃어버림), Cdc42의 약학적 억제는 노화된 HSC의 역노화를 유도한다(2013, Nature, 503, 392-396).

본 실험 예에서, Cdc42의 극성을 노화의 지표로써, 면역형광염색하여 확인하였다. 노령의 HSC를 파이브로넥틴이 코팅된 커버슬립(coverslip)에 뿌리고 4에서 10분간 배양하여 고정시킨 뒤, 10 uM의 TAT, TAT-TN13 또는 SB203580를 16시간 동안 처리하고, Cdc42 항체(Cell signaling), Alexa Fluor 546 항체(Life technology), DAPI containing mounting reagent (Molecular Probes)으로 염색하였다. 극성분석을 위해 Confocal microscope로 50 내지 60개의 HSC의 Cdc42의 극화 경향을 확인하였다.

그 결과, 도 대부분의 노화된 HSC는 비극화(depolarize) 되어 있으나(Old HSC-No, Old HSC-TAT), TAT-TN13 또는 SB203580으로 p38을 억제하면 HSC가 역노화하여 어린 HSC(2M HSC)와 유사하게 극성이 증가한다(도 10C).

또한, p38의 활성억제가 HSC의 역노화를 유도하는지 확인하기 위하여, TAT-TN13 또는 SB203580를 노령의 HSC에 처리하고 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 qPCR로 확인하였으며, 단기 귀소분석(Short-term homing assay)을 실시하였다. 단기 귀소 분석을 위해서 CD45.2⁺ HSC를 추출 즉시 10uM의 TAT, TAT-TN13 (Peptron사에서 합성) 또는 SB203580 (Selleckchem)를 처리하고, 16시간 동안 37, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 TAT, TAT-TN13 또는 SB203580가 처리된 HSC 또는 약물을 처리하지 않은 대조군 HSC 각각 10,000개를 치명적으로 방사능 조사된(9 Gy) 6 내지 8주령의 유사유전자계열 수여체(congenic recipient, CD45.1⁺) 생쥐의 꼬리정맥에 주입하였다. 18시간 뒤, 수여체 생쥐로부터 골수를 채취하여 CD45.1 또는 CD45.2 항체로 염색하고, 유세포 분석을 실시하여 총 골수세포 중 CD45.2⁺세포의 상대적 빈도를 분석하였다.

그 결과, TAT-TN13 또는 SB203580은 노화관련 유전자인 p16, p19, p21 및 Wnt5a의 발현을 현저히 감소시키며(도 10D-G), HSC의 귀소(homing)를 증가시키는 것을 확인함으로써(도 10H), TAT-TN13에 의한 p38의 활성 억제는 HSC의 역노화를 유도할 수 있다는 것을 밝혔다.

< 실험예 7> in vivo 에서 GFP -TN13 및 TAT -TN13에 의한 노화된 HSC의 역노화 확인

TN13 펩타이드가 동물에서도 적용되는지 확인하기 위하여, 생쥐로부터 CD45.2⁺ HSC를 추출하여, GFP가 결합된 GFP-TN13을 발현하는 lenti-viral vector를 36시간동안, 3회 감염시킨 뒤, GFP⁺ HSC만을 추출하고 CD45.1⁺ 골수세포와 혼합하여 경쟁적 이식을 실시하였다. 대조군으로 TN13이 결합되지 않은 GFP만 발현하는 lenti-viral vector를 사용하였다.

그 결과, TN13은 어린 TXNIP^-/-생쥐(TXNIP^-/- 2M-GFP) 및 노령의 TXNIP^+/+ 생쥐(TXNIP^+/+ Old-GFP)에서 나타나는 노화현상을 억제한다. 구체적으로 말초혈액을 분석하여 CD45.2⁺ 세포의 비율을 비교한 결과, 어린 TXNIP^-/-생쥐(TXNIP^-/- 2M-GFP)와 노화한 TXNIP^+/+ 생쥐(TXNIP^+/+ Old-GFP)에서 CD45.2⁺의 생착이 감소하였고, 상기 CD45.2⁺의 감소는 TN13 발현(TXNIP^-/- 2M-GFP-TN13 또는 TXNIP^+/+ Old-GFP-TN13)에 의해서 증가되었다(도 11A). 또한 계열편향 분석 결과, 말초혈액의 CD45.2⁺ 세포 중 TXNIP^-/- 2M-GFP-TN13 및 노화한 TXNIP^+/+ Old-GFP-TN13에서 myeloid의 증가를 억제하고, 감소된 B220 세포를 증가시켰으며(도 11B), CD45.2⁺ LSK 세포중 LT-HSC의 증가를 억제하고, 감소된 MPP를 증가시켜, TN13이 노화경향을 억제하는 것을 확인하였다(도 11C). 또한 TN13이TXNIP^-/- 2M-GFP-TN13 및 TXNIP^+/+ Old-GFP-TN13에서 p38 및 활성산소를 억제하는 것을 확인하였다(도 11D, E). 상기 결과는 TN13이 HSC의 노화를 억제할 수 있음을 제시한다.

in vivo의 노화된 HSC에 대한 역노화 약물로써 TAT-TN13의 활용성을 확인하기 위하여, TAT-TN13을 처리한 노령의 HSC(TXNIP^+/+ Old-TAT-TN13) 또는 12개월령의 TXNIP^-/- HSC(TXNIP^-/- 12M-TAT-TN13)를 경쟁적 이식하였다.

그 결과, TXNIP^+/+ Old-TAT-TN13 또는 TXNIP^-/- 12M-TAT-TN13에서 대조군(TXNIP^+/+ Old-TAT 또는 TXNIP^-/- 12M-TAT)에 비하여 CD45.2⁺세포의 생착이 증가되며(도 12A), 노화된 계열 편향 경향이 어린 TXNIP^+/+와 유사하게 회복되었고(도 12B), CD45.2⁺ LSK세포 중 LT-HSC 비율이 감소하고 MPP 비율이 증가되었으며(도 12C), p-p38 및 활성산소가 감소되어(도 11D, E), 대조군에서 나타나는 노화 특징들이 모두 역노화 특징으로 변화되는 것을 확인하였다. 또한, 노화된 TXNIP^+/+생쥐에 5-FU(100mg/kg)를 투여하여 급성 백혈구 감소증을 유도하고, 1일 뒤부터 4일간 매일 TAT-TN13(25 mg/kg)을 투여하였을 때, 대조군(24M-TXNIP^+/+-TAT)은 백혈구 수가 급격히 감소하여 10일에는 백혈구가 거의 없고 모두 사망하였는데 비해, TAT-TN13 투여군(24M-TXNIP^+/+ TAT-TN13)은 백혈구 수가 빠르게 증가하여 초기에는 어린 TXNIP^+/+보다도 수가 많음을 관찰하였고, 10일 이후 안정되어 13일에는 어린 TXNIP^+/+(TXNIP^+/+ 2M)와 같은 수준을 유지하였다(도 12F). 상기 결과는 TAT-TN13이 노화된 HSC를 역노화 시키는 약물로 활용 가능함을 제시한다.

< 실험예 8> TN13에 의한 p38 MAPK 활성 억제 확인

골수세포에서 TAT-TN13 펩타이드의 선택적인 P38 인산화 효소 활성 억제를 확인하기 위하여 TAT와 TXNIP유래이나 P38과의 상호작용에는 관여하지 않는 위치의 TXNIP의 아미노산 서열 110-122에 해당하는 LGTSFKGKYGCVD(서열번호 46) 서열을 포함하는 펩타이드 TAT-TN13C를 제작하여 대조군으로 실험하였다. 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 확인되는 바와 같이, TAT-TN13이 농도 의존적으로 p-P38의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 결과적으로 TAT-TN13 펩타이드가 선택적이고 효과적으로 P38 인산화 효소의 활성을 저해함을 확인하였다.

< 실험예 9> TN13에 의한 항염증 효과 확인

<9-1> 염증성 사이토카인 분비 억제 확인

TN13 펩타이드가 염증성 사이토카인들 (IL-1β/IL-6/TNF-α)의 세포 밖으로의 분비를 저해하는지 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 확인하였다. Raw264.7 대식세포를 12-well plate에 1×10⁶ cells/well이 되도록 분주하고 2시간 배양하였다. 이후 TN13 펩타이드를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양 후 각 well에 LPS를 100 ng/mL농도로 처리하여 18시간 배양한 상층액을 취하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성량을 측정하였다. Cytokine의 측정은 제조사의 분석방법에 따라 각 cytokine에 반응하는 항체가 코팅된 96 well plate에 준비된 standard와 sample들을 각100 μL씩 분주하여 실온에서 2시간 배양하고 3회 세척한 다음 biotinylated antibody reagent를 well당 50 μL씩 분주하여 실온에서 2시간 배양하였고, 3회 세척한 다음 Streptavidin-HRP solution을 well당 100 μL씩 분주하여 20분간 배양하고, 3회 세척 후 마지막으로 TMB substrate solution을 각 well당 100 μL씩 분주하여 실온 암소에서 반응시켰다. Stop solution(0.16 M sulfuric acid) 50μL씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (SpectraMax i3x,Molecular Device, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하여 정량하였다.

그 결과를 도 14에 나타내었다.

염증성 cytokine으로 대표되는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α는 염증반응을 매개하는 물질로 특히 초기 염증반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 염증성 cytokine의 생성양을 측정한 결과 TN13 펩타이드 처리는 LPS 로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포에서 증가된 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성을 효과적으로 감소시켰다. 특히, 20 μM 농도의 TN13 펩타이드를 처리한 경우에는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성이 LPS만 처리한 군에 비해 약 50%정도 억제되는 효과를 보였다. 이로써, TN13 펩타이드가 염증성 cytokines의 분비를 효과적으로 억제함을 확인하였다.

<9-2> p38 MAP Kinase, NF-kB (p65) 및 c-Jun의 활성 억제 확인

LPS자극을 통한 RAW264.7 cells에서의 p38 MAP Kinase 활성화가 TN13 펩타이드에 의해 억제되는지 확인하기 위해 RAW264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 6 well plates (Corning, USA)에 5×10⁵ cells/ml의 세포수가 되도록하여 각 well에 2ml씩 분주하여 37℃ 5% CO₂ incubator에서 2시간 동안 안정화시켜주었다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 TN13 펩타이드를 농도별 (1/5/10/20 μM)로 1시간동안 세포에 처리하였다. TN13 펩타이드의 반응이 종료된 후 100 ng/ml 농도로 LPS를 기존 배지에 첨가하여 30분간 자극을 주었다. LPS 자극 후 미디어를 제거하고 Cold PBS로 세척한 후 cell lysates는 Lysis buffer (+1% Triton X-100)를 첨가하여 proteins을 추출하였다. Protein content를 BCA protein assay (Thermo, USA)로 정량하여 40 ug의 단백질을 전기영동하였고, Immobilon-PVDF membrane (Merck, USA) 으로 transfer하였다. Transfer된 membrane은 Phosphate-buffered saline Tween-20 (PBST) (20 mM Tris, pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간동안 실온에서 blocking한 후 anti-phospho-p65, anti-p65, anti-phospho-p38, anti-p38 MAP kinase, anti-phospho-c-Jun, anti-c-Jun 그리고 β-actin primary antibody (1 : 1000 dilution)로 4℃에서 overnight 반응한 후 PBST로 3회 washing하고, HRP-conjugated secondary antibody (1 : 1000 dilution)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 면역반응성 단백질 밴드는 WSE-6200 LuminoGraph II (ATTO, Japan)을 이용하여 검출하였다.

그 결과를 도 15에 나타내었다.

p38 MAP Kinase의 활성은 염증반응에 중요한 전사인자인 NF-kB (p65)와 c-Jun의 활성을 유발한다고 알려져있다. 도 15에서 확인되는 바와 같이, TN13 펩타이드가 p38 MAP Kinase활성을 효과적으로 억제함으로써 NF-kB (p65)와 c-Jun의 활성을 억제함을 확인할 수 있었다.

<9-3> TN13 펩타이드에 의한 대식세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 억제 확인

염증반응이 일어나면 과량의 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE 2) 등의 염증인자가 유도형 NO synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase(COX-2)에 의해 형성된다. 이 두 단백질들에 대한 TN13 펩타이드의 효과를 확인하기 위해 RAW264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 6 well plates (Corning, USA)에 2.5×10⁵ cells/ml의 세포수가 되도록 하여 각 well에 2 ml씩 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 2시간동안 안정화시켜주었다. 새로운 DMEM배지로 교환한 후 TN13 펩타이드를 농도별 (1/5/10/20 μM)로 1시간동안 세포에 처리하였다.

그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에서 확인되는 바와 같이, LPS 비처리군은 COX-2 단백질이 거의 발현되지 않은 반면, LPS 처리군에서는 발현이 현저히 증가됨을 확인하였고, TN13 펩타이드 처리는 LPS로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포에서 효과적으로 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 이로써 TN13 펩타이드는 iNOS와 COX-2 단백질의 발현제어를 통해 NO 및 PGE2 생성을 억제하는 염증억제 작용이 확인되었으며, 특히 20 μM TN13 펩타이드의 경우 다른 농도에 비해 iNOS와 COX-2 단백질의 발현을 LPS 비처리군과 비슷한 수준으로 억제시킴을 확인하였다.

<9-4> TN13 펩타이드에 의한 대식세포에서의 NO 생성 억제 확인

NO 측정은 세포를 48-well plate 에 1×10⁵ cells/well이 되도록 분주하고 2시간 배양 후, TN13 펩타이드를 농도별 (1/5/10/20 μM) 로 처리하여 1시간동안 배양 후 각 well에 LPS를 100ng/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후에는 배양 상 층 액 100 μL를 취하여 Nitric Oxide detection kit (IntRON biotech.)의 매뉴얼에 따라 실험을 진행하여 NO level을 측정하였다.

그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에서 확인되는 바와 같이, LPS로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포는 NO의 생성이 현저히 증가되었으나 (10.433μM), TN13 펩타이드를 농도별 (1-20 μM)로 처리한 Raw264.7 macrophage에서는 NO의 생성을 억제하였다. 특히 20 μM TN13 펩타이드를 처리하였을 때는 LPS를 처리하지 않은 정상군(0.35 μM)에 가까운 NO 생성량을 나타내었다.

이상의 결과로 염증이 유도되었을 때 TN13 펩타이드의 처리가 효과적으로 NO의 생성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 10>TN13에 의한 골다공증 치료 효과 확인

<10-1> TN13에 의한 파골 세포 분화 억제 확인

Raw 264.7 세포를 1×10⁵/well의 밀도로 12 well plate에 분주하고 10% Fetal bovine serum (FBS)과 1×antibiotics, RANKL(40 ng/㎖)를 첨가한 α-minimum essential medium(α-MEM)배지에 TN13을 10 μM로 매일 처리하여 4일간 배양하였다. 2일 마다 배양액을 교환하여 TN13을 10 μM로 처리하였으며 4일째 TRAP용액으로 염색하여 파골세포로 분화를 확인하였다.

그 결과를 도 18의 A에 나타내었다.

도 18의 A에서 확인되는 바와 같이, 적자색의 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) 양성세포가 파골세포로 확인되는 바, TN13 처리에 의해 파골세포 분화가 억제됨이 확인되었다.

또한, 8주령의 암컷 C57BL6/J 생쥐를 경추탈골 법으로 희생시킨 후 경골 및 대퇴골에서 골수를 채취하였다. 채취한 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 FBS와 1×antibiotics, M-CSF (10 ng/㎖)를 첨가한 α-MEM배지에서 하루 배양하였다. 기질세포가 없는 비 부착성 세포만을 회수하여 FBS와 1×antibiotics, M-CSF (20 ng/㎖)를 첨가한 α-MEM 배지에서 100mm culture dish에 3일간 배양하였다. 3일 후 비 부착성 세포는 제거하고 나머지 부착세포는 파골전구세포로서의 대식세포(bone marrow macrophages, BMMs)로 사용하였다. 대식세포를 5×10⁴/well의 밀도로 24well plate에 분주하고 FBS와 1×antibiotics, M-CSF (30 ng/㎖), RANKL(50 ng/㎖)를 첨가한 α-MEM배지에 TN13과 p38 MAPK의 억제제인 SB203580을 10μM로 매일 처리하여 5일간 배양하였다. 2일 마다 배양액을 교환하여 TN13과 p38 MAPK의 억제제인 SB203580을 10μM로 매일 처리하였으며 5일째 TRAP용액으로 염색하여 파골세포를 확인하였다.

그 결과를 도 18의 B에 나타내었다.

도 18의 B에서 확인되는 바와 같이, 적자색의 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) 양성세포가 파골세포로 확인되는 바, TN13 처리에 의해 파골세포 분화가 억제됨이 확인되었으며, 이는 양성 대조군의 수준과 유사하였다.

<10-2> 골다공증 동물 모델에서의 치료 효과 확인

TN13 처리에 따른 골다공증의 치료 효과를 확인하였다.

실험 스케줄에 대해서는 도 19의 A에 나타내었다. 실험동물은 듀얼(주)에서 구입한 8주령의 C57BL6/J계 암컷 마우스를 구입하여 3군으로 분류하여 사용하였다. 골다공증 모델을 제작하기 위하여 전신마취 후 하복부의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 절개하고 복막, 근육, 피부의 각 층을 4호 실크로 봉합하고 (ovariectomy, OVX), 실험물질은 1주일의 회복기 후 투여를 시작하였으며, 1cc 주사기를 이용하여 복강내에 대조군으로 Vehicle과 25mg/kg의 용량으로 TN13을 이틀마다 6주간 투여하였다. 6주 후, 마우스를 경추탈골로 희생시키고 대퇴골을 얻어 4%의 formaldehyde로 고정하였다. micro-CT를 이용하여 대퇴골 내부의 3차원적 영상 (micro-CT)을 얻었으며 준비한 우측 대퇴골의 조직표본에서 골밀도, 소주골의 수. 골표면과 골부피/총부피, 골표면/총부피를 조직 형태학적으로 측정하였다.

그 결과를 도 19의 B에 나타내었다.

도 19의 B에서 확인되는 바와 같이, 25mg/kg의 용량으로 TN13을 복강내에 투여하였을 때 Vehicle을 투여한 군 보다 대퇴골 내부의 3차원적 영상의 골밀도 감소를 회복시킴이 확인되었다.

또한, 위 동물 모델을 이용하여 소주골의 골밀도, 소주골의 수, 골표면, 골부피/총부피, 및 골표면/총부피의 변화를 확인하였다. 분화된 성숙한 파골 세포의 배지를 걷어낸 후, 4%의 formaldehyde로 1분 동안 세포를 고정시킨후 증류수로 세척하여, 2% Fast garnet GBC base solution(Sigma, MO, USA)과 sodium nitrite solution (Sigma, MO, USA)을 같은 비율로 섞어 만든 용액, 5% Naphthol AS-BI phosphoric acid (Sigma, MO, USA), 4% Acetate solution(Sigma, MO, USA)과 2% Tartrate solution (Sigma, MO, USA)을 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하여 빛이 들어가지 않도록 주의하면서 37℃ water bath에서 1시간 동안 염색하고, 증류수로 세척한 후 현미경으로 적색으로 염색이 되어있는 세포를 확인하였다.

그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20에서 확인되는 바와 같이, TN13 처리에 의해 소주골의 골밀도(도 3A, TN13), 소주골의 수(도 3B, TN13), 골표면(도 3C, TN13), 골부피/총부피(도 3D, TN13), 골표면/총부피(도 3E, TN13)의 감소를 현저히 회복시키는 것을 관찰할 수 있었다.

위 결과를 통해 TN13이 골다공증 치료를 위한 치료물질로써 활용이 가능함을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition comprising peptide derived from thioredoxin-interacting protein or polynucleotide encoding the peptide for rejuvenation of stem cell <130> P17024-KRI <150> KR 10-2016-0121312 <151> 2016-09-22 <160> 46 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-TXNIP-T <400> 1 Asp Val Asn Thr Pro Asp Leu Met Ala Pro Val Ser Ala Lys Lys Glu 1 5 10 15 Lys Lys Val Ser Cys Met Phe Ile Pro Asp Gly Arg Val Ser Val Ser 20 25 30 Ala Arg Ile Asp Arg Lys Gly Phe Cys Glu Gly Asp Glu Ile Ser Ile 35 40 45 His Ala Asp Phe Glu Asn Thr Cys Ser Arg Ile Val Val Pro Lys Ala 50 55 60 Ala Ile Val Ala Arg His Thr Tyr Leu Ala Asn Gly Gln Thr Lys Val 65 70 75 80 Leu Thr Gln Lys Leu Ser Ser Val Arg Gly Asn His Ile Ile Ser Gly 85 90 95 Thr Cys Ala Ser Trp Arg Gly Lys Ser Leu Arg Val Gln Lys Ile Arg 100 105 110 Pro Ser Ile Leu Gly Cys Asn Ile Leu Arg Val Glu Tyr Ser Leu Leu 115 120 125 Ile Tyr Val Ser Val Pro Gly Ser Lys Lys Val Ile Leu Asp Leu Pro 130 135 140 Leu Val Ile Gly Ser Arg Ser Gly Leu Ser Ser Arg Thr Ser Ser Met 145 150 155 160 Ala Ser Arg Thr Ser Ser Glu Met 165 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN12 <400> 2 Gly Ser Lys Lys Val Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN13 <400> 3 Gly Ser Lys Lys Val Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN14 <400> 4 Gly Ser Lys Lys Val Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val Ile Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN15 <400> 5 Gly Ser Lys Lys Val Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val Ile Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK6 <400> 6 Ser Lys Gly Lys Lys Arg Asn Pro Gly Leu Lys Ile Pro Lys Glu Ala 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK3b <400> 7 Gly Lys Ser Lys Arg Lys Lys Asp Leu Arg Ile Ser Cys Asn Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEF2A <400> 8 Arg Lys Pro Asp Leu Arg Val Val Ile Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV TAT domain <400> 9 Tyr Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 2983 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 gtggctcttc tggcccgggc tactatatag agacgtttcc gcctcctgct tgaaactaac 60 ccctcttttt ctccaaagga gtgcttgtgg agatcggatc ttttctccag caattggggg 120 aaagaaggct ttttctctga attagcttag tgtaaccagc ggcgtatatt ttttaggcgc 180 cttttcgaaa acctagtagt taatattcat ttgtttaaat cttattttat ttttaagctc 240 aaactgctta agaatacctt aattccttaa agtgaaataa ttttttgcaa aggggtttcc 300 tcgatttgga gctttttttt tcttccaccg tcatttctaa ctcttaaaac caactcagtt 360 ccatcatggt gatgttcaag aagatcaagt cttttgaggt ggtctttaac gaccctgaaa 420 aggtgtacgg cagtggcgag aaggtggctg gccgggtgat agtggaggtg tgtgaagtta 480 ctcgtgtcaa agccgttagg atcctggctt gcggagtggc taaagtgctt tggatgcagg 540 gatcccagca gtgcaaacag acttcggagt acctgcgcta tgaagacacg cttcttctgg 600 aagaccagcc aacaggtgag aatgagatgg tgatcatgag acctggaaac aaatatgagt 660 acaagttcgg ctttgagctt cctcaggggc ctctgggaac atccttcaaa ggaaaatatg 720 ggtgtgtaga ctactgggtg aaggcttttc ttgaccgccc gagccagcca actcaagaga 780 caaagaaaaa ctttgaagta gtggatctgg tggatgtcaa tacccctgat ttaatggcac 840 ctgtgtctgc taaaaaagaa aagaaagttt cctgcatgtt cattcctgat gggcgggtgt 900 ctgtctctgc tcgaattgac agaaaaggat tctgtgaagg tgatgagatt tccatccatg 960 ctgactttga gaatacatgt tcccgaattg tggtccccaa agctgccatt gtggcccgcc 1020 acacttacct tgccaatggc cagaccaagg tgctgactca gaagttgtca tcagtcagag 1080 gcaatcatat tatctcaggg acatgcgcat catggcgtgg caagagcctt cgggttcaga 1140 agatcaggcc ttctatcctg ggctgcaaca tccttcgagt tgaatattcc ttactgatct 1200 atgttagcgt tcctggatcc aagaaggtca tccttgacct gcccctggta attggcagca 1260 gatcaggtct aagcagcaga acatccagca tggccagccg aaccagctct gagatgagtt 1320 gggtagatct gaacatccct gataccccag aagctcctcc ctgctatatg gatgtcattc 1380 ctgaagatca ccgattggag agcccaacca ctcctctgct agatgacatg gatggctctc 1440 aagacagccc tatctttatg tatgcccctg agttcaagtt catgccacca ccgacttata 1500 ctgaggtgga tccctgcatc ctcaacaaca atgtgcagtg agcatgtgga agaaaagaag 1560 cagctttacc tacttgtttc tttttgtctc tcttcctgga cactcacttt ttcagagact 1620 caacagtctc tgcaatggag tgtgggtcca ccttagcctc tgacttccta atgtaggagg 1680 tggtcagcag gcaatctcct gggccttaaa ggatgcggac tcatcctcag ccagcgccca 1740 tgttgtgata caggggtgtt tgttggatgg gtttaaaaat aactagaaaa actcaggccc 1800 atccattttc tcagatctcc ttgaaaattg aggccttttc gatagtttcg ggtcaggtaa 1860 aaatggcctc ctggcgtaag cttttcaagg ttttttggag gctttttgta aattgtgata 1920 ggaactttgg accttgaact tacgtatcat gtggagaaga gccaatttaa caaactagga 1980 agatgaaaag ggaaattgtg gccaaaactt tgggaaaagg aggttcttaa aatcagtgtt 2040 tcccctttgt gcacttgtag aaaaaaaaga aaaaccttct agagctgatt tgatggacaa 2100 tggagagagc tttccctgtg attataaaaa aggaagctag ctgctctacg gtcatctttg 2160 cttagagtat actttaacct ggcttttaaa gcagtagtaa ctgccccacc aaaggtctta 2220 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gtctaaagta 900 tatacattca gctgacataa ttcacaggga cctaaaacct agtaatctag ctgtgaatga 960 agactgtgag ctgaagattc tggattttgg actggctcgg cacacagatg atgaaatgac 1020 aggctacgtg gccactaggt ggtacagggc tcctgagatc atgctgaact ggatgcatta 1080 caaccagaca gttgatattt ggtcagtggg atgcataatg gccgagctgt tgactggaag 1140 aacattgttt cctggtacag accatattga tcagttgaag ctcattttaa gactcgttgg 1200 aaccccaggg gctgagcttt tgaagaaaat ctcctcagag tctgcaagaa actatattca 1260 gtctttgact cagatgccga agatgaactt tgcgaatgta tttattggtg ccaatcccct 1320 ggctgtcgac ttgctggaga agatgcttgt attggactca gataagagaa ttacagcggc 1380 ccaagccctt gcacatgcct actttgctca gtaccacgat cctgatgatg aaccagtggc 1440 cgatccttat gatcagtcct ttgaaagcag ggacctcctt atagatgagt ggaaaagcct 1500 gacctatgat gaagtcatca gctttgtgcc accacccctt gaccaagaag agatggagtc 1560 ctgagcacct ggtttctgtt ctgttgatcc cacttcactg tgaggggaag gccttttcac 1620 gggaactctc caaatattat tcaagtgcct cttgttgcag agatttcctc catggtggaa 1680 gggggtgtgc gtgcgtgtgc gtgcgtgtta gtgtgtgtgc atgtgtgtgt ctgtctttgt 1740 gggagggtaa gacaatatga acaaactatg atcacagtga ctttacagga ggttgtggat 1800 gctccagggc agcctccacc ttgctcttct ttctgagagt tggctcaggc agacaagagc 1860 tgctgtcctt ttaggaatat gttcaatgca aagtaaaaaa atatgaattg tccccaatcc 1920 cggtcatgct tttgccactt tggcttctcc tgtgacccca ccttgacggt ggggcgtaga 1980 cttgacaaca tcccacagtg gcacggagag aaggcccata ccttctggtt gcttcagacc 2040 tgacaccgtc cctcagtgat acgtacagcc aaaaaggacc aactggcttc tgtgcactag 2100 cctgtgatta acttgcttag tatggttctc agatcttgac agtatatttg aaactgtaaa 2160 tatgtttgtg ccttaaaagg agagaagaaa gtgtagatag ttaaaagact gcagctgctg 2220 aagttctgag ccgggcaagt cgagagggct gttggacagc tgcttgtggg cccggagtaa 2280 tcaggcagcc ttcataggcg gtcatgtgtg catgtgagca catgcgtata tgtgcgtctc 2340 tctttctccc tcacccccag gtgttgccat ttctctgctt acccttcacc tttggtgcag 2400 aggtttcttg aatatctgcc ccagtagtca gaagcaggtt cttgatgtca tgtacttcct 2460 gtgtactctt tatttctagc agagtgagga tgtgttttgc acgtcttgct atttgagcat 2520 gcacagctgc ttgtcctgct ctcttcagga ggccctggtg tcaggcaggt ttgccagtga 2580 agacttcttg ggtagtttag atcccatgtc acctcagctg atattatggc aagtgatatc 2640 acctctcttc agcccctagt gctattctgt gttgaacaca attgatactt caggtgcttt 2700 tgatgtgaaa atcatgaaaa gaggaacagg tggatgtata gcatttttat tcatgccatc 2760 tgttttcaac caactatttt tgaggaatta tcatgggaaa agaccagggc ttttcccagg 2820 aatatcccaa acttcggaaa caagttattc tcttcactcc caataactaa tgctaagaaa 2880 tgctgaaaat caaagtaaaa aattaaagcc cataaggcca gaaactcctt ttgctgtctt 2940 tctctaaata tgattacttt aaaataaaaa agtaacaagg tgtcttttcc actcctatgg 3000 aaaagggtct tcttggcagc ttaacattga cttcttggtt tggggagaaa taaattttgt 3060 ttcagaattt tgtatattgt aggaatcctt tgagaatgtg attccttttg atggggagaa 3120 agggcaaatt attttaatat tttgtatttt caactttata aagataaaat atcctcaggg 3180 gtggagaagt gtcgttttca taacttgctg aatttcaggc attttgttct acatgaggac 3240 tcatatattt aagccttttg tgtaataaga aagtataaag tcacttccag tgttggctgt 3300 gtgacagaat cttgtatttg ggccaaggtg tttccatttc tcaatcagtg cagtgataca 3360 tgtactccag agggacaggg tggaccccct gagtcaactg gagcaagaag gaaggaggca 3420 gactgatggc gattccctct cacccgggac tctccccctt tcaaggaaag tgaaccttta 3480 aagtaaaggc ctcatctcct ttattgcagt tcaaatcctc accatccaca gcaagatgaa 3540 ttttatcagc catgtttggt tgtaaatgct cgtgtgattt cctacagaaa tactgctctg 3600 aatattttgt aataaaggtc tttgcacatg tgaccacata cgtgttagga ggctgcatgc 3660 tctggaagcc tggactctaa gctggagctc ttggaagagc tcttcggttt ctgagcataa 3720 tgctcccatc tcctgatttc tctgaacaga aaacaaaaga gagaatgagg gaaattgcta 3780 ttttatttgt attcatgaac ttggctgtaa tcagttatgc cgtataggat gtcagacaat 3840 accactggtt aaaataaagc ctatttttca aatttagtga gtttctcaag tttattatat 3900 ttttctcttg tttttattta atgcacaata tggcattata tcaatatcct ttaaactgtg 3960 acctggcata cttgtctgac agatcttaat actactccta acatttagaa aatgttgata 4020 aagcttctta gttgtacatt ttttggtgaa gagtatccag gtctttgctg tggatgggta 4080 aagcaaagag caaatgaacg aagtattaag cattggggcc tgtcttatct acactcgagt 4140 gtaagagtgg ccgaaatgac agggctcagc agactgtggc ctgagggcca aatctggccc 4200 accacctgtt tggtgtagcc tgctaagaat ggcttttaca tttttaaatg gttgggaaag 4260 aaaaaaaaag aagtagtaga ttttgtagca tgtgatgtaa gtaatgtaaa acttaaattc 4320 cagtatccat aaataaagtt ttatgagaac aga 4353 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP(V178A/V180A) F <400> 12 ctgatgggcg ggcgtctgcc tctgctcgaa tt 32 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP(V178A/V180A) R <400> 13 aattcgagca gaggcagacg cccgcccatc agg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP(I208A/V210A) F <400> 14 acatgttccc gagctgtggc ccccaaagct gcc 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP(I208A/V210A) R <400> 15 ggcagctttg ggggccacag ctcgggaaca tgt 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP(I278A/V280A) F <400> 16 tattccttac tggcctatgc tagcgttcct gga 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP(I278A/V280A) R <400> 17 tccaggaacg ctagcatagg ccagtaagga ata 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence <220> <223> p38(D313A/D315A/D316A) F <400> 26 gctcagtacc acgctcctgc tgctgaacca gtggcc 36 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p38(D313A/D315A/D316A) R <400> 27 ggccactggt tcagcagcag gagcgtggta ctgagc 36 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p38AF F <400> 28 gatgaaatgg caggcttcgt ggccact 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p38AF R <400> 29 agtggccacg aagcctgcca tttcatc 27 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP F <400> 30 tgacctaatg gcaccagtgt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TXNIP R <400> 31 gccattggca aggtaagtgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16 F <400> 32 cgaactcttt cggtcgtacc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16 R <400> 33 cgaatctgca ccgtagttga 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p19 F <400> 34 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Claims

서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나로 이루어진 펩타이드와 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드의 융합펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 융합 펩타이드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 서열번호 9로 기재되는 서열로 구성된 TAT 펩타이드가 융합된 것을 특징으로 하는, 융합펩타이드.
역노화 활성 또는 줄기세포 노화 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나로 이루어진 펩타이드.
제1항의 융합펩타이드를 포함하는 역노화용 시약 조성물.
삭제
제1항의 융합펩타이드를 포함하는 줄기세포 노화 억제용 시약 조성물.
서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나로 이루어진 펩타이드를 함유하는 치매, 고혈압, 파킨슨병, 당뇨, 백내장, 골다공증, 뇌졸중, 치주질환 및 퇴행성관절염으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노인성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항의 융합펩타이드를 함유하는 치매, 고혈압, 파킨슨병, 당뇨, 백내장, 골다공증, 뇌졸중, 치주질환 및 퇴행성관절염으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노인성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나로 이루어진 펩타이드를 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항의 융합펩타이드를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
서열번호 2, 3, 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나로 이루어진 펩타이드를 함유하는 노화방지용 화장료 조성물.