KR20210009197A

KR20210009197A - 자가면역질환 및 염증성질환 펩타이드 치료제

Info

Publication number: KR20210009197A
Application number: KR1020190085927A
Authority: KR
Inventors: 최상돈; 서창희; 김욱; 샤 마수드; 아첵 아스마; 김기영; 정재연; 김순선
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-01-26
Also published as: CA3147002C; US20220257782A1; EP4001295A1; EP4001295A4; WO2021010621A1; KR102588548B1; AU2020313326B2; CN114502570A; CA3147002A1; JP2022540498A; AU2020313326A1

Abstract

본 발명은 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TIR-함유 분자에 강력하게 결합하여 TLR 특히, TLR4 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드, 상기 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 상기 펩타이드 또는 융합 펩타이드를 포함하는 TLR4 길항제 및 상기 펩타이드 또는 융합 펩타이드를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 TLR4를 비롯한 광범위한 TLR 신호전달 경로에 대한 억제 효과를 나타내며, MyD88- 및 TRIF-의존적 TLR4 경로를 차단하고, 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스 및 비알콜성 지방간염 마우스 모델에서 실질적인 질병 완화 효과를 가지므로, TLR의 음성 조절이 요구되는 면역 관련 질환 및 염증성 질환의 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

자가면역질환 및 염증성질환 펩타이드 치료제{Peptide Therapeutic Agent of Autoimmune Diseases and Inflammatory Diseases}

본 발명은 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TIR-함유 분자에 강력하게 결합하여 TLR 특히, TLR4 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드, 상기 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드, 상기 펩타이드 또는 융합 펩타이드를 포함하는 TLR 길항제 및 상기 펩타이드 또는 융합 펩타이드를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

수용체를 인식하는 패턴인식 패밀리인 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR)의 신호전달은 내재면역계에 의한 병원체 인식에 필수적이다. TLR은 감염 동안 사멸하는/손상된 세포에 의해 나타나는 또는 병원체에 의해 제시되는 독특한 특성을 인식한다. 이러한 특성은 danger-associated molecular patterns(DAMPs) 및 pathogen-associated molecular patterns(PAMPs)으로 알려져 있다(Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Cell 124, 783-801 (2006)). DAMPs/PAMPs를 인식하면 TLR의 TIR(Toll/interleukin-1 receptor) 도메인은 자가-결합(self-associates)을 하며, 이는 신호전달에 필수적이다. 이어서 TRIF(TICAM-1), MAL(TIRAP), MyD88 및 TRAM(TICAM-2)을 포함하는 다른 TIR-함유 어댑터 분자의 모집과 NF-κB, 인터페론 조절인자(IRFs) 및 다른 전사 인자의 활성화로 이어진다(Gay, N. J., et al ., Nat Rev Immunol 14, 546-558 (2014)). 어댑터 단백질의 모집 메커니즘은 모든 TLR에 대해 유사한 것은 아니다. MyD88을 통해 신호를 전달하는 TLR은 MAL-의존적일 수 있고, 또는 TLR-TIR 도메인에 직접 결합하여 하류 신호전달 캐스케이드를 유도할 수 있다. 한편, TLR3는 TRIF를 통해 MyD88 및 TRAM 자체적으로 신호전달을 조절한다.

일단 활성화되면, TLR은 원형질막에 위치한 지질뗏목(lipid raft)에 응집되어 매우 정교한 방식으로 하류 신호전달을 시작한다. TLR-TIR 및 어댑터 분자의 정확한 배열은 TLR이 신호를 전달하는 방법을 이해하는 데 중요하다. TIR-TIR 분자 상호작용을 해독하기 위해 많은 경험적 모델(Chen, C. J. et al ., Nat Med 13, 851-856 (2007)) 및 in silico 모델(Guven-Maiorov, E. et al ., Sci Rep 5, 13128 (2015))이 제안되었다. 그럼에도 불구하고, 그 복잡성으로 인해 전체 signalosome 구조는 아직 설명되지 않았다. 분자 도킹(molecular docking), 돌연변이유발(mutagenesis) 및 결정 접촉(crystal contact) 분석은 TIR-TIR 모델의 화학양론적 올리고머화를 제안하고 이들의 상호작용 인터페이스를 밝히는 데 사용되어 왔으나, 여전히 포유류 TIR 도메인에 대해서는 일반적인 TIR-TIR 인터페이스가 관찰되지 않았다. 결국, signalosome에서 TIR-TIR 상호작용의 화학양론적 관계는 가정되었으며, 이 상호작용-캐스케이드를 뒷받침하는 메커니즘은 모호하게 이해된다.

TIR-도메인 함유 어댑터 단백질 중에서 MAL(TIR domain adaptor protein; TIRAP)은 MyD88(Myeloid differentiation primary response 88)과 TLR2 또는 TLR4를 연결하는 능력을 갖는다. 양전하를 띠는 모티프를 함유한 N-말단은 PIP2 분자를 통해 원형질막에 MAL을 고정시킨다(Patra, M. C. & Choi, S., Front Immunol 9, 75 (2018)). MAL-TIR은 αC 및 αD 나선에 의해 촉진된 연속 대칭 이량체(back to back symmetric dimer) 형태 및 CD loop로 존재할 수 있다. 반대로, 최근 저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy; cryo-EM))에 의하면, MAL-TIR은 in vitro에서 BB-loop에 의해 촉진되는 자발적이고 가역적인 필라멘트를 형성한다고 제안되었다. 이는 아마도 이전의 결정 구조가 BB-loop 및 TIR-TIR 사슬내(intrastrand) 상호작용을 담당하는 다른 유연한 영역을 포착할 수 없었기 때문일 것이다. Cryo-EM 구조에 따르면, MAL은 head-to-tail 방식으로 BB-loop에 의해 사슬내 상호작용을 형성하고, 하나의 MAL-TIR의 αB 및 αC 나선 및 αD 나선 및 다른 MAL-TIR의 CD loop를 포함하는 사슬간(interstrand)-상호작용을 형성한다. 따라서, 사슬간-상호작용은 삼각형 방식으로 유지된다. 즉 하나의 서브유닛은 protofilament 내 2개의 다른 서브유닛과 상호작용한다. αC 나선을 포함하는 이 삼각형 사슬간 상호작용은 Lin et al .에 의해 제안된 이량체 대칭 인터페이스와 유사하다. MAL-TIR-filament는 또한 MyD88 어셈블리를 유도하고 TLR4-TIR과 co-filament를 형성한다.

αC 나선에서 W156, K158, Y159, L162 및 L165 잔기를 변이시킴으로써 사슬간 상호작용을 방해하면 MAL-TIR에서 filament 형성이 완전히 파괴된다. 또한 αC 나선에 존재하는 잔기는 MAL-MAL 상호작용을 방해하는 것으로 보고되었다. 이는 포유류 단백질-단백질 상호작용 트랩(mammalian protein-protein interaction trap; MAPPIT)) 방법을 통해 확인되었다. αC에서의 W156A 돌연변이는 실질적으로 MAL-MyD88 상호작용에 영향을 미쳤다(Bovijn, C. et al ., J Biol Chem 288, 12054-12066 (2013)). 대칭 인터페이스에서의 돌연변이는 또한 MAPPIT에서 MAL-TLR4ic(MAL-TLR4 intracellular domain)의 상호작용을 억제할 수 있었다. 나아가, MAL-MAL 사슬간-인터페이스와 유사한 방식으로, TLR4-TLR4-MAL TIR 상호작용에 대한 그럴듯한 사슬간-인터페이스가 제안되었다. 이러한 결과들은 TIR-TIR 상호작용 및 하류 신호전달 캐스케이드 촉진에서 MAL-αC의 중추적인 역할을 제안한다.

TLR2 및 TLR4 신호전달에서 MAL의 중요한 역할을 고려하여, MAL-유래 디코이 펩타이드(decoy peptide)가 디자인되었으며, TLR4 및 TLR2 길항 수용체(antagonistic capacities)가 보고되었다(Couture, L. A., et al ., J Biol Chem 287, 24641-24648 (2012)). 그러나 CC loop(TR6)와 함께 αC의 N-말단 절반으로부터 유래된 펩타이드는 TLR2/1 및 TLR4 신호전달을 억제할 수 있지만, CD loop(TR7)와 함께 C-말단 절반은 그렇지 못하다고 제안했다. 반대로, Lin et al .은 Q163A와 L165A(C-말단에 위치) 돌연변이가 NF-κB 유도를 각각 60% 및 20% 감소시킬 수 있다고 보고했다. Thomas et al .에 의한 구조 연구는 MAL protofilament 어셈블리에서 L165의 역할을 더욱 뒷받침한다(Lin, Z., et al ., PLoS One 7, e34202 (2012)).

이에, 본 발명자들은 αC의 C-말단이 N-말단의 절반만큼 중요하다고 가정하였으며, 안정한 나선형 구조로 인해 아미노산 P155-T166을 포함하는 펩타이드는 다른 MyD88-의존적 TLR 신호전달뿐만 아니라 MAL-TIR 어셈블리를 파괴하기에 충분할 것으로 가정하였다.

본 발명자들은 광범위한 TLR 신호전달 경로를 억제할 수 있는 새로운 디코이 펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, MAL의 αC 나선으로부터 유래된 펩타이드(‘MIP2’로 정의)를 디자인하고, 세포 투과성 펩타이드와 결합시킨 펩타이드가 TLR 신호전달을 성공적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 마우스의 건선 증상을 경감시키며, 전신홍반루푸스 마우스 모델에서 관찰된 증상을 완화시키고, 관절염 마우스 모델에서 치료 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 TLR 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드 및 상기 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 TLR 길항제(antagonist)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 TLR 길항제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 TLR4를 비롯한 광범위한 TLR 신호전달 경로에 대한 억제 효과를 나타내며, MyD88- 및 TRIF-의존적 TLR4 경로를 차단하고, 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스 및 비알콜성 지방간염 마우스 모델에서 실질적인 질병 완화 효과를 가지므로, TLR의 음성 조절이 요구되는 면역 관련 질환 및 염증성 질환의 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 펩타이드 디자인 및 in vitro 스크리닝을 나타낸 것으로,
도 1A는 MAL 및 다른 TIR-함유 어댑터 단백질과의 TIR-TIR 상호작용을 촉진하는 MAL의 αC를 나타낸 것이며, 도 1B는 컴퓨터를 이용하여 MAL/MyD88 억제 펩타이드(MIP) 및 그 유도체를 디자인하는 데 사용된 MAL의 αC 나선을 나타낸 것이다. 도 1C는 HEK-Blue™ hTLR4 세포에서 SEAP 신호를 측정하여 MIP1과 MIP2의 TLR-억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, 도 1D 내지 도 1E는 RAW264.7 세포에서 ELISA를 통해 측정된 IL-6와 TNF-α의 분비 수준을 나타낸 그래프이다. 도 1F는 RAW264.7 세포에서 TNF-α 수준을 측정하여 평가된 MIP2의 광범위한 TLR-억제 효과를 나타낸 그래프로, 다양한 농도의 PAM₃CSK₄(TLR1/2), FSL-1(TLR2/6), Poly(I:C)(TLR3), R848(TLR7/8), Imiquimod(IMQ; TLR7) 또는 CpG-ODN(TLR9)을 처리하여 세포를 활성화시켰다. 다양한 농도로 첨가하였다. 표시된 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험(n ≥ 3)에 의한 것이며, 막대는 평균 ± SEM(*P < 0.05, **P < 0.01)을 의미한다.
도 2는 MIP1, 2, 3로 명명된 각 펩타이드의 독성을 HEK-Blue^TM hTLR4, RAW264.7, THP-1 세포에서 평가한 것으로,
도 2A는 HEK-Blue^TM hTLR4 세포에서 MIP1과 MIP2 펩타이드가 독성을 나타내지 않음을 나타내고, 도 2B와 도 2C MIP2가 RAW264.7과 THP-1 세포에서도 독성을 나타내지 않음을 나타낸다. 도 2D는 MIP2-1, MIP2-2 및 MIP2-3가 LPS로 유도된 TNF-α 사이토카인과 NO의 분비를 억제 혹은 억제하지 못함을 각각 나타낸 것이며, 도 2E는 CPP가 없는 MIP2, CPP 단독 및 소수성 CPP인 PFVYLI가 LPS-자극 RAW264.7 세포에 대한 반응을 보여준다. 도 2F와 도 2G는 전신홍반루프스 마우스의 림프절과 비장을 절제하여 그 무게와 크기를 비교한 것이다.
도 3은 마우스 대식세포에서 MyD88- 및 TRIF-의존적 TLR4 신호전달을 억제하는 MIP2를 나타낸 것으로,
도 3A 내지 도 3C는 총-단백질 추출의 웨스턴 블랏 분석으로 측정된 RAW264.7 세포에서 p-p65, p65, Iκ-Bα, ATF3, p-IRF3, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38 및 p38의 단백질 발현 수준을 나타낸 것으로, β-actin이 loading control로 사용되었다. 도 3D는 면역형광 염색 및 공초점 현미경에 의해 측정된 NF-κB의 인산화(p-p65)를 나타낸 것으로, Hoechst가 핵 염색에 사용되었다(scale bar는 20μm을 나타냄). 도 3E는 웨스턴 블랏에 의해 측정된 MIP2로 완전히 억제된 iNOS 및 COX2의 발현 수준을 나타낸 것으로, β-actin이 loading control로 사용되었다. 도 3F는 standard NO secretion kit로 측정된 NO 분비 수준을 나타낸 그래프이며, 도 3G 및 도 3H는 각각 DAF-FM 및 DCF-DA 염색에 의해 정량화되고, MIP2에 의해 실질적으로 하향조절된 세포 내 NO와 ROS의 생성을 나타낸 그래프이다. 표시된 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험(n ≥ 3)에 의한 것이며, 막대는 평균 ± SEM(*P < 0.05, **P < 0.01)을 의미한다.
도 4는 THP-1 세포에서 TLR과 NLRP3 경로를 억제하는 MIP2를 나타낸 것으로,
도 4A는 웨스턴 블랏 분석으로 측정된 p-p65, Iκ-Bα, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38 및 p38을 포함하는 다중 전사 인자의 발현을 나타낸 것으로, β-actin이 loading control로 사용되었으며, 인자들의 인산화된 상태는 MIP2에 의해 실질적으로 억제되었다. 도 4B는 ELISA를 통해 평가할 때, MIP2에 의해 TNF-α와 IL-6의 분비 수준이 농도-의존적으로 억제됨을 나타내는 그래프이다. 도 4C는 LPS-사전처리(primed)후(100ng/ml for 4h) ATP-처리한(10mM) THP-1 세포에서 측정된 NLPR3에 대한 MIP2의 억제 효과를 나타낸 것으로, 웨스턴 블랏으로 NLRP3 및 pro-IL1β의 발현 수준을 측정하고, IL1β의 사이토카인 분비는 ELISA를 이용하여 평가하였다. 도 4D는 LPS-자극 세포에서 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정된 ATF3, p-IRF3, p-IRF7, pIRAK4 및 pro-IL1β의 발현 수준을 나타낸 것으로, β-actin이 loading control로 사용되었다. 표시된 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험(n ≥ 3)에 의한 것이며, 막대는 평균 ± SEM(*P < 0.05, **P < 0.01)을 의미한다.
도 5는 마우스에서 imiquimod-유도 건선을 개선하는 MIP2를 나타낸 것으로,
도 5A는 C57BL/6 수컷 마우스에서 imiquimod(IMQ)의 국소 도포에 의해 유도되는 건선을 나타낸 것으로, IMQ 도포 전 3가지 농도의 MIP2를 복강 내 투여하였으며, Methotrexate(MTX)는 MIP2의 상대적 치료 평가를 위한 양성 대조군으로 사용되었고, 등 피부 사진을 처리 4일째에 촬영하였으며, MIP2가 정상, 미처리 및 MTX로 처리된 그룹에 비해 치료 효과를 나타냄을 보여준다. 도 5B는 임상 Psoriasis Area and Severity Index(PASI)에 근거한 질병 중증도 점수를 나타낸 그래프로, 3개의 보라색 선은 각각 1, 10 및 20nmol/g의 MIP2로 처리한 마우스의 PASI 점수를 나타낸다. 도 5C 및 도 5D는 처리 요법 동안 MIP2가 마우스의 비장 중량 및 체중 동역학에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며, 도 5E는 MIP2가 표피의 두께(노란색 화살표)와 진피(초록색 화살표)의 두께에 미치는 영향을 나타낸 것으로, Leica DMi8 fluorescence microscope(scale bar 250μm)로 각 그룹의 피부 두께를 측정하였다. 도 5F는 각 그룹의 등쪽 피부 병변의 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것으로, brown staining의 강도는 병변에서 CD68(대식세포 마커)과 CD4 및 IL17(TH17 세포 마커)를 암시하고, 사용된 scale bar는 고배율 이미지에 대해 75μm이다. 데이터는 각 그룹의 5개 피부 조직 샘플로부터 얻은 평균 ± SEM을 나타낸다(###P < 0·001 between NC and PBS, **P < 0.01, *P < 0.05 between PBS and MIP2 at 1, 10, or 20nmol or MTX, according to two-tailed Student’s t-test).
도 6은 SLE 마우스 모델에서 MIP2의 치료 효과를 나타낸 것으로,
도 6A는 SLE 마우스 모델에서 MIP2의 억제 효과의 실험적 검증 결과를 나타낸 것으로, SLE-경향성 MIP2-처리 마우스에서 탈모의 현저한 감소가 관찰되었다. 도 6B는 MIP-처리 마우스에서 체중이 변하지 않았음을 보여주는 그래프이며, 도 6C 내지 도 6E는 MIP2-처리 SLE-경향성 마우스에서 임파선염과 비장종대가 유의하게 개선됨을 보여주는 그래프이다. 도 6F는 소변의 알부민 함량, 도 6G 내지 도 6J는 혈청 ANA, 항-dsDNA 항체, IL-6 및 C3 보체를 ELISA로 평가한 결과이다. 도 6K는 H&E 및 PAS 염색(scale bar 100μm)을 통한 신장의 조직학적 검사 결과로, 증식성 혈관사이세포(proliferative mesangial cell)와 확산된 초승달 모양(black broken circles)을 갖는 사구체 덩어리가 미처리 마우스에서 발견되었으며, MIP2-처리 마우스에서는 fibrocellular crescent(파란색 원)가 재형성되었고, 사구체가 정상으로 회복되었다.
도 7은 류마티스 관절염(RA) 랫트 모델에서 MIP2의 치료 효과를 나타낸 것으로,
도 7A는 1-6주에서 정상, MIP2-처리(20pmol/g of rat’s weight) 및 미처리 RA 랫트의 발 모니터링 결과이다(scale bar 10mm). 도 7B는 1-6주에 측정된 랫트의 발목 직경과 관절 지수 점수로, 두 그룹간의 평균값을 비교하기 위해 정확한 Wilcoxon Rank Sum test(Mann-Whitney U test와 수치적으로 동일)를 수행하였다(*P < 0.05 and **P < 0.01).
도 8A는 Oil red O stain을 통한 간 조직학적 검사를 나타낸 것이다(scale bar 50μm). Methionine-choline-deficient(MCD) diet에 의해 중대한 대수포성 지방(macrovesicular fat) 변화가 유발되었으며, MIP2에 의해 예방적 및 치료적 방식으로 지방증(steatosis)의 현저한 개선을 나타내지는 않았다(각각 MIP2 Prev 및 MIP2 Ther). 도 8B는 4마리 마우스 그룹의 간 콜레스테롤 및 중성지방 수준을 나타낸 것으로, MCD diet 유도된 간 지방 변화는 MIP2 Prev 및 MIP2 Ther 그룹 모두에서 개선됨을 확인하였다. 혈청 AST 및 ALT 수준은 MIP2에서 유의하게 개선되지 않았고(도 8C), 염증(도 8D) 및 섬유증(도 8E) 관련 유전자 전사 인자는 MIP2 투여로 유의하게 개선되었다. 조절장애 Pparα와 Ppar 전사 인자 수준이 MIP2 투여로 회복되었다(도 8F).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR)는 미생물과의 전투에서 중요한 역할을 하지만, 그들의 조절장애 신호전달 때문에 전신홍반루프스(systemic lupus erythematosus; SLE), 건선(psoriasis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA)과 같은 여러 면역 장애의 악화와 관련이 있다. 어댑터 TIR-TIR 상호작용의 화학양론(stoichiometry) 및 정확한 배열은 TLR 활성화 및 근본적인 신호전달-캐스케이드에 필수적이다. 어댑터 중 원형질막(plasma membrane)-고정 MAL은 BB-루프-매개 자체-올리고머화(BB-loop-mediated self-oligomerization)의 가능성이 있으며, αC 및 αD 나선을 통해 다른 TIR-도메인 함유 어댑터와 상호작용한다.

어댑터를 포함하는 TIR-도메인 중에서 MAL은 MyD88과 TLR9을 연결할 수 있다. 돌연변이 연구에 따르면, MAL의 αC 나선은 MAL-MAL뿐만 아니라 MAL-MyD88과 MAL-TLR4 상호작용에도 중요하다는 사실이 확인되었다. αC 나선의 C-말단 잔기의 돌연변이(Q163A 및 L165A)는 NF-κB 유도를 개별적으로 각각 60% 및 20% 저해하는 것으로 보고되었다. MAL-protofilament의 사슬간-인터페이스는 MAL-MyD88 및 MAL-TLR4/2 TIR-TIR 인터페이스와 유사한 것으로 제안되었다. 모델에서, TLR4의 αD 나선은 MAL의 αC 나선과 주요한 접촉을 형성하는 것으로 제안된다(도 1A). Tashchako et al .에 따르면 TLR4의 αD 나선으로부터 유래된 펩타이드는 TLR4에 대한 어댑터 모집을 차단했다. TLR4와 TLR2 사이의 ~40%의 서열 동일성 및 구조 유사성을 공유하는 TLR2의 αD 나선으로부터 유래한 펩타이드(2R9)는 TLR2에 대한 MAL의 모집을 억제했다. 따라서 본 발명자들은 전체 αC 나선(aa P155-T166 포함)으로 구성된 펩타이드는 나선 구조를 유지할 수 있고, 전체 TIR 도메인과 무관하게 MAL-TIR 어셈블리뿐만 아니라 다른 MyD88-의존적 TLR 신호전달을 억제하는 데 충분할 것으로 예상했다.

본 발명자들은 MAL-αC 인터페이스(interface) 지식 약물 분자구조(pharmacophore) 모델을 이용하여, 광범위한 TLR 억제 잠재력을 지니는 디코이 펩타이드(이하 “MIP2(MAL/MyD88 inhibitory peptide 2)”로 정의)를 디자인했다. MIP2는 쥐 및 인간 세포주에서 MyD88 및 TRIF-의존성 LPS-유도 TLR4 신호전달을 차단했다. MIP2는 건선, SLE 및 RA 질환 모델에서 치료적 잠재력을 나타냈다. 특징적인 혈청학적 및 조직학적 바이오마커가 현저하게 회복되었고, 질병 증상이 실질적으로 개선되었다. 종합하면, 이러한 in vitro 및 in vivo 연구결과는 MIP2가 TLR의 넓은 특이성을 가지며 미생물, 환경 또는 유전적 요인에 의해 유발된 자가면역성질환 및/또는 염증성질환을 조절하는데 효과적임을 시사하고 있다.

또한, 본 발명자들은 MAL의 αC 나선을 포함하는 펩타이드를 보고된 세포 투과성 펩타이드와 접합하여 리간드-유도 TLR 신호전달의 간섭에 대해 조사하였다. 초기 SEAP 분석에 따르면 CPP는 펩타이드의 효율적인 캐리어인 반면 PFV-접합 펩타이드는 상당한 효과를 나타내지 않았다(도 1C). 본 발명자들은 PFV-접합 펩타이드의 낮은 세포 투과능 때문이거나 CPP가 추가적인 TLR-억제 효과를 갖기 때문이라고 생각했다. TLR과 무관한 이전 연구 및 본 발명자들의 추가 조사에 따르면, CPP가 단독으로 사용되는 경우 TLR-억제 효과가 없었다.

락탐 브릿지와 이황화 결합은 구조적 자유를 제한하고, 치료용 펩타이드의 수용체 선택성 및 결합 친화도를 향상시키는 데 널리 사용되어 왔다(Harrison, R. S. et al ., Proc Natl Acad Sci U S A 107, 11686-11691 (2010)). 따라서 본 발명자들은 MIP2(또는 MIP3)에 이황화물 구조적 제한을 적용했다. MIP3에 의해 예상치 못한 세포독성 효과가 나타났으나, MIP2는 동일한 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다(도 2A). C-말단 잔기, 특히 L165가 MIP2의 TLR-억제 효과에 중요하다는 것을 확인하기 위해, 잔기 치환으로 유도체를 만들었다. MIP2-1(L165H 및 다른 치환)은 LPS-자극된 TLR4 신호전달을 억제하는 잠재력을 상실했다. 그러나, MIP2-2에서는 그 효과를 유지했으므로, 상기 효과의 상실은 C157A에 기인한 것이 아니다(도 2D, E).

인간과 마우스 대식세포에서 MIP2의 TLR-억제 효과를 더 평가하였다. MIP2는 광범위한 TLR-억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라, LPS-자극된 RAW264.7 세포와 THP1-유래 대식세포에서 TLR4의 MyD88 및 TRIF 의존 경로를 억제했다(도 3 및 도 4). 이는 MAL, TLR4-TIR 및 MyD88-TIR에 결합할 가능성이 있는 MAL의 αC 나선 구조로 MIP2가 구성된다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다(도 1A). 또한, MAL과 TRAM은 TLR4-TIR의 중첩 인터페이스와 결합하기 위해 경쟁하며, 두 경우 모두에서 MIP2가 관여된다. MIP2의 C-말단과 부분적으로 중첩되는 펩타이드는 TLR4와 MyD88 및 TRAM 물리적 상호작용을 배제하고 MyD88과 상호작용할 수 있다. MIP2는 광범위한 TIR-도메인 결합 능력을 보유하고, 따라서 광범위한 TLR-억제 잠재력을 보유함을 알 수 있었다. NLRP3 유도와 성숙한 IL-1β 방출은 TLR-자극과 관련이 있다. MyD88- 및 TRIF-의존적 TLR 경로는 모두 NLRP3 inflammasome을 감작시키고 활성화시킬 수 있다. 본 발명자들은 LPS로 감작된 ATP 활성화 THP-1 세포에서 MIP2가 NLRP3 및 pro-IL-1β의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다(도 4C).

TLR 신호전달 경로와 SLE, RA, 건선 및 패혈증을 비롯한 다양한 인체 질환과의 관계는 많은 데이터들에 의해 입증되었다(Duffy, L. & O’Reilly, S. C., ImmunoTargets and therapy 5, 69 (2016)). 건선, SLE 및 RA 동물 모델에서 MIP2의 치료 잠재력을 평가했다. MIP2는 C57BL/6 마우스에서 IMQ-유도 건선 증상을 실질적으로 완화시키고, 관련된 바이오마커(CD68, CD4 및 IL17)를 제한했다. MIP2는 IL6, 항-dsDNA, ANA 및 소변 알부민과 같은 SLE-관련 혈청 마커의 특징을 감소시키고, SLE-관련 임파선염 및 비장종대를 완화시켰다. 또한, 5-6주간 처리로 랫트의 관절염 증상을 완전히 치료하고, 관련 파라미터들을 회복시켰다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR4, TLR1/2, TLR2/6, TLR3, TLR7/8, TLR7 및 TLR9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TLR(Toll-like receptor)의 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 TLR4 또는 TLR7 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

TLR 외부 도메인(ectodomain)의 리간드-유도 이합체화(dimerization)는 TIR 도메인의 동형(homotypic) 및 이형(heterotypic) 결합(association)을 촉진하는 transmembrane 및 juxtamembrane 영역의 재배치를 유도한다. 그 결과, 협력하는 인터페이스 공유를 통한 TIR-포함 어댑터 분자의 모집으로 이어진다(Monie, T. P., et al ., Immunol Rev 227, 161-175 (2009)). TIR-TIR 상호작용의 복잡성과 모호한 화학량론은 일반적으로 인정된 인터페이스가 부족한 이유가 된다. TIR-TIR 상호작용이 TLR 신호전달에 필수적으로 필요한 초기 발생 이벤트라는 것은 일반적으로 인정된다. TLR-신호전달에서 중요한 역할을 하기 때문에, TIR-어셈블리의 분해는 관련된 면역 합병증에서 TLR 신호전달을 제거할 수 있는 잠재력이 있다. 종합하면, 본 발명에 따른 in vitro 및 in vivo 연구결과를 통해, 본 발명의 펩타이드가 TLR 억제의 광범위한 특이성을 갖고 있으며, 미생물 또는 환경 요인에 의해 유발된 자가면역 합병증을 조절하는 데 효과적일 것임을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 MAL(TIR domain adaptor protein; TIRAP)의 αC 나선으로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 TIR(Toll/interleukin-1 receptor) 도메인 또는 TIR-함유 어댑터(adaptor) 분자에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 TIR 도메인은 TLR 특히, TLR4 신호전달의 도메인이며, 상기 TIR-함유 어댑터 분자는 MAL(TIR domain adaptor protein; TIRAP), MyD88(Myeloid differentiation primary response 88), TRIF(TIR domain-containing adapter-inducing interferon β; TICAM-1) 또는 TRAM(TICAM-2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성 기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어, “TLR4”는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(transmembrane) 단백질 패밀리인 TLRs에 속하는 단백질로서, TLR4 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD 284(cluster of differentiation 284)로 명명되기도 한다. 상기 TLR4는 그람-음성 박테리아의 LPS를 비롯한 다양한 PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)를 인지하기 때문에 선천성 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.

본 발명에서 용어, “TLR4 신호전달 경로”는 TLR4를 통한 신호전달 경로를 말한다. TLR4는 여러 어댑터 단백질에 의해 신호를 전달하며, 상기 신호전달 경로는 TIRAP(MAL로도 지칭됨)과 MyD88 및 트램(TRAM)과 트리프(TRIF)로 작동한다. TLR4 매개 신호전달 경로는 다양한 하위 신호전달 분자를 통해 MyD88-의존적 및 MyD88-비의존적 신호전달의 활성화를 유도한다. MyD88-의존 경로의 개시는 NF-κB의 초기 단계 활성화 및 TNF-α 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 분비를 유도하며, MyD88-비의존적 경로의 개시는 IRF3 및 7의 활성화, IFNs의 분비 및 NF-κB의 후기 단계 활성화를 유도한다(Park, B.S et al ., Exp. Mol . Med . 45:e66, 2013; Nijland, R et al ., Mar . Drugs 12:4260-4273, 2014). 또한, TLR4는 ERK, JNK 및 p38를 포함하는 MAPK의 활성화를 유발하고, 염증성 사이토카인 및 IFN을 분비한다(Achek, A et al., Arch . Pharmacal Res . 39:1032-1049, 2016; Kawai,T et al., Nat . Immunol . 11:373-384, 2010). 대식세포에서 관련 리간드에 의한 TLR4의 자극이 COX2와 iNOS를 유도하고 NO의 생성을 유도하며, 미토콘드리아와 세포 내 ROS를 생성한다(Kim, J.Y et al., Eur . J. Pharmacol . 584:175-184, 2008; Liu, K.-L. et al . J. Agric . Food Chem . 54:3472-3478, 2006; West, A.P. et al . Nature 472:476, 2011).

본 발명에 있어서, 상기 TLR4 신호전달 경로는 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어, “억제”는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 활성이 저하되는 현상을 말하며, TLR의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나, 감소시키거나, 예방하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화시키거나 또는 하향 조절하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드의 TLR4 신호전달 경로 차단에 의해 IL-6, TNF-α 분비 억제; NF-κB 활성 억제; NLRP3 및 pro-IL-1β 발현 억제; IRF3, IRF7의 인산화 및 ATF3의 발현 억제; iNOS와 COX2의 발현 억제; NO의 방출 및 세포 내 ROS의 생성이 억제될 수 있으며, 상기 펩타이드는 MyD88-의존적 및 TRIF-의존적 TLR4 신호전달 경로를 모두 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)가 결합된 융합 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 TLR4 또는 TLR7 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 TLR4 신호전달 경로는 LPS에 의해 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드의 TLR4 신호전달 경로 차단에 의해 IL-6, TNF-α 분비 억제; NF-κB 활성 억제; NLRP3 및 pro-IL-1β 발현 억제; IRF3, IRF7의 인산화 및 ATF3의 발현 억제; iNOS와 COX2의 발현 억제; NO의 방출 및 세포 내 ROS의 생성이 억제될 수 있으며, 상기 펩타이드는 MyD88-의존적 및 TRIF-의존적 TLR4 신호전달 경로를 모두 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어, “세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide; CPP)”는 일종의 신호 펩타이드(signal peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 특정 아미노산 서열의 조합인 펩타이드이다. 현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 고분자 물질의 세포 내 전달을 위해 이용되고 있다.

본 발명의 융합 펩타이드는 세포 투과성 펩타이드를 이용하고 있으며, 상기 세포 투과성 펩타이드는 세포 내재화(endocytosis) 기전에 의해 세포 내로 들어가는 특징을 가지고 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 하기 표 1에 나열된 세포 투과성 펩타이드 또는 이의 변이체 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

세포 투과성 펩타이드

펩타이드	유래	서열(5’->3’)
Penetratin	Drosophila Antennapedia homeodomain	RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 6)
TAT_(48-60)	Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) TAT	GRKKRRQRRRPPQ
pVEC	VE-Cadherin(615-632)	LLIILRRRIRKQAHAHSK
Transportan 10 /TP10	Galanin-Lys-mastoparan	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
MPG	A hydrophobic domain from the fusion sequence of HIV gp41 and NLS of SV40 T-antigen	GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV
Pep-1	NLS from Simian Virus 40 large T antigen and reverse transcriptase of HIV-1	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
MAP	Amphipathic model peptide	KLALKLALKALKAALKLA
R₆/W₃	Based on penetratin	RRWWRRWRR
Polyarginine (R₉,R₈)	Positively charged sequence	R_n, n = 8 or 9
VP22	Herpes simplex virus	NAKTRRHERRRKLAIER
YTA2	MMP cleavage site as seeding sequence	YTAIAWVKAFIRKLRK
YTA4	MMP cleavage site as seeding sequence	IAWVKAFIRKLRKGPLG
M918	The tumor suppressor protein p14ARF	MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV
CADY	Derived from PPTG1 peptide, W and charged amino acids	GLWRALWRLLRSLWRLLWRA
SAP	Designed based on a natural protein of maize, γ-zein VHL (PPP)₈	(VRLLPPP)₃
SAP(E)	Design inspired by SAP; Arg residue replaced by Glu	Ac-CGGW(VELPPP)3
CyLoP-1	Derived from crotamine toxin found in snake venom, crot(27-39)	CRWRWKCCKK
gH 625	Based on the 625-644 residues of the glycoprotein HSV 1	HGLASTLTRWAHYNALIRAF
GALA	Glu-rich an containing His (imidazole group) in order to be pH responsive (endosomes) (Designed to efficiently escape endosomes)	WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA
CADY	Designed; based on chimeric peptide carrier PPTG1 derived from the fusion peptide JTS1	Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-cysteamide
L17E	Inspired by the spider venom M-lycotoxin	IWLTALKFLGKHAAKHEAKQQLSKL
MPPs	Designed to contain un-natural, cyclohexylalanine (F_x) residues and to have differential intracellular localization	Mitochondria-penetrating peptides (example: F_XrF_XKF_XrF_XK)
RR₅-APP RR₄-APP RR₃-APP	Small proteins (36-residue polypeptides)	RPRRPRRPRRPGRRAPVEDLIRFYNDLQQYLNVVTRHRYC RRPRRPRRPGRRAPVEDLIRFYNDLQQYLNVVTRHRYC GPRRPRRPGRRAPVEDLIRFYNDLQQYLNVVTRHRYC
TATp-D	Analogue of TAT
Cyclic Tat	Lys- and Glu- amino acids added to the linear Tat sequence to obtain a ring with the same overall charge as the native form	c[K-rRrQrRkKrG-E]c
K₁₀(QW)₆	The design was based on combining W and K at the primary structure level to obtain self-assembly into a variety of nanostructures	KKKKKKKKKKQWQWQWQWQWQW
TAT _(49-57)	HIV-1 TAT protein	RKKRRQRRR
DPV1047	Chemically synthesized	VKRGLKLRHVRPRVTRMDV
ARF_(1-22)	p14ARF protein	MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV
BPrPr_(1-28)	N terminus of unprocessed bovine prion protein	MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRP
p28	Azurin	LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD
VT5	Chemically synthesized	DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD
C105Y	α1-Antitrypsin	CSIPPEVKFNKPFVYLI
PFVYLI	Derived from synthetic C105Y	PFVYLI(서열번호 7)
Pep-7	CHL8 peptide phage clone	SDLWEMMMVSLACQY

한편, 상기 표 1의 세포 투과성 펩타이드 중 Transportan은 다음와 같은 변이체의 형태로 사용되는 것을 포함한다: AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH₂(TP10, PepFect 3), AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH₂(TP10, PepFect 6), AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL-NH₂(TP10, PepFect 14), AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH₂(NickFect 1), AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH₂(NickFect 2) 및 AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH₂(Nickfect 3).

본 발명의 일 실시예에서는 상기 표 1의 세포 투과성 펩타이드 중 Penetratin 서열(RQIKIWFQNRRMKWKK; 서열번호 6)과 PFVYLI(서열번호 7)을 선택하여 실험을 수행하였으며, 상기 실제로 사용한 세포 투과성 펩타이드 외에 다른 세포 투과성 펩타이드를 본 발명의 펩타이드와 융합시킨 경우에도 본 발명과 유사한 효과가 나타남은 당업자에게 자명할 것이다. 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과성 펩타이드를 융합시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 세포 투과성 펩타이드가 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 펩타이드의 N-말단에 세포 투과성 펩타이드가 결합된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단에 세포 투과성 펩타이드가 연결된 상기 융합 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있으며, 구체적으로 상기 변이체는 서열번호 8과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 펩타이드를 모두 포함할 수 있다. 상기 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것을 말한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 TLR 길항제(antagonist)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 TLR은 TLR4, TLR1/2, TLR2/6, TLR3, TLR7/8, TLR7 및 TLR9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어, “길항제(antagonist)”는 임의의 메커니즘에 의하여, 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미한다.

본 발명에서 용어, “TLR 길항제”는 TLR의 생물학적 활성을 직간접적으로, 또는 실질적으로 방해, 감소 또는 저해할 수 있는 물질을 말하며, 바람직하게는 TLR과 반응성인 펩타이드는 TLR 또는 TIR 도메인에 직접 결합하고, TLR의 활성을 중화시킴으로써 TLR 신호전달 경로를 차단하여, NF-κB 및 MAPKs의 활성화의 감소를 유발해 염증성 사이토카인, NO 및 ROS의 분비를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 펩타이드는 LPS에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써, IL-6, NO 및 ROS의 분비와 NF-κB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 효과가 우수하여, TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역질환 및 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

리간드-결합 도메인을 표적하는 TLR-억제 분자를 개발하기 위한 상당한 노력이 있어왔다. 소분자(small molecule)로 단백질-단백질 인터페이스(PPI)를 표적하기 위해 많은 노력이 있었음에도 불구하고, 생물학적으로 중요한 PPI에 효과적인 후보물질을 선택하는 것은 어려운 과제로 남아있다. TIR-도메인에 대한 소분자의 비가용성은 부분적으로 충분한 구조 정보의 부족, 평평한 단백질-단백질 인터페이스 및 잘 정의되지 않은 포켓(pocket) 때문일 수 있다. 펩타이드-약물은 효소 절단이 쉽고 생물학적 이용 가능성이 낮지만(Newland, A. et al ., British journal of haematology 135, 547-553 (2006)), 소분자에 비해 낮은 독성과 향상된 표적 선택성을 제공한다. 펩타이드 또는 펩타이드-유사체의 개발은 의약품이 될 수 없는 PPI를 특이적으로 타겟함으로써 ‘의약품이 될 만한 게놈(druggable genome)’을 확장하는 핵심적인 방법이 된다(Hopkins, A. L. & Groom, C. R., Nat Rev Drug Discov 1, 727-730 (2002)).

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “자가면역질환”은 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 발생하여 자기항원에 대한 면역반응이 일어나, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는 과정에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 상기 자기관용이란 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness)을 말한다. 본 발명의 자기면역 질환은 건선, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 천식, 크론병, 다발성 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염, 피부근육염, 원판상루푸스 및 전신홍반루푸스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 펩타이드 또는 융합 펩타이드를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 펩타이드 또는 융합 펩타이드와 함께 자가면역질환 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드를 포함하는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “염증성질환”은 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α, IL-1, IL-6, 프로스타글란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotriene) 또는 NO와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다. 본 발명의 염증성질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 습진, 알러지, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 측두 동맥염, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비만, 바이러스 감염 및 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물은 상술한 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

실시예 1-1: 펩타이드 합성, 시약 및 세포주 최적화

역위상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phase high performance liquid chromatography, HPLC; Shimadzu Prominence)에 의해 결정된 바와 같이, 펩타이드는 Biostem(Ansan, Korea)에 의해 97.09%(MIP1), 97.17%(MIP2) 및 95.1%(MIP3)의 순도로 합성되었다. 모든 펩타이드에 대해, Shiseido Capcell pak C18 column(4.6 x 50 mm)이 사용되었으며, 0.1% trifluoroacetic acid(TFA)-water에서 10-60% acetonitrile 구배와 함께 1ml/min 유속으로, 220nm에서 검출하였다. MIP1, MIP2 및 MIP3의 분자량은 Shimadzu LCMS-2020으로 측정하였으며, 각각 2182.6Da, 3710.5Da 및 3680.5Da이었다. LPS(Escherichia coli 0111: B4) 및 adenosine triphosphate(ATP)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. PAM₃CSK₄(TLR1/2), Poly(I:C)(TLR3), Imiquimod(IMQ; R837, TLR7), R848(TLR7/8) 및 CpG-ODN(TLR9)은 Thermo Fisher Scientific, Inc.로부터 구입하였고, FSL-1(TLR2/6)은 InvivoGen(San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다.

1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 및 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 및 0.2% 노모신(normocin)(InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 함유하는 또는 함유하지 않는 고당 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에서 HEK-Blue™ hTLR4 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA) 및 RAW264.7 세포를 배양하였다. THP-1 세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 및 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하고, 80nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 24시간 동안 대식세포로 분화 유도하였다. 모든 세포들을 5% CO₂, 37℃의 습한 조건(Thermo Fisher Scientific, Inc.)에서 배양하였고, 배양 18시간 후 배지를 교체하였다.

실시예 1-2: 세포 생존율( cell viability ) 분석

HEK-Blue™ hTLR4 세포를 5×10⁴/well의 밀도로 분주하고, RAW264.7 및 THP-1 세포는 2×10⁵/well로 분주하였다. 모든 세포를 96-well plates(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 밤새 배양하였다. 세포 생존율은 colorimetric 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan(MTT) assay(Sigma-Aldrich) 및/또는 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)(Promega Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이는 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Kwon, H. K. et al ., Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology 148, 204-219 (2015)).

실시예 1-3: SEAP 활성 분석

HEK-Blue™ hTLR4 세포를 2×10⁵/well의 밀도로 분주하고, 24-well plates(BD Biosciences)에서 밤새 배양하였다. LPS(100ng/ml)의 존재 및/또는 부재 하에, 상이한 농도의 MIPs를 세포에 처리하였다. 처리된 세포로부터 상층액 일부(200μl)를 미세원심분리(micro-centrifuge) 튜브로 옮기고, heating block(FINEPCR Co., Seoul, Korea)을 이용하여 65℃에서 10분간 가열하였다. 이후, 상층액을 새로운 96-well plates(BD Biosciences)에 옮기고, HEK-Blue™ detection kit(InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 사용하여 SEAP 생산을 검출하였다. 마이크로플레이트 리더 분광광도계 시스템(Molecular Devices Inc., Silicon Valley, CA, USA)을 이용하여 620nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 1-4: ELISA

THP-1-유래 대식세포 및 RAW264.7 세포를 96-well plates(BD Biosciences)에 2×10⁵/well의 밀도로 분주한 뒤, 밤새 성장시켰다. 처리 24시간 후, Mouse IL-6 ELISA MAX™ Deluxe(BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 IL-6 분비를 평가하였고, Mouse TNF alpha ELISA Ready-SET-Go!^® kit(eBioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 TNF-α 생산을 평가하였다. THP-1 세포에서 MIP2 처리 24시간 후, IL-6 및 TNF-α의 분비 수준을 각각 Human IL-6 및 TNF alpha ELISA MAX™ Deluxe(BioLegend, San Diego, CA, USA) kits를 사용하여 평가했다. 이어서 마이크로플레이트 분광광도계 시스템(Molecular Devices)을 이용하여 플레이트를 각각의 파장에서 분석하였다.

실시예 1-5: 단백질 정량( protein quantification ) 및 웨스턴 블랏 ( western blot ) 분석

총-단백질 추출은 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용하여 수행하였다. 단백질의 농도는 bicinchoninic acid(BCA) assay kit(Sigma-Aldrich)로 측정하였다. Mini-PROTEAN Tetra Cell 및 mini trans-blot electrophoretic transfer cell system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 겔 전기영동 및 전개를 포함한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(Kwon, H. K., et al ., Sci Rep 5, 15623 (2015)). 막을 p-p65, p-JNK, JNK, p-IRF3, p-IRF7, p-ERK, ERK, p-p38, p38, Iκ-Bα, IL1β, NLPR3 및 p-IRAK4(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA); p-ERK, p-p38, JNK, ATF3, COX2 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA); 및 iNOS(BD Biosciences)에 대한 특이적 1차 항체(1:500-1000)로 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 가볍게 쉐이킹하여 면역블랏팅하였다. 이어서, 상기 막을 PBST(phosphate buffered saline with Tween 20)로 철저히 세척하고, peroxidase-결합 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 항체(1:1000)와 함께 2시간 동안 배양하였다. SuperSignal West Pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific, Inc.)으로 단백질을 검출하고, ChemiDoc™ Touch Imaging System(Bio-Rad Laboratories)으로 검출된 단백질을 시각화하였다.

실시예 1-6: 세포 내 NO , ROS 평가 및 NO 분비 분석

RAW264.7 세포를 6cm 배양 접시(SPL Life Sciences, Pochun, Korea)에 1×10⁶으로 분주하고, 밤새 배양하였다. LPS 자극 및 MIP2 처리 후, DAF-FM 및 DCF-DA dyes(Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 세포 내 NO(Nitric Oxide) 및 ROS(reactive oxygen species)를 정량하였다(Kwon, H. K., et al ., Sci Rep 5, 15623 (2015)). Diva software(BD Biosciences)로 FACSAria III 기기를 사용하여 세포의 형광 강도를 분석하였다. 세포 외 NO 생성을 평가하기 위해, RAW264.7 세포를 96-well plates(BD Biosciences)에 2×10⁵/well의 밀도로 분주하고, 밤새 배양하였다. NO의 분비는 Nitric Oxide Detection Kit(iNtRON Biotechnology Inc., Seongnam, Korea)로 측정하였다(Kwon, H. K. et al ., Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology 148, 204-219 (2015)). 550nm에서 마이크로플레이트 분광광도계 시스템(Molecular Devices)을 사용하여 흡광도를 측정하였다.

실시예 1-7: 공초점 현미경( confocal microscopy ) 분석

RAW264.7 세포를 24-well plates(BD Biosciences)에 2×10⁵/well의 밀도로 분주하고, LPS 자극(100ng/ml) 전에 세포를 1시간 동안 MIP2(50μM)로 처리하였다. 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma-Aldrich)으로 고정하고, 0.2% 트리톤 X-100 용액(AMRESCO, Solon, OH, USA)으로 15분간 침지시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 2% BSA 용액(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용하여 블로킹하였다. 이후, 이들 세포를 2시간 동안 항-p-p65 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.)와 함께 배양하고, PBS로 철저히 세척하였다. 다음으로, 세포를 1시간 동안 Alexa Fluor 546 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 배양하고, PBS로 3회 세척하였다. Hoechst 33258 용액(5μM; Sigma-Aldrich)을 사용하여 핵을 염색하였다. 형광 강도는 공초점 현미경(LSM-700; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Munich, Germany)으로 측정하였고, Zen 2009 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하였다.

실시예 2: 동물 실험 절차

실시예 2-1: 건선 마우스 모델

6-7주령 C57BL/6 마우스를 Orient Bio Inc.(Seongnam, South Korea)에서 구입했다. 마우스를 특정 병원균이 없는 조건하에 보관하고, 자유 섭취의 표준 실험 식단(STD)을 제공하였다. 모든 동물 실험은 아주대학교의 동물 실험 및 사용위원회(IACUC)의 승인을 받았다(승인 번호 2017-0002). 62.5mg Aldara 크림(5% IMQ을 포함; Aldara, 3M Pharmaceutical LLC.)을 5일 연속 도포하여, 건선과 유사한 증상이 생성되었다. IMQ는 정상군에 적용되지 않았고, PBS만 주입되었다. 마우스에 Aldara 크림(5%)을 도포하기 하루 전에 MIP2(1, 10 또는 20nmol/g) 또는 PBS(대조군)를 투여하였다. IMQ 크림 도포 하루 전에 양성 대조군으로 MTX(10μg/g; cat. # M9929, Sigma-Aldrich)를 투여하였다. 5일 후, 마우스를 호흡 마취로 안락사 시키고, 조직학적 검사를 위해 피부 병변 및 비장 샘플을 수집하였다. 등 피부의 염증 정도를 평가하기 위해, 임상 PASI를 토대로 객관적인 채점 시스템을 개발하였다. 홍반(erythema), 스케일링(scaling), 주름(wrinkles) 및 두꺼워짐(thickening)과 같은 요소를 독립적으로 0에서 4까지 점수를 매겼다: 0, 없음; 1, 약간; 2, 중간; 3, 상당함; 4, 매우 현저함. 홍반, 스케일링 및 두께는 숙련된 연구자의 면밀한 감독하에 채점되었다. 누적 점수(홍반+스케일링+두꺼워짐, 0-12 등급)는 건선 증상의 중증도를 나타낸다.

마우스의 등쪽 병변에서 얻은 피부 샘플을 4% 파라포름알데히드 용액에 고정시키고, 파라핀에 끼워 넣은 뒤, 유리 슬라이드 위에 7μm 두께로 절편을 만들었다. 표피 및 진피의 두께를 확인하기 위해 절편을 H&E로 염색하였다. Leica LAS X Hardware Configurator를 이용한 Leica DMi8 fluorescence microscope를 사용하여 피부의 두께를 측정했다. CD68, CD4 및 IL-17을 인식하는 1차 항체를 이용한 마우스 특이적 HRC/DAB Detection IHC Kit(Abcam, cat. # AB64259)를 사용하여 피부에서의 IMQ-매개 염증을 평가하였다.

실시예 2-2: SLE 마우스 모델

최초 무게가 각각 18-20 및 38-40g인 6마리의 암컷 야생형(C57BL/6) 및 루푸스-경향성 마우스(MRL/lpr)를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입했다. 모든 동물 실험은 아주대학교 의료원 IACUC에 의해 검토 및 승인되었다(승인 번호 2017-0022). 마우스를 1주 동안 적응시킨 다음, 아주대학교 의과대학의 승인된 지침에 따라 병원체가 없는 조건에서 사육하였다. 비히클 그룹의 마우스는 복강 내(i.p.) PBS가 주입된 반면, 다른 것들은 1일 10nmol/g(in PBS)의 MIP2가 20일 동안 주입되었으며(4주간 주5회), 이들의 무게를 매일 모니터링 하였다. 마우스를 실험 종료시에 안락사 시켰으며, 혈액, 소변 및 조직을 수집하였다. 1시간 배양 후, 혈액 샘플을 혈청 분리 튜브에 수집하고, 20℃에서 10분간 3000rpm으로 원심분리한 뒤, -80℃에 보관하였다. 수집된 소변 샘플은 즉시 -80℃에 보관하였으며, 조직 샘플은 PBS로 철저히 세척하고 RNA 안정화 용액(Qiagen Sciences, Maryland, MD, USA)에 담가 두었다. 항-핵 항체, 항-dsDNA 항체, IL-6 및 C3 보체의 농도를 ELISA kit(MyBiosource, San Diego, CA)로 분석하였다. 또한, Mouse Albumin ELISA Kit(41-ALBMS-E01, Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA)를 사용하여 마우스 소변 알부민 수치를 분석하였다. 신장 조직을 수집한 다음, 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정시키고, 4℃에서 밤새 냉장시켰다. 그 다음, 고정된 조직을 파라핀에 끼워 넣은 뒤, 2-4μm 두께로 절편화하고, PAS(Periodic Acid-Schiff) 또는 H&E 시약으로 염색하였다. 샘플 당 3번의 독립적인 측정이 수행되었다.

실시예 2-3: CIA ( collagen - induced arthritis ; 콜라겐-유도 관절염) 모델

4주령 수컷 Lewis 랫트에 250μL(0.5mg 콜라겐 포함) 혼합 용액(bovine type II collagen 및 complete Freund’s adjuvant가 1:1 비율로 혼합)을 주입하여 RA를 유도하였다. 병진전(disease development) 3주 후, 부종 및 홍반 증상이 랫트의 부골, 발목 관절, 무릎 관절 및 발에서 개별적으로 관찰되었다. 실험은 아주대학교 의과대학의 동물 실험위원회의 승인된 지침에 따라 수행되었다(승인 번호 2013-0070). 랫트를 3개 그룹(각 그룹은 3마리를 포함) 즉, 정상(비-CIA, PBS만 주입), 미처리 CIA 및 MIP2-처리 CIA로 나누었다. 처리군의 CIA 랫트에 무릎 관절부에 20pmol/g(5.94μg/joint)의 농도로 100μl MIP2를 개별적으로 주사했다.

발목 직경 및 AI(관절염 지수) 점수를 측정하기 위해, 처리 요법 1, 2, 3, 4, 5 및 6주째에 각 그룹 개별 랫트의 뒷발을 관찰하였다. 발목 직경은 Vernier calipers를 사용하여 측정하였고, AI는 블라인드 테스트를 한 뒤, 다음과 같이 점수를 매겼다: 0, 부종 또는 홍반이 없음; +1, 약간의 부종 및 홍반; +2, 중간 정도의 부종 및 shackles; +3, 중족골(metatarsal)에 대한 관절의 제한된 사용 및 확대 증상을 가진 부종; +4, 관절 강직 및 총 뒷발과 연관된 심각한 증상으로 인한 과도한 팽창. 발목 직경과 AI 점수를 독립적으로 3회 측정한 결과를 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타냈다.

실시예 2-4: NASH ( Nonalcoholic steatohepatitis ; 비알콜성 지방간염 ) 마우스 모델

24마리의 9주령 수컷 야생형(C57BL/6J) 마우스(초기 무게 21-28g)를 Japan SLC, Inc.(Shizuoka, Japan)로부터 구입하였다. 10주령에서부터, 마우스를 6마리로 구성된 4개의 그룹으로 분리하였다. 보통 식사(normal chow diet)의 대조군, MCD diet의 MCD 군, MCD diet 및 MIP2의 MIP2 예방군은 처음부터 처리하였고, MCD diet 및 MIP2의 MIP2 치료군은 3주차부터 처리하였다. 대조군 또는 MCD 군의 마우스는 복강 내(i.p.) PBS로 주사하였고, 다른 것들은 6주 동안 주 7회 하루에 10nmol/g(in PBS)으로 MIP2를 투여하였으며, 체중을 매일 모니터링하였다. 실험 종료시 마우스를 안락사시키고, 혈액과 간 조직을 수집하였다. 1시간 배양 후, 혈액 샘플을 혈청 분리 튜브에 수집하고 3000rpm, 20℃에서 10분 동안 원심분리하여 -80℃에서 보관하였다. 제조사의 지시에 따라 간 용해물(lysate)을 RIPA buffer(Biosesang, R2002, KOREA)로 분리하였다. 간 용해물의 중성지방(triglyceride)은 Triglyceride quantification colorimetric kit(Biovision K622-100, Inc.)를 사용하여 측정하였다. 간 용해물의 콜레스테롤은 Total Cholesterol and Cholesteryl Ester colorimetric kit(Biovision K603-100, Inc.)를 사용하여 측정하였다. qRT-PCR 분석은 ABI Prism 7500 qRT-PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행하였다. 유전자 발현은 SYBR Premix Ex Taq(Takara RR420A, Inc.)로 검출하였고, delta-delta Ct method(2^-ΔΔCt)에 의해 기준 유전자 GAPDH로 표준화하여, 상대적인 유전자 발현을 측정하였다.

모든 실험은 3회 이상 수행되었고, 각 결과는 평균 ± SD로 나타냈다. Post-hoc 분석을 사용한 one-way ANOVA가 모든 통계에 사용되었다(*P < 0.05; **P < 0.001; ###P < 0.0001 compared to the MCD group). 모든 동물 실험은 Biotoxtech co. ltd.(Cheongju, South Korea)에서 아주대학교 의료원 IACUC에 의해 검토 및 승인되었다(승인 번호 180798).

실시예 3: 펩타이드 디자인 및 in silico (가상실험에서의 컴퓨터 프로그래밍) 분석

결정학(crystallography)을 통해 MAL-TIR 이합체(dimers)에 대한 대칭형과 비대칭형의 두 가지 인터페이스가 제안되었다. 이러한 연구결과는 비대칭 및 대칭 인터페이스가 각각 실제로 MAL-MAL protofilaments의 사슬내 및 사슬간 인터페이스라는 사실을 보고하고 있는 최근의 cryo-EM 연구에 의해 뒷받침된다. MAL 대칭 또는 사슬간 인터페이스에 대한 심층 분석은 MAL-MAL, MAL-TLR4 및 MAL-MyD88 TIR-TIR 상호작용에서 αC의 중추적인 역할을 강조한다. 결정 연구나 cryo-EM은 MAL-TIR 인터페이스에서 D154의 관여를 제안하지 않는다. 인터페이스 분석결과, D154가 αC의 멀리 떨어진 N-말단에 존재하고, 인접한 MALs과 직접 상호작용하지 않는다는 것이 밝혀졌다(도 1A 및 도 1B). NF-κB 리포터 분석에서, Lin et al.은 D154A가 아닌 W156A, Y159A 및 L165A 돌연변이가 NF-κB 신호에 유의한 영향을 미치는 것으로 보고하였다. 동일한 연구에서 D154A는 MAL-TLR4-TIR 및 MAL-Myd88-TIR 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다. 그러나, W156A 및 Y159A는 중대한 영향을 나타냈다. 또한, Valkov et al.은 그들의 MAL 구조 연구에서 알라닌(alanine) 스캐닝을 통해 MAL의 162-166 잔기가 MAL 자가-결합(self-association)에 관여할 뿐만 아니라 MAL-MyD88 결합에도 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 종합하면, 이러한 연구결과들은 MAL-αC의 P155에서 T166까지 잔기 스패닝이 TIR-TIR 상호작용에 중요하다는 것을 시사한다. 따라서 MAL, TLR 및 MyD88에서 αC 결합 인터페이스는 αC 그 자체 또는 그 유사체에 의해 관여될 수 있는 몇 가지 공통 약물 분자구조(common pharmacophore)를 보유한다.

αC 나선으로부터 dodecapeptide(MAL/MyD88 inhibitory peptide(MIP))를 디자인하였으며, 구조 안정성 및 세포 투과능을 조사하였다. 세포 내로 MIP 침투를 용이하게 하기 위해, 펩타이드를 보고된 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)인 PFVYLI(이하 ‘PFV’(Rhee, M. & Davis, P., J Biol Chem 281, 1233-1240 (2006))와 접합시켜 MIP1으로 분류하였으며, 또는 penetratin(CPP(Derossi, D., et al ., J Biol Chem 269, 10444-10450 (1994))과 접합시켜 MIP2로 분류하였다.

MIP2의 helicity와 구조적 안정성을 유지시키기 위해, in vitro에서 안전하고(도 2A) 효과적인 초기 평가(도 1B) 이후에, C157과 C161 사이의 이황화 결합(MIP3; 모 펩타이드에서 위치 7의 메티오닌이 시스테인으로 변이)을 만들어 구조적 제한을 적용시켰다(도 1B). 그러나, MIP3는 주어진 농도에서 세포독성 효과를 나타냈다(도 2A).

TLR-억제 효과에 있어서 C-말단 잔기의 관여, 특히 L165의 관여가 잔기 치환에 의한 MIP2의 변이체를 생성시킴으로써 확인되었다. MIP2-1(L165H, C157A 및 M161A 변이)은 LPS-자극된 TLR4 신호전달을 억제하는 잠재력을 상실했다. 그러나 MIP2-2(C157A 변이)가 그 효과를 유지하는 것으로 보아, 이러한 효과의 상실은 C157A에 기인한 것이 아니다(도 2D). C-말단에서 MLQALT 잔기가 결핍된 MIP2-3도 또한 평가되었고 효과가 상실됨으로 보아 C-말단이 중요함을 입증하였다(도 2D). CPP가 없는 MIP2, CPP 단독 및 소수성 CPP인 PFVYLI는 LPS- 자극 RAW 264.7 세포에 대한 어떠한 억제 효과도 나타내지 않았다(도 2E).

MAL-매개 경로에 대한 MIP1과 MIP2의 조절 효과를 추가로 평가하였다. MIP1은 아니지만 MIP2는 HEK-Blue™ hTLR4 세포에서 LPS-stimulated secreted alkaline phosphatase(SEAP) 신호의 농도-의존적 억제를 나타냈다(도 1A). 이는 소수성 PFV-캐리어 펩타이드는 MIP와 접합될 때 낮은 세포 투과능을 나타내거나, CPP가 MIP에 결합될 때 추가적인 TLR4-억제 효과를 갖는 것을 시사한다. 나아가, 본 발명자들은 PFV-접합 펩타이드가 세포 외(extracellular) 표적에 결합한다는 것을 관찰했다. CPP가 MIP에 대한 조절 효과를 가질 가능성을 배제하기 위해 CPP 단독으로 시험하였지만, TLR4 억제 효과는 관찰되지 않았다(데이터 미도시). 따라서, MIP2는 TLR4 억제 효과를 유지하고, CPP가 효과적인 캐리어-펩타이드임을 확인하였다.

실시예 4: MIP2의 광범위한 TLR 억제 및 마우스 대식세포에서 MyD88 -의존적 및 TRIF -의존적 TLR4 신호전달 억제 확인

MIP2가 광범위한 TLR-억제 효과를 갖고 MyD88- 및 TRIF-의존적 TLR4-신호를 정지시키는지 조사하기 위해, RAW264.7 세포에서 추가 실험을 수행했다. 50μM 이하의 농도에서 세포독성 효과가 없는 경우(도 2B) MIP2는 IL-6를 완전히 제거하고, LPS-자극된 세포에서 TNF-α 분비를 상당히 감소시켰다(도 1D 및 도 1E).

다른 TLR에 대한 MIP2의 효과를 평가하기 위해, PAM₃CSK₄(TLR1/2), FSL-1(TLR2/6), Poly(I:C)(TLR3), Resiquimod(R848; TLR7/8), Imiquimod(IMQ; TLR7) 또는 CpG-ODN(TLR9)과 같은 다른 TLR 리간드로 자극시킨 후, RAW264.7 세포에서 TNF-α 분비 수준을 측정하였다. TLR3를 제외한 모든 TLR은 농도-의존적으로 억제되었으며, 다른 TLR들에 비해 TLR7의 경우 상대적으로 억제 효과가 더 높았다(도 1F). TLR1/2 및 TLR2/6에 대해 억제 효과는 상대적으로 동일했다. 반대로, Couture et al.은 TR6가 3C(TLR1/2 리간드)-유도 TNF-α 및 IL-1β mRNA 수준을 유의하게 억제하지만, P2C(TLR2/6 리간드)-유도 효과는 그렇지 않은 것을 관찰하였다. 나아가, 이 결과는 MIP2가 엔도좀 TLR을 유의하게 억제함을 시사한다. 웨스턴 블랏 결과, MIP2가 ERK와 JNK의 인산화를 실질적으로 억제하였다(도 3A). MIP2와 달리, TR6는 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 ERK만 억제하고, JNK는 억제하지 못한다고 보고되었다.

TLR7과 TLR9은 TIRAP을 필요로 한다. 그럼에도 불구하고 TIRAP이 결핍된 세포와 마우스 실험에서 TLR3, TLR5, TLR7 및 TLR9 리간드에 정상적으로 반응하였고, TLR2 및 TLR4 리간드에 대한 반응은 사이토카인 유도가 손상되는 것으로 많은 in vivo 및 in vitro 연구에서 입증되었다(Yamamoto, M. et al ., Nature 420, 324-329 (2002)). MIP2는 광범위한 TIR-함유 분자에 강력하게 결합한다. 이는 TR6(MIP2와 중첩되는 잔기를 함유)가 TRAM 및 MyD88의 TLR4와의 상호작용을 배제하고(Piao, W., et al ., J Immunol 190, 2263-2272 (2013)), MyD88의 TIR 도메인과 물리적으로 상호작용한다는 사실에 부분적으로 상응한다.

TLR4는 TRAM-TRIF 경로를 통해서만 인터페론을 활성화시키는 반면, NF-κB는 MyD88 및 TRIF 모두를 통해 활성화될 수 있다(Yamamoto, M. et al ., Science 301, 640-643 (2003)). MAL과 TRAM은 이후에 결합하여 TLR4와의 TRIF 또는 MyD88 상호작용을 촉진한다는 것이 확인되었다. 이는 MAL과 TRAM이 TLR4 인터페이스를 공유하고 결합을 위해 경쟁하기 때문이다. 따라서 본 발명자들은 MIP2가 TLR4의 두 경로 모두를 억제할 수 있다고 생각했다. MIP2는 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 IRF3의 인산화 및 ATF3의 발현을 억제했다(도 3B). 이 효과는 THP-1 세포에서 반복되었으며, MIP2가 IRF3 및 IRF7의 인산화를 억제하였다. IRF3 발현과 IFN 생산이 상호 의존적이므로(Honda, K. & Taniguchi, T., Nat Rev Immunol 6, 644-658 (2006)), 본 발명자들은 type-1 IFN의 유도를 확인하기 위한 추가 분석을 수행하지 않았다.

MIP2의 TLR4-억제 효과는 NF-κB의 발현 및 핵 전이(translocation) 수준을 통해 더욱 확인되었다. MIP2가 LPS-유도 인산화된 NF-κB(p-p65)를 억제하고, Iκ-Bα 분해를 정지시키는 것을 웨스턴 블랏 데이터를 통해 확인하였다(도 3C). 이 결과는 공초점 현미경 분석에서 더 확인되었으며, MIP2가 NF-κB의 p65 서브유닛의 인산화와 핵으로의 전이를 완전히 억제했다(도 3D). TLR의 자극은 산화 질소(NO), 활성산소종(ROS)의 유도 및 nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase 2(COX2)와 같은 관련 효소의 발현과 관련이 있다(West, A. P. et al ., Nature 472, 476-480 (2011)). MIP2는 iNOS와 COX2의 발현(도 3E), NO의 세포 외 및 세포 내 방출(각각 도 3F 및 3G), 세포 내 ROS의 생성(도 3H)을 완전히 억제한다.

실시예 5: MIP2의 THP -1 세포에서 TLR 및 NLRP3 경로 억제 확인

RAW264.7 세포에서 관찰된 결과와 동일하게, MIP2는 LPS-자극된 THP-1-유래 대식세포에서 MAPK에 대한 억제 효과를 나타냈다. MIP2-처리 RAW264.7 세포에서 p38 발현은 약간 억제되었으며, 이러한 억제 효과는 LPS-자극된 THP-1 세포에서 더 두드러지는 것을 관찰했다(도 4A). p-p65와 다른 전사 인자, p-ERK 및 p-JNK의 발현은 LPS-자극된 세포에서 실질적으로 감소되었다. MIP2 농도-의존적으로 LPS-자극된 세포에서 TNF-α와 IL-6 분비가 억제되었다(도 4B).

TLR이 NLRP3, caspase-1 및 pro-IL-1β의 발현을 상향조절 한다는 것이 입증된 바 있다(Bauernfeind, F. G. et al ., J Immunol 183, 787-791 (2009)). ATP, Nigericin, Streptolysin O 및 Uric acid crystals과 같은 두 번째 신호가 없을 때, LPS-감작된(primed) 세포는 pro-IL-1β를 상향조절하지만 IL-1β로 처리되지 못하고 방출된다고 보고되었다. 또한, NLRP3 inflammasome을 감작시키고 활성화시키기 위해, TLR은 MyD88- 및 TRIF-경로 모두를 사용한다. 이는 LPS-감작된 세포가 ATP 처리시 NLRP3를 발현한 본 발명의 웨스턴 블랏 실험에서 확인되었다. 그러나, NLRP3 및 pro-IL-1β 발현은 모두 MIP2의 존재 하에서 실질적으로 억제되었다(도 4C).

pro-IL-1β의 NLRP3-caspase-1 처리 후 방출되는, 가공된 IL-1β의 유도는 LPS-감작된 ATP-처리 세포에서 현저하게 억제되었다(도 4C 하단). IRF3 외에도 IRF7 또한 TRIF-의존적 방법으로 TLR4의 하류에서 발현된다(Fitzgerald, K. A. et al ., J Exp Med 198, 1043-1055 (2003)). LPS와 CpG-ODN은 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion; MCAO) 마우스에서 IRF3 및 IRF7의 발현을 유도하고, 신경 보호를 제공한다(Stevens, S. L. et al ., J Neurosci 31, 8456-8463 (2011)). RAW264.7 세포에서 관찰된 결과와 일치하여, MIP2는 IRF3의 발현뿐만 아니라 IRF7의 발현도 억제했다. 또한, LPS-자극된 세포에서 pro-IL-1β 및 p-IRAK4의 발현이 억제되었다(도 4D).

이러한 결과들은 MIP2가 MyD88- 및 TRIF-의존적 사이토카인 생산에 영향을 미칠 뿐만 아니라, TLR-매개 NLRP3 inflammasome assembly를 억제한다는 것을 시사한다.

실시예 6: MIP2의 이미퀴모드 ( imiquimod )-유도 건선에 대한 효과 확인

건선(psoriasis)은 피부로의 염증 세포 침윤뿐만 아니라 표피 세포의 증폭된 증식 및 변화된 분화를 특징으로 하는 만성 염증성 피부 질환이다. TLR은 건선의 발병 및 진행과 광범위하게 연관되어있다(Hirai, T. et al ., J Immunol 190, 4805-4811 (2013)).

MIP2가 TLR-유도 건선 치료의 잠재력을 보유하는지 조사하기 위해, 6-7주령 C57BL/6 마우스에서 5일 연속으로 62.5mg의 5% IMQ-크림을 등 피부에 국소 처리하여 질병을 유발시켰다(도 5A). MIP2를 1, 10 또는 20nmol/g(마우스 중량)의 투여량으로 6일 동안 복강 내(i.p.) 주입하였다. 메토트렉세이트(MTX)와 PBS 주입 마우스에 동일한 프로토콜을 적용시켰다. 비교 표현형 조사(Comparative phenotypic examination)를 통해 MIP2가 MTX와 비슷한 정도로 질병 증상을 약화시키는 것을 확인했다(도 5A).

PBS 주입 마우스에서는 증상이 계속 진행되고 현저한 상태였다. Psoriasis Area and Severity Index(PASI, 건선 중증도 평가에 널리 사용되는 도구) 데이터에 따르면, 농도-의존적 효과는 관찰되지 않았으나, MIP2-처리가 PASI 지수를 크게 감소 시키는 것을 확인할 수 있다(도 5B).

비장종대(splenomegaly)는 건선과 광범위하게 연관되어 있다(Carceller, E. et al ., Sci Rep 6, 38825 (2016)). MIP2-처리 마우스에서 비장 중량의 농도-의존적인 감소가 나타났다(도 5C). 체중 모니터링 데이터는 PBS- 및 MTX-처리 마우스와 비교할 때 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 5D). Haemotoxylin and Eosin(H&E) staining을 통해 피부에서 조직병리학적 변화를 평가하였다. MIP2-처리 마우스에서 표피(노란색 화살표)와 진피(초록색 화살표)의 두께가 MTX-처리 마우스와 거의 유사하게 실질적으로 감소했다(도 5E).

피부의 과증식성(hyperproliferative) 상태와 면역세포 침윤(T 세포 또는 대식세포)은 건선의 주요 특징이다. 따라서 각 동물 그룹의 피부 병변을 수집하여 CD68(대식세포 마커), CD4 및 IL17(TH₁₇ 세포 마커) 항체를 사용하는 면역조직화학적 기술을 통해 분석하였다. MIP2는 건선-마우스에서 CD68, CD4 및 IL-17(brown staining)의 과발현을 감소시켰고, 이는 MTX-처리 그룹과 유사했다(도 5F).

이러한 데이터들을 종합하면, MIP2는 유도된 건선 증상을 완화시킬 것으로 기대된다. 이 효과는 imquimod(건선을 유도)와 MIP2(TLR7 경로 억제)의 공통 표적인 TLR7 때문일 수 있다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 비-TLR-유도 전신홍반루프스(systemic lupus erythematosus; SLE)-경향성(prone) 마우스에서 MIP2의 치료 효과를 평가했다.

실시예 7: SLE ( systemic lupus erythematosus ; 전신홍반루프스 ) 마우스 모델에서 MIP2의 치료 효과 확인

자기-핵 항원에 대한 신체의 내성이 결핍된 것을 특징으로 하는 질환인 SLE의 중증도와 병인은 TLR의 상향조절과 광범위하게 연관되어 있다(Wu, Y. W., Tang, W. & Zuo, J. P., Acta Pharmacol Sin 36, 1395-1407 (2015)). 따라서, 본 발명자들은 SLE 마우스 모델에서 MIP2의 치료 잠재력을 평가하고자 하였다.

MRL 림프증식성(lymphoproliferation) 마우스(이른바 MRL/lpr, 이들 마우스는 특징적인 혈청학적 마커 및 말초 병리, 대표적으로 낭창(lupus)을 자발적으로 발달시킨다)에 마우스 체중 당 10nmol/g의 용량으로 20일 동안 MIP2를 복강 내 주사 하였다(도 6A). SLE-경향성 MIP2-처리 마우스에서 탈모의 현저한 감소가 관찰된 반면, 미처리 마우스에서는 계속 악화되었다(도 6A). 체중 증가와 SLE 마커(ANA, ROS 및 비장종대) 증가 사이의 밀접한 관계는 물론 심장, 신장, 간 및 비장에 대한 손상이 보고된 바 있다(Toller-Kawahisa, J. E. et al ., Free Radic Biol Med 86, 362-373 (2015)). 본 발명자들은 MIP2가 표준식이 섭취 마우스의 체중 증가/감소를 방지하는 것을 확인했다(도 6B).

임파선염(lymphadenopathy)과 비장종대는 SLE 환자에서 널리 관찰되는 증상이다. 임파선염 및 비장종대는 각각 약 50% 및 10-40%의 SLE 환자에서 발생한다(Bashal, F., Open Rheumatol J 7, 87-95 (2013)). 림프절의 크기와 무게가 MIP2-처리 SLE-경향성 마우스에서 크게 감소하는 것을 확인했다(도 6C, 도 2F). 이와 유사한 감소 패턴이 MIP2-처리 마우스의 비장 크기 및 무게에서 기록되었다(도 6D, 6E 및 도 2G).

인터루킨(IL), 항-dsDNA 항체 및 항-핵 항체(antinuclear antibody; ANA) 및 소변 알부민 수치(사구체 신염과 관련됨)와 같은 SLE 관련 혈청학적 마커의 특징은 SLE 환자 및 동물 모델에서 나타난다. 또한, 상대적으로 낮은 보체 성분, 특히 C3와 C4의 혈청 수치는 SLE의 공통 마커이다(Sandhu, V. & Quan, M., Open Rheumatol J 12, 171 (2018)). 본 발명자들은 MIP2-처리 및 미처리 MRL/lpr 마우스에서 상기 마커들을 비교 모니터링했다. MIP2-처리 MRL/lpr 마우스에서 알부민 수준이 크게 감소했다(도 6F). 또한, 미처리 마우스와 비교하여 ANA 및 항-dsDNA 항체의 상당한 감소가 관찰되었다(도 6G 및 6H). 혈청-IL6 수준의 현저한 감소가 기록되었으며, MIP2-처리 마우스에서 혈청-C3의 상승을 확인하였다(도 6I 및 6J).

그 다음, H&E 및 PAS staining을 통한 마우스 신장의 조직학적 검사로 MIP2의 SLE-치료 효과를 조사했다(도 6K, scale bar 100μm). 증식성 혈관사이세포(proliferative mesangial cell)와 확산된 초승달 모양(black broken circles)을 갖는 사구체 덩어리가 미처리 마우스에서 발견되었다. MIP2 처리 후, fibrocellular crescent가 재형성되었고, 사구체 주변에서 severe mesangial cell, 내피세포 증식 및 염증세포 침윤이 실질적으로 회복되었다. 결과적으로, MIP2는 SLE 치료에 있어서, 상당한 잠재력을 보유하고 있음을 확인하였다.

실시예 8: MIP2의 류마티스 관절염( rheumatoid arthritis ; RA ) 치료 효과 확인

면역 질환에서 MIP2의 치료 잠재력을 확장시키기 위해, 수컷 Lewis RA 랫트에서 MIP2의 효과를 평가하였다. 렛트를 세 그룹으로 나누었고 각 그룹은 1) 정상/건강 랫트; 2) 미처리 RA 랫트; 3) MIP2-처리 RA 랫트의 3마리 렛트를 포함한다. 그룹 2와 3의 랫트는 MIP2를 무릎 관절에 주사하였고, 그룹 1에는 PBS를 주사하였다. 본 실시예에서 랫트는 RA 증상에 대해 표현형으로 평가되었다. 병리학적 검사는 수행되지 않았으나, MIP2의 치료 효과는 향후 재현될 수 있다. 1주 간격으로 6주 동안 랫트의 발을 시각적으로 모니터링하고, 발목 직경을 측정하고, 관절지수(articular index; AI)를 측정하여 MIP2의 효과를 평가하였다.

RA 절차 후 6주 동안 미처리 랫트에서는 관절 팽창, 심한 부종 및 홍반, 발목뼈(부골)의 뻣뻣함이 눈에 띄게 증가했다. MIP2-처리 랫트는 처리 2-3주 후에 부종과 발목의 팽창이 크게 감소했으며, 처리 요법 마지막 2주 동안 생리학적으로 정상적인 발을 회복했다(도 7A). AI 지수 및 발목 직경 평가를 통해 MIP2 처리-마우스가 처리 5-6 주 동안 정상이 된 것을 확인할 수 있으며, 반면 미처리 RA 랫트는 상승된 지수를 나타냈다(도 7B).

결과적으로, MIP2는 면역 관련 질환에 광범위한 치료 효과를 가지고 있으며, 향후 자가면역 질환을 표적으로 하는 유망한 치료제가 될 수 있음을 시사한다.

실시예 9: MIP2의 비알콜성 지방간염 ( Nonalcoholic steatohepatitis ; NASH )에 대한 예방 및 치료 효과 확인

비알콜성 지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis; NASH)의 병리 생리학은 간, 지방 조직, 위장관 및 뇌와 같은 여러 장기와 관련되어 있으며, TLR 경로는 NASH 발병의 핵심 경로 중 하나이다. TLR7 또는 TLR4 knockout 마우스는 비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)으로부터 보호되는 것으로 보고되어 있다(Rivera CA, et al ., J Hepatol 2007, 47;571-579; Roh YS, et al ., The American Journal of Pathology . 188;2574-2588).

MIP2가 NASH를 예방하거나 치료하는지 여부를 확인하기 위해 6주 동안 methionine-choline-deficient(MCD) diet를 이용하여 10주령 C57BL/6J 마우스에서 NASH를 유발시켰다. 예방 또는 치료 전략으로서, MIP2를 10nmol/g(마우스 중량)의 투여량으로 6주 또는 4주간 복강 내(i.p.) 주입하였다. H & E, Masson-trichrome 및 Oil red O stain으로 염색된 간 조직은 MCD diet 그룹에서, 중등도의 염증을 동반한 극심한 대수포성 지방(macrovesicular fat) 변화를 보였다. MIP2 예방군 또는 치료군은 지방증(steatosis)의 유의한 병리학적 개선을 보이지 않았다(도 8A). 유의한 총 변화는 없었지만, MIP2 투여시 간 콜레스테롤과 중성지방(triglyceride) 수준은 유의하게 감소하였다(도 8B). 이와 유사하게, MIP2 예방군 또는 치료군에서 serum alanine aminotransferase와 aspartate aminotransferase는 유의한 변화가 없었지만(도 8C), MIP2 투여로 염증성 전사 인자 TNF-α, Mcp1, IL-1β 및 IL-6의 간 발현(hepatic expression)이 감소하였다(도 8D). 간 염증에서의 MIP2-매개 개선과 일치하여, 섬유증 전사 인자 Col, Fn1 및 Acta2의 간 발현이 감소했다(도 8E). Choline 결핍은 Pparα를 감소시키고 Pparγ 전사 인자를 증가시켰으며, MIP2는 MCD-유도 NASH 마우스 모델에서 두 전사 인자를 모두 회복시켰다(도 8F).

결과적으로, MIP2는 간 지방 함량, 염증 및 섬유화 관련 유전자 발현을 감소시키고, MCD diet에 의해 유도된 NASH 마우스 모델에서 기능장애 PPAR 경로를 회복시켰다. NASH에 대한 MIP2의 효과는 치료보다 예방에 더 충분한 효과를 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Peptide Therapeutic Agent of Autoimmune Diseases and Inflammatory Diseases <130> P19-B163 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP <400> 1 Pro Trp Cys Lys Tyr Gln Met Leu Gln Ala Leu Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP <400> 2 Pro Trp Ala Lys Tyr Gln Ala Leu Gln Ala His Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP <400> 3 Pro Trp Ala Lys Tyr Gln Met Leu Gln Ala Leu Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP <400> 4 Pro Trp Cys Lys Tyr Gln 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIP <400> 5 Pro Trp Cys Lys Tyr Gln Cys Leu Gln Ala Leu Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 6 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 7 Pro Phe Val Tyr Leu Ile 1 5 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP-MIP2 <400> 8 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Pro Trp Cys Lys Tyr Gln Met Leu Gln Ala Leu Thr 20 25

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR4, TLR1/2, TLR2/6, TLR3, TLR7/8, TLR7 및 TLR9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TLR(Toll-like receptor)의 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 MAL(TIR domain adaptor protein; TIRAP)의 αC 나선으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 TIR(Toll/interleukin-1 receptor) 도메인 또는 TIR-함유 어댑터(adaptor) 분자에 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항의 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)가 결합된 융합 펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
제1항의 펩타이드 또는 제5항의 융합 펩타이드를 포함하는 TLR(Toll-like receptor) 길항제(antagonist).
제8항에 있어서, 상기 TLR은 TLR4, TLR1/2, TLR2/6, TLR3, TLR7/8, TLR7 및 TLR9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 TLR 길항제.
제1항의 펩타이드 또는 제5항의 융합 펩타이드를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 자가면역질환은 건선, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 실험적 자가면역 관절염, 천식, 크론병, 다발성 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염, 피부근육염, 원판상루푸스 및 전신홍반루푸스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항의 펩타이드 또는 제5항의 융합 펩타이드를 포함하는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 염증성질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 습진, 알러지, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 측두 동맥염, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비만, 바이러스 감염 및 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물.