KR102557890B1 - 두피 개선 및 탈모 완화용 펩타이드 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 두피 개선, 탈모증 예방, 개선 또는 치료효과를 나타내는 화장료 조성물일 수 있고, 본 발명에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 자가포식 활성화 및 β-카테닌 단백질의 발현을 조절함으로써, 모발 성장 및 발모 촉진을 위한 두피 환경 조성 및 유지 효과를 제공할 수 있다.

Description

두피 개선 및 탈모 완화용 펩타이드 조성물{Peptide Composition for improving scalp and reducing hair loss}

본 발명은 두피 개선과 탈모 완화용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자가포식 활성을 증가시켜 두피 상태를 개선하고, Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 활성화하여 탈모증을 완화하는 펩타이드 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 사람들은 하루 평균 약 100개 정도의 모발이 빠지며 동시에 새로운 모발이 자라기 때문에 두피 모발의 수는 쉽게 줄어들지 않는다. 탈모란 모발이 있어야 할 부위에 없거나 빈약한 상태를 말하는 것으로서, 모발 생성에 필요한 영양공급과 신진대사가 원활하게 이루어지지 않아 생기는 진행성 질환으로 분류하기도 한다.

탈모를 일으키는 요인들은 아직까지 명확하지 않지만, 노화, 유전적 요인, 스트레스, 남성 호르몬의 작용, 혈액순환 장애, 피지분비의 이상, 모낭충, 영양불량, 면역계의 혼란, 피부질환 등 여러 가지 요인들에 의해 복합적으로 발생할 수 있으며, 남성들뿐만 아니라 여성의 탈모도 증가하고 있는 추세로, 탈모로 인한 외형적 변화는 많은 스트레스와 심리적 불안, 외형적 컴플렉스를 유발하여 현대인에게 있어서 탈모는 심리적으로도 심각한 문제를 야기한다.

탈모를 치료하기 위한 방법으로 약물치료, 모낭이식수술, 민간요법, 한방치료, 탈모 기능성 샴푸 등 다양한 방법 등이 있다. 최초의 탈모 치료제인 로게인(Rogain)은 미 식약청 (FDA) 허가를 받은 안전한 제품이고 두피 혈액순환을 촉진시키지만 근본적인 치료효과는 없고, 판토가(pantogar)는 맥주 효모에 포함된 다양한 아미노산과 미네랄이 모발에 영양을 공급하나 큰 치료 효과는 없으며, 동의보감의 감초 약재 성분을 포함하며 아리메진산 비타민이 주성분인 드로젠(Drogen)은 발모에 대한 근거가 부족한 한방성분 발모 치료제로서, 상기의 탈모 치료제들은 부작용을 수반하거나 근본적인 탈모 치료 방법이 아니다.

현재 탈모 치료에 가장 많이 사용되고 있는 약물로는 미국 FDA에서 승인을 받은 2,4-디아미노-6-피페리디노피리미딘-3-옥사이드(일명 '미녹시딜 (Minoxidil, MINX)' 제제)와 II형 5α환원효소의 특정 억제제인 피나스테라이드 (finasteride)가 주성분인 프로페시아(Propecia, Merck & Co., Inc.의 상표명)를 들 수 있다. 미녹시딜 제제는 혈관 확장 효과를 통하여 혈류량을 증가시키고 모근에 영양분을 공급함으로써 모발 성장을 유도하는 약물로서, 특히 가마 부위의 탈모 증상 완화에 대해서 효과가 좋은 것으로 알려져 있으나, 규칙적으로 장기간에 걸쳐 사용하여야 하고, 가마 부위 이외 부위의 탈모에 대해서는 그다지 좋은 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있다. 경구투여용인 프로페시아 역시 지속적이고 규칙적인 복용을 필요로 하며, 여성이 장기복용하는 경우 기형아 출산 확률이 높고, 일부 환자들에 대해서는 성욕 감퇴, 발기 부전 등의 부작용을 나타낸다는 문제점이 보도된 바 있다. 따라서 미녹시딜 제제 또는 피나스테라이드 제제가 가지는 부작용을 극복할 수 있으면서 탈모 방지 및 발모 촉진 효과가 우수한 화합물의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 모낭세포의 순환 생리는 머리카락이 성장하는 성장단계(Anagen), 퇴화단계(Catagen), 휴지기 또는 정체기 단계(Telogen)의 3가지 단계가 순차적으로 거듭되어 이루어지고, 이에 따라 머리카락이 자라고 탈락하는 과정이 반복된다. 휴지기 또는 정체기 단계에 머무르는 모낭세포가 많아지면 머리카락이 탈락하는 대머리(alopecia) 상태가 되는데, 근본적인 탈모를 치료하기 위해서는 성장단계의 모낭세포를 증가시키고 퇴화단계 및 휴지기 단계의 세포를 감소시키는 방향으로의 접근이 필요하다.

Wnt/β-catenin 신호전달은 모낭의 발달, 재생 및 성장에 관여하며, 특히 β-catenin은 모낭의 기저부에 위치한 모유두세포에서 발현되어 모낭세포의 성장단계 유도 및 지속성을 촉진하는 역할을 한다(Bejaoui et al. 2019; Zhou et al. 2018).

또한, 자가포식은 세포 내 에너지원이 고갈되거나 세포 내외 스트레스 요인이 과도하게 발생한 경우 노후 또는 손상된 세포 내 물질 및 기관을 분해함에 따른 에너지 재생산 및 손상 물질 제거 기작과 관련된다. 최근 다양한 연구를 통해 노화가 진행될수록 또는 노화가 가속화 될수록 세포 내 자가포식 활성이 급격히 감소된다는 사실이 알려졌다. 즉, 자가포식 활성을 억제한 경우 세포 내 노후된 미토콘드리아나 잘못 접힌 단백질 등이 과도하게 축적되어 세포 내 자유 라디칼 및 산화 스트레스가 증가하여 결국에 세포의 사멸이 증가하고 노화가 촉진되는 결과가 야기된다.

자가포식은 두피 혈류의 정상적인 순환에 있어서도 영향을 미칠 수 있다. 누적된 스트레스로 인해 세포 내 물질의 분해가 억제됨에 따른 두피의 혈액 순환 장애는 탈모의 여러 가지 원인 중 하나로서, 두피의 혈액 순환 개선이 탈모 예방 또는 치료의 한 대안이 될 수 있다.

따라서 본 발명자는 Wnt/β-catenin 신호전달 및 자가포식 활성을 연계한 연구를 통하여 탈모증의 예방, 개선 또는 근본적인 치료 효과를 제공하는 조성물을 안출하게 되었다.

Bejaoui et al. Aging, 2019,4216-4237 Chai et al. Cell Reports, 2019, 3413-3421 Parodi et al. PLOS Biology, 2018, 1-22 Zhou et al. Scientific Reports 8, 2018, 13785

본 발명은 상술한 탈모 또는 두피 건강과 관련된 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 발명자는 모낭 각질형성세포의 자가포식을 활성화하고, 모유두세포의 Wnt/β-카테닌 신호전달계를 조절하는 펩타이드를 이용하여 모발 성장을 촉진하고 두피의 상태를 개선하는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 두피 개선, 탈모증 예방 또는 개선용 펩타이드 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 특정 부위에 국한되지 않고, 두피 전반에 걸친 탈모 증상에 효과가 있는 탈모증 개선을 위한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 모낭 세포 증식에 필요한 단백질의 발현을 조절하여, 모발 성장을 촉진시키는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 자가포식 활성화를 통한 두피 각질형성세포의 염증을 완화하고 두피의 노화를 억제하여 궁극적으로 모발 성장을 촉진시키는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 펩타이드 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1에서, n은 1 내지 10의 정수이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 1:1 내지 1:10의 비율로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물은 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%로 포함될수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 n은 3 내지 7의 정수일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드 조성물은 당귀추출물, 작약추출물, 참마뿌리추출물, 황기추출물, 지황추출물, 인삼추출물, 승마추출물, 복령추출물 및 감초추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 두피 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1에서, n은 1 내지 10의 정수이다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 탈모증 예방 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1에서, n은 1 내지 10의 정수이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 탈모증은 원형 탈모증, 유전성 안드로젠 탈모증, 휴지기 탈모증, 외상성 탈모증, 생장기 탈모증, 비강성 탈모증, 지루 탈모증 및 선천성 탈모증으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드 조성물은 자가포식을 활성화하여 세포노화를 지연하며 염증 완화와 함께 궁극적으로는 탈모 억제 효과를 구현하는 효과를 갖는다.

또한 본 발명에 따른 펩타이드 조성물은 Wnt/β-카테닌 신호전달계를 활성화시킴으로써, 조직 형성에 관여하는 성장 호르몬에 긍정적으로 작용하여 새로운 혈관 형성에 기여하고, 세포 재생력 향상, 케라틴 세포 증식 촉진 및 모낭 성장을 바람직한 양태로 조절함으로써, 모발의 성장기를 유지시켜 탈모를 예방하고 모발 생성을 촉진하는 효과를 제공할 수 있다.

따라서, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 이용하여 부작용이 적은 탈모증 예방 또는 개선을 위한 제품 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 비교예 1에 따라, 모낭 각질형성세포(Human hair follicle keratinocyte cells: HHFK cell)에서의 화학식 1 및 화학식 2에 따른 펩타이드의 단독 처리에 의한 자가포식 활성화 단백질 발현 변화를 비교 분석한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 1b는 본 발명의 비교예 1에 따라, 모유두 세포(Hair follicle dermal papilla cells: HFDP cell)에서의 화학식 1 및 화학식 2에 따른 펩타이드의 단독 처리에 의한 자가포식 활성화 단백질 발현 변화를 비교 분석한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2a는 본 발명의 비교예 2에 따라, 모유두 세포에서의 화학식 1 및 화학식 2에 따른 펩타이드의 단독 처리에 의한 β-카테닌 단백질 발현 변화를 분석한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2b는 본 발명의 비교예 2에 따라, 인체모낭 각질세포에서의 화학식 1 및 화학식 2에 따른 펩타이드의 단독 처리에 의한 β-카테닌 단백질 발현 변화를 분석한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라, 인체모낭 각질세포 및 모유두세포에서의 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 펩타이드 조성물 처리에 의한 자가포식 활성화 단백질 발현 변화 및 β-카테닌 단백질 발현 변화를 분석한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따라, 인체 모낭 각질세포에서의 IL-8 염증 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따라, 펩타이드 조성물을 처리한 인체 모낭조직에서의 (a) 자가포식 활성 및 (b) β-카테닌 단백질 발현 변화를 면역형광분석법으로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따라, 펩타이드 조성물을 처리한 인체 모낭조직에서의 Ki-67 단백질 발현을 면역형광분석법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 5에 따라, 펩타이드 조성물을 처리한 인체 모낭조직의 모간(hair shaft)의 길이 성장을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실험예로서, 펩타이드 조성물을 함유한 제형을 도포한 후 두피 붉은기 완화 및 두피수분손실 억제 효과를 평가한 임상실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실험예로서, 펩타이드 조성물을 함유한 제형을 도포한 후 두피 비듬 및 피지분비를 측정한 임상실험 결과를 나타낸 것이다.

이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, “약학적으로 허용 가능한 염”은 당업계에 알려진 통상적인 기술을 사용하여 제조되는 것으로, 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 무기산 또는 유기산의 일 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 트리플루로초산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산 또는 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 또한 상기 염기의 일 예로는 칼륨, 나트륨 등의 알칼리 금속; 마그네슘 등의 알칼리 토금속; 또는 암모늄; 등을 들 수 있다.

본 명세서에서, "개선"은 본 발명에 따른 조성물의 도포로 상태가 완화 또는 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 펩타이드 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1에서, n은 1 내지 10의 정수이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 n은 3 내지 7의 정수일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 자가포식 활성화를 유도할 수 있는 물질일 수 있다.

세포 내 자가포식 활성화는 젊은 사람의 조직 및 세포에서는 활발히 일어나지만, 노화가 진행되면서 세포 내 자가포식 관련 단백질의 발현량이 급속도로 감소하기 때문에 자가포식 활성도는 급격히 저하된다. 따라서 세포 내 노후 단백질, 지질 및 미토콘드리아가 시의적절하게 제거되지 못하여 세포 노화 현상이 급속도로 발생하게 되는 것이다. 자가포식의 활성화는 세포 내 해로운 단백질 및 기관의 제거를 통해 노화된 세포의 생존율을 향상시키고, 나아가 각 개체의 수명 증가와 매우 밀접한 관계가 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 모낭 각질형성세포의 자가포식을 활성화시키고, 염증을 완화하여, 탈모 예방 또는 개선에 보다 유용하게 작용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 Wnt/β-카테닌(β-catenin) 신호전달 경로를 활성화하는 물질일 수 있다.

Wnt는 세포로부터 분비되는 시스테인(cystein)이 많은 당단백질 중의 하나로서, 주변세포의 수용체에 결합하고, 이에 따라 활성화된 수용체를 통해 여러 가지 단계를 거쳐 많은 유전자의 발현을 조절함으로써, 다양한 생명 현상을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그 중에서도 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로는 모발 성장과 모낭 줄기세포 활성화에 중요한 역할을 한다.

Wnt 리간드(ligand)가 존재하지 않을 경우 β-카테닌은 GSK3β(glycogen synthase kinase-3β)에 의해 인산화되고, 세포 내의 β-카테닌 분해 복합체가 형성되어, 프로테아좀에 의해 β-카테닌이 분해된다. 하지만 Wnt 리간드가 수용체인 LRP5 혹은 LRP6에 결합하면 GSK3β의 활성이 억제됨으로써 β-카테닌의 인산화 및 분해가 억제될 수 있다. 따라서 세포질에 축적된 β-카테닌은 핵으로 이동하여 하위 표적 유전자의 발현을 촉진시키며, 이렇게 발현된 단백질들은 모발의 성장과 분화에 영향을 미칠 수 있다.

상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 Wnt/β-카테닌 신호 전달 경로의 활성화를 통하여 모발 성장과 연관된 단백질의 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드 조성물 중 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 1:1 내지 1:10의 비율로 포함되는 것일 수 있다. 바람직하게는 1:2 내지 1:8, 보다 바람직하게는 1:3 내지 1:5로 포함되는 것이 좋다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 바람직하게는 0.001 내지 8 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 함량 범위 내에서 자가포식, 모발 성장 및 모낭을 활성화시켜 모발을 강화시킬 뿐만 아니라, 두피 환경 개선에 효과적이며 탈모증 개선의 뚜렷한 효과를 볼 수 있다.

본 발명이 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드 조성물은 당귀추출물, 작약추출물, 참마뿌리추출물, 황기추출물, 지황추출물, 인삼추출물, 승마추출물, 복령추출물 및 감초추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 더 포함할 수 있다. 펩타이드 조성물에 상술한 추출물을 더 포함함으로써 두피 환경을 더욱 개선할 수 있고, 탈모증 개선에서의 상승 효과를 기대할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 두피 개선을 위한 화장료 조성물 및 탈모증 예방 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1에서, n은 1 내지 10의 정수이다.

구체적으로 상기 펩타이드는 염 형태로 존재하는 것을 사용할 수 있는데, 이는 아미노기를 적절한 산과 반응시키는 것에 의하여 만들어지는 것으로서, 예를 들면 유기산 부가염으로서 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 말리에이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 무기산 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 두피 세포의 항상성을 유지하기 위하여 완충액을 더 포함하는 것일 수 있다. 완충액은 단당류, 다가알코올 및 전해질 화합물을 포함하는 복합 완충액일 수 있다.

상기 단당류는 두피 세포 내 영양공급원으로 이용될 수 있는 것이면 제한없이 사용 가능하다. 구체적으로 6개의 탄소원자를 가진 단당류로서, D-글루코스(D-glucose), D-글로오스(D-gulose) D-만노오스(D-mannose), D-갈락토오스(D-galalctose), D-이도오스(D-idose), D-탈로오스(D-talose), D-알로오스 (D-allose), D-알트로오스(D-altrose), D-프룩토오스(D-fructose), D-타가토오스(D-tagatose) 및 L-소르보오스 (L-sorbose)로 이루어진 군에서 어느 하나 또는 둘 이상 선택하여 사용할 수 있다.

상기 단당류는 완충액 기준으로 5 내지 30 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는 7 내지 28 중량%, 더욱 바람직하게는 10 내지 25 중량%로 포함될 수 있다. 상술한 함량 범위로 포함되는 경우 적절한 점도 형성으로 사용감이 우수하다.

상기 전해질 화합물은 일반적으로 화장료 조성물에 사용되어 두피 내 깊숙이 무기질을 공급할 수 있고, 피부에 닿았을 때 알레르기 반응 및 자극감이 없는 것이면 특별히 한정되지 않고 사용 가능하다. 바람직하게는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 황산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한 전해질 화합물은 전체 화장료 조성물 기준으로 0.001 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.005 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량%로 포함될 수 있다. 상기 함량 범위에서 전해질 화합물이 포함되는 경우 세포 내외의 산염기의 균형을 유지하고, 모낭세포와의 삼투압을 적절하게 유지함으로써 건강한 두피 환경을 조성할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징 폼, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림, 샴푸, 린스, 트리트먼트 및 스프레이로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 두피의 건강 개선을 위한 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤 토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연을 더 포함할 수 있고, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 더 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 더 포함되고, 이는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 더 포함될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물에는 탈모를 예방할 수 있는 표피성장인자(Eepidermal growth factor, EGF), 형질전환생장인자-a(Transforming growth factor-a, TGFa), 형질전환생장인자-b(Transforming growth factor-b, TGF-b), 섬유아세포성장인자-2 (Basic fibroblast growth factor, bFGF), 세포성장인자(Keratinocyte Growth Factor, KGF), 줄기세포성장인자(Stem Cell Factor, SCF), 혈소판유래성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 혈관내피성장인자(Vascular endothelial Growth Factor, VEGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 필요에 따라 적절하게 선택하여 더 포함할 수 있고, 본 발명에 따른 펩타이드는 이러한 성장인자들을 활성화시킴으로써 모발 성장 및 발모 촉진을 위한 두피 환경 조성 및 유지 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 일반적으로 화장료 조성물이 적용될 수 있는 부위로서, 두피뿐만이 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용될 수 있다. 예를 들면 외상으로 인한 흉터로 모발 또는 털이 손상된 부위 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마, M형 이마, 속눈썹, 눈썹 또는 무모증의 상태 호전에도 사용할 수 있다.

상기 유효성분은 전술한 바와 같이 조성물 전체 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 함량 범위는 펩타이드가 성장인자를 활성화시켜 두피 내 혈행 개선을 통한 모발 성장 및 모낭을 활성화시켜 모발을 강화시킬 뿐만 아니라, 두피 건강 개선에 효과적이고 탈모증 예방 또는 개선의 뚜렷한 효과를 볼 수 있다.

이하 하기의 실시 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니며, 통상의 기술자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.

[제조예 1] 화학식 1의 펩타이드 제조

1-1. 화합물 1a의 합성

800 ㎖의 반응 용기에　2-chloro trityl chloride resin (20 g, 1당량)과　Fmoc-Lys(Dde)-OH(N _α -Fmoc-N _ε -Dde-L-lysine,N _α -Fmoc-N _ε -[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl]-L-lysine) (21.3 g, 2당량)　및　DIPEA(29.9 ㎖, 8당량)을　DCM(700 ㎖)을 넣어 상온에서　12시간 동안 반응시켰다.　필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　500 ㎖의　DCM(dichloromethane: 디클로로메탄)과　MeOH,DCM, DMF(디메틸폼아마이드)를 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조하여 고체 상 형태의　화합물 1a(Fmoc-Lys(Dde)-O-2-chloro trityl resin)을　99%　수율로　23 g　수득하였다.

1-2. 화합물 1b의 합성

800 ㎖의 반응 용기에　화합물 1a와 700 ㎖의 20% piperidine in DMF을 넣고 상온에서 5분간 반응한 후, 필터하여 반응액을 제거하였다. 700 ㎖의 20% piperidine in DMF을 한번 더 가하고 상온에서 5분간 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　500 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM, DMF를 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조하여 고체 상 형태의 Fmoc이 제거된 생성물에 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(47.3 g, 4당량)와 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 10.8 g, 4당량)그리고 DIC(12.4 ㎖, 4당량)을 600 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　500 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM, DMF를 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조하여 고체 상 형태의 화합물 1b(Fmoc-Lys(Fmoc)-Lys(Dde)-O-2-chloro trityl resin)을 98% 수율로 25g 수득하였다.

1-3. 화합물 1c의 합성

800 ㎖의 반응 용기에　화합물 1b와 700 ㎖의 20% piperidine in DMF을 넣고 상온에서 5분간 반응한 후, 필터하여 반응액을 제거하였다. 700 ㎖의 20% piperidine in DMF을 한번 더 가하고 상온에서 5분간 반응하였다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　500 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM, DMF를 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조하여 고체 상 형태의 Fmoc이 제거된 생성물에 tert-butyl bromoacetate(59.1 ㎖, 20당량)와 DIPEA(69.7 ㎖, 20당량)를 600 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 12시간동안 반응하였다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 500 ㎖의　DMF를 이용하여 세척하였다. 다시 1,8-Bis(dimethylamino)napthalene(85.7g, 20당량)와 tert-butyl bromoacetate(59.1 ㎖, 20당량) 및 DIPEA(69.7 ㎖, 20당량)를 600 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 12시간 동안 반응하였다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각 각　500 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM, DMF　를 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조하여 고체 상 형태의 화합물 1c(tert-butoxycarbonylmethyl)₂-Lys(tert-butoxycarbonylmethyl)₂-Lys(Dde)-O-2-chloro trityl resin)을 95% 수율로 31g 수득하였다.

1-4. 화합물 1d의 합성

800 ㎖의 반응 용기에　화합물 1c와 700 ㎖의 2% hydrazine in DMF을 넣어 5분간 상온에서 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 500 ㎖ DMF　를 이용하여 세척하였다.　다시 700 ㎖의 10% DIPEA in DMF를 가하고 상온에서 5분간 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　500 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM, DMF를 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조하여 고체 상 형태의 화합물 1d(tert-butoxycarbonylmethyl)₂-Lys(tert-butoxycarbonylmethyl)₂-Lys(NH₂)-O-2-chloro trityl resin)을 99% 수율로 30 g 수득하였다.

1-5. 화합물 2의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460 mg, 1당량)를 넣고, acetic anhydride(200 ㎕, 8당량)와 DIPEA(200 ㎕, 8당량)을 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각 각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터(디에틸에터)를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22 mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 2(LC mass로 측정된 분자량: 548.54)을 66% 수율로 80 mg 수득하였다.

1-6. 화합물 3의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460mg, 1당량)를 넣고, butyric anhydride(200 ㎕, 8당량)와 DIPEA(200 ㎕, 8당량)를 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각 각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM　을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 3(LC mass로 측정된 분자량: 576.59)을 68% 수율로 75 mg 수득하였다.

1-7. 화합물 4의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460 mg, 1당량)을 넣고, hexanoic acid(186 ㎕, 8당량)와 DIC(248 ㎕, 8당량) 그리고 HOBt(216 mg, 8당량)를 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22 mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 4(LC mass로 측정된 분자량 : 604.65)을 64% 수율로 77 mg 수득하였다.

1-8. 화합물 5의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460 mg, 1당량)을 넣고, octanoic acid(230 ㎕, 8당량)와 DIC(248 ㎕, 8당량) 그리고 HOBt(216 mg, 8당량)를 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22 mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 5(LC mass로 측정된 분자량 : 632.7)을 56% 수율로 62 mg 수득하였다.

1-9. 화합물 6의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460 mg, 1당량)를 넣고, decanoic acid(275 ㎕, 8당량)와 DIC(248 ㎕, 8당량) 그리고 HOBt(216 mg, 8당량)를 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22 mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 6(LC mass로 측정된 분자량: 660.36)을 66% 수율로 79 mg 수득하였다.

1-10. 화합물 7의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460 mg, 1당량)를 넣고, dodecanoic acid(320 ㎕, 8당량)와 DIC(248 ㎕, 8당량) 그리고 HOBt(216 mg, 8당량)를 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM　을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22 mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 7(LC mass로 측정된 분자량: 688.81)을 62% 수율로 72 mg 수득하였다.

1-11. 화합물 8의 펩타이드 제조

10 ㎖의 반응 용기에 화합물 1d(460 mg, 1당량)를 넣고, palmitic acid(308 mg, 8당량)와 DIC(248 ㎕, 8당량) 그리고 HOBt(216 mg, 8당량)를 5 ㎖의 DMF에 녹여서 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 제거하고,　합성된 레진을 각각　5 ㎖의　DCM과　MeOH, DCM을 이용하여 순차적으로 세척하였다.　진공 건조한 후, 5 ㎖의 cleavage cocktail(trifluoro acetic acid : triisopropylsilane : DW = 95 : 2.5 : 2.5)을 가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 필터하여 반응액을 모으고, 여기에 45 ㎖의 디에틸에터를 가하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여 고체 생성물을 모으고, 45 ㎖의 디에틸에터로 2회 세척하였다. 얻어진 고체 생성물을 Prep-HPLC (column C18, 10 ㎛, 250 mm X 22 mm) 이용하여 정제 후, 동결건조하여 화합물 8(LC mass로 측정된 분자량: 744.93)을 70% 수율로 80 mg 수득하였다.

[제조예 2] 화학식 2의 펩타이드(화합물 9) 제조

본 발명에 사용되는 펩타이드들의 합성은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)을 Nα아미노산의 보호기로 사용하는 고상법에 의해 합성하였으며(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis), HOBt-DIC (N-hydroxybenzotriazole-diisopropylcarbodiimide) 방법에 따라 펩타이드를 연장하였다(Wang C. Chan, Perter D. white, "Fmoc solid phase peptide synthesis" Oxford). 상기 방법으로 화학식 2(아르기닌-아이소류신-프롤린, RIP)의 펩타이드를 합성하였으며, 정제고성능액체크로마토그래피(Prep-HPLC, column C18, 10 ㎛, 250 mm×22 mm)를 이용하여 정제 후, 동결건조하여 91% 수율(LC mass로 측정된 분자량: 384.47)로 70 mg 수득하였다.

[비교예 1]. 모낭 각질형성세포에서의 자가포식 활성 증가 확인

본 발명의 화합물 단독 처리에 의한 자가포식 활성 증가를 분석하기 위해 LC3(light chain 3) 단백질에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 인간 유래의 모낭 각질형성세포(human hair follicular keratinocyte cell: HHFK)와 인간 모유두 세포(human follicular dermal papilla cell: HFDPC)를 각각 배양용 12웰 플레이트(well plate)에 5×10⁴ 개의 세포 수로 일정하게 분주하여 EpiLife(1x Human keratinocyte Growth supplement, 1X antibiotics)와 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco BRL)에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 이후, 화학식 1(화합물 8)과 화학식 2의 펩타이드 각각을 10 mM의 농도로 물로 녹여 농축액으로 하고, 이를 배지로 희석하여 각 희석액을 1 ㎖씩 넣어 처리한 후 일정 시간 동안 배양하고, 배양 종료 후 배지를 제거한 후 SDS sample buffer로 세포를 파쇄 후 SDS-PAGE gel 전기영동으로 각 단백질을 분리하고, PVDF membrane(polyvinylidene Fluoride)에 이동시켰다. 블로킹 버퍼를 이용해 비특이적 결합을 없애고, LC3 단백질에 대한 항체(sigma) 및 이에 대한 HRP 결합된 이차항체(anti-rabbit IgG HRP(sigma))를 반응시킨 후 ECL prime kit(Amersham pharmacia)를 이용한 Enhanced chemiluminescence(ECL) 반응을 시키고, ChemiDoc 분석을 수행하였다. 모낭 각질형성세포의 결과는 도 1a에, 인간 모유두 세포의 결과는 도 1b에 나타내었다.

도 1a와 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1에 따른 화합물에 의해 LC3-II(Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)의 생성이 증가되어 자가포식 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 반면 화학식 2에 따른 화합물의 경우 LC3-II의 생성을 유도하지 못하여 자가포식 활성이 확인되지 않았다.

[비교예 2]. 모유두 세포에서의 Wnt/β-카테닌 단백질 발현 증가 효과 확인

본 발명의 화합물 단독 처리에 의한 세포 내 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 활성화를 분석하기 위해 β-카테닌 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯을 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 블로킹 버퍼를 이용해 비특이적 결합을 없앤 후, Non-phospho(Active)β-카테닌 단백질에 대한 항체(cell signaling technology) 및 HRP 결합된 이차항체(anti-rabbit IgG HRP(sigma))를 반응시킨 후 ECL prime kit(Amersham pharmacia)를 이용한 Enhanced chemiluminescence(ECL) 반응을 시켜, ChemiDoc 분석을 수행하여, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a 및 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화학식 2에 따른 화합물에 의해 β-카테닌 단백질의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면 화학식 1(화합물 8)의 경우 β-카테닌 단백질의 발현 수준이 매우 낮음을 확인할 수 있었다. 다만, β-카테닌은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 펩타이드를 고농도로 처리한 경우에 비하여 저농도로 처리한 경우 발현 양이 높아 β-카테닌은 농도의존적으로 발현 활성이 증가하는 것은 아님은 확인할 수 있다.

[실시예 1]. 본 발명의 펩타이드 조성물에 의한 자가포식 활성 및 β-카테닌 단백질 발현 확인

본 발명에 따른 펩타이드 조성물에 대한 자가포식 활성 및 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 활성화 효과를 분석하기 위하여 모낭 각질형성세포에서의 LC3-II 및 모유두 세포에서의 β-카테닌 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯을 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 모두 포함하는 본 발명에 따른 펩타이드 조성물에 의해 LC3-II 와 β-카테닌 단백질의 발현이 모두 증가된 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]. 본 발명의 펩타이드 조성물에 의한 염증 억제효과 확인

본 발명의 펩타이드 조성물에 의한 항염 효과 여부를 분석하기 위해 피부 염증 반응과 매우 밀접한 관련이 있는 IL-8(interleukin 8)에 대한 ELISA 분석을 수행하였다.

인간 유래의 모낭 각질형성세포(human hair follicular keratinocyte cell: HHFK)를 배양용 24웰 플레이트(well plate)에 4×10⁴개의 세포 수로 일정하게 분주하여 EpiLife(1x Human keratinocyte Growth supplement, 1X antibiotics)에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 각 웰에 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)를 처리하여 염증 반응을 유도하면서, 본 발명의 펩타이드 조성물을 처리한 후 일정 시간 동안 배양하고, 배양 종료 후 배지를 모은 후 IL-8에 대한 ELISA 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 조성물에 의해 IL-8의 생성이 감소함을 확인할 수 있었다.

[실시예 3]. 본 발명의 펩타이드 조성물에 의한 인체 모낭에서의 자가포식 및 Wnt/β-카테닌 단백질 발현 증가 효과 확인

인체에서 분리된 모낭조직을 주변 구성물을 모두 분리하여 Earle's balanced salts solution (EBSS; SigmaAldrich)에 보관하였다. 성장단계의 모낭을 현미경하에서 조심스럽게 분리한 후 실험에 사용하였다. 분리된 모낭은 Williams medium E (Gibco, Grand Island, NY, USA)에 2 mM L-glutamine (Gibco, NY, USA), 10 μg/㎖ insulin (SigmaAldrich), 10 ng/㎖ hydrocortisone (SigmaAldrich), 100 unit/㎖ penicillin, 100 μg/㎖ streptomycin를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 95% air의 조건에서 배양하였다. 본 발명에 따른 펩타이드 조성물을 처리하여 7일간 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 미녹시딜(Minoxidil, 10 μM)을 처리하였다. 모낭조직은 10% 인산완충포르말린(Neutral buffered formalin: NBF)에 24시간 고정시킨 후, 고정된 조직을 세척, 탈수, 크실렌 치환, 파라핀 포매의 과정을 통해 파라핀 블록을 제작하여 5 ㎛의 두께로 박절하였다. 박절된 조직을 anti-LC3B (abcam), anti-beta catenin (cell signaling technology) 일차 항체 및 Goat Anti-Rabbit IgG H&L_Alexa Fluor® 488 (Abcam) 이차 항체를 이용하여 면역형광염색을 진행 후 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 조성물에 의해 인체 모낭조직에서 LC3-Ⅱ (a)와 β-카테닌 단백질 (b)의 발현이 대조군 및 미녹시딜 처리 조직과 대비하여 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 4]. 본 발명의 펩타이드 조성물에 의한 인체 모낭에서의 세포증식 효과 확인 (Ki-67)

실시예 3에서 제작된 모낭조직을 실시예 3과 동일한 방법으로 Ki-67 (Abcam) 일차 항체 및 Goat Anti-Rabbit IgG H&L_Alexa Fluor® 568 (Abcam) 이차 항체를 이용하여 면역형광염색을 진행 후 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 조성물에 의해 인체 모낭조직에서 세포 증식 관련 단백질 Ki-67의 발현이 미녹시딜을 처리한 조직에 비하여 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 5]. 본 발명의 펩타이드 조성물에 의한 인체 모낭에서의 모간 생장촉진 효과 확인

실시예 3과 동일한 방법으로 본 발명의 펩타이드 조성물을 처리하고, 7일간 배양 후 성장한 모간의 길이를 Image J (version 1.52a NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 측정하여 분석하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 조성물은 양성대조군인 미녹시딜에 대비하여 월등한 모간 길이 성장이 관찰되었다.

[실험예 1]. 본 발명의 펩타이드 조성물의 두피개선 효과에 대한 임상실험평가

시험 실시 전 특별한 피부 증상이 없고 시험에 영향을 미칠 수 있는 질환 및 약물 복용력이 없는 만 20-59세의 남, 여 성인을 피험자로 설정하여, 아래 제조예 3에 따라 제조된 헤어토닉을 샴푸 사용과는 상관없이 아침, 저녁 하루 2회에 걸쳐 두피에 사용하도록 하였으며, 특히 가려운 부분, 정수리 부분과 가르마 중심으로 사용하도록 하였다. 도포 4주 후 두피 붉은기의 변화, 두피 수분손실량의 변화, 두피 각질량의 변화 및 두피 유분량의 변화를 측정하여 도 8 및 도 9에 각각 나타내었다.

[제조예 3]. 본 발명의 펩타이드 조성물을 포함하는 헤어토닉

하기 표 1과 같은 함량으로 각각의 원료(중량%)를 계량하여 Agi Mixer 100 rpm으로 10분간 교반한 후 여과하여 헤어토닉을 제조하였다.

도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 조성물을 포함하는 제품을 사용한 결과, 사용 4주 후 두피 붉은기가 사용 전 대비하여 36% 이상 감소하였으며, 두피 수분손실량은 25% 감소한 결과를 나타내었다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 펩타이드 조성물을 포함하는 제품을 사용한 결과, 사용 4주 후 두피 각질량은 사용 전 대비하여 44% 이상 감소하였으며, 두피 유분량은 64% 이상 감소한 결과를 나타내었다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 탈모증 예방 또는 개선을 위한 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   
   [화학식 2]
   
   상기 화학식 1에서, n은 1 내지 10의 정수이다.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 1:1 내지 1:10의 비율로 포함되는, 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 화학식 1 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 화학식 2로 표시되는 화합물은 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%로 포함되는 것인, 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 n은 3 내지 7의 정수인, 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 당귀추출물, 작약추출물, 참마뿌리추출물, 황기추출물, 지황추출물, 인삼추출물, 승마추출물, 복령추출물 및 감초추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 더 포함하는, 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1항에 있어서,
   상기 탈모증은 원형 탈모증, 유전성 안드로젠 탈모증, 휴지기 탈모증, 외상성 탈모증, 생장기 탈모증, 비강성 탈모증, 지루 탈모증 및 선천성 탈모증으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상인, 화장료 조성물.