CN108137659B - 具有预防或治疗中枢神经系统疾病作用的肽和包含其作为活性成分的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明具有能够以优异效率渗透未曾显著渗透的中枢神经系统的血脑屏障和血脊髓屏障的功能，由此能够通过低剂量施用获得迅速、快速且更加有效的治疗效果。此外，本发明能够实现不同于常规治疗剂的局部施用，从而减少副作用，并且能够以高浓度局部施用治疗剂，从而潜在地能够实现新的治疗和处方。

Description

具有预防或治疗中枢神经系统疾病作用的肽和包含其作为活 性成分的药物组合物
技术领域
本发明涉及具有预防或治疗中枢神经系统疾病的作用的肽和包含其 作为活性成分的用于预防或治疗中枢神经系统疾病的药物组合物。
背景技术
多发性硬化(MS)是一种人自身免疫病，其由穿过血脑屏障(BBB) 的保护性环境的髓鞘特异性T细胞在中枢神经系统(cCNS)中诱导炎症 引起。作为MS的小鼠模型，已广泛研究了通过MOG35-55免疫接种诱导的 实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和表达干扰素-γ(IFN-γ)或白介素-17A (IL-17A)的辅助性T细胞1(Th1)或辅助性T细胞17(Th17)。在Th1和Th17细胞的高水平下，这些细胞在包括脑和脊髓的中枢神经系统中诱 导炎症和神经细胞坏死。
虽然这些效应细胞可以是潜在的治疗靶标，但是由于BBB和血脊髓 屏障(BSCB)，多种治疗性生物分子不能转移到中枢神经系统并且不可避 免地因此无法表现出治疗效果(非专利文件1和2)。
因此，克服这一现象的多种方法已经被开发。然而，开发的治疗性生 物分子来源于合成化合物或其他生物体并且由于长期毒性或其他副作用 以及被BBB和BSCB限制渗透而因此仍具有无法表现出足够治疗效果的 问题。
例如，已经报道了与改善对血脑屏障之渗透的基于肽的渗透剂或药物 载体相关的常规专利文件。例如，韩国专利No.10-0242597公开了血脑屏 障渗透剂，其包含具有NH2-精氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸-噻吩丙氨酸- 丝氨酸-脯氨酸-4-Me-酪氨酸(CH2NH)-精氨酸-COOH的氨基酸序列的肽或 其具有预定修饰的结构类似物(专利文件1)，并且韩国专利特许No. 10-2014-0026372公开了由预定序列表所示并且能够渗透血脑屏障的氨基 酸序列(专利文件2)。
发明内容
技术问题
因此，本发明是基于以上问题而做出的，并且本发明的一个目的是提 供能够有效地穿过血脑屏障或血脊髓屏障并且对IL-2具有优异抑制活性 的肽、包含其的药物组合物和使用其来预防或治疗疾病的方法。
技术方案
根据本发明，上述和其他目的可通过提供具有由序列ID No.1所示的 氨基酸序列对IL-2具有抑制活性的肽来实现。
根据本发明的另一个方面，提供了对IL-2具有抑制活性的肽，其包 含由序列IDNo.2或3所示的CTLA-4蛋白中胞质结构域的片段，或者两 个或更多个所述片段的融合肽。
融合肽可以具有由序列ID No.4所示的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了融合产物，其包含：具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的肽、其片段、或者两个或更多个所述片段的融 合肽；和细胞渗透肽。
所述片段可以具有由序列ID No.2或序列ID No.3所示的氨基酸序 列。
所述融合肽可以具有由序列ID No.4所示的氨基酸序列。
细胞渗透肽可以包括选自以下的任一种：HIV-1 tat(47-57)、D-氨基 酸取代的HIV-1 tat(48-60)、精氨酸取代的HIV-1 tat(48-60)、果蝇触角 足肽(DrosophilaAntennapaedia)(43-58)、包含7个或更多个氨基酸的病 毒RNA结合肽、包含7个或更多个精氨酸的DNA结合肽、包含6至8 个精氨酸的聚精氨酸多肽、包含7至11个赖氨酸的多肽、具有由序列ID No.5所示的氨基酸序列的dNP2蛋白、Hph-1(序列ID No.6)、Transportan (序列ID No.8)、Pep-1(序列ID No.9)、pVEC(序列ID No.10)、M918 (序列ID No.11)、TP10(序列ID No.12)、VP22(序列ID No.13)、Buforin 2(序列ID No.14)、KALA(序列ID No.15)、CL22(序列ID No.16) 和响尾蛇胺(Crotamine)(序列ID No.17)。
细胞渗透肽可以是氨基酸序列由序列ID No.5所示的dNP2蛋白。
根据本发明的另一个方面，提供了包含编码融合产物的基因的重组表 达载体。
根据本发明的另一个方面，提供了用于预防或治疗中枢神经系统疾病 的药物组合物，其包含所述融合产物作为活性成分。
在融合产物中的细胞渗透肽可以具有渗透血脑屏障或血脊髓屏障的 活性。
中枢神经系统疾病可以包括选自以下的任一种：脊髓损伤、卒中、脑 梗死、脑缺血、阿尔茨海默病和多发性硬化。
根据本发明的另一个方面，提供了通过向对象施用药物组合物来在动 物中预防或治疗中枢神经系统疾病的方法，所述动物不包括人。
发明效果
根据本发明，在高度有效地渗透过去不能显著渗透的中枢神经系统的 血脑屏障和血脊髓屏障的功能和与此同时IL-2抑制活性下，可以以甚至 更低的剂量更快速地实现更有效的治疗效果。
此外，与常规的治疗剂相比，本发明由于可能的局部施用而可减少副 作用，并且由于高浓度治疗剂的可能局部施用而可提供潜在新的治疗和处 方。
附图简述
本发明的以上和其他目的、特征和其他优点将从以下详细描述并结合 附图更清楚地理解，在附图中：
图1A示出了根据本发明的CTLA-4蛋白中胞质结构域的片段和变化 部分的鉴定结果；
图1B示出了根据本发明的人来源细胞渗透肽dNP2的鉴定结果；
图2示出了根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合蛋白的结构和使用 SDS-PAGE对dNP2-ctCTLA-4融合蛋白的分析结果；
图3是示出了ctCTLA-4肽以及dNP2-ctCTLA-4和Hph-1-ctCTLA-4 融合产物在原代小鼠CD4 T细胞中的细胞内转移效率的图；
图4是示出了1μM PBS、dNP2-ctCTLA-4融合产物和TAT-ctCTLA-4 融合产物的IL-2表达抑制效率的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表 p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验；
图5A和5B是示出了dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-EGFP融合 产物的IL-2表达抑制效率的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05， **代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验；
图6A是示出了dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-EGFP融合产物的 IFN-γ表达抑制效率的图，并且图6B是示出了dNP2-ctCTLA-4融合产物 和dNP2-EGFP融合产物的IL-17A表达抑制效率的图。数值代表平均值 ±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检 验；
图7是示出了测试例3中1)的测试结果的图，并且该图示出了各组中 作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型中的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验；
图8是示出了测试例3中2)的测试结果的图，并且该图示出了各组中 作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型中的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验；
图9是示出了测试例3中3)的测试结果的图，并且该图示出了各组中 作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型中的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验；
图10是示出了测试例3中4)的测试结果的图，并且该图示出了各组 中作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型中的临床评分(y 轴)。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代 表p＜0.001；学生t检验；
图11是勒克司坚牢蓝(luxol fast blue，LFB)和苏木精-伊红(H&E) 染色的图像，其示出了根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物和 dNP2-EGFP融合产物在EAE诱导的动物模型中对脱髓鞘和免疫细胞侵入 的作用，其中比例尺为100μm；
图12是示出了根据在图11中测量的各处理组的脊髓组织的侵入性免 疫细胞的数目的图，其中该数目利用Image J软件1.48v进行计数。数值 代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001； 学生t检验；
图13示出了在经根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物和 dNP2-EGFP融合产物处理的EAE动物模型中分离脊髓细胞后对IL-17A 和/或IFN-γ表达CD4 T细胞(关于Th1、Th17、Th2和Treg细胞(T细 胞))进行流式细胞术的结果。
图14是示出了对图13结果的分析的图。绝对细胞数在其中悬浮有来 自脊髓的单细胞的级分中计数。通过乘以该数目，测量CD4+细胞(a)、 IFNγ+CD4+细胞(b)、IL-17A+CD4+细胞(c)和IFNγ+IL-17A+CD4+细胞(d) 的总比率，并且数据表示为柱形图(n＝15)。数值代表平均值±s.e.m，并且 *代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；
图15是示出了0.5μM、1μM、2μM或5μM的WT、1YF、2YF和 DYF的IL-2表达抑制效率之测量结果的图。数值代表平均值±s.e.m，并 且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验；
图16是示出了在仅用PBS处理的原代小鼠CD4-T细胞中的引入效率 的图。
图17是示出了0.1μM、0.5μM、1μM、2μM或5μM的dNP2-TAMRA 融合产物、dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物在 原代小鼠CD4-T细胞中的细胞内转移效率的图；以及
图18是示出了0.1μM、0.5μM、1μM、2μM或5μM的dNP2-TAMRA 融合产物、dNP2-CTLA-4融合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物的IL-2 表达抑制效率的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表 p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验。
最佳方式
在下文中，将对本发明的数个方面和不同的实施方案进行更详细描 述。
已知中枢神经系统(CNS)侵入性效应T细胞在多发性硬化(MS) 的发生和发展中起关键作用。然而，至今开发的与MS相关的药物是非常 有限的。这样的原因是将这些药物转移到CNS并且从而调节侵入性T细 胞是相当困难的。
因此，本发明已经基于以下重复尝试而完成：克服常规药物的上述问 题，并且开发与中枢神经系统疾病相关且具有优异的渗透密集组织的脑血 屏障或脑脊髓屏障的能力的新蛋白质。
本发明的一个方面涉及对IL-2具有抑制活性的肽，其具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明的一个特征是开发以下新蛋白质，其具有优异的渗透脑血屏障 或脊髓血屏障(其不能容易地引入细胞中)的能力，并抑制T细胞(特别 地，Th17)的活性，并且从而减轻来源于自身免疫的疾病的原因，由此预 防或治疗中枢神经系统疾病。
本文所用的术语“具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的对IL-2 具有抑制活性的肽”是指来源于CTLA-4蛋白中胞质结构域的序列，其通 过对来源于人或小鼠的整个CTLA-4蛋白的外显子4的仅一部分进行测序 获得。即，其意指在人和小鼠中CTLA-4蛋白的氨基酸序列中具有100％ 同一性的部分的氨基酸序列。这样的氨基酸序列在施加于人时引起副作用 (例如免疫反应)的风险低。
具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的对IL-2具有抑制活性的肽 是CTLA-4蛋白中对IL-2表达具有抑制活性的CTLA-4片段，其具有高效 率穿过中枢神经系统(即血脑屏障或血脊髓屏障)的作用。通过使用在人 和除人之外的动物(小鼠)中具有100％同一性的氨基酸序列，片段可应 用于二者。
特别地，具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的对IL-2具有抑制 活性的肽是指包含细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)蛋白的第188 位氨基酸残基至第213位氨基酸序列的肽(序列ID No.1)，其在下文称 为“ctCTLA-4”。该肽是一种多肽，其N端和C端被部分地缺失以提供针 对血脑屏障或血脊髓屏障的渗透能力以及预防或治疗效果。
本发明的另一个方面涉及对IL-2具有抑制活性的肽，其包含由序列 ID No.2或3所示的CTLA-4蛋白中胞质结构域的片段，或者两个或更多 个所述片段的融合肽。
ctCTLA-4蛋白的片段包含ctCTLA-4蛋白的第201位氨基酸残基至第 210位氨基酸序列(序列ID No.2)或第218位氨基酸残基至第223位氨 基酸序列(序列ID No.3)，并且可以是以下多肽片段，其N端和C端被 部分地缺失以提供针对血脑屏障或血脊髓屏障的渗透能力以及预防或治 疗效果。
融合肽可以是其中序列ID No.2与序列ID No.3组合的由序列ID No. 4所示的氨基酸序列。
对IL-2具有抑制活性的肽非常小并且因此具有使可能的生物干扰最 小化的优点。
对IL-2具有抑制活性的肽可以是天然提取的或合成的或基于DNA序 列通过遗传重组产生的。
以下的不同测试结果显示，ctCTLA-4肽能够高度有效地穿过中枢神 经系统(即血脑屏障或血脊髓屏障)，并且具有抑制引起中枢神经系统疾 病的T细胞(特别地Th17)的活性的作用。
换言之，来源于CTLA-4蛋白的对IL-2具有抑制活性的肽具有以下 作用：改善向中枢神经系统的转移以及穿过血脑屏障和血脊髓屏障的渗 透；以及优异地抑制多发性硬化动物模型中的T细胞。因此，根据本发明 对IL-2具有抑制活性的肽可用于预防或治疗中枢神经系统疾病。
本发明的另一个方面涉及包含以下的融合产物：具有由序列ID No.1 所示的氨基酸序列的肽、其片段或者两个或更多个所述片段的融合肽；和 细胞渗透肽。
具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的肽、其片段或者两个或更多 个所述片段的融合肽已在上文中进行描述并且因此不再对其详细说明。
在本发明的一个实施方案中，向具有由序列ID No.1所示的氨基酸序 列的肽、其片段或者两个或更多个所述片段的融合肽的一侧或两侧进一步 引入细胞渗透肽，以使得可以进一步提高进入中枢神经系统血管的渗透能 力。这样的融合产物也可被称为“融合蛋白”。
在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的预防性和治疗性模型二者中， 融合产物都下调活化T细胞中细胞因子的产生并且显示出抑制作用，由此 促使降低脱髓鞘和CNS侵入性辅助性T细胞1(Th1)和辅助性T细胞 17(Th17)的数目。
本文所用的术语“融合产物”或“融合蛋白”包含ctCTLA-4肽、其 片段或融合肽，和细胞渗透肽，并且意指通过其遗传融合或化学键合形成 的共价键合的复合物。
此外，本文所用的术语“遗传融合”意指通过编码蛋白质的DNA序 列的遗传表达经由线性或共价键合产生的结合。
在本发明的一个实施方案中，细胞渗透肽可以是选自以下的任一种： HIV-1 tat(47-57)、D-氨基酸取代的HIV-1 tat(47-57)、精氨酸取代的HIV-1 tat(47-57)、果蝇触角足肽(43-58)、包含7个或更多个氨基酸的病毒RNA 结合肽、包含7个或更多个精氨酸的DNA结合肽、包含6至8个精氨酸 的聚精氨酸多肽、包含7至11个赖氨酸的多肽、具有由序列IDNo.5所 示的氨基酸序列的dNP2蛋白、Hph-1(序列ID No.6)、Transportan(序 列ID No.8)、Pep-1(序列ID No.9)、pVEC(序列ID No.10)、M918(序 列ID No.11)、TP10(序列ID No.12)、VP22(序列ID No.13)、Buforin 2(序列ID No.14)、KALA(序列ID No.15)、CL22(序列IDNo.16) 和响尾蛇胺(序列ID No.17)。
已知大多数细胞渗透肽在多种细胞系中具有优异的体外渗透效率并 且预期当与货物蛋白结合时提高细胞渗透能力。然而，通常发现细胞渗透 肽对原代细胞具有差得多的渗透效率。为此，细胞渗透肽在人中的临床应 用中受到极大限制(Simon，M.J.，Gao，S.，Kang，W.H.，Banta，S.&Morrison， B.，第三版.TAT-mediated intracellular proteindelivery to primary brain cells is dependent on glycosaminoglycanexpression.Biotechnology and bioengineering 104，10-19，doi：10.1002/bit.22377(2009))。在另一方面，本 发明证明，通过将对中枢神经系统(特别地血脑屏障或血脊髓屏障)具有 渗透能力的ctCTLA-4蛋白或其片段与细胞渗透肽组合可显著地提高常规 不能预期的对人临床应用的效果。特别地，当细胞渗透肽是具有由序列ID No.5所示之氨基酸序列的dNP2蛋白时，发现显著提高对血脑屏障或血 脊髓屏障的渗透能力。
本发明的另一个方面涉及包含编码融合产物的基因的重组表达载体， 或包含编码对IL-2具有抑制活性的肽的基因和编码细胞渗透肽的基因的 重组表达载体。
重组表达载体可以包含细胞渗透肽和对IL-2具有抑制活性的肽(序 列ID No.1、2、3或4)的序列，以及促进融合产物纯化的标签序列，例 如连续组氨酸密码子、麦芽糖结合蛋白密码子、Myc密码子等，并且还可 以包含配偶体等以提高融合产物的溶解度。此外，重组表达载体可以包含 间隔物氨基酸或碱基序列以稳定重组蛋白的整个结构和功能，或者赋予相 应基因编码的蛋白质柔性。间隔物的一些实例包括AAY(P.M.Daftarian 等，JTrans Med 2007，5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller等，J Immunol. 2000，165：7308-7315)、或(S.Ota等，Can Res.62，1471-1476；K.S. Kawamura等，J Immunol.2002，168：5709-5715)之一中的多个赖氨酸残基， 但本发明并不局限于此。此外，重组表达载体可以包含为除去重组蛋白的 非必需部分而被酶特异性切割的序列、表达调节序列、确定向细胞中的转 移的标志物和报道基因序列，但本发明并不局限于此。
用于重组表达载体的表达调节序列可以由调节结构域构成，所述调节 结构域包含对靶DNA和/或RNA被选择性地转移至其中或在其中表达的 细胞、组织或器官具有特异性的启动子。
根据本发明的融合产物可以用作预防性或治疗性药物组合物的活性 成分。该组合物可以是对治疗中枢神经系统炎性疾病有效的治疗剂。
中枢神经系统疾病可以是选自以下的任一种：脊髓损伤、卒中、脑梗 死、脑缺血、阿尔茨海默病和多发性硬化，但本发明并不限于此。
根据本发明的组合物还可以包含通常用于制备药物组合物的合适的 载体、赋形剂和稀释剂。根据本发明的药物组合物可以根据常规方法被配 制成以经口制剂、外用制剂、栓剂和无菌注射溶液的形式来使用，例如散 剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂。
本领域中已知的合适制剂优选地是Remington′s Pharmaceutical Science(MackPublishing Company，Easton PA)中公开的那些。
可以包含于根据本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的一 些实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、 麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、 甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基 苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。可以使用通常使用的稀释剂或赋形剂来生产制剂，所述稀释剂或赋形剂例如填充剂、增量剂、黏合剂、润 湿剂、崩解剂和表面活性剂。用于经口施用的固体制剂包括片剂、丸剂、 散剂、颗粒剂、胶囊剂等。这些固体制剂通过将提取物与至少一种赋形剂 混合来产生，所述赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。此外， 除简单的赋形剂之外，也可使用润滑剂例如硬脂酸镁和滑石。用于经口施 用的液体制剂包括混悬剂、内用液体、乳剂、糖浆剂等。可以包含通常使 用的稀释剂例如水和液体石蜡，以及各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、 芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、 混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。可用的非水性溶剂和混悬剂包括丙二醇、 聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。用于 栓剂的基质包括Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂精、甘油 明胶等。
本文所用的术语“施用”意指通过任何合适的方法向对象提供根据本 发明的预定组合物。
根据本发明的药物组合物的优选剂量可以根据患者的状况和体重、疾 病严重程度、剂型以及施用途径和时间由本领域技术人员适当地选择。为 了实现期望效果，本发明的组合物可以以0.001mg/kg至1000mg/kg的剂 量每日施用。组合物可以以每日单剂量或以每日多剂量施用。在任何上下 文中，剂量都不应被解释为限制本发明的范围。
根据本发明的药物组合物可以通过多种途径施用。所有的施用方法都 可以使用，例如经口、经直肠或通过静脉内、肌内、皮下、子宫内、硬膜 内或脑室内注射。
另外，本发明提供了用于预防或减轻中枢神经系统疾病的食品组合 物，其包含所述融合产物作为活性成分。
当根据本发明的组合物用作食品添加剂时，其可以被单独添加或可以 与其他食品或食品成分组合使用，并且可以根据常规方法适当地使用。活 性成分的添加量可以根据使用目的(预防性、健康或治疗性治疗)适当地 确定。当根据本发明的组合物用于食品或饮料的制备时，基于食品或饮料 的总重量，其通常以15wt％或更少、优选10wt％或更少的量添加。然而， 当出于健康、卫生或健康控制的目的而期望延长摄入时，活性成分的量可 以低于以上限定的范围的下限。此外，活性成分可以以高于上述范围的上 限的量使用，因为其不会在安全性方面造成问题。
除上述成分之外，根据本发明的组合物还可以包含多种营养物、维生 素、电解质、矫味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保 护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、杀菌剂、甘油、醇和用于碳酸饮 料的碳酸化剂。此外，根据本发明的组合物可以包含用于生产天然果汁、 果汁饮料和植物饮料的果肉。该成分可以单独使用或组合使用。该添加剂 的比例并不非常重要，但相对于根据本发明的组合物的100重量份，通常 确定为0.01至0.1重量份。
本发明的另一个方面涉及通过向对象施用药物组合物来在动物中预 防或治疗中枢神经系统疾病的方法，所述动物不包括人。
药物组合物可以通过例如以下途径体内或体外注射：静脉内、腹膜内、 肌内、皮下、皮内、经鼻、经黏膜、吸入或经口途径。转移模式的应用可 被充分扩展到向培养物细胞的转移以及一般性体内转移，即，向动物细胞 和动物组织以及动物的转移。
对于质粒大小没有限制，因为药物组合物是非免疫原性且非感染性的 并且DNA没有包装在载体生物体如逆转录病毒或腺病毒载体生物体中。 因此，药物组合物也可用于具有实际尺寸的任何重组基因表达结构。
在下文中，参考实施例将更详细地描述本发明。然而，包括以下实施 例的公开内容不应被理解为限制或限定本发明的范围和内容。此外，很明 显，本领域技术人员可以容易地实施并未具体表明实验结果的本发明，只 要基于包括以下实施例的公开内容即可，并且这些改变方案和修改方案落 入权利要求书的范围内。
具体实施方式
<测试方法>
1)细胞系和细胞培养
Jurka T细胞(人白血病细胞)购买自美国典型培养物保藏中心 (American TypeCulture Collection，ATCC)并且储存于补充有10％胎牛 血清(FBS)和1％青霉素/链霉素抗生素的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640培养基中。HeLa细胞(人宫颈癌细胞)购买自ATCC并且 培养于补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素抗生素的含有 GlutaMAX的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。所有的细胞都 于37℃下储存在5％二氧化碳培养箱中。上述试剂购买自Thermo Scientific HyClone。
2)小鼠
6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠购买自Orient Bio(Daejeon，Korea)。 将小鼠饲养和放置于汉阳大学的特定无菌设施中，并在预定温度(21℃ ±1℃)和湿度(50％±5％)以及12小时亮/暗周期的恒定条件下定期喂食 物和无菌水。本发明中使用的所有动物方案均经汉阳大学的实验动物管理 和使用委员会批准。
3)体外转移效率
将Jurkat T细胞以5.0×105个细胞/孔的密度在24孔板的RPMI 1640 培养基中进行培养。在接种细胞之后，在指定时间添加相应的蛋白质。在 培养后，收集细胞，并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤三次。利用荧光激活 细胞分选(FACS)Canto II流式细胞仪(BDBioscience)分析细胞内荧光 并利用FlowJo软件(Tree Star，INC.)分析数据。将分离自6周龄C57BL/6 小鼠的脾加样于包含3ml PBS的60×15mm细胞培养皿上。利用具有尺寸 为0.45μm的孔的细胞过滤器物理制备单细胞悬液，向其中添加10ml新 鲜PBS，并离心所得混合物。
将红细胞溶解在ACK缓冲溶液(0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、1mM EDTA-2Na，pH 7.2)中。在每个孔上接种1.0×106个脾细胞后，研究根据 本发明的蛋白质的转移效率。用抗小鼠CD4-PerCP-Cy5.5和抗小鼠 CD19-PE-Cy7或抗小鼠F4/80PerCP-Cy5.5、抗小鼠MHCII-PE、抗小鼠 CD11b-PE-Cy7和抗小鼠CD11c-APC FACS抗体对细胞进行染色，以将细 胞分成不同的类型。抗体购买自eBioscience Ltd.。
4)体外毒性分析
使用基于水性四唑-8的细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Dojindo)测量细 胞的生存力。在96孔板上接种总共5.0×103个HeLa细胞并用不同浓度的 10μM、30μM、50μM或100μMctCTLA-4蛋白或PBS处理24小时。在 培养后，用PBS洗涤细胞并在CCK-8溶液中进一步培养2小时。随后， 使用450nm读板器(Bio-rad)分析光密度。
5)人PBMC的分离和相应ctCTLA-4蛋白的体外转移效率
与本实验相关描述的方案是由汉阳大学的机构评审委员会(IRB)批 准的。从健康供体获得人血液样品，并使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)通过密度梯度离心分离血液淋巴细胞。将分离的淋巴细胞以 1.0×106个细胞/孔接种并分析相应ctCTLA-4蛋白的转移效率。还用抗人 CD4-PE-Cy7、抗人CD19-APC、抗人CD11b-PE-Cy7或抗人CD11c-APCFACS抗体对细胞进行染色，所有所述抗体均购买自eBioscience Ltd.。
6)原代CD4+T细胞的生物成像
对6周龄的C57BL/6小鼠实施安乐死，并使用CD4+T细胞阴性选择 试剂盒(StemCell Technologies，INC)从脾中分离CD4+T细胞和淋巴结。 将在RPMI培养基中的分离的CD4+T细胞接种于装备在Chamlide室中经 抗CD44抗体包被的玻璃盖玻片上。然后，将蛋白质溶液加入室中并启动 延时成像。以5分钟的间隔记录DIC和GFP图像2小时。利用MetaMorph 或Image J软件1.48v分析得到的延时图像。
7)根据本发明的蛋白质的转移机理
在不同的温度(4℃、25℃或37℃)下在相应ctCTLA-4蛋白的存在 下培养分离的脾细胞1小时。将脾细胞或HeLa细胞用肝素(0、10μg/ml、 20μg/ml或50μg/m1)、甲基-β-环糊精(0、3mM或5mM)、氯丙嗪(0、 10μM或30μM)或阿米洛利(0、1mM、2mM或5mM)在37℃下预 处理30分钟，然后用相应的ctCTLA-4蛋白处理，并且再与相应的 ctCTLA-4蛋白一起在37℃下培养1小时。将所有的细胞都用胰蛋白酶 (Thermo Scientific HyClone)处理并用FACS缓冲溶液(包含10％FBS、 5％叠氮化钠和1％EDTA的PBS)洗涤。肝素、MβCD、氯丙嗪和阿米洛 利均购买自Sigma-Aldrich Inc.。
8)利用多光子显微镜的生物成像
对于脑的体内多光子成像，对雄性C57BL/6小鼠(23g至25g)进 行手术操作以向颅引入观察窗。通过吸入异氟烷对动物进行麻醉并使用由 直肠探针控制的恒温加热垫系统使其保持体温(37℃至38℃)。将异氟烷 水平设为3％以诱导麻醉并且在颅窗手术或多光子成像期间维持在1.5％。 为了检查动物的生理健康，在整个过程中对动物进行详细监测。所有的手 术过程都得到成均馆大学的实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。 将动物固定在立体定位框架(David Kopf Instruments，Tujunga，CA)上， 并在右半球上产生直径为3mm的圆形颅窗，其基于+2.5mm的ML和-1.5 mm的AP。在开颅术后，将具有5mm观察孔的定制室板(Narishige Inc.， Tokyo，Japan)放置在打开的开颅术部位上并用牙质树脂固定。然后，向 开颅术窗填充无菌人工脑脊髓液(125mM NaCl、2.5mM KCl、25mM NaHCO3、1.25mMNaH2PO4、2mM CaCl2、1mM MgSO4、10mM葡萄糖， pH 7.4)并用7mm盖玻片覆盖。将开颅术窗用氰基丙烯酸类黏合剂密封 并且为了使用多光子显微镜(TCS SP8 MP，Leica MicrosystemsCMS GmbH)进行观察，将动物装在头部固定装置(MAG-1，Narishige INC.) 上。在此，使用900nm钛：蓝宝石激光器(Chameleon Vision II，Coherent INC.)进行成像，并在混合型检测器(HyD)上通过585/40带通滤波器立 方体检测发射的荧光信号。为了追踪载体肽向脑组织的转移，通过尾静脉 注射量为2.5mg/动物的载体肽，然后以20分钟为间隔获取3D z-堆叠图 像2小时。成像脑的尺寸为354.29×354.29μm2(1024×1024像素)，其使 用25×水浸物镜(N.A.0.95)获得。成像深度为距离脑表面约450至500μm， 并且分辨率为1μm。在成像后，利用LAS AF 3.2.0(Leica Microsystems CMS GmbH)和Imaris 7.7.2(Bitplane)软件对相应的图像进行分析。
9)免疫组织化学测定
将5mg的每种ctCTLA-4蛋白腹膜内注射到6周龄的C57BL/6小鼠 中以分析dNP2-dTomato的系统性转移效率。在注射后2小时，对小鼠实 施安乐死。然后，收集组织，用PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定。使用 O.C.T.化合物(WAKO Chemical)对所有收集的组织进行冷冻。使用低 温恒温器(Thermo Scientific)将冷冻块切成厚度为6μm的切片，并通过 荧光显微术(Leica Microsystems)进行检查。为了分析EAE诱导的小鼠 中的脑和脊髓组织，将2.5mg的每种ctCTLA-4蛋白静脉内注射到小鼠中， 并且在1小时后，对动物实施安乐死，并随后经心脏灌注15ml PBS，然 后灌注15ml 4％多聚甲醛。移出脑组织并用PBS洗涤。然后，在室温下 用4％多聚甲醛对组织进行1小时的后固定，并在4℃的低温下在30％蔗 糖中保护24小时。使用O.C.T.化合物(WAKO Chemical)对脑组织进行 冷冻。使用低温恒温器(Thermo Scientific，Logan，UT)将冷冻块切成厚度 为40μm的切片。将切片在-20℃下在冷丙酮中培养30分钟并在室温下用 PBS洗涤30分钟。将洗涤的样品在透化缓冲溶液(PBS中0.5％Triton X-100)中培养10分钟，然后在封闭缓冲溶液(3％BSA、0.1％Tween-20) 中培养20分钟。使用抗小鼠CD4-FITC(eBioscience)、抗小鼠GFAP (Millipore)、抗小鼠Iba-1(WAKO chemical)或抗小鼠NeuN(Abcam) 进行一抗染色过夜。在抗体结合后，使用Hoechst33342染料(Invitrogen) 或DAPI(Vector Laboratory)对细胞核进行染色。将所有的切片样品使用 共聚焦显微镜(TCS SP8，Leica Microsystems CMS GmbH)进行分析。
10)EAE透导
7周龄雌性C57BL/6小鼠购买自DBL。本文所述方案经汉阳大学的 实验动物管理和使用委员会批准。通过用弗氏佐剂乳剂(弗氏不完全佐剂 和4mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，BD Difco)中的 100μg MOG35-55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)进行皮下免疫接种来 诱导EAE。皮下注射的乳剂的总体积为200ul。在免疫接种后0小时和 48小时，用200ng百日咳毒素(List BiologicalLaboratories INC.)对小鼠 进行腹内处理。每天对动物的临床疾病症状进行评分。腹内注射一定剂量 在100μl PBS中稀释的每种ctCTLA-4蛋白或仅新鲜PBS。在测试结束时， 对小鼠实施安乐死，并通过Percoll密度梯度离心(GE Healthcare)来分 离中枢神经系统的淋巴细胞。将分离的淋巴细胞的表面用抗小鼠CD4 PerCP-Cy5.5抗体(eBioscience)进行染色。此外，使用固定/透化浓缩和 稀释试剂盒(eBioscience)，用抗小鼠IFN-γ-FITC和IL-17A-APC抗体 (eBioscience)对淋巴细胞进行染色。使用FACSCanto流式细胞仪和 FlowJo软件对细胞进行分析。对于组织学分析，将脊髓组织的石蜡块脱石 蜡并浸入勒克司坚牢蓝中。对于混合染色，使用苏木精-伊红(Dako)。使 用Image J软件1.48v对存在于脊髓组织白色区域中的侵入性细胞进行计 数。
12)体内毒性分析
将PBS和5mg/kg的每种ctCTLA-4蛋白各自每隔一天重复注射到三 组C57BL/6小鼠中，持续14天。每天监测小鼠的体重变化。15天后，处 死小鼠，并仔细观察脾、肝和脑的形态。使用膜联蛋白V和7-AAD染色 试剂盒(BD bioscience)分析各蛋白质对脾细胞和胸腺细胞的细胞毒性。 在用抗小鼠CD4-PerCP-Cy5.5抗体、抗小鼠CD62L-FITC抗体和抗小鼠CD44-PE FACS抗体(eBioscience)染色之后，由已从相应组织分离的淋 巴细胞来分析淋巴结和脾中天然CD4 T细胞的百分比。使用丙氨酸转氨酶 (ALT)活性测定试剂盒(BioVision)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性测 定试剂盒(BioVision)来分析蛋白质的肝毒性。
13)统计学
使用双尾学生t检验分析数据。p＜0.05被认为是显著的。
<制备例1>肽、其片段和融合肽的合成/分离纯化
合成了具有由序列ID No.1至7所示的氨基酸序列的肽。
在此，指定以下：具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的肽(下文 中也被称为“ctCTLA-4”)、具有由序列ID No.2所示的氨基酸序列的肽片 段(下文中也被称为“ctCTLA-4-fm1”)、具有由序列ID No.3所示的氨基 酸序列的肽片段(下文中也被称为“ctCTLA-4-fm2”)、具有由序列ID No.4 所示的氨基酸序列的融合肽(下文中也被称为“ctCTLA-4-fm3”)、具有由 序列ID No.5所示的氨基酸序列的细胞渗透肽(下文中也被称为“dNP2”)、和具有由序列ID No.6所示的氨基酸序列的细胞渗透肽(下文中也称为 “Hph-1”)、和具有由序列ID No.7所示的氨基酸序列的细胞渗透肽(下文 中也称为“TAT”)。
分别合成适于所述氨基酸序列的有义和反义寡脱氧核苷酸，然后使其 在95℃下静置3分钟以除去所得二级或三级结构(变性)，并在50℃和随 后72℃的不同温度下产生DNA双链。为了插入到pRSET-b载体中，除有 义和反义寡脱氧核苷酸之外，还将对限制性酶具有特异性的序列引入5’ 和3’中。然后，使序列在埃希氏菌属(Escherichia)中大量扩增。然后， 鉴定序列的完整性，并将序列转移到埃希氏菌属中以诱导表达。纯化由各 个菌株表达的各种肽。
<制备例2>肽变体的合成/分离纯化
通过在序列ID No.1中用F替换图1A所示“1Y”和“2Y”的Y氨基酸残 基来获得肽变体。
具体地，通过用F替换由“1Y”表示部分的Y氨基酸残基来获得肽变 体，其由“1YF”表示；通过用F替换由“2Y”表示部分的Y氨基酸残基来获 得肽变体，其由“2YF”表示；并且通过用F替换“1Y”和“2Y”部分二者的Y 氨基酸残基来获得肽变体，其由“DYF”表示。
以与制备例1中相同的方式合成和分离纯化肽变体，不同之处在于使 用的氨基酸序列。
<制备例3>融合产物(dNP2-ctCTLA-4、Hph-1-ctCTLA-4、TAT-ctCTLA-4)的制备
为了使制备例1中制备的具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的肽 与细胞渗透肽融合，制备用于将由序列ID No.5、序列ID No.6或序列ID No.7所示的细胞渗透肽连接至ctCTLA-4肽N端的引物，以通过PCR反 应制备dNP2-ctCTLA-4、Hph-1-ctCTLA-4或TAT-ctCTLA-4基因，将这些 基因注入载体(pRSET-b)中以在埃希氏菌属菌株中表达蛋白质，纯化蛋 白质，并进行测试以确定蛋白质向细胞中的转移效率。以下将描述详细过 程。
1)编码基因的制备
将用于编码具有由序列ID No.5、序列ID No.6或序列ID No.7所示 的氨基酸序列的细胞渗透肽的DNA碱基序列添加至用于编码制备例1中 获得的具有由序列ID No.1所示的氨基酸序列的肽之N端部分的DNA碱 基序列以制备正向引物。相应的引物、序列ID号和限制性酶识别位点在 表1中简要地示出。
用由序列ID No.18至21所示的引物使用包含用于编码肽序列ID No. 1的基因的pRSETb载体作为模板进行PCR反应。
使用PCR反应器(Biorad)进行30个循环，并且每个循环包括：在 95℃下进行初始热变性反应3分钟，在95℃下进行模板的热变性反应20 秒，在50℃下进行用于将引物连接至模板的聚合反应20秒，并在72℃下 进行延伸反应30秒。
表1
Figure GDA0003215332300000181
同时，在正向引物中，由于dNP2的序列 (KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK)非常长，因此dNP2-ctCTLA-4被分成 两部分用于PCR反应。
2)重组表达载体的制备
为了表达dNP2-ctCTLA-4、Hph-1-ctCTLA-4或TAT-ctCTLA-4融合产 物，将在制备例3的1)中产生的基因(DNA)片段用限制性酶进行切割， 然后使用连接酶插入到蛋白质表达载体pRSETb中。
使用NheI和HindIII(NEB)对制备例3的1)中扩增的DNA片段进 行酶反应，以使得DNA的5’/3’端变成黏性末端。同时，使用两种相同的 限制性酶对pRSETb进行酶反应以产生具有NheI和HindIII插入位点的线 性pRSETb载体。在各个酶反应之后，使用PCR纯化试剂盒(Cosmogenetech Co.，Ltd.)进行分离。
在25℃下使用T4连接酶(NEB)通过酶反应使分离的 dNP2-ctCTLA-4、Hph-1-ctCTLA-4或TAT-ctCTLA-4融合产物双链DNA 片段与pRSET-b载体连接2小时。
将由此其中插入有dNP2-ctCTLA-4、Hph-1-ctCTLA-4或 TAT-ctCTLA-4的连接环状pRSETb载体转化到DH5α埃希氏菌属菌株中， 并在包含50μg/ml氨苄西林作为抗生素的LB平板培养基中培养以针对形 成菌落选择转化的埃希氏菌属。将选择的埃希氏菌属菌落再次在包含50 μg/ml氨苄西林的液体培养基(LB)中培养，然后使用质粒微型制备试剂 盒(Cosmogenetech Co.，Ltd.)分离质粒载体。
为了鉴定通过该过程分离的质粒载体是其中插入有dNP2-ctCTLA-4、 Hph-1-ctCTLA-4或TAT-ctCTLA-4的pRSETb载体，首先使用NheI和 HindIII限制性酶进行酶反应，然后最后进行DNA碱基序列分析(仿生学)。
3)蛋白质的分离和纯化
将制备例3的2)中制备的其中插入有dNP2-ctCTLA-4、 Hph-1-ctCTLA-4、TAT-ctCTLA-4或dNP2-ctCTLA-4-fm3的pRSETb载体 转化到埃希氏菌属BL21(DE3)Star pLysS菌株中，将在包含34μg/ml 氯霉素和50μg/ml氨苄西林作为抗生素的LB平板培养基中产生的菌落接 种到50ml液体LB培养基中，并在37℃下培养10小时，将所得培养物 溶液接种到500mL的新鲜LB液体培养基中。培养溶液，直至当在相同 温度下测量培养物溶液时埃希氏菌属的量对应于0.5的O.D.，以1mM的 浓度添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，并在温度为20℃且 恒定转速为150rpm的摇动培养箱中进一步培养14小时。埃希氏菌属菌株表达的蛋白质在其前侧包含在pRSET-b载体中编码的6X-His标签。通 过以下测试方法使用该标签来纯化蛋白质。
通过离心收集培养物溶液，然后重悬于天然裂解溶液(0.5M NaCl、 5mM咪唑、20mMTris-HCl，pH8.0)中。为了破坏埃希氏菌属细胞壁和 细胞膜，将裂解溶液中的悬液静置10分钟。此外，使用超声细胞破碎仪 VCX-130(Sonics&Materials)破坏细胞并离心以分离上清液。使用0.45μm 过滤器(Advantec)将分离的上清液过滤一次，然后在室温下与Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)结合1小时。然后，使用组氨酸柱(His柱，Biorad) 仅使Ni-NTA琼脂糖结合的蛋白质产物结合到柱。将该柱用20mM和250 mM咪唑溶液洗涤，最后使用3M咪唑溶液洗脱。将洗脱的蛋白质产物施 加到PD-10脱盐柱(Amersham Bioscience)以最终单纯分离并纯化dNP2-ctCTLA-4、Hph-1-ctCTLA-4或TAT-ctCTLA-4融合产物。将经纯化 蛋白质的一部分通过12％SDS-PAGE鉴定，并示于图2中。
<制备例4>dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物的制备
包含制备例1中制备的具有由序列ID No.4所示的氨基酸序列之融合 肽(下文中，也被称为“ctCTLA-4-fm3”)和具有由序列ID No.5所示的氨 基酸序列之细胞渗透肽(dNP2)的融合产物(下文中，也被称为 “dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物”)由Cosmogenetech Co.，Ltd.合成。
<制备例5>对照组(dNP2-EGFP)的合成和分离纯化
为了使制备例1中制备的具有由序列ID No.5所示的氨基酸序列的细 胞渗透肽与绿色荧光蛋白(EGFP)融合，制备用于使EGFP结合至dNP2 的N端的引物，通过PCR反应制备dNP2-EGFP基因并将其插入到载体 (pRSET-b)中，在埃希氏菌属菌株中表达蛋白质并进行纯化。除引物不 同，整体过程与制备例3中相同。使用的引物如下。
[序列ID No.22]第一正向引物
Figure GDA0003215332300000201
[序列ID No.23]第二正向引物
Figure GDA0003215332300000202
<制备例6>对照组(dNP2-TAMRA)的合成
为了制备制备例1中制备的具有由序列ID No.5所示的氨基酸序列的 细胞渗透肽与荧光标记化合物TARMA的融合产物，使用由 Cosmogenetech Co.，Ltd.合成的物质。
<测试例1>
1)ctCTLA-4肽以及dNP2-ctCTLA-4和Hph-1-ctCTLA-4融合产物向小鼠脾细胞(免 疫细胞)中的转移效率
在制备例1中纯化的ctCTLA-4肽与制备例3中纯化的 dNP2-ctCTLA-4和Hph-1-ctCTLA-4融合产物之间比较细胞内引入效率。
具体地，使用测试方法中的“3)体外转移效率”来测量转移效率，其将 在以下简要描述。
将小鼠脾细胞与1μM的ctCTLA-4肽、或者dNP2-ctCTLA-4或 Hph-1-ctCTLA-4融合产物一起培养1小时，并用抗HA抗体染色已转移 至细胞中的ctCTLA-4肽或CPP-连接的ctCTLA-4融合产物。用PE缀合 的抗兔IgG抗体放大信号。收获细胞并使用流式细胞仪测量细胞内荧光以 测量原代小鼠CD4-T细胞中的ctCTLA-4蛋白引入效率。
图3是示出了ctCTLA-4肽以及dNP2-ctCTLA-4和Hph-1-ctCTLA-4 融合产物在原代小鼠CD4-T细胞中的细胞内转移效率的图。
如图3所示，即使未与细胞渗透肽(下文中，也被称为“CPP”)连接， 1μM的ctCTLA-4肽也表现出优异的细胞内转移效率。
可以看出，当CPP与ctCTLA-4肽连接时，(dNP2-ctCTLA-4或 Hph-1-ctCTLA-4融合产物)的细胞内转移效率进一步提高，优选地， dNP2-ctCTLA-4融合产物表现出最高的细胞内转移效率。具体地，与 Hph-1-ctCTLA-4融合产物和ctCTLA-4肽相比，dNP2-ctCTLA-4融合产物 表现出高约至少10倍的细胞内转移效率。
通过该测试，从其中CPP与ctCTLA-4融合的融合产物中筛选出具有 最优异转移效率的dNP2-ctCTLA-4融合产物，并且在以下测试中，基于 使用dNP2(其为代表性的常规CPP)制备的dNP2-ctCTLA-4融合产物进 行比较和分析。
<测试例2>
1)根据CPP类型评价CPP-ctCTLA-4融合产物的IL-2表达抑制能力
用PBS、dNP2-ctCTLA-4融合产物和TAT-ctCTLA-4融合产物各1μM 处理被抗CD3和抗CD28抗体活化的脾细胞，通过ELISA测量IL-2表达 抑制效率，并示于图17中。
首先，在37℃下用抗CD3(抗小鼠CD3)和抗CD28(抗小鼠CD28) 单克隆抗体以0.1μg/孔的浓度包被96孔板5小时，从7周龄C57BL/6中 分离脾细胞，并将分离的脾细胞悬浮成单细胞。将通过该过程悬浮的脾细 胞以2.5×105接种在经抗CD3(抗小鼠CD3)和抗28(抗小鼠CD28) 单克隆抗体包被的每个孔上，并用1μM PBS、dNP2-ctCTLA-4融合产物 和TAT-ctCTLA-4融合产物进行处理，然后活化24小时。
图4是示出了1μM PBS、dNP2-ctCTLA-4融合产物和TAT-ctCTLA-4 融合产物的IL-2表达抑制效率的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表 p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验。
如从图4中可以看出，与进行PBS处理的对应物相比，通过与常规 细胞渗透肽(TAT、dNP2、Hph-1)连接，根据本发明的ctCTLA-4蛋白 表现出40％至70％的IL-2表达降低。
可以看出，其中，dNP2-ctCTLA-4融合产物表现出70％的最佳降低效 果(具体地，比TAT-ctCTLA-4融合产物高至少两倍的效果)。
2)ctCTLA-4的IL-2表达抑制能力的评价
在制备例3中纯化的dNP2-ctCTLA-4融合产物与制备例5中纯化的 dNP2-EGFP融合产物(对照组)之间比较IL-2表达抑制能力。
将被抗CD3和抗CD28抗体活化的脾细胞各自用dNP2-ctCTLA-4融 合产物和dNP2-EGFP融合产物处理，通过ELISA测量IL-2表达抑制效率， 并示于图5A中。在此，根据制造商提供的标准方案，使用由Biolegend Corporation生产的试剂盒进行ELISA。
此外，用dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-EGFP融合产物处理被 PMA/离子霉素活化的脾细胞，通过ELISA测量IL-2表达抑制效率，并示 于图5B中。
在此，在1μM PBS、dNP2-ctCTLA-4融合产物或dNP2-EGFP融合产 物的存在下用抗CD3/CD28抗体或PMA/离子霉素将活化的脾细胞活化24 小时。
图5A和5B是示出了dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-EGFP融合 产物的IL-2表达抑制效率的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05， **代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验。
如从图5可以看出，dNP2-ctCTLA-4融合产物抑制IL-2表达，而 dNP2-EGFP融合产物不能抑制IL-2表达。
此外，根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物对通过PMA和离子霉 素的刺激而活化的脾细胞没有任何效果，这证明dNP2-ctCTLA-4融合产 物的靶标是邻近TcR信号分子。即，根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合 产物具有特异性靶标指向性。
此外，IL-2表达抑制效果是由于ctCTLA-4，而不是dNP2。
3)ctCTLA-4的IFN-γ和IL-17A表达抑制能力的评价
在制备例3中纯化的dNP2-ctCTLA-4融合产物与制备例5中纯化的 dNP2-EGFP融合产物(对照组)之间比较IFN-γ和IL-17A表达抑制能力。
将被抗CD3和抗CD28抗体活化的脾细胞各自用dNP2-ctCTLA-4融 合产物和dNP2-EGFP融合产物处理，通过ELISA测量IFN-γ和IL-17A 表达抑制能力，并示于图6中。
图6A是示出了dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-EGFP融合产物的 IFN-γ表达抑制效率的图，并且图6B是示出了dNP2-ctCTLA-4融合产物 和dNP2-EGFP融合产物的IL-17A表达抑制效率的图。数值代表平均值 ±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检 验。
如从图6可以看出，dNP2-ctCTLA-4融合产物显著降低活化的脾细胞 中表达的干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-17A(IL-17A)的水平。具体地，与 dNP2-EGFP融合产物相比，根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物具有 至少3倍低的表达水平。
<测试例3>
1)ctCTLA-4在多发性硬化小鼠模型(EAE诱导的动物模型)中的预防效果
为了分析ctCTLA-4在多发性硬化小鼠模型中的抑制效果，本发明采 用了经MOG35-55肽免疫接种并经百日咳毒素处理的C57BL/6小鼠作为标 准EAE模型。
在此，如上所述，在7周龄C57BL/6小鼠中诱导EAE。在MOG免 疫接种后7天，通过腹内注射用PBS、25μg dNP2-ctCTLA-4融合产物或 dNP2-EGFP融合产物处理小鼠，然后每隔一天处理(预防方案，n＝15)。 在小鼠中诱导EAE之后，每天观察小鼠并且EAE临床症状的评分示于图 7中。
图7是示出了测试例3的1)的测试结果的图，并且该图示出了各组中 作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验。
基于表2所示的等级通过评分来评价EAE临床症状。
表2
评分 描述
0 正常行为：无神经症状
0.5 瘫痪，不能卷尾
1 不能移动尾巴
2 跛行：行走时后腿不稳定
2.5 一条后腿完全瘫痪
3 两条后腿完全瘫痪：难以用后腿站立，但仍然可以移动其余的腿
3.5 甚至前腿也不能正常移动
4 小鼠的所有腿都瘫痪且不能移动，并且小鼠变瘦和憔悴
5 死亡
如从图7中可以看出，与经dNP2-EGFP融合产物或PBS处理的小鼠 的临床评分相比，经dNP2-ctCTLA-4融合产物处理的小鼠的临床评分保 持较低，而不是显著增大。
在另一方面，经dNP2-EGFP融合产物或PBS处理的小鼠在9天时开 始表现出临床症状，然后其状况非常迅速地恶化，即，所有的后腿都瘫痪 或在严重情况下，所有肢体都瘫痪。然而，经dNP2-ctCTLA-4融合产物 处理的小鼠在11天时开始表现出临床症状，然后其状况非常缓慢地恶化， 并且即使在最严重的情况下，也只有尾部瘫痪。这些结果表明，根据本发 明的dNP2-ctCTLA-4融合产物在预防中枢神经系统疾病特别是多发性硬 化方面高度有效。
2)CPP-ctCTLA-4融合产物根据CPP类型在多发性硬化小鼠模型(EAE诱导的动物模 型)中的预防效果
为了分析ctCTLA-4融合产物根据CPP类型在多发性硬化小鼠模型中 的抑制效果，本发明采用了经MOG35-55肽免疫接种并经百日咳毒素处理的 C57BL/6小鼠作为标准EAE模型。
在此，如上所述，在7周龄C57BL/6小鼠中诱导EAE。在MOG免 疫接种后7天，将小鼠各自通过腹内注射用PBS、25μg dNP2-ctCTLA-4 融合产物和Hph-1-ctCTLA-4融合产物进行处理，然后每隔一天进行相同 处理(预防方案，n＝15)。在小鼠中诱导EAE之后，每天观察小鼠并且 EAE临床症状的评分示于图8中。
图8是示出了测试例3的2)的测试结果的图，并且该图示出了各组中 作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验。
基于表2所示的等级通过评分来评价EAE临床症状。
如从图8中可以看出，与仅用PBS处理的小鼠相比，经 Hph-1-ctCTLA-4融合产物处理的小鼠在9天时开始表现出临床症状，这 稍晚一些并且更缓慢地恶化。即，Hph-1-ctCTLA-4融合产物也表现出优 异的渗透血脑屏障或血脊髓屏障的能力以及体内脑组织分割，并且具有显 著预防或缓解中枢神经系统疾病特别是多发性硬化的效果。
然而，经dNP2-ctCTLA-4融合产物处理的小鼠在11天时开始表现出 临床症状，然后其状况非常缓慢地恶化，并且即使在最严重的情况下，也 只有尾部瘫痪。这些结果表明，根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物 具有预防中枢神经系统疾病特别是多发性硬化的最佳效果。
3)ctCTLA-4根据剂量在多发性硬化小鼠模型(EAE诱导的动物模型)中的预防效果
为了分析ctCTLA-4根据ctCTLA-4剂量在多发性硬化小鼠模型中的 抑制效果，本发明采用了经MOG35-55肽免疫接种并经百日咳毒素处理的 C57BL/6小鼠作为标准EAE模型。
在此，如上所述，在7周龄C57BL/6小鼠中诱导EAE。在MOG免 疫接种后7天，将小鼠各自通过腹内注射用PBS、100μg dNP2-ctCTLA-4 融合产物和dNP2-EGFP融合产物进行处理，然后每隔一天进行相同处理 (预防方案，n＝15)。在小鼠中诱导EAE之后，每天观察小鼠并且EAE 临床症状的评分示于图9中。
图9是示出了测试例3的3)的测试结果的图，并且该图示出了各组中 作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验。
基于表2所示的等级通过评分来评价EAE临床症状。
如从图9中可以看出，与经dNP2-EGFP融合产物或PBS处理的小鼠 的临床评分相比，经dNP2-ctCTLA-4融合产物处理的小鼠的临床评分显 著更低。
即，可以看出，图9所示的结果非常类似于图7所示的那些，仅在于 剂量不同。这表明，融合产物的剂量对动物模型的临床评分没有大的影响。
4)ctCTLA-4在多发性硬化小鼠模型(EAE诱导的动物模型)中的治疗效果
将100μg dNP2-ctCTLA-4融合产物或dNP2-EGFP融合产物腹内注射 到其中发生疾病且平均临床评分为1的动物模型中，以确定治疗效果。
在本测试例中，使用经MOG35-55肽免疫接种且经百日咳毒素处理的 C57BL/6小鼠作为标准EAE模型。如上所述，在7周龄C57BL/6小鼠中 诱导EAE。在MOG免疫接种之后，使小鼠静置直至平均临床评分达到1 (在第10天)，并各自通过腹内注射用PBS、100μg dNP2-ctCTLA-4融合 产物和100μg dNP2-EGFP融合产物处理，然后隔一天在第12天再次进行 相同处理，然后每天处理(预防方案，第10天，n＝5)。在小鼠中诱导EAE 之后，每天观察小鼠并且EAE临床症状的评分示于图10中。
图10是示出了测试例3的4)的测试结果的图，并且该图示出了各组 中作为疾病诱导后天数(x轴)之函数的EAE动物模型的临床评分(y轴)。 数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表 p＜0.001；学生t检验。
基于表2所示的等级通过评分来评价EAE临床症状。
如从图10中可以看出，通过用dNP2-ctCTLA-4融合产物处理，症状 发展至临床评分为2.0的小鼠可以恢复至临床评分为1.0。
换言之，从根据本发明的数据可以得出以下结论：dNP2-ctCTLA-4融 合产物可以用作免疫调节蛋白，其能够体外和体内调节活化的T细胞反 应，以及调节中枢神经系统疾病，例如多发性硬化(需要渗透血脑屏障和 血脊髓屏障)。
在另一方面，用dNP2-EGFP融合产物进行处理导致维持临床评分或 使临床评分提高至2.5或更大(即，症状恶化)，而不是使临床评分降低。
5)ctCTLA-4在多发性硬化小鼠模型(EAE诱导的动物模型)的脱髓鞘和免疫细胞侵 入的抑制效果
图11是勒克司坚牢蓝(LFB)和苏木精-伊红(H&E)染色的图像， 其示出了根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-EGFP融合产物 在EAE诱导的动物模型中对脱髓鞘和免疫细胞侵入的作用。比例尺为100 μm。
图12是示出了根据在图11中测量的各处理组之脊髓组织的侵入性免 疫细胞的数目的图，其中该数目使用Image J软件1.48v进行计数。数值 代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001； 学生t检验。
如图11和12所示，在EAE动物模型中测试dNP2-ctCTLA-4融合产 物和dNP2-EGFP融合产物对脱髓鞘和免疫细胞侵入的抑制效果的结果发 现，与其他动物细胞中相比，经dNP2-ctCTLA-4融合产物处理的动物模 型表现出脱髓鞘和免疫细胞侵入降低。这表明，在经dNP2-ctCTLA-4融 合产物处理的动物模型中脊髓组织的炎症显著降低。
6)在多发性硬化小鼠模型(EAE诱导的动物模型)中ctCTLA-4的流式细胞术
图13示出了在经根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物和 dNP2-EGFP融合产物处理的EAE动物模型中分离脊髓细胞之后对IL-17A 和/或IFN-γ表达CD4 T细胞(Th1、Th17、Th2和Treg细胞(T细胞)) 进行流式细胞术的结果。
图14是示出了对图13结果的分析的图。在其中悬浮有来自脊髓的单 细胞的级分中对绝对细胞数进行计数。通过乘以该数目，测量CD4+细胞 (a)、IFNγ+CD4+细胞(b)、IL-17A+CD4+细胞(c)和IFNγ+IL-17A+CD4+ 细胞(d)的总比率，并且数据表示为柱形图(n＝15)。数值代表平均值±s.e.m， 并且*代表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验。
如图13和14所示，仅在用dNP2-ctCTLA-4融合产物进行处理时， 脊髓组织中侵入的IFN-γ和/或IL-17A产生CD4 T细胞的比例和数目显著 降低。
<测试例4>由序列ID No.2和3所示的片段肽和由序列ID No.4所示的融合肽的性 能评价
1)ctCTLA-4肽及其变体的IL-2表达抑制能力的评价
在制备例1中纯化的ctCTLA-4肽(在本测试例中由“WT”表示)与在 制备例2中纯化的1YF、2YF或DYF变体之间比较IL-2表达抑制能力。
将被抗CD3和抗CD28抗体活化的脾细胞各自用0.5μM、1μM、2μM 或5μM WT、1YF、2YF和DYF进行处理，通过ELISA测量IL-2表达抑 制能力，并示于图15中。
在此，在1μM PBS，0.5μM、1μM、2μM或5μM WT、1YF、2YF、 DYF的存在下，用抗CD3/CD28抗体将活化的脾细胞活化24小时。
图15是示出了0.5μM、1μM、2μM或5μM WT、1YF、2YF和DYF 的IL-2表达抑制效率的测量结果的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代 表p＜0.05，**代表p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验。
如从图15中可以看出，与WT相比，1YF、2YF和DYF表现出IL-2 表达抑制效率的显著降低。即，可以看出，根据本发明的ctCTTLA-4肽 中1Y和2Y所在的氨基酸片段对IL-2表达的抑制活性有很大贡献。
换言之，与本发明一样，包含1Y和2Y氨基酸残基的区域的ctCTLA-4 肽片段(序列ID No.2和3)也具有优异的IL-2表达抑制效果。
该测试鉴定了在ctCTLA-4中有活性的片段肽，并且使用通过融合 ctCTLA-4的片段肽产生的融合肽(序列ID No.4)来进行以下测试。
2)确定dNP2-TAMRA、dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物在小 鼠模型中对CD4 T细胞活化的抑制
进行本测试以检测根据本发明的dNP2-TAMRA、dNP2-ctCTLA-4融 合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物在小鼠模型中是否可以抑制CD4 T细胞活化。
在此，CD25是当T细胞被活化时表达水平提高的活化标志物，并且 基于表达的CD25的量来确定CD4 T细胞的活化是否被抑制。
具体地，测试方法如下。
在0.5％二氧化碳下在37℃下在细胞培养箱中用0.1μg抗CD3和抗 CD28抗体包被96孔板5小时。然后，以每孔2.5×105的密度接种小鼠 分离的脾细胞。将细胞用PBS或者0.1μM、0.5μM、1μM、2μM或5μM dNP2-TAMRA、dNP2-ctCTLA-4或dNP2-ctCTLA-4-Fm进行处理，然后在 0.5％二氧化碳下在37℃下在细胞培养箱中培养24小时。然后，将细胞用 APC荧光缀合的抗CD4 mAb和PE荧光融合的抗CD25 mAb在4℃下染 色20分钟。然后，通过流式细胞仪(FACS)分析通过上述过程产生的细 胞以比较表达的CD25的量。
图16是示出了经NA或PBS处理的原代小鼠CD4-T细胞(NA&PBS) 的引入效率的图，并且图17是示出了0.1μM、0.5μM、1μM、2μM或5 μM dNP2-TAMRA、dNP2-ctCTLA-4融合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3融合 产物在原代小鼠CD4-T细胞中的细胞内转移效率的图。
如本文所使用的“NA”意指未施加活化T细胞的刺激的阴性对照组， 并且本文使用的PBS意指施加抗CD3和抗CD28单克隆抗体的刺激以活 化T细胞的阳性对照组。
在图16中，NA用红色图表示，而PBS用蓝色图表示。在这种情况 下，对于PBS处理，CD3是T细胞受体并且CD28是共受体，靶向它们 的单克隆抗体用于向T细胞受体施加刺激。
即，如图16所示，经PBS处理的T细胞受体的图显示CD25表达极 大提高，而NA图显示由于没有施加刺激而维持CD25表达。
如从图17中可以看出，当以不同浓度进行dNP2-ctCTLA-4处理时， 与dNP2-ctCTLA-4的浓度成比例地抑制CD25表达，并且 dNP2-ctCTLA-4-fm3也表现出与此类似的效力。在另一方面， dNP2-TAMRA由于其没有类似于ctCTLA-4的活性而不能抑制CD25表 达。
此外，dNP2-CTLA-4融合产物可以表现出显著的效果，只要其以2μM 或更大的浓度使用即可，同时类似于dNP2-ctCTLA-4融合产物， dNP2-ctCTLA-4-fm融合产物即使是在0.1μM的浓度下也表现出优异的细 胞内转移效率。
3)其他种类ctCTLA-4蛋白的IL-2表达抑制能力的评价
将被抗CD3和抗CD28抗体活化的脾细胞各自用0.1μM、0.5μM、1 μM、2μM或5μMdNP2-TAMRA融合产物、dNP2-CTLA-4融合产物和 dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物进行处理，通过ELISA测量IL-2表达抑制 效率，并示于图18中。
在此，在1μM PBS，0.1μM、0.5μM、1μM、2μM或5μM dNP2-TAMRA融合产物、dNP2-CTLA-4融合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3 融合产物的存在下，用抗CD3/CD28抗体将活化的脾细胞活化24小时。
图18是示出了0.1μM、0.5μM、1μM、2μM或5μM dNP2-TAMRA 融合产物、dNP2-CTLA-4融合产物和dNP2-ctCTLA-4-fm3融合产物的IL-2 表达抑制效率的图。数值代表平均值±s.e.m，并且*代表p＜0.05，**代表 p＜0.01且***代表p＜0.001；学生t检验。
图18所示结果非常类似于图14所示的结果。具体地，dNP2-TAMRA 融合产物根本不能抑制IL-2表达。
此外，dNP2-CTLA-4融合产物也表现出对IL-2表达的抑制效果，但 该效果仅在2μM或更大的情况下显著。
最后，使用根据本发明的ctCTLA-4片段获得的dNP2-ctCTLA-4-fm 融合产物表现出优异的IL-2表达效果，与实施例2的dNP2-ctCTLA-4融 合蛋白相当。
<结论>
无论B7连接如何，根据本发明实施例1的ctCTLA-4肽都在转基因 NOD小鼠中表现出免疫调节功能。特别地，本发明发现，独立于B7， CTLA-4(ctCTLA-4)具有仅编码CTLA-4基因中外显子4的一部分的功 能。
在遗传上类似于ctCTLA-4的CTLA-4的另一种类似物蛋白1/4 CTLA-4已被常规地发现增强T细胞活化且促进自身免疫(Liu，S.M.等， Overexpression of the Ctla-4isoform lacking exons 2 and 3 causes autoimmunity.Journal of immunology 188，155-162， doi：10.4049/jimmuno1.1102042(2012)；Ichinose，K.等，Briefreport：increased expression of a short splice variant of CTLA-4exacerbates lupus inMRL/lpr mice.Arthritis and rheumatism 65，764-769，doi：10.1002/art.37790(2013))。 然而，1/4CTLA-4的选择性剪接诱导移码，这产生完全不同于ctCTLA-4 的氨基酸序列(Ichinose，K.等，Briefreport：increased expression of a short splice variantof CTLA-4 exacerbates lupus in MRL/lpr mice.Arthritis and rheumatism 65，764-769，doi：10.1002/art.37790(2013)；Ueda，H等， Association of the T-cellregulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease.Nature 423，506-511，doi：10.1038/nature01621(2003))。
此外，鉴定了其中根据本发明的ctCTLA-4蛋白与细胞渗透肽融合的 融合蛋白，其在自身免疫性脑脊髓炎模型中抑制T细胞活化并且表现出有 效的治疗效果。这表明，T细胞中CTLA-4胞质结构域的水平在其功能中 发挥重要作用。
可以看出，尽管dNP2-ctCTLA-4融合产物可以转移到巨嗜细胞
Figure GDA0003215332300000311
和树突细胞中，但在这些细胞中未观察到通过toll样受体 (TLR)配体刺激的炎性细胞因子产生的显著变化，而活化的CD4和CD8 T细胞成功地抑制了IL-2和IFN-γ的产生。
这意味着根据本发明的融合产物所具有的针对EAE的抑制机理不是 通过抑制先天免疫细胞而是通过抑制效应T细胞的功能来介导的。
此外，根据本发明的体内测试显示，即使在动物模型中尾部瘫痪之后， 当用dNP2-ctCTLA-4融合产物进行处理时，临床症状仍得到改善，这证 明根据本发明的融合产物具有有效的预防或治疗效果。
这意味着通过根据本发明的dNP2-ctCTLA-4融合产物抑制效应T细 胞功能可以调节疾病症状的进展或促进恢复而没有显著的体内毒性。
总之，本发明开发了新的有效ctCTLA-4肽以及其中ctCTLA-4肽与 细胞渗透肽的融合产物，并且证实了这些肽或其片段或融合产物可以转移 到脑和脊髓。
可以确定，基于使用根据本发明的ctCTLA-4肽以及其中ctCTLA-4 肽与细胞渗透肽连接的融合产物转移至CNS侵入性T细胞的技术的新治 疗方法可对控制多发性硬化是有效的，特别地，dNP2-ctCTLA-4融合产物 具有最佳的效力和稳定性。
工业实用性
由于高度有效地渗透过去不能显著渗透的中枢神经系统的血脑屏障 和血脊髓屏障的功能，根据本发明产生的肽尽管以低含量使用仍可以发挥 有效的治疗作用，由此适用于用来预防或治疗中枢神经系统疾病的多种物 质。
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation HanyangUniversity)
<120> 具有预防或治疗中枢神经系统疾病作用的肽和包含其作为活性成分的药物组合物
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<151> 2015-08-21
<160> 23
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ctCTLA-4的氨基酸序列
<400> 1
Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys
1 5 10 15
Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe
20 25 30
Ile Pro Ile Asn
35
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ctCTLA-4-fm1的氨基酸序列
<400> 2
Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ctCTLA-4-fm2的氨基酸序列
<400> 3
Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ctCTLA-4-fm3的氨基酸序列
<400> 4
Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
1 5 10 15
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dNP2的氨基酸序列
<400> 5
Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys
1 5 10 15
Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys
20
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hph-1的氨基酸序列
<400> 6
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT的氨基酸序列
<400> 7
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Transportan的氨基酸序列
<400> 8
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pep-1的氨基酸序列
<400> 9
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pVEC的氨基酸序列
<400> 10
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M918的氨基酸序列
<400> 11
Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP10的氨基酸序列
<400> 12
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 13
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VP22的氨基酸序列
<400> 13
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Glu
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Buforin2的氨基酸序列
<400> 14
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg
20
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KALA的氨基酸序列
<400> 15
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His
1 5 10 15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala
20 25 30
<210> 16
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL22的氨基酸序列
<400> 16
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Phe Leu Gly Phe Trp Arg Gly Glu
1 5 10 15
Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu
20 25 30
Lys Gly Lys
35
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 响尾蛇胺的氨基酸序列
<400> 17
Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly His Cys Phe Pro Lys Glu Lys
1 5 10 15
Ile Cys Leu Pro Pro Ser Ser Asp Phe Gly Lys Met Asp Cys Arg Trp
20 25 30
Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys Gly Ser Gly
35 40
<210> 18
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dNP2-ctCTLA-4的第一正向引物
<400> 18
aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aaggaattct acccatacga tgttccagat 60
tacgcta 67
<210> 19
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dNP2-ctCTLA-4的第二正向引物
<400> 19
gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccaagat taagaaagtc 60
aagaaga 67
<210> 20
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT-ctCTLA-4的正向引物
<400> 20
gctagctatg gacgcaagaa gcgccgccag cgccgccgcg gatcctaccc atacgatgtt 60
ccagattacg cta 73
<210> 21
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hph-1-ctCTLA-4的正向引物
<400> 21
tatgcgcgtg tgcgacgtcg tggcccacgt cgaggatcct acccatacga tgttccagat 60
tacgcta 67
<210> 22
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dNP2-ctCTLA-4的第一正向引物
<400> 22
aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aaggtgagca agggcgagga gctgttcacc 60
g 61
<210> 23
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dNP2-EGFP的第二正向引物
<400> 23
gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccaagat taagaaagtc 60
aagaaga 67

Claims (7)

1.对IL-2具有抑制活性的融合肽，其中所述融合肽由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成。
2.融合产物，其包含：
由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成的肽；和
细胞渗透肽，其包含选自以下的任一种：SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的HIV-1 tat（47-57）、SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的dNP2蛋白和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的Hph-1。
3.根据权利要求2所述的融合产物，其中所述细胞渗透肽是氨基酸序列由SEQ ID NO:5所示的dNP2蛋白。
4.重组表达载体，其包含编码根据权利要求2所述的融合产物的基因。
5.用于预防或治疗中枢神经系统疾病的药物组合物，其包含根据权利要求2所述的融合产物作为活性成分。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中在所述融合产物中的所述细胞渗透肽具有渗透血脑屏障或血脊髓屏障的活性。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述中枢神经系统疾病包括选自以下的任一种：脊髓损伤、卒中、脑梗死、脑缺血、阿尔茨海默病和多发性硬化。
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