CN106540242B - IL-1F7a的作用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白技术领域，本发明涉及白细胞介素IL‑1F7A亚类(IL‑F7a)的功能，即IL‑1F7a的活性部位及功能。具体公开了人IL‑1F7a N‑端蛋白、IL‑1F7a前体蛋白及成熟IL‑1F7a蛋白具有抑制炎症和治疗自身免疫性疾病的功能，且IL‑1F7a前体蛋白及成熟IL‑1F7a蛋白的抗炎功能明显优于IL‑1F7b亚类前体及成熟体蛋白。本发明还公开了重组IL‑1F7a前体及成熟体蛋白的制备方法。

Description

IL-1F7a的作用
技术领域
本发明涉及蛋白技术领域，具体涉及IL-1F7a的生物学特性、功能及其在疾病中的作用，尤其是人IL-1F7a N-端、人IL-1F7a前体及成熟人IL-1F7a蛋白在制备抑制炎症和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
背景技术
炎性疾病是机体对刺激(感染及非感染性)的应激反应，这种反应通常是生理性的、有益的，但如果反应失控(过高/低)，将导致病理性炎症反应和疾病的发生。炎症是最常见的患者就诊原因。临床表现是组织器官的红、肿、热、痛及机能障碍。虽然炎性疾病的诱生发展机理都不尽相同，且调控机制尚不完全清楚，但是，目前的研究表明，免疫细胞(先天和继发)功能失调和促炎性细胞因子的产生紊乱等，在炎性疾病的发生发展中起着重要的作用。因此，深入理解机体如何调控炎性免疫应答，特别是寻找到能够有效抑制炎性疾病发生发展的因子，将对炎性疾病的预防和治疗具有重大的临床意义。
IL-1F7(IL-37)是IL-1家族的新成员。IL-1F7基因编码6个外显子，经选择性剪接后共编码五种亚型前体蛋白(IL-1F7a-e，图1A)。这些亚型在蛋白序列、分子结构及在组织器官中的表达不尽相同。IL-1F7基因1-3号外显子分别编码五个不同的IL-1F7亚型前体蛋白的N末端，N末端含有不同的蛋白酶切割位点。4-6号外显子编码C末端IL-1F7亚类保守，此结构域与IL-1F7和其受体结合及信号通路激活有关。IL-1F7a、b和d含有完整的IL-1F7保守结构域，因此，推测它们具有细胞因子的生物学活性。而IL-1F7c和e缺乏细胞因子结构域上的前3个β片层。因此推测IL-1F7c和e(IL-37c和e)可能不具有细胞因子的生物学活性。
自2000年发现至今，关于IL-1F7的生物学功能研究仅限于IL-1F7b亚型。IL-1F7b是IL-1F7家族中分子量最大的一个成员，由IL-1F7基因中除3号外显子以外的所有外显子编码。研究表明IL-1F7b是免疫调节因子，可通过与其细胞受体SIGIRR/IL-18Ra结合并产生免疫调节信号来抑制炎症及自身免疫性疾病。然而，IL-1F7b对炎症及自身免疫性病的抑制作用并非很强。IL-1F7a是IL-1F7家族中唯一一个含有弹性蛋白酶(elastase)切割位点及核定位信号(Nuclear location sequence，NLS)的成员，弹性蛋白酶(elastase)切割位点及核定位信号是由3号外显子编码的。国际上关于IL-1F7a及其他亚型的生物学特性、功能及其在疾病中的作用尚不清楚。从结构组成来看，IL-1F7a和b可能是IL-1F7亚类中的主要活性分子(图1)。然而，两者N-端分子结构、理化特性(表1)及组织细胞的表达诱生均不同，故推测它们的功能可能不同。
表1 IL-1F7a和b氨基酸组成对比
专利号为US7585949的发明公布了IL-1zeta剪接异构体(IL-1F7 5种亚类)多肽的基因和蛋白序列。并公开了IL-1zeta异构体多肽增强IL-12从人单核细胞中的分泌。鉴于IL-12可促进Th1细胞介导的免疫反应及相关炎性疾病的发生，该发明建议IL-1zeta多肽抑制剂或拮抗剂可以用于治疗Th1细胞免疫应答异常引发的多种炎性疾病，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、胰岛素依赖型糖尿病和甲状腺炎。然而这些结果与目前对IL-1F7功能的认知相反，IL-1F7的临床应用设计可能是错误的。且上述专利并未涉及IL-1F7a亚型的生物学特征(核蛋白、核转移、成熟、细胞释放)及生物活性和炎症抑制功能及临床应用。
中国发明专利CN104083755A对白细胞介素-37(IL-37，也称IL-1F7)作为药物的活性成分及其制备保护。该发明具体公开了IL-37b(IL-1F7b)及其衍生物、变异体和/或截短多肽为活性成分，或者上述物质的编码核苷酸序列为活性成分。并公开了原核、真核细胞表达及纯化IL-1F7b的方法。也公开了IL-1F7b及其活性成分编码核苷酸序列克隆至各种表达载体进行基因治疗。还公开了上述活性成分在治疗自身免疫或慢性非感染性炎症疾病中的应用。该专利公开的IL-1F7活性成分实质是IL-1-F7b成熟蛋白，并未包括IL-1-F7b前体及IL-1F7a和其他IL-1F7亚类(异构体)。
由此可见，目前关于IL-1F7a亚型的生物学特性、结构与功能的关系及其在疾病中的作用尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了人IL-1F7a N-端蛋白、人IL-1F7a前体蛋白和/或成熟人IL-1F7a蛋白在制备抑制炎症的药物中的应用。
其中，按照本发明，所述人IL-1F7a N-端蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述人IL-1F7a前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述成熟人IL-1F7a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
按照本发明，所述炎症为感染性炎性疾病或非感染性炎性疾病。
其中，所述感染性炎症为细菌、病毒、霉菌和寄生虫感染引起的炎性疾病。
所述非感染性炎性疾病优选为自身免疫性疾病、过敏性疾病、老年病或肿瘤。
按照本发明，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、自发性节肠炎、自身免疫性肝炎或甲状腺机能亢进。
在一些实施方案中，所述药物包括人IL-1F7a N-端蛋白、人IL-1F7a前体蛋白和成熟人IL-1F7a蛋白中至少一种和药学上可接受的载体。
在另一些实施方案中，所述药物包括
(1)人IL-1F7a N-端蛋白、人IL-1F7a前体蛋白和成熟人IL-1F7a蛋白中至少一种；和
(2)其它抑制炎症的化合物和/或中药。
由上述技术方案可知，本发明涉及白细胞介素IL-1F7的一种亚类的功能，即IL-1F7a的活性部位及功能。具体公开了人IL-1F7a N-端蛋白、IL-1F7a前体蛋白及成熟IL-1F7a蛋白具有抑制炎症的功能，且我IL-1F7a前体蛋白及成熟IL-1F7a蛋白的抗炎功能明显优于IL-1F7b前体及成熟体蛋白。本发明还公开了重组IL-1F7a前体及成熟体蛋白的制备方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示IL-1F7基因、亚型蛋白编码和结构示意图，其中A为IL-1F7基因和编码的五种亚型蛋白；B为IL-1F7a和IL-1F7b蛋白的关键结构域；
图2示IL-1F7a和IL-1F7b亚类氨基酸序列比较；
图3示IL-1F7b成熟体氨基酸序列；
图4示IL-1F7a cDNA序列，其中A为IL-1F7a cDNA序列；B为NCBI BLAST比对本发明克隆的IL-1F7a cDNA与发表的序列，Query为本发明克隆的IL-1F7a cDNA，Sbjct为发表的序列；
图5示IL-1F7a氨基酸全序列，阴影标记部分为IL-1F7a的N-端，下划线部分为IL-1F7a成熟蛋白氨基酸序列；
图6示实施例2TLR配体诱导的IL-1F7a-e mRNA在人单核细胞中的表达图；
图7示不同IL-1F7a蛋白的亚细胞定位情况；
图8示IL-1F7a的释放方式检测结果图；
图9示IL-1F7a体外酶解图；
图10示IL-1F7a对其他亚类蛋白水平的影响图，分别敲低IL-1F7a及所有IL-1F7亚类，图A为qPCR检测IL-1F7a对其他亚类mRNA水平的影响，图B为ELSA检测IL-6产生情况；
图11示人IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠模型建立图，其中图A为IL-1F7a和IL-1F7b转基因载体示意图；图B分别为Western blot检测IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠血细胞中IL-1F7a和IL-1F7b蛋白的表达水平，其中WT为野生型小鼠，TG为转基因小鼠；图C为qPCR检测IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠肺、脾脏、脑中IL-1F7a和IL-1F7b的mRNA表达分布情况，“+”表示用IL-1F7a表达质粒DNA为PCR模板，作为阳性对照；“-”表示用不含IL-1F7a基因的质粒为PCR模板，作为阴性对照；图D为ELISA检测LPS刺激或不刺激的正常和转基因小鼠血清中IL-1F7a和IL-1F7b蛋白的表达水平图；
图12示重组人IL-1F7a和b全长蛋白的纯化和生物活性测定图；图A为原核表达IL-1F7a和IL-1F7b全长蛋白并进行Ni-HTA亲和层析和分子筛纯化去除LPS后的SDS-PAGE鉴定图；图B为小鼠单核细胞用LPS刺激，同时加不同剂量的全长rIL-1F7a或rIL-1F7b蛋白并分别培养24h后，收集细胞培养上清作ELISA检测重组IL-1F7a或IL-1F7b对促炎性细胞因子IL-6的产生的影响图；
图13示不同浓度梯度(0.08、0.12、50、100、150、200ng/ml)重组蛋白处理细胞24h后，ELISA检测培养上清中IL-6的产生情况图；其中图A为全长(FL)IL-1F7a、IL-1F7b重组蛋白、商品化的成熟IL-1F7b重组蛋白(novoprotein)；图B为成熟(m)IL-1F7a、IL-1F7b重组蛋白、商品化的成熟IL-1F7b重组蛋白(novoprotein)；
图14示体外分离小鼠树突状细胞，IL-1F7a和b处理后进行LPS刺激，随后利用CD40、CD80和MHCII抗体流式检测图；
图15示IL-1F7a对LPS诱导的致死性休克的影响图，其中图A为致死剂量LPS(40mg/kg)注射WT、IL-1F7a和IL-1F7b转基因杂合子小鼠，24h内小鼠死亡情况统计图；图B为ELISA检测图A实验小鼠血清中细胞因子IL-1β、TNF、IFN-γ、IL-6和IL-10的产生情况统计图；图C为致死剂量LPS(40mg/kg)注射WT小鼠5h后，PBS及不同浓度IL-1F7a和IL-1F7b重组蛋白(1、10mg/kg)注射小鼠，小鼠存活情况统计图；
图16示IL-1F7a抑制沙门氏菌感染的作用，图A为沙门氏菌感染小鼠后8天内，小鼠的生存状况统计图；图B为沙门氏菌感染第4天，检测并统计WT、IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠体内(肝脏、脾脏及肠系膜淋巴结)中的细菌数量统计图；
图17示IL-1F7a对抗胶原蛋白抗体诱导的关节炎及自身免疫性疾病相关细胞因子的产生的影响图；其中，图A为第0天以抗胶原蛋白抗体(Chondre，50μl/只)注射WT和IL-1F7a转基因小鼠，第1天，注射LPS(0.1μg/只)后每天临床观察结果图；图B为关节组织切片HE染色图；图C为关节组织RNA中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ、IL-17、TNFα和TGF-β1的表达水平统计图；
图18示SIGIRR中和抗体对IL-1F7a的抗炎功能的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在一个具体实施例中，本发明通过分别构建表达GFP标签融合的IL-1F7aN端(aa1-21，含有NLS)、成熟IL-1F7a(aa 22-192)以及全长IL-1F7a(aa 1-192)蛋白序列的过表达质粒并转染人肺癌上皮细胞A549及小鼠巨噬细胞系RAW264.7，待质粒表达后，通过荧光共聚焦检测IL-1F7a和IL-1F7b的亚细胞定位情况，结果显示人IL-1F7a N-端序列(aa 1-22，含有NLS序列)具有蛋白细胞核转移功能，并可介导全长人IL-1F7a核转移。与IL-1F7b相似，IL-1F7a成熟体蛋白也可以转移至细胞核。表明IL-1F7a是核蛋白并可能具有核内基因调控功能(图7)。
在一个具体实施例中，本发明用不同浓度的弹性蛋白酶和Caspase-1分别消化纯化的IL-1F7a全长重组蛋白，并同时设置弹性蛋白酶或Caspase-1抑制剂处理组，根据切割蛋白条带分子量确定IL-1F7a和IL-1F7b是否为弹性蛋白酶或Caspase-1的水解底物及是否正确切割。结果表明弹性蛋白酶是IL-1F7a的特异性消化酶(图9)。
在一个具体实施例中，本发明考察了人rIL-1F7a的体外和体内生物学活性，实验证实IL-1F7a前体及成熟体蛋白均具有抗炎功能，IL-1F7a前体蛋白功能优于成熟体蛋白，且IL-1F7a前体及成熟体蛋白抗炎功能明显优于IL-1F7b前体及成熟体蛋白，故IL-1F7a前体蛋白比IL-1F7b可能更具有药用价值(图12，13)。
在一个具体实施例中，病源微生物成分刺激的IL-1F7a在人细胞中的表达高于其它IL-1F7亚类(图6)。而siRNA敲低内源性IL-1F7a或全部IL-1F7实验显示IL-1F7a代表至少50％的IL-1F7的功能(图10)。表明IL-1F7a是IL-F7亚类中的主要活性蛋白。
过敏性哮喘属IgE介导的变态反应，是一种以肺部嗜酸性粒细胞浸润、粘液过度分泌、对各种激发因子产生气道高反应性为特征的慢性气道炎症性疾病。Th2型免疫反应亢进导致哮喘和过敏性疾病的发生。Th2细胞辅助B细胞IgE类别转换，机体产生大量抗原特异性IgE抗体，并最终介导了I型超敏反应的发生。针对Th2细胞分泌的细胞因子治疗并不能完全有效地减轻炎症反应。有报道显示IL-1F7b能够有效抑制实验过敏性哮喘的发生和病变，并能够有效的地抑制Th2细胞产生及分化，介导的肺组织中促炎性细胞的侵润和炎性因子的产生(Lunding L,IL-37requires IL-18Rαand SIGIRR/IL-1R8to diminish allergicairway inflammation in mice.Allergy.2015Apr；70(4):366-73)。IL-1F7a和IL-1F7b通过相同的细胞受体来抑制炎性发应(图18)，且IL-1F7a比IL-1F7b更具有药用价值(图15，16)。因此IL-1F7a也应可以抑制过敏性哮喘。
类风湿性关节炎(RA)是一种病因不明的，很常见的自身免疫性疾病。致残率较高，预后不良，目前还没有很好的根治方法。目前的研究结果表明，特异性免疫应答，特别是Th17细胞的非正常活化增生以及诱发自身抗体和促炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNFα)和IL-1家族成员(IL-1、IL-18和IL-33)的产生在RA的发病中起重要作用。在一个具体实施例中，本发明以抗胶原蛋白抗体分别注射WT和IL-1F7a转基因小鼠，1天后，注射LPS后每天临床观察结果(图17A)；第17天，处死小鼠。对关节进行组织切片、HE染色(图17B)；。同时提取关节组织RNA，qPCR检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ、IL-17、TNFα和TGF-β1的表达水平(图17C)。结果显示IL-1F7a转基因小鼠能够明显抑制抗胶原蛋白抗体诱导的关节炎的发生和病变(图17A)，并能够有效的地抑制关节中炎性细胞侵润和关节损伤(图17B)。此外，IL-1F7a能够有效抑制关节中自身免疫病相关的主要病理促炎性细胞因子IL-17、TNFα的产生(图17C)。
过度的产生IL-1F7可能导致免疫低下并引起相关的疾病，如慢性感染、肿瘤的发生及和减低疫苗免疫效果。因此，拮抗IL-1F7的功能在这些状况下可能对临床有益。拮抗IL-1F7的功能的方法包括：mico或siRNA方法敲低IL-1F7的产生，用可溶性IL-1F7受体Sigirr蛋白，或抗IL-1F7或其受体Sigirr的中和抗体来阻断IL-1F7a的受体结合及活性。在慢性感染或肿瘤动物模型或患者中，利用抗IL-1F7或其受体Sigirr的中和抗体来阻断IL-1F7a的受体结合及信号通路活性，从而可以增加抗感染、抗肿瘤免疫及疫苗的免疫功能。本发明采用先给WT和IL-1F7a转基因小鼠腹腔注射Sigirr中和抗体，并进行LPS攻击，ELISA检测小鼠血清中促炎因子IL-1、TNF-和IFN-γ的含量，结果显示Sigirr中和抗体可阻断IL-1F7a的抗促炎因子IL-1、TNF-和IFN-γ产生的功能。因此，SIGIRR是拮抗IL-1F7a的细胞表面受体，Sigirr中和抗体可阻断IL-1F7a的功能。
由上述结果可见，IL-1F7a是核蛋白并可能具有核内基因调控功能，弹性蛋白酶是IL-1F7a的特异性消化酶，IL-1F7a可能是IL-F7亚类中的主要活性蛋白，人IL-1F7a N-端序列(M1-L21，含有NLS序列)、IL-1F7a前体及成熟体蛋白均具有抗炎功能。同时IL-1F7a可以有效的抑制感染性休克。IL-1F7a还可以抑制抗胶原蛋白抗体诱导的关节炎的发生和病变，并能够有效的地抑制组织中促炎性细胞因子的产生，抑制自身免疫性疾病的发生和发展。因此本发明提供了人IL-1F7a N-端蛋白、人IL-1F7a前体蛋白或成熟人IL-1F7a蛋白在制备抑制炎症和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
其中，按照本发明，所述人IL-1F7a N-端蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述人IL-1F7a前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述成熟人IL-1F7a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
炎性疾病是机体对刺激(感染及非感染性)的应激反应。这种反应通常是生理性的、有益的，但如果反应失控(过高/低)，将导致病理性炎症反应和疾病的发生。炎症是最常见的患者就诊原因。临床表现是组织器官的红、肿、热、痛及机能障碍。炎性疾病分为感染性炎性疾病或非感染性炎性疾病。
感染性炎性疾病是由致病性病源微生物，包括细菌、病毒、霉菌和寄生虫感染引起的炎性疾病。大多数感染性疾病在健康人群可自愈。严重感染，特别在免疫低下个体，感染性炎症可导致多器官功能衰竭及休克和死亡。所述感染性炎性疾病包括但不局限于手足口病危重症、各种重症病毒性肺炎、某些类型的结核病(结核性心包炎、脑膜脑炎、胸膜炎)、布鲁菌病或流行性腮腺炎并发睾丸炎以及各种严重感染所致的休克，中毒性菌痢、中毒性肺炎、猩红热、败血症、暴发性流行性脑膜炎、暴发性肝炎、心包炎、心瓣膜炎等感染性炎症。
非感染性炎性疾病是由非感染性致病因子(物理、化学、生物)引起的组织和细胞应激和损伤造成的炎性疾病，包括但不局限于自身免疫性疾病、过敏性疾病、老年病、移植排斥及肿瘤。
其中所述自身免疫性疾病包括但不局限于多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、自发性节肠炎、自身免疫性肝炎和甲状腺机能亢进等。
所述过敏性疾病包括但不局限于过敏性哮喘、过敏性皮炎和食物过敏等。所述老年病包括但不局限于帕金森病、阿尔茨海默病(AD)、动脉粥样硬化和II型糖尿病等。所述肿瘤包括但不局限于结肠癌、直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤和骨髓瘤等。
在一些实施方案中，所述药物包括人IL-1F7a N-端蛋白、人IL-1F7a前体蛋白和成熟人IL-1F7a蛋白中至少一种和药学上可接受的载体。
在另一些实施方案中，所述药物包括
(1)人IL-1F7a N-端蛋白、人IL-1F7a前体蛋白和成熟人IL-1F7a蛋白中至少一种；和
(2)其它抑制炎症的化合物和/或中药。
本发明还公开了重组IL-1F7a蛋白的制备方法。具体为采用PCR方法从人单核细胞克隆全长人IL-1F7a cDNA，构建表达载体，转化宿主细胞诱导表达，收集菌体，超声破碎后Ni-NTA系统纯化IL-1F7a蛋白。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊说明，实施例中所涉及的试剂均为市售产品。
实施例1、IL-1F7a亚型的生物学及理化特性
用PCR方法从人单核细胞克隆全长人IL-1F7a cDNA，序列如图4A所示。DNA序列分析证明这些序列与发表的序列完全相同(图4B)；相应的IL-1F7a全长，N-端及成熟蛋白序列如图5。
实施例2、研究IL-1F7a生物学特性和体外诱导IL-1F7亚类基因表达的方法
(1)IL-1F7亚型在人外周血单核细胞(PBMC)中的表达水平
抽取人外周血，Ficoll密度梯度离心法分离人外周血PBMC，PBMC用不同浓度梯度TLR4配体LPS(0、0.1、0.5、1μg/ml)处理，随后提取RNA，反转录后通过qPCR方法检测IL-1F7各亚型mRNA表达水平。统计结果为mean±SD.*p<0.05,**p<0.01.结果代表三次实验。
结果显示，LPS诱导的IL-1F7各亚型mRNA水平不同，IL-1F7a在人单核细胞中的表达高于其它IL-1F7亚类(图6)。
(2)IL-1F7a细胞定位及核转导
为了确定IL-1F7a是否为核因子，确定哪一部分IL-1F7a蛋白起核转运作用，其N端NLS是否起核转运作用分别构建表达GFP标签融合的IL1F7aN端(aa1-21，含有NLS)、成熟IL1F7a(aa 22-192)以及全长IL1F7a(aa 1-192)和全长IL-1F7b(aa 1-218)，成熟IL-1F7b(aa 46-218)蛋白序列的过表达质粒并转染人肺癌上皮细胞A549及小鼠巨噬细胞系RAW264.7，待质粒表达后，通过荧光共聚焦检测IL-1F7a和IL-1F7b的亚细胞定位情况。结果如图7所示。
结果显示，与IL-1F7b不同，IL-1F7a全长、N-端及成熟蛋白均定位于细胞核，表明IL-1F7a蛋白是核因子，其N端NLS及IL-1F7保守序列都能起核转运作用。类似于IL-1，IL-1F7a也可能在细胞核内有基因调控功能。
(3)IL-1F7a的细胞释放(正常、细胞凋亡和细胞坏死释放)
分离IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，通过ATP刺激(正常释放)、细胞凋亡或坏死诱导，收集细胞培养上清，并通过ELISA检测其中IL-1F7a和IL-1F7b的含量，进而确定IL-1F7a和IL-1F7b的释放方式。IL-1a作为阳性对照。统计结果为mean±SD。*p<0.05，(n＝5小鼠/组)。结果代表两次实验。其中，正常释放采用ATP(6mM)刺激15min。利用0.4μg/ml丝裂霉素(MMC)处理16h诱导细胞凋亡，并使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(40-60,diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色细胞核，在荧光显微镜下观察核固缩的形成，确定细胞凋亡情况。通过-70℃和38℃反复冻融细胞3次的方法诱导细胞坏死，并用台盼蓝拒染法分析细胞坏死情况。
结果显示IL-1F7a主要通过ATP刺激来释放(正常释放)(图8)。
(4)IL-1F7a的成熟方式
用不同浓度的弹性蛋白酶和Caspase-1消化纯化的IL-1F7a全长重组蛋白(20μg/ml)37℃30min，并同时设置弹性蛋白酶或Caspase-1抑制剂处理组。酶解反应蛋白样品通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色，根据切割蛋白条带分子量确定IL-1F7a是否为弹性蛋白酶或Caspase-1的水解底物及是否正确切割，结果见图9。
结果显示，倒数第2泳道加Elastease后，IL-1F7a发生酶解主带下方出现一条新的条带；倒数第1泳道加入Elastase抑制剂后，此条带消失；显示IL-1F7a是弹性蛋白酶的水解底物。IL-1F7a全长重组蛋白可以被弹性蛋白酶而不是Caspase-1消化。且弹性蛋白酶消化IL-1F7a的作用仅被弹性蛋白酶的抑制剂阻断，而不是Caspase-1抑制剂阻断。表明弹性蛋白酶是IL-1F7a的特异性消化酶，IL-1F7a的成熟通过弹性蛋白酶的切割完成。
实施例3、IL-1F7a亚型的生物活性及免疫学功能
(1)内源性IL-1F7亚型在人细胞中的作用
在表达IL-1F7的细胞中，通过siRNA敲低IL-1F7a或全部IL-1F7(表2)，48h后，细胞进行LPS刺激，14小时后，qPCR分别检测IL-1F7亚类mRNA水平，同时，ELSA检测敲低IL-1F7a及所有IL-1F7亚类分别对IL-6产生的影响(B)。统计结果为mean±SD，*p<0.05，**p<0.01，结果代表两次实验。
表2 IL-1F7a和全部IL-1F7siRNA序列
名称 序列
IL-1F7a 1#:5’-GAGGGAAACAGAAACCAAAUU-3’
2#:5’-GGAAAGAACAGCUUUAAGAUU-3’
全部IL-1F7 1#:5’-UCAAGGAUGAGGCUAAUGCUU-3’
2#:5’-CAAUGUGUUUCCUGUUCUCUU-3’
3#:5’-UUACAAUUGCAGGAGGUGCUU-3’
4#:5’-UUAUCCUUGUCACAGUAGAUU-3’
结果显示，敲低IL-1F7a特异性影响IL-1F7a的表达，但不影响其它IL-1F7亚型的表达。而敲低全部IL-1F7降低所有IL-1F7亚类的表达(图10A)。敲低全部IL-1F7显著地增加了LPS-刺激的炎性淋巴因子IL-6的产生(图10B)。表明IL-1F7的全部作用是免疫抑制。更重要地是，相比敲低全部IL-1F7引起的IL-6水平，单独敲低IL-1F7a导致50％IL-6水平的增加(图10B)。表明平行于LPS诱导的IL-1F7a在人单核细胞中的表达高于其它IL-1F7亚类。这些结果证明IL-1F7a可能是IL-F7亚类中的主要活性蛋白。
(2)重组IL-1F7a的体内功能及其与IL-1F7b的功能异同：
建立人全长IL-1F7a和IL-1F7b过表达转基因小鼠模型(图11A)。
将合成的IL-1F7a和IL-1F7b cDNA序列插入转基因载体中，并将其进行线性化处理，随后显微注射至C57BL/6小鼠来源的受精卵中。通过基因型鉴定筛选阳性小鼠，并用qPCR检测转基因小鼠不同器官中IL-1F7a和IL-1F7b的mRNA水平，利用IL-1F7抗体通过ELISA和Western blot检测血清和血细胞中IL-1F7a和IL-1F7b的表达水平。统计结果为mean±SD，*p<0.05，***p<0.001，(n＝5小鼠/组)，结果代表两次实验。
结果显示，IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠可以分别表达IL-1F7a和IL-1F7b基因(图11C)和蛋白(图11B，图11D)。qPCR检测发现IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠肺、脾脏、脑中IL-1F7a和IL-1F7b的分布及mRNA表达情况相似(图11C)。ELISA检测LPS刺激或不刺激的正常和转基因小鼠血清IL-1F7水平显示：IL-1F7a和IL-1F7b可以从细胞分泌出来，且这种表达是可以被LPS诱生的(图11D)。IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠有相似的表达水平。这些转基因小鼠可以用于研究比较人IL-1F7a和IL-1F7b在疾病发生发展中的作用。
实施例4、产生和纯化人重组IL-1F7a和IL-1F7b全长及成熟重组蛋白
1、IL-1F7a和b表达载体转化感受态大肠杆菌
(1)从-80℃取出DE3(PLysS)感受态细菌，并置于冰上，并向其中加入IL-1F7a和b过表达质粒，冰上放置30min；
(2)42℃水浴热激45s，迅速置于冰上，放置10-20min；
(3)加入200μl无抗LB培养基，37℃摇床孵育45min；
(4)吸取200μl涂于含50μg/ml卡那霉素平板，置于37℃培养箱培养。
2、LB培养基的配制
(1)称量50mg NaCl，50mg胰蛋白胨，25mg酵母提取物，溶解于4750ml去离子水中；
(2)调节pH值至7.5，定容至5L；
(3)将配制好的培养基分装于8个容积为1L的锥形瓶中，每个625ml培养基，封口并灭菌。
3、IL-1F7a和IL-1F7b原核诱导表达
(1)挑取单克隆菌落放入50ml含50μg/ml卡那霉素LB培养基中过夜培养。
(2)每个锥形瓶625ml LB培养基中加入625μl卡那霉素(工作浓度为50μg/ml)；
(3)每个锥形瓶中加入6.25ml IL-1F7a和b菌液，摇床培养1.45h至OD600值约为0.6；
(4)加入IPTG诱导表达，IPTG诱导浓度为1mM，摇床培养3.2h。
4、收集及超声破碎细菌
(1)4℃，5000rpm，离心15min，收集细菌；
(2)收集的细菌置于50ml离心管中，冻于-80℃，待用。
5、Ni-NTA系统(Chromatograph system)纯化IL-1F7a和IL-1F7b蛋白
1)试剂准备：
(1)1×结合缓冲液：500mM NaCl，10mM咪唑，pH7.9 20mM Tris；
(2)1×洗脱缓冲液：500mM NaCl，500mM咪唑，pH7.9 20mM Tris；
(3)去离子水；
(4)20％乙醇；
(5)细菌裂解液：35ml 1×结合缓冲液中分别加入终浓度2mg/ml溶菌酶，蛋白酶抑制剂，150μl 1M MgCl2，终浓度5μg/ml DNase；
2)细菌超声破碎：
每管细菌加入35ml裂解液，细胞破碎仪超声条件：功率60％，工作25s，间歇25s，总时间20min；4℃，18000rpm，离心30min。
3)蛋白纯化：
(1)由于沉淀中的IL-1F7a和IL-1F7b重组蛋白较多，故收集IPTG诱导表达的菌液1L，离心并裂解细菌，收集沉淀；用pH8.0的8M尿素(含0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-Cl)溶解包涵体进行纯化；
(2)表达的IL-1F7a和IL-1F7b含有6个His标签，采用Ni2+-NTA凝胶进行变性条件下的亲和层析纯化。变性结合缓冲液为8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-Cl，pH＝8.0；变性漂洗缓冲液为8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-Cl，pH＝6.3；变性洗脱缓冲液为8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-Cl，pH＝4.5；
(3)用变性结合缓冲液洗涤Ni2+-NTA凝胶柱，使其再生，增强结合蛋白的能力；
(4)将pH＝8.0的IL-1F7a和IL-1F7b蛋白溶液过柱；
(5)用变性结合缓冲液洗涤Ni2+-NTA凝胶柱，去除部分杂蛋白；
(6)用变性漂洗缓冲液洗涤Ni2+-NTA凝胶柱，继续去除杂蛋白；
(7)用变性洗脱缓冲液洗涤Ni2+-NTA凝胶柱，收集IL-1F7a和IL-1F7b蛋白。
4)IL-1F7a和IL-1F7b蛋白包涵体复性：
(1)通过对重组蛋白进行透析复性并除去其中的尿素，透析液为8M尿素，0.1MNaH2PO4，0.01M Tris-Cl，pH＝8.0；以及PBS；
(2)将蛋白溶液装入截留分子量为7k的透析袋内，封紧袋口；
(3)于4℃环境透析24h，每2～3小时将10～20％体积的透析液更换为PBS；
(4)透析结束后，收集透析袋中的蛋白溶液。
进一步纯化此蛋白：FPLC分子筛层析去除细菌杂蛋白至纯度大于95％，用ENDOTRAP层析去除细菌内毒素至内毒素<0.5EU/毫克蛋白。
6、IL-1F7a和IL-1F7b蛋白的鉴定：
(1)进行SDS-PAGE电泳，配制12～15％的分离胶，将纯化过程中的各组分进行蛋白电泳；
(2)电泳结束后，用考马斯亮蓝对电泳胶染色30min～1h；
(3)能明显观察到Marker与蛋白条带后，用乙酸脱色液洗涤电泳胶至条带清晰，于紫外显影仪下观察蛋白条带；
(4)IL-1F7a蛋白在19kDa处，IL-1F7b蛋白在25kDa处(图12A)。表明IL-1F7a和IL-1F7b蛋白已被成功纯化出来
7、IL-1F7a和IL-1F7b蛋白的活性检测：
(1)用24孔细胞培养板培养小鼠单核细胞RAW 264.7，细胞密度约106个/孔，于37℃培养24h；
(2)采用0.05～200ng/ml不同浓度梯度的重组IL-1F7a和IL-1F7b蛋白与终浓度1μg/ml LPS共同作用于RAW 264.7细胞；阴性对照不加IL-1F7蛋白与LPS，阳性对照只加LPS；
(3)37℃培养细胞24h后，收集培养上清，通过ELISA方法检测上清中IL-6的表达量；
(4)提前一天在96孔板上包被捕获抗体，室温过夜；
(5)弃去旧液，用0.05％的PBST洗涤3次，用1％BSA室温封闭1h；
(6)洗涤3次后加入收集的细胞培养上清样品与稀释好的标准品，室温封闭2h；
(7)洗涤3次后加入检测抗体，室温封闭2h；
(8)洗涤3次后加入HRP，避光室温孵育20min；
(9)洗涤3次，按体积比1:1混合显色液A液与B液，避光孵育10～20min，随后加入终止液终止显色反应；
(10)通过酶标仪检测450nm波长处的OD值，按照OD值绘制标准曲线，并通过方程计算样品中IL-6表达量。统计结果为mean±SD。*p<0.05，**p<0.01，(n＝5小鼠/组)。结果代表三次实验。结果见图12B。
结果显示，全长rIL-1F7a对LPS诱导的炎性细胞因子IL-6产生的抑制作用明显强于全长rIL-1F7b和商品化的成熟IL-1F7b蛋白(Novoprotein)。
实施例5、系统比较全长及成熟重组人IL-1F7a与IL-1F7b蛋白的功能
1、对促炎性细胞因子的影响
人或小鼠单核细胞用LPS刺激，同时加不同剂量的全长或成熟rIL-1F7a或rIL-1F7b蛋白并分别培养12-24h后，收集细胞培养上清作ELISA检测重组IL-1F7a或IL-1F7b对促炎性细胞因子IL-6的产生的影响，统计结果为mean±SD，*p<0.05，*p<0.01(n＝5小鼠/组)。结果代表三次实验，结果见图13。
结果显示，全长rIL-1F7a重组蛋白对促炎性细胞因子产生的抑制效应明显强于全长rIL-1F7b(图13A)。此外，成熟rIL-1F7a重组蛋白对促炎性细胞因子产生的抑制效应明显强于成熟IL-1F7b(图13B)
2、抑制抗原提呈细胞功能：CD40、CD80和MHCII和树突状细胞的抗原提呈细胞功能密切相关。体外分离正常C57BL/6小鼠脾脏CD11+树突状细胞，并用或不用rIL-1F7a和b(100ng/ml)处理4小时后进行LPS刺激12小时或不刺激12小时，随后利用流式检测CD11+树突状细胞的CD40、CD80和MHCII表达水平的百分比。统计结果为mean±SD，*p<0.05，**p<0.01(n＝5小鼠)，结果代表三次实验。
结果表明全长rIL-1F7a对LPS诱导的树突状细胞CD40、CD80和MHCII表达水平的抑制作用明显强于rIL-1F7b蛋白(图14)。
3、对LPS诱导的致死性休克的影响
分别对WT、IL-1F7a和IL-1F7b杂合子转基因小鼠诱导LPS休克，随后观察小鼠的存活情况。
致死剂量LPS(40mg/kg)注射WT、IL-1F7a和IL-1F7b转基因杂合子小鼠，24h内观察小鼠死亡情况，计算存活率(百分比)。ELISA检测实验小鼠血清中细胞因子IL-1β、TNF、IFN-γ、IL-6和IL-10的产生情况。
致死剂量LPS(40mg/kg)注射WT小鼠5h后，用PBS或不同浓度IL-1F7a和IL-1F7b重组蛋白(1,10mg/kg)注射小鼠，观察小鼠存活率。统计结果为mean±SD，*p<0.05，**p<0.01(n＝10小鼠/组)，结果代表三次实验。
结果显示，全长IL-1F7a转基因小鼠对LPS诱导的致死性休克致死的保护作用及促炎性细胞因子产生的抑制效应明显强于IL-1F7b(图15A，B)。同时重组IL-1F7a比IL-1F7b蛋白更有效的治疗小鼠内毒素休克引起的死亡(图15C)。表明IL-1F7a比IL-1F7b具有更强的IL-10-非依赖性的抑制炎性细胞因子产生的作用。
4、对沙门氏菌感染的抑制作用
(1)细菌培养：
鼠伤寒沙门氏菌划线接种于固体无抗LB平板，37℃，过夜培养。随后挑取单菌落培养于无抗液体LB培养基，37℃，过夜静置培养，培养至对数期后，5000rpm，10min，离心收集菌体，用PBS缓冲液调节浓度至108cfu/ml，用于小鼠攻毒。
(2)鼠伤寒沙门氏菌S.Typhimurium感染小鼠模型的建立：
分别给予WT、IL-1F7a和IL-1F7b转基因小鼠(10只/组)致死剂量的沙门氏菌，随后观察小鼠的存活情况。沙门氏菌攻毒前，每只小鼠灌胃5％NaHCO3溶液100μl，中和胃酸后，采用PBS缓冲液调节浓度至108cfu/ml的鼠伤寒沙门氏菌，每只小鼠灌胃200μl，对照组小鼠给予相同体积5％的NaHCO3溶液和PBS缓冲液。
(3)小鼠体内细菌数量分析：
处死小鼠，体外分离肝脏、脾脏及肠系膜淋巴结，PBS缓冲液中研磨后，取上清用无抗生素液体LB培养基稀释成10-2、10-4、10-6后涂板(无抗LB平板)，37℃，过夜培养，最后统计细菌的数量。结果见图16。
结果显示，全长IL-1F7a比IL-1F7b转基因小鼠对沙门氏病菌感染引起的致死性病变有很强的保护作用(图16A)。IL-1F7a比IL-1F7b转基因小鼠及正常对照小鼠对细菌生长有明显的抑制效应(图16B)。表明平行于IL-1F7a比IL-1F7b亚类对细菌LPS诱导的休克有更好的保护，这些结果证明IL-1F7a可以有效的治疗感染引起的炎性疾病。
5、IL-1F7a对类风湿关节炎的影响
以抗胶原蛋白抗体(Chondre，50μl/只)分别注射WT和IL-1F7a转基因小鼠(10只/组)，1天后，注射LPS(0.1μg/只)来诱发关节炎。之后每天临床观察关节肿胀程度和患肢数量结果；第17天，处死小鼠。对关节进行组织切片、HE染色。同时提取关节组织RNA，qPCR检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ、IL-17、TNFα和TGF-β1的表达水平。统计结果为mean±SD，*p<0.05，**p<0.01(n＝5小鼠/组)，结果代表三次实验。
结果显示，IL-1F7a转基因小鼠能够明显抑制抗胶原蛋白抗体诱导的关节炎的发生和临床症状(图17A)及骨关节损伤病变(图17B)，并能够有效的地抑制关节中促炎性细胞因子的产生，特别是这些重要的类风湿关节炎特异性炎性因子IL-17和TNFa的产生(图17C)。
实施例6、拮抗IL-1F7a功能的方法
近一步研究Sigirr是否是IL-1F7a的功能受体，并且Sigirr中和抗体能否阻断IL-1F7a在疾病中的作用。
给WT和IL-1F7a转基因小鼠注射抗SIGIRR中和抗体或对照抗体(2mg/鼠)，4小时后再用LPS(20mg/kg)攻击，14h后，收集小鼠血清并用ELISA方法检测其中的炎性淋巴因子IL-1、TNF和IFN-r的水平，统计结果为mean±SD，*p<0.05，**p<0.01(n＝5小鼠/组)，结果代表两次实验，结果如图18。
结果显示，Sigirr中和抗体，而不是对照抗体，可以阻断IL-1F7a对LPS刺激炎性淋巴因子产生的抑制作用。表明Sigirr是IL-1F7a的功能受体。因此IL-1F7a拮抗剂，包括Sigirr中和抗体对过度的产生IL-1F7可能导致的免疫低下所引起的相关疾病，如慢性感染、肿瘤的发生具有治疗作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所
<120> IL-1F7a的作用
<130> MP1614989
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Ser Gly Cys Asp Arg Arg Glu Thr Glu Thr Lys Gly Lys Asn Ser
1 5 10 15
Phe Lys Lys Arg Leu
20
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Met Ser Gly Cys Asp Arg Arg Glu Thr Glu Thr Lys Gly Lys Asn Ser
1 5 10 15
Phe Lys Lys Arg Leu Arg Gly Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys
20 25 30
Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser
35 40 45
Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile
50 55 60
Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly
65 70 75 80
Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys
85 90 95
Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu
100 105 110
Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe
115 120 125
Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala
130 135 140
Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro
145 150 155 160
Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser
165 170 175
Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
180 185 190
<210> 3
<211> 171
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Arg Gly Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala
20 25 30
Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu
50 55 60
Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly
65 70 75 80
Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu
85 90 95
Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala
100 105 110
Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp
115 120 125
Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp
130 135 140
Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys
145 150 155 160
Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp
165 170

Claims (7)

1.成熟人IL-1F7a蛋白在制备抑制炎症的药物中的应用；所述成熟人IL-1F7a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症为感染性炎性疾病或非感染性炎性疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述感染性炎症为细菌、病毒、霉菌和寄生虫感染引起的炎性疾病。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非感染性炎性疾病为自身免疫性疾病、过敏性疾病、老年病或肿瘤。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、自发性节肠炎、自身免疫性肝炎或甲状腺机能亢进。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括成熟人IL-1F7a蛋白和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括
(1)成熟人IL-1F7a蛋白；和
(2)其它抑制炎症的化合物和/或中药。
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IL-37对炎症相关性疾病的抑制作用;李梦媛等;《中国比较医学杂志》;20151231;第25卷(第12期);第75-80页 *

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