CN107708718A - 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽 - Google Patents

用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽 Download PDF

Info

Publication number
CN107708718A
CN107708718A CN201680034226.0A CN201680034226A CN107708718A CN 107708718 A CN107708718 A CN 107708718A CN 201680034226 A CN201680034226 A CN 201680034226A CN 107708718 A CN107708718 A CN 107708718A
Authority
CN
China
Prior art keywords
days
peptide
glp
diabetes
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680034226.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107708718B (zh
Inventor
R·阿比拉
斯蒂芬·J·潘多尔
H·樊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cedars Sinai Medical Center
Original Assignee
Cedars Sinai Medical Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cedars Sinai Medical Center filed Critical Cedars Sinai Medical Center
Priority to CN202210041768.8A priority Critical patent/CN114366802A/zh
Publication of CN107708718A publication Critical patent/CN107708718A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107708718B publication Critical patent/CN107708718B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

本文描述了用于治疗糖尿病和/或肥胖症的方法和组合物。被配制用于肠内递送的苦味寡肽分子调节涉及面向胃肠道腔的受体的信号，所述信号传导涉及参与胃排空和食欲的抑制的激素，如胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)和肽酪氨酸‑酪氨酸(PYY)。作为在有限副作用情况下治疗糖尿病的新型方式，所描述的发明使用身体自身的内分泌系统来治疗糖尿病，这是相对于现有疗法的优点，即其可仅仅提供疾病管理而无需治愈或需要更激进的方法如手术介入。

Description

用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽
发明领域
本发明涉及用于治疗糖尿病的组合物和方法。
背景技术
本文中的所有公布都以引用的方式并入，该引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个别公布或专利申请以引用的方式并入一般。以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息都是现有技术，或与目前要求保护的本发明有关，或并不承认明确地或隐含地引用的任何公布是现有技术。
在胃肠道上皮的表面上，其被赋予检测膳食成分以及肠道微生物代谢物的分子感测机构。已经鉴定了许多类型的肠内分泌细胞，并且它们主要通过其内分泌递质的具体内容物分类。一些关键实例包括含有缩胆囊素(CCK)的肠内分泌I细胞；和含有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)的L细胞。这些药剂释放到血液中是由细胞内腔表面上的感受器与肠内容物中的营养或环境因素的相互作用产生的。各自均对胃肠道反应(包括局部和全身代谢)具有具体和必要功能。
GLP-1源自胰高血糖素原基因的转录产物。GLP-1的生物活性形式是：GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)NH2。一旦进入循环，由于酶二肽基肽酶-4(DPP4)的快速降解，GLP-1的半衰期小于2分钟。它是有效的抗高血糖激素，从而诱导胰岛素分泌的葡萄糖依赖性刺激，同时抑制胰高血糖素分泌。这种葡萄糖依赖性作用是特别有吸引力的，因为当血浆葡萄糖浓度处于正常空腹范围时，GLP-1不再刺激胰岛素来引起低血糖。GLP-1使用涉及GLUT2和葡萄糖激酶的表达增加的机制恢复胰腺β-细胞的葡萄糖敏感性。GLP-1还抑制胰腺β细胞凋亡，刺激胰岛素分泌型β细胞的增殖和分化，并且抑制胃分泌和运动。这延缓胃排空，其促进饱腹感和体重减轻。事实上，已经开发了GLP-1类似物以及内源性GLP-1降解的抑制剂，其证明了用于治疗与肥胖相关的类型的II型糖尿病的功效。所述类似物不仅被证明显著改善胰岛素分泌和葡萄糖控制，而且已经发现它们减少胃排空并增加饱腹感，从而产生体重减轻益处。L-细胞还释放两种循环形式的PYY：PYY1-36和PYY3-36。后一种形式被认为是禁食和进食状态中的主要形式，并且是通过肽酶DPP4从PYY1-36裂解N-末端Tyr-Pro残基产生的。PYY经由在下丘脑的弓形核的神经元中表达的PYY-2受体抑制食物摄取。PYY的其它作用包括减缓胃排空和减缓小肠蠕动。
存在使用动物和人模型进行的旨在探测肠道中的营养感测受体的基本机制作用的大量研究。这些研究已经鉴定了各种肠内分泌细胞中的味觉受体(甜味、鲜味和苦味)以及脂肪酸受体(由脂肪酸中的广泛范围的链长度活化)。甜味和鲜味受体最可能感测或品尝食物中的能量营养物质和氨基酸，而苦味受体潜在地感测或品尝食物中的任何有害和有毒成分。一旦感测到这些食物组分，就活化几种代谢途径。在苦味感测组分的情况下，减缓胃排空和食物吸收的途径可能被活化。这些关联中的许多并未很好地表征，特别是在人体生理学的背景下，并且一直发现缓慢。若干研究已经表明，GLP-1或其它激素如PYY、CCK和饥饿素的释放可通过活化这些感受器之一来实现。这些关联对了解这些味觉肠道感受器在食物消化中的详细作用至关重要。
从内衬胃肠道内腔的内分泌细胞释放的肽激素的生理学作用已经已知一段时间，但是通过肠内容物“感测”和分泌激素的机制还未知。现在发现，先前认为限于舌上皮的味觉受体也存在于胃、小肠和结肠中。若干肠内分泌细胞类型表达TAS2R家族苦味受体和T1R2/3甜味受体。事实上，肠内分泌细胞响应于苦味配体如苯基硫脲(PTC)分泌GLP-1、肽YY(PYY)或CCK，所述配体是苦味受体TAS2R38和地那铵(denatonium)的特异性活化剂，其活化苦味受体TAS2R47。
为了了解在肽激素释放的背景下L细胞的营养介导的信号传导，本发明人集中于苦味受体TAS2R38以研究其在从L-细胞释放GLP-1激素中的机制作用。本发明人已经鉴定了源自乳清蛋白的可用作2型糖尿病患者的治疗剂的四种苦味寡肽(BPx1、BPx2、BPx3和BPx4)。
概述
结合意在示例性和说明性而非限制范围的系统、组合物和方法来描述和说明以下实施方案及其各个方面。
本文提供用于治疗、抑制有需要的受试者的糖尿病和/或肥胖症、降低糖尿病和/或肥胖症的严重程度、减缓糖尿病和/或肥胖症的进展和/或促进糖尿病和/或肥胖症的预防的方法。所述方法包括提供增加肠激素释放的药剂并向有需要的受试者施用有效量的组合物，以便治疗、抑制所述受试者的糖尿病和/或肥胖症、降低糖尿病和/或肥胖症的严重程度、减缓糖尿病和/或肥胖症的进展和/或促进糖尿病和/或肥胖症的预防。在一个实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。
在一些实施方案中，肠激素是胰高血糖素肽-1(GLP-1)、肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)或其组合中的任何一种或多种。在一些实施方案中，GLP-1是GLP-1-(7-37)、GLP-1-(7-36)NH2或其组合中的任何一种或多种。
在所述方法的一些实施方案中，所述药剂是一种或多种苦味寡肽。在示例性实施方案中，所述苦味寡肽包括YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种、基本上由其组成或由其组成。
在一个实施方案中，所述苦味寡肽与药剂缀合以增加肠保留。在一些示例性实施方案中，增加肠保留的药剂是纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合中的任何一种或多种。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括提供源自食物的增加肠激素释放的脂肪酸或植物分子。在示例性实施方案中，源自食物的脂肪酸或植物分子包括但不限于以下中的任何一种或多种：尿石素A、鞣花酸、乌索酸、齐墩果酸、6-间丙基-2-硫尿嘧啶、丙酸、丁酸酯、棕榈酸或其组合。
在本文所述方法的各个实施方案中，肠激素释放的增加由G蛋白偶联受体(GPCR)介导，其中GPCR在内分泌L-细胞的表面上表达。在一些实施方案中，GPCR是SSTR2、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4中的任何一种或多种。
在所述方法的各个实施方案中，所述组合物口服、肠内施用至小肠或通过直肠栓剂或灌肠剂施用至结肠。在一个实施方案中，所述受试者是人。
在各个实施方案中，本文所述的方法还包括施用SGLT2抑制剂、胰岛素、吸入胰岛素、磺酰脲类、二甲双胍、阿卡波糖、噻唑烷二酮或其组合中的任何一种或多种。
在一些实施方案中，所述药剂的有效量是约0.1mg/kg/天至0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、5mg/kg/天至10mg/kg/天、10mg/kg/天至20mg/kg/天、20mg/kg/天至50mg/kg/天、50mg/kg/天至100mg/kg/天、100mg/kg/天至200mg/kg/天、200mg/kg/天至300mg/kg/天、300mg/kg/天至400mg/kg/天、400mg/kg/天至500mg/kg/天、500mg/kg/天至600mg/kg/天、600mg/kg/天至700mg/kg/天、700mg/kg/天至800mg/kg/天、800mg/kg/天至900mg/kg/天或900mg/kg/天至1000mg/kg/天。所述组合物可在受试者患糖尿病和/或肥胖症之前、期间或之后施用至受试者。在一些实施方案中，所述组合物按照每天1-3次或每周1-7次施用至受试者。在一些实施方案中，所述组合物被施用至受试者持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。
在各个实施方案中，增加肠激素和脂肪酸释放的药剂顺序地或同时地施用。
本文还提供包含一种或多种苦味寡肽和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述苦味寡肽刺激胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、肽酪氨酸酪氨酸(PYY)或其组合的释放。在一些实施方案中，GLP-1、PYY或其组合的释放由G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导介导。在一些实施方案中，所述GPCR包括TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4、SSTR2中的一种或多种。在一些实施方案中，所述苦味寡肽包括YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的一种或多种。在一些实施方案中，所述苦味寡肽与纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合中的任何一种或多种缀合。
本文还提供用于筛选用于治疗糖尿病和/或肥胖症的肽的方法。所述方法包括提供一种或多种候选肽，使所述肽与分泌GLP-1的细胞接触并确定所述接触是否引起GLP-1的分泌增加，GLP-1分泌的增加表明所述候选肽可用于治疗糖尿病。所述筛选方法包括分别接触待测试的多种候选肽中的每一种。在一些实施方案中，所述多种候选肽包括多于约104个样品。在一些实施方案中，所述多个样品包括多于约5X 104个样品。在一些实施方案中，所述候选肽是苦味寡肽。在一些实施方案中，所述细胞是Hu-Tu80细胞。
附图简述
在参照的图中说明示例性实施方案。本文公开的各个实施方案和图意图被视为说明性的而非限制性的。
图1描绘根据本发明的各个实施方案，已知受体及其在L-细胞中的潜在功能，包括受体介导的对来自肠内分泌细胞的GLP-1和PYY分泌的控制的概述。问号是指尚未鉴定的受体。
图2描绘根据本发明的各个实施方案，苦味受体TAS2R38中的α-乳啡肽四肽(青色)的结合口袋。
图3描绘根据本发明的各个实施方案，对于苦味寡肽(BPx1＝YGLF、BPx2＝YPFPGPIPN、BPx3＝IPAVF、BPx4＝LLF)、脂肪酸配体和二甲双胍，来自HuTu-80细胞的GLP-1释放的剂量-反应数据。
图4描绘根据本发明的各个实施方案，用PTU-纤维素、PTU或纤维素处理的小鼠中的GLP-1释放。(A)PTU-纤维素的合成。(B)用PTU-纤维素、PTU或纤维素处理的七只小鼠中的平均GLP-1释放。在雄性C57Bl/6小鼠中，PTU-纤维素剂量是5g/kg体重；PTU是200mg/kg体重；并且纤维素是5g/kg体重。在所指示的时间抽取血液并且使用EGLP-35K胰高血糖素样肽-1(活性)ELISA试剂盒(Millipore，MA)测量来自所述血液的血清中的GLP-1。
图5描绘根据本发明的各个实施方案，在培养的HuTu-80细胞中通过已知的TAS2R38配体PTU刺激GLP-1释放，所述细胞未经处理或用媒介物和所指示浓度处理30分钟。收集条件培养基并冷冻直到GLP-1测量。值是平均值±SE，N＝2(PTU)。使用Luminex测定来测量GLP-1。
图6描绘根据本发明的各个实施方案，在HuTu-80细胞、siRNA对照和受体siRNA中TAS2R38的mRNA倍数变化。
图7描绘根据本发明的各个实施方案，TAS2R38在大多数HuTu-80中表达。将人十二指肠上皮癌细胞HuTu-80(目录号HTB-40，ATCC，Manassas，VA)接种在涂覆有聚-L-赖氨酸(Sigma，St.Louis，MO)的4孔室载玻片(Nunc，Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)中。将汇合的细胞用4％多聚甲醛(Sigma)固定30分钟，用PBS(Sigma)洗涤3次，用PBS中的0.25％Triton X-100透化10分钟，用PBS洗涤3次，且在PBS中用5％BSA封闭2小时。将固定的细胞与(A)1∶150或(B)1∶250浓度的兔TAS2R38抗体(ab65509，Abcam，Cambridge，MA)一起孵育过夜。将细胞用PBS洗涤3次，并与1∶400第二Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG抗体一起孵育过夜，用PBS洗涤3次并用含有DAPI(Vector Labs，Burlingame，CA)的封固培养基复染色。使用专有Elements软件(Nikon，Melville，NY)，在Nikon Eclipse Ti-U显微镜上可视化荧光绿(TAS38R)和蓝色(DAPI)。
图8描绘根据本发明的各个实施方案，siTAS2R38在大多数HuTu-80中敲低。通过核穿孔(nucleoporation)(Lonza，Walkersville，MD)用对照siRNA或TAS2R38siRNA(Qiagen，Valencia，CA)转染人十二指肠上皮癌细胞HuTu-80(目录号HTB-40，ATCC，Manassas，VA)。将这些转染的HuTu-80细胞接种在涂覆有聚-L-赖氨酸(Sigma，St.Louis，MO)的4孔室载玻片(Nunc，Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)中。将汇合的细胞用4％多聚甲醛(Sigma)固定30分钟，用PBS(Sigma)洗涤3次，在PBS中用0.25％triton X-100透化10分钟，用PBS洗涤3次，且在PBS中用5％BSA封闭2小时。将固定的细胞与1∶250浓度的兔TAS2R38抗体(ab65509，Abcam，Cambridge，MA)一起孵育过夜。将细胞用PBS洗涤3次，并与1∶400第二Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG抗体一起孵育过夜，用PBS洗涤3次并用含有DAPI(VectorLabs，Burlingame，CA)的封固培养基复染色。使用专有Elements软件(Nikon，Melville，NY)，在Nikon Eclipse Ti-U显微镜上可视化并捕获荧光绿(TAS38R)和蓝色(DAPI)。
图9描绘根据本发明的各个实施方案，在培养的HuTu-80细胞中通过已知的苦味配体、植物化学物质和脂肪酸配体刺激GLP-1释放。图A.用石榴鞣花单宁代谢物和枇杷提取物TP成分刺激；图B.通过短链和长链游离脂肪酸活化FFAR。HuTu-80细胞未经处理(零时间)或用所指示浓度的媒介物和各种植物化学物质处理30分钟。收集条件培养基并冷冻直到GLP-1测量，如下文方法中所述。值是平均值±SE，N＝3，*P＜0.05，**P＜0.01
图10描绘根据本发明的各个实施方案，以两种浓度施用BPx1苦味寡肽后在健康小鼠中的体内GLP-1释放。
图11描绘根据本发明的各个实施方案，当抑制TAS2R表达时，在BPxl情况下GLP-1释放的增加降低，从而表明GLP-1释放是由BPx1进行的TAS2R38活化介导的。
发明详述
本文引用的所有参考文献都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Allen等人，Remington：The Science and Practice of Pharmacy第22版，Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人，Introduction toNanoscience and Nanotechnology，CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，修订版，J.Wiley&Sons(NewYork，NY 2006)；Smith，March’s Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanismsand Structure第7版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2013)；Singleton，Dictionary of DNAand Genome Technology第3版，Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor，NY 2012)，为本领域的技术人员提供对本申请中使用的许多术语的一般指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield，AntibodiesA Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY，2013)；和Milstein，Derivation of specific antibody-producing tissueculture and tumor lines by cellfusion，Eur.J.Immunol.1976年7月，6(7)：511-9；Queen和Selick，Humanized immunoglobulins，美国专利号5,585,089(1996年12月)；以及Riechmann等人，Reshaping human antibodies for therapy，Nature 1988年3月24日，332(6162)：323-7。
关于儿科学的参考文献，参见Schwartz等人，The 5-Minute Pediatric Consult第4版，Lippincott Williams&Wilkins，(2005年6月16日)；Robertson等人，The HarrietLane Handbook：A Manual for Pediatric House Officers第17版，Mosby(2005年6月24日)；以及Hay等人，Current Diagnosis and Treatment in Pediatrics(CurrentPediatrics Diagnosis&Treatment)第18版，McGraw-Hill Medical(2006年9月25日)。
本领域技术人员将认识到，与本文所描述的方法和材料类似或等效的许多方法和材料可用于实践本发明。实际上，本发明决不限于本文所述方法。出于本发明的目的，下文定义以下术语。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”关于可用于实施方案的组合物、方法及其各自的组分使用，其仍然为包括未指定的要素的开放式的术语，无论所述要素是否必需。本领域技术人员应了解，一般而言，本文使用的术语通常意图为“开放”术语(例如术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。
除非另行指出，在描述本申请的特定实施方案的背景中(特别是在权利要求的背景中)使用的术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”和类似的引用可以理解为涵盖单数和复数。本文中列举的数值范围仅仅希望作为单独提及落入范围中的每个独立数值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独数值均并入到本说明书中，如同本文单独列举每个单独数值一样。除非本文另外指明或上下文明显矛盾，否则可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法。使用相对于本文中的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)仅仅是希望更好地阐明本申请而不对另外要求的本申请的范围施加限制。缩写“e.g.”源于拉丁语例如(exempli gratia)并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。不应该将说明书中的语言解释为表示对实践本申请必需的任何未要求的要素。
“有益的结果”可以包括，但决不限于，减轻或缓和所述疾病状态的严重程度、预防所述疾病状态恶化、预防所述疾病状态发展、降低患者患所述疾病状态的几率以及延长患者寿命或预期寿命。有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、缺陷程度的减小、糖尿病进展的稳定化(即不恶化)状态、糖尿病的延迟或减缓以及与糖尿病相关的症状的改善或缓和。治疗还包括与未接受治疗的受试者相比，受试者的死亡率降低或寿命增加。
如本文所用的“施用(Administering)”和/或“施用(administer)”是指用于将药物组合物递送至患者的任何途径。在一个实施方案中，本文所述的组合物肠内施用至小肠。递送途径可包括非侵入性口服(通过口)、局部(皮肤)、经粘膜(鼻、颊/舌下、阴道、眼部和直肠)和吸入途径以及胃肠外途径，以及本领域中已知的其它方法。“胃肠外”是指通常与注射相关的递送途径，包括眶内、输注、动脉内、颈动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊椎内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液剂或混悬剂形式，或呈冻干粉剂形式。
如本文所用的术语“有效量”是指包含如本文公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物减轻疾病或病症的至少一种或多种症状的量，并且涉及足够量的药物组合物以提供所需的作用。如本文所用的短语“治疗有效量”是指以可适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗病症的组合物的足够量。
症状的治疗性或预防性显著减轻是与对照或未治疗的受试者或在施用本文所述的寡肽之前受试者的状态相比，测量参数的例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。测量的或可测量的参数包括疾病的临床上可检测的标志物，例如生物标志物的水平升高或降低以及与糖尿病的症状或标志物的临床上接受的量表相关的参数。然而，应理解，如本文公开的组合物和制剂的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。所需的确切量将根据诸如所治疗的疾病的类型、受试者的性别、年龄和体重等因素而变化。
如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科的种例如家养猫、犬科的种例如狗、狐狸、狼。术语“患者”、“个体”和“受试者”可在本文中互换使用。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。此外，本文所述的方法可用于治疗驯养动物和/或宠物。所述术语不指示特定年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿无论雄性或雌性都意图包括在此术语的范围内。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善(amelioration)”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的病状的进展或严重程度。术语“治疗”包括减轻或缓解病状、疾病或病症如糖尿病(如2型糖尿病)的至少一种副作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗是总体上“有效的”。或者，如果疾病的进展得以减轻或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还包括在不进行治疗的情况下所预期到使症状的进展或恶化中止或至少减慢。有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)。
如本文所用的“调节(Modulation)”或“调节(modulates)”或“调节(modulating)”是指反应的上调(即活化或刺激)、下调(即抑制或遏制)或组合或分开的两者。
如本文所用的“药学上可接受的载体”是指适用于本发明的常规药学上可接受的载体。
如本文所用的“促进(Promote)”和/或“促进(promoting)”是指细胞或生物体的特定行为的增加。
如本文所用的“治疗剂”是指用于例如治疗、抑制、预防、减轻疾病的作用，降低疾病的严重程度，降低患疾病的可能性，减缓疾病的进展和/或治愈疾病的药剂。由治疗剂靶向的疾病包括但不限于糖尿病，如2型糖尿病。
如本文所用的“肽模拟物”是被设计用于模拟蛋白质功能的小蛋白质样链。它们可以是现有肽的修饰，或者新设计来模拟已知肽。它们可以是例如类肽和/或β-肽和/或D-肽。
“重组病毒”是指已被遗传改变的病毒(例如，通过将异源核酸构建体添加或插入到所述颗粒中)。
“基因”或“编码序列”或“编码”具体蛋白质或肽的序列是当置于适当调控序列的控制下时在体外或体内转录(在DNA的情况下)并且翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。基因的边界由在5′(即氨基)末端的起始密码子以及在3′(即羧基)末端的翻译终止密码子来确定。基因可包括但是不限于来自原核或真核mRNA的eDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常将位于基因序列的3′。
术语“控制元件”共同地指代启动子区、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们共同提供编码序列在受体细胞中的复制、转录和翻译。并非所有这些控制元件需要总是存在，只要所选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。
术语“启动子区”在本文中以其普通含义用于指包括DNA调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3′方向)编码序列的转录的基因。
“可操作地连接”是指其中所描述的组件被配置成执行其通常功能的元件的排列。因此，可操作地连接至编码序列的控制元件能够实现编码序列的表达。控制元件不必是与编码序列邻近的，只要它起作用指导编码序列的表达即可。因此，例如，介入尚未翻译但是已经转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，并且启动子序列仍然可被认为“可操作地连接”至编码序列。
“基因转移”或“基因递送”是指用于将外来DNA可靠地插入宿主细胞中的方法或系统。此类方法可产生非整合转移的DNA的瞬时表达、染色体外复制和转移的复制子(例如，附加体)的表达，或转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。基因转移提供一种治疗获得性和遗传性疾病的独特方法。许多系统已被开发用于将基因转移到哺乳动物细胞中。参见，例如，美国专利号5,399,346。用于基因转移的熟知媒介物的实例包括腺病毒和重组腺病毒(RAd)、腺相关病毒(AAV)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)和慢病毒(LV)。
如本文所用的“遗传修饰的细胞”、“遗传工程改造的细胞”或“修饰的细胞”是指表达具有BPxl、BPx2、BPx3、BPx4或其组合、或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物中的任何一种或多种的序列的多核苷酸的细胞。BPxl由序列YGLF(SEQ ID NO：1)组成。BPx2由序列YPFPGPIPN(SEQ ID NO：2)组成。BPx3由氨基酸序列IPAVF(SEQ ID NO：3)组成。BPx4由序列LLF组成。在一些实施方案中，BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物与增加肠保留的药剂如纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合缀合。
如本文所用的“裸DNA”是指编码具有BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其组合、或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物中的任何一种或多种的序列的多肽的DNA，其以适当取向克隆在合适的表达载体中以用于表达。可使用的病毒载体包括但不限于SIN慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、杂合载体和/或质粒转座子(例如睡美人转座子系统)或基于整合酶的载体系统。可与本发明的替代实施方案一起使用的其它载体对于本领域的技术人员将是显而易见的。
如本文所用的“多核苷酸”包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成的DNA、合成的RNA和/或tRNA。
术语“转染”在本文中用于指细胞对外来DNA的摄取。当外源DNA被引入细胞膜内部时，细胞被“转染”。许多转染技术通常是本领域中已知的。参见，例如，Graham等人Virology，52：456(1973)；Sambrook等人Molecular Cloning，a laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratories，New York(1989)；Davis等人，Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier(1986)；以及Chu等人Gene 13：197(1981)。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分(如质粒载体和其它核酸分子)引入合适的宿主细胞中。所述术语是指遗传物质的稳定和瞬时摄取两者。
如本文所用的“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可通过其将多核苷酸序列(例如外源基因)引入宿主细胞中以便转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)的媒介物。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。
如本文所用的“肠”是指肠道。含有GLP-1和PYY的L细胞主要位于远端小肠(回肠)和结肠中。
如本文所用的“苦味肽”是指味苦的肽分子。BP是指苦味肽。
如上所述，在减肥手术后观察到餐后胰高血糖素样肽-1(GLP-1)水平升高。因为GLP-1的增加具有显著葡萄糖调控作用，所以手术对GLP-1分泌的作用的潜在分子机制可在糖尿病消退中起重要作用。减肥手术(特别是将摄入的营养物质直接送至中小肠的减肥手术)改变食物消化，以使得通常在小肠上段中完成的营养物质的消化和吸收移动到小肠的下部，负责GLP-1释放的肠内分泌L细胞位于小肠的下部中。因此，远端小肠中的内腔内容物将在手术后具有部分消化的膳食组分，并且未消化的食物的分子成分可能活化在这些细胞上的受体以引发GLP-1释放。一些营养物质受体如味觉受体和脂肪酸受体或它们的效应子已被证明存在于人和动物组织中的这些L-细胞中。已经鉴定出若干源自乳清蛋白(来源于β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、白蛋白和β-酪蛋白)的水解物的基于食物的苦味寡肽，所述寡肽可在L-细胞的体外模型中单独引起GLP-1释放。这些肽可肠内递送至靶受体所位于的小肠中。寡肽的相互作用将引起GLP-1释放到血液中，从而引起糖尿病消退。通过模拟肥胖手术后糖尿病消退背后的潜在机制，所述治疗对消退2型糖尿病具有广阔前景。
除了肥胖手术受试者的体重减轻之外，减肥手术还在2型糖尿病(T2DM)消退中提供了非常有利的结果。糖尿病消退通常在显著体重减轻之前发生，并且在手术的数天或数周内发生。这表明在这些手术后响应于食物摄取的代谢事件的根本性转变。这些手术对体重减轻和糖尿病预防的长期预后的有效性已经带来了跟踪手术患者和对照患者仅仅数周以及长达10年的追踪代谢标志物的若干纵向研究。若干研究已经表明β细胞葡萄糖敏感性增加与体重减轻无关。葡萄糖敏感性和GLP-1反应的相互作用是复杂的。研究表明，过度GLP-1反应引起改善的β细胞功能，且因此在手术后第一天内的葡萄糖耐量改善方面起关键作用。在此时间段之后，改善的肝胰岛素敏感性被认为在葡萄糖耐量方面发挥作用。一项研究显示了通过在减肥手术后患者中使用Exendin 9-39(一种GLP-1受体拮抗剂)，GLP-1在标准化葡萄糖水平中的具体作用。此研究发现拮抗GLP-1R导致β-细胞葡萄糖敏感性回到术前水平。
因为减肥手术(特别是用Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)绕过近端肠)将膳食大量营养素的消化置于中段小肠中，所以存在到达回肠和结肠并且通常在近端小肠中完全消化和吸收的更大浓度的中间消化产物(包括寡肽)。由于在进餐期间对内腔内容物采样的不切实际和有风险的性质，所以内腔内容物的消化产物概况极具挑战性。本发明人认为，呈递至内腔表面的寡肽可至少部分地负责对旁路手术后的测试膳食的过度GLP-1反应。本发明人还发现苦味受体(尤其是TAS2R38)存在于小肠中的L细胞上，所以他们认为苦味寡肽可与L细胞上的TAS2R38和可能的其它苦味受体相互作用以引起GLP-1的释放。
乳蛋白的胃蛋白酶/胰蛋白酶/糜蛋白酶消化物，如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、白蛋白和β-酪蛋白产生苦味的寡肽产物(Liu等人J.Agric.Food Chem.2014，62，5719-5725)。本发明人合成了这些寡肽中的四种，并且发现它们以高效力增强GLP-1的释放。发明者的数据表明，递送至回肠或结肠的低浓度的食物来源的苦味肽可通过从L细胞释放GLP-1(和肽酪氨酸酪氨酸(PYY))而引起有利于糖尿病控制的代谢反应。本发明人假设减肥手术(特别是RYGB)后的T2DM消退可通过将此类寡肽递送至远端小肠来模拟，并且设想寡肽激动L细胞上的GPCR，从而产生增强的GLP-1反应和随之发生的T2DM消退。
苦味受体TAS2R38是G蛋白偶联受体(GPCR)，其已经在诸如胃肠(GI)系统、呼吸系统和脑的许多口外部位发现，但是其在这些位置的功能仅开始被理解。为了探测受体的潜在代谢作用，进行人回肠组织的免疫组织化学检测，其显示受体与L细胞中的胰高血糖素样肽1(GLP-1)共定位。
本文描述的本发明提出糖尿病的治疗。因为本发明所提出的机制涉及面向胃肠道的内腔的受体，所以建议如果将这些寡肽分子(例如BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其组合)配制成用于肠内递送，则它们将是有效的。存在使用GLP-1类似物和方法来通过抑制分泌GLP-1分解而延长其寿命的治疗。然而，不存在如本文所述的解决方案。因为本发明使用身体自身的内分泌系统来治疗糖尿病，所以这是有利的，因为目前的疗法具有所使用的药剂的不利作用。实例是一直与诸如胰腺炎和胰腺癌的显著不利作用相关的GLP-1模拟型药剂。
本文提供药物组合物，其包含增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放的药剂和可接受的载体/赋形剂，由所述药剂和可接受的载体/赋形剂组成或基本上由所述药剂和可接受的载体/赋形剂组成。在一些实施方案中，所述药剂是苦味的寡肽，从而表明它们与舌上的苦味感受器相互作用，所述苦味感受器也表现在胃肠道的回肠和结肠中。在一些实施方案中，所述苦味寡肽是如本文所述的BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其组合或其类似物、药物等效物和/或肽模拟物中的任何一种或多种。在本发明的所有实施方案的某些方面，所述寡肽还包括融合蛋白。具体地说，所述融合蛋白包含与表位标签、半衰期延长剂或其组合中的任何一种或多种融合的本文所述的寡肽。在某些实施方案中，所述一种或多种寡肽引起肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％增加。当治疗性地施用时，所述寡肽组合物通常还包含药学上可接受的溶液或载体。在一些方面，多肽或蛋白质(例如，BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其组合)是包含非天然存在的氨基酸的“修饰的多肽”。在一些方面，所述多肽包含天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸的组合，并且在一些实施方案中，所述肽仅包含非天然存在的氨基酸。
在一个实施方案中，致使肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)增加的药剂包含氨基酸序列YGLF(BPx1；SEQ ID NO：1)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BPx1或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物与增加肠保留的药剂缀合。增加肠保留的药剂的实例包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。
在另一个实施方案中，致使肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)增加的药剂包含氨基酸序列YPFPGPIPN(BPx2；SEQ ID NO：2)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BPx2或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物与增加肠保留的药剂缀合。增加肠保留的药剂的实例包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。
在另一实施方案中，致使肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)增加的药剂包含氨基酸序列IPAVF(BPx3；SEQ ID NO：3)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BPx3或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物与增加肠保留的药剂缀合。增加肠保留的药剂的实例包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。
在另一实施方案中，致使肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)增加的药剂包含氨基酸序列LLF(BPx4)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BPx4或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物与增加肠保留的药剂缀合。增加肠保留的药剂的实例包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。
在一些实施方案中，所述BPx1、BPx2、BPx3、BPx4肽或其组合或其类似物、药物等效物和/或肽模拟物是修饰的肽。“修饰的肽”可包括将内酰胺桥、头-尾环化、非天然氨基酸并入本发明的肽中，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸，或者一个或多个D-氨基酸并入肽(或组合物的其它组分，蛋白酶识别序列除外)在某些情况下是理想的。与含L-氨基酸的形式相比，含有D-氨基酸的肽在体外或体内表现出增加的稳定性。因此，当需要或要求更大的体内或细胞内稳定性时，并入D-氨基酸的肽的构建可以是特别有用的。更具体地说，D-肽对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性，从而在连接的药物和缀合物的更好口服经上皮和经皮递送、改善的膜-永久性复合物的生物利用度(关于进一步论述，参见下文)以及延长的血管内和间质寿命是所期望时，提供此类性质。D-异构体肽的使用还可增强连接的药物和其它货物分子的经皮和口服经上皮递送。此外，D-肽不能有效地加工以用于主要组织相容性复合体II类限制性呈递至T辅助细胞，且因此在整个生物体中不太可能诱导体液免疫应答。因此，可使用例如细胞穿透肽序列的D-异构体形式、裂解位点的L-异构体形式和治疗性肽的D-异构体形式来构建肽缀合物。因此，在一些实施方案中，所公开的肽包含L氨基酸和D氨基酸，其中包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个D-氨基酸。在某些方面，所述肽包含多于10个D-氨基酸，并且在某些方面，所述肽的所有氨基酸都是D-氨基酸。
在一些实施方案中，致使肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放增加的药剂是BPx1肽、BPx2肽、BPx3肽、BPx4肽或其组合、或其类似物、药物等效物和/或肽模拟物的逆向-反转肽。“逆向-反转肽”是指在至少一个位置上具有肽键的方向的反转的肽，即相对于氨基酸的侧链的氨基和羧基末端的反转。因此，逆向-反转类似物具有反转的末端和反转的肽键方向，同时大致维持如在天然肽序列中的侧链的拓扑结构。逆向-反转肽可含有L-氨基酸或D-氨基酸、或L-氨基酸与D-氨基酸的混合物，直至所有氨基酸为D-异构体。部分逆向-反转肽类似物是其中序列的仅一部分被反转并被对映体氨基酸残基置换的多肽。由于这种类似物的逆向-反转部分具有反转的氨基和羧基末端，所以逆向-反转部分侧翼的氨基酸残基分别被侧链-类似的α-取代的偕二氨基甲烷和丙二酸酯置换。已经发现，细胞穿透肽的逆向-反转形式在跨膜易位方面与天然形式一样有效地起作用。逆向-反转肽类似物的合成描述于Bonelli，F.等人，Int J Pept Protein Res.24(6)：553-6(1984)；Verdini，A和Viscomi，G.C，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1：697-701(1985)；以及美国专利号6,261,569中，所述文献以引用的方式整体并入本文。已经描述了用于部分逆向-反转肽类似物的固相合成的方法(EP 97994-B)，其也以引用的方式整体并入本文。
本文所述的肽的其它变体(例如，BPx1、BPx2、BPx3和BPx4)可包含保守取代的序列，从而意味着原始肽的一个或多个氨基酸残基被不同的残基置换，并且保守取代的肽保留所需的生物活性，即基本上等效于原始肽的增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)的释放的能力。保守取代的实例包括不改变BPx1、BPx2、BPx3和/或BPx4的二级和/或三级结构的氨基酸的取代，不改变整体或局部疏水特性的取代，不改变整体或局部电荷的取代，被等效侧链大小的残基取代，或被具有相似反应性基团的侧链取代。
其它实例涉及在物种之间的亲本序列中未进化上保守的氨基酸的取代。有利地，在一些实施方案中，当产生保守取代的序列时，这些保守的氨基酸和结构不被改变。
给定氨基酸可被具有相似生理化学特征的残基置换，例如用一个脂族残基取代另一个(例如Ile、Val、Leu或Ala彼此取代)，或者用一个极性残基取代另一个(如Lys与Arg之间；Glu与Asp之间；或Gln与Asn之间)。其它此类保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代或具有相似侧链体积的残基的取代是众所周知的。包含保守氨基酸取代的分离的肽可在本文所述的任何一种测定中进行测试，以确认所需的活性，例如肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)的释放增加被保留，如通过本文别处所述的测定所测定。
氨基酸可根据其侧链的性质的相似性进行分组(在A.L.Lehninger，在Biochemistry，第二版，第73-75页，Worth Publishers，New York(1975)中)：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，天然存在的残基可基于共同侧链性质分为几组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin、Ala、Tyr、His、Pro、Gly；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、Pro、His或羟基脯氨酸。非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。
用于本文所述变体的特别优选的保守取代是如下：Ala取代为Gly或Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或His；Asp取代为Glu或Asn；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或Pro；His取代为Asn或Gln；Ile取代为Leu或Val；Leu取代为Ile或Val；Lys取代为Arg、Gln或Glu；Met取代为Leu、Tyr或Ile；Phe取代为Met、Leu或Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr或Phe；Tyr取代为Phe或Trp；和/或Phe取代为Val、Tyr、Ile或Leu。通常，保守取代涵盖与具有类似物理化学性质的残基的残基交换(即用疏水性残基取代另一个疏水性氨基酸)。
不参与维持如本文所述的分离的肽的适当构象的任何半胱氨酸残基还可被(通常用丝氨酸)取代以便改进分子的氧化稳定性并且预防异常交联。相反，一个或多个半胱氨酸键可如本文所述添加至分离的肽以改进其稳定性或促进多聚化。
如本文所用，“功能片段”是包含至少3个、至少4个或至少5个氨基酸并且可根据本文所述的测定增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放的肽的片段或区段。功能片段可包含本文公开的序列的保守取代，只要它们保持增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放的功能。这可通过检测肽的亲本(例如原始)型式的至少30％、至少40％或至少50％的释放增加来进行测试。
为了增强肽进入细胞的稳定性、生物利用度和/或递送，肽可被修饰。例如，在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可包含至少一个肽键置换。单个肽键或多个肽键，例如2个键、3个键、4个键、5个键或6个或更多个键或者所有肽键可被置换。如本文所述的分离的肽可包含一种类型的肽键置换或多种类型的肽键置换，例如2种类型、3种类型、4种类型、5种类型或更多类型的肽键置换。肽键置换的非限制性实例包括脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲、三氟乙胺、邻-(氨基烷基)-苯乙酸、对-(氨基烷基)-苯乙酸、间-(氨基烷基)-苯乙酸、硫代酰胺、四唑、硼酸酯、烯属基团及其衍生物。在一些实施方案中，BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物与增加肠保留的药剂缀合。增加肠保留的药剂的实例包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可包含通常存在于由活生物体产生的多肽和/或蛋白质中的天然存在的氨基酸，例如Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Glu(E)、Lys(K)、Arg(R)和His(H)。在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可包含替代氨基酸。替代氨基酸的非限制性实例包括D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、他汀类、1，2，3，4，-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、对氟苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和叔丁基甘氨酸)、二氨基丁酸、7-羟基-四氢异喹啉羧酸、萘基丙氨酸、联苯基丙氨酸、环己基丙氨酸、氨基-异丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、叔-亮氨酸、四氢异喹啉羧酸、哌可酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、环己基甘氨酸、脱氢亮氨酸、2，2-二乙基甘氨酸、1-氨基-1-环戊烷羧酸、1-氨基-1-环己烷羧酸、氨基-苯甲酸、氨基-萘甲酸、γ-氨基丁酸、二氟苯丙氨酸、哌啶甲酸、α-氨基丁酸、噻吩基-丙氨酸、叔丁基甘氨酸、三氟缬氨酸、六氟亮氨酸、氟化类似物、叠氮化物修饰的氨基酸、炔烃修饰的氨基酸、氰基修饰的氨基酸及其衍生物。
在一些实施方案中，可修饰分离的肽，例如可将部分添加至一个或多个组成所述肽的氨基酸中。在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可包含一个或多个部分分子，例如每个肽1个或多个部分分子、每个肽2个或更多个部分分子、每个肽5个或更多个部分分子、每个肽10个或更多个部分分子、或每个肽更多个部分分子。在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可包含一种或多种类型的修饰和/或部分，例如1种类型的修饰、2种类型的修饰、3种类型的修饰或更多种类型的修饰。修饰和/或部分的非限制性实例包括PEG化；糖基化；HES化；ELP化；脂化；乙酰化；酰胺化；封端修饰；氰基；磷酸化；以及环化。在一些实施方案中，封端修饰可包括N-末端的乙酰化、N-末端酰化和N-末端甲酰化。在一些实施方案中，封端修饰可包括C-末端的酰胺化、引入C-末端醇、醛、酯和硫酯部分。
如本文所述的分离的肽可偶联和或连接至第二功能分子、肽和/或多肽。在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽与靶向分子偶联。在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽通过将所述肽和靶向分子表达为融合肽，任选地用插入其间的肽接头序列而偶联至靶向分子。如本文所用，“靶向分子”可以是任何分子，例如肽、抗体或其片段、抗原、靶向脂质体或可与特定细胞或组织类型结合或被特定细胞或组织类型结合的小分子。作为非限制性实例，如果希望将本文所述的分离的肽靶向肠(例如，以治疗、抑制糖尿病如2型糖尿病，降低其严重程度和/或减缓其进展)，则包含BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物中的任一者的氨基酸序列的分离的肽可与对小肠和结肠具有特异性的抗体或其片段(例如如美国专利公布2005/0287066中所述的抗体或抗体片段)偶联。作为非限制性实例，如果希望将本文所述的分离的肽靶向肠以增加肠激素如GLP-1和/或PYY的释放，以治疗、抑制糖尿病(如2型糖尿病)、降低其严重程度和/或减缓其进展，则包含BPxl、BPx2、BPx3、BPx4或其变体、衍生物、药物等效物、肽模拟物或类似物中的任一者的氨基酸序列的分离的肽可与对肠具有特异性的抗体或其片段(例如IgA抗体)偶联。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可以是融合肽或多肽。融合多肽可包含插入在如本文所述的包含氨基酸序列LLF衍生物、变体、功能片段、前药或其类似物的肽或包含氨基酸序列SEQ ID NO：1-3或其衍生物、变体、功能片段、前药或类似物的肽的第一结构域与融合肽的至少第二结构域之间的肽接头结构域。在配偶体结构域在组成部分的片段互补后形成的情况下，第一肽结构域可以是N末端结构域或C末端结构域或内部序列。合成或产生融合蛋白的方法是本领域普通技术人员所熟知的。如本文所用的术语“融合蛋白”是指两种或更多种蛋白质的重组蛋白。融合蛋白可例如通过将编码一种蛋白质的核酸序列与编码另一种蛋白质的核酸连接，以使得它们构成单一开放阅读框而产生，所述开放阅读框可在细胞中翻译成含有所有预期蛋白质的单一多肽。蛋白质的排列顺序可变化。融合蛋白可包含表位标签或半衰期延长剂。表位标签包括生物素、FLAG标签、c-myc、血凝素、His6、地高辛、FITC、Cy3、Cy5、绿色荧光蛋白、V5表位标签、GST、β-半乳糖苷酶、AU1、AU5和抗生物素蛋白。半衰期延长剂包括Fc结构域和血清白蛋白。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可以是药学上可接受的前药。如本文所用，“前药”是指可通过一些化学或生理过程(例如酶过程和代谢水解)转化为治疗剂的化合物。因此，术语“前药”还是指药学上可接受的生物活性化合物的前体。当向受试者施用时，前药可以是无活性的(即酯)，但在体内转化为活性化合物，例如，通过水解成游离羧酸或游离羟基。前药化合物通常在生物体中提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点。术语“前药”还旨在包括任何共价键合的载体，当对受试者施用所述前药时，所述前药在体内释放活性化合物。活性化合物的前药可通过以在常规操作中或在体内将修饰物裂解成母体活性化合物的方式修饰存在于所述活性化合物中的官能团来制备。前药包括其中羟基、氨基或巯基与当对受试者施用所述活性化合物的前药时分别裂解以形成游离羟基、游离氨基或游离巯基的任何基团键合的化合物。前药的实例包括(但不限于)在活性化合物中的醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或在活性化合物中的胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。参见Harper，“Drug Latentiation″于Jucker，编辑Progress in DrugResearch 4：221-294(1962)中；Morozowich等人，“Application of Physical OrganicPrinciples to Prodrug Design″于E.B.Roche编辑Design of BiopharmaceuticalProperties through Prodrugs and Analogs，APHA Acad.Pharm.Sci.40(1977)中；Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design，Theory and Application，E.B.Roche，编辑，APHA Acad.Pharm.Sci.(1987)；Design of Prodrugs，H.Bundgaard，Elsevier(1985)；Wang等人“Prodrug approaches to the improved delivery ofpeptide drug″于Curr.Pharm.Design.5(4)：265-287(1999)中；Pauletti等人(1997)Improvement in peptide bioavailability：Peptidomimetics and ProdrugStrategies，Adv.Drug.Delivery Rev.27：235-256；Mizen等人(1998)“The Use ofEstersas Prodrugs for Oral Delivery of(3-Lactam antibiotics，″Pharm.Biotech.ll，：345-365；Gaignault等人(1996)“Designing Prodrugs and Bioprecursors I.CarrierProdrugs，″Pract.Med.Chem.671-696；Asgharnejad，“Improving Oral Drug Transport″，于Transport Processes in Pharmaceutical Systems中，G.L.Amidon，P.I.Lee和E.M.Topp，编辑，Marcell Dekker，第185-218页(2000)；Balant等人，“Prodrugs for theimprovement of drug absorption via different routes of administration″，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.，15(2)：143-53(1990)；Balimane和Sinko，“Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleosideanalogues″，Adv.Drug Delivery Rev.，39(1-3)：183-209(1999)；Browne，“Fosphenytoin(Cerebyx)″，Clin.Neuropharmacol.20(1)：1-12(1997)；Bundgaard，“Bioreversiblederivatization of drugs—principle and applicability to improve thetherapeutic effects of drugs″，Arch.Pharm.Chemi 86(1)：1-39(1979)；Bundgaard H.“Improved drug delivery by the prodrug approach″，Controlled Drug Delivery 17：179-96(1987)；Bundgaard H.“Prodrugs as a means to improve the delivery ofpeptide drugs″，Arfv.Drug Delivery Rev.8(1)：1-38(1992)；Fleisher等人“Improvedoral drug delivery：solubility limitations overcome by the use of prodrugs″，Arfv.Drug Delivery Rev.19(2)：115-130(1996)；Fleisher等人“Design of prodrugsfor improved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting″，Methods Enzymol.112(Drug Enzyme Targeting，Pt.A)：360-81，(1985)；Farquhar D，等人，“Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups″，Pharm.Sci.，72(3)：324-325(1983)；Freeman S，等人，“Bioreversible Protection for the Phospho Group：Chemical Stability and Bioactivation of Di(4-acetoxy-benzyl)Methylphosphonatewith Carboxyesterase，″Chem.Soc.，Chem.Commun.，875-877(1991)；Friis和Bundgaard，“Prodrugs of phosphates and phosphonates：Novel lipophilic alphaacyloxyalkylester derivatives of phosphate-or phosphonate containing drugs masking thenegative charges of these groups″，Eur.J.Pharm.Sci.4：49-59(1996)；Gangwar等人，“Pro-drug，molecular structure and percutaneous delivery″，Des.Biopharm.Prop.ProdrugsAnalogs，[Symp.]Meeting Date 1976，409-21.(1977)；Nathwani和Wood，“Penicillins：a curTent review of their clinical pharmacologyand therapeutic use″，Drugs 45(6)：866-94(1993)；Sinhababu和Thakker，“Prodrugs ofanticancer agents″，Adv.Drug Delivery Rev.19(2)：241-273(1996)；Stella等人，“Prodrugs.Do they have advantages in clinical practice？″，Drugs 29(5)：455-73(1985)；Tan等人“Development and optimization of anti-HIV hueleoside analogsand prodrugs：A review of their cellular pharmacology，structure-activityrelationships and pharmacokinetics″，Adv.Drug Delivery Rev.39(1-3)：117-151(1999)；Taylor，“Improved passive oral drug delivery via prodrugs″，Adv.DrugDelivery Rev.，19(2)：131-148(1996)；Valentino和Borchardt，“Prodrug strategies toenhance the intestinal absorption of peptides″，Drug Discovery Today 2(4)：148-155(1997)；Wiebe和Knaus，“Concepts for the design of anti-HIV nucleosideprodrugs for treating cephalic HIV infection″，Adv.DrugDelivery Rev..·39(1-3)：63-80(1999)；Waller等人，“Prodrugs″，Br.J. Clin.Pharmac.28：497-507(1989)，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可以是药学上可接受的溶剂合物。术语“溶剂合物”是指在固体状态下的如本文所述的分离的肽，其中合适溶剂的分子并入晶格中。用于治疗性施用的合适溶剂在所施用的剂量下是生理上可耐受的。用于治疗性施用的合适溶剂的实例是乙醇和水。当水为溶剂时，溶剂合物被称为水合物。通常，通过将化合物溶解在适当的溶剂中并通过冷却或使用抗溶剂分离溶剂合物来形成溶剂合物。溶剂合物通常在环境条件下干燥或共沸。
在一些实施方案中，如本文所述的分离的肽可以是非结晶的，即非晶的固体形式。
一方面，本文描述一种包含编码如本文所述的肽的核酸的载体。如本文所用，术语“载体”是指被设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒或非病毒。术语“载体”涵盖当与适当的控制元件缔合时能够复制并且可将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。可获得适用于将外源基因转移到靶哺乳动物细胞中的许多载体。所述载体可以是附加型的，例如质粒、病毒来源的载体如巨细胞病毒、腺病毒等，或者可通过同源重组或随机整合被整合到靶细胞基因组中，例如逆转录病毒来源的载体如MMLV、HIV-1、ALV等。许多病毒载体是本领域中已知的，并且可用作核酸调节化合物到细胞中的载体。例如，含有编码多肽的核酸的构建体可被整合并包装至非复制性缺陷型病毒基因组如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)或其它(包括逆转录病毒和慢病毒载体)中以用于感染或转导至细胞中。或者，所述构建体可并入能够发生附加体型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。并入到载体中的核酸可与表达控制序列可操作地连接，以使得表达控制序列控制并调控所述多核苷酸序列的转录和翻译。
如本文所用，术语“表达载体”是指从载体上与转录调控序列连接的序列指导RNA或多肽的表达的载体。所表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可包含另外的元件，例如，表达载体可具有两种复制系统，因此允许其被保持在两种生物体中，例如在人细胞中用于表达并且在原核宿主中进行克隆和扩增。
如本文所用的术语“转染”用于将外源核酸(如编码如本文所述的肽的核酸序列)引入到细胞中的方法，如化学方法。如本文所用，术语转染不涵盖将外源核酸引入细胞中的基于病毒的方法。转染方法包括物理治疗(电穿孔、纳米颗粒、磁转染)和基于化学的转染方法。基于化学的转染方法包括但不限于使用环糊精、聚合物、脂质体、纳米颗粒、阳离子脂质或其混合物(例如DOPA、Lipofectamine和UptiFectin)和阳离子聚合物，如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺的方法。
如本文所用，术语“病毒载体”是指包含病毒来源的至少一种元件并且具有被包装至病毒载体颗粒中的能力的核酸载体构建体。病毒载体可含有代替非必需病毒基因的编码如本文所述的肽的核酸。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中。许多形式的病毒载体是本领域中已知的。当用于提及病毒载体时，术语“无复制能力”意味着病毒载体不能进一步复制和包装其基因组。例如，当受试者的细胞用无复制能力的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子感染时，异源(也称为转基因)基因在患者的细胞中表达，但是rAAV是复制缺陷型的(例如，缺乏编码用于包装病毒的必需蛋白质的辅助基因)，并且病毒颗粒不能在患者的细胞中形成。如本文所用的术语“转导”是指使用病毒颗粒或病毒来将外源核酸引入细胞中。
逆转录病毒如慢病毒为递送编码目标药剂的核酸序列提供便利的平台。可使用本领域中已知的技术来将选定的核酸序列插入到载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。重组病毒然后可分离并被递送至细胞，例如，体外或离体。逆转录病毒系统是本领域中熟知的，并且描述于例如美国专利号5,219,740中；Kurth和Bannert(2010)“Retroviruses：MolecularBiology，Genomics and Pathogenesis″Calster Academic Press(ISBN：978-1-90455-55-4)；以及Hu和Pathak Pharmacological Reviews 200052：493-512；其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，目标核苷酸序列被插入到基于腺病毒的表达载体中。与整合至宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒持续存在于染色体外，从而使与插入诱变相关的风险最小化(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57：267-74；Bett等人(1993)J.Virol.67：5911-21；Mittereder等人(1994)Human Gene Therapy 5：717-29；Seth等人(1994)J.Virol.68：933-40；Barr等人(1994)Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6：616-29；以及Rich等人(1993)Human Gene Therapy 4：461-76)。腺病毒载体在基因疗法中具有若干优点。它们感染各种各样的细胞，具有广泛宿主范围，表现出高的感染效率，指导高水平的异源序列的表达，并实现这些序列在体内的长期表达。病毒作为无细胞的病毒粒子是完全感染性的，且因此不需要注射生产细胞系。关于安全性，腺病毒与严重的人病理学不相关，并且可通过病毒基因组的早期区1(“E1”)中的缺失而使源自病毒的重组载体为复制缺陷的。腺病毒也可相对容易地大量产生。由于所有这些原因，至少E1区已被缺失并被目标基因置换的源自人腺病毒的载体已广泛用于临床前和临床阶段的基因疗法实验。用于与本文所述的组合物和方法一起使用的腺病毒载体可源自各种腺病毒血清型中的任一种，包括但不限于超过40种腺病毒血清型菌株中的任一种，如血清型2、5、12、40和41。本文所述的方法中使用的腺病毒载体通常是复制缺陷型的，并含有在合适启动子控制下的目标序列。例如，美国专利号6,048,551(其以引用的方式整体并入本文)描述了复制缺陷型腺病毒载体，所述载体包含在劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子控制下的人基因。具有各种血清型并且包含不同启动子系统的其它重组腺病毒可由本领域技术人员创建。参见例如美国专利号6,306,652，其以引用的方式整体并入本文。用于递送核酸序列的其它有用的基于腺病毒的载体包括但不限于：如在美国专利号6,306,652中描述的“最小”腺病毒载体，其保留用于衣壳化所需的病毒基因组的至少一部分(衣壳化信号)以及ITR的至少一个功能部分或衍生物的至少一个拷贝；以及绝大多数病毒基因组已被除去并且基本上不产生病毒蛋白的“无肠(gutless)”(辅助病毒依赖性的)腺病毒，此类载体可允许基因表达在单次施用后持续存在一年以上(Wu等人(2001)Anesthes.94：1119-32；Parks(2000)Clin.Genet.58：1-11；Tsai等人(2000)Curr.Opin.Mol.Ther.2：515-23)。
在一些实施方案中，将编码如本文所述的肽的核苷酸序列插入到基于腺相关病毒的表达载体中。AAV是属于依赖病毒属的细小病毒，并且具有未在其它病毒中发现的若干特征。AAV可感染广泛范围的宿主细胞，包括非分裂细胞。AAV可感染来自不同物种的细胞。AAV未与任何人或动物疾病相关，并且在整合时似乎不会改变宿主细胞的生物学特性。事实上，据估计80％-85％的人口已经暴露于该病毒。最后，AAV在广泛范围的物理和化学条件下是稳定的，从而有助于生产、储存和运输。AAV是辅助病毒依赖性病毒；也就是说，其需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染以在野外形成AAV病毒粒子。在不存在与辅助病毒共感染的情况下，AAV建立其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中但不产生感染性病毒粒子的潜伏状态。随后的辅助病毒感染可挽救整合的基因组，从而允许其复制并将其基因组包装到感染性AAV病毒粒子中。虽然AAV可感染来自不同物种的细胞，但辅助病毒必须是与宿主细胞相同的物种。因此，例如，人AAV将在与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。腺相关病毒(AAV)已成功用于基因疗法中。AAV已被工程改造成通过缺失AAV基因组的内部非重复部分(即rep和cap基因)并在ITR之间插入异源序列(在这种情况下，编码所述药剂的序列)来递送目标基因。异源序列通常功能性地连接至能够在适当条件下驱动患者靶细胞中的表达的异源启动子(组成型、细胞特异性或诱导型)。包含编码目标药剂的核酸序列的重组AAV病毒粒子可使用各种本领域公认的技术来产生，如美国专利号5,139,941；5,622,856；5,139,941；6,001,650；以及6,004,797中所描述，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。用于制备无辅助病毒的rAAV原料所需的载体和细胞系可作为AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System)(目录号240071)(Agilent Technologies，SantaClara，Calif.)商购获得。
适用于递送编码如本文所述的肽的核酸分子的另外病毒载体包括源自痘病毒家族的那些，包括牛痘病毒和禽痘病毒。或者，可使用禽痘病毒，如鸡痘病毒和金丝雀痘病毒来递送基因。在人和其它哺乳动物物种的细胞中使用禽痘病毒载体在安全性方面是有利的，因为禽痘病毒属的成员只能在易感禽类物种中有成效地复制。用于产生重组禽痘病毒的方法是本领域中已知的并且采用遗传重组，参见例如WO 91/12882；WO 89/03429；和WO92/03545。
分子缀合物载体如腺病毒嵌合载体也可用于递送编码如本文所述的肽的序列(Michael等人(1993)J.Biol.Chem.268：6866-69和Wagner等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103)。甲病毒属的成员，例如辛德毕斯(Sindbis)病毒和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest viruses)也可用作用于递送核酸序列的病毒载体(参见，例如，Dubensky等人(1996)J.Virol.70：508-19；WO 95/07995；WO 96/17072)
在一些实施方案中，载体还包含与所述肽可操作地连接的信号肽。信号肽是末端(通常N末端)定位的肽序列，其提供蛋白质进入膜或穿过膜。不同的信号肽可在不同的应用中使用。例如，关于用于产生如本文所述的分离的肽的细胞系统，分泌的信号肽可允许增加的产率和易于纯化。作为另一个实例，关于产生如本文所述的肽并且出于治疗目的施用至受试者的细胞，多个信号肽，例如用于从第一细胞分泌的肽信号传导、用于通过第二细胞内化的肽信号传导和用于核定位的最终肽信号传导可增加到达目标环境的肽的量。作为另一实例，关于例如基因疗法应用，用于核定位的肽信号传导可增加到达目标环境的肽的量。信号肽是本领域中已知的。用于哺乳动物细胞中的核定位信号(NLS)肽的非限制性实例包括：SV40大T抗原NLS(PKKKRKV)(SEQ ID NO：4)；核质蛋白NLS(KR[PAATKKAGQA]KKKK)(SEQ IDNO：5)；K-K/R-X-K/R(SEQ ID NO：6)共有NLS(KKXR(SEQ ID NO：7)；KKXK(SEQ ID NO：8)；KRXK(SEQ ID NO：9)；KRXR(SEQ ID NO：10)；和PY-NLS(参见例如Dingwall等人J Cell Biol188107：841-9和Makkerh等人Curr Biol.19966：1025-7；其两者均以引用的方式整体并入本文以用于进一步论述)。用于哺乳动物细胞的分泌信号肽的非限制性实例包括人白蛋白信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS)(SEQ ID NO：11)；人糜蛋白酶信号肽(MAFLWLLSCWALLGTTGF)(SEQ ID NO：12)；人白介素-2信号肽(MQLLSCIALILALV)(SEQ ID NO：13)；人胰蛋白酶原-2信号肽(MNLLLILTFVAAAVA)(SEQ ID NO：14)；以及包括用于通过信号肽酶、弗林蛋白酶或其它激素原转化酶(例如PC3)进行前体裂解的信号的编码区的序列。例如，被弗林蛋白酶(也称为PACE，参见美国专利号5,460,950)、其它枯草杆菌蛋白酶(包括PC2、PCI/PC3、PACE4、PC4、PC5/PC6、LPC/PC7IPC8/SPC7和SKI-I；Nakayama，Biochem.J.，327：625-635(1997))；肠激酶(参见美国专利号5,270,181)或糜蛋白酶裂解的信号(肽)序列可被引入本文定义的信号(肽)序列中。另外的信号肽是本领域中已知的，并且信号肽的选择可受细胞类型、生长条件和肽的所需目的的影响。
一方面，本文描述一种表达包含编码如本文所述的肽的核酸的载体的细胞。在一些实施方案中，表达如本文所述的载体的细胞是适于产生多肽的细胞。适于产生多肽的细胞可以是原核或真核细胞，例如，细菌、病毒、酵母、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。作为非限制性实例，用于产生蛋白质的细胞可商购获得，例如，细菌细胞(BL21源性细胞-目录号60401-1，Lucigen；Middleton，WI)和哺乳动物细胞(293F细胞-目录号11625-019，Invitrogen；Grand Island，NY)。
重组分子，例如如本文所述的载体可经由转化，特别是转导、缀合、脂质转染、原生质体融合、动员、粒子轰击、电穿孔(Neumann等人，“Gene Transfer into Mouse LyomaCells by Electroporation in High Electric Fields，”EMBO J.1(7)：841-845(1982)；Wong等人，“Electric Field Mediated Gene Transfer，”Biochem Biophys Res Commun107(2)：584-587(1982)；Potter等人，“Enhancer-dependent Expression of Human KappaImmunoglobulin Genes Introduced into Mouse pre-B Lymphocytes byElectroporation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(22)：7161-7165(1984)，其特此以引用的方式整体并入)、聚乙二醇介导的DNA摄取(Joseph Sambrook&David W.Russell，MolecularCloning：A Laboratory Manual cp.16(1989年第2版)，其特此以引用的方式整体并入本文)、或原生质体与其它实体(例如，包含嵌合基因的微细胞、细胞、溶酶体或其它易融合的脂质表面体)的融合(Fraley等人，“Liposome-mediated Delivery of Tobacco MosaicVirus RNA into Tobacco Protoplasts：A Sensitive Assay for Monitoring Liposome-protoplast Interactions，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79(6)：1859-1863(1982)，其特此以引用的方式整体并入)引入至细胞中。然后将宿主细胞在合适的培养基中并在适于表达目标蛋白质或多肽的条件下培养。在培养后，通过物理或化学方法破坏细胞，并从所得粗提取物中纯化所述蛋白质或多肽。或者，培养可包括使蛋白质或多肽分泌到重组宿主细胞的生长培养基中的条件，并且从所述生长培养基中分离蛋白质或多肽。可在合适的情况下使用替代方法。
肽也可连接至佐剂。术语“佐剂”是指增强免疫应答和/或促进接种后的适当吸收速率的化合物或混合物，并且如本文所用，涵盖任何摄取促进剂。佐剂的非限制性实例包括趋化因子(例如，防卫素、HCC-1、HCC4、MCP-1、MCP-3、MCP4、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3α、MIP-2、RANTES)；趋化因子受体的其它配体(例如，CCR1、CCR-2、CCR-5、CCR6、CXCR-1)；细胞因子(例如，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17(A-F)、IL-18；IFNα、IFN-γ；TNF-α；GM-CSF)；TGF)-β；FLT-3配体；CD40配体；那些细胞因子的受体的其它配体；Th1细胞因子，包括但不限于IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-18和TNF；Th2细胞因子，包括但不限于IL-4、IL-5、IL-10和IL-13；以及Th17细胞因子，包括但不限于IL-17(A至F)、IL-23、TGF-β和IL-6；细菌DNA或寡核苷酸中的免疫刺激性CpG基序；脂多糖如单磷酰脂质A(MPL)的衍生物；胞壁酰二肽(MDP)及其衍生物(例如，莫拉丁酯、苏氨酰基-MDP、胞壁酰三肽、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637，被称为nor-MDP)；N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE))；MF59(参见国际公布号WO 90/14837)；聚[二(羧基合苯氧基)磷腈](PCPP聚合物；Virus Research Institute，USA)；RIBI(GSK)，其含有在2％角鲨烯/Tween 80乳液中的从细菌提取的三种组分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，Switzerland)；热休克蛋白及其衍生物；elF4a及其衍生物的利什曼虫同源物；细菌ADP-核糖基化外毒素及其衍生物(例如，遗传突变体、含A和/或B亚基的片段、化学类毒素化型式)；含有细菌ADP-核糖基化外毒素或其衍生物的化学缀合物或遗传重组体；C3d串联阵列；脂质A及其衍生物(例如，单磷酰基或二磷酰基脂质A、脂质A类似物、AGP、AS02、AS04、DC-Chol、Detox、OM-174)；ISCOMS和皂草苷(例如，Quil A、QS-21、(CambridgeBioscience，Worcester，MA))；角鲨烯；超抗原；或盐(例如，氢氧化铝或磷酸铝、磷酸钙)。关于其它有用的佐剂，还参见Nohria等人Biotherapy，7：261-269，1994；Richards等人，在Vaccine Design中，编辑Powell等人，Plenum Press，1995；以及Pashine等人.，NatureMedicine，11：S63-S68，4/2005)。佐剂的其它实例可包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.，Hamilton，MT.)、明矾、矿物凝胶如氢氧化铝凝胶、水包油乳液、油包水乳液，例如像弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)和SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、佐剂、皂草苷、Quil A或其它皂草苷级分、单磷酰脂质A和阿夫立定脂质-胺佐剂、以及其它合适的佐剂可包括例如表面活性物质，如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚等。
在一些实施方案中，细胞可被遗传工程改造来表达本文所述的肽，并且所述遗传工程改造的细胞可用于细胞疗法。可使用的细胞的实例包括但不限于树突细胞、T淋巴细胞(T细胞)、初始T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中心记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、自然杀伤细胞、造血干细胞和/或能够产生治疗相关子代的多能胚胎/诱导型干细胞。在一个实施方案中，所述遗传工程改造的细胞是自体细胞。作为实例，本发明的个体T细胞可以是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4-/CD8-或CD4+/CD8+。T细胞可以是CD4+/CD8-细胞和CD4-/CD8+细胞的混合群体或单个克隆的群体。当与表达所述肽的细胞(例如CD20+和/或CD19+肿瘤细胞)体外共同培养时，CD4+T细胞可产生IL-2、IFN□、TNF□和其它T细胞效应细胞因子。当与靶细胞体外共同培养时，CD8+T细胞可溶解抗原特异性靶细胞。在一些实施方案中，T细胞可以是CD45RA+CD62L+初始细胞、CD45RO+CD62L+中心记忆细胞、CD62L-效应记忆细胞或其组合中的任何一种或多种(Berger等人，Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity.Curr Opin Immunol 200921(2)224-232)。
在一些实施方案中，耐受性抗原呈递细胞可用于细胞疗法中。实例包括B细胞、树突细胞、巨噬细胞等。所述细胞可具有任何来源，包括来自人。可使用本文所述的肽来使所述细胞产生耐受性。在一些实施方案中，在细胞因子存在下使所述细胞产生耐受性。
在一些实施方案中，可将产生如本文所述的肽的细胞施用于受试者，例如，用于治疗、抑制糖尿病(如2型糖尿病)，降低其严重程度和/或减缓其进展。
在一些实施方案中，可将包含如本文所述的肽的纳米颗粒施用于受试者。在一些实施方案中，用于与本文所述的肽一起使用的纳米颗粒可如Levine等人，Polymersomes：Anew multi-functional tool for cancer diagnosis and therapy.Methods 2008第46卷第25-32页中所描述或如S Jain，等人，Gold nanoparticles as novel agents forcancer therapy.Br J Radiol.2012年2月；85(1010)：101-113中所描述。
在一些实施方案中，表达编码如本文所述的肽的载体的细胞可以是受试者的细胞，例如施用用于治疗、抑制糖尿病(如2型糖尿病)、降低其严重程度和/或减缓其进展的基因疗法的受试者。用于基因疗法的载体可包括如本文别处所述的病毒或非病毒载体。
使用方法
本文提供用于治疗、抑制有需要的受试者的疾病状态、降低所述疾病状态的严重程度、减缓所述疾病状态的进展和/或促进所述疾病状态的预防的方法。所述方法包括提供包含增加肠激素(如GLP-1和/或PYY)释放的药剂的组合物，并且向所述受试者施用有效量的组合物以便治疗、抑制所述疾病状态、降低所述疾病状态的严重程度和/或促进所述疾病状态的预防。在一些实施方案中，GLP-1是GLP-1-(7-37)、GLP-1-(7-36)NH2或其组合中的任何一种或多种。在各个实施方案中，所述疾病状态是糖尿病。在一个实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。在另一个实施方案中，所述疾病状态是肥胖症。在一些实施方案中，所述药剂是SSTR2、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4受体中的任何一种或多种的激动剂。在另一个实施方案中，所述药剂是生长抑素的拮抗剂。在一个实施方案中，所述药剂包括苦味寡肽。在一些实施方案中，增加肠激素释放的药剂是BPxl、BPx2、BPx3、BPx4或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述苦味寡肽与增加肠(例如，远端小肠)保留的药剂缀合。在示例性实施方案中，增加肠保留的药剂的实例包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。在一些实施方案中，治疗、抑制所述疾病状态、降低所述疾病状态的严重程度和/或促进所述疾病状态的预防还包括施用在食物中发现的脂肪酸和/或植物分子。在示例性实施方案中，在食物中发现的脂肪酸或植物分子包括但不限于以下中的任何一种或多种：尿石素A、鞣花酸、乌索酸、齐墩果酸、6-间丙基-2-硫尿嘧啶、丙酸、丁酸酯、棕榈酸或其组合。在一些实施方案中，治疗、抑制所述疾病状态、降低所述疾病状态的严重程度和/或促进所述疾病状态的预防还包括施用与纤维素缀合的PTU(PTU-纤维素)。在各个实施方案中，顺序地或同时地施用增加肠激素释放的药剂与在食物中发现的脂肪酸、植物分子和/或PTU-纤维素的组合。在各个实施方案中，增加肠激素释放的药剂与脂肪酸和/或PTU-纤维素的组合口服、肠内施用至小肠或通过直肠栓剂或灌肠剂施用至结肠。在一个实施方案中，所述受试者是人。在各个实施方案中，本文所述的组合物在所述受试者患所述疾病状态之前、期间或之后施用于受试者。在一些实施方案中，所述组合物每天1-3次或每周1-7次施用至受试者。在一些实施方案中，所述组合物被施用至受试者持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。
本文还提供用于治疗、抑制有需要的受试者的糖尿病、降低糖尿病的严重程度、减缓糖尿病的进展和/或促进糖尿病的预防的方法。所述方法包括提供包含增加肠激素(如GLP-1和/或PYY)释放的药剂的组合物，并且向所述受试者施用有效量的组合物以便治疗、抑制所述受试者的糖尿病、降低所述受试者的糖尿病的严重程度和/或促进所述受试者的糖尿病的预防。在一些实施方案中，GLP-1是GLP-1-(7-37)、GLP-1-(7-36)NH2或其组合中的任何一种或多种。在一个实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。在一些实施方案中，所述药剂是SSTR2、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4受体中的任何一种或多种的激动剂。在另一个实施方案中，所述药剂是生长抑素的拮抗剂。在一个实施方案中，所述药剂包含苦味寡肽。在一些实施方案中，增加肠激素释放的药剂是BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述苦味寡肽与增加肠(例如，远端小肠)保留的药剂缀合。在示例性实施方案中，增加细胞保留的药剂包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。在一些实施方案中，治疗、抑制糖尿病、降低糖尿病的严重程度和/或促进糖尿病的预防还包括施用在食物中发现的增加GLP-1释放的脂肪酸和/或植物分子。在示例性实施方案中，在食物中发现的脂肪酸或植物分子包括但不限于以下中的任何一种或多种：尿石素A、鞣花酸、乌索酸、齐墩果酸、6-间丙基-2-硫尿嘧啶、丙酸、丁酸酯、棕榈酸或其组合。在一些实施方案中，治疗、抑制糖尿病、降低糖尿病的严重程度和/或促进糖尿病的预防还包括施用与纤维素缀合的PTU(PTU-纤维素)。在各个实施方案中，顺序地或同时地施用增加肠激素释放的药剂与脂肪酸和/或PTU-纤维素的组合。在各个实施方案中，增加肠激素释放的药剂与脂肪酸和/或PTU-纤维素的组合口服、肠内施用至小肠或通过直肠栓剂或灌肠剂施用至结肠。在一个实施方案中，所述受试者是人。在各个实施方案中，本文所述的组合物在所述受试者患所述疾病状态之前、期间或之后施用于受试者。在一些实施方案中，所述组合物每天1-3次或每周1-7次施用至受试者。在一些实施方案中，所述组合物被施用至受试者持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。
本文进一步提供用于治疗、抑制有需要的受试者的肥胖症、降低所述受试者的肥胖症的严重程度和/或促进所述受试者的肥胖症的预防的方法。所述方法包括提供包含增加肠激素(如GLP-1和/或PYY)释放的药剂的组合物，并且向所述受试者施用有效量的组合物以便治疗、抑制所述受试者的肥胖症、降低所述受试者的肥胖症的严重程度和/或促进所述受试者的肥胖症的预防。在一些实施方案中，GLP-1是GLP-1-(7-37)、GLP-1-(7-36)NH2或其组合中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂是SSTR2、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4受体中的任何一种或多种的激动剂。在另一个实施方案中，所述药剂是生长抑素的拮抗剂。在一个实施方案中，所述药剂包含苦味寡肽。在一些实施方案中，增加肠激素释放的药剂是BPx1、BPx2、BPx3、BPx4或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述苦味寡肽与增加肠(例如，远端小肠)保留的药剂缀合。在示例性实施方案中，增加细胞保留的药剂包括但不限于纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合。在一些实施方案中，治疗、抑制肥胖症、降低肥胖症的严重程度和/或促进肥胖症的预防还包括施用在食物中发现的增加GLP-1释放的脂肪酸和/或植物分子。在示例性实施方案中，在食物中发现的脂肪酸或植物分子包括但不限于以下中的任何一种或多种：尿石素A、鞣花酸、乌索酸、齐墩果酸、6-间丙基-2-硫尿嘧啶、丙酸、丁酸酯、棕榈酸或其组合。在一些实施方案中，治疗、抑制肥胖症、降低肥胖症的严重程度和/或促进肥胖症的预防还包括施用与纤维素缀合的PTU(PTU-纤维素)。在各个实施方案中，顺序地或同时地施用增加肠激素释放的药剂与脂肪酸和/或PTU-纤维素的组合。在各个实施方案中，增加肠激素释放的药剂与脂肪酸和/或PTU-纤维素的组合口服、肠内施用至小肠或通过直肠栓剂或灌肠剂施用至结肠。在一个实施方案中，所述受试者是人。在各个实施方案中，本文所述的组合物在所述受试者患所述疾病状态之前、期间或之后施用于受试者。在一些实施方案中，所述组合物每天1-3次或每周1-7次施用至受试者。在一些实施方案中，所述组合物被施用至受试者持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。
在一些实施方案中，如本文所述的用于治疗糖尿病的BPx1、BPx2、BPx3、BPx4和/或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物可与用于糖尿病的现有治疗共同施用。寡肽BPx1、BPx2、BPx3、BPx4和/或其组合、或类似物、药物等效物或肽模拟物可与用于糖尿病的现有治疗顺序地或同时地施用。在一些实施方案中，可与本文所述的方法一起使用的现有治疗包括但不限于SGLT2抑制剂(如卡格列净(Invokana)、达格列净(Farxiga)、依帕列净(Jardiance))、胰岛素、吸入胰岛素、磺酰脲、二甲双胍、阿卡波糖、噻唑烷二酮类或其组合。
在各个实施方案中，增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)的释放的药剂(例如，BPx1、BPx2、BPx3、BPx4和/或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种)的有效量是约0.01至0.05μg/kg/天、0.05-0.1μg/kg/天、0.1至0.5μg/kg/天、0.5至5μg/kg/天、5至10μg/kg/天、10至20μg/kg/天、20至50μg/kg/天、50至100μg/kg/天、100至150μg/kg/天、150至200μg/kg/天、200至250μg/kg/天、250至300μg/kg/天、300至350μg/kg/天、350至400μg/kg/天、400至500μg/kg/天、500至600μg/kg/天、600至700μg/kg/天、700至800μg/kg/天、800至900μg/kg/天、900至1000μg/kg/天、0.01至0.05mg/kg/天、0.05-0.1mg/kg/天、0.1至0.5mg/kg/天、0.5至1mg/kg/天、1至5mg/kg/天、5至10mg/kg/天、10至15mg/kg/天、15至20mg/kg/天、20至50mg/kg/天、50至100mg/kg/天、100至200mg/kg/天、200至300mg/kg/天、300至400mg/kg/天、400至500mg/kg/天、500至600mg/kg/天、600至700mg/kg/天、700至800mg/kg/天、800至900mg/kg/天、900至1000mg/kg/天或其组合中的任何一个或多个。增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放的药剂(例如，BPx1、BPx2、BPx3、BPx4和/或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种)的典型剂量可在制造商推荐的使用已知的治疗化合物的范围内，并且还可通过体外反应或动物模型中的反应来指示给本领域的技术人员。此类剂量通常可在浓度或量上降低最多约一个数量级而不丧失相关的生物活性。实际剂量可取决于医师的判断、患者的病状以及治疗方法的有效性，所述治疗方法基于例如相关的培养细胞或组织培养的组织样品(如活检的恶性肿瘤)的体外反应性或在适当的动物模型中观察到的反应。在各个实施方案中，包含增加肠激素(如GLP-1、PYY或其组合)释放的药剂(例如，BPx1、BPx2、BPx3、BPx4和/或其组合、或其类似物、药物等效物或肽模拟物中的任何一种或多种)的本发明组合物可每天一次(SID/QD)、每天两次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或更多次施用，以便向所述受试者施用有效量，其中所述有效量是本文所述的剂量中的任何一个或多个。
在各个实施方案中，所述受试者选自由以下各项组成的组：人、非人灵长类动物、猴、猿、狗、猫、奶牛、马、兔、小鼠和大鼠。
本文还提供用于筛选用于治疗糖尿病的肽的方法。所述方法包括提供在食物中发现的一种或多种候选肽、脂肪酸或植物分子，使在食物中发现的所述候选肽、脂肪酸或植物分子与分泌GLP-1的细胞接触，并确定所述接触是否导致GLP-1的分泌增加。GLP-1分泌的增加表明在食物中发现的候选肽、脂肪酸或植物分子可用于治疗糖尿病。在一个实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。在一些实施方案中，所述候选肽是苦味寡肽。在一些实施方案中，所述方法包括分别接触待测试的多种候选肽中的每一种。在一些实施方案中，所述多种候选肽包括多于约104个样品。在一些实施方案中，所述多个样品包括多于约5X 104个样品。在一些实施方案中，分泌GLP-1的细胞是Hu-Tu80细胞。在示例性实施方案中，分泌的增加是相对于参考值而言。所述参考值可以是阴性对照(例如，不存在候选肽)或在PTU存在下的GLP-1分泌水平或在本文所述的脂肪酸存在下的GLP-1分泌水平或其组合。测试配体与已知在L细胞上并负责调控GLP-1释放的受体的相互作用的能力的其它系统可作为HuTu80细胞的替代使用。
药物组合物
本文提供药物组合物，其包含增加肠激素释放的治疗剂和可接受的载体/赋形剂，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述治疗剂增加GLP-1、PYY或其组合中的任何一种或多种的释放，以便治疗有需要的受试者的糖尿病。在一个实施方案中，糖尿病是2型糖尿病(T2DM)。在一个实施方案中，所述治疗剂是寡肽。在另一个实施方案中，所述治疗剂是小分子。在一些示例性实施方案中，所述寡肽包含氨基酸序列YGLF(BPxl，SEQ ID NO：1)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，YPFPGPIPN(BPx2，SEQ ID NO：2)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，IPAVF(BPx3，SEQ ID NO：3)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，LLF或其类似物、药物等效物或肽模拟物或其组合，由其组成或基本上由其组成。
在各个实施方案中，根据本发明的药物组合物可被配制来经由任何施用途径递送。“施用途径”可指本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、经鼻、经口、经粘膜、经皮、胃肠外或肠内。在一些实施方案中，所述药物组合物可肠内施用于小肠。在一些实施方案中，所述药物组合物可口服施用。在一些实施方案中，所述药物组合物可通过直肠栓剂或灌肠剂施用至结肠。“胃肠外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊椎内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液剂或混悬剂形式，或呈冻干粉剂形式。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液剂或混悬剂形式。通过经肠途径，药物组合物可呈片剂、凝胶胶囊、糖包衣片剂、糖浆剂、混悬剂、溶液剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、允许控释的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡形式。
如本文所用的短语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射。如本文所用的短语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”是指施用增加除了直接进入靶位点、组织或器官之外的肠激素释放的治疗剂，以使得所述治疗剂进入受试者的循环系统并因此进行代谢和其它类似的过程。
“药学上可接受的赋形剂”意指适用于制备药物组合物的通常安全、无毒且合乎需要的赋形剂，并且包括可为兽医学用途以及人医药用途所接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下可为气体。
根据本发明的药物组合物还可含有任何药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”是指涉及从身体的一种组织、器官或部分携带或运送目标化合物至身体的另一组织、器官或部分的药学上可接受的物质、组合物或媒介物。举例而言，载体可为液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质或其组合。载体的各组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与配方的其它成分相容。它还必须适用于与它可能与之接触的任何组织或器官接触，这意味着它必须不携有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过度超过其治疗益处的任何其它并发症的风险。
根据本发明的药物组合物也可被包封、制片或以乳剂或糖浆剂形式制备以供口服施用。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或有助于制备组合物。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可包括持续释放物质，如单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
药物制剂是遵循常规制药技术制备的，所述技术涉及研磨、混合、粒化和必要时压制(针对片剂形式)；或研磨、混合和填充(针对硬质明胶胶囊形式)。当使用液体载体时，制剂将呈糖浆剂、酏剂、乳剂或水性或非水性混悬剂形式。此类液体制剂可直接口服施用或填充至软质明胶胶囊中。
根据本发明的药物组合物可以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是就在给定受试者中的治疗疗效而言，组合物将产生最有效的结果的那个量。这个量将取决于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药物动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质以及施药途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验，例如通过监测受试者对施用化合物的反应以及相应地调整剂量来确定治疗有效量。对于其它指导，参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy(Gennaro编，第20版，Williams&Wilkins PA，USA)(2000)。
本文所述的治疗剂可以单个剂量或多个剂量施用于患者。当施用多个剂量时，所述剂量可彼此间隔例如1小时、3小时、6小时、8小时、1天、2天、1周、2周或1个月。例如，可施用所述治疗剂持续例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或更多个周。在各个实施方案中，所述组合物每天1-3次或每周1-7次施用至受试者。在各个实施方案中，所述组合物被施用至受试者持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。应理解，对于任何特定的受试者，应根据所述个体的需要以及施用或监督所述组合物的施用的人士的专业判断随时间来调整特定的剂量方案。例如，如果较低剂量不能提供足够的治疗活性，则可增加治疗剂的剂量。尽管主治医师最终将决定适当的量和剂量方案，但是治疗有效量的如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物可以0.0001、0.01、0.01、0.1、1、5、10、25、50、100、500或1,000mg/kg或μg/kg的剂量提供。有效剂量可从由体外或动物模型测试生物测定或系统获得的剂量-反应曲线外推而来。
如本文所用的有效量还将包括足以延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的病程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。因此，不可能指定精确的“有效量”。但是，对于任何给定情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验方法确定。
可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定有效量、毒性以及治疗功效，所述标准药物程序例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。所述剂量可根据所采用的剂型和使用的施用途径而改变。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且它可被表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。最初可从细胞培养物测定中评估治疗有效剂量。另外，可在动物模型中配制剂量以实现包括IC50的循环血浆浓度范围(即，增加肠激素释放的治疗剂的浓度，所述浓度实现症状的半数最大抑制)，如在细胞培养物或适当动物模型中确定的。可测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。可通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的作用。可由医师确定剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗作用。
短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文所用的短语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意指参与维持增加肠激素释放的治疗剂的稳定性、溶解度或活性的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬酯酸)或溶剂包封材料。各载体在可与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(8)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(9)二醇类，如丙二醇；(10)多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(11)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(12)琼脂；(13)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(14)海藻酸；(15)无热原水；(16)等渗盐水；(17)林格氏溶液(Ringer′s solution)；(18)pH缓冲溶液；(19)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酸酐类；20)填充剂，如多肽和氨基酸；(21)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，如乙醇；以及(23)在药物制剂中采用的其它无毒性相容的物质。脱模剂、包衣剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等的术语在本文中可互换使用。
增加本文所述的肠激素的释放的治疗剂可特别配制用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用化合物，包括适用于以下的那些：(1)胃肠外施用，例如，作为例如无菌溶液或混悬剂或持续释放制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；(2)局部施加，例如作为施加至皮肤的霜剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾剂；(3)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、霜剂或泡沫；(4)眼部；(5)经皮；(6)经粘膜；(7)肠内或(8)经鼻。此外，增加本文所述的肠激素释放的治疗剂可植入患者体内或使用药物递送系统注射。参见例如，Urquhart，等人，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24：199-236(1984)；Lewis，编辑″Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals″(Plenum Press，New York，1981)；美国专利号3,773,919；以及美国专利号3,270,960。
以下说明可用于本文所述方法中的增加肠激素释放的治疗剂的制剂和施用模式的其它实施方案。
胃肠外剂型。增加肠激素释放的治疗剂的胃肠外剂型也可通过各种途径施用于受试者，所述途径包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内和动脉内。由于胃肠外剂型的施用通常绕过患者对污染物的天然防御，所以胃肠外剂型优选是无菌的或能够在施用至患者之前进行灭菌。胃肠外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮于药学上可接受的注射用媒介物中的无水产品、准备注射的混悬剂、控制释放的胃肠外剂型和乳剂。
可用于提供本公开的胃肠外剂型的合适媒介物是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：无菌水；注射用水USP；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物，如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水混溶性媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
气雾剂制剂。增加肠激素释放的治疗剂可与合适的推进剂(如烃类推进剂如丙烷、丁烷或异丁烷)和常规助剂一起包装在加压气雾剂容器中。增加肠激素释放的治疗剂也可以非加压形式施用，如在喷雾器或雾化器中。增加肠激素释放的治疗剂也可例如通过使用吸入器以干粉形式直接施用于气道。
作为说明，合适的粉末组合物包括与乳糖充分混合的增加肠激素释放的治疗剂的粉末制剂，或对于支气管内施用可接受的其它惰性粉末。粉末组合物可经由气雾剂分配器施用或包封在可被受试者插入到装置中的可破碎胶囊中，所述装置可刺穿胶囊并以适于吸入的稳定流将粉末吹出。所述组合物可包含推进剂、表面活性剂和共溶剂，并且可被填充至由合适的计量阀封闭的常规气雾剂容器中。
用于递送至呼吸道的气雾剂是本领域中已知的。参见例如，Adjei，A.和Garren，J.Pharm.Res.，1：565-569(1990)；Zanen，P.和Lamm，J.-W.J.Int.J.Pharm.，114：111-115(1995)；Gonda，I.″Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents tothe respiratory tract，″在Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，6：273-313(1990)中；Anderson等人，Am.Rev.Respir.Dis.，140：1317-1324(1989))并且还具有用于全身递送肽和蛋白质的潜力(Patton和Platz，Advanced DrugDelivery Reviews，8：179-196(1992))；Timsina等人，Int.J.Pharm.，101：1-13(1995)；和Tansey，I.P.，Spray Technol.Market，4：26-29(1994)；French，D.L.，Edwards，D.A.和Niven，R.W.，Aerosol Sci.，27：769-783(1996)；Visser，J.，Powder Technology 58：1-10(1989))；Rudt，S.和R.H.Muller，J.Controlled Release，22：263-272(1992)；Tabata，Y，和Y.Ikada，Biomed.Mater.Res.，22：837-858(1988)；Wall，D.A.，Drug Delivery，2：101-201995)；Patton，J.和Platz，R.，Adv.Drug Del.Rev.，8：179-196(1992)；Bryon，P.，Adv.Drug.Del.Rev.，5：107-132(1990)；Patton，J.S.，等人，Controlled Release，28：1579-85(1994)；Damms，B.和Bains，W.，Nature Biotechnology(1996)；Niven，R.W.，等人，Pharm.Res.，12(9)；1343-1349(1995)；以及Kobayashi，S.，等人，Pharm.Res.，13(1)：80-83(1996)，其全部的内容以引用的方式整体并入本文。
本文所述的增加肠激素释放的治疗剂的制剂还涵盖无水药物组合物和包含所公开的化合物作为活性成分的剂型，因为水可促进一些化合物的降解。例如，添加水(例如5％)在制药领域中广泛接受作为模拟长期保存的方法，以便测定特性(诸如保质期或制剂随时间推移的稳定性)。参见例如，Jens T.Carstensen，Drug Stability：Principles&Practice，379-80(第2版，Marcel Dekker，NY，N.Y.：1995)。本公开的无水药物组合物和剂型可使用无水或含低水分的成分以及低水分或低湿度条件制备。如果期望在制造、包装和/或储存期间与水分和/或湿气实质性接触，则包含乳糖和至少一种包括伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型优选为无水的。优选使用已知防止暴露于水的材料来包装无水组合物，以使得其可包含于适当的处方试剂盒(formulary kit)中。合适的包装的实例包括但不限于气密密封的箔片、塑料、有或无干燥剂的单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装和条带包装。
受控和延迟释放剂型。在本文所述方法的一些实施方案中，增加肠激素释放的治疗剂可通过受控或延迟释放方式施用于受试者。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控制释放制剂的特征在于最少的药物物质用于在最短时间内治愈或控制病状。控制释放制剂的优点包括：1)延长药物的活性；2)降低剂量频率；3)提高患者依从性；4)使用较少总药物；5)减少局部或全身副作用；6)药物积累最小化；7)血液水平波动减少；8)治疗功效改善；9)减少药物活性的增强或丧失；和10)提高疾病或病状的控制速度(Kim，Cherng-ju，Controlled Release Dosage Form Design，2(Technomic Publishing，Lancaster，Pa.：2000))。控制释放制剂可用于控制化合物的作用开始、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平和峰值血液水平。具体地，可使用受控或延长释放剂型或制剂来确保实现式(I)化合物的最大有效性，同时使潜在不利影响和安全性问题最小化，所述不利影响和安全性问题可由于药物剂量不足(即，低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平而发生。
多种已知的受控或延长释放剂型、制剂和装置可适于与增加本文所述的肠激素释放的治疗剂一起使用。实例包括但不限于在美国专利号：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；以及6,365,185 B1中描述的那些，其各自以引用的方式整体并入本文。这些剂型可用于使用例如不同比例的羟丙甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统(如(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))、多层包衣、微颗粒、脂质体或微球体或其组合来提供所需的释放特性而提供一种或多种活性成分的缓慢或受控释放。此外，可使用离子交换材料来制备所公开化合物的固定的、吸附的盐形式且由此实现药物的受控递送。具体阴离子交换剂的实例包括但不限于，A568和AP143(Rohm&Haas，Spring House，Pa.USA)。
在一些实施方案中，用于在本文所述的方法中使用的增加肠激素释放的治疗剂通过持续释放或脉冲施用于受试者。脉冲疗法不是随时间推移相同量的组合物的不连续施用的形式，而是包括以降低的频率施用相同剂量的组合物或减少剂量的施用。当病症持续发生在受试者中时，例如当受试者具有病毒感染的连续或慢性症状时，持续释放或脉冲施用是特别优选的。可减少每个脉冲剂量，并且使在治疗过程中施用于患者的增加肠激素释放的治疗剂的总量最小化。
必要时，脉冲之间的间隔可由本领域普通技术人员来确定。通常，当在递送下一个脉冲之前，所述组合物或所述组合物的活性组分在受试者中不再可检测时，可通过施用另一剂量的所述组合物来计算脉冲之间的时间间隔。时间间隔也可从组合物的体内半衰期计算。时间间隔可被计算为大于体内半衰期，或组合物半衰期的2、3、4、5且甚至10倍大。用于通过输注或其它形式的递送至患者的脉冲组合物的各种方法和装置在美国专利号4,747,825；4,723,958；4,948,592；4,965,251和5,403,590中公开。
本发明的试剂盒
本发明还提供一种用于治疗、抑制有需要的受试者的糖尿病(例如，2型糖尿病)和/或降低所述糖尿病的严重程度的试剂盒。所述试剂盒包括包含增加肠激素释放的治疗剂的组合物，和用于使用所述组合物治疗、抑制有需要的受试者的糖尿病和/或降低所述糖尿病的严重程度的说明书。在一些实施方案中，增加肠激素释放的治疗剂是寡肽，其中所述寡肽包含氨基酸序列YGLF(SEQ ID NO：1)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，YPFPGPIPN(SEQ ID NO：2)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，IPAVF(SEQ ID NO：3)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，LLF或其类似物、药物等效物或肽模拟物或其组合，由其组成或基本上由其组成。
所述试剂盒是包括本文所述的至少一种组合物的材料或组分的集合。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含寡肽的组合物，其中所述寡肽包含氨基酸序列YGLF(SEQ ID NO：1)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，YPFPGPIPN(SEQ ID NO：2)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，IPAVF(SEQ ID NO：3)或其类似物、药物等效物或肽模拟物，LLF或其类似物、药物等效物或肽模拟物或其组合，或其中的任何一种或多种的组合，由其组成或基本上由其组成。
本发明试剂盒中配置的组分的准确性质取决于所述试剂盒的预定目的。在一个实施方案中，所述试剂盒是特别针对人受试者配置的。在其它实施方案中，所述试剂盒被配置来用于治疗如但不限于家畜、家养动物和实验室动物的受试者的兽医学应用。
使用说明书可包括在试剂盒中。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述，所需结果诸如治疗、抑制受试者的糖尿病，降低所述糖尿病的严重程度。任选地，试剂盒还含有其它适用组分，如测量工具、稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件。
可向从业者提供试剂盒中配置的以保持材料或组分的可操作性和效用的以任何便利和适合方式储存的材料或组分。举例而言，组分可呈溶解、脱水或冻干形式；它们可在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供。组分通常包含于合适的包装材料中。如本文所用的短语“包装材料”是指一种或多种用于容纳试剂盒的内容物(如本发明组合物等)的物理结构。包装材料是通过熟知方法构造的，优选提供无菌、无污染物的环境。如本文所用的术语“包装”是指诸如玻璃、塑料、纸、箔等能够容纳个别试剂盒组分的合适的固体基质或材料。因此，例如，包装可以是用于容纳适量的含有如本文所述的药物组合物的本发明组合物的瓶子。所述包装材料通常具有指示试剂盒和/或其组成部分的内容物和/或目的的外部标签。
实施例
提供以下实施例以更好说明要求保护的本发明且不应解释为限制本发明的范围。就提及的特定材料而言，仅出于说明目的且不意图限制本发明。本领域技术人员可在不行使本发明的能力和不脱离本发明的范围下开发等效手段或反应物。
实施例1
实验方法
通过使用免疫组织化学方法针对TAS2R38与GLP-1的共定位来对使用IRB方案34332的来自Cedars-Sinai Biobank的人回肠组织进行分析以观察受体是否存在于L细胞中。在平行研究中，TAS2R38的尝味者(taster)单倍型PAV的先前确定的结构[J.Tan，等人，第3版3D Structure Prediction of TAS2R38Bitter Receptors Bound to AgonistsPhenylthiocarbamide(PTC)and 6-n-Propylthiouracil(PROP)，J Chem InfModel 52(2012)1875-1885]用于来自ZINC数据库的可购买化合物的基于结构的虚拟配体筛选[J.J.Irwin，T等人，ZINC：a free tool to discover chemistry for biology，J ChemInf Model 52(2012)1757-1768]。购买了热门分子中的三种并在使用HuTu-80细胞的体外测定和体内测定中针对其GLP-1释放的潜力进行了测试。所述分子中的一种还用TAS2R38敲除细胞进行测试。用于这些研究的方法和材料如下文所述。
免疫组织化学
设计实验以确定TAS2R38受体是否在人肠内分泌L细胞上表达。为了鉴定它是否在天然L细胞上与GLP-1共定位，使用先前验证的GPCR和GLP-1抗体通过在人GI组织上的双重免疫染色进行IHC。所使用的抗体是：TAS2R38[兔多克隆(H：ab65509，Abcam)]、GLP-1[山羊多克隆(sc-26637，Santa Cruz Biotechnology)]。对细胞染色GLP-1或TAS2R38或两者的数目进行视觉计数。
虚拟配体筛选
使用DOCK Blaster服务器[38]在虚拟配体筛选(VLS)研究中使用先前预测的PTU结合的PAV构象[36]，所述服务器可访问若干化合物文库，包括来自ZINC数据库的具有约200万种可商购获得的化合物的文库[J.J.Irwin，等人，ZINC：A Free Tool to DiscoverChemistry for Biology，J Chem Inf Model(2012)]。对于每个配体分子，此服务器将对应于其内部自由扭转度的多个配体构象对接到由用户提供的推定结合位点，并通过评分函数对分子进行排序。从这个服务器中获得了前500种热门分子，并使用基于全原子Dreiding力场的更准确的评分函数对它们进行优先级排序[S.L.Mayo，B.D.Olafson，W.A.Goddard，Dreiding-a Generic Force-Field for Molecular Simulations，Journal of PhysicalChemistry 94(1990)8897-8909]，以选择对应于不同化学支架的前200种不同的小分子。从此列表中选择了前15种分子，并购买了其中三种分子用于进一步研究。
PTU-纤维素合成
合成反应总结在图4A中。通过首先进行2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮与戊二酸酐的克莱森缩合，从而产生7-乙氧基-5，7-二氧代庚酸来合成具有取代甲基的羧基的PTU，其与硫脲的缩合反应产生羧基取代的PTU。然后将其使用N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)和4-二-甲基氨基吡啶(DMAP)在DMSO中与纤维素的羟基缀合。通过使用IR光谱法确认产物的结构。
体外研究
a.GLP-1释放。使HuTu-80细胞(HTB-40，ATCC)在补充有10％FBS和PSG抗生素混合物的含有4mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和4.5g/L葡萄糖的杜氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)(DMEM)中增殖并维持在10％CO2和37℃下。对于实验，将这些细胞接种在6孔板或100-mm2组织培养皿中，增殖至汇合(5-7天)，并在处理前将其在无血清培养基中停留过夜。在实验之前，用含有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)的OPTI-MEM(Gibco，Life Technologies，Grand Island，NY)置换废弃的培养基，并对各孔给药30分钟。对于实验，确定了从HuTu-80细胞到培养基中的剂量依赖性GLP-1释放。收集来自细胞的培养基，并冷冻以用于使用Luminex MAGPIX代谢多重测定试剂盒(HMHMAG-34K)按照制造商的说明书进行随后的肽激素释放测量。
b.GPCR表达的抑制。为了确定特异性GPCR介导特定配体的反应，进行了TAS2R38的体外RNA沉默。使用由特异性靶向每种基因转录物的4种预先设计的寡核苷酸组成的商业试剂盒(FlexiTube siRNA，Qiagen)进行RNA沉默。每个试剂盒还具有用于检测基因敲低的伴随对照和定量测定。根据制造商推荐的程序，使用HiPerFect转染试剂(Qiagen)或Lipofectamine 2000(Life Tech)，用TAS2R38的单一和混合寡核苷酸siRNA转染培养的HuTu-80细胞。将细胞在基础培养基中维持达48小时。通过RT-qPCR和蛋白质印迹通过合适的抗体评估基因敲低以确保发生抑制。在平行组的转染的HuTu-80细胞中，使用有效剂量的特异性配体来刺激GLP-1释放。产生有或无siRNA处理情况下的配体的剂量-反应曲线。
体内研究
将所测试的配体通过胃管饲法施用于无病原体的6至8周龄的雄性BALB/c小鼠：预测的配体，PTU-纤维素缀合物；在计算为在PTU-纤维素中的相同量下的PTU；或单独纤维素。获得了眶后血液，并以规律的时间间隔测量了GLP-1。
实施例2
使用免疫组织化学(IHC)和/或原位杂交(ISH)技术，来自减肥手术患者的人肠组织中的调节L细胞的内腔表面上的GLP-1/PYY释放的GPCR感受器的存在
TAS2R和FFAR GPCR亚家族的成员在人L细胞系(HuTu-80和H716细胞)上功能性地表达，并通过RT-PCR分析在肠组织中可检测。使用Cedars-Sinai Medical Center BioBank及其Microscopy Core对来自回肠和结肠的人GI组织使用免疫组织化学方法基于用GLP-1的抗体染色鉴定了许多L细胞。这些L细胞中的几种显示出基于相应受体抗体测定的与苦味受体TAS2R38或脂肪酸受体GPR40(FFAR1)4或生长抑素受体SSTR2的GLP-1共定位。这些受体主要存在于细胞表面上，并且在这些细胞中的细胞质颗粒中发现了GLP-1。这些共定位数据显示这些受体在调节来自L细胞的GLP-1释放中的作用。
生长抑素受体亚型5(SSTR5)已经在动物模型中显示被GLP-1用于通过诱导相邻的D细胞释放生长抑素来调控自身(通过旁分泌信号传导)，所述生长抑素抑制来自L-细胞的肠促胰岛素释放。显示这一点的模型在图1中示出，其表明使用生长抑素拮抗剂来增强GLP-1释放。虽然本发明人在人回肠L细胞中未发现SSTR5受体，但是在L细胞的顶端表面上检测到另一种亚型SSTR2。这表明在肠腔内存在产生的调控L细胞GLP-1分泌反应的配体。这些配体可以是食物的消化产物或存在于肠腔内的细菌的作用产物。其它人已经鉴定了人胃肠粘膜和肠神经元中的GLP-1受体，其可潜在地介导D细胞上的这种旁分泌信号传导。如本文所述，SSTR2配体可用于调控来自L-细胞的GLP-1释放。具体地，可使用单独和与苦味寡肽组合的SSTR2激动剂来调节GLP-1释放的水平。此外，单独和与食物中的苦味寡肽、脂肪酸和/或植物分子组合的充当SSTR2拮抗剂的药剂可用于增强自L-细胞的GLP-1释放。
鉴定的结合至寡肽的L细胞Gpcrs的分子结构以指导体外和体内研究
发明人已经使用了经验证的计算方法来预测促味剂结合的苦味受体TAS2R38的结构，其用于鉴定来自大分子文库的小分子，所述小分子随后显示在体外和体内研究中引起GLP-1释放。结合实验使用这些方法来预测配体/肽提供了最有效的方式来探索机制。
苦味受体TAS2R38的原子水平结构预测需要考虑受体的已知单倍型(如下所述的尝味者和非尝味者)。苯基硫脲(PTC)和6-正丙基硫尿嘧啶(PTU)是TAS2R38的两种强效和特异性激动剂。PTC对于一些个体而言是非常苦涩的，但对于其它人来说它们基本上是无味的，这已被追溯到2种常见形式的TAS2R38基因，其在3个位点展示单核苷酸多态性(SNP)：a)氨基酸(AA)位置49，其中编码Pro/Ala；b)AA位置262，其中编码Ala/Val；和c)AA位置296，其中编码Val/Ile。这些变化引起两种频繁单倍型，hTAS2R38PAV和hTAS2R38AVI，其中hTAS2R38PAV在μM浓度下显示对PTC的强烈反应，而hTAS2R38AVI对PTC无反应。突变分析已经表明氨基酸位置49和262对细胞反应至关重要。为了解决基于hTAS2R38受体的苦味尝味者和非尝味者群体之间的分子差异以及其激动剂PTC和PTU的相应活化机制，本发明人使用他们自己的计算方法来预测一系列苦味受体单倍型的原子水平结构：从尝味者hTAS2R38PAV至非尝味者hTAS2R38AVI(非尝味者)。
发明人然后使用GenDock方法来预测PTC和PTU对尝味者和非尝味者受体形式两者的预测原子结构的结合位点和结合亲和力。PTC和PTU两者均与尝味者(hTAS2R38PAV)受体形式的残基262形成稳定的H键，而不与非尝味者(hTAS2R38AVI)受体形式的所述残基形成稳定的H键。因此，这个残基对于与实验一致的PTC/TAS2R38尝味者差异似乎是非常重要的。最近，本发明人将苦味寡肽中的一种(α-乳啡肽)对接至TAS2R38。结合口袋在图2中示出。
使用L细胞的体外模型的研究和使用小鼠模型的体内研究来验证基于受体的机制介导寡肽的作用的作用
这些研究用HuTu-80细胞进行，这些细胞是肠内分泌L细胞的优异模型。先前的研究证明，至少17个TAS2R家族成员在人结肠组织中表达，同时它们中的11个也在HuTu-80细胞中检测到。此外，这些细胞对具有GLP-1释放的苦味配体如PTC配体有反应。为了确认存在此项目的受体，进行了RT-PCR分析。使用HuTu-80细胞cDNA作为模板以通过RT-PCR检测TAS2R和FFAR转录物的存在。TAS2R、FFAR和L细胞标志物、胰高血糖素(GCG)/GLP-1、PYY和嗜铬粒蛋白A(CgA)的转录物在这些细胞中的基础水平下可容易地检测到，从而使得它们适合于本方案中的体外研究。
使用暴露于来自乳蛋白和脂肪酸配体的苦味寡肽的HuTu-80细胞进行GLP-1释放测定。图3示出所述配体中的每种的剂量反应效应，从而首次证明源自膳食蛋白质的消化的苦味寡肽可活化GLP-1释放。还观察到响应于已知活化FFAR3的脂肪酸丙酸酯和丁酸酯以及已知活化FFAR1的棕榈酸酯的GLP-1分泌反应。最后，结果表明，二甲双胍可活化GLP-1释放，这与近期报道一致的并且表明二甲双胍的作用部分地由L细胞上的受体介导。结果表明，HuTu80细胞为受体关联的GLP-1分泌提供较大平台。
为了确定TAS2R38受体特异性激动剂(PTU)是否能够活化动物中的GLP-1的L-细胞分泌，施用PTU或PTU-纤维素缀合物(经计算为得到相同数目的PTU分子)。缀合物的目的是将PTU保持在肠腔中，以证明PTU引起GLP-1释放的活性是由于与TAS2R38受体的腔表面相互作用。通过胃管饲法将分子施用于无病原体的6至8周龄雄性BALB/c小鼠。获得了眶后血液，并以规律的时间间隔测量了GLP-1(图4B)。结果表明，PTU和PTU缀合物两者均引起GLP-1释放到血液中，并且与单独PTU相比，在PTU缀合物情况下的增加幅度更大且持续时间更长。单独纤维素没有作用。这些结果表明通过胃管饲法施用用TAS2R38的激动剂释放GLP-1。使用结构分析，鉴定了可与TAS2R38相互作用以在HuTu80细胞中引起GLP-1释放的新型分子。将这些分子通过胃管饲施用至小鼠，并且它们在小鼠中引起GLP-1释放。此结果再次验证了本发明人的建模方法用于特异性受体的配体缔合。
在GMP设施中合成最有效和强效的苦味肽，将其与FDA批准的显示为提供结肠/回肠靶向递送的制剂组合，并将其包封以用于施用至前驱糖尿病患者
对于苦味寡肽的体外测试，本发明人外包了4种肽(BPx1至BPx4)中的每种的10mg的合成。基于小鼠中的体内研究(图3)的最有效的寡肽BPx1和BPx2将以中等量(＜100gms)在良好生产规范(GMP)设施中合成。
实施例3
使用Cedars-Sinai Medical Center BioBank及其Microscopy Core对来自回肠和结肠的人GI组织使用免疫组织化学方法鉴定了许多与TAS2R38和GLP-1共定位的细胞。认为用GLP-1的抗体染色的细胞是L细胞。GLP-1与TAS2R38共定位，其主要在细胞表面上观察到并且面向管腔处于更高水平。另外，对覆盖回肠和结肠组织的染色的细胞的视觉计数显示约8％的回肠L细胞和约12％的结肠L细胞已经针对TAS2R38染色。详细数字在表1中示出。这些数字应被视为定性数字，因为由于金字塔形L细胞的顶端和面向管腔的表面的较小表面积而使共定位的定量计数具有挑战性。
表1.针对仅TAS2R38、GLP-1染色以及针对回肠组织(前四行)和结肠共定位的细胞的数量
进行使用野生型和TAS2R38敲除HuTu-80细胞的PTU和Z7对GLP-1释放的作用的剂量-反应研究。如图5中所示，PTU引起了GLP-1释放，其在具有TAS2R38的敲低的细胞中向右移位。图6、图7和图8示出使用TAS2R38受体siRNA，HuTu-80细胞中的受体表达和敲低。这些结果强烈地表明PTU配体与此受体相互作用。更大浓度的配体能够在受体表达降低的情况下引起GLP-1释放的事实表明，这些配体也与其它受体相互作用以引起GLP-1释放，或仅需要一小部分受体来提供完整反应。这些初步数据还表明，HuTu-80细胞的GLP-1释放对一些苦味配体敏感且具有特异性，从而使这些细胞成为快速筛选新化合物的理想模型。
对PTU-纤维素缀合物进行测试以观察GLP-1释放是否能够通过减缓PTU从胃肠道的吸收来维持。因为靶受体可从内腔进入，所以潜在药物分子不需要针对其药理学作用全身分配。图4B中的结果表明，PTU和PTU-纤维素两者均引起GLP-1释放到血液中，并且与单独PTU相比，在PTU-纤维素情况下的增加幅度更大且持续时间更长。单独纤维素没有作用。PTU纤维素数据表明，功能化PTU以减少吸收能够增强GLP-1释放，从而表明除了使由全身循环引起的副作用最小化外，潜在药物的肠限制还可用于控制GLP-1释放。
这些数据表明活化TAS2R38引起肠肽激素GLP-1的释放，从而使TAS2R38作为增加GLP-1水平的药剂成为新型糖尿病靶标，并且GLP-1类似物在糖尿病管理中有效。这些数据表明一组复杂的信号级联可以调节肠肽的释放并潜在地引起代谢作用。这也使得营养受体成为对具有异常肠肽信号传导的代谢疾病非常有吸引力的治疗靶标。从本研究中描述的TAS2R38的上下文中，可活化所述受体的食物的苦味(但安全的)组分可成为有希望的治疗候选物。本研究中提出的TAS2R38受体的结果揭示了筛选和鉴定能够活化所述受体并引起所需代谢作用(特别是对于糖尿病消退而言)的新型“苦味”分子的可能性。
实施例4
通过植物苦味化合物和脂肪酸配体释放GLP-1
还对暴露于植物苦味化合物、脂肪酸配体、PTC以及通过计算机建模被预测与TAS2R38相互作用的化合物的HuTu-80细胞进行了GLP-1释放测定。
测试了植物信号促进GLP-1释放的能力。图9A中的结果证明，石榴源性的鞣花单宁代谢物尿石素A和鞣花酸或枇杷三萜组分乌索酸和齐墩果酸在30分钟内引起GLP-1相对于基础释放的显著增加。
此外，图9B示出短链脂肪酸丙酸酯和丁酸酯或长链棕榈酸两者均刺激可与TAS2R38配体PTC和PTU(10mM)相当的GLP-1释放。对于这些实验，选择了可测量效应的浓度。
图10的左图示出在施用葡萄糖以及作为TAS2R38受体的配体的不同剂量的PTU分子后健康小鼠中的GLP-1反应。图10的右图示出在施用两种不同剂量的苦味肽BPx1后健康小鼠中的GLP-1反应。
图11示出未处理(si对照)或用TAS2R38siRNA媒介物(siTAS2R38)和所指示浓度持续30分钟处理的培养的HuTu-80细胞中通过苦味肽BPxl(图11A)和乱序聚丙氨酸肽Ala-Ala-Ala-Ala(图11B)刺激GLP-1释放。收集条件培养基并冷冻直到GLP-1测量。值是平均值±SD，N＝3。使用Luminex测定来测量GLP-1。数据表明苦味肽对GLP-1释放的作用主要是通过TAS2R38。此外，诸如聚丙氨酸的乱序肽在引起GLP-1释放方面是有效的。这些数据表明GLP-1释放对BPx1具有特异性。
上述各种方法和技术提供许多实施本发明的方式。当然，应理解根据本文中描述的任何特定实施方案不一定可实现所述的所有目标或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以实现或最优化如本文中教示的一个优点或一组优点的方式进行，而不一定需要实现本文中教示或指出的其它目标或优点。本文中提及多种有利的和不利的替代方案。应理解，一些优选实施方案专门地包括一个、另一个或若干有利的特征，而其它的实施方案专门地排除一个、另一个或若干不利的特征，而又一些其它的实施方案通过包括一个、另一个或若干有利的特征而专门地弱化现在不利的特征。
此外，技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，本领域的普通技术人员可混合和匹配上述各种要素、特征和步骤以及各个这样的要素、特征或步骤的其它已知等效物来执行根据本文所述的原理的方法。在不同的实施方案中，所述各要素、特征和步骤中的一些将被专门地包括而其它的则被专门地排除。
虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明的实施方案将专门公开的实施方案扩展到其它替代实施方案和/或用途以及其修改和等效物。
已经在本发明的实施方案中公开了许多变型和替代要素。更进一步的变型和替代要素对于本领域技术人员来说将是显而易见的。在这些变型中(但不限于)的是寡肽设计、受此类寡肽调节的受体、施用此类组合物的方法以及其中相关的治疗，包括通过本发明的教义产生的产品的具体用途。本发明的各个实施方案可具体地包括或排除这些变型或要素中的任一个。
在一些实施方案中，用于描述和要求本发明的某些实施方案的表示成分、特性(诸如浓度、反应条件等)的量的数值在一些情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，在书面描述和随附权利要求书中阐述的数值参数是可随通过特定的实施方案设法获得的希望特性而变化的近似值。在一些实施方案中，应该根据报道的有效数字的数目并且通过应用一般的舍入技术来解释数值参数。虽然阐述本发明的一些实施方案的广泛的范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定的实例中阐述的数值尽可能精确地被报告。在本发明的一些实施方案中提供的数值可含有由在它们的相应试验测量中见到的标准偏差必然产生的某些误差。
在一些实施方案中，在描述本发明的特定实施方案的上下文中(特别是在某些下列权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a/an)”和“该/所述”以及类似的引用可理解为涵盖单数和复数。本文中列举的数值范围仅仅希望作为单独提及落入范围中的每个独立数值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独数值均并入到本说明书中，如同本文单独列举每个单独数值一样。除非本文另外指明或上下文另外明显矛盾，否则可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法。使用相对于本文中的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的目的仅仅是希望更好地阐明本发明而不对另外要求的本发明的范围施加限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。
本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每个组成员可单独地提及并要求保护，或以与所述组的其它成员或本文中出现的其它要素的任何组合形式提及并要求保护。出于便利性和/或专利性的原因，一组的一个或多个成员可包括在一个组中或从一个组中删掉。当出现任何此类包括或删除时，本说明书在本文中应被认为包含所修改的组，因此满足所附权利要求书中使用的所有马库什(Markush)组的书面说明。
本文中描述了本发明的优选实施方案，其包括为发明者所知用来执行本发明的最佳模式。通过阅读上述描述，那些优选实施方案的变化形式对普通技术人员而言将变得显而易见。预计本领域技术人员可以适当地使用这些变化形式，并且可以用本文中特定描述的另外方式实践本发明。因此，经适用的法律许可，本发明的许多实施方案包括在此附加的权利要求中叙述的所有主题的修改和等效物。此外，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则在其所有可能变化形式的上述要素的任何组合都涵盖在本发明内。
此外，整个本说明书对专利和印刷的出版物做了很多引用。上文引用的参考文献和印刷的出版物中的每个均单独地以引用的方式整体并入本文。
应理解，本文所公开的本发明的实施方案是本发明原理的示例说明。可使用的其它修改可在本发明的范围之内。因此，例如，但不限于，可根据本文的教义使用本发明的替代配置。因此，本发明的实施方案不限于所精确显示和描述的。
序列表
<110> 西达-赛奈医疗中心
R•阿比拉
斯蒂芬•J•潘多尔
H•樊
<120> 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽
<130> 065472-000547WO00
<150> 62/151,306
<151> 2015-04-22
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>

Claims (40)

1.一种治疗、抑制有需要的受试者的糖尿病、降低所述受试者的糖尿病的严重程度、减缓所述受试者的糖尿病的进展和/或促进所述受试者的糖尿病的预防的方法，所述方法包括：
提供增加肠激素释放的药剂；以及
向有需要的受试者施用有效量的组合物，以便治疗、抑制所述受试者的糖尿病、降低所述受试者的糖尿病的严重程度、减缓所述受试者的糖尿病的进展和/或促进所述受试者的糖尿病的预防。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述药剂是一种或多种苦味寡肽。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述苦味寡肽包括YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述苦味寡肽基本上由YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的一种或多种组成。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述苦味寡肽与药剂缀合以增加肠保留。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述增加肠保留的药剂是纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合中的任何一种或多种。
7.如权利要求1所述的方法，其还包括提供源自食物的增加肠激素释放的脂肪酸或植物分子。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述源自食物的脂肪酸或植物分子是以下中的任何一种或多种：尿石素A、鞣花酸、乌索酸、齐墩果酸、6-间丙基-2-硫尿嘧啶、丙酸、丁酸酯、棕榈酸或其组合。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述肠激素是胰高血糖素肽-1(GLP-1)、肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)或其组合中的任何一种或多种。
10.如权利要求9所述的方法，其中GLP-1是GLP-1-(7-37)、GLP-1-(7-36)NH2或其组合中的任何一种或多种。
11.如权利要求1所述的方法，其中肠激素释放的增加由G蛋白偶联受体(GPCR)介导。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述GPCR在内分泌L-细胞的表面上表达。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述GPCR包括SSTR2、TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4中的一种或多种。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物口服、肠内施用至小肠或通过直肠栓剂或灌肠剂施用至结肠。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
17.如权利要求1所述的方法，其还包括施用SGLT2抑制剂、胰岛素、吸入胰岛素、磺酰脲类、二甲双胍、阿卡波糖、噻唑烷二酮或其组合中的任何一种或多种。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述有效量是约0.1mg/kg/天至0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、5mg/kg/天至10mg/kg/天、10mg/kg/天至20mg/kg/天、20mg/kg/天至50mg/kg/天、50mg/kg/天至100mg/kg/天、100mg/kg/天至200mg/kg/天、200mg/kg/天至300mg/kg/天、300mg/kg/天至400mg/kg/天、400mg/kg/天至500mg/kg/天、500mg/kg/天至600mg/kg/天、600mg/kg/天至700mg/kg/天、700mg/kg/天至800mg/kg/天、800mg/kg/天至900mg/kg/天或900mg/kg/天至1000mg/kg/天。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物在所述受试者患所述疾病状态之前、期间或之后施用至所述受试者。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物每天1-3次或每周1-7次施用至所述受试者。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物被施用至所述受试者持续1-5天、1-5周、1-5个月或1-5年。
22.如权利要求7所述的方法，其中所述药剂和所述源自食物的脂肪酸或植物分子顺序地或同时地施用。
23.一种药物组合物，其包含一种或多种苦味寡肽和药学上可接受的载体。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述苦味寡肽刺激胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、肽酪氨酸酪氨酸(PYY)或其组合的释放。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其中GLP-1、PYY或其组合的所述释放由G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导来介导。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述GPCR包括TAS2R38、TAS2R39、TAS2R46、TAS2R47、FFAR1、FFAR2、FFAR4或FFAR4、SSTR2中的一种或多种。
27.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述苦味寡肽包括YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的一种或多种。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其中所述苦味寡肽与纤维素、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)或其组合中的任何一种或多种缀合。
29.一种用于筛选用于治疗糖尿病的肽的方法，所述方法包括：
提供一种或多种候选肽；
使所述肽与分泌GLP-1的细胞接触；
确定所述接触是否引起GLP-1的分泌增加，GLP-1分泌的增加表明所述候选肽可用于治疗糖尿病。
30.根据权利要求29所述的筛选方法，其包括分别接触待测试的多种候选肽中的每一种。
31.如权利要求30所述的筛选方法，其中所述多种候选肽包括多于约104个样品。
32.如权利要求30所述的筛选方法，其中所述多个样品包括多于约5X 104个样品。
33.如权利要求29所述的筛选方法，其中所述候选肽是苦味寡肽。
34.如权利要求29所述的筛选方法，其中所述细胞是Hu-Tu80细胞。
35.一种治疗或减轻有需要的受试者的肥胖症的方法，所述方法包括：
提供增加肠激素释放的药剂；以及
向有需要的受试者施用有效量的所述组合物，以便治疗或减轻所述受试者的肥胖症。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述药剂是一种或多种苦味寡肽。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述苦味寡肽包括YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的一种或多种。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述苦味寡肽基本上由YGLF、YPFPGPIPN、IPAVF、LLF、其组合或者其类似物、药物等效物或肽模拟物中的一种或多种组成。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述苦味寡肽与药剂缀合以增加肠保留。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述增加肠保留的药剂是纤维素、脂肪酸和聚乙二醇(PEG)中的任何一种或多种。
CN201680034226.0A 2015-04-22 2016-04-22 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽 Active CN107708718B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210041768.8A CN114366802A (zh) 2015-04-22 2016-04-22 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562151306P 2015-04-22 2015-04-22
US62/151,306 2015-04-22
PCT/US2016/028841 WO2016172479A1 (en) 2015-04-22 2016-04-22 Enterically delivered bitter oligopeptides for the treatment for type 2 diabetes

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210041768.8A Division CN114366802A (zh) 2015-04-22 2016-04-22 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107708718A true CN107708718A (zh) 2018-02-16
CN107708718B CN107708718B (zh) 2022-01-11

Family

ID=57143514

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210041768.8A Pending CN114366802A (zh) 2015-04-22 2016-04-22 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽
CN201680034226.0A Active CN107708718B (zh) 2015-04-22 2016-04-22 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210041768.8A Pending CN114366802A (zh) 2015-04-22 2016-04-22 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20180110823A1 (zh)
EP (2) EP3285795B1 (zh)
CN (2) CN114366802A (zh)
WO (1) WO2016172479A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10835505B2 (en) * 2018-06-11 2020-11-17 Aardvark Therapeutics, Inc. Oral pharmaceutical formulation for weight loss, diabetes and related disorders
JP7450613B2 (ja) * 2019-04-26 2024-03-15 サントリーホールディングス株式会社 Ｇｌｐ－１分泌促進用組成物
WO2021042321A1 (zh) * 2019-09-05 2021-03-11 清华大学 基因修饰MSCs治疗2型糖尿病
CN115819508B (zh) * 2022-12-06 2023-07-18 中国农业大学 分离的寡肽及其在制备降血糖药物或食品中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009956A1 (en) * 2002-04-29 2004-01-15 Dehua Pei Inhibition of protein tyrosine phosphatases and SH2 domains by a neutral phosphotyrosine mimetic
US20100197605A1 (en) * 2007-09-11 2010-08-05 Dorian Bevec Therapeutic use of peptide yglf and combination with kvlpvpq
CN103596595A (zh) * 2011-06-02 2014-02-19 韩美科学株式会社 用于治疗糖尿病的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物
WO2014150563A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Mjn U.S. Holdings Llc Activating adiponectin by casein hydrolysate
WO2014150571A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Mjn U.S. Holdings Llc Reducing proinflammatory response

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3270960A (en) 1964-09-11 1966-09-06 Sperry Rand Corp Fluid sensor
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
IT1190891B (it) 1982-06-24 1988-02-24 Anic Spa Metodo per la sintesi in fase solida di polipeptidi retroinvertiti
US4747825A (en) 1984-06-29 1988-05-31 Ferring Laboratories, Inc. Apparatus and methodology for pulsed administration of growth promoting agents
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4948592A (en) 1986-05-09 1990-08-14 Alza Corporation Pulsed drug delivery
US4723958A (en) 1986-05-23 1988-02-09 Merck & Co., Inc. Pulsatile drug delivery system
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US4965251A (en) 1987-04-03 1990-10-23 The Board Of Regents Of The University Of Washington Pulse treatment of hemoglobinopathies with erythropoietin
DE10399032I1 (de) 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
FR2658432B1 (fr) 1990-02-22 1994-07-01 Medgenix Group Sa Microspheres pour la liberation controlee des substances hydrosolubles et procede de preparation.
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
DK0574402T3 (da) 1990-11-26 1998-05-18 Chiron Corp Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US5270181A (en) 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
BR9306984A (pt) 1992-08-27 1999-01-12 Deakin Res Ltd Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo
US5403590A (en) 1992-12-21 1995-04-04 New England Deaconess Hospital Corporation Method of pulsatile drug infusion
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5834441A (en) 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
DE69638058D1 (de) 1995-06-15 2009-11-26 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane rekombinante Adenoviren zur Gentherapie
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US6048551A (en) 1997-03-27 2000-04-11 Hilfinger; John M. Microsphere encapsulation of gene transfer vectors
US6365185B1 (en) 1998-03-26 2002-04-02 University Of Cincinnati Self-destructing, controlled release peroral drug delivery system
GB9927603D0 (en) * 1999-11-22 2000-01-19 Nestle Sa Use of a milk protein hydrolysate in the treatment of diabetes
AU2002367154A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-15 Smithkline Beecham Corporation Dosing regimen for ppar-gamma activators
JP2005531325A (ja) * 2002-07-03 2005-10-20 エイツー・コーポレーション・リミテッド 生乳の脂肪酸の組成を変える方法
EP1619958A1 (en) * 2003-05-05 2006-02-01 Unilever N.V. Peptides having an ace inhibiting effect
US20050287066A1 (en) 2004-06-28 2005-12-29 Monoace, Inc. Anti-rat angiotensin I-converting enzyme (ACE, CD143) monoclonal antibodies and uses thereof
JP5687425B2 (ja) * 2006-06-06 2015-03-18 オレグ イリッチ エプシュテイン 肥満、真性糖尿病及び耐糖能異常を伴う疾患の治療用薬剤
TW200813232A (en) * 2006-06-08 2008-03-16 Senomyx Inc Rationale, methods, and assays for identifying novel taste cell genes and salty taste receptor targets and assays using these identified genes or gene products
EP2679597A1 (en) * 2007-09-05 2014-01-01 Novo Nordisk A/S Glucagon-like peptide-1 derivatives and their pharmaceutical use
BRPI1006145B8 (pt) * 2009-01-12 2021-05-25 Biokier Inc composição e método para tratamento de diabetes
KR20130112019A (ko) * 2010-06-17 2013-10-11 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 호르몬을 조절하기 위한 방법 및 시스템 및 관련 방법, 작용제 및 조성물
SG191297A1 (en) * 2010-12-23 2013-07-31 Amazentis Sa Compositions and methods for improving mitochondrial function and treating neurodenegenerative diseases and cognitive disorders
KR102626825B1 (ko) * 2013-08-23 2024-01-17 디 에이2 밀크 컴퍼니 리미티드 베타-카세인 ａ２ 및 혈중 글루코스 수준

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009956A1 (en) * 2002-04-29 2004-01-15 Dehua Pei Inhibition of protein tyrosine phosphatases and SH2 domains by a neutral phosphotyrosine mimetic
US20100197605A1 (en) * 2007-09-11 2010-08-05 Dorian Bevec Therapeutic use of peptide yglf and combination with kvlpvpq
CN103596595A (zh) * 2011-06-02 2014-02-19 韩美科学株式会社 用于治疗糖尿病的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物
WO2014150563A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Mjn U.S. Holdings Llc Activating adiponectin by casein hydrolysate
WO2014150571A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Mjn U.S. Holdings Llc Reducing proinflammatory response
CN105142658A (zh) * 2013-03-15 2015-12-09 Mjn美国控股有限责任公司 减少促炎反应

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIANO BRANDELLI等: "Whey as a source of peptides with remarkable biological activities", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *
MIGUEL E. OSEGUERA-TOLEDO等: "Proteins and bioactive peptides", 《NUTRAFOODS》 *
XIAOWEI LIU等: "Identification of Bitter Peptides in Whey Protein Hydrolysate", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
李维林等: "《治疗糖尿病的中草药》", 31 May 2006, 东南大学出版社 *
许曼音等: "《糖尿病学》", 31 May 2010, 上海科学技术出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3285795A1 (en) 2018-02-28
US20180110823A1 (en) 2018-04-26
EP3285795B1 (en) 2022-11-16
WO2016172479A1 (en) 2016-10-27
EP3285795A4 (en) 2019-02-20
CN107708718B (zh) 2022-01-11
EP4194001A1 (en) 2023-06-14
CN114366802A (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107880101A (zh) 针对癌症的靶向细胞周期蛋白a1的t细胞免疫疗法
CN107708718A (zh) 用于治疗2型糖尿病的肠内递送的苦味寡肽
US11660335B2 (en) Vaccines against coronavirus and methods of use
CN109757100A (zh) 用于向中枢神经系统（cns）递送蛋白质的工程改造的寄生虫
EP4205762A1 (en) Improved dna vaccine for sars-cov-2
CN103200955A (zh) 包含肽和病毒神经氨酸酶抑制剂的组合物
AU2022201142A1 (en) Vaccine compositions and methods for restoring NKG2D pathway function against cancers
CN110325206A (zh) 用于管理病毒感染的多肽
CN106061501A (zh) 用于治疗和预防炎症相关疾病的涉及p62/sqstm1的方法和组合物
CN107847551A (zh) 具有抗病毒作用的肽和包含其的组合物
AU2021290231A1 (en) Arthrogenic alphavirus vaccine
US20200048318A1 (en) Myomerger polypeptides, nucleic acid molecules, cells, and related methods
US11560412B2 (en) Compositions comprising GRIM-19 therapeutics and methods of use
EP2884998B1 (en) Attenuated live vaccine for crimean-congo hemorrhagic fever virus and erve virus
CN103848914B (zh) 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
EP3517133A2 (en) Pharmaceutical composition containing mtor inhibitor for treating macular degeneration
KR20190034546A (ko) TATκ-CDKL5 융합 단백질, 그의 조성물, 제형 및 용도
US11547738B2 (en) Compositions and methods for treating fibrosis
KR102259320B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
US20200023036A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory respiratory disease containing fusion protein in which cell-penetrating peptide and ctctla4 peptide are fused as active ingredient
KR101711730B1 (ko) Dab2 유전자가 과발현된 수지상 세포를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
Alsamarai et al. SARS-CoV-2: Treatment and Therapeutic Approaches: SARS-CoV-2
US20220370598A1 (en) Vaccines Against Coronavirus and Methods of Use
CA2514955A1 (en) Compositions for modulating immune cell activity and methods for detection thereof
WO2023144779A1 (en) Coronavirus antigen variants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant