CN107206104A - 基于微小RNA miR‑574‑5p的化合物作为免疫调节剂的用途及它们的组合物 - Google Patents

基于微小RNA miR‑574‑5p的化合物作为免疫调节剂的用途及它们的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及miR‑574‑5p、miR‑574‑5p模拟物或衍生物和miR‑574‑5p抑制剂通过调节TLR7和/或TLR8信号转导发挥作用，从而作为免疫调节剂用于预防或治疗的用途。本发明还涉及包含miR‑574‑5p、miR‑574‑5p模拟物或衍生物、或miR‑574‑5p抑制剂的组合物，及其施用方法。

Description

基于微小RNA miR-574-5p的化合物作为免疫调节剂的用途及 它们的组合物
技术领域
本发明一般涉及免疫调节和免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物和miR-574-5p抑制剂的用途，特别是作为免疫调节剂和/或佐剂的用途，这些调节剂和/或佐剂优选通过调节哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导而发挥作用。本发明还涉及包含miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、或miR-574-5p抑制剂作为免疫调节剂和/或佐剂的组合物。本发明还涉及与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物异常的TLR8信号转导相关的疾病或病症的治疗或预防，其中包括对有此需要的对象施用miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物或miR-574-5p抑制剂、或者包含miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物或miR-574-5p抑制剂的组合物。
背景技术
受到病源性侵害时，生物体首先利用各种跨膜和分泌分子启动先天性免疫应答，诱导炎症因子的释放以及免疫细胞的激活，之后才激活适应性免疫应答(Ciraci等人，2012)。模式识别受体(PRR)，如Toll样受体(TLR)家族蛋白，是先天性免疫应答的重要成分，识别几种不同类的病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)，并因此引起迅速的免疫应答(Cervantes等人，2012；Aderem和Ulevitch，2000；Kawai和Akira，2009；Kawai和Akira，2011；Akira等人，2001；Pandey和Agrawal，2006；Kawai和Akira，2007a)。作为I型跨膜蛋白，TLR的特征在于由富含亮氨酸的重复单位构成的胞外结构域和与哺乳动物的白介素1的I型受体(IL-1R)同源的胞浆域，称为Toll/白介素-1受体结构域(TIR)(Gay和Keith，1991)。TLR的胞外域负责PAMP和DAMP的识别，而胞浆域是下游信号转导所必需的(Takeda和Akira，2005)。迄今为止，已描述了人类或小鼠体内的13种TLR (TLR1-TLR13)(O’Neill等人，2013)。根据PAMP/DAMP识别的需要，TLR在不同免疫细胞的表达模式具有较高的选择性(Chuang和Ulevitch，2000；Du等人，2000；Rock等人，1998；Takeuchi等人，1999；Chuang和Ulevitch，2001；Barton和Medzhitov，2003；Hedayat等人，2012)。
许多研究已表明，TLR通过识别各种内源和外源的配体，启动免疫和炎症应答(Akira和Takeda，2004；Moghimpour Bijani等人，2012；Akira等人，2001)。由于该原因，TLRs在细胞中有不同定位，即定位在在细胞表面上或定位在胞内体(endosomes)或溶酶体(lysosomes)上(Kawai和Akira，2007b；Latz等人，2004；Oldenburg等人，2012)。TLR7和TLR8高度同源，并与TLR3和TLR9一起形成TLR超家族内的一个亚家族。这个TLR亚家族的成员都能识别核酸，并在胞内体中表达，其信号转导有赖于胞内体的成熟(Du等，2000；Liu等，2010；Heil等，2003)。尽管病毒ssRNA和人工合成的ssRNA先前被认为是TLR7和TLR8仅有的配体(Heil等人，2004；Diebold等人，2004；Lund等人，2004)，研究已证明一些小分子,如咪唑喹啉和特定的核苷类似物，能激活TLR7和TLR8并引起TLR信号转导(Lee等人，2003；Schon和Schon，2008；Hemmi等人，2002；Jurk等人，2002)。在人类中，TLR7主要在浆细胞样树突状细胞(pDC)、B细胞和中性粒细胞中表达，而TLR8在单核细胞、巨噬细胞、髓样树突状细胞(mDC)和中性粒细胞中高度表达(Chuang和Ulevitch，2000；Iwasaki和Medzhitov，2004；Hemmi等人，2002；Jurk等人，2002；Gorden等人，2005；Jurk等人，2006)。由于细胞表达的这些差异，通过人TLR7的免疫应答的激活引起通过I型IFN产生控制的应答，而通过人TLR8的激活诱导多种促炎性细胞因子，如TNF、IL-12、IL-6、IL-8和IL-1(Barrat等，2005；Gorden等，2005；Pasare和Medzhitov，2005)。因此，通过TLR7和TLR8的免疫应答的激活主要引起T辅助细胞1(Th1)型免疫应答的诱导(Pasare和Medzhitov，2005)。寻找和发现新的高效TLR7和/或TLR8激动剂或拮抗剂在炎性疾病、自身免疫病和癌症的治疗方面具有十分重要的意义。
微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA(18至25个核苷酸长度)，通常通过结合至目标信使RNA(mRNA)的3’-非翻译区(3’UTR)来调节基因表达以引起mRNA降解和抑制翻译(Bartel，2009；Bartel，2004；Ambros， 2004)。作为基因表达的重要调节物，miRNA在多种生物过程和病理状态，包括细胞增殖、分化和凋亡、神经过程、致癌作用、免疫应答、病毒致病机理和代谢疾病中发挥作用(Miska，2005；Kutay等人，2006；Visone等人，2008；Saba等人，2014；Jiang等人，2014；Hammond，2015)。最近的研究还表明，miRNA在免疫应答中也有重要作用，可能涉及B细胞和T细胞的发育和分化的调控、单核细胞和中性粒细胞的增殖、抗体转换和炎症介质的释放(Lindsay，2008)。另一方面，已报道miRNA在多种疾病状态如癌症、自身免疫病、心血管疾病和神经退行性疾病中有异常表达(Bushati和Cohen，2007；Chang和Mendell，2007)。
研究已表明，许多miRNA在免疫和炎症应答调控中多个方面发挥着作用(Li等人，2007；Rodriguez等人，2007；Fontana等人，2007；Johnnidis等人，2008；Taganov等人，2006；Hou等人，2009；O'Connell等人，2007；Tili等人，2007；Sheedy等人，2010)。近期研究还显示，一些miRNA直接地或间接地作为TLR信号转导通路的重要调制物(Tserel等人，2011)(Olivieri等人，2013)(Bai等人，2012；Sun等人，2012；Alam和O'Neill，2011)，有助于控制和微调免疫应答以及免疫相关疾病的发展(O'Neill等人,2011)。就TLR7和TLR8来说，已有研究描述了大量天然的和合成的免疫刺激配体(在(Smits等人，2008)中回顾)。此外，作为短的ssRNA分子，有研究表明miRNA可以模拟病毒RNA直接与TLR7和/或TLR8结合，由此实现对致病核酸的检测(Olivieri等人，2013)。miRNA因此可以通过与具有与ssRNA结合能力的TLR结合，起到一个激动剂的作用，引起NF-κB信号传导通路激活和促炎性细胞因子的分泌(Fabbri，2012)。根据miRNA在免疫应答中可能发挥的核心作用，可以预期它们可以被开发来用作治疗药物(Van和Kauppinen，2014)。尤其令人感兴趣的是TLR的miRNA配体/激动剂/拮抗剂在治疗、特别是免疫治疗中的应用和作为疫苗佐剂的应用(Chew和Abastado，2013；Rhee等人，2010；Hennessy等人，2010)。该前提形成了本公开的基础。
编码miR-574-5p(本公开关注的miRNA)和miR-574-3p的人miRNA基因MIR574位于人4p14染色体区域的Fam114a1基因的第一个内含子区，并且与人TLR1/6/10直接相邻；小鼠Mir574基因则位于染色体小鼠5qC31染色体区，并且也与小鼠Tlr1/6直接相邻。miR-574-5p在哺乳动物中是进化保守的，且高度富含 鸟苷和尿苷(富含GU)。miR-574-5p在大多数组织中都有表达(Zhang等人，2014)。一些研究已表明，miR-574-5p的异常过表达可能与多种人类癌症相关；另一些研究表明miR-574-5p可能是疾病如败血症和系统性红斑狼疮的生物标记物(Meyers-Needham等人，2012；Ranade等人，2010；Ji等人，2013；Mao等人，2010)(Wang等人，2012)。不过，有关miR-574-5p在免疫和炎症应答以及在免疫相关疾病病情发展中的作用还很不清楚。
发明内容
本发明人近期发现，miR-574-5p或miR-574-5p模拟物或衍生物可以作为与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8结合的配体，在体外或体内引起TLR7和/或TLR8介导的免疫应答。因此，miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、或miR-574-5p抑制剂在与TLR7和/或TLR8介导的免疫和炎症应答相关的许多应用中是有用的，这些用途例如开发用于治疗或预防涉及异常的免疫活动的疾病如炎性疾病、自身免疫病和癌症的方法。本发明人发现，miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、或miR-574-5p抑制剂作为哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的配体/激动剂/拮抗剂的独特且广谱的免疫调节能力，其可以用于调节免疫疗法应用的免疫应答。
在本发明的第一方面，提供了miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、miR-574-5p抑制剂或其组合作为哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的激动剂的用途。
在第一方面的一个实施方案中，miR-574-5p模拟物或衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p或其组合。
在第一方面的另一实施方案中，提供了一种用于在细胞或对象中引起哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的组合物，其包含miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、或其组合，和/或药学上可接受的赋形剂。
在第一方面的另一实施方案中，提供了用于在对象中引起哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对 象施用有效量的miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、或其组合。
在第一方面的又一实施方案中，提供了用于在对象中引起哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的包含miR-574-5p、miR-574-5p模拟物或衍生物、或其组合的组合物。
在第一方面的再一实施方案中，哺乳动物TLR7是小鼠TLR7(mTLR7)，哺乳动物TLR8是人TLR8(hTLR8)。
在本发明的第二方面，提供了miR-574-5p抑制剂作为哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8拮抗剂的用途。
在第二方面的一个实施方案中，miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的短发夹RNA(shRNA)、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链小干扰RNA(siRNA)、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、锁核酸(LNA)修饰形式的模拟物或衍生物；或其组合。
在第二方面的另一实施方案中，提供了一种用于在细胞或对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的组合物，其包含miR-574-5p抑制剂和/或药学上可接受的赋形剂。
在第二方面的另一实施方案中，提供了一种用于在细胞或对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的组合物，其包含针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合；和/或药学上可接受的赋形剂。
在第二方面的又一实施方案中，提供了用于在对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的miR-574-5p抑制剂。
在第二方面的再一实施方案中，提供了用于在对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
在第二方面的再一实施方案中，提供了用于在对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的包含miR-574-5p抑制剂的组合物。
在第二方面的再一实施方案中，哺乳动物TLR7是小鼠TLR7(mTLR7)，哺乳动物TLR8是人TLR8(hTLR8)。
在本发明的第三方面，提供了miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合作为佐剂的用途。
在第三方面的一个实施方案中，佐剂可以与疫苗、抗菌剂或抗原一起施用给有此需要的对象。
在第三方面的另一实施方案中，提供一种组合物，其包含miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合，和疫苗、抗菌剂或抗原，以及药学上可接受的赋形剂。
在第三方面的另一实施方案中，miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p或其组合。
在第三方面的又一实施方案中，哺乳动物TLR7是小鼠TLR7(mTLR7)，哺乳动物TLR8是人TLR8(hTLR8)。
在第四方面中，本发明提供一种用于治疗患有与异常的哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症的对象的方法，所述疾病或病症例如是癌症、自身免疫病、气道炎症、炎性疾病、感染性疾病、皮肤病、过敏、哮喘或由病原体引起的疾病，该方法包括对患有这类疾病或病症的患者施用治 疗有效量的根据本发明的基于miR-574-5p的化合物。
在第五方面中，本发明提供一种用于预防对象的与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症例如是癌症、自身免疫病、气道炎症、炎性疾病、感染性疾病、皮肤病、过敏、哮喘或由病原体引起的疾病，该方法包括对易患这类疾病或病症的对象施用治疗有效量的根据本发明的基于miR-574-5p的化合物。
在本发明的一些实施方案中，miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或miR-574-5p抑制剂可以用于预防或治疗以下疾病：自身免疫病和炎性疾病，如SLE、MS和哮喘；病毒感染，如H5N1、VSV和SARS；细菌感染，如败血症；移植物抗宿主病；癌症，如肺癌、胰腺癌、CRC、前列腺癌和HNC；以及心血管和肺动脉高压。
在第六方面中，本发明的实施方案提供了诊断对象中与免疫相关状况有关的风险的方法，其包括：(i)确定与对照相比的相对miR-574-5p表达；(ii)如果对象具有与对照相比增加的miR-574-5p表达，则诊断为对象中增加的免疫相关状况的风险，或(iii)如果对象不具有与对照相比增加的miR-574-5p表达，则诊断为对象中没有增加的免疫相关状况的风险。
在第七方面中，本发明的实施方案提供了miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或miR-574-5p抑制剂在制备用于治疗与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症的药物中的用途。
在第七方面的一个实施方案中，miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合；其中miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
附图说明
图1说明人MIR574和小鼠Mir574基因在基因组中的位置、miR-574-5p在哺乳动物中的序列保守性和哺乳动物miR-574-5p与病毒来源的ssRNA之间的序列相似性。图1a示出人MIR574基因位于人染色体4p.14位点上，且与hTLR1/6/10直接相邻。图1b示出小鼠Mir574基因位于小鼠染色体5q.C31位点上，且与mTLR1/6直接相邻。图1c示出哺乳动物牛(bta，Bostaurus)、狗(cfa，Canis familiaris)、大棕蝠(efu，Eptesicus fuscus)、大猩猩(ggo，Gorilla gorilla)、人(hsa，Homo sapiens)、小鼠(mmu，Mus musculus)、猪(ssc，Susscrofa)之间的序列比对。图1d示出哺乳动物miR-574-5p miRNA序列和三种病毒来源的ssRNA序列之间的相似性。
图2说明利用RNA-蛋白质免疫共沉淀(co-IP)确定的miR-574-5p与mTlr7或hTLR8之间的RNA-蛋白质相互作用，和通过共聚焦荧光显微镜确定的miR-574-5p在胞内体溶酶体中的定位。图2a的co-IP分析展示了Dig-miR-574-5p与截短的hTLR8结合而不与截短的hTLR7结合。图2b的co-IP分析展示了Dig-miR-574-5p与全长的hTLR8结合而不与全长的hTLR7和hTLR9结合。图2c的co-IP分析展示了Dig-miR-574-5p与截短的mTLR7结合而不与截短的mTLR8结合。图2d的co-IP分析展示了Dig-miR-574-5p与全长的mTLR7结合而不与全长的mTLR8和mTLR9结合。图2e的共聚焦显微镜图片展示了miR-574-5p在胞内体或溶酶体中定位。用Dotap偶联的Cy3-miR-574-5p转染HeLa细胞(红色)后，再经LysoTracker DND-22染色(蓝色)，然后在共聚焦显微镜下拍照。
图3显示了通过miRNA qPCR分析人单核细胞THP1和宫颈癌细胞HeLa中miR-574-5p过表达或敲降。图3a展示了THP1细胞中miR-574-5p过表达或敲降。***，p<0.001。比较在phsa-MIR574转染组与pFlag-CMV2转染组以及pLV-miR-574-5p-shRNA转染组与LV-miR-shRNA-ctrl转染组间进行(n＝3-4)。图3b示出用于微阵列分析的HeLa细胞中慢病毒介导的miR-574-5p敲降。接种HeLa细胞后，用LV-miR-574-5p-shRNA或对照病毒感染96小时，收集细胞用于分析。**，p<0.01；组间比较在LV-miR-574-5p-shRNA转染组与LV-miR-shRNA-ctrl转染组间进行(n＝3)。
图4展示多个分析所确定的miR-574-5p对免疫应答的刺激。图4a的蛋白印迹(western blot)示出在THP1单核细胞中质粒介导的过表达miR-574-5p上调了酪氨酸-701磷酸化STAT1和总STAT1表达，而miR-574-5p敲降则抑制了MyD88、 TRAF3、酪氨酸-701磷酸化STAT1和总STAT1的蛋白表达，n＝3。图4b是上述蛋白印迹的统计分析。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，组间比较在phsa-MIR574转染组与pFlag-CMV2转染组间，或LV-miR-574-5p-shRNA转染与LV-miR-shRNA-ctrl转染组间进行。
图5的荧光素酶报告基因分析说明miR-574-5p通过激活hTLR8调控免疫和炎症应答。图5a示出质粒介导的miR-574-5p过表达在人THP1单核细胞中刺激了NFκB和干扰素介导的转录活性，而miR-574-5p敲降抑制了NFκB和干扰素介导的转录活性。用过表达或敲降质粒或对照质粒与荧光素酶报告基因质粒和pSV40-β-半乳糖苷酶质粒(4:3:1)共转染THP1细胞。24小时后，收集细胞用于荧光素酶报告基因分析和β-半乳糖苷酶活性分析。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，组间比较在phsa-MIR574转染组与pFlag-CMV2转染组，或pLV-miR-574-5p-shRNA转染组与pLV-miR-shRNA-ctrl转染组间进行，n＝3。图5b示出质粒介导的miR-574-5p过表达在HEK-Blue-TLR8细胞中刺激了NFκB和干扰素介导的转录活性，但在HEK-Blue-TLR7细胞中质粒介导的miR-574-5p过表达没此作用(除IFNβ外)(n＝4)。用指定的质粒转染THP1细胞24小时，或用LV-miR-574-5p-shRNA或对照慢病毒感染THP1细胞96小时。收获细胞用于蛋白印迹分析。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，组间比较在phsa-MIR574转染组与pFlag-CMV2转染组间进行。图5c示出在HEK-Blue-TLR8细胞中Dotap偶联的miR-574-5p转染刺激NFκB转录活性，但在HEK-Blue-TLR7细胞中Dotap偶联的miR-574-5p转染没此作用(n＝3)。HEK-Blue-TLR7或HEK-Blue-TLR8细胞接种后，共转染荧光素酶报告基因质粒(pNFκB-luc)和pSV40-β-半乳糖苷酶(3:1)。24小时后，在4mM尿苷不存在或存在的情况下用1μg/ml的R848或10μg/ml的Dotap-PS-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p刺激细胞8小时。miR-16用作阴性对照，而R848用作阳性对照。收集细胞用于荧光素酶活性分析。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，与对照培养基组相比；###，p<0.001，组间比较在Dotap-PS-miR-574-5p+尿苷处理组与Dotap-PS-miR-574-5p处理组间进行。
图6通过荧光素酶报告基因分析展示了敲降hTLR8或hTLR7对NFκB介导的转录活性的影响。图6a示出HEK-Blue-TLR7细胞转染hTLR7-shRNA质粒后hTLR7的敲降。利用图示质粒分别转染细胞。转染24小时后，收集细胞用于实时 定量PCR(qPCR)分析。***，p<0.001；pLV-sh-hTLR7-1/2转染组与pLV-sh-ctrl转染组相比；n＝3-4。图6b示出HEK-Blue-TLR8细胞中转染hTLR8-shRNA质粒后hTLR8的敲降效果。利用图示质粒分别转染细胞。24小时后，收集细胞用于qPCR分析。。***，p<0.001；pLV-sh-hTLR8-1/2/3转染组与pLV-sh-ctrl转染组对比；n＝3-4。图6c示出敲降hTLR7后抑制了1μg/ml R848对NFκB转录活性的激活作用，而不影响miR-574-5p对NFκB转录活性的激活作用。根据图示转染细胞。24小时后，收集细胞用于qPCR分析。NS，不显著；***，p<0.001；与pLV-sh-ctrl+Dotap-PS-miR-574-5p或pLV-sh-ctrl+R848进行比较，n＝3-4。图6d示出敲降hTLR8抑制了R848和miR-574-5p对NFκB转录活性的激活作用。根据图示转染细胞。24小时后，收集细胞用于qPCR分析。NS，不显著；***，p<0.001；与pLV-sh-ctrl+Dotap-PS-miR-574-5p或pLV-sh-ctrl+R848进行比较，n＝3-4。
图7的ELISA分析说明了miR-574-5p对hPBMC中IFNα/γ、TNFα和IL/6的分泌的影响。用1μg/ml R848或者10μg/ml Dotap-PS-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p处理hPBMC 24小时，或用LV-miR-ctrl或LV-MIR574感染hPBMC 96小时。收集细胞培养基用于ELISA分析。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；与对照培养基处理的或仅Dotap处理的或LV-miR-shRNA-ctrl对LV-miR-574-5p-shRNA进行比较，n＝3。图7a:IFNα。图7b:IFNγ。图7c:TNFα。图7d:IL6。
图8的流式细胞术分析说明miR-574-5p对分泌TNFα的hPBMC的影响。在6孔板中接种约1×106个人血单核细胞hPBMC，并用1μg/ml R848或10μg/ml Dotap-PS-miR-574-5p或仅Dotap进行处理。24小时后，收集细胞用于流式细胞术分析。图8a示出典型的流式细胞分析结果。图8b的流式细胞术分析的统计分析示出miR-574-5p刺激显著地增加了分泌TNFα的hPBMC的百分比。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；与仅Dotap处理组进行比较，n＝3。
图9的流式细胞术分析说明miR-574-5p对hPBMC中几种免疫细胞的分布的影响。图9a示出用miR-574-5p刺激后hPBMC中的免疫细胞分布变化。在6孔板中接种约1×106个hPBMC，用1μg/ml R848或10μg/ml Dotap-PS-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p处理。24小时后，收集细胞用于流式细胞术分析。T辅助细胞，Th(CD3+CD4+)；T毒性细胞，Tc(CD3+CD8+)；天然杀伤细胞，NK(CD3-CD56+)；天然杀伤T细胞，NKT(CD3+CD56+)和调节性T细胞，Treg(CD4+CD25+)。NS，不 显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；与Dotap-PS-miR-16处理组或仅Dotap处理组对比，n＝3。图9b是示出miR-574-5p引起hPMBC中免疫细胞分布变化的代表性流式细胞分析结果。
图10的ELISA分析示出miR-574-5p对小鼠巨噬细胞和mPBMC细胞因子分泌的刺激作用。图10a示出miR-574-5p处理显著地刺激小鼠腹膜巨噬细胞中的TNFα和IL6的分泌(n＝3-4)。在96孔板中接种约1×105个小鼠腹水巨噬细胞，并用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或1μg/ml的R848处理。刺激24小时后，收集培养基用于ELISA分析。**，p<0.01；与B6.WT+Dotap组进行比较。图10b示出R848和miR-574-5p对RAW264.7巨噬细胞的Tnfα分泌的影响。用1μg/ml R848和10μg/ml Dotap-PS-miR-574-5p+4mM尿苷刺激RAW264.7巨噬细胞24小时。***，p<0.01；与经Dotap+尿苷处理组进行比较，n＝3-4。图10c示出miR-574-5p对mPBMC细胞的Tnfα和IL6的分泌的影响。用10μg/ml Dotap-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p刺激24小时的mPBMC中Tnfα和IL6的分泌。***，p<0.01；与仅Dotap组进行比较，n＝3-6。
图11说明通过miR-574-5p激活mTLR7以调控小鼠体内的免疫和炎症应答。图11a示出慢病毒介导的miR-574-5p的过表达显著增加野生型C57BL/6小鼠中TNFα和IL6的血清水平，但是在mTLR7敲除的小鼠中该刺激显著减弱。NS，不显著；***，p<0.001；与B6.WT+LV-MIR-ctrl或B6.mTLR7-/-+LV-MIR-ctrl组进行比较；###，p<0.001，与B6.WT+LV-hsa-MIR574组进行比较；n＝4-6。图11b和图11c示出miR-574-5p处理显著地刺激B6.WT小鼠中分泌TNFα的mBMDC(流式细胞术)和mBMDC的TNFα分泌(ELISA)，但在B6.mTLR7-/-小鼠中该刺激显著减弱(n＝3)。在6孔板中接种约1×105或1×106个mBMDC，用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或100ng/ml的LPS处理。24小时后，收集细胞用于流式细胞术分析或ELISA分析。NS，不显著；**，p<0.01；***，p<0.001，与B6.WT+Dotap组或B6.mTLR7-/-+Dotap组进行比较。##，p<0.01；###，p<0.001；B6.mTLR7-/-+Dotap-PS-miR-574-5p与B6.WT+Dotap-PS-miR-574-5p相比。图11d示出miR-574-5p处理显著地增加B6.WT小鼠脾细胞中的CD69阳性脾细胞，但不增加B6.mTLR7-/-小鼠中的CD69阳性脾细胞。在6孔板中接种约1×106个小鼠脾细胞，用10μg/ml Dotap-PS-miR-574-5p或miR-16处理。24小时后，收集细胞用于流式细胞术分析。*，p<0.05；***，p<0.001，与B6.WT+Dotap组或B6.mTLR7-/- +Dotap组相比。###，p<0.001；B6.mTLR7-/-+Dotap-PS-miR-574-5p组与B6.WT+Dotap-PS-miR-574-5p组相比；n＝4。
图12的流式细胞术分析说明miR-574-5p对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)和脾T淋巴细胞的刺激作用。图12a示出miR-574-5p处理显著地刺激了来自野生型小鼠的CD11c+BMDC中的TNFα分泌，而在mTLR7敲除的小鼠来源的BMDC中该影响显著降低。图12b示出miR-574-5p处理显著地刺激了来自野生型小鼠的脾T淋巴细胞的激活(CD69)，而不能激活mTLR7敲除小鼠来源的脾T淋巴细胞。
图13说明通过微阵列杂交、qPCR或蛋白印迹检测miR-574-5p敲降的HeLa细胞中mRNA或蛋白表达的分析。CCL2，(C-C模体)配体-2；CD74，分化群-74；HLA-DRA，HLA II类组织相容性抗原，DRα链；HLA-C，主要组织相容性复合体，I类，C；IL8，白介素-8；IRF8，干扰素调节因子-8；NR4A1，核受体亚族-4，A组，成员-1；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体-1；SFRS1，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子-1；TSC1，结节性硬化-1。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，LV-miR-574-5p-shRNA组与LV-miR-shRNA-ctrl对比。图13a示出通过NimbleGen 12×135K微阵列杂交确定的miR-574-5p敲降的HeLa细胞中mRNA表达的火山图(n＝3)。根据本领域技术人员熟知的常规方法进行阵列杂交和数据处理。图中的红色点代表具有统计显著性的差异表达的基因。图中竖直的绿色线分别将被上调(151个基因)或被下调(661个基因)至少两倍的基因分开，而水平的绿线表示0.05的p值。图13b示出在miR-574-5p敲降的HeLa细胞中一些差异表达基因的蛋白表达的蛋白印迹分析验证。图13c示出在miR-574-5p敲降的HeLa细胞中一些差异表达基因的mRNA表达的qPCR分析验证(n＝3-5)。图13d示出在miR-574-5p敲降的HeLa细胞中661个显著下调的基因在30个信号转导途径和疾病通路中的富集。
图14说明异常的miR-574-5p信号转导与宫颈癌发展之间的相关性。图14a示出通过qPCR分析确定的来自18个人类患者的宫颈癌组织以及它们邻近的正常组织中的miR-574-5p表达差异。数据表示三次重复的平均值±标准差。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，宫颈肿瘤与邻近的正常组织相比。图14b示出敲降miR-574-5p显著降低HeLa细胞在裸鼠中的肿瘤生长。无胸腺的BALB/c裸鼠购自中国上海斯莱克实验动物有限公司(SLACLaboratory Animals Co Ltd)。分别在8周雄性裸鼠左侧和右侧(箭头所示部位)背部皮下注射2×106个 LV-miR-shRNA-ctrl和LV-miR-574-5p-shRNA感染的HeLa细胞。接种后4周解剖肿瘤用以比较分析。
图15说明来自人类SLE患者的血清样品和来自易发狼疮的雌性B6.Faslpr/lpr小鼠的血清或其他组织中的miR-574-5p表达水平的qPCR分析结果。图15aqPCR确定分析示出SLE患者中血清miR-574-5p的水平显著高于正常健康个体的水平。**，p<0.01，SLE患者与正常健康个体对比，n＝11。图15b示出通过qPCR确定的90天和180天的B6.WT小鼠或B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p的血清表达水平。*，p<0.05，***，p<0.001，B6.Faslpr/lpr与B6.WT对比；n＝3-6。图15c示出通过qPCR确定的90天和180天的B6.WT小鼠或B6.Faslpr/lpr小鼠肾脏中miR-574-5p的表达水平。*，p<0.05，***，p<0.001，B6.Faslpr/lpr与B6.WT对比，n＝3-6。图15d示出90天的B6.WT小鼠或B6.Faslpr/lpr小鼠的脑、心、肝、肺、淋巴结和脾组织中的miR-574-5p表达水平。NS，不显著；*，p<0.05；B6.Faslpr/lpr与B6.WT对比；n＝6-7。图15e示出180天的B6.WT小鼠或B6.Faslpr/lpr小鼠的脑、心、肝、肺、淋巴结和脾组织中的miR-574-5p表达水平。NS，不显著；*，p<0.05，**，p<0.01，B6.Faslpr/lpr与B6.WT对比；n＝6-7。
图16说明miR-574-5p敲降对20周龄的B6.Faslpr/lpr小鼠中与SLE和狼疮性肾炎相关的参数的改善作用。NS，不显著；**，p<0.01；***，p<0.001，LV-miR-574-5p-shRNA组与LV-miR-shRNA-ctr对比。miR-574-5p在小鼠体内的敲降是通过对小鼠注射携带针对miR-574-5p的shRNA的慢病毒而实现的。图16a示出在B6.Faslpr/lpr小鼠的肾和肝组织中慢病毒介导的miR-574-5p的敲降(n＝6)。图16b示出miR-574-5p敲降显著地改善了伴随着狼疮发展的脾肿大(n＝6)。图16c-h示出在易发狼疮的B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p敲降显著降低了血清抗dsDNA的自身抗体、血尿素氮、蛋白尿、血清TNFα、IL6和IFNα(n＝5-7)。不过蛋白尿和血清IFNα的变化不太显著。
图17说明20周龄的三组小鼠(B6.WT+未经处理、B6.Faslpr/lpr+LV-miR-shRNA-ctrl处理和B6.Faslpr/lpr+LV-miR-574-5p-shRNA处理)中的肾组织和肝组织的组织化学和免疫组化染色分析结果。所展示的结果代表了至少三只小鼠的典型结果。图17a示出通过PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色的肾皮质的组织化学染色和通过抗IgG抗体的肾皮质的免疫组化染色。图17b示出通过PAS染色的肾髓质的组织化学染色和通过抗IgG抗体的肾髓质的免疫组化染色。图 17c示出通过抗CD68抗体的肾皮质的免疫组化染色。图17d示出通过抗CD68抗体的肝组织的免疫组化染色。
图18的流式细胞分析说明miR-574-5p敲降改变了雌性B6.Faslpr/lpr小鼠中的脾免疫细胞的分布。图18a示出20周龄的经LV-miR-shRNA-ctrl处理的B6.Faslpr/lpr和经LV-miR-574-5p-shRNA处理的B6.Faslpr/lpr中脾免疫细胞的变化。小鼠脾细胞悬浮液由LV-miR-shRNA-ctrl或LV-miR-574-5p-shRNA处理的B6.Faslpr/lpr解剖到的脾组织制备而得。去除红细胞后，用所示的抗体对脾细胞进行染色，然后用于流式细胞术分析。T辅助细胞，Th(CD3+CD4+)；细胞毒性T细胞，Tc(CD3+CD8+)；天然杀伤细胞，NK，(CD3-NK1.1+)；天然杀伤T细胞，NKT(CD3+NK1.1+)和调节性T细胞，Treg(CD4+CD25+)。NS，不显著；*，p<0.05；LV-miR-574-5p-shRNA组与LV-miR-shRNA-ctrl对比；n＝6。图18b示出Th和NK/NKT细胞的流式细胞分析的代表性结果。图18c示出Tc和Treg细胞的流式细胞分析的代表性结果。
具体实施方式
给出下面的详细描述和实施例仅为了易于理解本发明和举例说明其优点，而不意图限制本发明。
在本公开全文中，通过引用参考各种出版物、专利和公开专利说明书。这些出版物、专利和公开专利说明书的公开内容通过引用并入本文。
本发明发现miR-574-5p、miR-574-5p衍生物和miR-574-5p抑制剂是有效的免疫调节化合物。miR-574-5p、miR-574-5p衍生物和miR-574-5p抑制剂的免疫调节潜力通过用miRNA和哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的一系列实验获得确认。由于该工作，现在已发现miR-574-5p、miR-574-5p衍生物和miR-574-5p抑制剂是免疫调节剂，且通过哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导起作用。具体地，本发明提供通过哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8调节免疫应答的天然的或合成的miR-574-5p以及具有改善的体内稳定性的miR-574-5p衍生物和miR-574-5p抑制剂。当作为哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的激动剂发挥作用时，miR-574-5p和其衍生物可以通过激活许多免疫细胞来引发多种多样的先天性或获得性免疫应答机制，伴随着生成的细胞因子和干扰素分泌、再加上抗原特异性抗体的产生和细胞介导的应答引起病原体或肿瘤细胞的消除。当作为哺 乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的拮抗剂发挥作用时，miR-574-5p的抑制剂(antagomiR-574-5p)可以通过阻断异常的哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导来抑制不期望的免疫和炎症应答。
本发明提供用于增强或减弱由miR-574-5p、miR-574-5p衍生物和miR-574-5p抑制剂引起的免疫和炎症应答的组合物和方法。这些组合物和方法用于免疫疗法或相关的应用，如用于癌症、自身免疫病、哮喘、过敏、和细菌、寄生虫和病毒感染的治疗。miR-574-5p和miR-574-5p衍生物可以与对于治疗或预防与免疫应答调节、特别是通过哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导的免疫应答调节相关的疾病或病症有用的其他试剂结合用作佐剂。
定义
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文所描述的方法、装置和材料相似的或等同的任何方法、装置和材料都可以用于本发明的实践。
如本文所使用的，术语“Toll样受体”和等同的“TLR”指至少十个高度保守的哺乳动物模式识别受体蛋白(TLR1-TLR10)家族的任何成员，其识别病原体相关分子模式(PAMP)并在先天性免疫中作为关键信号转导元素。TLR多肽都具有包括具有富含亮氨酸重复结构的胞外(细胞质外)结构域和涉及TLR信号转导的胞内(细胞质)结构域的特征性结构。TLR包括但不限于人TLR。
如本文所使用的，术语“激动剂”指与受体(例如TLR)一起，能诱导产生细胞应答的化合物。激动剂可以是直接与受体结合的配体。或者，激动剂可以与受体间接组合，例如通过(a)和直接与受体结合的另一分子形成复合物，或(b)可以导致另一化合物的修饰以使得该化合物可以直接与受体结合。一种激动剂可以是特定TLR的激动剂(例如TLR7和/或TLR8激动剂)。在本发明的一些实施方案中，mTLR7或hTLR8的激动剂可以是miR-574-5p或miR-574-5p衍生物。
如本文所使用的，术语“拮抗剂”指可以与受体组合以降低或抑制细胞活性的化合物。拮抗剂可以是直接与受体结合的配体。或者，拮抗剂可以与受体间接组合，例如通过(a)和能直接与受体结合的另一分子形成复合物，或(b)导致另一化合物的修饰已使得该化合物直接与受体结合。在本发明的一些实施方案中，mTLR7或hTLR8的拮抗剂可以是miR-574-5p抑制剂。
如本文所使用的，术语“miR”、“mir”和“miRNA”用于指微小RNA，一类能够调节RNA翻译的小RNA分子。
“miR-574-5p”指具有以下核酸序列的成熟miRNA：5’-UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU-3’。
如本文所使用的，术语“miR-574-5p抑制剂”指具有沉默miR-574-5p的能力的核苷酸链或其衍生物，其可以是针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
“PS(phosphothiolate)”指用于替代磷酸二酯键的通过其使核苷酸连接的硫代磷酸酯键。例如，“PS-miR-574-5p”指具有以下碱基序列的miRNA：5’-UsGsAsGsUsGsUsGsUsGsUsGsUsGsUsGsAsGsUsGsUsGsU-3’，其中“s”代表硫代磷酸酯键。
“Dotap”指用作转染试剂的脂质载体，其化学名称为1,2-二油酰基-3-三甲基胺-丙烷。
“吗啉基”指RNA序列用吗啉基基团修饰。
“2’-O-甲基”指RNA序列在2’位置用O-甲基基团修饰。
“2’-O-甲氧基乙基”指RNA序列在2’位置用O-甲氧基乙基基团修饰。
“2’-氟”指RNA序列在2’位置用氟基团修饰。
如本文所使用的，术语“基于miR-574-5p的化合物”指本发明说明书全文所公开的miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或miR-574-5p抑制剂。
如本文所使用的，术语“LNA”指修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2’氧和4’碳的额外的桥修饰。桥修饰将核糖“锁定”为3’-内型(North)构象，常见于A型双螺旋。有需要的时候，LNA核苷酸可以与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合，并根据沃森-克里克碱基配对规则与DNA或RNA杂交。
如本文所使用的，术语“佐剂”一般指一种物质，当添加至具免疫原性的 试剂如疫苗、抗菌剂或抗原时，佐剂能在受体宿主中增强或加强对免疫原混合物的免疫应答。TLR激动剂已被确定为具有潜在的疫苗佐剂性能的一类分子。在本发明的一些实施方案中，miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合可以用作佐剂。
如本文所使用的，术语“先天性免疫应答”指针对某些病原体相关分子模式(PAMP)的任何类型的免疫应答。先天性免疫，又称为天然免疫或自然免疫，主要涉及中性粒细胞、粒细胞、单核吞噬细胞、树突细胞、NKT细胞和NK细胞。先天性免疫应答可以包括但不限于I型干扰素产生(例如IFNα)、中性粒细胞激活、巨噬细胞激活、吞噬作用、调理作用、补体激活及其任意组合。
如本文所使用的，术语“适应性免疫应答”指任何类型的抗原特异性免疫应答。适应性免疫应答，也称为获得性免疫或特异性免疫应答，涉及以免疫记忆为特征的淋巴细胞。借助免疫记忆，第二次或之后暴露于抗原的应答比第一次暴露于抗原的应答更加强烈。术语适应性免疫应答包括体液(抗体)免疫和细胞介导的(细胞)免疫。
如本文所使用的，关于病症、疾病或病况使用的术语“治疗”指干预这类病症、疾病或病况以预防或减慢病症、疾病或病况的发展，预防、减慢或停止病症、疾病或病况的进程，或者消除病症、疾病或病况。
如本文所使用的，术语“自身免疫病”和等同的“自身免疫紊乱”和“自身免疫”指免疫介导的对来源于本人的组织或器官的急性或慢性损伤。该术语包含细胞介导的自身免疫和抗体介导的自身免疫，以及器官特异性或非器官特异性的自身免疫。自身免疫病包括胰岛素依赖型糖尿病、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、动脉粥样硬化及炎症性肠病。自身免疫病还包括但不限于强直性脊柱炎、自身免疫性溶血性贫血、白塞氏综合征、古德帕斯特综合征、格雷夫斯病、格林巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少症、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性硬化症、牛皮癣、结节病、硬化性胆管炎、干燥综合征、系统性硬化症(硬皮病、CREST综合征)、多发性大动脉炎、颞动脉炎和韦格纳肉芽肿。自身免疫病还包括一些免疫复合物相关的疾病。
如本文所使用的，术语“癌症”指一种本人来源与自身的异常复制细胞在 对象中以可检测的量存在的病况。癌症可以是恶性的或非恶性的。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内肿瘤、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞或非小细胞性)、黑色素瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、以及其它癌和恶性肿瘤。癌症可以是原发性或转移性的。
如本文所使用的，术语“感染”和等同的“感染性疾病”指一种其中感染性生物体或试剂在对象的血液或正常无菌组织或正常无菌区室中以可检测的量存在的病况。感染性生物体和试剂包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。术语包括急性感染和慢性感染以及败血症。
如本文所使用的，术语“细胞因子”指通过特异性受体作用于免疫细胞以影响免疫细胞的激活和功能的状态的大量可溶性蛋白或糖蛋白中的任一种。细胞因子包括干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、转化生长因子-β、集落刺激因子(CSF)、趋化因子以及其他。各种细胞因子影响先天性免疫、获得性免疫或两者。细胞因子具体包括但不限于IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、TNFα、TGFβ、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
“hPBMC”指人外周血单核细胞，“mPBMC”指小鼠外周血单核细胞。
如本文所使用的，术语“有效量”指实现或促进所期望结果所需的或足够的任意量。在一些例子中，有效量是治疗上有效的量。治疗上有效的量是在对象中实现或促进所期望的生物应答所需的或足够的任意量。任何具体的应用的有效量可以根据以下因素来改变：要治疗的疾病或病况、要施用的具体试剂、对象的大小、或者疾病或病况的严重程度。本领域普通技术人员可以根据经验确定具体试剂的有效量而不需要过度的实验。
如本文所使用的，术语“对象”指脊椎动物。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在另一些实施方案中对象是人。在其他实施方案中，对象是非人类脊椎动物，包括但不限于非人类灵长类动物、实验动物、家畜、驯养动物和非驯养动物。
如本文所使用的，术语“TLR7和/或TLR8配体”、“用于TLR7和/或TLR8的 配体”或“TLR7和/或TLR8激动剂或拮抗剂”指通过TLR7和/或TLR8结构域直接或间接与TLR7和/或TLR8相互作用并引起TLR7和/或TLR8介导的信号转导的分子。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8配体是天然配体，即在自然中发现的TLR7和/或TLR8配体。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8配体指除TLR7和/或TLR8的天然配体之外的分子，例如通过人类活动制备的分子。
术语“转染”指DNA或RNA被细胞摄取。当外源(即外来的)DNA或RNA被引入到细胞膜内侧时，细胞就已经被转染。转染可以是暂时的(即所引入的DNA或RNA保持在染色体外并在细胞分裂期间被稀释掉)或稳定的(即所引入的DNA或RNA整合到细胞基因组中或维持为稳定的游离单元)。
术语“miR-574-5p抑制剂”指抗miR-574-5p或拮抗miR-574-5p，其包括但不限于与miR-574-5p互补的单链RNA、与miR-574-5p互补的单链DNA、针对miR-574-5p的短发夹RNA、针对miR-574-5p的双链小干扰RNA、和与miR-574-5p互补的单链RNA的衍生物、与miR-574-5p互补的单链DNA的衍生物、针对miR-574-5p的短发夹RNA的衍生物、针对miR-574-5p的双链小干扰RNA的衍生物。
等同替代
上述发明已被尽量做了清晰和容易理解的详细描述。然而，在不背离本发明和所附权利要求的真实范围的情况下，本领域技术人员还可通过阅读本公开理解体会一些可以形式和细节上的改变。本发明的所有优点不一定已被本发明的每一个实施方案所涵盖。
本申请所引用的所有参考文献、专利和专利公开通过完整引用并入本文。
本发明通过以下非限制性实施例来加以说明。
实施例
下文的实施例旨在进一步举例说明本发明的一些示例性实施方案，而非意图限制本发明的范围。
本发明所采用的材料和方法描述如下。
动物和处理
除非另外表明，小鼠被安置在厦门大学实验动物中心的无特定病原体条件下，具有12小时-12小时的亮暗周期，定期提供食物，随时提供水。根据厦门大学机构动物使用和保护委员会批准的动物实验规程进行涉及动物的所有实验步骤。
易发狼疮小鼠(B6.MRL-Faslpr/J或B6.Faslpr/lpr)是从中国江苏省南京市南京大学获得的，而mTLR7缺陷小鼠(B6.129S1-TLR7tm1Flv/J，B6.mTLR7-/-)购自Jackson实验室(Cat#008380,Jackson实验室，美国缅因州巴尔港)。正常的野生型C57BL/6小鼠(B6.WT)作为B6.mTLR7-/-和B6.Faslpr/lpr两者的对照。
为了实现体内的miR-574-5p过表达，以1×107转化单位(TU)/只小鼠的剂量通过一次静脉注射过表达miR-574-5p的慢病毒或对照病毒来感染10周龄的雄性B6.mTLR7-/-或B6.WT小鼠。施用慢病毒后72小时，处死小鼠并收集血清和组织样品用于分析。
为了在体内敲降miR-574-5p，每两周一次地对8周龄的雌性B6.Faslpr/lpr小鼠静脉内注射2×106TU/只小鼠的LV-miR-574-5p-shRNA或它的对照慢病毒LV-miR-shRNA-ctrl，最后达到1.2×107TU/只小鼠的总量。最后一次注射后2周，从20周龄的小鼠收集血清、尿、肾和肝组织样品用于分析。通过膀胱按压收集尿。通过窦穿刺收集血液样品。
临床样品
所有的临床样品是在患者知情同意和依照赫尔辛基宣言(1975)的伦理指导方针的研究方案的情况下收集的，并经福建医科大学的机构医学伦理委员会批准。由在中国福州的福建医科大学协和医院招募没有任何年龄或性别分组的SLE的人类患者和健康对照组。所有SLE患者满足1997年美国风湿病学会修订的关于SLE的标准。患有其它疾病或合并感染的患者被排除。血液样品从知情同意后的所有参与者获得。分离hPBMC时合并了来自多个健康人类个体的血液样品。
细胞培养、转染和处理
小鼠巨噬细胞RAW264.7、人单核细胞THP1、宫颈癌HeLa细胞和胚胎肾细胞(HEK293T)购自美国模式培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，并根据说明书进行培养。过表达hTLR7和/或TLR8的HEK293T细胞(重新命名为HEK-Blue-hTLR7和/或TLR8)购自InvivoGen(美国加利福尼亚州圣地亚哥)， 并在补充了10％(体积/体积)FBS、Normocin(50μg/mL)、Blasticidin(10μg/mL)和Zeocin(100μg/mL)(InvivoGen)的DMEM中培养。
人类或小鼠周血单核细胞(hPBMC或mPBMC)通过Ficoll-hypaque梯度离心从健康人类供体或小鼠的全血中分离而得。这些细胞hPBMC/mPBMC在补充了10％(体积/体积)胎牛血清(FBS)的RPMI1640(Gibco，美国纽约格兰德岛)中培养。
小鼠腹水用8至10mL冰冷的PBS在7至10周龄的雌性B6.WT小鼠中通过腹腔灌洗获得。腹水巨噬细胞以350×g离心5分钟采集。将腹水巨噬细胞以5×105个细胞/ml重新铺板到补充了10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(均购自SangonBiotech，中国上海)的DMEM中，并在转染和刺激之前培养过夜。
脾细胞悬浮液由从7至10周龄的雌性B6.WT和B6.mTLR7-/-小鼠组织制备而得。使用红细胞裂解液(Cat#00-4300-54，eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行渗透性裂解5分钟去除红细胞，再通过以350×g离心5分钟获得脾细胞。得到的细胞以5×105个细胞/ml铺板于补充了补充了10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素的DMEM中。将小鼠脾细胞在转染和刺激之前培养过夜。
小鼠骨髓来源的树突状细胞(mBMDC)按传统方法制备。简言之，将来自7至10周龄的雌性B6.WT和B6.mTLR7-/-小鼠的小鼠胫骨和股骨获得的骨髓细胞穿过尼龙网以去除碎片，再将约3×106个细胞铺板于含有3ml树突状细胞培养基(补充了10％FBS、10ng/ml GM-CSF(Cat#14-8331-62，eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)和10ng/ml IL4(Cat#14-8041-62，eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)的RPMI1640)的6孔板中。在第4天和第7天，用新鲜培养基替换50％的培养基。在第7天和第8天，取出松散的粘着团，并温和地收集用于相关的实验。
将Lipofectamine-3000试剂(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)用于质粒DNA转染。由如表1列出的中国广东广州的Invitrogen或中国江苏南京的Genscript根据制造商的方案化学合成硫代磷酸化或地高辛标记的miRNA。阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵甲基-硫酸盐(Dotap，脂质体 转染试剂，Cat#1202375，Roche，Nonnenwald，德国潘茨堡)用于硫代磷酸化的miRNA的偶联。除非另外指明，Dotap偶联的和硫代磷酸化的miRNA以10μg/ml的工作浓度用于细胞转染。
TLR7和/或TLR8双激动剂瑞喹莫德(R848，Cat#tlrl-r848，Invivogen，美国加利福尼亚州圣地亚哥)以1μg/ml的工作浓度用于细胞处理。脂多糖(LPS)购自Sigma-Aldrich(Cat#L2630，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)，并以100ng/ml的浓度用于细胞处理。
质粒和慢病毒的构建
全长的人hTLR7和/或TLR8/9过表达质粒pFlag-hTLR7、pFlag-hTLR8和pFlag-hTLR9是厦门大学韩家淮教授惠赠。
为了制备过表达hTLR8胞外区(不包括跨膜和胞内结构域)的质粒，使用表3中列出的引物，由pFlag-hTLR8扩增截短的hTLR8(氨基酸27-827，hTLR827-827)，而由金黄色葡萄球菌亚种Aureus(Staphylococcus aureus subsp.Aureus)(Cat#USA300_TCH1516,ATCC)扩增蛋白A(PA)cDNA片段。通过重叠PCR来融合hTLR827-827和PA cDNA片段，将得到的hTLR827-827-PA片段插入到使用BglII和EcoRI限制性位点的果蝇表达系统载体pMT-BIP-V5-His(Cat#V413020，Biofeng，中国上海)以生成PA-和His-双标签的hTLR827-827过表达质粒phTLR827 -827-PA-His。以类似的方式，使用表3中列出的引物制备包含截短的hTLR7或mTLR7和/或TLR8的其它质粒，所述其它质粒包括phTLR727-838-PA-His、pmTLR727-839-PA-His和pmTLR827 -818-PA-His。
过表达人miR-574-5p(phsa-MIR574)、小鼠miR-574-5p(pFlag-Mir574)和携带用于miR-574-5p的shRNA(LV-miR-574-5p-shRNA)或阴性对照shRNA(LV-miR-shRNA-ctrl)的慢病毒的质粒如前所述。为了构建过表达miR-574-5p的慢病毒载体，用表3中列出的引物由人基因组DNA来PCR扩增345bp的人MIR574基因DNA片段。将PCR扩增的片段插入到慢病毒载体pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro(pLV-MIR-ctrl)中以生成pLV-hsa-MIR574。将病毒载体pLV-hsa-MIR574或pLV-MIR-ctrl以及三个慢病毒包装质粒(pMDL、pVSVG和pREV)共转染到HEK293T细胞中。pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro、pMDL、pVSVG和pREV为厦门大学韩家淮教授惠赠。每24小时收集三次包含慢病毒 (LV-hsa-MIR574和LV-MIR-ctrl)的培养基，用超速离心来纯化慢病毒。
通过在HapI和XhoI位点将表2列出的包含靶向hTLR7和hTLR8的shRNA序列的化学合成的双链DNA片段插入到质粒pLentiLox3.7中来构建表达针对hTLR7(NM_016562.3)和hTLR8(NM_016610.3)的小发夹RNA的质粒载体，产生质粒pLV-sh-hTLR7-1、pLV-sh-hTLR7-2、pLV-sh-hTLR8-1、pLV-sh-hTLR8-2、pLV-sh-hTLR8-3和pLV-sh-ctrl。插入的DNA片段通过DNA测序来验证。
miR-574-5p敲降的HeLa细胞中的mRNA微阵列分析
以20％至30％融合的密度将HeLa细胞接种于培养板上，并孵育过夜。在Polyberene(Cat#107689，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)的存在下用慢病毒LV-miR-574-5p-shRNA或LV-miR-shRNA-ctrl以1:1的感染复数进行HeLa细胞的慢病毒感染。病毒感染后96小时，收集细胞，并制备总RNA用于通过qPCR和微阵列分析的miR-574-5p和mRNA表达分析。
miR-574-5p敲降的HeLa细胞的mRNA表达的微阵列分析由KangChen Biotech(中国上海)用NimbleGen 12×135K微阵列(Roche NimbleGen公司，美国威斯康辛麦迪逊)进行。简言之，按照下列步骤将每个样品的总RNA用于标记和阵列杂交：1)用InvitrogenSuperscript ds-cDNA合成试剂盒进行逆转录；2)用NimbleGen单色DNA标记试剂盒来标记ds-cDNA；3)使用NimbleGen杂交系统进行阵列杂交，然后用NimbleGen洗涤缓冲剂试剂盒进行洗涤；4)使用Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪(Molecular Devices Corporation)进行阵列扫描。然后将扫描的图像导入NimbleScan软件(2.5版)用于网格比对和表达数据分析。通过包含在NimbleScan软件中的分位数归一化和鲁棒多芯片平均(Robust MultichipAverage)算法对表达数据进行归一化。使用Agilent GeneSpring GX v11.5.1软件进行另外的数据分析。通过火山图过滤确定了显著差异表达的基因。应用基因本体分析(Geneontology)以确定差异表达基因在这些生物通路中的富集。
实时定量PCR(qPCR)
对于mRNA的qPCR分析，使用所示的ReverTraKit(Cat#FSQ-101,Toyobo，日本东京)利用TRIzol(Invitrogen)提取的总RNA进行逆转录。根据制造商的方案，使用表4中列出的适当引物对，使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(Cat#QPK-212,Toyobo)和Step One Plus Real-Time PCR系统(Applied Biosystems Inc.，美国加利福尼亚福斯特市)进行qPCR，并以18SrRNA作为对照。
根据说明书，使用mirVana miRNA分离试剂盒(Cat#AM1556，Ambion，美国德克萨斯奥斯汀)提取血清总RNA，而使用TRIzol提取来自培养的细胞或组织的总RNA。使用所示的ReverTraKit(TOYOBO，中国上海)和表4中列出的miRNA特异性茎环引物逆转录5微升的总RNA。使用通用引物和使用表4中列出的miRNA特异性反向LNA-引物，用总RNA进行qPCR，以U6RNA作为内参。人血清miR-574-5p的qPCR分析，采用从11个人SLE患者和11个健康对照收集的血清样品。
荧光素酶报告基因分析
NFκB活性的荧光素酶报告基因质粒(pNFκB-luc)由厦门大学韩家淮惠赠，而干扰素活性的报告基因质粒(pISRE-luc、pGL3-IFNα-luc和pGL3-IFNβ-luc)由来自加拿大蒙特利尔麦吉尔大学林荣团教授惠赠。使用所示的荧光素酶报告基因分析系统(Cat#,Promega，美国威斯康辛麦迪逊)来确定用任意荧光素酶报告基因共转染的细胞中的荧光素酶报告基因活性。对于在所有的荧光素酶分析中，测定β-半乳糖苷酶活性以校准转染效率。使用合适对照的校准值对所有其他值进行归一化，以获得归一化的相对荧光素酶单位(RLU)。
miRNA-TLR蛋白质免疫共沉淀(co-IP)分析
为了表达和纯化截短的hTLR8蛋白(胞外区)，在质粒pCoHygro(Cat#K4130-01Biofeng，中国上海)的存在下，用phTLR827-827-PA-His转染黑腹果蝇Schneider 2(S2)细胞(Cat#R690-07，Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。转染后48小时，用含有300μg/mL潮霉素(Cat#10687-010Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)的Sf-900II SFM培养基(Cat#10902-096，Gibco，Grand Island，美国纽约)筛选细胞以获得稳定表达hTLR827-827-PA-His的细胞。用5mM浓度的CuSO4诱导约2.5×108个稳定细胞72小时，如前所述收集50ml的培养基。用IgG珠(Cat#17-0969-01，GE Healthcare，Connecticut，美国康涅狄格)纯化蛋白质hTLR827-827-PA-His，在200μl的NT2缓冲液中重悬，并将其用于miRNA-蛋白质co-IP。以类似的方式，过表达并纯化截短的蛋白质hTLR727-838-PA-His、mTLR727-839-PA-His和mTLR827-818-PA-His。
对于miRNA与截短的PA-和His-双标签TLR的体外co-IP，首先将1μg的5’-Dig标记的miR-16或miR-574-5p(Dig-miR-16和Dig-miR-574-5p，表1)与100μl上面纯化的hTLR827 -827-PA-His和900μl的NET2缓冲液混合以使得能够在4℃进行可能的miR-TLR相互作用3小时。然后，向混合物添加1μg的抗Dig抗体，并在4℃孵育过夜，以实现anti-Dig-(Dig-miR)相互作用。然后向混合物添加蛋白A/G珠(Genscript，中国江苏南京)，并另外孵育5小时。用NT2缓冲液洗涤珠6次。洗脱的样品用抗His和抗Dig抗体进行印迹(表5)。与截短的蛋白质hTLR727-838-PA-His、mTLR727-839-PA-His和mTLR827-818-PA-His进行类似的co-IP。
对于与全长TLR的co-IP，接种5×106个HEK293T细胞，并用大约5μg过表达带Flag标签的hTLR7和/或TLR8/9的质粒或过表达带HA标签的mT7/8/9的质粒进行转染。转染后24小时，如前所述，收获细胞并在冰上的300μl的多核糖体裂解缓冲液中通过超声进行裂解(Keene JD等人，2006)。裂解液以14,000×g离心15分钟。100μl得到的上清液与1μg的5’-Dig标记的和硫代磷酸化的miRNA在NET2缓冲液中在4℃孵育3小时。然后，向上清液加入抗Dig抗体，混合物在4℃孵育过夜。通过在4℃在终体积1ml的NET2缓冲液中孵育混合物与蛋白A/G珠5小时来实现下拉(pull-down)。将珠离心并用NT2缓冲液洗涤六次。使用抗Dig抗体、抗Flag抗体或抗HA抗体通过免疫印迹来分析洗脱的样品。
共聚焦荧光显微镜
将HeLa细胞接种到细胞培养板上，并生长至50％密度。然后用Dotap偶联的Cy3标记的miR-574-5p(Genscript，中国南京)转染细胞，并孵育24小时。转染的细胞然之用PBS洗涤四次，并与在PBS中以1:20000稀释的LysoTracker blue DND-22(Cat#L7525,Invitrogen)一起孵育2小时，然后在共聚焦显微镜下检查。
流式细胞分析
对于细胞表面染色，将hPBMC、mBMDC、巨噬细胞或小鼠脾细胞以1×106/孔的密度接种于6孔板，并用10μg/ml Dotap偶联的miR-574-5p或10μg/ml Dotap偶联的miR-16、或1μg/ml R848、或100ng/ml LPS处理。刺激后24小时，洗涤细胞，在冷的FACS缓冲液(包含0.1％叠氮化钠(Cat#S2002,Sigma-Aldrich，美国密苏里圣路易斯)和2％FBS的PBS)中重悬，然后在4℃孵育10分钟。之后，用表5列出的抗体对其染色30分钟。对于细胞内染色，用冷的FACS缓冲液洗涤细 胞，并在4℃将其固定在固定缓冲液(Cat#420801，BioLegend，美国加利福尼亚圣地亚哥)中1小时。然后用破膜液(Cat#421002，BioLegend，美国加利福尼亚圣地亚哥)洗涤细胞，并在4℃在破膜液中用抗TNFα抗体染色4小时。经染色的细胞用FACS缓冲液洗涤，并通过流式细胞术(LSRFortessa，BD，美国加利福尼亚州圣何塞)进行分析。
蛋白印迹或免疫印迹
使用表5列出的抗体通过标准方案进行蛋白印迹和免疫印迹。
IFNα/γ、TNFα和IL6和血清抗dsDNA自身抗体的ELISA分析
根据制造商的说明书，使用表6列出的ELISA试剂盒，分析细胞培养物或血清样品的上清液的人或小鼠IFNα/γ、TNFα和IL6和血清抗dsDNA的水平。
生化参数、免疫组化和形态测定分析
为了评价肾功能，根据制造商的说明书，使用来自Jiancheng BioengineeringInstitute(中国江苏南京)的商品化试剂盒来测量尿蛋白(Cat#C035-2，JianchengBioengineering Institute，中国江苏南京)浓度和血尿素氮(BUN,Cat#C013-2)。
对于组织和免疫组化分析，在20周龄时处死小鼠，迅速分离肾和肝组织，并在包于石蜡之前在10％福尔马林缓冲液(体积/体积)中固定24小时。5μm厚度的肾组织切片用高碘酸-希夫试剂(PAS，Cat#YM0715LA13，Yuanye BioTechnology，中国上海)染色，并在光学显微镜下检查。对于IgG沉积，肾切片与过氧化酶偶联的抗小鼠IgG一起孵育。使用显色底物3-3’二氨基联苯胺(Cat#1412232031,Maixin Biotech，中国福建福州)显色。另外，对肾和肝组织进行切片脱蜡，再水化，并在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复。然后切片与1:200稀释的抗CD68抗体(Abcam，英国伦敦剑桥)一起在4℃孵育过夜，然后用所指示的DAB(链霉亲合素-生物素)Detection Kit(Cat#KIT-0017，Maixin Biotech)处理。
其他数据采集、图像处理和统计分析
通过具有GeneScope V1.73软件的Biosense SC8108GelDocumentation System(Shanghai BioTech，中国上海)拍摄蛋白印迹图像。将凝胶图像导入Photoshop中用于定向和裁剪。数据是平均值±标准差。使用利用单向方差分析结合 Bonferonni检验用于多重比较，学生t检验(双尾)用于配对比较。
表1.从Invitrogen(中国广州)或Genscript(中国南京)购买的化学合成和HPLC纯化的miRNA的列表
注：Dig，地高辛；PS，硫代磷酸化的；s，硫代磷酸酯键。
表2.miRNA和mRNA的慢病毒shRNA载体列表
表4.用于miRNA和mRNA的qPCR分析的引物列表。LNA，锁核苷酸。
表5.本研究中用于免疫印迹(IB)、免疫沉淀(IP)、流式细胞术或免疫组化的抗体的列表
表6.本研究中所使用的ELISA试剂盒的列表
实施例1 miR-574-5p序列的相似性分析
人MIR574基因位于人染色体4p.14上，且与hTLR1/6/10直接相邻。数据基于Ensembl Release 79(http://asia.ensembl.org/index.html？redirect＝no)。令人感兴趣的是，先前通过连锁分析发现4p.16-15.2区域与SLE密切相关。小鼠Mir574基因位于小鼠染色体5q.C31上，且与mTLR1/6直接相邻。数据基于Ensembl Release 79。序列比对显示miR-574-5p是高度富含GU的，且在哺乳动物牛(bta，Bos taurus)、狗(cfa，Canisfamiliaris)、大棕蝠(efu，Eptesicus fuscus)、大猩猩(ggo，Gorilla gorilla)、人(hsa，Homo sapiens)、小鼠(mmu，Mus musculus)、猪(ssc，Sus scrofa)之间是进化上保守的。人和小鼠miR-574-5p序列基于miRBase 21(http://www.mirbase.org)。其他miR-574-5p序列的序列是由相应的mir574基因的前体序列预测的。RNA40来源于HIV-1RNA的U5区域，ssRNA83和ssRNA120来源于SARS冠状病毒基因组。哺乳动物miR-574-5p miRNA序列与三种病毒来源的ssRNA序列之间的相似性显示miR-574-5p可能是哺乳动物TLR7或哺乳动物TLR8可能的配体(见图1)。
实施例2 miR-574-5p是hTLR8和mTLR7的一种内源性配体
为了确定miR-574-5p是否可以作为TLR配体，分析了miR-574-5p结合至人或小鼠TLR的能力。根据前述的方法，首先使hTLR7和/或TLR8或mTLR7和/或TLR8与来自金黄色葡萄球菌的蛋白A(PA)融合，并在黑腹果蝇S2细胞中表达融合蛋白。纯化PA和组氨酸(His)-双标签的截短的TLR蛋白，并将其与地高辛(Dig)标记的miR-574-5p或miR-16一起孵育，以实现可能的miRNA-TLR相互作用。根据本领域技术人员熟知的常规方法进行RNA-蛋白免疫共沉淀(co-IP)。在Dig标记的miR-574-5p或miR-16被抗Dig抗体下拉之后，通过抗His抗体的免疫印迹显示，在抗Dig免疫沉淀物中仅检测到胞外hTLR8或mTLR7而没有胞外hTLR7或mTLR8(见图2a和2c)。在表达全长hTLR7和/或TLR8/9或mTLR7和/或TLR8/9的HEK293T细胞中，类似的co-IP分析显示，在Dig-miR-574-5p-免疫共沉淀物中仅检测到hTLR8或mTLR7而没有hTLR7/9或mTLR8/9(见图2b和2d)。用Dotap偶联的Cy3-miR-574-5p(红色)转染HeLa细胞，并用LysoTracker DND-22(蓝色)染色，并在共聚焦显微镜下观察。共聚焦显微镜显影从另一角度证明外源引入的miR-574-5p主要位于HeLa细胞的胞内体/溶酶体(见图2e)，使得miR-574-5p能够与TLR7与TLR8进行物理相互作用。总之，这些结果清楚地证实miR-574-5p能够与胞内体hTLR8或mTLR7特异性结合，表明miR-574-5p是hTLR7和/或TLR8和mTLR7和/或TLR8的新的内源性配体。
实施例3 miR-574-5p对免疫应答的刺激
为了评价miR-574-5p对免疫和炎症应答的影响，首先对人单核细胞THP1细胞和宫颈癌HeLa细胞中的miR-574-5p进行过表达或敲降。接种HeLa细胞并用LV-miR-574-5p-shRNA或对照病毒进行感染。感染后96小时，收集细胞用于分析。结果通过miRNA qPCR验证。**，p<0.01；LV-miR-574-5p-shRNA处理组与LV-miR-shRNA-ctrl处理组对比(n＝3)(见图3a和3b)。然后进行蛋白印迹分析和相应的统计分析，结果表明miR-574-5p的过表达显著地增加未磷酸化的信号转导与转录激活因子-1(STAT1)和Y701-磷酸化的STAT1，而miR-574-5p的抑制显著地抑制髓样分化初次应答基因-88(MyD88)、TNF受体相关因子-3(TRAF3)、未磷酸化的STAT1和Y701-磷酸化的STAT1的蛋白表达。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，phsa-MIR574转染组与pFlag-CMV2转染组对比，或LV-miR-574-5p-shRNA转染组与LV-miR-shRNA-ctrl转染组对比(图4a和4b)。
实施例4 miR-574-5p和miR-574-5p衍生物通过激活人hTLR8调节免疫和炎症应答
用图5a示出的指定质粒pLV-miR-574-5p-shRNA和对照质粒与荧光素酶报告基因质粒和pSV40-β-半乳糖苷酶(4:3:1)一起共转染THP1细胞，并孵育24小时。收集细胞用于荧光素酶报告基因分析和β-半乳糖苷酶活性分析。根据本领域技术人员熟知的常规方法进行荧光素酶报告基因分析。荧光素酶报告基因分析表明，在THP1单核细胞中，质粒介导的miR-574-5p过表达刺激NFκB和干扰素介导的转录活性，而miR-574-5p敲降抑制NFκB和干扰素介导的转录活性。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，phsa-MIR57转染组与pFlag-CMV2转染组对比，或pLV-miR-574-5p-shRNA转染组与pLV-miR-shRNA-ctrl对比，n＝3(见图5a)。
分别用图5b示出的指定质粒phsa-MIR574或pFlag-CMV2转染分别稳定表达hTLR7或hTLR8的HEK-Blue-hTLR7或HEK-Blue-hTLR8细胞24小时。收集细胞用于蛋白印迹分析。在HEK-Blue-TLR8细胞中质粒介导的miR-574-5p过表达刺激NFκB(通过pNFκB-luc-报告基因分析的)和干扰素介导的转录活性(分别通过 pGL3-ISRE-luc、pGL3-IFNα-luc和pGL3-IFNβ-luc分析的)，但在HEK-Blue-TLR7细胞中质粒介导的miR-574-5p过表达没有刺激NFκB和干扰素介导的转录活性(除IFNβ外)(n＝4)(见图5b)。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，phsa-MIR574转染组与pFlag-CMV2转染组对比。
这些结果表明miR-574-5p在免疫和炎症应答中发挥着重要调节作用。为了确定通过miR-574-5p的hTLR8的专一性激活，在HEK-Blue-hTLR7或HEK-Blue-hTLR8细胞中用Dotap偶联的miR-574-5p或miR-16进行转染研究。使HEK-Blue-TLR7或HEK-Blue-TLR8细胞生长，并用荧光素酶报告基因质粒(pNFκB-luc)和pSV40-β-半乳糖苷酶(3:1)共转染。转染后24小时，在4mM尿苷不存在或存在的情况下用1μg/ml的R848或10μg/ml的Dotap-PS-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p刺激细胞8小时。miR-16用作阴性对照，而R848用作阳性对照。收集细胞用于荧光素酶活性分析。荧光素酶报告基因分析表明在HEK-Blue-TLR8细胞中Dotap偶联的miR-574-5p转染刺激NFκB转录活性，但在HEK-Blue-TLR7细胞中Dotap偶联的miR-574-5p转染没有刺激NFκB转录活性(n＝3)(见图5c)。令人感兴趣的是，尿苷的存在显著地增强miR-574-5p对hTLR8的刺激作用，这与hTLR8X-射线晶体结构研究的最新发现一致。通过一系列的转染实验进一步验证了miR-574-5p对hTLR8的结合和激活的特异性。总之，这些数据证实miR-574-5p是hTLR8的特异和有效的激动剂。
实施例5敲降hTLR8显著降低由miR-574-5p引起的NFκB转录活性
为了评估hTLR7和hTLR8对NFκB介导的转录活性的影响，首先在HEK-Blue-TLR7细胞中分别用图6a所示pLV-sh-hTLR7-1、pLV-sh-hTLR7-2或对照质粒转染细胞对hTLR7进行敲降。转染后24小时，收获细胞用于qPCR分析。对于pLV-sh-ctrl对pLV-sh-hTLR7-1或pLV-sh-hTLR7-2进行统计比较(见图6a)。***，p<0.001；n＝3-4。
第二，在HEK-Blue-TLR8细胞中分别用图6b示出的指示质粒pLV-sh-hTLR8-1、pLV-sh-hTLR8-2、pLV-sh-hTLR8-3或对照质粒转染细胞对hTLR8进行敲降。转染后24小时，收集细胞用于qPCR分析。比较了pLV-sh-ctrl转染组与pLV-sh-hTLR7-1或pLV-sh-hTLR7-2转染组。在pLV-sh-ctrl和pLV-sh-hTLR8-1、pLV-sh-hTLR8-2或pLV-sh-hTLR8-3之间进行统计比较。***，p<0.001；n＝3-4(见图6b)。
第三，在HEK-Blue-TLR7细胞中然后分别用图6c示出的质粒转染对hTLR7进行敲降。。转染后24小时，收集细胞用于qPCR分析。NS，不显著；***，p<0.001；与pLV-sh-ctrl+Dotap-PS-miR-574-5p或pLV-sh-ctrl+R848进行比较，n＝3-4(见图6c)。结果表明在HEK-Blue-TLR7细胞中hTLR7敲降后不会改变miR-574-5p引起的NFκB介导的转录活性。
第四，在HEK-Blue-TLR8细胞中分别用图6d示出的质粒转染细胞对hTLR8进行敲降。转染后24小时，收集细胞用于qPCR分析。NS，不显著；***，p<0.001；与pLV-sh-ctrl+Dotap-PS-miR-574-5p或pLV-sh-ctrl+R848进行比较，n＝3-4(见图6d)。结果表明在HEK-Blue-TLR8细胞中hTLR8敲降显著降低了miR-574-5p引起的NFκB转录活性。
总之，这些数据证实敲降hTLR8而非hTLR7显著降低了miR-574-5p对NFκB转录活性。
实施例6 hPNMC中miR-574-5p和miR-574-5p衍生物的暴露有效地刺激IFNα、IFNγ、TNFα和IL/6的分泌
用1μg/ml的R848或者10μg/ml的Dotap-PS-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p处理hPBMC 24小时。或者，用LV-miR-ctrl或LV-miR574感染hPBMC96小时。然后，收集培养基用于ELISA分析。ELISA分析表明miR-574-5p暴露有效地刺激hPBMC中IFNα/γ、TNFα和IL/6的分泌。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；LV-miR-574-5p-shRNA转染组与经对照培养基处理的或仅Dotap处理的或LV-miR-shRNA-ctrl进行比较，n＝3(见图7)。
实施例7 miR-574-5p和miR-574-5p衍生物的转染显著地增加分泌TNFα的hPBMC的百分比
在6孔板中接种约1×106个hPBMC，并用1μg/ml的R848或10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或仅Dotap处理。处理后24小时，收集细胞用于流式细胞术分析。流式细胞分析显示miR-574-5p暴露显著地增加分泌TNFα的hPBMC的百分比。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；与仅Dotap进行比较，n＝3(见图8)。
实施例8 miR-574-5p和miR-574-5p衍生物的暴露引起hPBMC中免疫细胞分布的显著变化
miR-574-5p被用于刺激以评估hPBMC中的免疫细胞重新分布。在6孔板中接种约1×106个hPBMC，并用1μg/ml的R848或10μg/ml的Dotap-PS-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p处理。处理后24小时，收集细胞用于流式细胞术分析。T辅助细胞，Th(CD3+CD4+)；细胞毒性T细胞，Tc(CD3+CD8+)；天然杀伤细胞，NK，(CD3-CD56+)；天然杀伤T细胞，NKT(CD3+CD56+)和调控T细胞，Treg(CD4+CD25+)。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；与Dotap-PS-miR-16处理组或仅Dotap处理组进行比较，n＝3(见图9a)。图9b示出代表性流式细胞结果证明miR-574-5p引起hPMBC中的免疫细胞重新分布。
实施例9 miR-574-5p和miR-574-5p衍生物刺激小鼠巨噬细胞和小鼠外周血单核细胞(mPBMC)中的细胞因子分泌
使用miR-574-5p诱导小鼠腹膜巨噬细胞中的TNFα和IL6分泌(n＝3-4)。在96孔板中接种约1×105个小鼠腹膜巨噬细胞，并用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或1μg/mlR848处理。刺激后24小时，收集培养基用于ELISA分析。**，p<0.01；与Dotap-PS-miR-16处理组或仅Dotap处理组进行比较(见图10a)。
用1μg/ml的R848和10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p+4mM尿苷刺激培养的RAW264.7巨噬细胞中的Tnfα分泌24小时。***，p<0.01；与经Dotap+尿苷处理的进行比较，n＝3-4(见图10b)。
用10μg/ml的Dotap-miR-16或Dotap-PS-miR-574-5p刺激mPBMC中Tnfα和IL6分泌24小时。***，p<0.01；与仅Dotap的进行比较，n＝3-6(见图10c)。这些ELISA分析表明miR-574-5p刺激小鼠巨噬细胞和mPBMC中的细胞因子分泌。
实施例10 miR-574-5p和miR-574-5p衍生物在小鼠中激活mTLR7以调节免疫和炎症应答
对于体内的miR-574-5p过表达，以1×107转化单位(TU)/只小鼠的剂量通过一次静脉注射过表达miR-574-5p的慢病毒或对照病毒来感染10周龄的雄性B6.mTLR7-/-或B6.WT小鼠。注射慢病毒后72小时，处死小鼠并收集血清和组织样品用于分析。结果显示慢病毒介导的miR-574-5p过表达显著增加野生型C57BL/6小鼠中TNFα和IL6的血清水平，但是在mTLR7敲除的小鼠中该刺激大幅减弱。NS，不显著；***，p<0.001；与B6.WT+LV-MIR-ctrl组或B6.mTLR7-/-+ LV-MIR-ctrl组进行比较；###，p<0.001，与B6.WT+LV-hsa-MIR574组进行比较；n＝4-6(见图11a)。
在6孔板中接种约1×105或1×106个mBMDC，并用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或100ng/ml的LPS处理。24小时后，收集细胞用于流式细胞术分析或ELISA分析。结果表明miR-574-5p暴露显著地增加B6.WT小鼠中分泌TNFα的mBMDC细胞数量(流式细胞术)和mBMDC的TNFα分泌(ELISA)，但在B6.mTLR7-/-小鼠中没有该现象(n＝3)。NS，不显著；**，p<0.01；***，p<0.001，与B6.WT+Dotap组或B6.mTLR7-/-+Dotap组进行比较。##，p<0.01；###，p<0.001；B6.mTLR7-/-+Dotap-PS-miR-574-5p组与B6.WT+Dotap-PS-miR-574-5p组对比(见图11b和c)。
在6孔板中接种约1×106个脾细胞，并用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或miR-16处理。处理后24小时，收集细胞用于流式细胞术分析。结果表明miR-574-5p暴露显著地增加B6.WT小鼠中CD69阳性脾细胞，但没有增加B6.mTLR7-/-小鼠中CD69阳性脾细胞(n＝4)。*，p<0.05；***，p<0.001，与B6.WT+Dotap或B6.mTLR7-/-+Dotap进行比较。###，p<0.001；B6.mTLR7-/-+Dotap-PS-miR-574-5p组与B6.WT+Dotap-PS-miR-574-5p对比(见图11d)。
实施例11 miR-574-5p或miR-574-5p衍生物对骨髓来源树突状细胞(BMDC)和脾T淋巴细胞的刺激的代表性流式细胞术分析
分别在6孔板中接种约1×105或1×106个来自野生型小鼠或B6.mTLR7-/-小鼠的mBMDC，并分别用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或100ng/ml的LPS处理。处理后24小时，收集细胞用于流式细胞分析。结果表明miR-574-5p显著地刺激来自野生型小鼠的CD11c+BMDC中的TNFα分泌，但是在mTLR7敲除的小鼠中该影响大幅降低(见图12a)。
分别在6孔板中接种约1×105或1×106个来自野生型小鼠或B6.mTLR7-/-小鼠的脾T淋巴细胞，并分别用10μg/ml的Dotap-PS-miR-574-5p或10μg/ml的Dotap-PS-miR-16处理。处理后24小时，收集细胞用于流式细胞术分析。结果表明miR-574-5p显著地刺激来自野生型小鼠的脾T淋巴细胞的激活(CD69)，但是在mTLR7敲除的小鼠中该影响大幅降低(见图12b)。
实施例12通过微阵列、qPCR或蛋白印迹来分析miR-574-5p敲降的HeLa细 胞中的mRNA或蛋白表达
通过NimbleGen 12×135K微阵列杂交确定miR-574-5p敲降的HeLa细胞中mRNA表达的火山图(n＝3)。根据本领域技术人员熟知的常规方法进行阵列杂交和数据处理。图中的红色点代表具有统计显著性的差异表达的基因。图中竖直的绿色线分别代表了被上调(151个基因)或被下调(661个基因)至少两倍的基因的分界线，而水平的绿线表示0.05的p值(见图13a)。通过蛋白印迹确定miR-574-5p敲降的HeLa细胞中的选定基因HLA-C、HLA-DRA、IRF8和β-肌动蛋白的蛋白表达(见图13b)。通过qPCR确定miR-574-5p敲降的HeLa细胞中的选定基因CCL2、CD74、HLA-DRA、HLA-C、IL6、IL8、IRF7、IRF8、NR4A1、OLR1、SFRS1和TSC1的mRNA表达(n＝3-5)(见图13c)。在miR-574-5p敲降的HeLa细胞中有30个信号转导和疾病通路中的661个基因显著下调(见图13d)。CCL2，(C-C模体)配体-2；CD74，分化群-74；HLA-DRA，HLA II类组织相容性抗原，DRα链；HLA-C，主要组织相容性复合体，I类，C；IL8，白介素-8；IRF8，干扰素调节因子-8；NR4A1，核受体亚族-4，A组，成员-1；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体-1；SFRS1，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子-1；TSC1，结节性硬化-1。NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，LV-miR-574-5p-shRNA组与LV-miR-shRNA-ctrl组对比。
实施例13异常的miR-574-5p信号转导显著地促进宫颈癌发展
根据制造商的说明书，使用TRIzol提取来自培养的细胞或组织的总RNA。使用所示的ReverTraKit(TOYOBO，中国上海)和表4中列出的miRNA特异性茎环引物逆转录5微升的总RNA。使用通用引物和表4中列出的miRNA特异性反向LNA-引物，用总RNA进行qPCR，以U6RNA作为内部对照。
通过qPCR确定来自18个人类患者的宫颈癌组织以及它们邻近的正常组织中的miR-574-5p表达。数据表示三次重复的平均值±标准差(见图14a)。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，宫颈癌组织与邻近的正常组织对比。
用2×106个HeLa细胞在8周雄性裸鼠的背部进行皮下接种，左侧接种感染LV-miR-shRNA-ctrl的细胞而右侧接种感染LV-miR-574-5p-shRNA的细胞。无胸腺的BALB/c裸鼠购自中国上海斯莱克实验动物有限公司获得的。接种后4周切下肿瘤。结果表明在接种了HeLa细胞的裸鼠中miR-574-5p的敲降显著降低肿瘤生长。 (见图14b)
实施例14人系统性红斑狼疮(SLE)患者和雌性易发狼疮B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p水平的测量
根据制造商的说明书使用mirVana miRNA分离试剂盒(Cat#AM1556，Ambion，美国德克萨斯奥斯汀)提取血清总RNA，而根据制造商的说明书使用TRIzol提取来自培养的细胞或组织的总RNA。使用所指示的ReverTraKit(TOYOBO，中国上海)和表4中列出的miRNA特异性茎环引物逆转录5微升的总RNA。使用通用引物和表4中列出的miRNA特异性反向LNA-引物，用总RNA进行qPCR，以U6RNA作为内参。
通过qPCR测量miR-574-5p水平。图15a示出通过qPCR确定的正常健康个体和SLE患者中miR-574-5p的血清水平。**，p<0.01，SLE患者与正常健康个体对比，n＝11。图15b示出通过qPCR确定的90天和180天的B6.WT或B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p的血清水平。*，p<0.05，***，p<0.001，B6.Faslpr/lpr组与B6.WT组对比；n＝3-6。图15c示出通过qPCR确定的90天和180天的B6.WT或B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p的肾脏水平。*，p<0.05，***，p<0.001，B6.Faslpr/lpr组与B6.WT组对比；n＝3-6。图15d示出90天的B6.WT或B6.Faslpr/lpr小鼠的脑、心、肝、肺、淋巴结和脾组织中的miR-574-5p水平；n＝6-7。如15e示出180天的B6.WT或B6.Faslpr/lpr小鼠的脑、心、肝、肺、淋巴结和脾组织中的miR-574-5p水平。NS，不显著；*，p<0.05，**，p<0.01，B6.Faslpr/lpr组与B6.WT组对比；n＝6-7。
总之，这些数据证实来自人SLE患者的血清样品和来自雌性易发狼疮B6.Faslpr/lpr小鼠的血清和其他组织中的miR-574-5p被显著上调。
实施例15在20周龄的B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p的敲降显著改善与SLE和狼疮性肾炎相关的参数
miR-574-5p的体内沉默是通过用携带针对miR-574-5p的shRNA、即所述的miR-574-5p抑制剂的慢病毒处理来实现的。图16a示出在B6.Faslpr/lpr小鼠的肾和肝中慢病毒介导的miR-574-5p的敲降(n＝6)。图16b示出miR-574-5p的抑制显著地改善与狼疮相关的脾肿大(n＝6)。图16c-h示出在易发狼疮B6.Faslpr/lpr小鼠模型中miR-574-5p的沉默导致减少的血清抗dsDNA的自身抗体、血尿素氮、蛋白尿、血清TNFα、IL6和IFNα(n＝5-7)，尽管蛋白尿和血清IFNα的统计差异不显著。 NS，不显著；**，p<0.01；***，p<0.001，LV-miR-574-5p-shRNA组与LV-miR-shRNA-ctrl组对比。总之，这些数据证实在B6.Faslpr/lpr小鼠中miR-574-5p的敲降显著改善与SLE和狼疮性肾炎相关的参数。
实施例16组织化学和免疫组化染色分析
对20周龄的未处理的B6.WT、经LV-miR-shRNA-ctrl处理的B6.Faslpr/lpr和经LV-miR-574-5p-shRNA处理的B6.Faslpr/lpr的肾组织和肝组织进行组织化学和免疫组化染色分析。每组至少三只小鼠。图17a示出通过PAS染色的肾皮质的组织化学染色和通过抗IgG抗体的肾皮质的免疫组化染色。图17b示出通过PAS染色的肾髓质的组织化学染色和通过抗IgG抗体的肾髓质的免疫组化染色。图17c示出通过抗CD68抗体的肾皮质的免疫组化染色。图17d示出通过抗CD68抗体的肝组织的免疫组化染色。
实施例17miR-574-5p敲降改变雌性B6.Faslpr/lpr小鼠中脾免疫细胞的分布
分别用质粒LV-miR-shRNA-ctrl或LV-miR-574-5p-shRNA处理20周龄的B6.Faslpr /lpr中的脾免疫细胞。由经LV-miR-shRNA-ctrl处理的或经LV-miR-574-5p-shRNA处理的B6.Faslpr/lpr切割的脾组织制备小鼠脾细胞悬浮液。去除红细胞后，用所指出的特定抗体对脾细胞进行染色，并将其用于流式细胞术分析。T辅助细胞，Th(CD3+CD4+)；细胞毒性T细胞，Tc(CD3+CD8+)；天然杀伤细胞，NK，(CD3-NK1.1+)；天然杀伤T细胞，NKT(CD3+NK1.1+)和调控T细胞，Treg(CD4+CD25+)。NS，不显著；*，p<0.05；LV-miR-574-5p-shRNA组与LV-miR-shRNA-ctrl组对比；n＝6(见图18a)。Th和NK/NKT细胞的流式细胞术分析的代表性结果在图18b中示出。Tc和Treg细胞的流式细胞术分析的代表性结果在图18c中示出。流式细胞分析显示miR-574-5p敲降改变了雌性B6.Faslpr/lpr小鼠中的脾免疫细胞分布。
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Claims (40)

1.miR-574-5p、miR-574-5p衍生物和miR-574-5p抑制剂作为免疫调节剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述miR-574-5p和/或miR-574-5p衍生物用作哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的激动剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述miR-574-5p和/或miR-574-5p衍生物用作小鼠mTLR7和/或人hTLR8的激动剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述miR-574-5p抑制剂用作哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8的拮抗剂。
6.根据权利要求1或5所述的用途，其中所述miR-574-5p抑制剂用作小鼠mTLR7和/或人hTLR8的拮抗剂。
7.根据权利要求1、5或6所述的用途，其中所述miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
8.一种用于在细胞或对象中引起哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的组合物，其包含miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合，和/或药学上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是hTLR8。
11.一种用于在对象中引起哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
14.一种用于在对象中引起哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的权利要求5或6所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
16.一种用于抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的组合物，其包含miR-574-5p抑制剂和/或药学上可接受的赋形剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述哺乳动物TLR7是mTLR7，所述哺乳动物TLR8是hTLR8。
19.一种用于在对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的miR-574-5p抑制剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
22.一种用于在对象中抑制哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8介导的免疫应答的方法，其包括对有此需要的对象施用有效量的权利要求16或17所述的组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
24.miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合用作佐剂的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述佐剂与疫苗、抗菌剂或抗原一起施用。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合。
27.一种组合物，其包含有效量的miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或其组合，和疫苗、抗菌剂或抗原，以及药学上可接受的赋形剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合。
29.一种用于治疗患有与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症的对象的方法，其包括对患有这类疾病或病症的患者施用有效量的miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或miR-574-5p抑制剂，其中所述与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症选自癌症、自身免疫病、气道炎症、炎性疾病、感染性疾病、皮肤病、过敏、哮喘或者由病原体引起的疾病。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合；其中所述miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
32.一种用于预防对象罹患与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症的方法，其包括对患有这种病症或疾病的患者施用有效量的miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或miR-574-5p抑制剂，其中所述与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症选自癌症、自身免疫病、气道炎症、炎性疾病、感染性疾病、皮肤病、过敏、哮喘或者由病原体引起的疾病。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合；其中所述miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
35.根据权利要求29或32所述的方法，所述与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症选自：自身免疫病和炎性疾病，如SLE、MS和哮喘；病毒感染，如H5N1、VSV和SARS；细菌感染，如败血症；移植物抗宿主病；癌症，如肺癌、胰腺癌、CRC、前列腺癌和HNC；以及心血管和肺动脉高压。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
37.一种诊断对象中与免疫相关状况有关的风险的方法，其包括：(i)确定与对照相比的相对miR-574-5p表达；(ii)如果对象具有与对照相比增加的miR-574-5p表达，则诊断为对象中增加的免疫相关状况的风险，或(iii)如果对象不具有与对照相比增加的miR-574-5p表达，则诊断为对象中没有增加的免疫相关状况的风险。
38.miR-574-5p、miR-574-5p衍生物或miR-574-5p抑制剂在制备用于治疗与哺乳动物TLR7和/或哺乳动物TLR8信号转导相关的疾病或病症的药物中的用途。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述miR-574-5p衍生物选自PS-miR-574-5p、吗啉基-miR-574-5p、2’-O-甲基-miR-574-5p、2’-O-甲氧乙基-miR-574-5p、2’-氟-miR-574-5p及其组合；其中所述miR-574-5p抑制剂选自针对miR-574-5p的shRNA、与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、与miR-574-5p互补的单链DNA；与miR-574-5p互补的单链RNA、靶向miR-574-5p的双链siRNA、和与miR-574-5p互补的单链DNA的硫代磷酸酯修饰、吗啉基修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧乙基修饰、2’-氟修饰、LNA修饰形式的衍生物；或其组合。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述哺乳动物TLR7是小鼠mTLR7，所述哺乳动物TLR8是人hTLR8。
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