KR20210095132A - 뉴로메딘 펩티드를 이용하여 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 방법 - Google Patents

뉴로메딘 펩티드를 이용하여 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 방법 Download PDF

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KR20210095132A
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마크 씨 시라쿠사
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럿거스, 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴 저지
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Abstract

천연 및 변이체 뉴로메딘 B(Nmb) 펩티드 또는 코딩 서열을 이용하여, 예를 들어 IL-5 및 Il-13 활성을 감소시킴으로써 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 염증성 장애, 예컨대, 천식, COPD 또는 알레르기 반응을 치료하는 데 사용될 수 있다. 변형된 Nmb 펩티드 또한 제공한다.

Description

뉴로메딘 펩티드를 이용하여 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 4일에 제출된 미국 출원 제62/741,188호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
분야
본 출원은 천연 및 변이체 뉴로메딘 펩티드를 이용하여, 예를 들어 인터류킨(IL: interleukin)-5 및 IL-13 활성을 감소시킴으로써 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 상기 방법은 염증성 장애, 예컨대, 천식 또는 알레르기 반응을 치료하는 데 사용된다.
정부 지원 승인
본 발명은 미국 국립 보건원(NIH: National Institutes of Health)에 의해 수여된 R01 AI131634-01 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
인터류킨(IL)-4, 5, 9 및 13 생산을 특징으로 하는 2형 사이토카인 반응은 기생충에 대한 면역을 촉진시키고, 조직 수복을 개시하고, 대사 건강을 조절하지만, 알레르기 및 천식과 연관된 염증의 원인이 되기도 한다(1-4). 분화된 선천 면역 세포 집단 사이의 크로스-토크가 2형 사이토카인 반응의 강도를 지시할 수 있다(5). 예를 들어, 호염기구는 2형 선천 림프구양 세포(ILC2: type 2 innate lymphoid cell)에 신호를 전달함으로써 그의 IL-5 및 IL-13 생산을 촉진시킨다(6, 7). 추가로, 뉴런 유래 펩티드 뉴로메딘 U(NMU: neuromedin U)는 ILC2를 직접 활성화시켜 니포스트롱길러스 브라실리엔시스(Nb: Nippostrongylus brasiliensis)에 대한 면역을 촉진시킨다(8, 9). 그러나, 2형 염증을 제한하고, 조직 무결성을 촉진시키기 위해 면역 및 신경계가 소통하는지 그 여부는 여전히 충분히 정의되지 않은 상태이다.
Nb 유도성 ILC2 반응은 호염기구 부재하에서는 과장되어 나타나고, 그 결과로 염증은 증가되고, 폐 기능은 감소되는 것으로 본원에 제시되어 있다. 추가로, 호염기구 고갈 마우스로부터의 ILC2는 그의 활성화 증진과 연관된 뉴로메딘 B(Nmb: neuromedin B) 수용체를 감소된 수준으로 발현하는 것으로 제시되어 있다. Nmb 펩티드의 생체내 투여가 감염 유도성 ILC2 반응, 폐 호산구 및 기생충 소거를 감소시켰다. 더욱이, Nmb 처리는 대조군 마우스로부터의 분류 정제된 폐 ILC2에 의한 IL-5 및 IL-13 발현을 감소시키는 데 충분하였지만, 호염기구 고갈 마우스는 그렇지 않았다. 추가로, Nmb는 또한 활성화된 T 헬퍼 2형(TH2: T helper type 2) T 세포에 의한 IL-5 및 IL-13 발현을 감소시키는 데에도 충분하였다. 종합해보면, 이들 데이터는 호염기구가, 염증을 제한하고, 조직 무결성을 유지하는 데 필요한 뉴런 유래 신호에 반응할 수 있는 ILC2의 능력을 매개한다는 것을 입증한다. 추가로, 이들 데이터는 또한 Nmb 처리가 2형 염증을 촉진하는 IL-5 및 IL-13의 선천 및 적응 공급원 둘 모두를 감소시키는 데 충분하다는 것도 입증한다.
이러한 관찰결과에 기초하여, 본원에서는 포유동물 대상체에서 장애, 예컨대, 염증성 장애, 예를 들어, 바람직하지 않은 인터류킨-5(IL-5) 및/또는 IL-13 생산/활성과 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 상기 방법은 IL-5 활성을 감소, IL-13 활성을 감소, ILC2 반응을 감소, TH2 반응을 감소, 호산구증가증을 감소시키거나, 또는 이들의 조합을 달성함으로써 장애를 치료한다. 치료될 수 있는 예시적인 장애로는 기도 장애(예컨대, 천식, 부비강염, 특발성 폐 섬유증, 비염, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구성 식도염, 또는 COPD) 및 피부 장애(예컨대, 습진, 아토피성 피부염, 또는 두드러기)를 포함한다. 다른 예시적인 장애는 표 1에 제공되어 있다.
본 방법은 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 또는 수의 대상체에게 치료 유효량의, 적어도 하나의 뉴로메딘 B(Nmb) 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 투여하여 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 Nmb 단백질은 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 예에서, Nmb 단백질을 사용하는 대신, 뉴로메딘 C(Nmc: neuromedin C) 단백질, 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질이 사용된다. 일부 예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 Nmb 단백질을 코딩한다. 다른 예에서, 핵산 분자는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 Nmc 단백질을 코딩한다. 일부 예에서, 적어도 2개의 상이한 Nmb 단백질, 예컨대, (1) 서열번호 1이 아닌, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 Nmb 단백질, 및 (2) 서열번호 1이 아닌, 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 적어도 하나의 Nmb 단백질이 사용된다. 일부 예에서, 적어도 2개의 상이한 Nmb 단백질, 예컨대, (1) 서열번호 1, 및 (2) 서열번호 1이 아닌, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 Nmb 단백질이 사용된다. 추가 예에서, 적어도 하나의 Nmb 단백질 및 적어도 하나의 Nmc 단백질이 사용된다. 일부 예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 이는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노 연관 바이러스 벡터의 일부일 수 있다. 핵산 분자가 투여되는 예에서, 상기 핵산 분자는 프로모터, 예컨대, 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 예에서, 투여는 주사(예컨대, iv, im, ip, 또는 진피내), 경구 투여, 흡입식 투여, 또는 국소 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 Sprr2a2, Serpinb2, Il1b, Xist 및 Tsix를 포함하는 제1 유전자 세트 중 하나 이상의 발현을 상향조절한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 Hgs2, Nkg7, Klra7, P2rx7, Ly6c2 및 Mcpt2를 포함하는 제2 유전자 세트 중 하나 이상의 발현을 하향조절한다. 추가 실시양태에서, 본 방법은 Sprr2a2, Serpinb2, Il1b, Xist 및 Tsix를 포함하는 제1 유전자 세트 중 하나 이상의 발현을 상향조절하고, Hgs2, Nkg7, Klra7, P2rx7, Ly6c2 및 Mcpt2를 포함하는 제2 유전자 세트 중 하나 이상의 발현을 하향조절한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 대상체, 예컨대, 염증성 또는 기도 장애를 앓는 대상체의 폐에서 세포 침윤물 수준을 감소시킨다.
적어도 하나의 Nmb 또는 Nmc 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자는 약학 조성물, 예컨대, 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 물 또는 염수를 포함하는 약학 조성물에 존재할 수 있다. 상기 조성물은 다른 치료 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 치료 유효량의, 적어도 하나의 Nmb 또는 Nmc 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자의 적어도 2회 별개 투여가 대상체에게 제공되고, 예컨대, 적어도 2회 별개 투여는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 1년 떨어져 있다. 일부 예에서, 투여는 장애 발병 5분 이내, 10분 이내, 30분 이내, 1시간 이내, 2시간 이내, 3시간 이내, 4시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내, 48시간 이내, 72시간 이내, 96시간 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 또는 3개월 이내에 이루어진다. 본 방법은 대상체에게 치료 유효량의 또 다른 치료제(예컨대, 표 1 참조)를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 추가 치료제는 프로스타글란딘 E2(PGE2: prostaglandin E2)이다.
서열번호 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 Nmb 단백질 및 리포솜을 포함하는 조성물로서, 여기서, Nmb 단백질이 리포솜에 캡슐화되어 있는 것인 조성물 또한 제공한다. 서열번호 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 Nmb 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물 또한 제공한다. 서열번호 1 또는 38이 아닌, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물 또한 제공한다. 일부 예에서, 상기 조성물은 비천연 Nmb 단백질이 리포솜에 캡슐화되어 있는 리포솜을 포함한다. (1) 서열번호 1이 아닌, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 적어도 단백질, 및/또는 (2) 서열번호 1 또는 38이 아닌, 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 적어도 하나의 단백질을 포함하는 조성물 또한 제공한다.
개시된 방법 및 조성물은 또한 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질 또는 비천연 Nmb 단백질이 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질 또는 비천연 Nmb 단백질 및 세포 투과성 펩티드을 포함하는 융합 단백질인 융합 또는 키메라 단백질(또는 그를 코딩하는 핵산 분자)을 이용할 수 있다. Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질 또는 비천연 Nmb 단백질은 세포 투과성 펩티드에 대해 N 또는 C 말단일 수 있다. 추가로, Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질 또는 비천연 Nmb 단백질 및 세포 투과성 펩티드는 링커에 의해 분리될 수 있다.
본 개시내용의 상기 목적 및 다른 목적은 첨부된 도면을 참조하면서 진행되는 하기 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
도 1a-1f. 호염기구가 기생충 유도성 염증을 조절한다. (a), 장 기생충 부하량을 대조군 또는 호염기구 고갈 마우스(baso-dep)에서 Nb 감염 후 7일째에 정량화하였다. (b), 대조군 및 baso-dep 마우스의 폐에서의 2형 사이토카인 발현을 Nb 감염 후 7일째 실시간 PCR에 의해 측정하였다. (c), CD200R로 생체내 염색체 의해 폐 상주 호염기구를 측정하였다. (d), Nb 감염 후 폐 상주 호염기구의 비율(%)을 정량화하였다. (e), Nb 감염 후 7일째 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 폐 병리를 평가하였다. (f), Nb 감염 후 대조군 및 baso-dep 마우스에 대한 펄스옥시미터에 의해 산소 수준을 측정하였다. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다.
도 2a-2b. Nb 감염 후 7일째 (a) 과아이오딘산 쉬프 염색 및 (b) 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 폐 병리를 평가하였다. (a), 더 큰 오버뷰를 제공하기 위해 개별 영상을 디지털 방식으로 타일링하였다.
도 3a-3h. 호염기구는 ILC2 반응을 음성적으로 조절한다. 대조군 또는 baso-dep 마우스에서 Nb 감염 후 7일째 기관지 폐포 세척액(BAL: bronchoalveolar lavage) 중 (a), 호중구, (b) 호산구 및 (c) ILC2를 정량화하였다. Nb 감염 후 7일째 BAL 중 계통 음성, CD90+, CD127+ ILC2에서 (d) IL-5 및 (e) IL-13에 대한 세포내 사이토카인 염색을 수행하고, 사이토카인 양성 세포를 정량화하였다. Nb 감염 후 baso-dep 마우스 내로 호염기구를 입양 전달하고(i.t.), BAL 중 (f) ILC2, (g) IL-5+ ILC2 및 IL-13+ ILC2, 및 (h) 호산구의 개수를 정량화하였다. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다.
도 4a-4g. 대조군 또는 baso-dep 마우스에서 Nb 감염 후 7일째 폐 중 (a), 호중구, (b) 호산구 및 (c) ILC2를 정량화하였다. Nb 감염 후 7일째 폐 중 계통 음성, CD90+, CD127+ ILC2에서 (d) IL-5 및 IL-13에 대한 세포내 사이토카인 염색을 수행하고, 사이토카인 양성 세포를 정량화하였다. Nb 감염 후 baso-dep 마우스 내로 호염기구를 입양 전달하고(i.t.), 폐 중 (e) ILC2, (f) IL-5+ ILC2 및 IL-13+ ILC2, 및 (g) 호산구의 개수를 정량화하였다. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다.
도 5a-5h. 호염기구가 ILC2 상에서의 Nmb 수용체(Nmbr: Nmb receptor)의 발현을 촉진시킨다. Rag2 결핍 마우스를 호염기구 고갈 항체 Ba103으로 처리하고, Nb 감염 후 7일째 BAL 중 (a) IL-5+ ILC2, IL-13+ ILC2 및 (b) 호산구의 개수를 정량화하였다. Nb 후 7일째 대조군 또는 호염기구 고갈 마우스의 폐로부터의 분류 정제된 ILC2의 리보핵산(RNA: ribonucleic acid) 시퀀싱 분석을 수행하였다. (c), 대조군 또는 baso-dep ILC2 사이에서 2배 이상 상이하게 발현된 유전자를 도시한 벤 다이어그램. 대조군 ILC2에 농축된 899개의 유전자의 DAVID 경로 분석을 수행하였다. (d), 로돕신 유사 경로를 정의하는, 대조군 ILC2에 농축된 유전자. Nb 후 7일째 대조군 또는 baso-dep 마우스의 폐 중 (e) Mcpt8, (f) Nmb 및 (g) Nmbr 발현을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. (h) Nb 후 7일째 폐로부터 분류 정제된 대조군 또는 baso-dep ILC2에 의한 Nmbr 발현. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다.
도 6a-6e. Nmb는 2형 사이토카인 반응을 억제시킨다. (a), Nb 감염된 마우스를 PBS 또는 Nmb(i.t.)로 처리하였고, BAL 중 ILC2를 정량화하였다. (b) Nb 후 7일째 PBS 또는 Nmb 처리된 마우스의 폐 중 IL-5 및 IL-13의 발현을 실시간 PCR에 의해 측정하였다. (c) BAL 중 호산구를 정량화하고, (d) Nb 감염 후 7일째 기생충 부하량을 측정하였다. ILC2를 Nb 감염 후 7일째 대조군 또는 baso-dep 마우스의 폐로부터 분류 정제하고, Nmb의 존재 또는 부재하에서 IL-2 및 IL-7과 함께 배양하고, (e) 배양 상청액 중 IL-5 및 IL-13 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다.
도 7a-7i. Nmb 처리는 알레르기성 기도 염증을 억제시키는 데 충분하다. 파파인으로 챌린지된 마우스를 PBS 또는 Nmb(i.t.)로 처리하고, (a) 폐 ILC2, (b) IL-5+ 및 IL-13+ ILC2, 및 (c) 호산구를 평가하였다. (b) Nb 후 7일째 장간막 림프절(MLN: Mesenteric lymph node)을 단리시키고, 단일 세포 현탁액을 48시간 동안 Nmb의 존재 또는 부재하에서 항CD3 및 항CD28로 처리하고, (e), IL-5 및 (f) IL-13을 무세포 상청액 중에서 ELISA에 의해 정량화하였다. (f-i), 변형된 버전의 Nmb(표 2 참조)를, Nb 후 7일째 단리된 항CD3 및 항CD28 MLN 세포로부터의 IL-5 및 IL-13 생산을 변경시킬 수 있는 그의 능력에 대해 시험하였다. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다. 청색 별표 표시는 배지 처리된 대조군과 천연 Nmb 사이의 비교를 나타낸다. 적색 별표 표시는 배지 처리된 대조군과 표 2에 기술된 것과 같은 변형된 버전의 Nmb 사이의 비교를 나타낸다. (*, p<0.05), (**, p<0.01), (***, p<0.001) 또는 (f-i).
도 8a-8b. Nb 후 7일째 장간막 림프절(MLN)을 단리시키고, 단일 세포 현탁액을 48시간 동안 천연 Nmb 또는 변형된 버전의 펩티드의 존재 또는 부재하에서 항CD3 및 항CD28로 처리하고, (a), IL-5 및 (b) IL-13을 무세포 상청액 중에서 ELISA에 의해 정량화하였다. 양측 스튜던츠 t 검정에 의해 P 값을 측정하였다. 청색 별표 표시는 배지 처리된 대조군과 천연 Nmb 사이의 비교를 나타낸다. 적색 별표 표시는 배지 처리된 대조군과 표 2에 기술된 것과 같은 변형된 버전의 Nmb 사이의 비교를 나타낸다. (*, p<0.05), (**, p<0.01), (***, p<0.001).
도 9. 호염기구는 NMBR 발현을 조절한다. ILC2를 Nb 감염된 마우스의 폐로부터 분류 정제하고(7일째), 생존 사이토카인(IL-7 및 IL-2)으로, 및 또한 활성화된 호염기구, IL-4 또는 IL-33으로 밤새도록 자극시켰다. 배양 후 유세포 측정 분석에 의해 NMBR 발현을 모니터링하였다. 데이터는 기하 평균 형광 강도(GMFI: geometric mean fluorescent intensity)로 제시되어 있다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계적 비교를 수행하였다.
도 10a-10b. NMB는 IL-33 활성화된 ILC2로부터의 2형 사이토카인 생산을 억제시킨다. ILC2를 Nb 감염된 마우스의 폐로부터 분류 정제하고(7일째), 생존 사이토카인(IL-7, IL-2)과 함께, 및 Nmb 및/또는 IL-33의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 밤새도록 배양한 후, 상청액을 ELISA에 의해 IL-5(도 10a) 및 IL-13(도 10b)의 존재에 대해 시험하였다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계적 비교를 수행하였다.
도 11a-11b. 2형 사이토카인 생산을 조절하는 데 조혈 세포 상의 NMBR 매개 신호전달이 요구된다. 나이브 또는 Nb 감염된(7일째) Vav1-Cre, NMBR-플록싱된, 또는 Vav1-Cre-NMBR-플록싱된 마우스의 BAL로부터 단리된 ILC2에서 IL-5(도 11a) 및 IL-13(도 11b)에 대한 세포내 염색을 수행하였다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계적 비교를 수행하였다.
도 12. 폐에서 세포 침윤물을 조절하는 데 조혈 세포 상의 NMBR 매개 신호전달이 요구된다. 폐 병리(H 및 E 염색)를 나이브 또는 Nb 감염된(7일째), Vav1-Cre, NMBR-플록싱된, 또는 Vav1-Cre-NMBR-플록싱된 마우스에 대해 평가하였다.
도 13. NMBR은 여러 면역 세포 집단에 의해 발현된다. 나이브(솔리드 기호) 및 Nb 감염된 마우스(7일째)(오픈형 기호)를 각종 면역 세포 집단상에서의 NMBR 발현에 대해 평가하였다. 림프구(lymph), 폐포 대식세포(Alv Mac), 비폐포 대식세포(NAM), 호산구(Eo) 및 호중구(Neut).
도 14. 프로스타글란딘 E2는 림프구 상에서의 NMBR의 발현을 상향조절시킨다. 폐 ILC2를 Nb 후 7일째 마우스의 폐로부터 분류 정제하고, 생존 사이토카인(IL-2 및 IL-7) 및/또는 활성화 사이토카인(IL-25 및 IL-33)의 조합과 함께 배양하였다. 추가로, 배양물을 NMB 또는 프로스타글란딘 E2(PGE2)로 처리하고, 배양 후 4일째 유세포 측정 분석에 의해 NMBR의 발현을 측정하였다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 이소타입 대조군 항체에 의해 측정된 음성 NMBR 염색 또한 제시되어 있다(Isot).
서열 목록
첨부된 서열 목록에 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 염기의 경우, 표준 문자 약칭을 이용하여, 및 아미노산의 경우, 3문자 코드를 이용하여 제시되어 있다. 각 핵산 서열의 한 가닥만이 제시되어 있지만, 디스플레이된 가닥을 참조함으로써 상보적 가닥도 포함된 것으로 이해된다.
서열번호 1은 예시적인 천연 인간 Nmb 단백질 서열이다.
서열번호 2는 천연 인간 Nmb의 예시적인 코딩 서열이다.
서열번호 3-37은 예시적인 비천연 Nmb 단백질 서열.
서열번호 38은 예시적인 천연 인간 뉴로메딘 C 단백질 서열.
서열번호 39-58은 예시적인 세포 투과성 펩티드이다.
달리 언급되지 않는 한, 기술 용어는 통상의 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 일반 용어 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 1999]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995]; 및 다른 유사 참고문헌에서 살펴볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 단수 뿐만 아니라, 복수의 것, 둘 모두를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "포함한다(comprises)"라는 용어는 "포함한다("includes")"는 것을 의미한다. 따라서, "Nmb 펩티드를 포함하는"이라는 것은 다른 요소를 배재하지 않으면서 "Nmb 펩티드를 포함하는" 것을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산에 대해 제공된 임의의 모든 염기 크기는 근사치이고, 기술 목적으로 제공된다는 것도 추가로 이해하여야 한다. 비록 본원에 기술된 것과 유사 또는 등가인 다수의 방법 및 물질이 사용될 수 있지만, 특정의 적합한 방법 및 물질은 하기에서 기술된다. 상충할 경우, 용어 설명이 포함된 본 명세서가 우선하게 될 것이다. 추가로, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특허 출원 및 특허를 비롯한 모든 참고문헌, 및 (2018년 10월 4일 현재) 열거된 열거된 진뱅크(GenBank)® 수탁 번호와 연관된 서열은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에 관한 검토를 용이하게 하기 위해, 하기에 구체적인 용어에 관한 설명이 제공된다:
I. 용어
투여: 대상체에게 작용제, 예컨대, Nmb 핵산 분자 또는 단백질을 임의의 효과적인 경로에 의해 제공 또는 주는 것이다. 예시적인 투여 경로로는 주사 (예컨대, 정맥내, intramuscular, 진피내, 복강내, 또는 CNS 내로의 주사, 예를 들어, 척수 또는 뇌 내로의 주사), 경구, 비강, 경피, 질, 직장, 또는 흡입을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
에어로졸: 미세한 고체 또는 액체 입자의 임의의 기체 현탁액. 따라서, "에어로졸화된"이라는 용어는 대기 또는 가스에 분산 또는 현탁된 미세한 고체 또는 액체 입자의 형태를 지칭한다. 한 예에서, 미세한 고체의 공기역학 질량 중위 직경은 1 ㎛ 내지 20 ㎛이다. "네블라이징하다"라는 용어는 (액체를) 미세 스프레이 또는 전환시키거나, 또는 분무화하는 조치를 지칭한다. 따라서, "건조 분말 에어로졸"이라는 용어는 기체, 전형적으로 대기에 현탁된 임의의 미세한 고체를 지칭한다. 개시된 조성물 (예컨대, Nmb 핵산 분자 또는 단백질을 포함하는 것)은 저속 방출 제제로 제제화될 수도 있다. 에어로졸 전달은 에어로졸로서 제제화된 작용제(예컨대, Nmb 핵산 분자 또는 단백질)의 (예컨대, 기도로의) 투여를 지칭한다.
기도 장애 또는 질환: 일반적으로, 기도 장애/질환은 폐의 기도와 관련된 임의의 장애/질환을 포함한다. 특정의 비제한적인 예에서, 폐 장애/질환은 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease)이다.
알레르겐: 알레르기 반응(response) 또는 반응(reaction)을 일으키는 임의의 물질. 일반적인 알레르겐으로는 먼지, 꽃가루, 식물, 애완동물(예컨대, 고양이 또는 개 비듬), 약물, 특정 식품(예컨대, 계란, 우유, 땅콩, 갑각류), 곤충 독, 바이러스 또는 박테리아를 포함한다. (해로운) 반응은 섭취, 흡입, 주사 또는 피부 접촉을 통해 피험자가 노출된 후 발생할 수 있다. 임의의 알레르겐은 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
알레르기 반응: 결과적으로는 극심한 염증 반응을 일으키는, IgE에 의한 비만 세포 및 호염기구의 과도한 활성화를 특징으로 하는 (예컨대, 일반적으로 무해한 엔티티에 대한) 과민 반응의 한 형태. 일반적인 알레르기 반응으로는 습진, 심마진, 건초열, 천식, 식품 알레르기, 예컨대, 말벌 및 벌과 같은 쏘는 곤충의 독에 대한 반응을 포함한다.
아미드화 또는 아미드 유도체: 예컨대, Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1 및 3-37 중 임의의 것) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)와 같은 아미드를 형성하기 위한 번역 후 변형. 따라서, 일부 예에서, 본원에 제공된 Nmb 또는 Nmc 펩티드는 아미드화되고, 이는 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 아미드화에서, C 말단 아미노산(펩티드-COOH)은 변형되어 아미드(펩티드-CONH2)를 형성한다. 아미드는 번역 후 C- 말단 아미드화에 의해 형성 될 수 있다. 변형될 아미노산 다음에는 아미드 기를 제공하는 글리신이 올 수 있다. 일부 예에서, 아미드는 Nmb 또는 Nmc 펩티드의 생물학적 활성을 증가시킨다.
아나필락시스: 가장 심각한 전신 알레르기 반응을 나타내는 임상 증후군. 이는 이전에 감작 된 개체에서 특정 항원에 노출된 후 비만 세포 및/또는 호염기구 매개체(2형 사이토카인 포함)의 면역학적으로 유도된 방출로부터 발생한다. 어느 물질이든 아나필락시스를 유발할 수 있는 잠재성을 갖고 있지만, IgE 매개 아나필락시스의 가장 일반적인 원인은 곤충에 쏘이는 것, 약물, 라텍스, 땅콩 및 견과류(예컨대, 호두, 헤이즐넛, 아몬드, 캐슈, 피칸 및 피스타치오), 갑각류 및 어류, 우유, 계란 및 밀이다. ILC2 및 TH2 세포에 의해 2형 사이토카인이 생산될 때에 IgE가 생산되고, 이로써, 호염기구 및 비만 세포를 프라이밍하여 후속 알레르겐에 대한 노출에 반응한다. 운동으로 인한 아나필락시스 및 특발성 아나필락시스도 발생하며, 이는 다른 기전에 의해 매개된다. 일부 예에서, 개시된 방법(예컨대, Nmb 펩티드 투여)은 아나필락시스를 치료하거나, 예방하는 데 사용된다.
천식: 천식은 호흡계의 많은 증후군 또는 표현형을 설명하는 포괄적인 용어이다. 이들 장애에서, 대개 하나 이상의 "유발인자," 예컨대, 환경 자극제(또는 알레르겐), 화학물질, 차가운 공기, 운동, 또는 바이러스에의 노출에 대한 반응으로, 또는 완전히 알려지지 않은 이유에서 기도는 수축되고, 염증이 생기고, 과량의 점액이 붙어 있게 된다. 이러한 기도 협착은 쌕쌕거림, 숨가쁨, 흉부 압박감 및 기침과 같은 증상을 유발한다. 장애는, 기도가 기관지 과민 반응, 염증, 점액 생산 증가 및 간헐적 기도 폐쇄를 특징으로 하는, 다양한 자극에 대하여 증가된 반응성을 발생시키는 만성 또는 재발성 염증 병태이다. 더욱 중증으로 이환된 환자에서, 간헐성과 대조되는 폐쇄가 고정될 수 있다. 전형적인 알레르기성 천식 반응에서, Th2 염증 프로세스에 의해 형성된 IgE 항체는 주로 세기관지 및 작은 기관지와 밀접한 연관성을 갖는 폐 간질에 있는 비만 세포에 부착된다. 세포의 유발은 사이토카인, 케모카인 및 아라키돈산 유래 매개인자를 포함하나, 이 에 제한되지 않는 여러 물질의 방출을 유발하여, 기관지 수축, 기도 과민 반응, 과도한 점액 분비 및 기도 염증을 유발한다. 그러나, 모든 천식이 알레르기성은 아니며, 더 중증 형태의 천식 환자는 Th2 염증 뿐만 아니라, Th1 염증도 존재한다는 것을 시사하는 좋은 증거가 있다.
국제 가이드라인에 따르면, 간헐적 증상, 상대적으로 정상적인 폐 기능 및 약간의 악화인 것으로 정의된 경증 천식. 개시된 Nmb 핵산 분자 및 펩티드는 예를 들어, 저용량의 흡입식 코르티코스테로이드제(CS: inhaled corticosteroids) 또는 기관지확장제와 함께 조합하여 경증 천식을 치료하는 데 사용될 수 있다. 중등도 천식은 더 지속적이고, 심한 증상, 간헐적 악화 및/또는 폐 기능 악화로 정의된다. 개시된 Nmb 핵산 분자 및 펩티드는 예를 들어, 더 높은 고용량의 흡입식 CS 및 장기 작용 베타 효능제(LABA: long acting beta agonist) 또는 류코트리엔 조절제와 함께 조합하여 중등도 천식을 치료하는 데 사용될 수 있다. 중증 천식은 ATS-ERS 중증 천식 가이드라인에서, 제2 조절제(LABA 또는 류코트리엔 조절제)와 함께 조합된, 고용량의 흡입식 CS 치료, 또는 질환 통제(더 낮은 악화, 증상이 거의 없음, 및 더 우수한 폐 기능)를 유지하기 위한 전신 CS 사용을 요구하거나, 또는 이러한 치료에도 불구하고 통제되지 않는 천식으로 정의된다. 개시된 Nmb 핵산 분자 및 펩티드는 예를 들어, 상기 시약과 함께 조합하여 중증 천식을 치료하는 데 사용될 수 있다.
기관지확장제: 진경제 또는 기관지 또는 세기관지를 확장하는 다른 작용제. 기관지확장제는 기도의 평활근을 이완시켜 기도를 확장시킨다. 기관지확장제 약물은 전형적으로는 염증을 억제시키지 않는다. 예로는 단기(예컨대, 살부타몰) 및 장기 작용(예컨대, 포르모테롤) 베타-2 아드레날린성 효능제, 및 항콜린제(예컨대, 티오트로피움 및 이프라트로피움 브로마이드)를 포함한다.
세포 투과성: 분자가 세포막(예컨대, 포유동물 세포)을 통과하는 능력. 일부 예에서, 세포 투과성은 수동 확산 및 수송체 매개 침투와 같은 다양한 수송 수단을 통한 투과성을 포함한다. 특정 작용제는 세포 투과성을 증진시킬 수 있으며(즉, 세포 투과 증진제), 이는 예를 들어, 태그에 포함되어 있는 것과 같은, 펩티드, 예컨대, 세포 투과성 펩티드; 단백질 기반 작용제, 예컨대, 포어 또는 채널 형성 단백질; 바이러스 기반 작용제; 지질 또는 중합체 기반 작용제; 또는 무기 작용제를 포함한다. 한 예에서, Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1 및 3-37 중 임의의 것)는 그의 세포 투과성을 증가시키는 태그, 예컨대, 펩티드 태그(이는 또한 세포 투과성 펩티드(CPP: cell penetrating peptide)로도 지칭)(예컨대, 전사의 전사활성인자(transactivator of transcription), TAT, 예컨대, TAT48 -57, TAT47 -57, 또는 TAT49 -57; 페네트라틴; Pep-1; 물질 P, SP; 폴리아르기닌, 예컨대, R5-R12; pVEC; 트랜스포르탄; MAP; 디아토스 펩티드 벡터 1047, DPV1047, 벡토셀(VECTOCELL)®; MPG; ADP 리보실화 인자(ADP ribosylation factor), ARF, 예컨대, ARF1 -22; BPrPr(예컨대, BPrPr1-28); p28; VT5; Bac 7, 예컨대, Bac1 -24; C105Y; PFVYLI(서열번호 58); Pep-7, SynB1[RGGRLSYSRRRFSTSTGR; 서열번호 39], SynB3[RRLSYSRRRF; 서열번호 40], PTD-4[PIRRRKKLRRLK; 서열번호 41], PTD-5[RRQRRTSKLMKR; 서열번호 42], FHV Coat-(35-49)[RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 43], BMV Gag-(7-25)[KMTRAQRRAAARRNRWTAR; 서열번호 44], HTLV-II Rex-(4-16)[TRRQRTRRARRNR; 서열번호 45], D-Tat[GRKKRRQRRRPPQ; 서열번호 46], R9-Tat GRRRRRRRRRPPQ[서열번호 47] 및 페네트라틴[RQIKWFQNRRMKWKK; 서열번호 48]), 양친매성 펩티드(예컨대, MAP[KLALKLALKLALALKLA; 서열번호 49], SBP[MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; 서열번호 50], FBP[GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열번호 51], MPG ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 52], MPG(ΔNLS)[ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; 서열번호 53], Pep-2[ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 54], 및 트랜스포르탄[GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; 서열번호 55]), 주기적 서열(예컨대, pVec, 폴리아르기닌 RxN(4<N<17) 키메라, 폴리리신 KxN(4<N<17) 키메라, (RAca)6R, (RAbu)6R, (RG)6R, (RM)6R, (RT)6R, (RS)6R, R10, (RA)6R, R7, 및 pep-1[ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 56]), 및 Cr10(사이클릭 pol-아르기닌 CPP), 또는 상기 펩티드 태그를 코딩하는 핵산을 포함한다.
키메라 또는 융합 단백질: 펩티드(예컨대, Nmb) 및 제2 펩티드(예컨대, 세포 투과성 펩티드)를 포함하는 단백질로서, 여기서, 제1 및 제2 단백질이 상이한 것인 단백질. 키메라 폴리펩티드는 또한 동일한 폴리펩티드로 유래된 2개 이상의 비인접부를 포함하는 폴리펩티드도 포함한다. 일부 예에서, 키메라 단백질은 Nmb/세포 투과성 펩티드 융합 단백질을 포함하고, 여기서, 세포 투과성 펩티드는 Nmb의 N 또는 C 말단있다. 2개 이상의 상이한 펩티드는 직접 또는 간접적으로, 예를 들어, 링커(예컨대, 1-30개의 아미노산)를 사용하여 연결될 수 있다.
만성 폐쇄성 폐 질환: 장기간의 호흡 문제 및 불량한 기류를 특징으로하는 폐쇄성 폐 질환의 한 유형. 기류 제한은 일반적으로 점진적이고, 유해 입자 또는 기체에 대한 폐의 비정상적인 염증 반응과 연관이 있다. 주요 증상은 가래 생성과 함께 숨가쁨과 기침을 포함한다. 담배 흡연은 COPD의 가장 흔한 원인이다. 개시된 Nmb 핵산 분자 및 펩티드는 예를 들어, 기관지확장제, 코르티코스테로이드제, 항생제, 산소 보충, 또는 이들의 조합과 함께 조합하여 COPD를 치료하는 데 사용될 수 있다.
cDNA(상보적 DNA: complementary DNA): 내부, 비코딩 세그먼트(인트론) 및 전사를 결정하는 조절 서열이 없는 DNA 조각. cDNA는 메신저 RNA에서 역전사에 의해 합성될 수 있다.
접촉: 고체 또는 액체 형태를 포함하는, 직접적인 물리적 결합에 배치. 접촉은 시험관내 또는 생체외에서, 예를 들어, 시약을 샘플(예컨대, ILC2 세포를 포함하는 것)에 첨가하거나, 또는 대상체에게 투여함으로써 생체내에서 발생할 수 있다.
대조군: 참조 표준. 일부 실시양태에서, 대조군은 건강한 대상체이다. 다른 실시양태에서, 대조군은 하기 표 1에 열거된 장애를 앓는 대상체이다. 추가의 다른 실시양태에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위(예컨대, 예후 또는 결과가 공지되어 있는, 이전에 시험된 대조군 대상체 또는 기준선 또는 정상 값을 나타내는 대상체 군)이다. 시험 대상체와 대조군 사이의 차이는 증가 또는 감소일 수 있다. 차이는 정성적 차이 또는 정량적 차이, 예를 들어, 통계적으로 유의적인 차이일 수 있다. 일부 예에서, 차이는 대조군 대비 적어도 약 5%, 예컨대, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 또는 500% 초과의 증가 또는 감소이다.
축퇴성 변이체: 유전자 코드의 결과로 축퇴성인 서열을 포함하는, 펩티드, 예컨대, Nmb를 코딩하는 뉴클레오티드. 20종의 천연 아미노산이 존재하며, 대부분은 1 초가의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 펩티드의 아미노산 서열이 변경되지 않는 한, 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 본 개시내용에 포함된다.
유효량 또는 치료 유효량: 예를 들어, 치료받는 대상체에서 유익하거나, 원하는 결과를 달성하는 데 충분한 제제(예컨대, Nmb 단백질 또는 Nmb를 코딩하는 핵산 분자)의 양. 예를 들어, 이는 염증(예컨대, 2형 사이토카인 매개 염증), 천식 발작, 알레르기 반응을 감소 또는 억제시키는 데, 증상 및 폐 기능을 개선시키는 데, 또는 이들의 조합을 달성하는 데 필요한 Nmb 단백질 또는 Nmb를 코딩하는 핵산 분자의 양일 수 있다. 대상체에게 투여되었을 때, (예를 들어, 기도에서) 원하는 생체내 효과를 달성하는 것으로 나타난 표적 조직 농도를 달성하게 되는 투여량이 일반적으로 사용될 것이다.
치료 유효량은 치료받는 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상의 것에 의존하여 달라질 수 있으며, 이는 당업계의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 유익한 치료 효과는 질환, 증상, 장애, 또는 병적 상태의 호전; 질환, 증상, 장애 또는 병태 발병 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질환, 증상, 장애 또는 병적 상태 억제를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, "유효량"은 (1) 예를 들어, 폐에서, 또는 알레르기 반응 부위에서 염증을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, (2) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-5를 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, (3) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-13을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, (4) ILC2 및/또는 T 세포 반응, 예를 들어, 존재, 증식 및/또는 활성화된 ILC2 및/또는 T 세포의 개수를 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, 및/또는 (5) 폐에서, 또는 말초 혈액 중에서 호산구증가증을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데 충분한 양이다.
호산구증가증: (예를 들어, 전혈구 계수(CBC: complete blood count)에 의해 측정된 바) 말초 혈액 중 호산구 계수가 약 450-500개의 세포/㎕를 초과하거나, 조직 병리학적 검사시 비혈액 조직 호산구 계수 증가가 관찰되는 병태. 호산구는 일반적으로 순환하는 백혈구의 5-7% 미만을 차지한다. 예시적인 원인으로는 알레르기 반응 및 기생충 감염을 포함한다.
거담제: 기침과 같이 폐 및 기도에서 점액, 가래 및 다른 체액을 배출하도록 유도하는 약물 또는 화학 물질. 상기 시약의 한 예로 구아이페네신이 있다.
증가 또는 감소: 대조군 값(예컨대, Nmb 단백질 또는 핵산 분자를 이용한 치료 이전의 값, 또는 Nmb 단백질 또는 핵산 분자를 이용한 치료를 받지 않는, 유사 장애를 앓는 대상체에서의 값)으로부터의 양의 통계적으로 유의적인 양성적 또는 음성적 변화. 증가는 대조군 값 대비 양성적 변화, 예컨대, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가이다. 감소는 대조군 값 대비 음성적 변화, 예컨대, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 감소이다. 일부 예에서, 감소는 100% 미만, 예컨대, 90% 이하, 95% 이하, 또는 99% 이하의 감소이다.
2형 선천 림프구양 세포( ILC2 ): 일반 림프구양 전구 세포로부터 유래된, 선천 림프구양 세포의 한 유형. 이들 세포에는 재조합 활성 유전자가 없기 때문에 항원 특이적 B 또는 T 세포 수용체가 없다. ILC2는 2형 사이토카인(예컨대, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13)을 생산한다.
인터류킨 -5(IL-5): (예컨대, OMIM 147850): 2형 헬퍼 세포(Th2 세포), ILC2 세포, 및 비만 세포에 의해 생산된 인터류킨. IL-5는 B 세포 성장을 자극하고, 면역글로불린, 주로, IgA 분비를 증가시킨다. 이는 또한 호산구 활성화를 매개한다. IL-5는 알레르기성 비염 및 천식을 비롯한 여러 알레르기성 질환의 원인과 연관이 있다. IL-5를 표적화하는 예시적인 약물은 메폴리주맙, 벤라리주맙, 및 레슬리주맙을 포함하며, 이는 예를 들어, 천식(예컨대, 호산구성 천식) 또는 호산구성 육아종증 다발혈관염(EGPA: eosinophilic granulomatosis with polyangiitis)을 치료하는 데 본원에 개시된 Nmb 단백질 또는 핵산 분자와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
IL-5 서열은 예를 들어, 진뱅크® 서열 데이터베이스로부터 공개적으로 이용가능하다(예컨대, 수탁 번호 NP_000870.1(성숙한 펩티드 aa 20-134), CAA29607.1, 및 NP_001006951.1은 예시적인 IL-5 단백질 서열을 제공하는 반면, 수탁 번호 NM_000879.2, X06271.1, 및 NM_001006950.1은 예시적인 IL-5 핵산 서열을 제공한다). IL-5 변이체, 예컨대, 상기 수탁 번호와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 것이 고려된다.
인터류킨 -13(IL-13)(예컨대, OMIM 147683): Th2 세포, CD4 세포, 자연 살해 T 세포, 비만 세포, 호염기구, 호산구 및 ILC2 세포에 의해 분비된 사이토카인. IL-13은 IgE 합성, 배상 세포 증식, 점액 과다 분비, 기도 과민 반응, 섬유증 및 키티나제 상향 조절에서 중요한 조절인자이다. 이는 알레르기성 염증 및 천식을 비롯한 상이한 질환의 매개인자이다. L-13을 표적화하는 예시적인 약물은 트랄로키누맙 및 레브리키주맙을 포함하며, 이는 예를 들어, 천식, 아토피성 피부염, 또는 호지킨 림프종을 치료하는 데 본원에 개시된 Nmb 단백질 또는 핵산 분자와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
IL-13 서열은 예를 들어, 진뱅크(GenBank)® 서열 데이터베이스로부터 공개적으로 이용가능하다(예컨대, 수탁 번호 NP_002179.2(성숙한 펩티드 aa 21-132), NP_032381.1(성숙한 펩티드 aa 22-131), 및 NP_446280.1(성숙한 펩티드 aa 21-131)은 예시적인 IL-13 단백질 서열을 제공하는 반면, 수탁 번호 NM_002188.2, NM_008355.3, 및 NM_001003384.1은 예시적인 IL-13 핵산 서열을 제공한다). IL-13 변이체, 예컨대, 상기 수탁 번호와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 것이 고려된다.
흡입기: 흡입을 통해 증기 또는 휘발된 약물을 투여하는 장치. 흡입기는 대개 예를 들어, 천식을 치료하기 위해 약물을 기도로 국소적으로 투여하는 데 사용된다. 일부 예에서, 흡입기는 건조 분말 흡입기이다. 다른 예에서, 흡입기는 정량식 흡입기이다. 일부 예에서, 흡입기는 본원에 개시된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 중 어느 하나), 또는 상기를 코딩하는 핵산 분자(예컨대, 서열번호 2)(또는 핵산 분자를 함유하는 벡터)를 포함한다.
억제시킨다: 분자의 작용 또는 기능을 감소, 제한 또는 차단하는 것. 한 예에서, IL-5 및/또는 IL-13 활성은 본원에 개시된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 중 어느 하나), 또는 상기를 코딩하는 핵산 분자(예컨대, 서열번호 2)(또는 핵산 분자를 함유하는 벡터)에 의해 감소 또는 억제된다. 예를 들어, 본원에 개시된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 중 어느 하나), 또는 상기를 코딩하는 핵산 분자(예컨대, 서열번호 2)(또는 핵산 분자를 함유하는 벡터)는 IL-5 및/또는 IL-13 활성을 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 IL-5 및/또는 IL-13 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소 또는 억제시킨다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분(예컨대, 단백질 또는 핵산, 또는 세포)은 성분이 존재하는 유기체의 세포 또는 조직 중의 다른 생물학적 성분, 예컨대, 다른 세포, 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA 및 단백질로부터 실질적으로 분리, 그와 별개로 제조, 또는 그로부터 정제된 것이다. "단리된" 핵산 및 단백질로는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질(예컨대, Nmb 단백질 및 핵산 분자) 뿐만 아니라, 화학적으로 합성된 핵산 및 단백질도 포괄한다. 일부 예에서, 단리된 Nmb 단백질, Nmb 핵산, 또는 세포(예컨대, ILC2 세포)는 적어도 50% 순수, 예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 100% 순수하다.
링커 또는 스페이서: 2개 이상의 모이어티(예컨대, 여기서, 모이어티 중 하나는 Nmb 펩티드이다)를 함께 연결하지만, 특정 생물학적 활성을 갖지 않고, 모이어티의 활성 또는 기능에 유의적으로 부정적인 영향을 주지 않는 분자. 링커는 바람직하게는 생체적합성이다. 링커는 연결된 모이어티의 특성, 예를 들어, 모이어티의 폴딩, 형태, 소수성 및/또는 이격화를 제공하거나, 또는 그에 영향을 주도록 선택될 수 있다. 일부 예에서, 링커는 각각이 본원에 기술된 화합물에 포함된 모이어 티 중 하나와 공유 결합을 형성 할 수 있는 각 말단에 반응성 부위를 포함한다. 일부 예에서, 링커는 펩티드, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 또는 헤테로사이클릭 탄소 링커를 포함한다.
네블라이저: 예를 들어, 약물(예컨대, Nmb 단백질 또는 핵산을 포함하는 것)을 호흡기의 심부로 전달로 전달하기 위한 액체 형태의 약물을 흡입될 수 있는 미세 스프레이(에어로졸)로 바꾸는 장치.
뉴로메딘 B( Nmb ): (예컨대, OMIM 162340): 뉴로메딘 A, B, C, K, L, N, S 및 U를 비롯한, 펩티드 뉴로메딘 패밀리의 일부. Nmb는 포유동물의 중추 신경계, 폐, 위장관 및 지방 조직에서 발현되는 봄베신 유사 펩티드이다. Nmb는 그의 고친화성 세포 표면 수용체인 뉴로메딘 B 수용체(NMBR)에의 결합에 의해 작용한다. Nmb는 그의 수용체에의 결합시, 세포 성장, 체온, 혈압 및 글루코스 수준을 조절하는 것으로 보고되어 있다. Nmb는 또한 예컨대, IL-5 및 IL-13의 발현을 감소시킴으로써 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시킬 수 있다는 것이 본원에 제시되어 있다.
서열 Nmb 데카펩티드는 포유동물 종 간에 고도로 보존되고: GNLWATGHFM(서열번호 1), 이는 서열 ggcaacctctgggccaccggtcacttcatg(서열번호 2)에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 데카펩티드는 대개 뉴로메딘 B, 또는 뉴로메딘 B 23-32로 언급된다.
데카펩티드를 갖는 전장 Nmb 서열은 예를 들어, 진뱅크® 서열 데이터베이스로부터 확인될 수 있고, 공개적으로 이용가능하다(예컨대, 수탁 번호 AAA59934.1, AAH28490.1, 및 A37178은 예시적인 단백질 서열을 제공하는 반면, 수탁 번호 BC007407.2, BC028490.1, 및 EU375564.1은 예시적인 핵산 서열을 제공한다). Nmb 변이체, 예컨대, 서열번호 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 것, 예컨대, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나는 생성될 수 있고, 예를 들어, 본원에 제공된 방법을 사용하여, 예컨대, 표 1에 열거된 것과 같은 염증성 장애를 치료하기 위해 치료 재조합 핵산 분자 및 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다.
비자연적으로 발생된 또는 조작된: 본 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 사람 손이 관여한 것을 의미한다. 핵산 분자 또는 폴리펩티드(예컨대, Nmb 분자)를 언급할 때, 본 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 자연상에서 자연적으로 그와 회합되어 있고, 자연상에서 발견되는 것과 같은 적어도 하나의 다른 성분을 적어도 실질적으로 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 추가로, 본 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 예컨대, 변이체 Nmb 분자는 자연상에서 발견되지 않는 서열을 갖는 것임을 의미할 수 있다.
작동가능하게 연결: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계가 있도록 배치되어 있을 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열(예컨대, Nmb 데카펩티드 코딩 서열)의 전사 또는 발현에 영향을 준다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결 DNA 서열은 인접해 있고, 두 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우, 같은 리딩 프레임 내에 있다.
약학적으로 허용되는 담체: 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 통상적인 것이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 22nd Edition, 2013]에는 본원에 개시된 Nmb 단백질의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제제가 기술되어 있다.
일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 모드에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구적 제제는 일반적으로 비히클로서 약학적으로 및 생리적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사가능한 유체, 예컨대, 물, 생리 식염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 포함한다. 고체 조성물(예컨대, 산제, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상의 비독성 고체 담체는 예를 들어, 약학 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에도, 투여되는 약학 조성물은 최소량의 비독성 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충화제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨 또는 소르비탄 모노올레이트를 함유할 수 있다.
폴리펩티드, 펩티드 및 단백질: 본 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예컨대, 아미드 결합(CONH)을 통해 함께 화학적으로 결합된 아미노산과 같은, 임의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 본 용어는 또한 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대, 표지화 성분과의 접합과 같이, 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 사용되는 바, "아미노산"이라는 용어는 글리신을 비롯한, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 모두, 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체(peptidomimetics)를 포함한다. 일부 예에서, 펩티드는 Nmb 펩티드, 예컨대, Nmb 데카펩티드이다.
정제된: 정제된이라는 용어는 절대 순도를 필요로 하지 않고; 오히려 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 핵산은 핵산이 세포 내에서 그의 천연 환경 중의 핵산보다 더 크게 농축되어 있는 것이다. 유사하게, 정제된 펩티드 제제는 단백질이 예를 들어, 세포내 단백질보다 더 크게 농축되어 있는 것이다. 실질적 정제란, 다른 단백질 또는 세포 성분으로부터의 정제를 의미한다. 한 실시양태에서, 제제는 본원에 개시된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나)이 제제 중 단백질의 총 함량의 적어도 50%(예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)에 상당하도록 정제된(또는 단리된) 것이다. 본원에 개시된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나)은 수단들 임의의 수단에 의해 정제(및/또는 합성)될 수 있다(예컨대, 문헌 [Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 2nd Edition, 2009]; 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 3rd Edition, 1994] 참조).
서열 동일성/유사성: 아미노산(또는 뉴클레오티드) 서열 사이의 유사성은 다르게는 서열 동일성으로 지칭되는, 서열 사이의 유사성으로 표시된다. 서열 동일성은 빈번하게는 동일성(%)(또는 유사성(%) 또는 상동성(%))으로 측정되고; 그 비율이 높을수록, 두 서열의 유사성은 더 크다.
비교를 위한 서열 정렬 방법 및 정렬 알고리즘은 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482, 1981]; [Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970]; [Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 85:2444, 1988]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989]; [Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988]; 및 [Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 85:2444, 1988]에 기술되어 있다. 문헌 [Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994]에는 서열 정렬 방법 및 상동성 산출에 대한 상세한 고려 사항이 제공되어 있다.
NCBI 기본 국부 정렬 검색 도구(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403, 1990)는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 관련하여 사용하기 위해 미국 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)를 비롯한 여러 정보원으로부터 및 인터넷상에서 이용가능하다. 상기 프로그램을 이용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 것은 인터넷상의 NCBI 웹사이트에서 이용가능하다.
(본원에 제공된 Nmb 서열을 포함하는) 단백질 및 핵산 서열의 변이체는 전형적으로 디폴트 파라미터로 설정된 갭이 있는 blastp, NCBI Blast 2.0을 이용한 아미노산 서열과의 전장 정렬에 걸쳐 계수된 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 한다. 약 30개 초과의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터(갭 존재 비용 11, 잔기당 갭 비용 1)로 설정된 디폴트 BLOSUM62 행렬을 이용하는 Blast 2 서열 함수가 사용된다. 짧은 펩티드(약 30개 미만의 아미노산)를 정렬할 때, 정렬은 디폴트 파라미터(개방 갭 9, 확장 갭 1 패널티)로 설정된 PAM30 행렬을 이용하는 Blast 2 서열 함수를 이용하여 수행될 수 있다. 상기와 같은 짧은 윈도우에 걸쳐 서열 동일성을 결정하는 방법은 인터넷상의 NCBI 웹사이트에서 이용가능하다. 이들 서열 동일성 범위는 단지 가이던스를 위해 제공되며; 제공된 범위 밖에 포함된 매우 중요한 상동체를 수득할 수 있다는 것도 전적으로 가능하다.
대상체: 포유동물, 예컨대, 인간 또는 수의 대상체. 포유동물로는 뮤린, 시미안, 인간, 농장 동물, 스포츠용 동물, 및 애완동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 대상체 는 비인간 포유동물 대상체, 예컨대, 원숭이, 또는 다른 비인간 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 염소, 양, 개, 고양이, 수퇘지, 황소, 말, 또는 소를 포함한다. 일부 예에서, 대상체는 실험실용 동물/유기체, 예컨대, 마웃, 토끼, 또는 래트이다. 일부 예에서, 대상체는 염증성 장애, 예컨대, 표 1에 열거된 것과 같은 것(예컨대, 천식, COPD, 또는 알레르기 반응)을 앓는 대상체이다.
치료하는 또는 치료: 질환 또는 질환 또는 병리와 관련된 병적 상태(예컨대, 표 1에 열거된 것, 예컨대, 기도 장애, 예컨대, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환, 또는 알레르기 반응)의 징후 또는 증상을 호전시키는 치료적 개입을 지칭한다. 치료는 또한 관해를 유도하거나, 또는 상기 병태를 치유할 수 있다. 구체적인 예에서, 치료는 염증을 감소시키는 것을 포함한다.
질환(예컨대, 기도 질환 또는 표 1에 열거된 다른 장애)과 연관된 징후 또는 증상을 감소 또는 억제시키는 것은 예를 들어, 감수성 대상체에서 질환의 임상적 증상 발병 지연, 질환의 임상적 증상 중 일부 또는 그들 모두의 중증도 감소, 질환 진행 저속화(예를 들어, 질환을 앓는 대상체의 삶을 연장시킴으로써), 질환 재발건수 감소, 대상체의 전체 건강 또는 웰빙 개선에 의해, 또는 특정 질환에 대해 특이적인, 당업계에 널리 공지된 다른 파라미터에 의해 증명될 수 있다.
치료는 신체 검사, 및 다른 임상 시험 등의 결과를 포함하는, 객관적 또는 주관적 파라미터에 의해 평가될 수 있다. 한 예에서, 개시된 방법을 사용하는 치료는 (1) 예를 들어, 폐에서, 또는 알레르기 반응 부위에서 염증을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키고/거나, (2) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-5를 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키고/거나, (3) 예를 들어, ILC2 및/또는 세포에서, IL-13을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키고/거나, (4) ILC2 및/또는 T 세포 반응, 예를 들어, 존재, 증식 및/또는 활성화된 ILC2 및/또는 T 세포의 개수를 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키고/거나, (5) 폐에서, 또는 말초 혈액 중에서 호산구증가증을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시킨다.
~에 대해 충분한 조건하에서: 원하는 활성을 허용하는 임의 환경을 기술하는 데 사용되는 어구. 한 예에서, 이는 원하는 활성(예컨대, IL-5 및/또는 IL-13과 연관된 염증 감소)을 허용하는 데 충분한 유효량의, 하나 이상의 본원에 개시된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 하나 이상의), 또는 상기를 코딩하는 핵산 분자(예컨대, 서열번호 2)(또는 핵산 분자를 함유하는 벡터)를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
단위 용량: 개별적으로 또는 집합적으로 예컨대, 치료 효과 같은 원하는 효과를 발휘하도록 산출된 소정량의 활성 물질을 함유하는 물리적으로 분리된 단위. 단일의 단위 용량 또는 복수의 단위 용량은 원하는 효과, 예컨대, 장애, 예를 들어, 표 1에 열거된 것, 예컨대, 천식, COPD, 또는 알레르기 반응 치료를 달성하는 데 사용될 수 있다.
벡터: 핵산 분자는 세포 내로 도입되어 형질전환된 세포를 생성한다. 벡터는 숙주 세포에서의 그의 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대, 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 치료제(예컨대, 본원에 제공된 Nmb 펩티드를 코딩하는 것) 및/또는 선별가능한 마커 유전자 및 다른 유전자 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시켜 세포가 세포에 대해 천연인 것 이외의 다른 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 세포 내로 핵산을 진입시키는 데 도움을 주는 물질, 예컨대, 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅 등을 포함한다. 한 예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, AAV 또는 렌티바이러스 벡터이다.
II. 개요
호염기구는 그의 IL-4 생산, 및 ILC2 및 TH2 세포를 비롯한 다른 세포 유형의 활성화를 촉진시킬 수 있는 능력을 통해 2형 사이토카인 반응을 증폭시킬 수 있다(2, 5, 10). 추가로, 호염기구증가증은 기생충 감염 또는 알레르기성 염증 유도 후의 2형 사이토카인 매개 염증의 일반적인 특징이다(2, 10). 2형 염증의 특징인 호염기구 반응에도 불구하고, 이들 정체 불명의 세포가 2형 반응을 조절하는 데에서 맡고 있는 역할(들)은 여전히 많은 논란의 여지를 남기고 있다. 예를 들어, 호염기구 집단은 Nb 감염 후에 빠르게 확장되지만, 이들 세포의 고갈은 항기생충 및 기생충 소거에는 영향을 거의 미치지 못하거나, 또는 전혀 미치지 못한다(2, 11). 따라서, Nb 유도성 호염기구는 기생충 소거에는 기여하지 않지만, 다른 미확인된 기능을 수행할 수 있다.
본원에 제시된 데이터를 통해 ILC2 및 TH2 세포 반응을 음성적으로 조절할 수 있는 면역계와 신경계 사이의 크로스-토크 중 앞서 인정받지 못했던 측면이 확인된다. 이전 연구에서는 콜린성 뉴런에 의한 뉴로메딘 U의 발현이 ILC2의 활성화를 촉진시킬 수 있고, 기생충에 대한 면역을 증폭시킬 수 있다는 것이 입증되었고(8, 9). 이는 신경계와 면역계가 병원체의 최적의 감지 및 소거를 허용하는 방식으로 협력한다는 것을 시사하는 것이다. 본원에 제시된 연구는 신경계와 면역계가 함께 진화함에 따라, 조직 무결성 유지를 돕기 위하여 뉴로메딘 B 신호전달을 통해 염증 반응을 음성적으로 조절하는 기전을 개발했다는 것을 시사한다. 추가로, 본원의 데이터는 추가 수준의 복잡성을 확인하고, 호염기구가 면역 세포에 의해 Nmbr의 발현을 촉진시켜 뉴런 유래 신호를 수신할 수 있도록 한다는 것을 시사한다. 따라서, 다른 분화된 선천 면역 세포는 뉴런과 2형 사이토카인 생산 면역 세포 사이의 소통 라인을 매개하는 데 도움을 준다. 데이터는 추가로 프로스타글란딘 E2(PGE2)가 림프구에 의한 Nmbr의 발현을 촉진시킨다는 것을 제안한다. 호염기구는 PGE2의 강력한 공급원이기 때문에, 상기 데이터는 호염기구가 PGE2를 통해 염증을 억제할 수 있는 Nmb의 능력을 조절한다고 제안한다. 이러한 데이터는 감염체 또는 알레르겐에의 노출 후, 점막 부위에서 염증의 시작을 허용하지만, 주의 깊게 조절되는 염증 지속성을 허용하는 데 필요한 고도로 조정된 세포 이벤트를 구명한다. 추가로, 본원에 제시된 데이터를 통해 다중 형태의 알레르기성 질환 및 만성 염증, 및 다른 질환을 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있는, 2형 사이토카인 반응의 음성 조절인자로서, 앞서 인정받지 못했던 Nmb의 역할이 확인된다.
III. 치료 방법
본원에서는 포유동물 대상체에서 장애, 예컨대, 염증성 장애, 예컨대, 2형 사이토카인에 의해 유발된 염증성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 장애는 바람직하지 않은 인터류킨-5(IL-5) 및/또는 IL-13 활성과 연관이 있다. 상기 장애의 예는 표 1에 제공되어 있고, 알레르기, 기도 장애(예컨대, 천식, 부비강염, 특발성 폐 섬유증, 비염, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구성 식도염, 및 COPD), 피부 장애(예컨대, 습진, 아토피성 피부염, 및 두드러기) 및 호산구성 장애(예컨대, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 장염, 호산구성 결장염, 호산구성 천식, 호산구성 위장 장애(EGID: eosinophilic gastrointestinal disorder), 호산구성 근막염, EGPA, 호산구성 폐 장애, 과호산구증가 증후군(HES: hypereosinophilic syndrome), 또는 호산구성 백혈병)를 포함한다. 한 예에서, 치료되는 장애는 호지킨 림프종이다. 따라서, 상기 장애를 앓는 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 또는 수의 대상체는 개시된 방법으로 치료될 수 있다.
치료 유효량의 하나 이상의 Nmb 또는 Nmc 단백질, 또는 하나 이상의 Nmb 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 투여는 (1) 예를 들어, 폐에서, 또는 알레르기 반응 부위에서의 염증 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, (2) 예를 들어, ILC2 및/또는 세포에서, IL-5 활성(예컨대, 핵산 또는 단백질 발현) 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, (3) 예를 들어, ILC2 및/또는 세포에서, IL-13 활성(예컨대, 핵산 또는 단백질 발현) 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, (4) ILC2 및/또는 T 세포 반응, 예를 들어, 존재, 증식 및/또는 활성화된 ILC2 및/또는 T 세포의 개수 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, 및/또는 (5) 폐에서, 또는 말초 혈액 중에서 호산구증가증 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시켜 장애를 치료할 수 있다.
개시된 치료 방법은 대상체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 뉴로메딘 B(Nmb) 단백질 또는 뉴로메딘 C(Nmc) 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 투여하여 장애를 치료하는 단계를 포함한다. Nmb 또는 Nmc 단백질(들) 또는 핵산 분자(들)는 약학 조성물, 예컨대, 염수 또는 물을 포함하는 것에 존재할 수 있다.
따라서, 일부 예에서, 적어도 2개의 상이한 Nmb 단백질, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)이 투여된다. 일부 예에서, 투여되는 Nmb 단백질 중 적어도 하나는 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 예에서, 투여되는 Nmb 단백질 중 적어도 하나는 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 예에서, 적어도 2개의 Nmb 단백질이 투여되고, 여기서, (1)은 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 또는 37 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, (2)는 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 예에서, 적어도 2개의 Nmb 단백질이 투여되고, 여기서, (1)은 서열번호 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 21, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 35, 36, 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, (2)는 서열번호 3, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 23과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다(여기서, 두 Nmb 단백질은 상이하다). 일부 예에서, 적어도 2개의 Nmb 단백질이 투여되고, 여기서, (1)은 서열번호 1을 포함하거나, 또는 그로 구성되고, (2)는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
일부 예에서, 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 1 초과의 Nmb 단백질, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 Nmb 단백질을 코딩한다. 일부 예에서, 본 방법은 각각의 것이 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 것인, 다중의 상이한 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 투여되는 핵산 분자(들)는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 또는 아데노 연관 바이러스 벡터의 일부분일 수 있다. 추가로, 투여되는 핵산 분자(들)는 프로모터, 예컨대, 구성적 프로모터 또는 다른 인핸서 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.
예시적인 투여 모드는 주사(예컨대, iv, im, ip, 또는 진피내), 경구 투여, 비강 투여, 흡입식 투여, 또는 국소 투여를 포함한다. 1회 이상의 용량, 예컨대, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5회의 용량으로 치료 유효량의 적어도 하나의 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자가 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 1년의 간격을 두고 진행되는 적어도 2회 별개 투여를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 투여는 장애 발병 5분 이내, 10분 이내, 30분 이내, 1시간 이내, 2시간 이내, 3시간 이내, 4시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내, 48시간 이내, 72시간 이내, 96시간 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 또는 3개월 이내에 이루어진다.
일부 예에서, 투여되는 적어도 하나의 Nmb 단백질은 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 예에서, 투여되는 적어도 하나의 핵산 분자는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩한다. 일부 예에서, 투여되는 적어도 하나의 Nmb 핵산 분자 코딩 서열은 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서, 코딩 서열은 벡터로 삽입될 수 있거나, 또는 그의 일부일 수 있다. 일부 예에서, 뉴로메딘 C(Nmc) 단백질은 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 예에서, 핵산 분자는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 Nmc 단백질을 코딩한다.
일부 예에서, 본 방법은 대상체에게 치료 유효량의 또 다른 치료제, 예컨대, 표 1에 제공된 것들 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 포함한다. 한 예에서, 본 방법은 대상체에게 치료 유효량의 PGE2를 투여하는 단계를 포함한다.
표 1: 예시적인 장애 및 추가 치료제
장애 예시적인 추가 요법
알레르기 반응
· 계절성(예컨대, 꽃가루)
· 먼지/곰팡이
· 식품(예컨대, 갑각류, 달걀, 우유, 견과류, 밀)
· 애완동물(예컨대, 비듬)
· 식물
· 약물(예컨대, 항생제, 예컨대, 술파 또는 페니실린, 아스피린, NSAID, 항경련제, 화학요법 약물)
· 곤충(예컨대, 바퀴벌레 뿐만 아니라, 꿀벌, 말벌(hornet), 말벌(wasp), 옐로우 자켓 말벌, 불개미로부터의 독)
· 병원체(예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충)
· 라텍스		 충혈제거제
항히스타민제
코르티코스테로이드제
면역요법
에피네프린
부비강염 항생제(예컨대, 아목시실린)
코르티코스테로이드제
천식(경증, 중등도 또는 중증, 호산구성 천식 및 스테로이드 내성 천식 포함) 코르티코스테로이드제
글루코코르티코이드
기관지확장제(예컨대, 단기(예컨대, 살부타몰) 또는 장기 작용(예컨대, 포르모테롤) 베타-2 아드레날린 효능제, 항콜린제(예컨대, 티오트로피움 및 이프라트로피움 브로마이드)
장기 작용 베타 효능제(LABA) 류코트리엔 조절제
메폴리주맙
벤라리주맙
레슬리주맙
트랄로키누맙
레브리키주맙
두필루맙
COPD 코르티코스테로이드제
기관지확장제(예컨대, 단기(예컨대, 살부타몰) 또는 장기 작용(예컨대, 포르모테롤) 베타-2 아드레날린 효능제, 항콜린제(예컨대, 티오트로피움 및 이프라트로피움 브로마이드)
항생제(예컨대, 에르티로마이신)
산소 보충
특발성 폐 섬유증(IPF) 피르페니돈
안지오키나제 억제제(예컨대, 닌테다닙)
비염 항히스타민제 비강용 스프레이
코르티코스테로이드제 비강용 스프레이
항콜린성 비강용 스프레이(예컨대, 이프라트로피움)
충혈제거제(예컨대, 슈도에페드린 또는 페닐에프린)
호산구성 육아종증 다발혈관염(EGPA) 메폴리주맙
글루코코르티코이드(예컨대, 프레드니솔론)
면역억제제(예컨대, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드)
메토트렉세이트
호산구성 식도염 국소용 코르티코스테로이드제(예컨대, 부데소니드, 플루티카손)
양성자 펌프 억제제(예컨대, 오메프라졸, 란소프라졸, 덱스란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 라베프라졸, 일라프라졸)
습진 코르티코스테로이드제(예컨대, 하이드로코르티손, 클로베타솔 프로피오네이트)
면역억제제(예컨대, 피메크로리무스, 타크로리무스)
두드러기(심마진) 항히스타민제(예컨대, 디펜히드라민, 하이드록시진, 로라타딘, 세티리진, 데슬로라타딘)
류코트리엔 길항제(예컨대, 몬테루카스트 및 자피를루카스트)
경구용 글루코코르티코이드
항염증제
오말리주맙
면역억제제
만성 가려움증 코르티코스테로이드제(예컨대, 코르티손 및 프레드니손)
칼시뉴린 억제제(예컨대, 피메크로리무스 및 투크로리무스)
항우울제(예컨대, 프로작 및 졸로푸트)
혈관부종 항히스타민제(예컨대, 세티리진)
안드로겐
결막염 항히스타민제(예컨대, 디펜히드라민)
비만 세포 안정화제(예컨대, 크로몰린)
항생제
아토피성 피부염 트랄로키누맙
국소용 코르티코스테로이드제(예컨대, 하이드로코르티손)
국소용 칼시뉴린 억제제(예컨대, 타크로리미스 또는 피메크로리무스)
전신 면역억제제(예컨대, 사이클로스포인, 메토트렉세이트, 인터페론 감마-1b)
호산구성 장애
· 호산구성 식도염
· 호산구성 위염
· 호산구성 위장염
· 호산구성 장염
· 호산구성 결장염
· 호산구성 천식(상기 참조)
· 호산구성 위장 장애(EGID)
· 호산구성 근막염
· 호산구성 육아종증 다발혈관염(이전 명칭 척-스트라우스 증후군(Churg-Strauss Syndrome))EGPA(상기 참조)
· 호산구성 폐 장애
· 과호산구증가 증후군(HES)
· 호산구성 백혈병(만성, 급성, 또는 클론성)		 국소 또는 전신 스테로이드제(예컨대, 코르티코스테로이드제, 글루코코르티코이드, 예컨대, 프레드니손)
아미노산 기반 식이
면역억제제(예컨대, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드

백혈병인 경우: 화학요법(예컨대, 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 디하이드로클로라이드, 인터류킨 2), 글리벡, 티로신 키나제 억제제(예컨대, 소라페닙, 미도스타루인, 포나티닙),
조혈 줄기 세포 이식
기생충 또는 진균 감염 항진균제(예컨대, 폴리엔(예컨대 암포테리신 B, 니스타틴, 나타마이신), 아졸(예컨대, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸), 알릴아민(예컨대, 테르비나핀), 및 에키노칸딘(예컨대 카스포펀진)
타바보롤
항기생충제(예컨대, 구충제, 항원충제, 항아메바제)
호지킨 림프종 레브리키주맙
MOPP
방사선 요법
ABVD(아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카르바진)
스탠포드 V(아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 클로르메틴, 에토포시드, 프레드니손)
BEACOPP(독소루비신, 블레오마이신, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 프로카르바진, 에토포시드, 프레드니손)
A. 뉴로메딘 단백질
예시적인 Nmb 데카펩티드는 서열번호 1(인간)에 제시되어 있고, 그의 변이체는 서열번호 3-37에 제시되어 있다. 일부 예에서, Nmb 단백질은 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37의 단백질 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 예시적인 Nmb 코딩 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다. 일부 예에서, Nmb 핵산 서열은 서열번호 2를 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 일부 예에서, 이는 플라스미드 또는 벡터의 일부이고, 일부 예에서는 프로모터(예컨대, 구성적 프로모터)에 작동가능하게 연결되어 있다.
한 예에서, 개시된 방법은 Nmb 단백질(예컨대, 포유동물 Nmb 단백질)을 이용하고, 즉, Nmb 단백질은 대상체에게 투여된다. 상기 단백질의 한 예는 서열번호 1(천연 Nmb 단백질)에 제시되어 있다. 천연 또는 변이체 Nmb 단백질이 사용될 수 있다. 한 예에서, 변이체 Nmb 펩티드는 Nmb 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써 제조된다. 일부 예에서, 단백질이 IL-5 활성 감소, IL-13 활성 감소, 호산구증가증 감소, 염증 감소, ILC2 반응 감소, 또는 이들의 조합을 달성할 수 있는 능력을 보유하는 한, 변이체 Nmb 서열, 예컨대, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 사용된다. IL-5 활성(예컨대, DNA 또는 단백질 발현 측정), IL-13 활성(예컨대, DNA 또는 단백질 발현 측정), 호산구증가증, 염증, 및 ILC2 반응을 측정하는 예시적인 방법이 본원에 기술되어 있다. 치환에 대해 내성을 띨 가능성이 더 높은 Nmb의 영역은 서열을 정렬함으로써 결정되고, 여기서, 종 사이에 보존되는 아미노산은 치환에 대해 내성을 띨 가능성이 더 낮은 반면, 특정 위치에서 달라지는 아미노산은 치환에 대해 내성을 띨 가능성이 더 높다. 추가로, 알라닌 스캔 및 말단절단 스캔이 사용될 수 있다(실시예 7 참조).
변이체 Nmb 단백질, 예컨대, 서열번호 1의 변이체는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 단일 삽입, 단일 결실, 또는 단일 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 돌연변이체 Nmb 단백질은 1 내지 5개의 삽입, 1 내지 5개의 결실, 1 내지 5개의 치환, 또는 그의 임의 조합(예컨대, 1-5개의 치환과 함께 단일 삽입)을 포함한다. 일부 예에서, 변이체 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1)은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변이, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환(예컨대, 보존적 아미노산 치환), 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 삽입, 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합을 갖는다. 일부 예에서, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변이, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 삽입, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 결실, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 또는 그의 임의 조합(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환과 함께 1 또는 2개의 아미노산 결실). 한 예에서, 서열번호 1은 아미노산 1, 2, 3, 4, 10에서 아미노산 치환, 예컨대, 알라닌 또는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 예에서, 서열번호 1은 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 예컨대, 아미노산 1, 2, 3, 4, 및/또는 10에서 알라닌 또는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 예에서, 서열번호 1은 예컨대, 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 예컨대, aa 5 및/또는 aa 7에서 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 결실,을 포함한다. 한 예에서, 서열번호 1은 예컨대, 아미노산 1 및 2, 1-3, 1-4, 2-3, 2-4, 2-5 등에서 2, 3, 또는 4개의 연속 아미노산 결실을 포함한다. 한 예에서, 서열번호 1은 아미노산 1, 2, 3, 4, 10에서 아미노산 치환, 예컨대, 알라닌 또는 보존적 아미노산 치환, 및 아미노산 5 및/또는 7에서 1 또는 2개의 아미노산 결실을 포함한다. 한 예에서, 서열번호 1은 N 또는 C 말단에서 캡, 예컨대, 메탄술포닐 캡, NHMe, 캡 또는 OH 캡을 포함한다.
변형 또는 돌연변이의 한 유형으로는 생화학적 특성이 유사한 아미노산 잔기를 대신하는 아미노산으로 치환, 즉, 보존적 치환(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 치환)을 포함한다. 전형적으로, 보존적 치환은 생성된 Nmb 펩티드의 활성에 거의 영향을 주지 않거나, 또는 전혀 주지 않는다. 예를 들어, 보존적 치환은 포유동물에서 IL-5 활성 감소, IL-13 활성 감소, 호산구증가증 감소, 염증 감소, ILC2 반응 감소, 또는 이들의 조합을 달성할 수 있는 Nmb 펩티드의 능력에 실질적으로 영향을 주지 않는, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37에서의 아미노산 치환이다. 알라닌 스캔은 Nmb 단백질, 예컨대, 서열번호 1 중 어느 아미노산 잔기가 아미노산 치환에 대해 내성을 띨 수 있는지 확인하는 데 사용될 수 있다(실시예 7 참조). 한 예에서, Nmb(예컨대, 서열번호 1)의 이들 활성은 알라닌, 또는 다른 보존적 아미노산이 1, 2, 3, 4, 또는 5 천연 아미노산 대신으로 치환되었을 때, 25% 초과, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하만큼 변경되지 않는다. 단백질(예컨대, Nmb) 중 원래의 아미노산 대신으로 치환될 수 있고, 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 예로 Ala 대신 Ser; Arg 대신 Lys; Asn 대신 Gln 또는 His; Asp 대신 Glu; Cys 대신 Ser; Gln 대신 Asn; Glu 대신 Asp; Gly 대신 Pro; His 대신 Asn 또는 Gln; Ile 대신 Leu 또는 Val; Leu 대신 Ile 또는 Val; Lys 대신 Arg 또는 Gln; Met 대신 Leu 또는 Ile; Phe 대신 Met, Leu 또는 Tyr; Ser 대신 Thr; Thr 대신 Ser; Trp 대신 Tyr; Tyr 대신 Trp 또는 Phe; 및 Val 대신 Ile 또는 Leu로의 치환을 포함한다.
더욱 실질적인 변이는 덜 보존적인 치환을 사용하여, 예컨대, (a) 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체형태와 같이, 치환 부위에서 폴리펩티드 백본의 구조; (b) 표적 부위에서의 폴리펩티드의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 데 미치는 그의 영향에 있어서 더욱 유의적인 차이를 보이는 잔기를 선택함으로써 이루어질 수 있다. 일반적으로 폴리펩티드 기능에서 가장 변이를 일으킬 것으로 예상되는 치환은 (a) 친유성 잔기, 예컨대, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예컨대, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌 대신으로 치환(또는 그에 의해 치환)되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기 대신으로 치환(또는 그에 의해 치환)되거나; (c) 양전기 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘이 음전기 잔기, 예컨대, 글루탐산 또는 아스파르트산 대신으로 치환(또는 그에 의해 치환)되거나; 또는 (d) 벌키한 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 페닐알라닌이 측쇄를 갖닌 않는 것, 예컨대, 글리신 대신으로 치환(또는 그에 의해 치환)되는 것이다. 이러한 아미노산 치환(또는 다른 결실 또는 부가)의 효과는 포유동물에서 IL-5 활성 감소, IL-13 활성 감소, 호산구증가증 감소, 염증 감소, ILC2 반응 감소, 또는 이들의 조합을 달성할 수 있는 변이체 Nmb 단백질의 능력을 분석하여 Nmb 단백질, 예컨대, 서열번호 1의 기능을 분석함으로써 평가될 수 있다.
일부 예에서, 개시된 방법 또는 조성물에서 사용되는 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38)은 하나 이상의 위치에서 PEG화된다. 일부 예에서, 개시된 방법 또는 조성물에서 사용되는 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질은 면역글로불린 FC 도메인을 포함한다. 항체의 보존된 FC 단편은 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질의 n 말단 또는 c 말단에 도입될 수 있고, 단백질의 안정성을 증강시킬 수 있으며, 이로써, 혈청 반감기를 증진시킬 수 있다. FC 도메인 또한 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 비드 상에서 단백질을 정제하는 수단으로서 사용될 수 있다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38)은 세포 흡수를 촉진시키기 위해 세포 투과성 펩티드(CPP) 태그가 부착될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 사용되는 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질은 (1) Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질, 및 (2) 세포 투과성 펩티드을 포함하는 융합 단백질이다. 세포 투과성 펩티드는 Nmb 또는 Nmc 단백질의 N 또는 C 말단에 있을 수 있다. 세포 투과성 펩티드는 일반적으로 고도의 양이온성을 띠고, 일반적으로 단백질의 세포 섭취/흡수를 촉진시킬 수 있는 아르기닌 및 리신이 풍부한 짧은 펩티드(40개 이하의 아미노산)이다. 사용될 수 있는 예시적인 세포 투과성 펩티드는 친유성 펩티드(예컨대, TAT[YGRKKRRQRRR; 서열번호 57], SynB1[RGGRLSYSRRRFSTSTGR; 서열번호 39], SynB3[RRLSYSRRRF; 서열번호 40], PTD-4[PIRRRKKLRRLK; 서열번호 41], PTD-5[RRQRRTSKLMKR; 서열번호 42], FHV Coat-(35-49)[RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 43], BMV Gag-(7-25)[KMTRAQRRAAARRNRWTAR; 서열번호 44], HTLV-II Rex-(4-16)[TRRQRTRRARRNR; 서열번호 45], D-Tat[GRKKRRQRRRPPQ; 서열번호 46], R9-Tat GRRRRRRRRRPPQ[서열번호 47] 및 페네트라틴[RQIKWFQNRRMKWKK; 서열번호 48]), 양친매성 펩티드(예컨대, MAP[KLALKLALKLALALKLA; 서열번호 49], SBP[MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; 서열번호 50], FBP[GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열번호 51], MPG ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 52], MPG(ΔNLS)[ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; 서열번호 53], Pep-2[ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 54], 및 트랜스포르탄[GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; 서열번호 55]), 주기적 서열(예컨대, pVec, 폴리아르기닌 RxN(4<N<17) 키메라, 폴리리신 KxN(4<N<17) 키메라, (RAca)6R, (RAbu)6R, (RG)6R, (RM)6R, (RT)6R, (RS)6R, R10, (RA)6R, R7, 및 pep-1[ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 56]), Cr10(사이클릭 pol-아르기닌 CPP), TAT48 -57, TAT47 -57, 또는 TAT49 -57; 페네트라틴; Pep-1; 물질 P, SP; 폴리아르기닌, 예컨대, R5-R12; pVEC; 트랜스포르탄; MAP; 디아토스 펩티드 벡터 1047, DPV1047, 벡토셀®; MPG; ADP 리보실화 인자, ARF, 예컨대, ARF1 -22; BPrPr(예컨대, BPrPr1 -28); p28; VT5; Bac 7, 예컨대, Bac1 -24; C105Y; PFVYLI(서열번호 58); 및 Pep-7을 포함한다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38)은 N 말단 캡, 예컨대, 포르밀, 아세틸, 2-18개의 탄소 아실, 아릴아실(예컨대, 벤조일), 헤테로아릴아실(예컨대, 2-아세틸피리딘), 카바메이트(예컨대, t-부틸카바메이트), 숙시닐, 알킬 또는 아릴술폰아미드 및/또는 C 말단 캡, 예컨대, 아미드, 산, 알데히드, 및 에스테르(아릴, 알킬, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 예컨대, 2-20개의 반복 단위로 이루어진 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다.
B. 단백질 생성
재조합적으로 발현된 Nmb 또는 Nmc 단백질의 단리 및 정제는 종래 수단, 예컨대, 분취용 크로마토그래피 및 면역학적 분리에 의해 수행되었다. 일단 발현되고 나면, Nmb 또는 Nmc 단백질은 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피 등을 비롯산, 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌 [R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982] 참조). 균일도가 적어도 약 90 내지 95%인 실질적으로 순수한 조성물이 본원에서 개시되고, 98 내지 99% 이상의 균일도는 약학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
재조합 방법 이외에도, Nmb 또는 Nmc 단백질(상기 기술된 바와 같이 그의 변이체)은 또한 표준 펩티드 합성을 이용하여 전체로 또는 부분적으로 구성될 수 있다. 한 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카복실 말단의 축합에 의해 합성된다. 펩티드 결합은 (예컨대, 커플링 시약 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 사용에 의한) 카복실 말단 단부의 활성화에 의해 형성될 수 있다.
C. 단백질에 대한 변형
개시된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 Nmb 펩티드는 본원에 기술된 Nmb 펩티드의 합성 실시양태를 포함한다. 추가로, 이들 단백질의 유사체(비펩티드 유기 분자), 유도체(개시된 펩티드 서열로 출발하여 수득된 화학적으로 관능화된 폴리펩티드 분자) 및 변이체(상동체)가 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 각각의 Nmb 펩티드 Nmc 펩티드는 자연적으로 발생 및 다른 방식으로 존재하는, L- 및/또는 D-아미노산일 수 있는 아미노산의 서열로 구성된다.
Nmb 및 Nmc 펩티드는 각종 화학적 기술에 의해 변형되어, 변형되지 않은 Nmb 및 Nmc 펩티드와 본질적으로 동일한 활성을 갖고, 임의로, 다른 바람직한 특성을 갖는 유도체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 카복실산 기는 카복실 말단이든, 또는 측쇄이든 간에, 약학적으로 허용되는 양이온의 염의 형태로 제공될 수 있거나, 또는 에스테르화되어 C1-C16 에스테르를 형성할 수 있거나, 또는 식 NR1R2의 아미드(여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C16 알킬이거나, 또는 조합되어 헤테로사이클릭 고리, 예컨대, 5원 또는 6원 고리를 형성)로 전환될 수 있다. 펩티드의 아미노 기는 아미노 말단이든지, 또는 측쇄이든 간에, 약학적으로 허용되는 산 부가 염, 예컨대, HCl, HBr, 아세트산, 벤조산, 톨루엔 술폰산, 말레산, 타르타르산 및 다른 유기 염의 형태일 수 있거나, 또는 C1-C16 알킬 또는 디알킬 아미노로 변형될 수 있거나, 또는 리간드 분자의 결합부의 특정 관능기의 도입을 위해 아미드로 추가로 전환될 수 있다.
펩티드 측쇄의 하이드록실 기는 펩티드에 소수성 특징을 도입하기 위해 C1-C16 알콕시로 또는 C1-C16 에스테르로 전환될 수 있다. 대안적으로, 하이드록실 기는 음 전하를 도입하고, 수가용성을 증가시키기 위해 황산화 또는 인산화될 수 있다. 대안적으로, 측쇄 하이드록실 또는/및 아스파라긴 및 또는 아스파르트산 측쇄는 펩티드의 특성을 조정할 수 있는 세린/트레오닌 글리코펩티드 또는 N-아세틸글리코펩티드와 같이 글리코실화될 수 있다. 펩티드 측쇄의 페닐 및 페놀성 고리는 하나 이상의 할로겐 원자, 예컨대 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘으로 치환될 수 있거나, 또는 C1-C16 알킬, C1-C16 알콕시, 카복실산 및 그의 에스테르, 또는 상기 카복실산의 아미드로 치환될 수 있다. 펩티드 측쇄의 메틸렌 기는 상동 C2-C4 알킬렌이 되도록 연장될 수 있다. 티올은 널리 인식된 다수의 보호기, 예컨대, 아세트아미드 기 중 어느 하나로 보호될 수 있다. 티올은 말레이미드 또는 디술피드와 반응할 수 있다.
펩티드모방체 및 유기모방체(organomimetic) 실시양태가 구상되며, 이로써, 상기 펩티드모방체 및 유기모방체의 화학적 성분의 3차원 배열이 폴리펩티드 백본 및 성분 아미노산 측쇄의 3차원 배열을 모방하여, 2형 사이토카인 생산 및 생성된 염증을 감소시킬 수 있는 측정가능하거나 또는 증강된 능력을 가진 Nmb 또는 Nmc 펩티드의 상기 펩티드모방체 및 유기모방체가 생성된다. 컴퓨터 모델링 적용의 경우, 약리작용단은 생물학적 활성을 위한 구조적 요건의 이상적인 3차원 정의이다. 펩티드모방체 및 유기모방체는 컴퓨터 모델링 소프트웨어(컴퓨터 지원 약물 디자인 또는 CADD(computer assisted drug design)를 이용)를 사용하여 각각의 약리작용단이 적합화되도록 디자인될 수 있다. CADD에서 사용된 기술 설명을 위해, 문헌 [Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs," in Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-174 and Principles of Pharmacology, Munson (ed.) 1995, Ch. 102]를 참조한다. 상기 기술을 이용하여 제조된 모방체 또한 포함된다.
일부 예에서, 개시된 방법 또는 조성물에서 사용된 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38)은 하나 이상의 변형된 아미노산(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형된 아미노산)을 포함한다. 예시적인 Nmb 또는 Nmc 펩티드는 글리코실화, 페길화, 인산화 또는 유도 기점이 된 펩티드의 적어도 하나의 생물학적 기능(예컨대, IL-5 활성 감소, IL-13 활성 감소, 호산구증가증 감소, 염증 감소, ILC2 반응 감소, 또는 이들의 조합)을 유지하는 임의의 유사한 프로세스에 의해 변형된 것일 수 있는 유도체 펩티드이다. Nmb 또는 Nmc 펩티드는 또한 하나 이상의 비자연적으로 발생된 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 치환 또는 부가로서 Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38) 내로 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산은 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, 감마-Abu, 엡실론-Ahx, 6-아미노 헥사노산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대, 베타-메틸 아미노산, C알파-메틸 아미노산, N알파-메틸 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 아미노산은 D(우선성) 또는 L(좌선성)일 수 있다. 다른 구체적인 예에서, 예컨대, 서열 내의 하나 이상의 아미노산을, 하나 이상의 아미노산과 펩티드 결합을 형성할 수 있는 (이에 따라, "분지"를 형성할 수 있는) 유리 측쇄를 수반한 아미노산 또는 아미노산 유사체로 치환시킴으로써, 본원에 열거된 Nmb 펩티드 및 Nmc 펩티드의 분지형 버전을 제공한다. 사이클릭 펩티드 또한 고려된다.
또한, 예컨대 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 페길화, 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해적 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에의 연결 등에 의해 합성하는 동안 또는 그 후에 차별적으로 변형되는 펩티드 유도체도 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)는 N 말단에서 아세틸화되고/거나, C 말단에서 아미드화된다. 한 예에서, Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)는 카복시 말단 아미드를 포함한다.
펩티드모방체는 펩티드 및 단백질을 기반으로 하거나, 또는 그로부터 유도된 화합물이다. 펩티드모방체는 비자연 아미노산, 입체형태적 구속, 등비체적 대체 등을 이용하여 공지된 펩티드 서열을 구조적으로 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 대상 펩티드모방체는 펩티드와 비펩티드 합성 구조 사이에 구조적 공간의 연속체로 구성되고; 따라서, 펩티드모방체는 약리작용단을 묘사하는데 유용할 수 있고, 펩티드를 모페 펩티드의 활성을 수반한 비펩티드 화합물로 번역하기 위해 도움을 주는 데 유용할 수 있다.
Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)의 미메토프(mimetope)가 본 개시내용에 포함된다. 이러한 펩티드모방체는 가수 분해될 수 없는 속성(예컨대, 펩티드를 분해시키는 다른 생리학적 조건 또는 프로테아제에 대항한 안정성 증가)을 가질 수 있다. 예시 목적으로, 펩티드 유사체는, 예를 들어, 벤조디아제핀(예컨대, 문헌 [Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988] 참조), 치환된 감마 락탐 고리(문헌 [Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, pl23]), C-7 모의체(mimics) (문헌 [Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p. 105]), 케토-메틸렌 슈도펩티드(문헌 [Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29:295]; 및 [Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., 1985]), β-선회 디펩티드 코어(문헌 [Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647]; 및 [Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231]), β-아미노알콜(문헌 [Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun126:419]; 및 [Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71]), 디아미노케톤(문헌 [Natarajan et al. (1984) Biochem Biophys Res Commun 124:141]), 및 메틸렌아미노 변형된 것(문헌 [Roark et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p134])을 사용하여 생성될 수 있다. 또한, 일반적으로 문헌 [Session III: Analytic and synthetic methods, in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988]을 참조한다.
펩티드모방체를 생성시키기 위해 수행될 수 있는 각종 측쇄 대체 이외에도, 본 개시내용은 펩티드 2차 구조의 입체형태적으로 구속된 모의체의 사용을 구체적으로 고려한다. 펩티드의 아미드 결합에 대한 대용물이 개발되어 있다. 아미드 결합에 위해 빈번하게 이용되는 대용물은 다음 기를 포함한다: (i) 트랜스-올레핀, (ii) 플루오로알켄, (iii) 메틸렌아미노, (iv) 포스폰아미드, 및 (v) 술폰아미드. 추가로, 펩티드의 백본의 더 실질적 변형을 기반으로 한 펩티드모방체가 사용될 수 있다. 이러한 카테고리에 속하는 펩티드모방체는 (i) 레트로-인버소 유사체, 및 (ii) N-알킬 글리신 유사체(소위 펩토이드)를 포함한다. 추가로, 조합 화학의 방법을 이용하여 펩티드모방체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 소위 "펩티드 모핑" 전략의 한 실시양태는 광범위한 펩티드 결합 치환기를 포함하는 펩티드 유사체의 라이브러리의 무작위 생성에 초점을 둔다. 예시적인 실시양태에서, Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)의 펩티드모방체는 펩티드의 레트로-인버소 유사체로서 유도될 수 있다. 이러한 레트로-인버소 유사체는 공지된 방법, 예컨대, 미국 특허 제4,522,752호(Sisto et al.)에 기재된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 레트로-인버소 유사체는, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 00/01720에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다. 혼합된 펩티드, 예컨대, 일부 일반 펩티드 연결을 포함한 것이 생성될 수 있다. 일반적인 가이드로서, 단백질 분해에 가장 영향을 받기 쉬운 부위가 전형적으로 변경되며, 덜 영향을 받기 쉬운 아미드 연결이 모방체 전환에 대해 임의적이다. 최종 생성물, 또는 그의 중간체는 정제될 수 있다.
Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)는 D 입체이성질체인 적어도 하나의 아미노산 또는 모든 아미노산을 포함할 수 있다. Nmb 펩티드 또는 Nmc 펩티드는 역전되는 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 역전되는 아미노산은 D 입체이성질체일 수 있다. 펩티드의 모든 아미노산은 역전될 수 있고/거나, 모든 아미노산은 D 입체이성질체일 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 펩티드모방체는 펩티드의 레트로-에난티오 유사체로서 유도될 수 있다. 예컨대, 이와 같은 레트로-에난티오 유사체는 상업적으로 이용가능한 D-아미노산(또는 그의 유사체), 및 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/01720에 기술된 바와 같은 표준 고체 상 또는 용액 상 펩티드 합성 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 최종 생성물은 HPLC에 의해 정제하여 순수한 레트로-에난티오 유사체를 수득할 수 있다. 추가의 또 다른 예시되는 실시양태에서, 트랜스-올레핀 유도체가 대상 펩티드에 대해 제조될 수 있다. 트랜스-올레핀 유사체는 문헌 [Y. K. Shue et al. (1987) Tetrahedron Letters 28:3225]의 방법에 따라 및 PCT 공개 WO 00/01720에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 상기 방법에 의해 합성된 슈도디펩티드를 다른 슈도디펩티드와 커플링시켜, 아미드 관능기 대신 여러 올레핀 관능기를 수반한 펩티드 유사체를 제조하는 것이 추가로 가능하다. 추가의 또 다른 부류의 펩티드모방체 유도체는 포스포네이트 유도체를 포함한다. 이러한 포스포네이트 유도체의 합성은 공지된 합성 방식으로부터 적합화될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Loots et al. in Peptides: Chemistry and Biology, (Escom Science Publishers, Leiden, 1988, p. 118))]; [Petrillo et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., 1985)] 참조).
다른 펩티드모방체 구조가 공지되어 있고, 대상 펩티드모방체에 사용하기 위해 용이하게 적합화될 수 있다. 예를 들어, 펩티드모방체는 제한된 아미노산 유사체로서 1-아자비사이클로[4.3.0]노난 대용물(문헌 [Kim et al. (1997) J. Org. Chem. 62:2847] 참조), 또는 N-아실 피페라진산(문헌 [Xi et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:80] 참조), 또는 2-치환된 피페라진 모이어티를 혼입할 수 있다(문헌 [Williams et al. (1996) J. Med. Chem. 39:1345-1348] 참조). 추가의 다른 실시양태에서, Nmb 펩티드(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 펩티드(예컨대, 서열번호 38)의 특정 아미노산 잔기를 아릴 및 비아릴 모이어티, 예컨대, 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 또는 헤테로방향족 핵, 또는 비방향족, 방향족-헤테로방향족, 또는 비헤테로방향족 핵으로 대체시킬 수 있다. 대상 펩티드모방체는, 예컨대, 고처리량 스크리닝과 조합된 조합 합성 기술에 의해 최적화될 수 있다. 더욱이, 미메토프의 다른 예는 단백질 기반 화합물, 탄수화물 기반 화합물, 지질 기반 화합물, 핵산 기반 화합물, 자연 유기 화합물, 합성적으로 유도된 유기 화합물, 항이디오타입 항체 및/또는 촉매성 항체, 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 미메토프는, 예를 들어, 섬유증을 억제할 수 있는 화합물에 대해 자연 및 합성 화합물의 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 미메토프는 또한 예를 들어, 자연 및 합성 화합물의 라이브러리, 특히, 화학적 또는 조합 라이브러리(예컨대, 서열 또는 크기 면에서 상이하지만, 동일한 빌딩 블록을 갖는 화합물의 라이브러리)로부터 수득될 수 있다. 미메토프는 또한 예를 들어 합리적 약물 디자인에 의해 수득될 수 있다. 합리적 약물 디자인 절차에서는, 본 발명의 화합물의 3차원 구조가, 예를 들어, 핵 자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance) 또는 X선 결정학에 의해 분석될 수 있다. 이어서, 이러한 3차원 구조를 이용하여, 예를 들어, 컴퓨터 모델링에 의해 잠재적 미메토프의 구조를 예측할 수 있다. 이어서, 예측된 미메토프 구조는, 예를 들어, 화학적 합성, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 자연 공급원(예를 들어, 식물, 동물, 박테리아 및 진균)으로부터 미메토프를 단리시킴으로써 생성될 수 있다.
D. 뉴로메딘 핵산 분자 및 벡터
예시적인 Nmb 코딩 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다. 일부 예에서, Nmb를 코딩하는 Nmb 핵산 분자는 서열번호 2를 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 일부 예에서, Nmb 핵산 분자는 서열번호 1의 단백질, 또는 그의 변이체(예컨대, 상기 기술된 것)를 코딩한다. 일부 예에서, Nmb 핵산 서열은 서열번호 2를 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 일부 예에서, 이는 플라스미드 또는 벡터의 일부이고, 일부 예에서, 프로모터(예컨대, 구성적 프로모터)에 작동가능하게 연결되어 있다.
한 예에서, 개시된 방법은 Nmb 핵산 서열 또는 Nmc 핵산 서열(예컨대, cDNA, 게놈, 또는 RNA 서열)을 사용하고, 즉, Nmb 또는 Nmc 핵산 분자가 대상체에게 투여되고, 코딩된 Nmb 또는 Nmc 단백질은 핵산 분자가 도입된 세포에서 발현된다. Nmb 또는 Nmc 핵산 분자는 상기 기술된 바와 같은 천연 또는 변이체 Nmb 또는 Nmc 단백질을 코딩할 수 있다.
유전자 코드에 기초하여, 임의의 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38)을 코딩하는 핵산 서열이 생성될 수 있다. 일부 예에서, 상기 서열은 숙주 세포, 예컨대, Nmb 또는 Nmc 단백질을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된다. 상기 핵산은 직접 사용될 수 있거나(예컨대, 대상체에게 투여될 수 있거나), 대상체에게 투여되는 Nmb 또는 Nmc 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다.
한 예에서, Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2의 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 상기 핵산을 포함하는 세포, 플라스미드 및 바이러스 벡터로서, Nmb 또는 Nmc 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 또한 포함할 수 있는 것 또한 제공한다.
한 예에서, Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 상기 서열은 본원에 제공된 아미노산 서열 및 유전자 코드를 이용하여 쉽게 제조될 수 있다. 추가로, 당업자는 기능적으로 등가인 핵산, 예컨대, 서열은 상이하지만, 동일한 Nmb 단백질 서열을 코딩하는 것인 핵산을 함유하는 다양한 클론을 구성할 수 있다.
핵산 분자는 Nmb 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 DNA, cDNA, mRNA, 및 RNA 서열을 포함한다. 코딩 서열 내의 침묵 돌연변이는 유전자 코드의 축퇴성(즉, 중복성)으로부터 초래되고, 이로써, 1 초과의 코돈이 동일한 아미노산 잔기를 코딩할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 류신은 CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, 또는 TTG에 의해 코딩될 수 있고; 세린은 TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, 또는 AGC에 의해 코딩될 수 있고; 아스파라긴은 AAT 또는 AAC에 의해 코딩될 수 있고; 아스파르트산은 GAT 또는 GAC에 의해 코딩될 수 있고; 시스테인은 TGT 또는 TGC에 의해 코딩될 수 있고; 알라닌은 GCT, GCC, GCA, 또는 GCG에 의해 코딩될 수 있고; 글루타민은 CAA 또는 CAG에 의해 코딩될 수 있고; 티로신은 TAT 또는 TAC에 의해 코딩될 수 있고; 이소류신은 ATT, ATC, 또는 ATA에 의해 코딩될 수 있다. 표준 유전자 코드를 제시하는 표는 다양한 정보원에서 살펴볼 수 있다(예를 들어, 문헌 [Stryer, 1988, Biochemistry, 3rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NY] 참조).
특정 종에 대한 코돈 선호도 및 코돈 사용빈도 표를 사용하여, 상기 특정 종의 코돈 사용빈도 선호도를 이용하는 Nmb 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것), 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것)를 조작할 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법에서 사용된 Nmb 단백질은 관심 특정 유기체(예컨대, 인간 또는 마우스)에 의해 우선적으로 사용되는 코돈을 갖도록 디자인될 수 있다.
Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것)은 시험관내 방법에 의해, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 리가제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction), 전사 기반 증폭 시스템(TAS: transcription-based amplification system), 자립적 서열 복제 시스템(3SR: self-sustained sequence replication system) 및 Qβ 레플리카제 증폭 시스템(QB)에 의해 클로닝되거나 또는 증폭될 수 있다. 추가로, Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것)은 클로닝 기술(예컨대, 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, N.Y., 1989], 및 [Ausubel et al., (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley and Sons, New York, N.Y.]에서 살펴볼 수 있는 것))에 의해 제조될 수 있다.
Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것)은 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해, 또는 예컨대, 문헌 [Narang et al., Meth . Enzymol . 68:90-99, 1979]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth . Enzymol . 68:109-151, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 예를 들어, 문헌 [Needham-VanDevanter et al., Nucl . Acids Res. 12:6159-6168, 1984]에 기술된 바와 같이 자동화 합성기를 이용하는, 문헌 [Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts . 22(20):1859-1862, 1981]에 의해 기술된 고체상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체상 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성을 통해 단일 가닥 올리뉴클레오티드가 생성된다. 이는 상보적 서열과의 하이브리드화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 이용하여 DNA 폴리머라제로 중합화함으로써 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다.
한 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것)은 Nmb 단백질을 코딩하는 cDNA(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 cDNA를 벡터 내로 삽입함으로써 제조된다. 삽입은 Nmb 또는 Nmc 단백질이 리딩프레임 내에 있도록 이루어질 수 있고, 이로써, Nmb 또는 Nmc 단백질이 생성된다.
Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것)은 플라스미드, 바이러스 또는 서열이 삽입 또는 도입될 수 있도록 조작될 수 있고, 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현될 수 있는 다른 비히클을 포함하나, 이에 제한되지 않는 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 숙주는 미생물, 효모, 곤충, 식물, 및 포유동물 유기체를 포함할 수 있다. 벡터는 선별가능한 마커, 예컨대, 티미딘, 키나제 유전자, 항생제 내성 유전자, 또는 형광 단백질을 코딩할 수 있다.
Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것)은 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. Nmb 또는 Nmc 단백질 코딩 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열은 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열과 화합성인 조건하에서 달성되도록 라이게이션된다. 예시적인 발현 제어 서열로는 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, Nmb 또는 Nmc 단백질 코딩 유전자 앞의 출발 코돈(즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위해 그 유전자의 정확한 리딩프레임의 유지, 및 정지 코돈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 효모, 예컨대, S. 세레비지아에(S. cerevisiae), P. 파스토리스(P. pastoris), 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서의 발현을 위한 벡터가 사용된다. 효소 발현 시스템에서의 사용을 위한 예시적인 프로모터로는 구성적 프로모터, 혈장 막 H+-ATPase(PMA1 : plasma membrane H+-ATPase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK1 : phosphoglycerate kinase-1), 알콜 데하이드로게나제-1(ADH1 : alcohol dehydrogenase-1), 및 다면발현성 약물 내성 펌프(PDR5 : pleiotropic drug-resistant pump)를 포함한다. 추가로, 유도성 프로모터, 예컨대, GAL1 -10(갈락토스에 의해 유도), PHO5(낮은 세포외 무기 포스페이트에 의해 유도), 및 탠덤 열 쇼크 HSE 요소(37℃로의 온도 상승에 의해 유도)가 유용하다. 적정가능한 유도인자에 반응하여 가변적 발현을 지시하는 프로모터는 메티오닌 반응성 MET3 및 MET25 프로모터, 및 구리 의존성 CUP1 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터 중 임의의 것을 멀티카피 (2 μ) 또는 단일 카피(CEN) 플라스미드 내로 클로닝하여 발현 수준에 있어서 부가의 제어 수준을 제공할 수 있다. 플라스미드는 효모에서의 선별을 위한 영양 마커(예컨대, URA3, ADE3, HIS1 등) 및 박테리아에서의 번식에 대한 항생제 내성(AMP)을 포함할 수 있다. K. 락티스(K. lactis) 상에서의 발현을 위한 플라스미드, 예컨대, pKLAC1이 공지되어 있다. 따라서, 한 예에서, 박테리아에서 증폭시킨 후, 플라스미드를 박테리아 형질전환과 유사한 방법에 의해 상응하는 효모 영양요구주 내로 도입할 수 있다. Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 분자(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산 분자(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것) 또한, 곤충 세포에서 발현하도록 디자인될 수 있다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것)은 효모 균주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 7개의 다면발현성 약물 내성 수송체, YOR1, SNQ2, PDR5, YCF1, PDR10, PDR11, 및 PDR15 모두 그의 활성화 전사 인자, PDR1 및 PDR3과 함께 효모 숙주 세포에서 동시에 결실시켜, 이로써 생성되는 균주가 약물에 대해 감수성이 되도록 하였다. 혈장 막의 지질 조성이 변경된 효모 균주, 예컨대, 에르고스테롤 생합성에 결함이 있는 erg6 돌연변이체 또한 사용될 수 있다. 단백질분해에 대해 고도로 감수성인 단백질은 다른 액포성 하이드롤라제의 활성화를 제어하는 마스터 액포성 엔도펩티다제 Pep4가 결여된 효모에서 발현될 수 있다. 상응하는 널 돌연변이체가 생존불가능한 경우에는, 유전자의 온도-감수성(ts: temperature-sensitive) 대립유전자를 수반하는 균주에서의 이종 발현이 이용될 수 있다.
Nmb 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것), 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것) 또한 제조될 수 있다. 예시적인 바이러스 벡터는 폴리오마, SV40, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(HSV 및 EBV 포함), 신드비스 바이러스, 알파바이러스 및 조류, 뮤린, 및 인간 기원의 레트로바이러스를 포함한다. 바큘로바이러스(아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 다핵의 다각체병 바이러스; AcMNPV(Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus)) 벡터 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 오르토폭스 벡터, 아비폭스 벡터, 계두 벡터, 카프리폭스 벡터, 수이폭스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 신드비스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 폴리오바이러스 벡터를 포함한다. 구체적 예시적인 벡터는 폭스바이러스 벡터, 예컨대, 백시니아 바이러스, 계두 바이러스 및 고도로 약독화된 백시니아 바이러스(MVA), 아데노바이러스, 바큘로바이러스 등이다. 유용한 폭스 바이러스는 오르토폭스, 수이폭스, 아비폭스, 및 카프리폭스 바이러스를 포함한다. 오르토폭스는 백시니아, 엑트로멜리아, 및 너구리 폭스를 포함한다. 유용한 오르토폭스의 한 예는 백시니아이다. 아비폭스는 계두, 카나리아 폭스 및 피죤 폭스를 포함한다. 카프리폭스는 산양 폭스 및 면양 폭스를 포함한다. 한 예에서, 수이폭스는 돼지 폭스이다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 다른 DNA 바이러스, 예컨대, 헤르페스 바이러스 및 아데노바이러스, 및 RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스 및 폴리오를 포함한다.
Nmb 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)는 Nmb 단백질 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 발현 제어 요소는 벡터에 삽입되어 상기 핵산 서열의 발현을 제어 및 조절한다. 이들 벡터에서 유용한 발현 제어 요소의 예는 lac 시스템, 파지 람다의 오퍼레이터 및 프로모터 영역, 효모 프로모터, 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 SV40으로부터 유래된 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 작동적 요소는 리더 서열, 종결 코돈, 폴리아데닐화 신호, 및 숙주 시스템에서 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 적절한 전사 및 후속 번역에 필요한 임의의 다른 서열을 를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 발현 벡터는 숙주 시스템에서 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전달 및 후속 복제에 필요한 추가 요소를 함유할 수 있다. 상기 요소의 예는 복제 기점 및 선별가능한 마커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 통상적인 방법을 이용하여 구성될 수 있고(문헌 [Ausubel et al., (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley and Sons, New York, N.Y.]), 상업적으로 이용가능하다.
한 예에서, Nmb 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)는 렌티바이러스 또는 AAV 벡터이고, Nmb 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 예에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대, CMV, 베타 액틴, 또는 T7, 또는 조직 특이적 프로모터, 예컨대, 폐 특이적 프로모터(예컨대, 폐 특이적 계면활성제 단백질 B 유전자 프로모터, SP-B 프로모터, 또는 CC10 프로모터) 또는 피부 특이적 프로모터(예컨대, 케라틴 14 프로모터, 필라그린 프로모터, 또는 트랜스글루타미나제 3 프로모터)이다.
Nmb 단백질을 코딩하는 이종성 DNA 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것), 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 이종성 DNA 서열(서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)를 함유하는 재조합 바이러스를 제조하는 방법은 공지되어 있다. 상기 기술은 예를 들어, 공여 플라스미드 내의 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열을 플랭킹하는 바이러스 DNA 서열과 모체 바이러스에 존재하는 상동성 서열 사이의 상동성 재조합을 포함한다. 벡터는 예를 들어, 자연적으로 존재하거나, 또는 이종 DNA를 삽입하기 위해 모체 바이러스 벡터에 인공적으로 삽입되는 고유한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 이용함으로써 구성될 수 있다.
Nmb 또는 Nmc 코딩 서열이 도입되는 세포가 진핵 세포인 경우, 형질감염 방법은 인산칼슘 공침전, 기계적 절차, 예컨대 미세주사, 전기천공, 리포솜 내에 감싸진 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 진핵 세포는 또한 Nmb 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것), 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자), 및 선별가능한 표현형을 코딩하는 제2의 외래 DNA 분자, 예컨대, 단순 포진 티미딘 키나제 유전자로 공동 형질전환될 수 있다. 또 다른 방법은 진핵성 바이러스 벡터, 예컨대, 시미안 바이러스 40(SV40) 또는 소 유두종 바이러스를 사용하여, 진핵 세포를 일시적으로 감염 또는 형질전환시키고, 단백질을 발현시키는 것이다(예를 들어, 문헌 [Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982]). 발현 시스템, 예컨대, 플라스미드 및 벡터는 고등 진핵 세포, 예컨대, COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 비롯한 세포에서 Nmb 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다.
E. 투여 및 투약
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)을 포함하는 약학 조성물은 선택된 특정 투여 모드에 의존하여 적절한 약학적으로 허용되는 담체(예컨대, 물 또는 염수)를 이용하여 제제화될 수 있다. 상기 조성물은 개시된 방법을 이용하여 신경 장애를 앓는 대상체에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 약학 조성물은 예컨대, 피부, 정맥, 또는 근육 내로의 주사와 같은 주사에 적합하다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본질적으로 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자), 및 약학적으로 허용되는 담체로 구성된다. 이들 실시양태에서, 추가의 치료적으로 효과적인 제제는 조성물에 포함되지 않는다.
다른 실시양태에서, 약학 조성물은 Nmb 단백질, 예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 추가 치료제, 예컨대, 2형 사이토카인에 의해 유발된 염증성 장애(예컨대, 표 1에 제시된 장애)의 치료를 위한 작용제가 포함될 수 있다. 따라서, 약학 조성물은 치료 유효량의 또 다른 작용제를 포함할 수 있다. 상기 작용제의 예로는 제한 없이, PGE2, 표 1에서 "F" 섹션 아래에 열거되어 있는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시내용에서 유용한 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제는 통상적인 것이다. 예컨대, 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 22st Edition (2013)]을 참조한다. 예를 들어, 비경구적 제제는 일반적으로 약학적으로 및 생리적으로 허용되는 유체 비히클인 주사가능한 유체, 예컨대, 물, 생리 식염수, 다른 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 포함한다. 고체 조성물(예컨대, 산제, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상의 비독성 고체 담체는 예를 들어, 약학 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에도, 투여되는 약학 조성물은 최소량의 비독성 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충화제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨 또는 소르비탄 모노올레이트를 함유할 수 있다. 포함될 수 있는 부형제는 예를 들어, 다른 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 혈장 시료이다.
일부 실시양태에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 방출 조절형 제제, 예를 들어, 마이크로캡슐화된 제제에 포함된다. 각종 유형의 생체분해성 및 생체적합성 중합체, 방법이 사용될 수 있고, 다양한 합성 화합물, 단백질 및 핵산을 캡슐화하는 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2007/0148074호; 제2007/0092575호; 및 제2006/0246139호; 미국 특허 제4,522,811호; 제5,753,234호; 및 제7,081,489호; PCT 공개 번호 WO/2006/052285; 문헌 [Benita, Microencapsulation : Methods and Industrial Applications, 2nd ed., CRC Press, 2006] 참조).
다른 실시양태에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 나노분산 시스템에 포함된다. 예컨대, 미국 특허 제6,780,324호; 미국 특허 공개 제2009/0175953호를 참조한다. 예를 들어, 나노분산 시스템은 생물학적 활성제 및 분산화제(예컨대, 중합체, 공중합체, 또는 저분자량 계면활성제)를 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 중합체 또는 공중합체로는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리(D,L-락트산)(PLA), 폴리(D,L-락틱-코-글리콜산(PLGA), 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 예시적인 저분자량 계면활성제는 소듐 도데실 술페이트, 헥사데실 피리디늄 클로라이드, 폴리소르베이트, 소르비탄, 폴리(옥시에틸렌) 알킬 에테르, 폴리(옥시에틸렌) 알킬 에스테르, 및 이들의 조합을 포함한다. 한 예에서, 나노분산 시스템은 PVP 및 ODP 또는 그의 이형(예컨대, 80/20 w/w)을 포함한다. 일부 예에서, 나노분산제는 용매 증발 방법을 사용하요 제조되고, 예를 들어, 문헌 [Kanaze et al., Drug Dev . Indus. Pharm . 36:292-301, 2010]; [Kanaze et al., J. Appl . Polymer Sci . 102:460-471, 2006]을 참조한다. 핵산 투여와 관련하여, 핵산을 투여하기 위한 한 접근법은 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 또는 AAV 벡터를 이용한 직접 처리이다. 상기 기술된 바와 같이, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자), 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)을 코딩하는 핵산 분자는 Nmb 또는 Nmc 단백질의 발현을 증가시키기 위해 프로모터의 제어하에 배치될 수 있다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 단독으로, 또는 다양한 조합으로, 및 다른 치료 조성물과 함께 조합하여 투여될 수 있다. 추가로, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
많은 유형의 방출 전달 시스템이 사용될 수 있다. 예로는 중합체 기반 시스템, 예컨대, 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시아미노부티르산, 및 폴리안하이드라이드를 포함한다. 약물을 함유하는 상기 중합체의 마이크로캡슐은 예를 들어, 미국 특허 제5,075,109호에 기술되어 있다. 전달 시스템은 또한 비중합체 시스템, 예컨대, 지질, 예로서, 스테롤, 예컨대, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대, 모노- 디- 및 트리-글리세리드; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상의 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 부분적으로 융합된 임플란트 등을 포함한다. 구체적인 예로는 (a) Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)이 예컨대, 미국 특허 제4,452,775호; 제4,667,014호; 제4,748,034호; 제5,239,660호; 및 제6,218,371호에 기술되어 있는 것과 같이, 매트릭스 내의 형태로 함유되어 있는 것인 부식 시스템, 및 (b) 활성 성분이 예컨대, 미국 특허 제3,832,253호 및 제3,854,480호에 기술되어 있는 것과 같이, 중합체로부터 속도 조절 방식으로 침투하는 것인 확산 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 펌프 기반 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있고, 그 중 일부는 이식을 위해 적합화된다.
장기간 지속 방출형 임플란트는 만성 병태, 예컨대, 염증성 장애(예컨대, 표 1 참조) 치료에 적합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 장기간 방출은, 임플란트가 구성되고, 치료 수준의 활성 성분을 적어도 30일, 또는 적어도 60일 동안 전달하도록 조정된 것을 의미한다. 장기간 지속 방출 임플란트는 상기 기술된 방출 시스템을 포함한다. 이들 시스템은 핵산을 이용한 사용에 대해 기술된 바 있다(미국 특허 제6,218,371호 참조). 생체내 사용을 위해, 핵산 및 펩티드는 상대적으로 (예컨대, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 통한) 분해에 대해 내성을 띤다. 따라서, Nmb 또는 Nmc 단백질의 변형, 예컨대, C 말단 아미드를 포함하는 것이 사용될 수 있다.
일부 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 예를 들어, (고체 또는 액체 입자를 포함할 수 있는) 에어로졸 스프레이 형태로, 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하여 예컨대, 가압 팩 또는 네블라이저로부터 기도로 국소적으로 투여된다. 가압식 에어노졸인 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물, 및 적합한 산제 기제, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하는, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지가 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 흡입에 의해 투여된다. 예를 들어, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 에어로졸화된 형태로, 예컨대, 네블라이저, 정량식 흡입기(MDI: metered dose inhaler) 또는 건조 분말 흡입기(DPI: dry powder inhaler)를 사용하여 투여된다. 사용 기술은 마이크로펌프 네블라이저(예컨대, Aerogen Go® 시스템), 다량의 미세 입 입자 분획을 생성하도록 디자인된 제트 네블라이저(예컨대, Pari LC Star®), 분무화 동안 더 적은 전단력을 발생시키는 제트 네블라이저(예컨대, Hudson MicroMist®), 및 초음파 네블라이저(예컨대, DeVilbiss Ultra-Neb®)를 포함한다.
제트 네블라이저든, 또는 초음파 네블라이저든, 네블라이저와 함께 사용하는 데 적합한 제제는 용액 1 mL당 0.1 내지 25 mg인 농도로 물 중에 용해된 Nmb 단백질 또는 핵산 분자를 포함한다. 제제는 또한 완충제 및 단순 당(예컨대, 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위해)을 포함할 수 있다. 네블라이저 제제는 또한 에어로졸을 형성할 때 용액의 분무화에 의해 유발된 Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 표면 유도 응집을 감소 또는 방지하기 위해 계면활성제를 함유할 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2007/0065367호).
MDI 장치와 함께 사용하기 위한 제제는 일반적으로 계면활성제의 도움으로 추진제 중에 현탁된 Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자를 함유하는 미분 산제를 포함한다. 추진제는 상기 목적을 위해 사용되는 임의의 통상의 물질, 예컨대, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올, 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 조합을 비롯한, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 탄화수소일 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트리올레이트 및 대두 레시틴을 포함한다. 올레산 또한 계면활성제로서 유용할 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2007/0065367호). 흡입 시스템 장치는 (예컨대, 블리스터 팩에 의해) 단일 용량으로 전달될 수 있거나, 또는 디자인상 다회 용량일 수 있다. 정확한 투약을 보장하기 위해, 제제 전달은 흡입 사이클에서 특정 시점에 이루어지도록 마이크로프로세서를 통해 프로그램화될 수 있다. 일부 경우에, MDI는 휴대용이고, 소형이다.
건조 분말 흡입기(DPI) 또한 에어로졸 전달 장치로서 사용될 수 있다. DPI의 기본 디자인은 계량 시스템, 분말화된 조성물 및 조성물을 분산시키는 방법을 포함한다. 회전력 및 진동력과 같은 힘이 조성물을 분산시키는 데 사용될 수 있다. 계량 및 분산 시스템은 기계적으로 또는 전기적으로 구동될 수 있고, 마이크로프로세서 프로그램화될 수 있다. 장치는 휴대용이고, 소형일 수 있다. 흡입기는 디자인상 다회 또는 단일 용량일 수 있고, 정확한 단위 용량을 위해 경질 젤라틴 캡슐 또는 블리스터 팩과 같은 옵션을 이용한다. Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자는 수동적 흡입에 의해 장치로부터 분산될 수 있거나(예컨대, 환자 본인의 호흡 노력), 능동적 분산 시스템이 사용될 수 있다. 치료 조성물의 건조 분말은 프로세스, 예컨대, 제트 밀링, 분무 건조 및 초임계 유체 제조를 통해 사이징될 수 있다. 허용가능한 부형제, 예컨대, 당, 만닛톨 및 말토스가 분말형 제제의 제조에서 사용될 수 있다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 단백질을 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 담체, 예컨대, 염수 중에 용해되고, 상기 장치를 사용하여 분무화될 수 있다. 회합된 에어로졸은 일련의 공기역학 단계를 이용하여 에어로졸을 분리하고, 예컨대, 소기도 및 폐포에 침착되는 것과 같은, 소적 크기에 기초하여 개별 분획으로 수집하는 것인 넥스트 제너레이션 임팩터(Next Generation Impactor)®(NGI)(MSP Corp.: 미국 미네소타주 쇼어뷰 소재)를 사용하여 수집될 수 있다.
에어로졸 입자 크기는 대개 입자 크기, 형상, 및 밀도에 기초한 파라미터인 공기역학 질량 중위 직경(MMAD: mass median aerodynamic diameter)으로 표시된다. 구형 입자인 경우, MMAD는 MMD(p1/2)와 같고, 여기서, MMD는 질량 중위 직경(mass median diameter)이고, r은 벌크 밀도이다. 비구형 입자인 경우, MMAD는 MMD (p/x)1/2와 같고, 여기서, X는 형상 계수이다. 따라서, 단위 밀도보다 더 큰 입자의 실제 직경은 그의 MMAD보다 더 작을 것이다.
호흡기 내의 입자 침착 부위는 입자 크기에 따라 구분된다. 한 예에서, 약 1 내지 약 500 미크론의 입자가 사용되고, 예컨대, 약 25 내지 약 250 미크론, 또는 약 10 내지 약 25 미크론의 입자가 사용된다. 다른 실시양태에서, 약 1 내지 50 미크론의 입자가 이용된다. 정량식 흡입기에서 사용되는 경우, 폐에 약 10 미크론 미만의 입자를 투여하기 위해, 예컨대, 약 2 내지 약 8 미크론, 예컨대, 약 1 내지 약 5 미크론의 입자, 예컨대, 2 내지 3 미크론의 입자가 사용될 수 있다.
약학 조성물의 제형은 선택된 투여 모드에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 주사가능한 유체 이외에, 국소, 흡입, 경구 및 좌약 제제가 사용될 수 있다. 국소용 제제는 점안제, 연고, 스프레이, 패치 등을 포함할 수 있다. 흡입용 제제는 액체(예컨대, 액제 또는 현탁제)일 수 있고, 미스트, 스프레이 등을 포함할 수 있다. 경구 제제는 액체(예컨대, 시럽, 액제 또는 현탁제) 또는 고체(예컨대, 산제, 환제, 정제 또는 캡슐)일 수 있다. 좌약 제제는 또한 고체, 겔 또는 현탁액 형태일 수 있다. 고체 조성물의 경우, 통상의 비독성 고체 담체는 약학 등급의 만닛톨, 락토스, 셀룰로스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다.
일부 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)의 치료 유효량은 (1) 예를 들어, 폐에서, 또는 알레르기 반응 부위에서 염증을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, (2) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-5를 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, (3) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-13을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, (4) ILC2 및/또는 T 반응, 예를 들어, 존재, 증식 및/또는 활성화된 ILC2 및/또는 T 세포의 개수를 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데, 및/또는 (5) 폐에서, 또는 말초 혈액 중에서 호산구증가증을 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소시키는 데 필요한, Nmb 또는 Nmc 단백질, 또는 Nmb 또는 Nmc를 코딩하는 핵산의 양이다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)을 포함하는 약학 조성물은 정확한 투여량을 개별 투여하는 데 적합한 단위 제형으로 제제화될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 단위 투여량은 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 약 1　㎍ 내지 약 1 g, 예컨대, 약 1 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 약 100 mg, 약 50 mg 내지 약 500 mg, 약 50 mg 내지 약 100 mg, 약 100 mg 내지 약 900 mg, 약 250　mg 내지 약 750 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 600 mg을 함유한다. 다른 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 치료 유효량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 예를 들어, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10　mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 1　mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다. 다른 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 치료 유효량은 약 0.1 ug/kg 내지 약 10　ug/kg, 약 0.1 ug/kg 내지 약 1　ug/kg, 예를 들어, 약 0.8 ug/kg이다. 특정 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 치료 유효량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 예컨대, 약 2 mg/kg이다.
다른 적합한 범위는 Nmb 또는 Nmc 단백질 약 100 ㎍/kg(체중) 내지 10 mg/kg(체중) 이상(예컨대, 약 0.1-10 mg/kg, 약 1-20 mg/kg, 약 5-50 mg/kg, 또는 약 10-100 mg/kg)의 용량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유효 투여량은 예를 들어, 5-40 mg/kg, 10-35 mg/kg 또는 20-25 mg/kg인 더 좁은 범위 내에서 선택될 것이다. 다른 예에서, 투여량은 약 1-100 mg, 예컨대, 약 1-10 mg, 약 5-25 mg, 약 10-50 mg, 약 25-60 mg, 또는 약 50-100 mg(예를 들어, 약 1 mg, 5, mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 또는 100 mg)이다. 특정 예에서, 용량은 약 20-60 mg이고, 한 비제한적인 예에서는 약 25 mg이다.
Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 것, 예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)을 포함하는 약학 조성물은 정확한 투여량을 개별 투여하는 데 적합한 단위 제형으로 제제화될 수 있다. 일반적으로, 투여하고자 하는 Nmb 단백질의 핵산 코딩 서열을 보유하는 재조합 바이러스 벡터의 정량은 바이러스 입자의 역가에 기초한다. 한 비제한적인 예에서, 예를 들어, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질)을 코딩하는 핵산, 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)의 투여를 위해 바이러스 벡터, 예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 함유하는 벡터가 사용될 때, 단위 투여량(예컨대, 0.5-1.5 ㎕)은 약 105 내지 약 1010 플라크 형성 단위(pfu: plaque forming unit)/ml/포유동물를 함유한다. 따라서, 일부 예에서, 수용자 대상체는 조성물 중 약 105 내지 약 1010 pfu/ml/포유동물의 재조합 바이러스인 용량으로 투여받는다. 일부 예에서, 수용자 대상체는 적어도 105 pfu/ml/포유동물, 적어도 106 pfu/ml/포유동물, 적어도 107 pfu/ml/포유동물, 적어도 108 pfu/ml/포유동물, 적어도 109 pfu/ml/포유동물, 또는 적어도 1010 pfu/ml/포유동물인 용량으로 투여받는다. 조성물을 포유동물 내로 투여하기 위한 방법의 예로는 조성물의 이환된 조직 내로의(예컨대, 피부 또는 폐 내로의) 주사, 또는 정맥내, 피하, 진피내 또는 근육내 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)을 포함하는 본 개시내용의 조성물은 인간 또는 다른 동물에게, 경구적으로, 정맥내로, 근육내로, 복강내로, 비내로, 진피내로, 뇌실질내로, 뇌실내로, 경막내로(예컨대, 수조 및 요추), 피하로, 흡입을 통해 또는 좌제를 통해 수행되는 것을 비롯한 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 조성물은 주사를 통해 투여된다. 일부 예에서, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 코딩 서열을 피부 조직에 또는 폐 내로(예컨대, 흡입을 통해) 투여함으로써 조성물의 부위 특이적 투여가 사용될 수 있다.
치료는 단일 투여, 또는 다회 투여(예컨대, 적어도 2회 별개 투여), 예컨대, 수일 내지 수개월, 또는 심지어 수년 기간 동안에 걸친 투약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량의 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 단일 용량으로, 또는 치료 진행 과정 동안 예를 들어, 매일, 매주, 개월, 또는 매년 다회 용량으로 투여될 수 있다. 특정의 비제한적인 예에서, 치료는 매월 1회, 매년 1회, 또는 격월로 투여하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 다회 용량이 투여되는 경우, 적어도 2회 별개 투여는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 1년 떨어져 있을 수 있다.
일부 예에서, 투여되는 제1 용량(일부 예에서, 단 1회의 용량)은 장애(예컨대, 2형 사이토카인 염증) 발병 1분 이내, 10분 이내, 15분 이내, 30분 이내, 1시간 이내, 2시간 이내, 3시간 이내, 4시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내, 48시간 이내, 72시간 이내, 96시간 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 또는 3개월 이내, 예컨대, 장애 발병 1 내지 24시간, 2 내지 24시간, 4 내지 24시간, 또는 1 내지 96시간 이내에 이루어진다.
일부 실시양태에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 알레르기 유발인자에의 노출 이전에 예방적으로 투여된다. 예를 들어, 천식 환자는 운동 이전, 또는 환경 유발인자, 예컨대, 오염 또는 알레르겐에의 노출 이전에 Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자로 치료될 수 있다. 예방적 치료는 또한 화학물질 노출 위험이 있는 대상체, 예컨대, 화학적 사고에 대한 최초 반응자를 치료하는 데 유용할 수 있다. Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자는 또한 대상체에서 천식 발작을 유발하는 것으로 알려진 작용제에 반복적으로 노출되는 무증상 개체에게 예방적으로 투여될 수 있다. 한 예에서, 유효량의 Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자가 천식 발작을 유도하는 것으로 알려진 알레르겐에 반복적으로 노출되는 건강한 개체에게 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자는 코르티코스테로이드제(CS) 요법을 필요로 하거나, 이전에 CS요법을 받은 경험이 있는 대상체에게 투여된다. Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자는 천식 발작의 중증도를 감소시키기 위해, 또는 모두 피하기 위해 천식 발작을 유발하는 활동에 참가하기 이전에 천식을 앓는 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자 투여는 천식 발작을 예방한다. 일부 실시양태에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자는 매일 증상으로 고생하는 대상에서 만성적으로 증상을 개선시키기 위해 투여된다.
일부 예에서, 효과는 (1) 예를 들어, 폐에서, 또는 알레르기 반응 부위에서의 염증 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, (2) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-5 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, (3) 예를 들어, ILC2 및/또는 T 세포에서, IL-13 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, (4) ILC2 및/또는 T 반응, 예를 들어, 존재, 증식 및/또는 활성화된 ILC2 및/또는 T 세포의 개수 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소, 및/또는 (5) 폐에서, 또는 말초 혈액 중에서 호산구증가증 감소, 예컨대, 예를 들어, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 핵산 분자의 비투여 대비 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 또는 적어도 90% 감소를 검출 또는 측정함으로써 측정된다.
일부 예에서, 치료의 효과는 폐 기능을 모니터링함으로써 측정된다. 예를 들어, 치료 이전, 그 중 또는 그 이후에 다양한 측정가능한 폐 기능 파라미터를 연구할 수 있다. 폐 기능은 흡기 유속, 호기 유속 및 폐 부피를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 물리적으로 측정가능한 폐 작용 중 하나를 검사하여 모니터링할 수 있다. 상기 파라미터 중 하나 이상의 것의 통계적으로 유의미한 증가는 치료 효능을 나타낸다. 증상 감소, 천식 악화, 구조용 흡입기 사용 또는 염증 척도 또한 효능의 증거이다.
임상 실습에서 가장 일반적으로 사용되는 폐 기능 측정 방법은 특정 파라미터를 측정하는 흡기 및 호기 조작의 시간 측정을 포함한다. 예를 들어, FVC는 환자가 처음에 깊게 들이마신 후, 그로부터 힘있게 내쉬는 총 부피(리터 단위)를 측정한다. 이 파라미터는 FEV1과 함께 평가될 때, 기관지 수축을 정량적으로 평가할 수 있다. FVC 또는 FEV1의 수학 공식에 의해 결정된 통계적으로 유의적인 증가는 기관지 수축의 감소를 반영하며, 이는 요법이 효과적이라는 것을 나타낸다.
폐 기능의 지표로 호기된 공기의 양을 측정하는 것 이외에도, 호기 주기의 다른 부분에 대해 측정된 분당 유량은 환자의 폐 기능 상태를 결정하는 데 유용할 수 있다. 특히, 강제 최대 호기 동안 분당 최고 기류 속도(리터 단위)로 간주되는 최고 호기 기류는 천식 및 다른 호흡기 질환 환자의 전반적인 폐 기능과 밀접한 상관관계를 갖는다. 따라서, TPO 억제제 투여 후 최고 호기 기류의 통계적으로 유의적인 증가는 요법이 효과적이라는 것을 나타낸다.
F. 추가 요법 투여
일부 예에서, Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질) 또는 Nmc 단백질(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질), 또는 Nmb 코딩 서열(예컨대, 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것) 또는 Nmc 코딩 서열(예컨대, 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자)은 하나 이상의 다른 작용제, 예컨대, 표 1에 열거된 염증성 장애 또는 다른 장애의 치료에서 유용한 것과 함께 조합하여(예컨대, 순차적으로, 동시에, 또는 동시적으로) 투여된다. "조합하여 투여" 또는 "공동 투여"라는 용어는 둘 모두 활성제의 동시 및 순차적 투여, 둘 모두를 지칭한다.
일부 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열은 대상체에게 유효량의 코르티코스테로이드제(예컨대, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니손), 항히스타민제, 또는 그 둘 모두와 함께 조합하여 투여된다. 일부 예에서, Nmb 단백질 또는 Nmb 코딩 서열은 대상체에게 유효량의 IL-4 억제제(예컨대, 두필루맙), IL-5 억제제(예컨대, 메폴리주맙, 벤라리주맙, 및 레슬리주맙), IL-13 억제제(예컨대, 트랄로키누맙 및 레브리키주맙), 또는 이들의 조합과 함께 조합하여 투여된다. 또 다른 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열은 대상체에게 유효량의 PGE2와 함께 조합하여 투여된다.
일부 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩은 대상체에게 유효량의, 기도 장애(예컨대, 천식 또는 COPD)와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상을 예방 또는 치료하기 위한 작용제와 함께 조합하여 투여된다. 예를 들어, 하나 이상의 β-효능제(베타-2 효능제 포함)(예컨대, 살부타몰), 하나 이상의 류코트리엔 길항제/형성 억제제(예를 들어, 질류톤인, Abbott Laboratories의 Zyflo®, 몬테루카스트인 Merck and Company의 Singulair® 및 기타), IgE를 차단하는 항체, 거담제, 또는 이들의 조합 또한 투여될 수 있다.
일부 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열은 염증성 장애, 예컨대, 알레르기 또는 알레르기 반응, 부비강염, 천식(경증, 중등도 또는 중증, 호산구성 천식 포함), COPD, 특발성 폐 섬유증(IPF), 비염, EGPA, 호산구성 식도염, 습진, 두드러기, 만성 가려움증, 혈관부종, 결막염 또는 아토피성 피부염을 앓는 대상체에게 유효 용량의 하나 이상의 다른 치료제와 함께 조합하여 투여된다. 예를 들어, 대상체가 알레르기 반응(예를 들어, 계절성 알레르기 또는 먼지/곰팡이, 식품(예컨대, 갑각류, 달걀, 우유, 견과류, 밀), 동물(예컨대, 비듬), 식물, 약물(예컨대, 항생제, 술파 또는 페니실린, 아스피린, NSAID, 항경련제, 화학요법 약물), 곤충(예컨대, 바퀴벌레 뿐만 아니라, 꿀벌, 말벌(hornet), 말벌(wasp), 옐로우 자켓 말벌, 불개미로부터의 독), 병원체(예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충) 또는 화학물질(예컨대, 라텍스)에 대한 알레르기 반응)을 보인다면, 본 방법은 치료 유효량의, 충혈제거제, 항히스타민제, 코르티코스테로이드제, 면역요법 및 에피네프린 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 부비강염을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 항생제(예컨대, 아목시실린) 및/또는 코르티코스테로이드제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 천식(경증, 중등도 또는 중증, 호산구성 천식 포함)을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의, 코르티코스테로이드제, 글루코코르티코이드, 기관지확장제(예컨대, 단기(예컨대, 살부타몰) 또는 장기 작용(예컨대, 포르모테롤) 베타-2 아드레날린 효능제, 항콜린제(예컨대, 티오트로피움 및 이프라트로피움 브로마이드), 장기 작용 베타 효능제(LABA) 류코트리엔 조절제, IL-4 억제제(예컨대, 두필루맙), 메폴리주맙, 벤라리주맙, 레슬리주맙, 트랄로키누맙, 및 레브리키주맙 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 COPD를 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 코르티코스테로이드제, 기관지확장제(예컨대, 단기(예컨대, 살부타몰) 또는 장기 작용(예컨대, 포르모테롤) 베타-2 아드레날린 효능제, 항콜린제(예컨대, 티오트로피움 및 이프라트로피움 브로마이드), 항생제(예컨대, 에르티로마이신) 및 산소 보충 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 특발성 폐 섬유증(IPF)을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 피르페니돈 및/또는 안지오키나제 억제제(예컨대, 닌테다닙)를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 비염을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 항히스타민제 비강용 스프레이, 코르티코스테로이드제 비강용 스프레이, 항콜린성 비강용 스프레이(예컨대, 이프라트로피움), 및 충혈제거제(예컨대, 슈도에페드린 또는 페닐에프린) 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 EGPA를 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 메폴리주맙, 글루코코르티코이드(예컨대, 프레드니솔론), 면역억제제(예컨대, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드) 및 메토트렉세이트 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 호산구성 식도염을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 국소용 코르티코스테로이드제(예컨대, 부데소니드, 플루티카손) 및/또는 양성자 펌프 억제제(예컨대, 오메프라졸, 란소프라졸, 덱스란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 라베프라졸, 일라프라졸)를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 습진을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 코르티코스테로이드제(예컨대, 하이드로코르티손, 클로베타솔 프로피오네이트) 및/또는 면역억제제(예컨대, 피메크로리무스, 타크로리무스)를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 두드러기를 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의, 항히스타민제(예컨대, 디펜히드라민, 하이드록시진, 로라타딘, 세티리진, 데슬로라타딘), 류코트리엔 길항제(예컨대, 몬테루카스트 및 자피를루카스트), 경구용 글루코코르티코이드, 항염증제, 오말리주맙, 및 면역억제제 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 만성 가려움증을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의, 코르티코스테로이드제(예컨대, 코르티손 및 프레드니손), 칼시뉴린 억제제(예컨대, 피메크로리무스 및 투크로리무스) 및 항우울제(예컨대, 프로작 및 졸로푸트) 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 혈관부종을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의 항히스타민제(예컨대, 세티리진) 및/또는 안드로겐을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 결막염을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의, 항히스타민제(예컨대, 디펜히드라민), 비만 세포 안정화제(예컨대, 크로몰린), 또는 항생제 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 아토피성 피부염을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의, 트랄로키누맙, 국소용 코르티코스테로이드제(예컨대, 하이드로코르티손), 국소용 칼시뉴린 억제제(예컨대, 타크로리미스 또는 피메크로리무스), 및 전신 면역억제제(예컨대, 사이클로스포인, 메토트렉세이트, 인터페론 감마-1b) 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 호산구성 장애(예컨대, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 장염, 호산구성 결장염, 호산구성 천식, 호산구성 위장 장애(EGID), 호산구성 근막염, EGPA, 호산구성 폐 장애, 과호산구증가 증후군(HES))을 앓는다면, 본 방법은 치료 유효량의, 국소 또는 전신 스테로이드제(예컨대, 코르티코스테로이드제, 글루코코르티코이드, 예컨대, 프레드니손), 아미노산 기반 식이, 및 면역억제제(예컨대, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드) 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열은 기생충 또는 진균 감염을 앓는 대상체에게 투여되고, 본 방법은 치료 유효량의, 항진균제(예컨대, 폴리엔(예컨대 암포테리신 B, 니스타틴, 나타마이신), 아졸(예컨대, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸), 알릴아민(예컨대, 테르비나핀), 및 에키노칸딘(예컨대 카스포펀진) 및/또는 항기생충제(예컨대, 구충제, 항원충제, 항아메바제)를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열은 호산구성 백혈병(만성, 급성, 또는 클론성)을 앓는 대상체에게 투여되고, 본 방법은 치료 유효량의, 화학요법(예컨대, 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 디하이드로클로라이드, 인터류킨 2), 글리벡, 티로신 키나제 억제제(예컨대, 소라페닙, 미도스타루인, 포나티닙), 및 조혈 줄기 세포 이식 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, Nmb 또는 Nmc 단백질 또는 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열은 호지킨 림프종을 앓는 대상체에게 투여되고, 본 방법은 치료 유효량의, 레브리키주맙, MOPP, 방사선 요법, ABVD(아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카르바진), 스탠포드 V(아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 클로르메틴, 에토포시드, 프레드니손), 및 BEACOPP(독소루비신, 블레오마이신, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 프로카르바진, 에토포시드, 프레드니손) 중 하나 이상의 것을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 조성물
개시된 방법과 함께 사용될 수 있는 조성물 또한 제공한다. 한 예에서, 조성물은 서열번호 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리된 Nmb 단백질, 또는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리된 Nmc 단백질, 및 리포솜을 포함하고, 여기서, Nmb 또는 Nmc 단백질은 리포솜에 캡슐화되어 있다. 한 예에서, 조성물은 (1) 서열번호 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 Nmb 단백질, 또는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 Nmc 단백질, 및 (2) 세포 투과성 펩티드로 구성된 Nmb 융합 단백질(또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자)을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 (서열번호 1이 아닌) 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 비천연 Nmb 단백질, 약학적으로 허용되는 담체, 및 임의로, 리포솜을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 적어도 하나의 비천연 Nmb 단백질, 예컨대, 서열번호 1이 아닌, 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것; 및/또는 서열번호 1이 아닌, 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 (1) 천연 Nmb 단백질(예컨대, 서열번호 1) 및 (2) 비천연 Nmb 단백질, 예컨대, (서열번호 1이 아닌), 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것을 포함한다. 한 예에서, 조성물은 (1) 서열번호 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 및 19 중 하나 이상의 것, 및 (2) 서열번호 3, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 및 23 중 하나 이상의 것을 포함한다(여기서, 조성물은 천연 Nmb 단백질, 예컨대, 서열번호 1을 추가로 포함할 수 있다).
한 예에서, 조성물은 (예컨대, 서열번호 1이 아닌) 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리된 비천연 Nmb 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체(예컨대, 물 또는 염수)를 포함한다. 일부 예에서, 비천연 Nmb 단백질은 리포솜에 캡슐화된다. 일부 예에서, 비천연 Nmb 단백질은 (1) 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 비천연 Nmb 단백질 및 (2) 세포 투과성 펩티드로 구성된 융합 단백질(또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자)의 일부이다. 일부 예에서, 조성물은 비천연 Nmb 단백질 대신 비천연 Nmb 코딩 서열을 포함한다. 다른 예에서, Nmc 단백질은 (1) 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 Nmc 단백질 및 (2) 세포 투과성 펩티드로 구성된 융합 단백질(또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자)의 일부이다. 상기 조성물은 다른 물질, 예컨대, 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 물 또는 염수을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 조성물은 Nmb 또는 Nmc 단백질 대신 Nmb 또는 Nmc 코딩 서열을 포함한다.
사용될 수 있는 예시적인 세포 투과성 펩티드는 친유성 펩티드(예컨대, TAT[YGRKKRRQRRR; 서열번호 57], SynB1[RGGRLSYSRRRFSTSTGR; 서열번호 39], SynB3[RRLSYSRRRF; 서열번호 40], PTD-4[PIRRRKKLRRLK; 서열번호 41], PTD-5[RRQRRTSKLMKR; 서열번호 42], FHV Coat-(35-49)[RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 43], BMV Gag-(7-25)[KMTRAQRRAAARRNRWTAR; 서열번호 44], HTLV-II Rex-(4-16)[TRRQRTRRARRNR; 서열번호 45], D-Tat[GRKKRRQRRRPPQ; 서열번호 46], R9-Tat GRRRRRRRRRPPQ[서열번호 47] 및 페네트라틴[RQIKWFQNRRMKWKK; 서열번호 48]), 양친매성 펩티드(예컨대, MAP[KLALKLALKLALALKLA; 서열번호 49], SBP[MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; 서열번호 50], FBP[GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열번호 51], MPG ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 52], MPG(ΔNLS)[ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; 서열번호 NI: 53], Pep-2[ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 54], 및 트랜스포르탄[GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; 서열번호 NI: 55]), 주기적 서열(예컨대, pVec, 폴리아르기닌 RxN(4<N<17) 키메라, 폴리리신 KxN(4<N<17) 키메라, (RAca)6R, (RAbu)6R, (RG)6R, (RM)6R, (RT)6R, (RS)6R, R10, (RA)6R, R7, 및 pep-1[ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 56]), Cr10(사이클릭 pol-아르기닌 CPP), TAT48 -57, TAT47 -57, 또는 TAT49 -57; 페네트라틴; Pep-1; 물질 P, SP; 폴리아르기닌, 예컨대, R5-R12; pVEC; 트랜스포르탄; MAP; 디아토스 펩티드 벡터 1047, DPV1047, 벡토셀®; MPG; ADP 리보실화 인자, ARF, 예컨대, ARF1 -22; BPrPr(예컨대, BPrPr1 -28); p28; VT5; Bac 7, 예컨대, Bac1 -24; C105Y; PFVYLI(서열번호 58); 및 Pep-7을 포함한다.
일부 예에서, 조성물은 액체이다. 일부 예에서, 조성물은 냉동 건조 또는 동결건조된 것이다.
상기 약학 조성물은 추가로 투여 모드 및 제형에 의존하여 하나 이상의 희석제, 충전제, 결합제, 및 다른 부형제를 포함할 수 있다. 치료적으로 불활성인 무기 또는 유기 담체의 예로는 락토스, 옥수수 전분 또는 그의 유도체, 탈크, 식물성 오일, 왁스, 지방, 폴리올, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 물, 사카로스, 알콜, 글리세린 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 각종 보존제, 유화제, 분산제, 향미제, 습윤화제, 항산화제, 감미제, 착색제, 안정화제, 염, 완충제 등 또한 첨가될 수 있다.
일부 예에서, 조성물은 추가로 하나 이상의 담체, 보조 물질, 또는 안정화제, 예컨대, 완충제(예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 트리스 또는 아세트산나트륨 및 다른 유기산); 항산화제, 예컨대, 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드(대략 10개 미만의 잔기), 단백질 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친유성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 류신 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 만노스, 락토스, 시트레이트, 트레할로스, 말토덱스트린 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당 알콜, 예컨대, 만닛톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예컨대, 나트륨, 및/또는 비이온성 계면활성 물질, 예컨대, 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)을 포함한다.
일부 예에서, 조성물은 네블라이저, 정량식 흡입기(MDI) 또는 건조 분말 흡입기(DPI)에 포함된다. 분말 흡입기 장치로부터 분배하기 위한 제제는 Nmb 펩티드 또는 핵산 분자를 함유하는 미분 건조 분말을 포함할 수 있고, 장치로부터 분말의 분산을 촉진시키는 양으로, 예를 들어, 제제의 50 내지 90중량%로 벌크화제, 벌크화제, 예컨대, 락토스, 소르비톨, 수크로스, 또는 만닛톨을 포함할 수 있다. 화합물은 원위부 폐로의 전달을 위해 평균 입자 크기가 10 μM 미만, 예컨대, 0.5 내지 5 μM인 미립자 형태로 제조될 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2007/0065367호).
본 개시내용은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
실시예 1
물질 및 방법
본 실시예는 하기 실시예에서 사용되는 물질 및 방법을 제공한다.
마우스
8-10주령된 C57BL(6) 야생형(WT: wild-type), Mcpt8tm1(cre)Lksy, ROSA26iDTR, 및 Rag2KO 마우스는 더 잭슨 라보라토리(The Jackson Laboratory)로부터 구입하였다. 호염기구 고갈 마우스는 앞서 기술된 바와 같이 Mcpt8tm1(cre)Lksy 마우스를 ROSA26iDTR 마우스와 교배하여 얻었다(문헌 [Sullivan et al., Nat Immunol. 2011 Jun;12(6):527-35, 2011]). 모든 마우스는 특정 병원체가 없는 시설에서 유지시켰다.
N. 브라실리엔시스 (N. brasiliensis ) 감염 및 물질 투여
N. 브라실리엔시스 유충의 유지, 회수, 감염, 및 단리 방법은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다(문헌 [Camberis et al., 2003, Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current protocols in immunology/edited by John E. Coligan ... [ et al.] Chapter 19:Unit 19.12.]). 마우스를 피하 주사에 의해 ~500 N. 브라실리엔시스 유충으로 감염시켰다. 호염기구 고갈을 위해, WT 및 호염기구 고갈 마우스를 격일로 0.375 ㎍의 디프테리아 독소를 이용하여 i.p.로 처리하고; 마우스를 N. 브라실리엔시스 감염 후 3-7일째에 희생시켰다. 뉴로메딘 B 처리를 위해, 마우스를 마취시키고, 기관내 점적주입을 통해 투여하여 50 ㎕의 PBS 중에 용해된 10 ㎍의 뉴로메딘 B(MP Biomedicals)로 처리하였다. 항체 매개 호염기구 고갈을 위해, Rag2 결핍 마우스를 N. 브라실리엔시스 감염 후 1, 3 및 5일째에 20 ㎍의 항FceR1 알파 항체(클론 MAR-1, eBioscience) 또는 항CD200R3 항체(클론 Ba103, hycult biotech)를 이용하여 i.p.로 처리하였다.
입양 전달
8일 동안 매 3일마다 200 ㎕의 PBS 중 재조합 IL-3(1 ㎍) 및 α-IL-3 항체(0.5 ㎍)(BioLegend: 클론 MP2-8F8)의 조합을 WT 마우스에 주사(i.p.)하였다. 부검시, 비장의 단일 세포 현탁액을 제조하고, 호염기구 집단을 분류 정제하였다. 15,000개의 호염기구를 50 ㎕의 PBS 중에 재현탁시키고, 감염 후 3, 4, 5 및 6일째 기관내 점적주입을 통해 각 마우스로 전달하였다.
혈관내 생체내 염색
혈관내 생체내 염색 프로토콜을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다(문헌 [Laidlaw et al., Immunity 41:633-645, 2014]). 간략하면, 마우스를 안락사시키기 5분 전에 300 ㎕의 PBS 중에 희석된, 3 ㎍의 형광 표지된 항체 표적화 CD200R(클론 OX110, eBioscience)을 주사하였다.
폐 및 기관지 폐포 세척액( BAL ) 세포 현탁액
부검 후 BAL 수집을 위해, 5 mL의 PBS를 주사하고, 각 마우스의 기관으로부터 흡인하고, 수집 후, 수집된 BAL 부피를 기록하였다. BAL 수집 후, 부검시 폐를 수집하고, 유세포 측정 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 앞서 기술된 바와 같이 제조하였다(문헌 [Jungblut et al., J Vis Exp 29:1266, 2009]). 간략하면, 폐 조직를 민싱(minced)하고, 2.5%의 FBS, 콜라게나제 D(2 mg/mL, Roche) 및 DNAse I(80 U/mL, Roche)를 함유하는 HBSS 중 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 100 μM 필터를 통해 여과하고, 유세포 측정법에 의해 분석하였다. 추가로, 실시간 PCR 및 조직학적 분석을 위해 폐 조직 절편을 수집하였다.
유세포 측정법 및 세포 분류
세포를 e바이오사이언스(eBioscience) 또는 BD 바이오사이언시스즈(BD Biosciences)로부터 입수한 모노클로날 항마우스 형광 접합된 항체: B220(RA3-6B2), c-Kit(ACK2), CD3(145-2C11), CD4(GK1.5), CD5(53-73), CD19(1D3), NK1.1(PK136), CD11b(MI/70), CD11c(N418), IgE(23G3), FcεRI(MAR-1), CD49b(DX5), CD45(30-F11), CD90(5E10), CD127(A7R34), F4/80(BM8), γδTCR(eBioGL3), Siglec-F(E50-2440), Ly6G(1A8), Ly6C(AL-21), IL-5(TRFK5), IL-13(eBio13A), Ter-119(TER-119)로 염색하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 제조사의 설명서에 따라 BD 골지플러그(BD GolgiPlug)™(BD Biosciences)를 이용하여 류코사이트 액티베이션 칵테일(Leukocyte Activation Cocktail)과 함께 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 호염기구는 CD45+CD3-CD19-FceR1+CD49b+로서 분석하였다. 호산구는 CD45+CD11b+Siglec-F+CD11c-로서 분석하였다. 호중구는 생 CD45+ CD11b+Ly6G+로서 분석하였다. ILC2는 CD45+CD3-CD19-CD11b-CD11c-NK1.1-B220-CD5-Ter-119- γδ TCR-CD90+CD127+IL-5+IL-13+로서 분석하였다. 샘플을 BD 포테사(BD Fortessa) 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 획득하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(v10.0.5, Tree Star)를 이용하여 분석하였다. FACSAriaII(BD Bioscience)를 이용하여 세포 분류를 수행하였다.
ILC2 시험관내 배양
N. 브라실리엔시스 감염 후 7일째 WT 또는 호염기구 고갈 마우스의 폐로부터 폐 세포를 단리시켰다. ILC 집단(CD45+Lin-CD90+CD127+)을 분류 정제하고, 10,000개의 세포를 100 ng/mL의 IL-2, IL-7 및 비히클(PBS) 또는 10 ㎍/mL의 뉴로메딘 B의 존재하에 24시간 동안 배양하였다. IL-5 및 IL-13은 ELISA에 의해 무세포 상청액 중에서 정량화하였다.
RNA 단리 및 정량적 실시간 PCR 분석
TRIzol(Invitrogen) 중 균질화, 이어서, 페놀-클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전에 의해 폐 조직 절편으로부터 RNA를 단리시켰다. 슈퍼스크립트(Superscript) 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 cDNA를 생성하고, 실시간 PCR을 위한 입력값으로 사용하였다. 내인성 하우스키핑 유전자로서 작용하는 β-액틴과 함께 SYBR 그린(SYBR Green) 화학법(Applied Biosystems)을 이용하여 ΔΔCT 방법으로 실시간 데이터를 분석하였다. 모든 반응은 ABI 7500 패스트 리얼-타임 PCR 시스템(ABI 7500 Fast Real-Time PCR System)(Applied Biosystems) 상에서 실행되었다. 샘플을 나이브 대조군에 대해 정규화하였다. 하기의, 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 콴티테크(QuantiTech) 프라이머를 사용하였다: Mcpt1(QT00157864), IL-4(QT00160678), IL-5(QT00099715), IL-13(QT00099554), Mcpt8 (QT00131565), Nmb(QT00105945), Nmbr1(QT00312494), Muc5ac(QT01161104).
펄스 산소측정법.
제조사의 설명서에 따라 마우스 옥스 플러스(MouseOx Plus)®(Starr Lifesciences Corp)를 이용하여 산소 포화를 평가하였다. 간략하면, N. 브라실리엔시스 감염 1일 전 대퇴부 주변의 털을 제거하고, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 대략 5분의 간격으로 대퇴부 센서를 이용하여 산소 포화를 모니터링하였다.
통계
결과는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시되어 있다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 6에서 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다.
실시예 2
호염기구는 기생충 유도성 염증을 조절한다.
호염기구의 존재 및 부재하에서 Nb에 의해 유도된 2형 사이토카인 매개 염증의 파라미터를 조사하였다.
호염기구의 계통 특이적 고갈(11)은 위장관내 염증 또는 기생충 배출을 변경시키지 않았지만(도 1a), 호염기구 고갈은 폐에서 2형 사이토카인 반응을 유의적으로 증가시켰다(도 1b). 혈액 대 조직 상주 세포를 구별하는 데 사용된 생체내 염색 프로토콜 결과(12), 조직 상주 호염기구 집단이 폐에서 3일째를 시작으로, 감염 후 5일째 채취 시점에 관찰될 수 있는 것으로 나타났다(도 1c,1d).
2형 사이토카인 반응과 관련하여 활성화된 효과기 세포는 기생충 소거를 촉진시키는 것으로 보고되고, 이는 또한 기생충으로 이환된 조직의 무결성을 촉진시킨다(2). Nb 유충은 대다수의 호염기구가 도착하기 전에 감염 후 3일째 폐 조직을 빠져나오기 때문에, 호염기구는 기생충 부하량을 제한하는 역할을 하기보다는 폐 기능을 회복시키고자 하는 회복시키고자 하는 시도로 염증을 조절할 수 있다. 이러한 가설을 뒷받침하면서, 호염기구가 고갈된 Nb 감염된 마우스는 점액 생산(도 2a) 및 염증 세포 침윤물(도 1e, 2b)의 증가를 특징으로 하는 폐 병리 변경을 나타내었고, 대조군 마우스과 비교하여 유의적으로 감소된 산소 수준을 보였다(도 1f). 종합하면, 이들 데이터는 호염기구 집단이 감염 유도성 2형 사이토카인 반응을 음성적으로 조절하고, 감염 후 폐 기능을 유지시키는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다.
실시예 3
호염기구는 ILC2 반응을 음성적으로 조절한다.
실시예 2에서 관찰된 폐 병리의 현미경 분석 결과, 호염기구 고갈 마우스는 상승된 감염 유도성 호산구 반응을 보인 것으로 나타났다.
기관지 폐포 세척액(BAL) 체액 및 폐 침윤물의 유세포 측정 분석 결과, 감염 유도성 호중구증가증은 유의적으로 변경되지 않았지만(도 3a, 4a), 호염기구 고갈 마우스는 유의적으로 증가된 BAL 및 폐 호산구 반응을 보였다(도 3b, 4b). Nb 유도성 호산구 반응 및 점액 생산은 2형 선천 림프구양 세포(ILCS2) 및/또는 CD4+ T cells (1-3)에 의해 생산되는 IL-5 및 IL-13에 의존한다. ILC2 반응이 중요할 때에는 선천 윈도우 동안 감염 후 처음 몇일 이내에(3-5일째) 폐 호염기구 반응이 일어난다(13, 14). 추가로, ILC2와 소통하고, ILC2의 활성화 상태를 변경시킬 수 있는 호염기구의 능력이 입증되었다(2).
그러므로, 호염기구 고갈이 점액 생산 증가 및 호산구증가증과 상관관계를 가진 상승된 감염 유도성 ILC2 반응을 보였는지 여부를 측정하였다(14). 흥미롭게도, ILC2 집단은 대조군과 비교하여 호염기구 고갈 마우스의 BAL 및 폐 조직, 둘 모두에서 증가된다(도 3c, 4c). 추가로, IL-5 및 IL-13 생산 ILC2의 증가 또한 감염 후 호염기구 고갈 마우스의 BAL 및 폐 조직에서 검출되었다(도 3d, 3e, 4d). 오프-타겟(off-target) 고갈 효과의 가능성을 배제시키기 위해, 기능 획득 접근법을 사용하였다. 디프테리아 독소 수용체(DTR: diphtheria toxin receptor) 음성 호염기구를 호염기구 고갈 마우스 내로 도입하였다. DTR 음성 호염기구 및 호염기구 고갈 마우스의 기관내 전달은 BAL 및 폐, 둘 모두에서 ILC2 반응 및 호산구증가증을 다시 WT 수준으로 억제시키는 데 충분하였다(도 3f-3h, 4e-4g). 종합해면, 이러한 기능 상실 및 획득 접근법은 호염기구가 Nb 감염 후 폐 ILC2 반응을 음성적으로 조절한다는 것을 나타낸다.
실시예 4
호염기구는 ILC2 상에서의 Nmbr의 발현을 촉진시킨다 .
호염기구 고갈의 효과는 적응 림프구와는 독립적으로 발생하였다는 것을 확인하기 위해, 재조합 활성화 유전자(Rag2: recombination-activation gene) 결핍 마우스를 호염기구-고갈 항체 Ba103으로 처리하였다. Ba103으로 처리된 Rag2-/- 마우스는 대조군 마우스와 빅하여 유의적으로 상승된 Nb 유도성 ILC2 반응(도 5a) 및 상승된 호산구증가증(도 5b)을 보였다. 종합해 보면, 기능 상실 및 획득 접근법, 둘 모두 호염기구가 Nb 감염 후 폐 ILC2 반응을 음성적으로 조절한다는 것을 나타낸다.
어느 호염기구를 통해 기전이 ILC2를 조절하는지 확인하기 위해, 감염 후 폐 ILC2에서 게놈 와이드 전사 프로파일링을 수행하였다. 호염기구 고갈 마우스로부터 분류 정제된 ILC2와 비교하여 대조군 동물로부터의 ILC2는 감각 변환, 7회 통과 막횡단 도메인 수용체(7TM: seven-pass-transmembrane domain receptor), G-단백질 커플링된 수용체 신호전달 및 로돕신 유사 신호전달과 연관된 경로에 대해 농축되어 있었다(도 5c).
특히, 이들 경로와 연관된 구동 유전자 중 하나는 뉴로메딘 B 수용체(Nmbr)였다(도 5d). 뉴로메딘 B(Nmb)는 뉴로메딘 A, B, C, K, L, N, S 및 U를 비롯한, 펩티드 뉴로메딘 패밀리의 일부이다(15, 16). 뉴로메딘 B는 포유동물의 중추 신경계, 폐, 위장관 및 지방 조직에서 발현되는 봄베신 유사 펩티드이다(15, 17). 이전 연구는 Nmb 및 그의 수용체는 점막하에서 발견되는 뉴런으로 국재화된다고 제안한다(18). Nmb는 그의 수용체에의 결합시, 세포 성장, 체온, 혈압 및 글루코스 수준을 조절하는 것으로 보고되어 있지만, 면역 및 염증을 조절할 수 있는 그의 능력에 대해서는 여전히 정의되어야 하는 상태 그대로이다(15).
호염기구가 Nb 감염 후 폐에서 Nmb 신호전달 경로를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, (Mcpt8 발현 감소로 확인되는) 호염기구의 존재 또는 부재하에서 Nmb 및 그의 수용체 발현을 조사하였다(도 5e). Nb 감염 후 Nmb 발현 변화는 검출되지 않았지만(도 5f); Nmb은 감염된 동물에서 유의적으로 더 높은 수준으로 발현되었다. 추가로, 호염기구 고갈은 폐에서 Nmbr 발현을 유의적으로 감소시키는 결과를 초래하였다(도 5g). RNAseq 분석과 일관되게, Nmbr 발현은 또한 대조군과의 비교시 호염기구 결핍 마우스로부터 분류 정제된 ILC2에서 유의적으로 감소되었다(도 5h).
실시예 5
Nmb는 2형 사이토카인 반응을 억제시킨다 .
Nmb가 2형 사이토카인 반응의 음성 조절인자로서 작용하는지 여부를 확인하기 위해, 마우스를 니포스트롱길러스로 감염시키고, 재조합 천연 Nmb(서열번호 1)로 처리하였다. 감염 후 7일째, 2형 사이토카인 의존성 염증의 파라미터를 평가하였다.
놀랍게도, Nmb 처리는 감염 유도성 호중구증가증에는 어떤 효과도 미치지 않았고, Nmb 처리된 마우스는 감소된 ILC2 반응(도 6a), IL-5 및 IL-13 발현(도 6b), 호산구증가증(도 6c)을 보였고, 대조군 마우스만큼 효율적으로 기생충을 소거하는 데에는 실패하였다(도 6d). 이들 데이터는 Nmb가 2형 사이토카인 매개 면역의 음성 조절인자로서 작용한다는 것을 나타낸다.
Nmb가 폐에서 Nb 활성화된 ILC2를 직접 억제시킬 수 있는지 여부, 및 호염기구가 상기 프로세스를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, Nb 감염된 대조군 및 호염기구 고갈 마우스로부터의 폐 ILC2를 분류 정제하고, Nmb의 존재 또는 부재하에서 밤새도록 배양하였다. 특히, Nmb 처리는 호염기구 결핍 마우스가 아닌, 호염기구는 충분하지만 마우스로부터 단리된 ILC2에 의한 IL-5 및 IL-13 생산을 유의적으로 감소시켰다(도 6e).
실시예 6
Nmb 처리는 알레르기성 기도 염증을 억제시키는 데 충분하다
ILC2 반응은 알레르기성 염증과 연관된 2형 사이토카인 생산, 호산구증가증, 점액 생산의 주된 원인인자이다(14). 추가로, 활성화된 ILC2는 알레르기성 염증의 중요한 조절인자인 활성화 TH2 세포에서 중요한 역할을 한다(13, 14). 그러므로, ILC2는 다중 형태의 알레르기성 질환을 처리하는 것으로 표적화될 수 있는 유의적인 치료 잠재능을 가진 세포 집단을 나타낸다. 상기 제시된 데이터는 Nmb가 기생충 감염과 관련하여 ILC2 반응을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. Nmb가 알레르기성 염증을 치료하는 데 사용될 수 있는지를 입증하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.
ILC2에 의존하는 것으로 공지된 파파인 유도성 알레르기성 기도 염증에 대해 잘 확립된 모델을 사용하였다(19, 20). 파파인으로 처리된 마우스는 상승된 비율로 ILC2(도 7a), ILC2에 의한 IL-5 및 IL-13의 상승된 발현(도 7b) 및 폐 호산구증가증(도 7c)을 보였다. 중요하게는, Nmb의 생체내 투여가 파파인 유도성 ILC2 반응 및 호산구증가증를 감소시키는 데 충분하였고(도 7a-7c), 이는 Nmb가 치료상 알레르기성 염증을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, Nmb는 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 ILC2 반응을 음성적으로 조절한다.
ILC2는 그의 적응 TH2 카운터파트와 공통되는 다수의 특징을 공유하고, 따라서, Nmb는 또한 TH2 세포를 억제시킬 수 있는 능력을 가질 수도 있다(13, 14). Nb 후 평가된 시점에서, 대다수의 2형 사이토카인은 ILC2 유래이고(14), Nmb가 TH2 세포 반응에 미치는 임의의 효과는 검출하기 어려울 수 있다. 이를 처리하기 위해, 폐 배출 LN을 Nb 후 7일째 단리시키고, 재조합 Nmb의 존재 및 부재 둘 모두에서 항CD3 및 항CD28로 자극시켜 T 세포를 활성화시켰다. 항CD3 및 항CD28로 처리된 LN 세포는 IL-5, 및 IL-13의 양을 증가시켰다(도 7d, 7e). Nmb로 처리된 배양물은 유의적으로 감소된 수준의 IL-5 및 13을 나타내었다(도 7d, 7e). 이들 데이터는 Nmb가 또한 활성화된 TH2 세포로부터의 사이토카인 생산을 억제시킨다는 것을 입증한다.
실시예 7
Nmb 단백질 변이체
상기 결과는 Nmb가 ILC2 및 TH2 세포 반응, 둘 모두의 음성 조절인자로서 작용하고, 예를 들어, 기생충 감염 및 또는 알레르기성 기도 염증을 앓는 대상체에서 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 데 충분하다는 것을 입증한다. 따라서, Nmb는 2형 사이토카인 매개 염증을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 천연 Nmb는 Nmb 수용체에 결합할 수 있는 그의 능력을 통해 작용하는 10-mer 펩티드(서열번호 1)이다(15). 본 실시예는 Nmb의 다양한 잔기를 알라닌으로 체계적으로 치환시키는 알라닌 스캔의 결과(표 2) 및 TH2 세포에 의한 2형 사이토카인 생산을 억제시킬 수 있는 변이체 Nmb 펩티드의 생성된 능력을 기술한다. 추가로, 캡을 천연 형태의 Nmb(서열번호 1)에 부가하였고, 그의 생체활성을 모니터링하였다(도 5a).
Figure pct00001
펩티드 C, F 및 K(각각 서열번호 5, 8 및 13)는 천연 형태의 Nmb(서열번호 1)와 비교하여 IL-5 생산을 억제시키는 능력에 있어 유의적인 감소를 보였고, Nmb 변이체 펩티드 중 어느 것도 IL-5 생산을 억제시키는 능력에서 어떤 유의적인 증강도 보이지 않았다(도 7f). 그에 반해, 펩티드 F 및 H(각각 서열번호 8 및 10)는 IL-13 생산을 억제시키는 능력에 있어 유의적인 감소를 보였고, 펩티드 A, B, C, D, I, J, K 및 L(각각 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 및 14)은 천연 Nmb와 비교하여 IL-13을 억제시키는 능력이 유의적으로 더 컸다(도 7g).
TH2 세포로부터의 2형 사이토카인 생산을 조절할 수 있는 말단절단된 버전의 Nmb(표 2, 서열번호 16-25)의 능력을 조사하였다. 천연 Nmb는 TH2 세포로부터의 IL-5 생산을 유의적으로 감소시키는 데 충분하였지만, 말단절단된 펩티드 N, O, P, R, U, V 및 W(각각 서열번호 16, 17, 18, 20, 23, 24 및 25)는 IL-5 생산을 억제시킬 수 있는 능력에 있어 감소를 보였다(도 7h). 흥미롭게도, 말단절단된 펩티드 V(서열번호 24)는 IL-13을 억제시킬 수 있는 능력에 있어 감소를 보였고, 펩티드 R 및 T(각각 서열번호 20 및 22)는 TH2 세포로부터의 IL-13을 억제시킬 수 있는 능력이 증강된 것으로 나타났다(도 7i).
TH2 세포로부터의 2형 사이토카인 생산을 조절할 수 있는 능력 변경에 대해 오프셋 길이(표 2, 서열번호 26-36)가 미치는 효과를 조사하였다. 앞서 상기 제시된 바와 같이, 천연 Nmb는 TH2 세포로부터의 IL-5 및 IL-13 생산을 감소시키는 데 충분하였다. 오프셋 펩티드 X(서열번호 26), Y(서열번호 27), AA(서열번호 29), AG(서열번호 35), 및 AH(서열번호 36)는 활성화된 TH2 세포로부터의 IL-5 생산을 억제시킬 수 있는 능력이 유의적으로 증강된 것으로 나타났다(도 8a). 추가로, 펩티드 X(서열번호 26), Y(서열번호 27), Z(서열번호 28), AA(서열번호 29), AB(서열번호 30), AC(서열번호 31), AD(서열번호 32), AG(서열번호 35), AH(서열번호 36) 및 AI(서열번호 37)는 TH2 세포로부터의 IL-13 생산을 감소시킬 수 있는 능력이 증강된 것으로 나타났다(도 8b).
종합해 보면, 본 데이터는 Nmb는 2형 사이토카인 생산을 억제시키기 위해 변형될 수 있고, 이러한 변경된 펩티드는 천연 버전의 Nmb(서열번호 1)보다 2형 염증을 변형시킬 수 있는 치료 잠재능이 더 클 수 있다는 것을 나타낸다.
추가로, 본 데이터는 Nmb 변이체 펩티드의 조합, 예컨대, IL-5를 감소시키는 적어도 하나의 변이체 펩티드와 IL-13을 감소시키는 적어도 하나의 변이체 펩티드의 조합, 예컨대, 하기 표 3에 제시된 펩티드의 조합이 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 추가로, 또한, 본 데이터는 예컨대, (1) IL-5를 감소시키는 적어도 하나의 변이체 펩티드를 갖는 천연 Nmb, (2) IL-13을 감소시키는 적어도 하나의 변이체 펩티드를 갖는 천연 Nmb, 또는 (3) IL-5를 감소시키는 적어도 하나의 변이체 펩티드 및 IL-13을 감소시키는 적어도 하나의 변이체 펩티드를 갖는 천연 Nmb의 조합(예컨대, 하기 표 3에 제시된 펩티드)과 같이, 천연 Nmb(서열번호 1)가 하나 이상의 Nmb 변이체 펩티드와 함께 조합하여 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 한 예로, 본 방법은 IL-5를 감소시키는 능력이 증강된 적어도 하나의 Nmb 변이체 펩티드, 예컨대, 펩티드 X(서열번호 26), Y(서열번호 27), AA(서열번호 29), AG(서열번호 35), 및 AH(서열번호 36) 중 하나 이상의 것을 사용한다. 한 예로, 본 방법은 IL-13을 감소시키는 능력이 증강된 적어도 하나의 Nmb 변이체 펩티드, 예컨대, 펩티드 A, B, C, D, I, J, K, L, R, T, X, Y, Z, AA, AB, AC, AD, AG, AH, 및 AI(각각 서열번호 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 36 및 37) 중 하나 이상의 것을 사용한다.
Figure pct00002
실시예 8
뉴로메딘 C 단백질
일부 예에서, 개시된 방법 및 조성물에서 Nmb 단백질(또는 그의 변이체)을 사용하는 대신(또는 그에 추가로), 뉴로메딘 C 단백질(또는 그의 변이체)이 사용된다. 예시적인 천연 뉴로메딘 C 단백질은 GNHWAVGHLM(서열번호 38)이다. 대안적으로, 뉴로메딘 C를 코딩하는 핵산 분자가 사용된다. 따라서, 서열번호 38과 적어도 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질, 또는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 뉴로메딘 C 단백질을 코딩하는 한 핵산 분자 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 포유동물에 진행된 이전 연구는 Nmb 및 Nmc가 공동 수용체(PMID 1720612)와 상호작용할 수 있다는 것을 제안하였다. 그러므로, Nmc 및 Nmb는 2형 염증을 억제시킬 수 있는 공동 신호전달 경로를 개시할 수 있다.
실시예 9
호염기구가 Nmbr 발현을 조절한다.
호염기구가 Nb 감염 후 고갈되었을 때, 폐 ILC2에 의한 NMBR 발현은 감소되었다. 호염기구가 NMBR의 발현을 직접 매개하는지 여부, 또는 호염기구가 중간 경로를 거쳐 작용하는지 여부를 측정하기 위해, Nb 감염된 마우스의 폐로부터 ILC2를 분류 정제하고(7일째), 생존 사이토카인 IL-2 및 IL-7과 함께 배양하였다. 추가로, ILC2를 활성화된 호염기구, IL-4, 또는 IL-33과 함께 밤새도록 배양하였다. 이어서, 배양 후 NMBR 발현을 유세포 측정 분석에 의해 모니터링하였다. 생성된 데이터는 ILC2 활성화를 촉진시키는 것으로 알려져 있는 사이토카인인 IL-4 또는 IL-33(21, 23, 24)으로 처리된 ILC2는 NMBR 발현 수준에서 어떤 변화도 보이지 않은 반면, 활성화된 호염기구와 함께 배양된 ILC2는 유의적으로 증가된 NMBR 발현을 보였다는 것을 나타낸다(도 9). 종합해 보면, 본 결과는 활성화된 호염기구가 ILC2에 의한 NMBR 발현을 직접 조절하는 데 충분하다는 것을 입증한다.
본 연구는 Nb 유도성 ILC2 반응이 호염기구의 부재하에서는 과장된다는 것을 예시한다. 추가로, 본 데이터는 호염기구 부재하에서의 감소된 NMB-NMBR 신호전달이 고조된 상태의 ILC2 활성화를 초래할 수 있다는 것을 제안한다. 그러나, ILC2 반응은 또한 Nb 챌린지 후 여러 다른 인자에 의해 조절되는 것으로도 알려져 있다. 구체적으로, IL-33은 Nb 감염 후 폐 ILC2 반응의 중요한 조절인자인 것으로 보고되어 있다(24). NMB-NMBR 신호전달 경로의 변경보다는 호염기구 부재하에서의 변경된 ILC2 활성이 IL-33의 이용가능성의 감소의 결과인지 여부에 대해 다루기 위해, Nb 감염된 마우스의 폐로부터 ILC2를 분류 정제하고(7일째), 생존 사이토카인(IL-2, IL-7) 및/또는 IL-33 및 NMB와 함께 배양하였다. 밤새도록 배양한 후, 상청액을 표준 ELISA에 의해 IL-5 및 IL-13의 존재에 대하여 시험하였다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계적 비교를 수행하였다. 본 데이터는 NMB가 활성화된 ILC2로부터의 2형 사이토카인 생산을 억제시킨다는 것을 나타낸다. 특히, NMB는 ILC2로부터의 IL-5 및 IL-13 생산을 정상 상태로 유의적으로 감소시키는 데 충분하였다(도 10a-10b). 추가로, IL-33 처리는 IL-5 및 IL-13의 수준을 증가시키는 반면, NMB 처리는 여전히 2형 사이토카인을 유의적으로 감소시켰다는 것이 본 데이터를 통해 밝혀졌다. 종합해 보면, 본 연구는 NMB는 심지어 과한 양의 IL-33이 존재할 때에도 ILC2의 음성 조절인자로서 작용한다는 것을 입증한다.
개시된 연구는 조혈 세포 상에서의 NMB-NMBR 신호전달이 2형 사이토카인 반응을 적절히 조절하는 데 요구된다는 것을 제안한다. 이러한 가능성을 추가로 평가하기 위해, 신규 NMBR-플록싱된 마우스를 생성하고, Vav1-Cre 발현 마우스와 교배시켰다. Vav1은 모든 조혈 세포에 의해 발현되고(22), 그를 신규 플록싱된 마우스 모델과 교배시킴에 따라 모든 면역 세포 상에서 NMBR의 선택적 결실이 일어났다. 이어서, 상기 마우스를 Nb로 감염시키고, 2형 사이토카인 반응 및 폐 병리를 평가하였다. 나이브 또는 Nb 감염된(7일째) Vav1-Cre, NMBR-플록싱된, 또는 Vav1-Cre-NMBR-플록싱된 마우스의 BAL로부터 단리된 ILC2에서 IL-5(도 11a) 및 IL-13(도 11b)에 대한 세포내 염색을 수행하였다. 스튜던츠 t 검정을 이용하여 통계적 비교를 수행하였다. 본 데이터는 2형 사이토카인 생산을 조절하는 데 조혈 세포 상의 NMBR 매개 신호전달이 요구된다는 것을 나타낸다. 이전 데이터와 일관되게, 면역 세포 상의 NMBR의 유전적 결실은 감염된 동물의 BAL에 대해 단리된 ILC2에 의한 IL-5 및 IL-13 생산을 유의적으로 상승시켰다(도 11a-11b). 폐 병리(H 및 E 염색)를 나이브 또는 Nb 감염된(7일째), Vav1-Cre, NMBR-플록싱된, 또는 Vav1-Cre-NMBR플록싱된 마우스에 대해 평가하였다. NMBR-플록싱된-Vav1-Cre 마우스는 폐에서는 세포 침윤물 증가를 나타내고, 현저히 악화된 폐 병리를 보였다(도 12). 이는 폐에서 세포 침윤물을 조절하는 데(예컨대, 감소시키는 데) 조혈 세포 상의 NMBR 매개 신호전달이 요구된다는 것을 시사한다. 이러한 유전적 접근법을 통해 2형 사이토카인 매개 염증을 적절히 조절하는 데 있어 면역 세포 상에서의 NMB-NMBR 신호전달의 중요성이 추가로 확인된다.
상기 제시된 데이터는 NMB가 림프구에 의한 2형 사이토카인 반응의 중요한 음성 조절인자라는 것을 제안한다. NMB가 림프구 활성화를 어떻게 변경시킬 수 있는지에 관해 추가로 통찰하기 위해, ILC2를 Nb 감염된 마우스의 폐로부터 분류 정제하고, Nmb의 존재 또는 부재하에서 생존 사이토카인(IL-2, IL-7)과 함께 밤새도록 배양하였다. 이어서, RNA 시퀀싱 분석에 의해 유전자 발현을 평가하였다. 구체적으로, 배양 후, 세포를 RNA 시퀀싱을 위해 제출하고, NMB 처리에 의해 유의적으로 상향조절 또는 하향조절된(>1.5배) 유전자를 확인하였다(하기 표 4). 이를 통해 NMB 신호전달 경로를 확인할 수 있었다. 본 결과는 NMB 처리가 다른 것들 중에서도 특히 Sprr2a2, Serpinb2, Il1b, Xist 및 Tsix를 비롯한 수개의 유전자를 상향조절하였다는 것을 나타낸다. 추가로, NMB 처리는 다른 것들 중에서도 특히 Hgs2, Nkg7, Klra7, P2rx7, Ly6c2 및 Mcpt2를 하향조절하였다. 종합해 보면, 본 데이터는 NMB가 표 4에 열거된 유전자에 영향을 줌으로써 작용할 수 있고, 이들 유전자는 상당한 치료적 잠재능을 가질 수 있다는 것을 제안한다.
Figure pct00003
상기에서 고찰된 마우스 모델은 CD45+ 세포 상에서의 NMBR 발현이 2형 사이토카인 매개 염증을 적절히 조절하는 데 요구된다는 것을 입증하였다(도 11a-b, 12). 상기 신호전달 경로가 적절히 조절되어야 하는 것을 요구할 수 있는 세포 유형을 더욱 잘 확인하기 위해, 폐 중 면역 세포 상에서의 NMBR의 발현을 정상 상태에서 및 Nb 후 7일째 평가하였다. 본 데이터는 NMBR이 수개의 면역 세포 집단에 의해 발현된다는 것을 나타낸다. ILC2, CD4+ 및 CD4- 림프구, 폐포 대식세포, 비폐포 대식세포, 호산구 및 호중구가 다양한 수준의 NMBR을 발현하는 것으로 밝혀졌다(도 13). 본 데이터는 NMB가 다양한 세포 표적을 통해 염증을 조절할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 10
프로스타글란딘 E2가 림프구 상에서의 NMBR의 발현을 상향조절한다
호염기구가 림프구 상에서의 NMBR의 발현을 조절하는 기전을 더욱 잘 확인하기 위해, ILC2를 NMB 또는 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 존재 또는 부재하에서 생존 사이토카인 및 활성화 사이토카인의 조합과 함께 배양하였다. IL-25, IL-33, 및 NMB의 조합은 ILC2에 의한 NMBR 발현을 상향조절하는 데 실패하였지만, PGE2 처리는 NMBR의 수준을 유의적으로 상향조절하였다(도 14). 본 데이터는 호염기구(잘 설명되어 있는 프로스타글란딘의 공급원)가 그의 PGE2 방출을 통해 NMBR 발현을 조절할 수 있다는 것을 제안한다.
PGE2가 림프구에 의한 Nmbr의 발현을 촉진시킨다는 것을 제안하는 본 데이터에 비추어, 장애(예컨대, 염증성 장애) 치료 방법의 실시양태는 대상체에게 유효량의, 본원에 개시된 Nmb 펩티드 또는 핵산 및 유효량의 PGE2를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
참고문헌
Figure pct00004
Figure pct00005
본 개시내용의 원리가 적용될 수 있는 다수의 가능한 실시양태에 비추어, 예시된 실시양태는 단지 본 발명의 예일 뿐이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 함을 이해하여야 한다. 오히려, 본 발명의 범주는 하기 청구범위에 의해 정의된다. 본 발명자는 이들 청구범위의 범주 및 정신 범위 내에 포함되어 있는 모두가 본 발명자의 발명임을 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> Rutgers, The State University of New Jersey Siracusa, Mark <120> METHODS OF REDUCDING TYPE 2 CYTOKINE-MEDIATED INFLAMMATION USING NEUROMEDIN PEPTIDES <130> 7213-101257-02 <150> US 62/741,188 <151> 2018-10-04 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Neuromedin B with C-terminal amidation <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 1 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggcaacctct gggccaccgg tcacttcatg 30 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 3 Ala Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Amidation <400> 4 Gly Ala Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 5 Gly Asn Ala Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 6 Gly Asn Leu Ala Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 7 Gly Asn Leu Trp Ala Ala Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 8 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Ala His Phe Met 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 9 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly Ala Phe Met 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 10 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Ala Met 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 11 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> Acetylation <222> (1)..(1) <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 12 Gly Leu Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Methanesulfonyl <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 13 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> N-methylation <400> 14 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Free acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <400> 15 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 16 Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 17 Gly Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 18 Gly Asn Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 19 Gly Asn Leu Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 20 Gly Asn Leu Trp Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 21 Gly Asn Leu Trp Ala Gly His Phe Met 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 22 Gly Asn Leu Trp Ala Thr His Phe Met 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 23 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly Phe Met 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 24 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Met 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 25 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> AMIDATION <400> 26 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly His 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> AMIDATION <400> 27 Asn Leu Trp Ala Thr Gly His Phe 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> AMIDATION <400> 28 Leu Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 29 Gly Asn Leu Trp Ala Thr Gly 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 30 Asn Leu Trp Ala Thr Gly His 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 31 Leu Trp Ala Thr Gly His Phe 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 32 Trp Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 33 Gly Asn Leu Trp Ala Thr 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 34 Asn Leu Trp Ala Thr Gly 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 35 Leu Trp Ala Thr Gly His 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 36 Trp Ala Thr Gly His Phe 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Variant neuromedin B peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 37 Ala Thr Gly His Phe Met 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met 1 5 10 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 39 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 40 Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 41 Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 42 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 43 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 44 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 45 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 46 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 47 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 48 Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 49 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 50 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 50 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 51 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 51 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 52 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Cysteamide <400> 52 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 53 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Cysteamide <400> 53 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 54 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Cysteamide <400> 54 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 55 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 55 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 56 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Cysteamide <400> 56 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 57 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 58 Pro Phe Val Tyr Leu Ile 1 5

Claims (42)

  1. 포유동물 대상체에게 치료 유효량의, 적어도 하나의 뉴로메딘 B(Nmb) 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 투여하여 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 장애는 염증성 장애인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 장애는 바람직하지 않은 인터류킨-5(IL-5) 및/또는 IL-13 활성과 연관이 있고, 치료 유효량의, 하나 이상의 Nmb 단백질, 또는 하나 이상의 Nmb 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자의 투여는 IL-5 및/또는 IL-13 활성을 감소시켜 장애를 치료하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 장애는 알레르기, 호산구성 장애, 또는 기도 장애인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 기도 장애는 천식, 부비강염, 특발성 폐 섬유증, 비염, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구성 식도염, 또는 COPD인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 장애는 피부 장애인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 피부 장애는 습진, 아토피성 피부염, 또는 두드러기인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 장애는 표 1에 열거된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Nmb 단백질은 서열번호 26, 27, 29, 35, 36, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하거나, 또는 적어도 하나의 핵산 분자는 서열번호 26, 27, 29, 35, 36, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 분자는 서열번호 2와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 분자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 아데노 연관 바이러스 벡터인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 분자는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 주사, 경구 투여, 흡입식 투여, 또는 국소 투여를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 대상체는 인간 대상체인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량의, 적어도 하나의 Nmb 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자는 약학 조성물에 존재하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 치료 유효량의, 적어도 하나의 Nmb 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자의 적어도 2회 별개 투여를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 2회 별개 투여는 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 1년 떨어져 있는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 장애 발병 5분 이내, 10분 이내, 30분 이내, 1시간 이내, 2시간 이내, 3시간 이내, 4시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내, 48시간 이내, 72시간 이내, 96시간 이내, 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 또는 3개월 이내에 이루어지는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료 유효량의 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 감소, IL-5 활성 감소, IL-13 활성 감소, ILC2 반응 감소, 호산구증가증 감소, 또는 이들의 조합을 달성하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Nmb 단백질은 서열번호 26, 27, 29, 35, 36, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 28, 30, 31, 32, 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 비천연 Nmb 단백질인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Nmb 단백질은 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 비천연 Nmb 단백질인 방법.
  24. 조성물로서,
    서열번호 1과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 Nmb 단백질; 및
    리포솜
    을 포함하고, Nmb 단백질은 리포솜에 캡슐화되어 있는 것인 조성물.
  25. 조성물로서,
    (서열번호 1이 아닌) 서열번호 26, 27, 29, 35, 36, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 단백질; 및
    약학적으로 허용되는 담체;
    임의로, 리포솜
    을 포함하고, 단백질은 리포솜에 캡슐화되어 있는 것인 조성물.
  26. 조성물로서,
    서열번호 1이 아닌, 서열번호 26, 27, 29, 35, 36, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 20, 22, 28, 30, 31, 32, 또는 37과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 적어도 하나의 단백질; 및/또는
    서열번호 1이 아닌, 서열번호 26, 27, 29, 35 또는 36과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 적어도 하나의 단백질을 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 서열번호 1의 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Nmb 단백질 또는 단백질은 Nmb 단백질 또는 단백질 및 세포 투과성 펩티드를 포함하는 융합 단백질인 방법, 또는 조성물.
  29. 제5항에 있어서, 기도 장애는 특발성 폐 섬유증 또는 COPD이고, 방법은 IL-13 활성을 감소시키는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료 유효량의, 적어도 하나의 뉴로메딘 C(Nmc) 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmc 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 투여하여 장애를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 포유동물 대상체에게 치료 유효량의, 적어도 하나의 뉴로메딘 C(Nmc) 단백질, 또는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 투여하여 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 적어도 하나의 Nmc 단백질은 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하거나, 또는 적어도 하나의 핵산 분자는 서열번호 38과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 적어도 하나의 Nmb 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 장애는 염증성 장애인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 장애는 알레르기, 호산구성 장애, 또는 기도 장애인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 기도 장애는 천식, 부비강염, 특발성 폐 섬유증, 비염, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구성 식도염, 또는 COPD인 방법.
  36. 제31항 또는 제32항에 있어서, 장애는 피부 장애인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 피부 장애는 습진, 아토피성 피부염, 또는 두드러기인 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 장애는 표 1에 열거된 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제5항 및 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, Sprr2a2, Serpinb2, Il1b, Xist 및 Tsix를 포함하는 제1 유전자 세트 중 하나 이상의 발현을 상향조절하는 방법.
  40. 제1항 내지 제23항 및 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Hgs2, Nkg7, Klra7, P2rx7, Ly6c2 및 Mcpt2를 포함하는 제2 유전자 세트 중 하나 이상의 발현을 하향조절하는 방법.
  41. 제1항 내지 제23항 및 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 장애는 염증성 장애이고, 방법은 대상체의 폐 중 세포 침윤물 수준을 감소시키는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제23항 및 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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