CN106317225A - 具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域。具体涉及具有靶向性的长效白细胞介素22融合蛋白的制备及其用途。本发明针对白细胞介素22的靶向给药，延长白细胞介素22的体内半衰期，减少白细胞介素22的免疫原性等问题提供一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白由白细胞介素22和载脂蛋白AI组成，由于载脂蛋白AI能特异性靶向B族I型清道夫受体(SRB-I),从而实现白细胞介素22的靶向给药。该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单，可用于大规模的药物级融合蛋白的生产和制备。该融合蛋白可用于自身免疫性肝病，病毒性肝炎，酒精肝，肝细胞癌等肝脏疾病及糖尿病的治疗。

Description

具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域，涉及重组融合蛋白，具体涉及一种具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白及其制备方法和在制药中的用途。该融合蛋白可用于制备治疗自身免疫性肝病，病毒性肝炎，酒精肝，肝细胞癌等肝脏疾病及糖尿病的药物。

背景技术

现有技术公开了白细胞介素22(Interleukin 22)是属于白细胞介素10家族的一种细胞因子，可由经抗CD3抗体刺激后的T淋巴细胞产生。研究显示，白细胞介素22具有广泛的生物学效应，对多种慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病具有调节作用[Yang X,Zheng SG.Interleukin-22:a likely target for treatment ofautoimmune diseases.Autoimmun Rev.2014；13:615-20.]，其作用具体表现为：能促进抗菌肽产生，抵抗细菌感染；促进角质形成细胞增殖，调节上皮细胞组织修复；在感染性疾病中发挥抗炎作用[Sertorio M,Hou X,Carmo RF,Dessein H,Cabantous S,Abdelwahed M,et al.Interleukin-22 and IL-22 binding protein(IL-22BP)regulate fibrosis and cirrhosis in hepatitis C virus and schistosomeinfections.Hepatology.2014.doi:10.1002/hep.27629.；Backert I,Koralov SB,WirtzS,Kitowski V,Billmeier U,MartiniE,et al.STAT3 activation in Th17 and Th22 cellscontrols IL-22-mediated epithelial host defense during infectious colitis.J Immunol.2014；193:3779-91.；Moniaga CS,Egawa G,Miyachi Y,Kabashima K.Calcipotriolmodulates IL-22 receptor expression and keratinocyte proliferation in IL-22-inducedepidermal hyperplasia.J Dermatol Sci.2013；71:76-7.]。有研究报道了白细胞介素22的抗炎作用广泛，对肠炎、糖尿病及酒精性肝炎等疾病具有较好的抗炎及保护效果[Hasegawa M,Yada S,Liu MZ,Kamada N,Munoz-Planillo R,Do N,et al.Interleukin-22 regulates the complement system to promote resistance againstpathobionts after pathogen-induced intestinal damage.Immunity.2014；41:620-32.；Wang X,Ota N,Manzanillo P,Kates L,Zavala-Solorio J,Eidenschenk C,et al.Interleukin-22 alleviates metabolic disorders and restores mucosalimmunity indiabetes.Nature.2014；514:237-41.]；以及白细胞介素22能促进肝脏细胞再生，参与肝脏组织的修复并保护肝细胞[Ki SH,Park O,Zheng M,Morales-Ibanez O,Kolls JK,Bataller R,et al.Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injuryin a murine model of chronic-binge ethanol feeding:role of signal transducer andactivator of transcription 3.Hepatology.2010；52:1291-300.]；以及白细胞介素22通过与白细胞介素22受体和白细胞介素10受体结合，激活并活化Jak和Stat3信号通路从而发挥生物学作用[Lejeune D,Dumoutier L,Constantinescu S,Kruijer W,Schuringa JJ,Renauld JC.Interleukin-22(IL-22)activates the JAK/STAT,ERK,JNK,and p38 MAP kinase pathways in a rat hepatoma cell line.Pathways that are sharedwith and distinct from IL-10.J Biol Chem.2002；277:33676-82.]；白细胞介素22受体分布于正常的胰脏、肝脏、小肠、结肠、肾组织；而白细胞介素10受体广泛分布于全身各组织[Sabat R,Ouyang W,Wolk K.Therapeutic opportunities of theIL-22-IL-22R1 system.Nat Rev Drug Discov.2014；13:21-38.；Moore KW,de WaalMalefyt R,Coffman RL,O'Garra A.Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor.Annu Rev Immunol.2001；19:683-765.]；因此，静脉给药后白细胞介素22能引起全身性的生物学效应，不适合自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝、肝细胞癌等肝脏疾病的治疗。

现有技术还公开了高密度脂蛋白能将肝外组织的胆固醇运送到肝脏，从而避免游离胆固醇在肝外组织细胞上的沉积。高密度脂蛋白主要由肝脏和小肠合成，其中肝脏合成的高密度脂蛋白以磷脂和载脂蛋白AI(ApolipoproteinAI,ApoAI)为主。载脂蛋白AI是高密度脂蛋白的重要组成成分，约占高密度脂蛋白的75％；研究发现载脂蛋白AI具有良好的抗炎功能[White CR,Garber DW,Anantharamaiah GM.Anti-inflammatory and cholesterol-reducing properties ofapolipoprotein mimetics:a review.J Lipid Res.2014；55:2007-21.]；B族I型清道夫受体(Scavenger receptor class B type I,SR-BI)在高密度脂蛋白生物学功能中发挥着重要作用，高密度脂蛋白在与清道夫受体SR-BI结合后，介导细胞中胆固醇和磷脂的转运，从而发挥细胞保护功能[Kingwell BA,Chapman MJ,Kontush A,MillerNE..Nat Rev Drug Discov.2014；13:445-64.]；清道夫受体SR-BI在大部分细胞中表达水平较低，在肝脏，肠细胞中表达水平较高，因而其I有望作为肝脏靶向递药的理想靶点[Out R,Hoekstra M,Spijkers JA,Kruijt JK,van Eck M,Bos IS,et al..J Lipid Res.2004；45:2088-95.]。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白及其制备方法和在制药中的用途。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种新的重组融合蛋白，具体涉及一种靶向性长效白细胞介素22融合蛋白。所要解决的关键技术问题是如何实现白细胞介素22的靶向递药，如何减少白细胞介素22的免疫原性，如何延长白细胞介素22在体内的半衰期，在延长白细胞介素22的体内半衰期的同时能保持其生物活性。

本发明的另一目的在于提供该具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的制备方法。

本发明的进一步目的在于提供该具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白在制备治疗自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝、肝细胞癌等肝脏疾病及糖尿病药物中的应用。具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白及其制备方法和在制药中的用途。

本发明提供了一种具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白是由白细胞介素22和载脂蛋白AI多肽融合而成的重组蛋白。

本发明中，所述的白细胞介素22包括但不限于人白细胞介素22原型及其突变型。

本发明中，所述的载脂蛋白AI的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明中，所述白细胞介素22的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明中，提供了一种具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白，优选的是N端为白细胞介素22，C端为载脂蛋白AI，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步，本发明还提供了上述具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；其中，编码白细胞介素22的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明中，编码载脂蛋白AI的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明所述白细胞介素22与载脂蛋白AI之间的融合包括但不限于直接融合和间接融合。

本发明还提供了白细胞介素22与载脂蛋白AI之间进行间接融合所需氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：GSSGSSGSSGSSG(SEQ ID NO:7)；

本发明还提供了含有上述具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因的表达载体、宿主细胞、重组菌；

所述的表达载体，可采用原核表达载体，也可采用真核表达载体，较优的为原核表达载体pET24b、pET28a；

所述的重组菌为大肠杆菌，酵母菌等，较优的是大肠杆菌BL21(DE3)CONDONPLUS,大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明进一步提供了上述的具有靶向性的白细胞介素22融合蛋白的制备方法，其包括：以SEQ ID No.1的氨基酸序列为单位进行重复组合，与白细胞介素22的N-端或C-端进行融合，其组合方式包括但不限于N-端白细胞介素22-载脂蛋白AI多肽-C端，N-端白细胞介素22-载脂蛋白AI多肽-白细胞介素22-C端；

所述多肽与白细胞介素22之间或多肽本身之间的融合包括但不限于直接融合和间接融合；间接融合所述的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

更具体的，所述的制备方法包括以下步骤：

A、克隆如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

B、构建含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的重组质粒；

C、在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO:3所示的重组融合蛋白。

本发明所述的制备方法中，较优的，步骤A中，设计并合成如下引物：

上游引物为：AGTTCATATGGCGCCCATCAGCTCCCACT(SEQ ID NO:8)

下游引物为：ATCGAATTCAATGCAGGCATTTCTCAGAGAC(SEQ ID NO:9)

合成白细胞介素22的编码基因；

设计并合成如下引物：

上游引物为：CTAGGATCCGACGAACCACCTCAATCCCCTT(SEQ ID NO:10)

下游引物为：ATGCTCGAGTTATTGTGTGTTCAATTTCTTAGTG(SEQ ID NO:11)

合成载脂蛋白AI的编码基因；

所述的制备方法中，较优的，步骤B中，构建所用的质粒为pET28a、pET24b；分别构建pET28a-白细胞介素22和pMD19-载脂蛋白AI编码基因质粒，在此基础上构建pET28a-白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白编码基因质粒；

所述的制备方法中，较优的，步骤C中，将pET28a-白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白编码基因质粒转化感受态大肠杆菌BL21DE3condonplus，涂布于硫酸卡那霉素和氯霉素抗性LB平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，扩大培养，收集菌体，振荡、分离、纯化。

本发明进一步提供了上述融合蛋白、编码基因、表达载体、重组菌在制备治疗自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝、肝细胞癌等肝脏疾病及糖尿病药物中的应用。

本发明提供了由白细胞介素22和载脂蛋白AI组成的重组融合蛋白，由于载脂蛋白AI能特异性靶向B族I型清道夫受体(SRB-I),从而实现白细胞介素22的靶向给药；该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单，可用于大规模的药物级融合蛋白的生产和制备。本发明的白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白可实现白细胞介素22的靶向递药，同时相较于白细胞介素22在体内的半衰期显著延长，又保持了其生物活性，减少了白细胞介素22的免疫原性；该融合蛋白可用于制备治疗自身免疫性肝病，病毒性肝炎，酒精肝，肝细胞癌等肝脏疾病及糖尿病的药物。

附图说明

图1：人白细胞介素22目的基因的克隆及载脂蛋白AI编码基因的克隆。

图2：编码载脂蛋白AI与pET28a酶切产物回收。

图3：编码人白细胞介素22目的基因回收产物及pET28a-载脂蛋白AI回收产物。

图4：编码人白细胞介素22-载脂蛋白AI目的基因的PCR产物。

图5：编码人白细胞介素22-载脂蛋白AI目的基因的测序比对结果。

图6：白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的诱导表达。

图7：编码白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的大肠杆菌扩大培养诱导表达。

图8：白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的分离。

图9：白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的鉴定。

图10：白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的活性研究。

图11：白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的药代动力学研究。

图12：白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的药效学研究。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂盒原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白编码基因的获得

白细胞介素22编码基因的获得：人外周血单核细胞在含有5μg/ml的脂多糖的RPMI 1640培养基中培养18小时，采用Trizol进行RNA的提取，并采用逆转录试剂盒进行RNA的反转，最终获得cDNA；

以反转录获得的cDNA为模板，采用Primer设计引物，其中上游引物为：5’-agttCATATggcgcccatcagctcccact-3’,其中下划线处为NdeI酶切位点；下游引物为：5’-atcgGGATCCaatgcaggcatttctcagag-3’,其中下划线处为BamHI酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成；

采用PCR方法克隆含有NdeI和BamHI酶切位点的白细胞介素22基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图1所示：PCR产物的大小在500bp左右，与白细胞介素22的目的基因大小相符；

载脂蛋白AI的基因序列由金斯瑞生物技术公司合成。采用Primer设计引物，其中上游引物为：5’-ctaGGATCCgacgaaccacctcaatcccctt-3’,其中下划线处为BamHI酶切位点；下游引物为：5’-atgCTCGAGttattgtgtgttcaatttcttagtg-3’,其中下划线处为XhoI酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成；

采用PCR方法克隆含有BamHI和XhoI酶切位点的载脂蛋白AI基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图1所示：PCR产物的大小在750bp左右，与载脂蛋白AI的目的基因大小相符；

PCR反应II：在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀：

2X Taq Mix 25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；cDNA 1μl；超纯水20μl；

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，共进行30个循环反应。最后，72℃，30min；

将克隆到的PCR产物连接pMD19-T simple载体，挑取阳性克隆，进行测序，经比对与人工化学合成的核苷酸序列一致。

实施例2、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白编码基因表达载体的构建

取pET24b表达载体及pMD19-T-白细胞介素22编码基因质粒，采用NdeI和BamHI限制性核酸内切酶进行双酶切，双酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，NdeI1ul，BamHI1ul，2X buffer Tango 4ul,无菌水4ul。37℃酶切5h，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET24b表达载体回收5000bp左右的片段，pMD19-白细胞介素22回收约500p的片段；

连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pET24b表达载体酶切片段与白细胞介素22基因目的片段的摩尔数比约为1:3，连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10X T4 DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序(测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成)；

取构建成功的pET24b-白细胞介素22和pMD19-载脂蛋白AI编码基因质粒，采用BamHI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，XhoI1ul，BamHI1ul，2X buffer Tango 4ul,无菌水4ul，37℃酶切5h，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET24b-白细胞介素22表达载体回收5800bp左右的片段，pMD19-载脂蛋白AI编码基因回收约750bp的片段；

连接反应在T4 DNA连接酶催化下进行，pET24b-白细胞介素22基因目的片段与亲水性非重复序列多肽编码基因片段的摩尔数比约为1:3，连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10X T4 DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序(测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成)。

实施例3、含有组氨酸标签的白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白编码基因表达载体的构建

取pET28a表达载体及pMD19-T-载脂蛋白AI编码基因质粒，采用BamHI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，双酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，BamHI1ul，XhoI1ul，2X buffer Tango 4ul,无菌水4ul，37℃酶切5h，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段，试验结果如图2所示：其中pET28a表达载体回收5000bp左右的片段，pMD19-载脂蛋白AI回收约750p的片段；

连接反应在T4 DNA连接酶催化下进行，pET28a表达载体酶切片段与载脂蛋白AI目的片段的摩尔数比约为1:3，连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10X T4 DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成；

取构建成功的pET28a-载脂蛋白AI和pMD19-白细胞介素22编码基因质粒，采用NdeI和BamHI限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，NdeI1ul，BamHI1ul，2X buffer Tango 4ul,无菌水4ul。37℃酶切5h。酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，实验结果如图3所示；采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET28a-载脂蛋白AI表达载体回收5800bp左右的片段，pMD19-白细胞介素22编码基因回收约500p的片段；

连接反应在T4 DNA连接酶催化下进行，pET28a-载脂蛋白AI基因目的片段与白细胞介素22编码基因片段的摩尔数比约为1:3，连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10X T4 DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒；

采用PCR方法克隆含有NdeI和XhoI酶切位点的白细胞介素22-载脂蛋白AI编码基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图4四所示：PCR产物的大小在1200bp左右，与白细胞介素22-载脂蛋白AI的目的基因大小相符；

PCR反应II：在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀：

2X Taq Mix 25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；cDNA 1μl；超纯水20μl。

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min，共进行30个循环反应，最后，72℃，30min；

将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序(测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成)，试验结果如图5所示：克隆得到的白细胞介素22-载脂蛋白AI基因序列正确。

实施例4、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白的表达

将测序正确的pET28a-白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白编码基因质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)condonplus，涂布于硫酸卡那霉素和氯霉素抗性LB平板，37℃培养过夜。随机挑取平板上4个单菌落，扩大培养，按1％的比例转接至3ml新鲜LB试管中，37℃震荡培养至OD600≈0.6时，分别取样加入终浓度为1mM的IPTG，继续震荡培养3小时，取1ml菌液离心收集菌体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，实验结果如图6所示，与未经IPTG诱导对照组相比，IPTG诱导的实验组在43KDa附近有目的蛋白表达，大小与预期相符；

取编码白细胞介素22-载脂蛋白AI融合蛋白的大肠杆菌表达株进行扩大培养，并诱导表达，实验结果如图7所示，与未经IPTG诱导剂诱导的对照组相比，诱导剂诱导的实验组有大量目的蛋白表达，大小与预期相符。

实施例5、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白的纯化及鉴定

取诱导后的大肠杆菌，8000rpm离心15min收集菌体，将菌体用生理盐水进行洗涤后，按每g菌体加入5ml生理盐水，将菌体重悬，进行超声破碎，其中破碎时间2s，间隔2s，共进行8次循环，每次破碎4min，将破碎的菌液8000rpm离心15min，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析，取破碎后的上清上样至生理盐水平衡的镍柱，并采用含不同浓度咪唑的生理盐水进行梯度洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测；实验结果如图8所示，将纯化到的目的蛋白溶液置于生理盐水中透析，除去其中的咪唑，获得白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白，采用Western Blot对白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白进行鉴定，实验结果如图9所示：采用载脂蛋白AI单克隆抗体孵育可见信号，条带大小与白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白大小一致。

实施例6、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白的活性测定

由于直接检测白细胞介素22的量无法反映其真实的细胞活性，因而根据白细胞介素22的生物学功能，检测其下游效应分子的激活程度间接反映其生物活性；利用白细胞介素22具有激活STAT3的功能，通过构建稳定转染STAT3萤光素酶报告基因的细胞株检测报告基因的表达水平，从而定量检测白细胞介素22的生物活性，实验结果如图10所示，白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白的活性与相同摩尔量的白细胞介素22的蛋白活性类似。

实施例7、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白的药代动力学实验

取BalB/c小鼠分别注射相同摩尔量的白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白或白细胞介素22，分别于注射后30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，36h，48h，72h取血，采用ELISA试剂盒检测血液样品中白细胞介素22的含量，实验结果如图11所示，白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白的体内半衰期明显长于相同摩尔量的白细胞介素22。

实施例8、白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白治疗自身免疫性肝炎的药效学实验

取C57小鼠构建实验性自身免疫性肝炎模型，采用白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白进行尾静脉注射治疗，。治疗14天后，取小鼠肝脏，进行固定、切片和HE染色，观察比较对照组，模型组及治疗组的肝损伤程度，实验结果如图12所示：实验性自身免疫性肝炎小鼠模型可见明显的肝细胞损伤，细胞质与细胞核分离，细胞核染色加深；采用白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合蛋白治疗可显著削弱实验性自身免疫性肝炎小鼠模型的肝损伤程度。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白及其制备方法和用途

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 243

<212> PRT

<213> 载脂蛋白AI

<400> 1

Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr

1 5 10 15

Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln

20 25 30

Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp

35 40 45

Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu

50 55 60

Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu

65 70 75 80

Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys

85 90 95

Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met

100 105 110

Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu

115 120 125

Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu

130 135 140

Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg

145 150 155 160

Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala

165 170 175

Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr

180 185 190

His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys

195 200 205

Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser

210 215 220

Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu

225 230 235 240

Asn Thr Gln

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 白细胞介素22

<400> 2

Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser

20 25 30

Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe

35 40 45

His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu

50 55 60

Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln

65 70 75 80

Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg

85 90 95

Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn

100 105 110

Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu

115 120 125

Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn

130 135 140

Ala Cys Ile

145

<210> 3

<211> 392

<212> PRT

<213> 具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白

<400> 3

Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser

20 25 30

Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe

35 40 45

His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu

50 55 60

Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln

65 70 75 80

Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg

85 90 95

Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn

100 105 110

Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu

115 120 125

Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn

130 135 140

Ala Cys Ile Gly Ser Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val

145 150 155 160

Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg

165 170 175

Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn

180 185 190

Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys

195 200 205

Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu

210 215 220

Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu

225 230 235 240

Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys

245 250 255

Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg

260 265 270

Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu

275 280 285

Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His

290 295 300

Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg

305 310 315 320

Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala

325 330 335

Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu

340 345 350

Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu

355 360 365

Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu

370 375 380

Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

385 390

<210> 4

<211> 1176

<212> DNA

<213> 具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因

<400> 4

atggcgccca tcagctccca ctgcaggctt gacaagtcca acttccagca gccctatatc 60

accaaccgca ccttcatgct ggctaaggag gctagcttgg ctgataacaa cacagacgtt 120

cgtctcattg gggagaaact gttccacgga gtcagtatga gtgagcgctg ctatctgatg 180

aagcaggtgc tgaacttcac ccttgaagaa gtgctgttcc ctcaatctga taggttccag 240

ccttatatgc aggaggtggt gcccttcctg gccaggctca gcaacaggct aagcacatgt 300

catattgaag gtgatgacct gcatatccag aggaatgtgc aaaagctgaa ggacacagtg 360

aaaaagcttg gagagagtgg agagatcaaa gcaattggag aactggattt gctgtttatg 420

tctctgagaa atgcctgcat tggatccgac gaaccacctc aatccccttg ggatagagtc 480

aaggacttgg ccactgttta cgtcgatgtt ttgaaagact ccggtagaga ttatgttagt 540

caatttgaag gttctgcttt gggaaagcag ttgaacctta aattgcttga taattgggac 600

tcagtcacta gtacattttc taagttgaga gagcaacttg gtccagttac acaggaattc 660

tgggacaact tggaaaagga gaccgaagga cttagacaag aaatgtctaa agatttggaa 720

gaggtcaagg ctaaagttca gccatacttg gatgacttcc aaaagaaatg gcaggaagag 780

atggagttgt atagacaaaa ggttgaacct ttgagagctg agcttcaaga aggtgccaga 840

cagaagttgc atgagcttca ggaaaaattg tccccacttg gagaagagat gagagacaga 900

gcaagagctc atgttgatgc attgagaact caccttgctc cttactcaga cgaattgaga 960

caaagacttg ctgccagatt ggaggctctt aaggaaaacg gtggagctag attggccgag 1020

tatcatgcca aagcaacaga acacttgtcc accctttcag agaaggcaaa accagctttg 1080

gaagatctta gacaaggttt gcttcctgtc ttggaatctt ttaaggttag tttcttgtct 1140

gctcttgaag agtacactaa gaaattgaac acacaa 1176

<210> 5

<211> 441

<212> DNA

<213> 编码白细胞介素22

<400> 5

atggcgccca tcagctccca ctgcaggctt gacaagtcca acttccagca gccctatatc 60

accaaccgca ccttcatgct ggctaaggag gctagcttgg ctgataacaa cacagacgtt 120

cgtctcattg gggagaaact gttccacgga gtcagtatga gtgagcgctg ctatctgatg 180

aagcaggtgc tgaacttcac ccttgaagaa gtgctgttcc ctcaatctga taggttccag 240

ccttatatgc aggaggtggt gcccttcctg gccaggctca gcaacaggct aagcacatgt 300

catattgaag gtgatgacct gcatatccag aggaatgtgc aaaagctgaa ggacacagtg 360

aaaaagcttg gagagagtgg agagatcaaa gcaattggag aactggattt gctgtttatg 420

tctctgagaa atgcctgcat t 441

<210> 6

<211> 729

<212> DNA

<213> 编码载脂蛋白AI

<400> 6

gacgaaccac ctcaatcccc ttgggataga gtcaaggact tggccactgt ttacgtcgat 60

gttttgaaag actccggtag agattatgtt agtcaatttg aaggttctgc tttgggaaag 120

cagttgaacc ttaaattgct tgataattgg gactcagtca ctagtacatt ttctaagttg 180

agagagcaac ttggtccagt tacacaggaa ttctgggaca acttggaaaa ggagaccgaa 240

ggacttagac aagaaatgtc taaagatttg gaagaggtca aggctaaagt tcagccatac 300

ttggatgact tccaaaagaa atggcaggaa gagatggagt tgtatagaca aaaggttgaa 360

cctttgagag ctgagcttca agaaggtgcc agacagaagt tgcatgagct tcaggaaaaa 420

ttgtccccac ttggagaaga gatgagagac agagcaagag ctcatgttga tgcattgaga 480

actcaccttg ctccttactc agacgaattg agacaaagac ttgctgccag attggaggct 540

cttaaggaaa acggtggagc tagattggcc gagtatcatg ccaaagcaac agaacacttg 600

tccacccttt cagagaaggc aaaaccagct ttggaagatc ttagacaagg tttgcttcct 660

gtcttggaat cttttaaggt tagtttcttg tctgctcttg aagagtacac taagaaattg 720

aacacacaa 729

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 白细胞介素22与载脂蛋白AI之间进行间接融合所需氨基酸序列

<400> 7

Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 8

agttcatatg gcgcccatca gctcccact 29

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 9

atcgaattca atgcaggcat ttctcagaga c 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 10

ctaggatccg acgaaccacc tcaatcccct t 31

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 11

atgctcgagt tattgtgtgt tcaatttctt agtg 34

Claims (14)

1.具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白，其特征在于：由白细胞介素22和载脂蛋白AI多肽融合而成。

2.根据权利要求1所述具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白，其特征在于，所述的白细胞介素22包括人白细胞介素22原型及其突变型。

3.根据权利要求1或2所述的具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白，其特征在于：所述载脂蛋白AI多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1或2所述的具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白，其特征在于：所述白细胞介素22的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.编码权利要求1、3或4任一项所述的载脂蛋白AI多肽的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的编码载脂蛋白AI多肽的核苷酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID No.3所示。

7.编码权利要求1、3或4任一项所述的具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID No.4所示。

8.权利要求1的具有靶向性的白细胞介素22融合蛋白的制备方法，其特征在于，其中：以SEQ ID No.1的氨基酸序列为单位进行重复组合，与白细胞介素22的N-端或C-端进行融合，其组合方式为N-端白细胞介素22-载脂蛋白AI多肽-C端，N-端白细胞介素22-载脂蛋白AI多肽-白细胞介素22-C端；

包括以下步骤：

(1)克隆如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

(2)构建含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的重组质粒；

(3)在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO:3所示的重组融合蛋白。

9.按权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多肽与白细胞介素22之间或多肽本身之间的融合包括直接融合和间接融合。间接融合所述的氨基酸序列为SEQID No.5所示。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的间接融合的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

11.具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因的表达载体。

12.具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因的宿主细胞。

13.具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因的重组菌。

14.权利要求1～7所述的具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白在制备治疗自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝、肝细胞癌疾病或糖尿病药物中的用途。