CN109224066A - 一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物 - Google Patents

一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物 Download PDF

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Abstract

本发明属生物制药领域，涉及一种基于靶向白细胞介素22治疗肝损伤的纳米基因药物及其制备方法，本发明的纳米基因治疗药物由DOTAP/Cholesterol包裹IL‑22/ApoA I融合蛋白表达载体构成，利用薄膜水化法制备成纳米药物。所述的纳米药物中在体内预期表达的IL‑22/ApoA I融合蛋白，可识别SR‑BI配体阳性表达的肝细胞，制备的liposIA在体内表达的蛋白质分子能克服半衰期短的缺点以及能实现减少白细胞介素22的免疫原性。该纳米药物具有稳定性高、质量可控和相对安全的特点。可进一步制成抗肝细胞损伤的药物。

Description

一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物
技术领域
本发明属生物制药领域，涉及治疗肝损伤的纳米基因药物，具体涉及一种基于靶向白细胞介素22治疗肝损伤的纳米基因药物，及其制备方法，该纳米基因药物可用于治疗药物性肝损伤、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝、肝细胞癌等肝脏疾病及糖尿病。
背景技术
现有技术公开了白细胞介素22(Interleukin 22)作为白细胞介素10家族的一种细胞因子，不仅可以产生特殊的细胞趋化因子和抗菌蛋白，而且可以上调某些细胞增殖基因、抗凋亡蛋白和抗氧化因子[Sertorio M,Hou X,Carmo RF,Dessein H,Cabantous S,Abdelwahed M,et al.Interleukin-22and IL-22binding protein(IL-22BP)regulatefibrosis and cirrhosis in hepatitis C virus and schistosomeinfections.Hepatology.2014.doi:10.1002/hep.27629.；Backert I,Koralov SB,WirtzS,Kitowski V,Billmeier U,Martini E,et al.STAT3activation in Th17 and Th22cells controls IL-22-mediated epithelial host defense during infectiouscolitis.J Immunol.2014；193:3779-91.；Moniaga CS,Egawa G,Miyachi Y,KabashimaK.Calcipotriol modulates IL-22 receptor expression and keratinocyxteproliferation in IL-22-induced epidermal hyperplasia.J Dermatol Sci.2013；71:76-7]。越来越多的研究表明，白细胞介素22能在Con A、四氯化碳、对乙酰氨基酚、急性或慢性酒精性肝损伤中具有参与肝脏组织的修复，促进肝脏细胞再生并保护肝细胞的功能[KiSH,Park O,Zheng M,Morales-Ibanez O,Kolls JK,Bataller R,et al.Interleukin-22treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding:role of signal transducer and activator oftranscription 3.Hepatology.2010；52:1291-300.]。尽管白介素22不阻止HBV、HCV病人体内病毒的复制，但研究表明它可以通过促进肝星状细胞的增殖产生肝保护作用[Feng D,Kong X,Weng H,Park O,Wang H,Dooley S,et al.Interleukin-22 promotesproliferation of liver stem/progenitor cells in mice and patients withchronic hepatitis B virus infection.Gastroenterology 2012；143:188-198.]。因此，白介素22作为一种参与急性或慢性肝细胞损伤的干预方式，具有巨大的应用前景。
研究表明，虽然白介素22在疾病治疗应用方面取得了巨大的进步，但是它作为一个安全有效的药物仍然面临着巨大的挑战。白介素22的受体广泛分布于正常的胰脏、肝脏、小肠、结肠、肾等组织[Sabat R,Ouyang W,Wolk K.Therapeutic opportunities of theIL-22-IL-22R1system.Nat Rev Drug Discov.2014；13:21-38.；Moore KW,de WaalMalefyt R,Coffman RL,O'Garra A.Interleukin-10and the interleukin-10receptor.Annu Rev Immunol.2001；19:683-765.]；因此，静脉给药后白介素22能引起全身性的生物学效应，因此其不适合自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎、酒精肝等肝脏疾病的干预治疗。有研究表明载脂蛋白AI(Apolipoprotein AI,ApoA I)能将肝外组织的胆固醇运送到肝脏，从而避免游离胆固醇在肝外组织细胞上的沉积。高密度脂蛋白主要由肝脏和小肠合成，其中肝脏合成的高密度脂蛋白以磷脂和载脂蛋白AI(ApolipoproteinAI,ApoA I)为主；B族I型清道夫受体(Scavenger receptor class B type I,SR-BI)在ApoA I生物学功能中发挥着重要作用，ApoA I在与清道夫受体SR-BI结合后，介导胆固醇和磷脂等货物在肝脏细胞聚集，从而发挥细胞保护功能[Kingwell BA,Chapman MJ,KontushA,Miller NE.HDL-targeted therapies:progress,failures and future.Nat Rev DrugDiscov.2014；13:445-64.]；研究还表明，SR-BI在大部分细胞中表达水平较低，在肝脏中表达水平较高，因而将白介素22和ApoA I融合，将会增强它的肝靶向且提高疗效[Out R,Hoekstra M,Spijkers JA,Kruijt JK,van Eck M,Bos IS,et al.Scavenger receptorclass B type I is solely responsible for the selective uptake of cholesterylesters from HDL by the liver and the adrenals in mice.J Lipid Res.2004；45:2088-95.]。
基于现有技术的基础，本申请的发明人拟提供一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供新的治疗肝损伤的纳米基因药物，具体涉及一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物。
本发明的另一目的在于提供所述的纳米基因药物的制备方法。
本发明的进一步在于提供该具有靶向白细胞介素22治疗肝损伤的纳米基因药物在制备治疗自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎、酒精肝等肝脏疾病及糖尿病药物中的应用。
本发明所要解决的关键技术问题是如何实现白细胞介素22的靶向递药，如何减少白细胞介素22的免疫原性，如何延长白细胞介素22在体内的半衰期，在延长白细胞介素22的体内半衰期的同事又能保持其生物活性。
本发明通过下述技术方案解决所述的技术问题：
本发明的基于靶向白细胞介素22治疗肝损伤的纳米基因药物，由纳米材料包裹IL-22/ApoA I融合蛋白表达载体构成；优选的，由DOTAP/Cholesterol包封IL-22/ApoA I融合蛋白表达载体构成。
本发明中，所述的白细胞介素22包括但不限于人白细胞介素22原型及其突变型；
本发明中，表达载体为上游引入Kozak增强子序列pVAX1构成。
本发明中，通过下述方法制备靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物，其包括步骤：
1)构建pVAX1-IL-22/ApoA I融合基因表达载体，利用PCR分别扩增IL-22的融合片段SEQ ID NO:2和ApoA I的融合片段SEQ ID NO:3，将该两个片段先后插入pVAX1载体，得到融合蛋白表达载体；
2)制备靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物：利用大提质粒试剂盒，大量提取无内毒素pVAX1-IL-22/ApoA I融合基因表达载体，利用薄膜水化法制备成纳米药物。
本发明的制备方法中，DOTAP/Cholesterol：融合蛋白表达载体质量比为1：1-22：1。
本发明的制备方法中，采用薄膜水化法制备纳米药物，包括步骤：将融合蛋白表达载体溶液滴加入DOTAP/Cholesterol中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均匀；用0.22μm的滤膜过滤以上混合物，获得合适粒径大小的纳米基因药物。
本发明中，所述的IL-22/ApoA I融合基因的核苷酸序列，其序列为SEQ ID No.1所示。
本发明提供了上述具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，
ATGGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGCTTGACAAGTCCAACTTCCAGCAGCCCTATATCACCAACCGCACCTTCATGCTGGCTAAGGAGGCTAGCTTGGCTGATAACAACACAGACGTTCGTCTCATTGGGGAGAAACTGTTCCACGGAGTCAGTATGAGTGAGCGCTGCTATCTGATGAAGCAGGTGCTGAACTTCACCCTTGAAGAAGTGCTGTTCCCTCAATCTGATAGGTTCCAGCCTTATATGCAGGAGGTGGTGCCCTTCCTGGCCAGGCTCAGCAACAGGCTAAGCACATGTCATATTGAAGGTGATGACCTGCATATCCAGAGGAATGTGCAAAAGCTGAAGGACACAGTGAAAAAGCTTGGAGAGAGTGGAGAGATCAAAGCAATTGGAGAACTGGATTTGCTGTTTATGTCTCTGAGAAATGCCTGCATTGGATCCGACGAACCACCTCAATCCCCTTGGGATAGAGTCAAGGACTTGGCCACTGTTTACGTCGATGTTTTGAAAGACTCCGGTAGAGATTATGTTAGTCAATTTGAAGGTTCTGCTTTGGGAAAGCAGTTGAACCTTAAATTGCTTGATAATTGGGACTCAGTCACTAGTACATTTTCTAAGTTGAGAGAGCAACTTGGTCCAGTTACACAGGAATTCTGGGACAACTTGGAAAAGGAGACCGAAGGACTTAGACAAGAAATGTCTAAAGATTTGGAAGAGGTCAAGGCTAAAGTTCAGCCATACTTGGATGACTTCCAAAAGAAATGGCAGGAAGAGATGGAGTTGTATAGACAAAAGGTTGAACCTTTGAGAGCTGAGCTTCAAGAAGGTGCCAGACAGAAGTTGCATGAGCTTCAGGAAAAATTGTCCCCACTTGGAGAAGAGATGAGAGACAGAGCAAGAGCTCATGTTGATGCATTGAGAACTCACCTTGCTCCTTACTCAGACGAATTGAGACAAAGACTTGCTGCCAGATTGGAGGCTCTTAAGGAAAACGGTGGAGCTAGATTGGCCGAGTATCATGCCAAAGCAACAGAACACTTGTCCACCCTTTCAGAGAAGGCAAAACCAGCTTTGGAAGATCTTAGACAAGGTTTGCTTCCTGTCTTGGAATCTTTTAAGGTTAGTTTCTTGTCTGCTCTTGAAGAGTACACTAAGAAATTGAACACACAA(SEQ ID NO:1)
其中，编码白细胞介素22的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
ATGGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGCTTGACAAGTCCAACTTCCAGCAGCCCTATATCACCAACCGCACCTTCATGCTGGCTAAGGAGGCTAGCTTGGCTGATAACAACACAGACGTTCGTCTCATTGGGGAGAAACTGTTCCACGGAGTCAGTATGAGTGAGCGCTGCTATCTGATGAAGCAGGTGCTGAACTTCACCCTTGAAGAAGTGCTGTTCCCTCAATCTGATAGGTTCCAGCCTTATATGCAGGAGGTGGTGCCCTTCCTGGCCAGGCTCAGCAACAGGCTAAGCACATGTCATATTGAAGGTGATGACCTGCATATCCAGAGGAATGTGCAAAAGCTGAAGGACACAGTGAAAAAGCTTGGAGAGAGTGGAGAGATCAAAGCAATTGGAGAACTGGATTTGCTGTTTATGTCTCTGAGAAATGCCTGCATT(SEQ ID NO:2)
编码载脂蛋白AI的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，
GACGAACCACCTCAATCCCCTTGGGATAGAGTCAAGGACTTGGCCACTGTTTACGTCGATGTTTTGAAAGACTCCGGTAGAGATTATGTTAGTCAATTTGAAGGTTCTGCTTTGGGAAAGCAGTTGAACCTTAAATTGCTTGATAATTGGGACTCAGTCACTAGTACATTTTCTAAGTTGAGAGAGCAACTTGGTCCAGTTACACAGGAATTCTGGGACAACTTGGAAAAGGAGACCGAAGGACTTAGACAAGAAATGTCTAAAGATTTGGAAGAGGTCAAGGCTAAAGTTCAGCCATACTTGGATGACTTCCAAAAGAAATGGCAGGAAGAGATGGAGTTGTATAGACAAAAGGTTGAACCTTTGAGAGCTGAGCTTCAAGAAGGTGCCAGACAGAAGTTGCATGAGCTTCAGGAAAAATTGTCCCCACTTGGAGAAGAGATGAGAGACAGAGCAAGAGCTCATGTTGATGCATTGAGAACTCACCTTGCTCCTTACTCAGACGAATTGAGACAAAGACTTGCTGCCAGATTGGAGGCTCTTAAGGAAAACGGTGGAGCTAGATTGGCCGAGTATCATGCCAAAGCAACAGAACACTTGTCCACCCTTTCAGAGAAGGCAAAACCAGCTTTGGAAGATCTTAGACAAGGTTTGCTTCCTGTCTTGGAATCTTTTAAGGTTAGTTTCTTGTCTGCTCTTGAAGAGTACACTAAGAAATTGAACACACAA(SEQ ID NO:3)
本发明还提供了具有靶向白细胞介素22得治疗肝损伤的纳米基因药物在制备治疗药物性肝损伤、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝、等肝脏疾病及糖尿病药物中的用途。
本发明的基于靶向白介素22治疗肝损伤的纳米基因药物具有下列优点：
1)IL-22/ApoA I融合基因在体内预期表达的IL-22/ApoA I融合蛋白，可识别SR-BI配体阳性表达的肝细胞，具有较好的局部优势分布效应。
2)外源性补充IL-22蛋白药物已被证实具有很好的保护肝损伤的作用，然而该药物在体内的半衰期很短，本发明制备的liposIA在体内表达的蛋白质分子，可克服半衰期短的缺点。
3)本发明的基于靶向白介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物能实现减少白细胞介素22的免疫原性。
附图说明
图1显示了pVAX1-IL-22/ApoA I(pIA)基因的构建及表征。
图2显示了liposIA的制备及表征。
图3显示了liposIA的药代动力学、组织分布及对肝脏STAT3的活性影响。
图4显示了liposIA可以保护对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。
图5显示了liposIA可以激活肝细胞的STAT3/Erk和AKT/mTOR信号传导通路。
图6显示了liposIA抑制ROS的产生并阻止对乙酰氨基酚诱导的线粒体功能紊乱。
图7显示了liposIA对细胞、血液系统和组织器官没有明显的毒副作用。
具体实施方式
以下结合实施例和附图，对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂盒原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1、制得白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合基因
白细胞介素22编码基因的获得：人外周血单核细胞在含有5μg/ml的脂多糖的RPMI1640培养基中培养18小时，采用Trizol进行RNA的提取，并采用逆转录试剂盒进行RNA的反转，最终获得cDNA；
以反转录获得的cDNA为模板，采用Primer设计引物，其中上游引物为：5’-agttCATATggcgcccatcagctcccact-3’,)其中下划线处为NdeI酶切位点；下游引物为：5’-atcgGGATCCaatgcaggcatttctcagag-3’,其中下划线处为BamHI酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成；
采用PCR方法克隆含有NdeI和BamHI酶切位点的白细胞介素22基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物的大小在500bp左右，与白细胞介素22的目的基因大小相符；
载脂蛋白AI的基因序列由金斯瑞生物技术公司合成，采用Primer设计引物，其中上游引物为：5’-ctaGGATCCgacgaaccacctcaatcccctt-3’,其中下划线处为BamHI酶切位点；下游引物为：5’-atgCTCGAGttattgtgtgttcaatttcttagtg-3’,其中下划线处为XhoI酶切位点，引物由上海生工生物工程公司合成；
采用PCR方法克隆含有BamHI和XhoI酶切位点的载脂蛋白AI基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物的大小在750bp左右，与载脂蛋白AI的目的基因大小相符；
将克隆到的PCR产物连接pMD19-T simple载体，挑取阳性克隆，送至上海英骏贸易有限公司进行测序，经比对与人工化学合成的核苷酸序列一致。
实施例2、构建白细胞介素22与载脂蛋白AI重组融合基因表达载体
取pVAX1表达载体及pMD19-T-白细胞介素22编码基因质粒，采用NdeI和BamHI限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pVAX1表达载体回收3000bp左右的片段，pMD19-白细胞介素22回收约500bp的片段；
连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pET24b表达载体酶切片段与白细胞介素22基因目的片段的摩尔数比约为1:3，连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10XT4DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；
连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成；
取构建成功的pVAX1-IL22和pMD19-载脂蛋白AI编码基因质粒，采用BamHI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，Xho I 1ul，BamHI1ul，2X buffer Tango 4ul,无菌水4ul，37℃酶切5h，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pVAX1-IL22表达载体回收3500bp左右的片段，pMD19-载脂蛋白AI编码基因回收约750bp的片段；
连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pVAX1-IL22基因目的片段与亲水性非重复序列多肽编码基因片段的摩尔数比约为1:3，连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10XT4DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；
连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序结果如图1A所示(反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成)。
实施例3pIA在体外和体内表达实验
将HEK-293T细胞种于六孔板中，待细胞融合率达到70-80％时，用lipofectamine2000分别转染2和4μg的pIA。细胞继续培养24小时，收取细胞并用细胞裂解液裂解后，用BCA试剂盒定量，Western blot检测细胞内的白介素22和ApoA I的含量(如图1B,C所示)；
HEK-293T细胞种于含有灭过菌的盖玻片上，待细胞融合率达到70％时，用lipofectamine 2000转染4μg的pIA，细胞培养过夜后，吸弃培养基并用含有4％的多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗涤细胞3遍，接着用含有0.5％的Triton X-100溶液穿透细胞20分钟，并用PBS洗涤3遍。然后用FBS封闭细胞20分钟。在四度条件下，用含有1％的抗-ApoA I的一抗孵育细胞12小时，待一抗和目的蛋白充分结合后，用PBST洗涤细胞五分钟，重复此步骤三遍，然后在37度条件下，用抗兔-IgG-AF488二抗孵育细胞一小时，接着用PBST洗涤细胞三遍后，在荧光显微镜下观察结果(如图1D所示)；
进一步验证pIA能否顺利的在小鼠体内表达，将C57小鼠分为三组，分别给予单剂量PBS、pVAX1和pIA。并在指定的时间收集小鼠的血液，测量血清中白介素22的含量(如图1E,F所示)，同时收集用药后第三天小鼠的肝脏，并利用Western blot技术检测细胞内p-STAT3的含量(如图1G,H所示)，结果显示，pIA可以顺利的在小鼠体内表达且具有活性。
实施例4、制备靶向治疗肝损伤的纳米基因药物(liposIA)
利用薄膜水化法制备纳米基因药物，该纳米基因药物的组成如图2A所示；首先，称取20毫克的DOTAP和11毫克的胆固醇并溶与氯仿中，室温条件下利用旋转蒸发仪将溶液蒸干从而形成薄膜，然后，利用氮气流除尽残留溶剂，向该薄膜混合物中加入一定体积质量百分数为五的葡萄糖溶液，使该溶液的总浓度为5mg/mL，然后将混合物放在超声仪下，超声破碎5分钟并用孔径大小为0.22μm的滤膜过滤，最终，获得由DOTAP/Chol组成的阳离子脂质体；
LiposN，liposIL-22和liposIA混合物在注射前制备，DNA溶解于质量百分数为五的葡萄糖溶液中，并将不同质量比DOTAP/Chol阳离子脂质体迅速加入，该混合物涡旋30秒，且在室温条件下孵育半小时，不同组分的脂质体葡聚糖凝胶电泳如图2B、C所示，利用马尔文粒径仪测量纳米药物的粒径、Z电位和PDI值(如图2D、E和F所示)。
实施例5、靶向治疗肝损伤的纳米基因药物(liposIA)的稳定性研究
为了评价该纳米基因药物的血清稳定性，分别取含有相同质量DNA的liposIA和pIA在37度条件下与PBS及含有50％的FBS孵育，同时，在不同时间点取10μl的反应混合物并保存在-80度冰箱。用葡聚糖凝胶鉴定liposIA的稳定性，结果如图2H、I所示，liposIA具有相对较好的血清稳定性。
实施例6、靶向治疗肝损伤的纳米基因药物(liposIA)的药代动力学研究
取C57小鼠分别注射相同质量的liposN，liposIL-22和liposIA或PBS，分别于注射后12h，1天，2天，3天，5天，7天，10天取血，采用ELISA试剂盒检测血液样品中白细胞介素22的含量，实验结果如图3A、B所示，liposIA的体内半衰期明显长于相同质量的liposIL-22；
进一步验证该纳米基因药物可以使白介素22靶向于肝脏，分别在注射liposIA一天和两天后采取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑组织，采用ELISA试剂盒检测组织匀浆样品中白细胞介素22的含量，实验结果如图3C、D所示，liposIA的体内肝分布明显大于相同质量的liposIL-22，West bolt结果表明liposIA作用小鼠肝脏组织中STAT3的活性显著优于liposIL-22(如图3E、F所示)。
实施例7、靶向治疗肝损伤的纳米基因药物(liposIA)的药效学研究
取C57小鼠构建实验性药物肝损伤模型，采用liposIA进行肌肉注射治疗，治疗1天后，取小鼠肝脏，进行固定、切片和HE染色，并观察比较对照组，模型组及治疗组的肝损伤程度，实验结果如图4A、B所示：实验性药物肝损伤小鼠模型可见明显的肝细胞损伤，细胞质与细胞核分离，细胞核染色加深；采用liposIA治疗可显著削弱实验性药物肝损伤的程度，且单剂量的liposIA可以显著的降低小鼠体内的AST、ALT和TNF-α水平(如图4C、D、E所示)。
实施例8、靶向治疗肝损伤的纳米基因药物(liposIA)的分子机制研究
进一步论证liposIA在治疗肝损伤的分子机制，分别取由对乙酰氨基酚造药物性肝损伤且用liposN，liposIL-22和liposIA或PBS治疗小鼠的肝组织均将做West bolt，取部分肝组织进行MitoSOX和JC-1染色，如图5A、B所示liposIA发挥保护肝脏的同时激活了STAT3/Erk和AKT/mTOR信号通路；且降低了线粒体ROS的产生和稳定了线粒体膜电位(如图6A所示)，同时West bolt结果显示liposIA显著的降低肝脏的iNOS和p-JNK的升高(如图6B所示)。
实施例9、靶向治疗肝损伤的纳米基因药物(liposIA)的毒副作用研究
取健康C57小鼠，并分为四组，每组小鼠分别给予相同质量大剂量的liposN，liposIL-22和liposIA或PBS，药物作用三天后分别取小鼠血液测血液指标；取小鼠的器官固定、HE染色，结果表明liposIA未对健康小鼠的血液系统和组织脏器产生毒副作用(如图7所示)。
以上已对本发明的较佳实施例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
本发明提供了上述具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，
ATGGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGCTTGACAAGTCCAACTTCCAGCAGCCCTATATCACCAACCGCACCTTCATGCTGGCT AAGGAGGCTAGCTTGGCTGATAACAACACAGACGTTCGTCTCATTGGGGAGAAACTGTTCCACGGAGTCAGTATGAGTGAGCGCTGCTATCTGATGAAGCAGGTGCTGAACTTCACCCTTGAAGAAGTGCTGTTCCCTCAATCTGATAGGTTCCAGCCTTATATGCAGGAGGTGGTGCCCTTCCTGGCCAGGCTCAGCAACAGGCTAAGCACATGTCATATTGAAGGTGATGACCTGCATATCCAGAGGAATGTGCAAAAGCTGAAGGACACAGTGAAAAAGCTTGGAGAGAGTGGAGAGATCAAAGCAATTGGAGAACTGGATTTGCTGTTTATGTCTCTGAGAAATGCCTGCATTGGATCCGACGAACCACCTCAATCCCCTTGGGATAGAGTCAAGGACTTGGCCACTGTTTACGTCGATGTTTTGAAAGACTCCGGTAGAGATTATGTTAGTCAATTTGAAGGTTCTGCTTTGGGAAAGCAGTTGAACCTTAAATTGCTTGATAATTGGGACTCAGTCACTAGTACATTTTCTAAGTTGAGAGAGCAACTTGGTCCAGTTACACAGGAATTCTGGGACAACTTGGAAAAGGAGACCGAAGGACTTAGACAAGAAATGTCTAAAGATTTGGAAGAGGTCAAGGCTAAAGTTCAGCCATACTTGGATGACTTCCAAAAGAAATGGCAGGAAGAGATGGAGTTGTATAGACAAAAGGTTGAACCTTTGAGAGCTGAGCTTCAAGAAGGTGCCAGACAGAAGTTGCATGAGCTTCAGGAAAAATTGTCCCCACTTGGAGAAGAGATGAGAGACAGAGCAAGAGCTCATGTTGATGCATTGAGAACTCACCTTGCTCCTTACTCAGACGAATTGAGACAAAGACTTGCTGCCAGATTGGAGGCTCTTAAGGAAAACGGTGGAGCTAGATTGGCCGAGTATCATGCCAAAGCAACAGAACACTTGTCCACCCTTTCAGAGAAGGCAAAACCAGCTTTGGAAGATCTTAGACAAGGTTTGCTTCCTGTCTTGGAATCTTTTAAGGTTAGTTTCTTGTCTGCTCTTGAAGAGTACACTAAGAAATTGAACACACAA(SEQ ID NO:1)
其中，编码白细胞介素22的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
ATGGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGCTTGACAAGTCCAACTTCCAGCAGCCCTATATCACCAACCGCACCTTCATGCTGGCTAAGGAGGCTAGCTTGGCTGATAACAACACAGACGTTCGTCTCATTGGGGAGAAACTGTTCCACGGAGTCAGTATGAGTGAGCGCTGCTATCTGATGAAGCAGGTGCTGAACTTCACCCTTGAAGAAGTGCTGTTCCCTCAATCTGATAGGTTCCAGCCTTATATGCAGGAGGTGGTGCCCTTCCTGGCCAGGCTCAGCAACAGGCTAAGCACATGTCATATTGAAGGTGATGACCTGCATATCCAGAGGAATGTGCAAAAGCTGAAGGACACAGTGAAAAAGCTTGGAGAGAGTGGAGAGATCAAAGCAATTGGAGAACTGGATTTGCTGTTTATGTCTCTGAGAAATGCCTGCATT(SEQ ID NO:2)
编码载脂蛋白AI的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，
GACGAACCACCTCAATCCCCTTGGGATAGAGTCAAGGACTTGGCCACTGTTTACGTCGATGTTTTGAAAGACTCCGGTAGAGATTATGTTAGTCAATTTGAAGGTTCTGCTTTGGGAAAGCAGTTGAACCTTAAATTGCTTGATAATTGGGACTCAGTCACTAGTACATTTTCTAAGTTGAGAGAGCAACTTGGTCCAGTTACACAGGAATTCTGGGACAACTTGGAAAAGGAGACCGAAGGACTTAGACAAGAAATGTCTAAAGATTTGGAAGAGGTCAAGGCTAAAGTTCAGCCATACTTGGATGACTTCCAAAAGAAATGGCAGGAAGAGATGGAGTTGTATAGACAAAAGGTTGAACCTTTGAGAGCTGAGCTTCAAGAAGGTGCCAGACAGAAGTTGCATGAGCTTCAGGAAAAATTGTCCCCACTTGGAGAAGAGATGAGAGACAGAGCAAGAGCTCATGTTGATGCATTGAGAACTCACCTTGCTCCTTACTCAGACGAATTGAGACAAAGACTTGCTGCCAGATTGGAGGCTCTTAAGGAAAACGGTGGAGCTAGATTGGCCGAGTATCATGCCAAAGCAACAGAACACTTGTCCACCCTTTCAGAGAAGGCAAAACCAGCTTTGGAAGATCTTAGACAAGGTTTGCTTCCTGTCTTGGAATCTTTTAAGGTTAGTTTCTTGTCTGCTCTTGAAGAGTACACTAAGAAATTGAACACACAA(SEQ ID NO:3)。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物
<130> 20170710
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1176
<212> DNA
<213> 具有靶向性长效白细胞介素22融合蛋白的编码基因
<400> 1
atggcgccca tcagctccca ctgcaggctt gacaagtcca acttccagca gccctatatc 60
accaaccgca ccttcatgct ggctaaggag gctagcttgg ctgataacaa cacagacgtt 120
cgtctcattg gggagaaact gttccacgga gtcagtatga gtgagcgctg ctatctgatg 180
aagcaggtgc tgaacttcac ccttgaagaa gtgctgttcc ctcaatctga taggttccag 240
ccttatatgc aggaggtggt gcccttcctg gccaggctca gcaacaggct aagcacatgt 300
catattgaag gtgatgacct gcatatccag aggaatgtgc aaaagctgaa ggacacagtg 360
aaaaagcttg gagagagtgg agagatcaaa gcaattggag aactggattt gctgtttatg 420
tctctgagaa atgcctgcat tggatccgac gaaccacctc aatccccttg ggatagagtc 480
aaggacttgg ccactgttta cgtcgatgtt ttgaaagact ccggtagaga ttatgttagt 540
caatttgaag gttctgcttt gggaaagcag ttgaacctta aattgcttga taattgggac 600
tcagtcacta gtacattttc taagttgaga gagcaacttg gtccagttac acaggaattc 660
tgggacaact tggaaaagga gaccgaagga cttagacaag aaatgtctaa agatttggaa 720
gaggtcaagg ctaaagttca gccatacttg gatgacttcc aaaagaaatg gcaggaagag 780
atggagttgt atagacaaaa ggttgaacct ttgagagctg agcttcaaga aggtgccaga 840
cagaagttgc atgagcttca ggaaaaattg tccccacttg gagaagagat gagagacaga 900
gcaagagctc atgttgatgc attgagaact caccttgctc cttactcaga cgaattgaga 960
caaagacttg ctgccagatt ggaggctctt aaggaaaacg gtggagctag attggccgag 1020
tatcatgcca aagcaacaga acacttgtcc accctttcag agaaggcaaa accagctttg 1080
gaagatctta gacaaggttt gcttcctgtc ttggaatctt ttaaggttag tttcttgtct 1140
gctcttgaag agtacactaa gaaattgaac acacaa 1176
<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> 编码白细胞介素22
<400> 2
atggcgccca tcagctccca ctgcaggctt gacaagtcca acttccagca gccctatatc 60
accaaccgca ccttcatgct ggctaaggag gctagcttgg ctgataacaa cacagacgtt 120
cgtctcattg gggagaaact gttccacgga gtcagtatga gtgagcgctg ctatctgatg 180
aagcaggtgc tgaacttcac ccttgaagaa gtgctgttcc ctcaatctga taggttccag 240
ccttatatgc aggaggtggt gcccttcctg gccaggctca gcaacaggct aagcacatgt 300
catattgaag gtgatgacct gcatatccag aggaatgtgc aaaagctgaa ggacacagtg 360
aaaaagcttg gagagagtgg agagatcaaa gcaattggag aactggattt gctgtttatg 420
tctctgagaa atgcctgcat t 441
<210> 3
<211> 729
<212> DNA
<213> 编码载脂蛋白AI
<400> 3
gacgaaccac ctcaatcccc ttgggataga gtcaaggact tggccactgt ttacgtcgat 60
gttttgaaag actccggtag agattatgtt agtcaatttg aaggttctgc tttgggaaag 120
cagttgaacc ttaaattgct tgataattgg gactcagtca ctagtacatt ttctaagttg 180
agagagcaac ttggtccagt tacacaggaa ttctgggaca acttggaaaa ggagaccgaa 240
ggacttagac aagaaatgtc taaagatttg gaagaggtca aggctaaagt tcagccatac 300
ttggatgact tccaaaagaa atggcaggaa gagatggagt tgtatagaca aaaggttgaa 360
cctttgagag ctgagcttca agaaggtgcc agacagaagt tgcatgagct tcaggaaaaa 420
ttgtccccac ttggagaaga gatgagagac agagcaagag ctcatgttga tgcattgaga 480
actcaccttg ctccttactc agacgaattg agacaaagac ttgctgccag attggaggct 540
cttaaggaaa acggtggagc tagattggcc gagtatcatg ccaaagcaac agaacacttg 600
tccacccttt cagagaaggc aaaaccagct ttggaagatc ttagacaagg tttgcttcct 660
gtcttggaat cttttaaggt tagtttcttg tctgctcttg aagagtacac taagaaattg 720
aacacacaa 729

Claims (9)

1.基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物，其特征在于，由纳米材料包裹IL-22/ApoA I融合蛋白表达载体构成。
2.按权利要求1所述的基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物，其特征在于，所述的纳米材料选自DOTAP/Cholesterol，其中，DOTAP/Cholesterol：融合蛋白表达载体质量比为1：1-22：1。
3.按权利要求1所述的基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物，其特征在于，所述的表达载体为上游引入Kozak增强子序列pVAX1构成。
4.按权利要求1所述的基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物，其特征在于，所述的白细胞介素22为人白细胞介素22原型及其突变型。
5.按权利要求1所述的基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物，其特征在于，所述的融合蛋白其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码白细胞介素22的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；编码载脂蛋白AI的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.制备靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物的方法，其特征在于，其包括步骤：
1)构建pVAX1-IL-22/ApoA I融合基因表达载体，
利用PCR分别扩增IL-22的融合片段SEQ ID NO:2和ApoA I的融合片段SEQ ID NO:3，将该两个片段先后插入pVAX1载体，得到融合蛋白表达载体；
2)制备靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物：利用大提质粒试剂盒，大量提取无内毒素pVAX1-IL-22/ApoA I融合基因表达载体，利用薄膜水化法制备成纳米药物。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，DOTAP/Cholesterol：融合蛋白表达载体质量比为1：1-22：1。
8.按权利要求6所述的方法，其特征在于，其中薄膜水化法制备成纳米药物，包括步骤：
1)将融合蛋白表达载体溶液滴加入DOTAP/Cholesterol中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均匀；
2)用0.22μm的滤膜过滤以上混合物，获得合适粒径大小的纳米基因药物。
9.权利要求1或2所述的基于靶向白细胞介素22的治疗肝损伤的纳米基因药物在制备治疗药物性肝损伤、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、酒精肝或糖尿病药物中的用途。
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