CN102753574A - 用于免疫治疗和抗肿瘤治疗的缀合物和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在受试者体内基于ApoA、白介素15和IL15受体α链的Sushi结构域的组合使用，能够促进先天性免疫应答和获得性免疫应答的组合物，本发明还涉及将所述组合物用于刺激患者的免疫应答的用途，本发明还涉及用于治疗传染性和肿瘤性疾病的方法。

Description

用于免疫治疗和抗肿瘤治疗的缀合物和组合物

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地说，涉及能够促进受试者的先天性免疫应答和获得性免疫应答的组合物的领域。所述组合物可用于治疗需要较大免疫系统活性的疾病，如肿瘤和传染性疾病。

背景技术

白介素15（IL15或IL15）是NK、NKT细胞和CD8记忆T淋巴细胞活性的关键细胞因子，它通过由被称作α、β和γ的三个亚基组成的受体发挥作用。亚基β和γ为IL-2受体所共有。IL15受体的α链为IL15所独有，并且是细胞因子释放到胞外基质中[Duitman，E.H.等，Mol CellBiol，2008.28：4851-61]、将IL15“呈递”给亚基IL15Rβ和IL15Rγ所必须的。

由于免疫系统的刺激特性，该白介素依赖于NK细胞（Suzuki，2001，J.Leuokoc.Biol.，69：531-537）和T细胞（Hazama，1999，Br.J.Cancer.，80：1420-1426，Meazza，2000，Int.J.Cancer，87：574-581和Klebanoff，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2004，101：1969-1974）的存在而具备抗肿瘤特性。IL15还参与了抗病毒感染的保护，以及在免疫接种和树突细胞发育中参与基于T细胞应答的扩增和维持。

因此，IL15可能是有用的治疗剂，可用于治疗与免疫系统相关的疾病。然而，对IL15功能的体内研究受到了阻碍，这部分归因于重组IL15缺乏可用性，以及在通过天然基因表达IL15时观察到的低分泌水平。另外，考虑到这些细胞因子在体内以局部且短暂的方式产生，大部分细胞因子具有极低的血浆半衰期。因此，IL15在体内的使用需要使用较大的剂量，并且要频繁施用，导致了各种副作用，这可能导致癌症患者不能忍受这种治疗。

为了克服以上缺陷，已将IL15与其他治疗剂，如抗-CD40、IL-7或IL-6抗体组合用于抗-肿瘤治疗[Chou，P.C.等，2009，Vet ImmunolImmunopathol，130：25-34；Lin，C.Y.等，Cancer Lett，2008.272（2）：p.285-95；Zhang，M.等，Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：7513-8和Cha，E.等，Breast Cancer Res Treat，2009]。这些组合表现出协同效应，使其能够以较低剂量的IL15获得类似的效果。

提高IL 15活性另一种可能性包括在施用IL 15的同时共同施用包括免疫球蛋白的恒定区和IL 15受体α链的可溶性区域的融合蛋白，这样可以将IL 15活性提高50倍（Rubinstein M.P.等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：9166–71和Stoklasek T.A.等，2006，J.Immunol.；177：6072–80）。

最近，业已证实了由I L15受体α链的氨基末端的1-77位氨基酸形成的多肽（所谓的“Sushi结构域”）是IL15的刺激剂[Mortier，E.等，J BiolChem，2006.281（3）：p.1612-9]。因此，施用包含所述结构域的融合蛋白和IL15表现出的抗癌作用大于施用IL15的抗癌作用，使得B16F10瘤的肺转移减少65%，并且使得植入裸鼠盲肠的HCT-116人类肿瘤的转移瘤数量减少[Bessard，A.等，Mol Cancer Ther，2009.8（9）：p.2736-45]。

另一种改善IL15的效果而又不引起不希望的副作用的替代方案包括对该分子进行修饰，以延长其半衰期。因此，US2006257361描述了包括免疫球蛋白的恒定区和IL15的融合蛋白，施用之后该融合蛋白在血清中的半衰期高于未修饰过的IL15的半衰期。

尽管如此，现有技术中仍然需要IL15的替代剂型，其中，所述蛋白保持其促进免疫应答的活性，而尽可能降低IL15相关的副作用。

发明概述

第一方面，本发明涉及一种组合物，同时或分别包括，

(i)选自以下组的第一组分

(a)包括Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多肽，和

(b)编码Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸，和

(ii)选自以下组的第二组分

(a)IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(b)编码IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸，和

(iii)选自以下组的第三组分

(a)IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(b)IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(c)编码所述IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸。

第二方面，本发明涉及一种融合蛋白，包括

(i)由Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域A，

(ii)由IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域B，和

(iii)由Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域A，

(iv)由IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域B，和

(v)由IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域C。

其他方面，本发明涉及编码本发明的融合蛋白的多核苷酸、包括本发明的多核苷酸的载体或基因构建体、包括本发明的融合蛋白的宿主细胞、本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的基因构建体。

另一方面，本发明涉及一种药物组合物，包括本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。

另一方面，本发明涉及一种促进抗原特异性T-淋巴细胞扩增的体外方法，包括使预先在体内暴露于所述抗原的淋巴细胞群体接触本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的宿主细胞。

另外，本发明涉及将本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的宿主细胞用于药品或用于治疗需要刺激受试者的免疫应答的疾病的用途。

附图说明

图1.hIL15（ng/mL）随时间（h：小时）变化的表达动力学。C57B16小鼠组接受质粒、pApo-hIL15+pSushi、pApo-hIL15、phIL15+pSushi、phIL15、pApo或生理盐水（S）的流体力学注射。在第8、24、96、168和240小时，抽血，并且通过ELISA测定分析hIL15的血清浓度。示出了每组用2-3只动物进行的代表性实验的平均值和平均标准偏差。通过重复测量方差分析对结果进行统计学比较，随后进行Bonferroni检验。在第8和24小时，观察到用pApo-hIL15处理的组与其他组的hIL15水平具有显著性差异（p<0.001）。

图2.通过流体力学注射共同施用pSushi与pApo-hIL15的功能增殖试验。CTLL2细胞在用pApo-hIL15和pApo-hIL15+pSushi处理小鼠24小时之后获得的血清的系列稀释液中培养。在第48h，用增殖指数（c.p.m.）分析氚化胸腺嘧啶整合到CTLL2细胞的情况，观察到用pApo-hIL15和pSushi同时处理过的小鼠血清诱导的增殖高于仅用pApo-hIL15处理的小鼠血清诱导的增殖（p<0.001）。示出了每组4-5只动物的代表性实验的平均值和平均标准偏差。通过重复测量方差分析对结果进行统计学比较。

图3.随着时间推移（t（d），以天计），CD8⁺T细胞相对总脾细胞的总数和百分比的增加情况。C57B 16小鼠组接受不同质粒构建体的流体力学注射，在第3、4、5、6和7天处死小鼠，并取出脾脏。测定CD8⁺T细胞数量（A）、CD8⁺T细胞相对总脾细胞（B）的百分比、CD8⁺CD44⁺记忆T细胞的数量（C）和CD8⁺CD44⁺记忆T细胞相对总脾细胞的百分比（D）。施用质粒pApo-hIL15和pSushi（■）的小鼠组与其他组相比呈现出更多数量的CD8⁺T细胞：pApo-hIL15（□），phIL15+pSushi（▲），phIL15（Δ），pApo（○）和生理盐水赋形剂（*）。示出了每组2只动物的代表性实验的平均值和平均标准偏差。通过重复测量方差分析分析数据，随后进行Bonferroni检验，比较pApo-hIL15+pSushi组和phIL15+pSushi组（*p<0.05；**p<0.001；***p<0.0001）。

图4.随着时间推移（t（d），以天计），CD8⁺T细胞相对于肝脏中总淋巴细胞的百分比的增加情况。对C57B16小鼠流体力学施用不同的构建体。在第3、4、5、6和7天，处死动物并分离肝脏。测定CD8⁺T细胞相对总淋巴细胞的百分比。与其余组相比，施用质粒pApo-hIL15和pSushi（■）的小鼠组表现出较高的CD8⁺T细胞百分比：pApo-hIL15（□），phIL15+pSushi（▲），phIL15（Δ），pApo（○）和生理盐水赋形剂（*）。示出了每组2只动物的代表性实验的平均值和平均标准偏差。通过重复测量方差分析分析数据，随后进行Bonferroni检验，比较pApo-hIL15+pSushi组和phIL15+pSushi组（*p<0.05；**p<0.001；***p<0.0001）。

图5.CD8⁺T细胞相对外周血淋巴细胞的总数和百分比的增加情况。对C57B16小鼠流体力学施用不同的含phIL15的构建体。在第3、4、5和6天抽血，并测定CD8⁺T淋巴细胞（A）和CD8⁺CD44⁺记忆T细胞（B）的百分比，以及效应记忆细胞CD8⁺CD44⁺CD62L^-（C）和中心记忆细胞CD8⁺CD44⁺CD62L⁺（D）的百分比。在所有研究的群体中，接受质粒pApo-hIL15和pSushi（■）的小鼠组相对其他班组表现出较高的CD8⁺T细胞百分比：pApo-hIL15（□），phIL15+pSushi（▲），phIL15（Δ），pApo（●），pSushi

和生理盐水赋形剂（*）。示出了每组3只动物的代表性实验的平均值和平均标准偏差。通过重复测量方差分析分析数据，随后进行Bonferroni检验，比较pApo-hIL15+Sushi组和phIL15+pSushi组（*p<0.05；**p<0.001；***p<0.0001）。

图6.构建体在皮下CT26肿瘤模型中随着时间推移（t（d），以天计）的抗肿瘤癌作用。Balb/c小鼠皮下接受5x10⁵的CT26细胞，并且在3天之后用pApo-hIL15、pApo-hIL15+pSushi、phIL15、phIL15+pSushi、pApo或用生理盐水溶液（S）流体力学处理。每2天用数显测径器测量肿瘤尺寸（以mm²计（A）），观察动物的存活时间（SV%）（B）。观察到与来自其他组的小鼠相比，施用质粒pApo-hIL15和pSushi的小鼠表现出肿瘤生长延迟且小鼠存活率更高。示出了每组8只动物的代表性实验的平均值和平均标准偏差。

图7.质粒在皮下MC38肿瘤模型中随着时间推移（t（d），以天计）的抗肿瘤作用。对C57B16小鼠皮下施用5x10⁵的MC38细胞，并且在6天之后用pApo-hIL15、pApo-hIL15+pSushi、phIL15、phIL15+pSushi、pApo或生理盐水溶液（S）流体力学处理。每2天用数显测径器测量肿瘤尺寸（以mm²计（A）），观察动物的存活时间（SV%）（B）。观察到施用质粒pApo-hIL15和pSushi的小鼠表现出肿瘤生长延迟。示出了代表性实验的平均值和平均标准偏差。

图8.不同质粒在脾内MC38肿瘤模型中的抗转移作用。对C57B16小鼠脾内施用5x10⁵的MC38细胞，并且在次日用pApo-hIL15、pApo-hIL15+pSushi、phIL15、phIL15+pSushi、pApo或生理盐水溶液（S）流体力学处理。19天之后，处死小鼠，并将其分成3组：I，因为肝转移或广泛转移死亡的小鼠；II，在部分肝脏组织中出现转移瘤的小鼠；III，无肝转移瘤的小鼠。示出了代表性实验的数据。

图9.不同质粒在IL15的α受体“敲除”小鼠中的作用。用质粒pApo-hIL15和pSushi、phIL15和pSushi，pApo和pApo-hIL15对缺乏IL15的α受体的四只小鼠流体力学处理。5日后处死动物，提取脾脏，并且通过流式细胞仪（使用CD3标记以便区分）测量NK细胞和CD8⁺T记忆淋巴细胞的脾群体。图中还包括非突变C57B 16小鼠的NK和CD8⁺T记忆群体。示出了研究的小鼠的CD8⁺T淋巴细胞（B）和CD8⁺CD44⁺亚群（C）的NK细胞（A）的百分比。示出了相对总脾细胞的细胞百分比。

图10.脾细胞以及CD8⁺T细胞和NK1.1细胞总数的增加情况。用下列质粒流体力学注射处理C57B16小鼠组：1）pmSushi-mIL15-mApo；2）pApo-hIL15与pSushi（pApo-hIL15+pSushi）组合；3）pApo-hIL15；4）phIL15与pSushi（phIL15+pSushi）组合；5）phIL15和6）pApo。第6天，处死动物，并且提取脾脏。流式细胞仪研究内容包括A）总脾细胞群体；B）CD8⁺T记忆淋巴细胞（CD8⁺CD3⁺）；和C）NK细胞（NK1.1⁺CD3⁺）。与其他组相比，施用pmSushi-mIL15-mApo的小鼠组表现出相对总脾细胞而言更多数量的CD8⁺T细胞。图中示出了每组用2-3只动物进行的代表性实验的平均值和平均标准偏差。通过单因素方差分析分析数据，随后进行Bonferroni检验，比较pmSushi-mIL15-mApo组和注射了编码指示蛋白的质粒的其他组（*p<0.05；**p<0.001；***p<0.0001）。

图11.IL15的人或鼠同种型在增加脾细胞总数和CD8⁺T和NK细胞相对总脾细胞的百分比方面的效果比较。用以下质粒对C57BL/6小鼠组流体力学注射处理：1）pmIL15；2）phIL15；3）pmIL15与pSushi组合；和4）phIL15与pSushi组合。4天之后处死动物，并分离脾脏，统计总脾细胞数（A）、CD8T细胞相对总脾细胞数（B）和NK细胞相对总脾细胞数（C）。图中示出了每组1-2只动物的代表性实验的平均值和平均标准偏差（如果适用的话）。通过Kruskall-Wallis检验分析数据，随后进行Dunn’s多重比较检验。图中示出了mIL15和hIL15以类似的方式促进脾脏中脾细胞和CD8T细胞及NK细胞的数量。

图12.mSushi与mIL15和ApoAI的融合体对脾脏（A）和肝脏（B）中NK细胞的百分比的影响。用以下质粒对C57BL/6小鼠组流体力学注射处理：1）pmSushi-mIL15-mApo，分别以不同的剂量施用：1μg/小鼠，2.5μg/小鼠，和5μg/小鼠；和2）pmSushi-mIL15与pApo组合，二者以相同的三个剂量施用。4天后处死动物，并分离脾脏（A）和肝脏（B），标记NK细胞（NK1.1⁺CD3⁺）。在所有研究的剂量下，与其他组相比，施用质粒pmSushi-mIL15-mApo的小鼠组表现出较高的NK细胞百分比。图中示出了每组用2-3只动物进行的代表性实验的每一个重复和平均值。通过单因素方差分析分析数据。

图13.mSushi与mIL15和ApoAI的融合体在皮下MC38肿瘤模型中的抗肿瘤作用。对C57B16小鼠皮下施用5x10⁵的MC38细胞，并且在8和19天之后用以下质粒流体力学处理：1）pApo；2）pmSushi-mIL15-mApo和3）pApo-hIL15与pSushi（pApo-hIL15+pSushi）组合。每2-3天用数显测径器测量肿瘤尺寸，以mm²计。观察到施用pmSushi-mIL15-mApo的小鼠表现出肿瘤生长延迟。图中示出了每组5-9只动物的代表性实验的平均值和标准偏差。

发明详述

本发明的作者意外地发现，与共同施用IL15和IL15αR-sushi相比，同时施用编码包括与ApoA蛋白融合的IL15的融合蛋白的核酸和IL15受体α链的Sushi结构域（以下称之为IL15αR-sushi）产生了较高的IL15活性。所述较高的活性不仅是在本发明的实施例3中观察到的IL15更高更长的持续循环水平的结果，而且还是诱导CTLL2细胞增殖的能力（本发明的实施例4）、促进脾内CD8T淋巴细胞和CD8T记忆细胞、CD8T肝内淋巴细胞和血液CD8T淋巴细胞增殖的能力（本发明的实施例5）以及在两种实验肿瘤模型中较高的抗肿瘤作用（本发明的实施例7）和抗-转移作用（本发明的实施例8）的结果。

不希望局限于任何理论，据信通过施用与ApoA以融合蛋白形式的IL15所产生的协同效应是IL15作用于能在其表面表达ApoA受体的目标组织的结果，这样，IL15能够在不同组织或补充组织上发挥其作用，迄今为止都是这样认为的。支持该假说的原因在于协同效应同样出现在缺失了编码IL15的α受体的基因的小鼠中。

更意外的是，发现施用编码三元融合蛋白并允许其表达的核酸，所产生的CD8淋巴细胞和NK细胞的增殖，远高于单独施用编码IL15的核酸或与编码IL15αR-sushi的其他核酸组合施用，或单独施用编码ApoA1与IL15的融合蛋白的核酸或与编码IL15αR-sushi的其他核酸组合施用所获得的增殖，所述三元融合蛋白包括融合在IL15和IL15αR-sushi上的ApoA1蛋白的。

本发明的组合物

因此，第一方面，本发明涉及一种组合物，同时或分别包括，

(i)选自以下组的第一组分

(a)包括Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多肽，和

(b)编码Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸，和

(ii)选自以下组的第二组分

(a)IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(b)编码IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸，和

(iii)选自以下组的第三组分

(d)IL15受体的α链的Sushi结构域其与IL15受体的α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(e)编码所述IL15受体的α链的Sushi结构域或其与IL15受体的α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸。

用于本发明的术语“组合物”是指包括所指明的组分的物质的组合物，换言之，即多肽Apo A、IL15和IL15受体α链的Sushi结构域以及不同组分以任意数量直接或间接组合形成的任何其他产物。本领域专业人员可以理解的是，所述组合物能够以单一剂型配制或以每一种组分独立存在的剂型出现，以便它们能够组合以组合制剂的形式联合使用。所述组合物可以是若干组分的试剂盒，其中，每一种组分都是独立配制和包装的。

与多肽无差别地用于本发明的术语“蛋白质”，是指任何长度的氨基酸链，其中，不同的氨基酸通过肽键或二硫键连接在一起。

用于本发明的术语“多核苷酸”，涉及由不同数量单体形成的聚合物，其中，所述单体是核苷酸，包括核糖核苷酸以及脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸包括通过甲基化修饰的单体以及未修饰过的形式。术语“多核苷酸”和“核酸”在本发明中是无差别使用的，并包括mRNA、cDNA和重组多核苷酸。在本发明中，多核苷酸不局限于天然形式的多核苷酸，并且还包括存在非天然核苷酸类似物和非天然核苷酸间键的多核苷酸。这种类型的非天然结构的非限定性例子包括其中的糖不同于核糖的多核苷酸，其中存在3’-5’和2’-5’磷酸二酯键的多核苷酸，其中存在反向键（3’-3’和5’-5’）和分支结构的多核苷酸。另外，本发明的多核苷酸包括非天然核苷酸间键，如肽核酸（PNA），锁定核酸（LNA），膦酸甲酯的C1-C4磷酸烷基酯键，磷酸胺，C1-C6烷基磷酸三酯，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯类型。在任何情况下，本发明的多核苷酸都保持了以类似于天然多核苷酸的方式与目标核酸杂交的能力。

本发明组合物的第一组分

本发明的第一组分选自以下组：Apo A多肽或其功能等效变体和编码Apo A多肽或其功能等效变体的核酸。

用于本发明的术语“ApoA多肽”，涉及Apo A家族的任何成员，它们是形成高密度脂蛋白（HDL）的一部分，并且能够与肝细胞表面上的受体特异性地相互作用，以便确保其将目的分子转运到与上述Apo A蛋白结合的器官的能力。优选地，可用于本发明的Apo A分子选自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-III、ApoA-IV和ApoA-V或其功能等效变体组成的组中。

在一个优选实施方案中，用于本发明的Apo A蛋白是蛋白ApoA-I。在本发明中，ApoA-I被理解为前-原ApoA-I蛋白的成熟形式，它构成了高密度脂蛋白（HDL）的一部分。ApoA-I是作为包含分泌信号序列的前体（前-原ApoA-I）合成的，消除该信号序列，以便为所述前体让路。所述信号序列由18个氨基酸组成，前导肽包括6个氨基酸，且所述蛋白的成熟形式包括243个氨基酸。优选的是所述成熟蛋白形式以缺少所述肽信号形式使用并加工。在一个优选实施方案中，所述ApoA-I蛋白是人源性的，其氨基酸序列参见SEQ ID NO：1（UniProt登录号P02647）。在另一个优选实施方案中，蛋白ApoA-I是鼠源性的，特别是来源于小鼠的，其氨基酸序列参见SEQ ID NO：2（UniProt登录号Q00623）。在另一个优选实施方案中，所述ApoA-1蛋白是鼠源性的，特别是来源于大鼠的，其氨基酸序列参见SEQ ID NO：3（UniProt登录号P04639）。

“ApoA-I的功能等效变体”被理解为表示因上述ApoA-I序列插入、置换或缺失一个或多个氨基酸形成的所有多肽，这些多肽大体上保持了其与所谓的“清道夫受体B类I型”（SR-BI）相互作用的全部能力，形成存在于肝细胞中的HDL受体。与HDL受体相互作用的能力基本上是按照Monaco等描述的方法测定的（EMBO J.，1987，6：3253-3260），或通过研究ApoA-I与肝细胞膜的结合或通过测定ApoA-I或其变体抑制HDL与肝细胞膜的受体结合的能力。优选的是，与肝细胞膜结合的ApoA-I变体的离解常数至少为10^-8M、10^-7M、10^-6M、10^-5M或10^-4M。

用于本发明的ApoA-I变体包括表现出与ApoA-I多肽具有至少70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、或95%相似性或同一性的多肽。两种多肽之间的同一度是利用计算机执行的算法和本领域技术人员众所周知的方法测定的。两个氨基酸序列之间的同一性优选是利用BLASTP算法测定的（BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.，等，J.，1990，Mol.Biol.215：403-410）。

优选的是，用于本发明的ApoA-I变体相对上述ApoA-I而言呈现出长的血清半衰期，使其能够达到的ApoA-I血清水平高于用ApoA-I观察到的水平。测定蛋白，特别是ApoA-I的血清半衰期的方法为本领域所公知，尤其是包括利用基于用标记蛋白进行代谢标记的方法，参见Eisenberg，S.等（J.Lipid Res.，1973，14：446-458），Blum等（J.Clin.Invest.，1977，60：795-807）和Graversen等（J Cardiovasc Pharmacol.，2008，51：170-177）。例如，表现出较长半衰期的变体的例子是被称作Milano的变体（它包括R173C突变）。

本发明的第一组分可以是编码上述ApoA和Apo A变体中至少一个的核酸。因此，对于编码ApoA的核酸来说，它可以是人源性的，对应于NCBI登录号X02162（SEQ ID NO：4）的序列，可以是鼠源性的，对应于NCBI登录号X64262（SEQ ID NO：5）的序列，可以是大鼠源性的，对应于NCBI登录号M00001（SEQ ID NO：6）的序列。

本领域专业人员可以理解的是，形成本发明的第一组分的核酸需要在细胞内表达，并最终分泌到基质中，因此，编码ApoA或其功能等效变体的序列可以在5’末端存在一个编码分泌信号的序列。用于本发明的表述“分泌信号序列”，指的是能够促进所有在其N-末端具有所述序列的蛋白进入细胞分泌途径的氨基酸序列。用于本发明的合适的信号序列包括，尤其是，组织纤溶酶原激活物（tPA）的信号序列，生长激素的信号序列，GM-CSF和免疫球蛋白的信号序列，特别是Igκ或IgVχ的信号序列。优选的是，构成本发明的组分A的一部分的信号序列是上述Apo A本身的信号序列。

另外，本发明的第一组分可以是表现出与上述任何序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%，至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸，其中，所述同一性百分比是利用GAP、BESTFIT或FASTA型算法测定的，其计算机执行方式出现在WisconsinGenetics Software Package Release 7（Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.）中，并且，其利用了Smith和Waterman（Adv.Appl.Math.，1981，2：482）、Needleman和Wunsch（J.Mol..Biol.1970，48：443）或Pearson和Lipman（Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.），1988，85：2444）的局部算法，使用了不同参数的缺省值。

另外，本发明的组合物的第一组分是编码ApoA或其变体的多核苷酸，能够与对应于前述不同哺乳动物的ApoA的任何天然序列特异性地杂交。在本发明中，“能够与目标多核苷酸特异性地杂交的多核苷酸”应理解为表示能够在严格条件下杂交的多核苷酸，严格条件应理解为表示允许两种核酸例如在大约65℃下杂交的条件，在6X SSC溶液，0.5%SDS，5%Denhardt溶液以及浓度为100μg/ml的非特异性变性DNA，以及等价的离子强度的任何溶液，随后在存在例如，0.2%SSC和0.1%SDS溶液和具有等价的离子强度的任何其他溶液的条件下，在65℃温度下洗涤。不过，所述严格条件可以由本领域技术人员根据要杂交的序列的大小、根据GC含量和其他参数进行调整。选择合适杂交条件的合适方法参见Sambrook等，2001（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rdEdition，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York）。

本发明组合物的第二组分

本发明的第二组分选自由L15或其功能等效变体，和编码IL15或其功能等效变体的核酸组成的组中。

用于本发明的术语“IL15”或“IL-15”，是指细胞因子，其分离、克隆和测序参见Grabstein等（US5747024和Grabstein等，1994，Science 246：965-968）。术语IL15包括具有天然IL15的氨基酸序列的任何多肽形式。可用于形成本发明的组合物和融合蛋白一部分的IL15的例子包括，啮齿动物（小鼠、大鼠、仓鼠）、人类、灵长类动物、犬、猫科动物、猪、马、牛和羊等的IL15。可用于形成本发明的组合物和融合蛋白一部分的哺乳动物的IL 15多肽的例子包括，但不局限于，人源性IL15，其氨基酸序列参见P40933（SEQ ID NO：7）；小鼠IL15，其氨基酸序列参见P48346（SEQ ID NO：8），大鼠IL15，其氨基酸序列参见P97604（SEQID NO：9），猫IL15，其氨基酸序列参见O97687（SEQ ID NO：10）和牛IL15，其氨基酸序列参见Q28028（SEQ ID NO：11）。

“I L15的功能等效变体”应理解为表示在IL15的上述任何序列中插入、置换或缺失一个或多个氨基酸所得到的所有多肽，这些多肽基本上完整保留了IL15的至少一种功能，其中，所述功能选自：

-促进CD8⁺T细胞增殖的能力，例如，通过Montes等描述的方法（Clin.Exp.Immunol.，2005，142：292-302），基于在存在IL15的变体的条件下外周血单核细胞群体与抗原肽的培养进行测定，随后测定可以用抗CD8的特异性抗体标记的细胞的百分比，

-在由树突状细胞以反式形式呈递之后促进NK细胞激活的能力。该能力可以通过测量在存在IL15的条件下整合在CD56+NK细胞上的氚化胸腺嘧啶来测定，或通过测量NK细胞分泌的GM-CSF细胞因子来测定。测定IL15的这两种功能的方法参见Carson，W.等（J.Exp.med.，1994，180：1395-1403），巨噬细胞和中性白细胞。

-IL15以B-细胞前体形式抑制Fas-介导的细胞凋亡的能力，参见Demirci等（Cell Mol Immunol.2004，1：123-8.），可以利用诸如TUNEL的测定细胞凋亡的标准技术测定，或通过凝胶电泳和溴化乙锭染色测定DNA裂解。

用于本发明的IL15变体包括表现出与上述哺乳动物的IL15多肽具有至少70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%或95%的相似性或同一性的多肽。两种多肽之间的同一性程度是利用计算机执行的算法和本领域技术人员众所周知的方法测定的。两个氨基酸序列之间的同一性优选是利用BLASTP算法测定的（BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBINLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.等，J.，1990，Mol.Biol.215：403-410）。

本发明的第二组分可以是编码上述天然IL15和IL15的变体中至少一种的核酸。编码哺乳动物IL15的核酸可以从核酸库中回收，并且包括，但不局限于，其序列如登录号U14407（人，SEQ ID NO：12）、U14332（小鼠，SEQ ID NO：13）、U69272（大鼠，SEQ ID NO：14）、AF 108148（猫，SEQ ID NO：15）和U42433（牛，SEQ ID NO：16）所定义的多核苷酸。

所述多核苷酸包括与上述任何序列表现出至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多核苷酸，其中，所述同一性百分比是利用上述算法之一测定的。

可替代地，形成本发明的第二组分的多核苷酸是能够与前述多核苷酸特异性杂交的多核苷酸。测定一种多核苷酸与目标序列特异性杂交的能力的方法也已在说明本发明的第一组分时详细披露。

本领域专业人员可以理解的是，可以发现形成本发明的第二组分的核酸可操作地与信号序列连接，使得IL15或功能等效变体能够分泌到基质中。适用于本发明使用的信号序列包括在说明本发明的第一组分时所提到的序列。优选的是，形成本发明组合物的第二组分部分的信号序列是前述IL15本身的信号序列，或免疫球蛋白之一，特别是Igκ或IgVχ的信号序列。

本发明组合物的第三组分

本发明的第三组分选自由IL15受体α链的Sushi结构域或其功能等效变体组成的组中。

用于本发明的表述“IL15受体α链的Sushi结构域”（以下称之为IL15Rα-sushi），是指出现在IL15受体α链的细胞外区域的氨基酸序列，对应于起始于出现在IL15受体α链基因的第一个外显子中的第一个半胱氨酸的序列，并终止于由IL15受体α链基因的外显子4编码的半胱氨酸的序列。可替代地，所述Sushi结构域被定义为起始于信号序列之后IL15受体α链的第一个半胱氨酸残基，并且终止于上述序列中位于信号序列之后的第四个半胱氨酸残基的序列。用于本发明的合适的Sushi结构域包括来自于人源性IL15受体α链的Sushi结构域，对应于UniProt登录号NP_002180所示序列，并且，其Sushi结构域对应于以下序列

CPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTSSLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKC（SEQ ID NO：17）

和来自于小鼠IL15受体α链的Sushi结构域，对应于Swiss-Prot登录号Q60819序列，并且，其Sushi结构域对应于以下序列

CPPPV SIEHADIRVK NYSVNSRERYV CNSGF KRKA GTSTLIECVINKNTNVAHWT TPSLKC（SEQ ID NO：18）；

“IL15受体α链的Sushi结构域的功能等效变体”应理解为表示通过在前述人源性或鼠Sushi结构域的任何序列上插入、置换或缺失一个或多个氨基酸所得到的所有多肽，并且，所述多肽基本上完整保留了其与IL15结合的能力，并提高了IL15在表达低亲和力IL15受体的细胞中（例如，来自Mo-7e或32Dβ细胞系的细胞）的增殖效果，参见Mortier等（J.Biol.Chem.，2006，281：1612-1619）。

用于本发明的IL15Rα-sushi的变体包括表现出与上述多肽具有至少70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、或95%序列相似性或同一性的多肽。两种多肽之间的同一性程度是利用计算机执行的算法和本领域技术人员众所周知的方法测定的。两个氨基酸序列之间的同一性优选是利用BLASTP算法测定的（BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLMNIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.等，J.，1990，Mol.Biol.215：403-410）。

本发明的第三组分可以是编码前述IL15受体α链、天然IL15受体α链或其变体的Sushi结构域中至少一种的核酸。编码哺乳动物IL15Rα-sushi的核酸可以从存在于核酸库中的相应的α链的序列中回收，包括，但不局限于，编码人IL15受体α链的IL15Rα-sushi的序列（NCBI登录号对应于U31628，SEQ ID NO：19）和小鼠IL15受体α链的IL15Rα-sushi的序列（NCBI登录：U22339，SEQ ID NO：20）。

所述多核苷酸包括与上述序列表现出具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性的多核苷酸，其中，所述同一性百分比利用前述任意算法测定。

可替代地，形成本发明的第三组分的多核苷酸是能够与上述多核苷酸特异性杂交的多核苷酸。测定多核苷酸与目标序列特异性杂交能力的方法已在说明本发明的第一组分时详细披露。

本领域专业人员可以理解的是，形成本发明的第二组分的核酸能够可操作地与信号序列连接，使Sushi结构域或其功能等效变体能够分泌到基质中。适用于本发明的信号序列包括上文在说明本发明组合物的第一组分时所披露的序列。优选的是，形成本发明组合物的第二组分一部分的信号序列是前述IL15受体α链本身的信号序列或免疫球蛋白之一，特别是Igκ或IgVχ的信号序列。

在一个优选实施方案中，本发明的组合物的第三组分是包括或由SEQ ID NO：21所示序列组成的多核苷酸，它所编码的多肽包括人IL15RA受体的Sushi结构域，其前面是它自身的信号肽（SEQ ID NO：22）。

本发明的组合物可以由来自不同物种的多肽或多核苷酸构成。尽管如此，在一个优选实施方案中，三种组分来自相同的动物物种。在一个优选实施方案中，三种组分是人源性的。在另一个优选实施方案中，三种组分是鼠源性的。

第一和第二组分形成单分子的组合物

本发明的作者已发现，当本发明的组合物的第一种和第二组分构成单分子的一部分时，它能够在IL15的抗癌活性方面获得协同效应。在这种情况下，本发明的组合物是由第一组分和第二组分形成的二元组合物，所述第一组分又包括上述第一和第二组分，而第二组分对应于上述第三组分。本领域专业人员可以理解的是，如果所述组合物的第一和第二组分是多肽，所述单分子是包括（i）Apo A多肽或其功能等效变体，和（ii）IL15或其功能等效变体的融合蛋白。

用于本发明的术语“融合蛋白”，指的是包括来自不同的蛋白或异种蛋白的两个或两个以上区域的多肽。

可替换地，当所述组合物的所述第一和第二组分均为多核苷酸时，所述单分子是编码融合蛋白的多核苷酸，该融合蛋白包括（i）包括Apo A多肽或其功能等效变体的多肽，和（ii）IL15或其功能等效变体。

在这种情况下，当第一组分和第二组分是肽类时，本发明涉及一种组合物，其中，所述第一组分位于相对所述第二组分的N-末端位置，并且涉及一种组合物，其中，所述第一组分位于相对所述第二组分的C-末端位置。

当所述第一组分和第二组分为多核苷酸类时，本发明涉及一种组合物，其中，所述第一组分位于相对所述第二组分的5’位置，并且涉及一种组合物，其中，所述第一组分位于相对所述第二组分的3’位置。

在这两种情况下，所述第一组分和第二组分可以直接结合，换言之，所述第一组分的C-末端与所述第二组分的N-末端结合，或所述第二组分的C-末端与所述第一组分的N-末端结合，或所述第一组分的3’末端与所述第二组分的5’末端结合，以及所述第二组分的3’末端与所述第一组分的5’末端结合的组合物。

可替代地，另一方面，本发明涉一种及组合物，其中，所述第一组分和第二组分的融合是通过肽接头（此时，所述第一组分和第二组分是多肽类）或通过编码肽接头的序列（此时，所述第一组分和第二组分是多核苷酸类）实现的。

用于本发明的术语“肽接头”，“接头”，“连接体”，“间隔基”或其语法同义词，是指将两个分子连接在一起的分子，并且通常允许连接的分子获得有功能的构型。所述肽接头优选包括至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或大约100个氨基酸。

适用于本发明的接头包括：

-包括2个氨基酸或更多个选自以下组的氨基酸的接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸，例如，但不局限于序列SGGTSGSTSGTGST（SEQ ID NO：23），AGSSTGSSTGPGSTT（SEQ ID NO：24），GGSGGAP（SEQ ID NO：25）和GGGVEGGG（SEQ ID NO：26）的接头，参见Muller，K.M.等（Methods.Enzimology，2000，328：261-281）。

-基于形成四连接素上的β折叠的四连接素的53-56位残基，和形成四连接素上的转角的57-59位残基的接头（Nielsen，B.B.等，FEBS Lett.412：388-396，1997），如序列GTKVHMK（SEQ ID NO：27）的接头，

-基于人纤连蛋白的接头折叠3的子序列的接头，对应于1992-2102位氨基酸，如，接头PGTSGQQPSVGQQ（SEQ ID NO：28）对应于2037-2049位氨基酸，并且，更优选其中的子序列片段GTSGQ（SEQ IDNO：29）对应于2038-2042位氨基酸的残基，

-基于鼠IgG3的上游铰链区域氨基酸的10个残基的序列的接头，如序列PKPSTPPGSS（SEQ ID NO：30）的接头，它业已被用于通过卷曲螺旋生产二聚体抗体（Pack P.和Pluckthun，A.，1992，Biochemistry31：1579-1584），

-序列APAETKAEPMT（SEQ ID NO：31）的肽接头

-序列GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ（SEQ ID NO：32）的肽接头

-序列GAP的肽接头。

另外，本发明缀合物的两种组分可以通过其序列包括蛋白酶的裂解目标的肽连接，以便ApoA-I能够与组分（ii）分离。适合整合在本发明的多肽中的蛋白酶切割位点包括肠激酶（切割位点DDDDK SEQ ID NO：33），Xa因子（切割位点IEDGR，SEQ ID NO：34），凝血酶（切割位点LVPRGS，SEQ ID NO：35），TEV蛋白酶（切割位点ENLYFQG，SEQ ID NO：36），前切割蛋白酶（切割位点LEVLFQGP，SEQ ID NO：37）和内含肽等。在一个优选实施方案中，所述切割位点是在肿瘤组织，炎性组织或肝脏中表达的蛋白酶，其表达方式为一旦所述缀合物到达肝脏，Apo A和组分（ii）就发生分离。在一个优选实施方案中，所述接头包括基质金属蛋白酶9识别位点（切割位点LFPTS，SEQ ID NO：38）。

尽管已结合来自第一组分和第二组分的融合体（Apo A与IL15的融合蛋白）的两种组分、并且第三组分（IL15受体α链的Sushi结构域）是以核酸形式使用的组合物对本发明进行了说明，但本发明并不局限于其中两种组分都是核酸的组合物，作为替代，本发明涉及其中的第一和/或第二组分是多肽的组合物。因此，本发明涉及通过以下方法形成的组合物：

-包括由Apo A和IL15形成的融合蛋白的多肽和包括IL15受体α链的Sushi结构域的多肽。

-包括由Apo A和IL15形成的融合蛋白的多肽和编码包括IL15受体α链的Sushi结构域的多肽的多核苷酸。

-编码包括由Apo A和IL15形成的融合蛋白的多肽的多核苷酸和包括the IL15受体α链的Sushi结构域的多肽。

-编码包括由Apo A和IL15形成的融合蛋白的多肽的多核苷酸和编码包括IL15受体α链的Sushi结构域的多肽的多核苷酸。

本发明的组合物的组分形成部分组合物的比例取决于用于每一种特定情况的第一组分和第二组分的诱导剂，以及所需的用途。因此，本发明涉及一种组合物，其中，所述两种组分用量之间的比例范围为50：1至1：50，特别是20：1至1：20、1：10至10：1或5：1至1：5。

对于其中的第一组分和第二组分形成单分子的组合物来说，所述每一种组分可来自不同的物种，尽管优选的是来自相同的物种的组分形成单分子的一部分。因此，在一个优选实施方案中，Apo A或与其功能等效的变体是人源性的，并且IL15或与其功能等效的变体是人源性的。在另一个优选实施方案中，Apo A或与其功能等效的变体是鼠源性的，并且IL15或与其功能等效的变体是鼠源性的。

在一个优选实施方案中，形成所述组合物的第一组分的单分子是由人源性ApoAI多肽和人源性IL15形成的，由呈递GAP序列的接头分隔开。编码所述融合体的多核苷酸是本发明中以SEQ ID NO：39形式出现的序列。

在另一个优选实施方案中，形成所述组合物的第一组分的单分子是由鼠源性ApoAI多肽和人源性IL15形成的，由呈递GAP序列的接头分隔开。编码所述融合体的多核苷酸是本发明中以SEQ ID NO：40形式出现的序列。

在另一个优选实施方案中，形成所述组合物的第一组分的单分子是由鼠源性ApoAI多肽和鼠源性IL15形成的，由呈递GAP序列的接头分隔开。编码所述融合体的多核苷酸是本发明中以SEQ ID NO：41形式出现的序列。

包括IL15受体α链的Sushi结构域或与其功能等效变体的多肽可以是人源性或鼠源性的。尽管如此，如果形成所述单分子的组分都是人源性的，优选所述IL15受体α链的Sushi结构域或其功能等效变体也是人源性的。另外，如果形成所述单分子的组分都是鼠源性的，优选所述IL15受体α链的Sushi结构域或其功能等效变体也是鼠源性的。

另一方面，本发明涉及包括ApoA或其功能等效变体，和IL15或其功能等效变体的融合蛋白。术语“ApoA”、“IL15”、“ApoA的功能等效变体”、“IL15的功能等效变体”已在上文做过详细解释，并且，基本上以与所述融合蛋白相同的方式使用。

所述融合蛋白可以使多肽ApoA出现在相对IL-15的N-末端位置，或使多肽IL-15出现在相对Apo A的N-末端位置。类似的，两种组分直接结合或通过接头结合，所述接头可以是本发明提到过的任何接头。同样地，所述组分可以是人源性或鼠源性的，使得本发明涉及人源性ApoA和IL15的融合体，鼠源性ApoA和IL15的融合体，以及其中的ApoA是人源性的而IL15是鼠源性的ApoA和IL15的融合体和其中的ApoA是鼠源性的而IL15是人源性的ApoA和IL15的融合体。

在本发明的优选实施方案中，Apo A和IL15的融合蛋白对应于具有SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示序列的多肽。

本发明的融合蛋白

另一方面，本发明涉及融合蛋白，包括

(i)由Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域A，

(ii)由IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域B，和

(iii)由IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域C。

基本上与本发明组合物的第一组分一致的融合蛋白的区域A，意味着上文已对其做过详细说明。

基本上与本发明组合物的第二组分一致的融合蛋白的区域B，意味着上文已对其做过详细说明。

基本上与本发明组合物的第三组分一致的融合蛋白的区域C，意味着上文已对其做过详细说明。

本领域专业人员可以理解的是，本发明的融合蛋白可以是区域A，B和C的不同排列。因此，本发明涉及：

-一种融合蛋白，其中，区域A位于N-末端位置，区域B位于中心位置，而区域C位于C-末端位置，

-一种融合蛋白，其中，区域A位于N-末端位置，区域C位于中心位置，而区域B位于C-末端位置，

-一种融合蛋白，其中，区域B位于N-末端位置，区域A位于中心位置，而区域C位于C-末端位置，

-一种融合蛋白，其中，区域B位于N-末端位置，区域C位于中心位置，而区域A位于C-末端位置，

-一种融合蛋白，其中，区域C位于N-末端位置，区域A位于中心位置，而区域B位于C-末端位置，和

-一种融合蛋白，其中，区域C位于N-末端位置，区域B位于中心位置，而区域A位于C-末端位置。

另外，区域A，B和/或C可以直接结合，换言之，其中，一个区域的C-末端氨基酸通过肽键与另一个区域的N-末端氨基酸结合。可替代地，不同的区域通过肽接头结合。适用于本发明的融合蛋白的接头基本上与上文已详细说明的用于本发明的组合物的接头相同。本领域专业人员可以理解的是，根据三个区域中仅有两个通过接头结合在一起还是三个区域都通过接头结合在一起，所述融合蛋白可以包括一个或两个肽接头。

在一个优选实施方案中，所述融合蛋白是C-B-A-型排列，换言之，其包括沿N-到C末端方向包括IL15Rα的Sushi结构域（区域C）、IL15（区域B）和ApoAI（区域A）。在一个更优选的实施方案中，区域C和B由GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ（SEQ ID NO：32）型接头隔开。在另一个实施方案中，区域B和A由GAP-型接头隔开。在一个更优选的实施方案中，区域C和B由GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ（SEQ ID NO：32）型接头隔开，而区域B和A由GAP-型接头隔开。

尽管本发明的融合蛋白是以其中的区域A、B和C为鼠源性的融合蛋白为例进行说明的，本领域专业人员可以理解的是本发明涉及其中区域A、B和C中的每一个具有不同来源的融合蛋白，来自上述区域的不同变体。

因此，在一个优选实施方案中，所述融合蛋白包括人源性或鼠源性的区域A，人源性或鼠源性的区域B，人源性或鼠源性的区域C。在一个更优选的实施方案中，所述三个区域来自相同的生物。因此，在一个更优选的实施方案中，区域A、B和C是鼠源性的。在另一个优选实施方案中，区域A、B和C是人源性的。

在一个优选实施方案中，所述融合蛋白是C-B-A型排列，其中，所述三种组分都是人源性的，并且，其中，区域C和B以及区域B和A均通过肽键结合。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白沿N-到C-末端方向包括，人IL15Rα的Sushi结构域（区域C），人IL15（区域B）和人ApoAI（区域A）。在一个更优选的实施方案中，区域C和B通过GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型接头隔开。在另一个实施方案中，区域B和A通过GAP-型接头隔开。在一个更优选的实施方案中，区域C和B通过GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型接头隔开，而区域B和A通过GAP-型接头隔开。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白包括SEQ ID NO：42所示序列。

在另一个优选实施方案中，所述融合蛋白沿N-到C末端方向包括鼠IL15Rα的Sushi结构域（区域C），鼠IL15（区域B）和鼠ApoAI（区域A）。在一个更优选的实施方案中，区域C和B通过GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型接头隔开。在另一个实施方案中，区域B和A通过GAP-型接头隔开。在一个更优选的实施方案中，区域C和B通过GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ型接头隔开，而区域B和A通过GAP-型接头隔开。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白包括SEQ ID NO：43所示序列。

本发明的多核苷酸、基因构建体、载体和宿主细胞

另一方面，本发明涉及编码本发明融合蛋白的多核苷酸。考虑到本发明的融合蛋白在胞外基质发挥其功能，优选的是，编码本发明的融合蛋白的多核苷酸具有信号序列，它使得所述融合蛋白可以进入分泌通道，并且所述融合蛋白可分泌到基质中。适合与所述融合蛋白一起使用的信号序列包括所述任何融合蛋白组分的信号序列（Apo A的信号序列，IL15的信号序列或IL15受体α链的信号序列）或上文说明本发明组合物的第一组分时提到的任何信号序列，换言之，合适的信号序列是组织纤溶酶原激活物（tPA）、生长激素、GM-CSF和免疫球蛋白、特别是Igκ或IgVχ的信号序列。

在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸包括被称为SEQ ID NO：44的序列，编码包括人源性Sushi结构域、人源性IL15和人源性ApoA1的融合蛋白或缀合物，其中所述Sushi结构域和IL15通过序列为GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ的接头隔开，其中IL15和ApoA1通过序列为GAP的接头隔开，并且，其中所述融合体的前面是人源性IL-15受体α链的信号序列。

在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸包括被称为SEQ ID NO：45的序列，编码包括鼠源性Sushi结构域、鼠源性IL15和鼠源性ApoA1的融合蛋白或缀合物，其中所述Sushi结构域和IL15通过序列为GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ的接头隔开，其中IL15和ApoA1通过序列为GAP的接头隔开，并且，其中所述融合体的前面是鼠源性IL-15受体α链的信号序列。

编码本发明的融合蛋白的多核苷酸能够可操作地与表达调控区结合，以便形成基因构建体。因此，另一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸的基因构建体。优选的是，所述构建体包括本发明的多核苷酸，它受能调控本发明的多核苷酸表达的序列操作控制。本领域专业人员可以理解的是，本发明的多核苷酸必须进入目标组织的细胞核，并且在这里转录和翻译，以便形成具有生物学活性的融合蛋白。

原则上讲，任何启动子都可用于本发明的基因构建体，只要所述启动子与表达所述多核苷酸的细胞兼容。因此，适用于实施本发明的启动子包括，但不局限于，组成型启动子，如来自真核生物病毒（如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽肉瘤病毒、乙型肝炎病毒）基因组的启动子，金属硫蛋白基因启动子，单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因启动子，逆转录酶病毒的LTR区域，免疫球蛋白基因启动子，肌动蛋白基因启动子，EF-1α基因启动子以及诱导性启动子，其中，所述蛋白的表达取决于分子或外源信号的添加，如四环素系统，NFκB/UV光照系统，Cre/Lox系统和热休克基因启动子，披露于WO/2006/135436的RNA聚合酶II的可调控启动子以及特异性组织启动子。

本发明的多核苷酸或包括它们的基因构建体可构成载体的一部分。因此，另一方面，本发明涉及一种载体，它包括多核苷酸或本发明的基因构建体。本领域专业人员可以理解的是可以使用的载体类型不受限制，因为所述载体可以是适合增殖并且适合获得合适的多核苷酸或基因构建体的克隆载体，或适合纯化所述缀合物的不同的异种生物中的表达载体。因此，根据本发明的合适的载体包括原核生物表达载体，如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColEl、pCRl、RP4、噬菌体和“穿梭”载体（如pSA3和pAT28）、酵母中的表达载体（如2-微米质粒-型载体、整合质粒、YEP载体和着丝粒质粒等）、昆虫细胞中的表达载体（如pAC-系列和pVL-系列载体）、植物中的表达载体（如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体等）、和基于病毒载体（腺病毒、与腺病毒相关的病毒以及逆转录酶病毒和慢病毒）的高等真核细胞中的表达载体、以及非-病毒载体（如pSilencer 4.1-CMV（Ambion）、pcDNA3、pcDNA3.1/潮霉素、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/组氨酸、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-组氨酸、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl）。

本发明的载体可用于转化、转染或感染容易被所述载体转化、转染或感染的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。举例来说，导入了所述DNA序列的载体可以是这样一种质粒或载体，它在导入宿主细胞之后，整合在所述细胞的基因组中，并且与整合了它的染色体（或染色体组）一起复制。所述载体可以通过本领域技术人员公知的方法获得（Sambrook等，2001，如上文所述）。

因此，另一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸、基因构建体或载体的细胞，因此，可以用本发明提供的构建体或载体转化、转染或感染所述细胞。转化、转染或感染的细胞可以通过本领域专业人员公知的方法获得（Sambrook等，2001，如上文所述）。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是用合适的载体转染或感染的动物细胞。

适合表达本发明的缀合物的宿主细胞包括，但不局限于，哺乳动物、植物、昆虫、真菌和细菌细胞。细菌细胞包括，但不局限于，革兰氏阳性菌[如芽孢杆菌属（Bacillus），链霉菌属（Streptomyces）和葡萄球菌属（Staphylococcus）细胞，以及革兰氏阴性菌（如埃希氏菌属（Escherichia）和假单胞菌属（Pseudomonas））细胞。优选的是，真菌细胞包括酵母[如酵母属（Saccharomyces），毕赤酵母（Pichia pastoris）和多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha））细胞。昆虫细胞包括，但不局限于果蝇细胞和Sf9细胞。植物细胞尤其包括来自作物诸如谷类植物、药用植物或观赏植物或球茎的细胞。适用于本发明的哺乳动物细胞包括上皮细胞系（猪等）、骨肉瘤细胞系（人等）、成神经细胞瘤细胞系（人等）、上皮癌（人等）、神经胶质细胞（鼠等）、肝细胞系（猴子等）、CHO细胞（中国仓鼠卵巢）、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞、911、AT1080、A549、293或PER.C6、人ECCs NTERA-2细胞、mESCs细胞系的D3细胞、人胚胎干细胞如HS293和BGV01、SHEF1、SHEF2以及HS181、NIH3T3细胞、293T、REH和MCF-7和hMSCs细胞。

本发明的体外方法

业已披露了IL15能促进抗原-致敏化T淋巴细胞增殖。因此，据证明让预先暴露于确定抗原的分离的淋巴细胞群体与IL15接触可导致淋巴细胞增殖增强。该扩增的淋巴细胞群体可用于获得性免疫治疗，以便随后再将其施用于获得所述原始群体的患者。因此，另一方面，本发明涉及一种用于促进抗原特异性T淋巴细胞扩增的体外方法，包括让预先暴露于所述抗原的淋巴细胞群体接触本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的基因构建体或本发明的宿主细胞。

术语“扩增”与增殖无差别别地用于本发明中，并且必须被理解为细胞分裂或细胞生长。所述扩增可以用众所周知的方法测定，例如，文献Transplantation（1999）67：605-613中披露的方法。

用于本发明的表述“抗原特异性T淋巴细胞”是指能够识别特异性抗原的淋巴细胞群体。通常，淋巴细胞是从暴露于所述抗原的患者体内分离的。另外，所述抗原可以与人工抗原-呈递系统中的淋巴细胞群体接触，参见美国专利US6828150或US6787154。

用于本发明的术语“抗原”是指能够在不耐受所述抗原的受试者体内引起免疫应答的任何物质。所述抗原可来自所述受试者本身，此时，所述抗原是自体抗原（换言之，来自相同物种的个体的抗原），或者可以是异体抗原。另外，所述抗原可以是异种抗原，换言之，来自不同物种的个体的抗原。

可用于本发明方法的淋巴细胞包括，但不局限于，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、T辅助细胞、淋巴因子-激活细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TILS）、NK细胞、幼稚细胞、记忆细胞、γδT细胞、NKT细胞以及包括可变数量的一种或多种上述细胞的细胞群体。在一个优选实施方案中，所述淋巴细胞是CTL。用于获得CTLs以便随后利用本发明的方法体外扩增的合适的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括，但不局限于，从外周血、脐带血、含有淋巴细胞的组织中分离。在一个优选实施方案中，所述淋巴细胞是通过从患有特定疾病的患者的淋巴结中引流获得的。

一旦分离到了淋巴细胞，即可让其在合适条件下与本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的基因构建体或本发明的宿主细胞接触，以便进行淋巴细胞扩增。用于抗原特异性CTL扩增的基本条件可以按照众所周知的方法确定[例如，Carter J.等，Immunology，57（1），123-129，（1996）]，并且可以有本领域技术人员进行常规优化。通常，淋巴细胞与本发明的组合物、融合蛋白、多核苷酸、载体、基因构建体或宿主细胞的接触是通过在适合所述细胞的培养基中培养所述淋巴细胞实现的。所述细胞可以在常规条件下在适合淋巴细胞生长的培养基中培养，所述培养基包括最小基本培养基或RPMI 1640培养基。为了促进细胞生长，可以添加必须的增殖因子和活力因子，包括血清，例如，胎牛血清或人血清和抗生素，例如，青霉素、链霉素。所述淋巴细胞在支持生长的必要条件下培养，例如，在37℃的合适温度和气氛中，例如，空气加上5%CO₂。

在一个优选实施方案中，所述淋巴细胞在进行刺激之前可以用本发明的化合物处理，以促进其体外激活，所述处理是让所述淋巴细胞与它们的特异性抗原接触。对于患有产生免疫抑制物质的肿瘤的患者来说，这是尤为必要的。为此，必须用合适的抗原刺激所述淋巴细胞的培养。通常，抗原是以如下方式呈递给T细胞：T细胞中的信号是通过TCR/CD3复合物启动的。优选的是，抗原可以通过抗原-呈递细胞呈递给T细胞。

用于本发明的表述“抗原-呈递细胞”是指有助于通过将抗原呈递给T淋巴细胞而产生免疫应答的细胞。抗原-呈递细胞包括树突状细胞、单核吞噬细胞、B淋巴细胞或朗氏细胞。例如，抗原-呈递细胞可以从骨髓、血液、胸腺、表皮、肝或胎儿肝脏中分离。

当抗原为肿瘤抗原时，可以利用自体肿瘤和/或重组肿瘤抗原的提取物。当抗原来自病原体时，扩增之前的淋巴细胞激活可以利用病原体-感染的细胞完成，例如，病原体的病毒呈递抗原。

在本发明的抗原特异性CTL扩增方法中，用本发明的组合物、融合蛋白处理细胞优选在存在抗-CD3抗体，优选的是，存在人单克隆抗-CD3抗体，更优选存在OKT3的条件下进行。扩增过程中抗-CD3抗体的浓度没有特别限制，例如，0.001-100mg/mL，更优选0.01-100mg/mL。作为补充或替代，细胞可以与抗-CD28抗体，更优选与人单克隆抗-CD28抗体共培养。作为补充或替代，细胞可以与淋巴细胞-刺激因子，如凝集素共培养。另外，可以将所述组分的一种或多种固定在固相上。

同样地，在扩增本发明的抗原特异性CTLs的方法中，根据情况所述细胞可以与饲养细胞共培养。原则上，可以使用的饲养细胞的类型不受限制，只要所述饲养细胞在促进CTL-增殖的能力方面与本发明的蛋白或组合物或与上文提到过的试剂协同作用即可。优选地，合适的饲养细胞包括，但不局限于外周血单核细胞（PBMCs）和自体或非-自体EBV-B细胞。通常，一旦要消除饲养细胞的增殖能力，就对其进行处理，优选通过X-射线或细胞毒性剂，如丝裂霉素进行处理。

通过本发明的方法获得的所述淋巴细胞群体的细胞毒性可以用众所周知的方法测定。例如，可以测定淋巴细胞激发标记的目标细胞裂解的能力，以及测定标记物质的释放。可替代地，细胞毒性活性可以通过鉴别由淋巴细胞或目标细胞产生的细胞因子（例如，GM-CSF和IFN-γ）水平测定。另外，细胞毒性可以通过以下方法测定：让所述淋巴细胞接触用第一种荧光分子标记的细胞毒性淋巴细胞的抗体，并用第二种荧光分子标记的由抗原肽与主要组织兼容性复合物形成的配合物，然后通过流式细胞计量术检测用这两种分子标记的细胞。

通过本发明的方法扩增的淋巴细胞群体特别适用于获得性免疫治疗，换言之，特别适用于再施用于需要针对特异性抗原的较高免疫应答的受试者。优选的是，T淋巴细胞是自体使用的，换言之，被再施用于最初提取这些细胞的受试者。

本发明的药用组合物

本发明的组合物、多核苷酸和融合蛋白对于治疗需要持久剂量IL15的疾病是有效的。因此，另一方面，本发明涉及一种药物制剂，其包括治疗有效量的本发明的组合物、融合蛋白、多核苷酸、基因构建体、载体或宿主细胞和药学上可接受的赋形剂或赋形剂。

用于本发明的优选的赋形剂包括糖，淀粉、纤维素、树胶和蛋白质。在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物被制成固体药物剂型本发明的药用组合物是以作为固体施用的药物形式制备的（例如片剂、胶囊、锭剂、颗粒、栓剂、结晶或能够可被再造为液体形式的无定型无菌固体等），液体药物剂型（例如溶液、悬浮液、乳剂、酏剂、洗液、软膏等）或半固体药物剂型（凝胶剂、油膏和霜剂等）。本发明的药用组合物可以通过任何途径施用，包括，但不限于，口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠途径。活性成分组分施用的不同形式的改进，可以使用的赋形剂及其生产方法可以参见：Tratado de Farmacia Galénica，C.FaulíiTrillo，Luzán 5，S.A.de Ediciones，1993和in Remington’s PharmaceuticalSciences（A.R.Gennaro，Ed.），20^th edition，Williams & Wilkins PA，USA（2000）。药学上可接受的载体的例子在现有技术中是公知的，并且，包括磷酸盐缓冲的盐溶液、水、乳浊液、如油/水乳浊液、不同类型的湿润剂、无菌溶液等。包括所述赋形剂的组合物可以通过现有技术中公知的常规方法制备。

可替代地，本发明的组合物和化合物可以制备成纳米脂颗粒，在一种情况下，所述组合物包括ApoA蛋白或ApoA和第二组分（IL15或IL15受体α链的Sushi结构域）的融合体，或在另一种情况下，本发明涉及包括Apo A、IL15和IL15RA的Sushi结构域的融合蛋白。纳米脂颗粒的制备是基于ApoA是高密度脂蛋白（HDL）的主要组分。

在本发明中，术语“纳米脂颗粒”等同于术语“脂蛋白”或“脂蛋白颗粒”，这些术语可无差别地使用。纳米脂颗粒被理解为表示由非极性类脂（如酯化胆固醇和甘油三酯）核心形成的任何水溶性颗粒，外部由脱辅基蛋白、磷脂和游离的胆固醇覆盖的极性层。

纳米脂颗粒或脂蛋白按照其密度分类为乳糜微粒，极低密度脂蛋白（VLDs），中等密度脂蛋白（IDLs），低密度脂蛋白（LDLs）和高密度脂蛋白（HDLs）。不同脂蛋白的特征如表1所示。

表1

在一个更具体的实施方案中，纳米脂颗粒是HDL-型脂蛋白，其特征在于组合物可以以上表中所示形式，并且形成蛋白部分的载脂蛋白是Apo A、Apo C、Apo D和Apo E。

纳米脂颗粒可以提供本领域技术人员公知的常规方法获得。例如，纳米脂颗粒可以通过按照Lerch等（Vox Sang，1996，71：155-164）披露的方法在体外在融合蛋白上添加胆固醇和磷脂酰胆碱来获得，或在体内通过使用能在肝脏表达本发明缀合物的非-人动物来获得，以便形成被分泌到血清中的纳米脂颗粒，这些纳米脂颗粒可以从血清中分离。

当本发明的药物组合物包括核酸（本发明的多核苷酸、载体或基因构建体）时，本发明涉及用于施用所述核酸的特制的药物组合物。所述药物组合物可以包括裸露形式的所述核酸，换言之，没有保护所述核酸免受生物核酸酶降解的化合物，其优点在于消除了与用于转染的试剂相关的毒性。裸露化合物的合适的给药途径包括血管内、瘤内、颅内、腹膜内、脾内、肌肉内、视网膜下、皮下、粘膜、局部和口腔途径（Templeton，2002，DNA Cell Biol.，21：857-867）。可替代地，核酸能够以形成部分脂的形式施用，与胆固醇缀合或与能够促进通过细胞膜的转运的化合物缀合，如源于HIV-1的TAT蛋白的Tat肽，果蝇触角蛋白的同源异型结构域的第三个螺旋、单纯疱疹病毒的VP22蛋白、精氨酸的寡聚体以及WO07069090所描述的那些肽（Lindgren，A.等，2000，Trends Pharmacol.Sci，21：99-103，Schwarze，S.R.等，2000，Trends Pharmacol.Sci.，21：45-48，Lundberg，M等，2003，Mol.Therapy 8：143-150和Snyder，E.L.和Dowdy，S.F.，2004，Pharm.Res.21：389-393）。另外，多核苷酸能够以形成部分质粒载体或病毒载体的形式施用，优选基于腺病毒、腺相关病毒或逆转录酶病毒载体的载体，如基于鼠白血病病毒（MLV）或慢病毒（HIV、FIV、EIAV）的病毒。

在另一个实施方案中，本发明的组合物、融合蛋白和多核苷酸是通过Liu，F.等披露（Gene Ther，1999，6：1258-66）所谓的“流体力学施用”的方式施用的。按照上述方法，所述化合物以高速大体积的方式通过血管内途径导入生物体，导致更分散分布的高转染水平。业已证实进入细胞内的效力直接取决于所施用流体的体积和注射速度（Liu等，1999，Science，305：1437-1441）。在小鼠中，所述施用的优化值为1ml/10g体重，用时3-5秒（Hodges等，2003，Exp.Opin.Biol.Ther，3：91-918）。在通过流体力学施用方法施用多核苷酸之后其体内细胞转染的确切机制尚不清楚。对于小鼠来说，据信以比心跳更高的频率通过尾静脉施用，使得施用的流体聚集在上腔静脉。该流体随后进入器官的血管，随后通过所述血管中的穿孔，进入血管外空间。这样，所述多核苷酸在与血液混合之前与目标器官的细胞接触，从而降低了被核酸酶降解的可能性。

本发明的组合物可以以小于10mg/千克体重的剂量施用，优选小于5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg/千克体重和小于200nmol的RNA制剂，换言之，大约4.4x 10¹⁶拷贝/千克体重或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15或0.075nmol/千克体重。单位剂量可以通过注射、吸入或局部方式施用。本发明的双功能多核苷酸和组合物可以直接施用到表达目标mRNA的器官中，此时施用的剂量为0.00001mg-3mg/器官，或优选0.0001-0.001mg/器官，大约0.03-3.0mg/器官，大约0.1-3.0mg/器官或0.3-3.0mg/器官。

所述剂量取决于要治疗病症的严重程度和反应，并且可以在数日到数月之间变化，或者直到症状缓解。最佳剂量可以通过定期测量患者机体内药剂的浓度确定。最佳剂量可以由EC50值确定，该值是通过预先在动物模型上进行的体外和体内试验获得的。单位剂量可以每日一次或小于每日一次施用，优选的是，小于每2、4、8或30天一次。另外，可以施用一个初始剂量，随后施用一个或几个维持剂量，通常维持剂量小于初始剂量。维持方案可能涉及用0.01μg-1.4mg/kg体重/日，例如1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/千克体重/日的剂量治疗患者。优选的是，维持剂量以每5、10或30天一次的频率施用。治疗必须持续一段时间，其根据患者所患病情的类型、严重程度和患者症状而变化。治疗后，必须监测患者的变化，以便确定：当疾病对治疗没有反应时加大剂量，或当出现疾病的缓解或不希望的副作用时降低剂量。

根据具体情况，每日剂量能够以单一剂量或两个或两个以上剂量施用。如果需要重复施用或经常施用，建议植入给药设备，如泵，半永久性导管（静脉内、腹膜内、脑池内或囊内）或储存器。

本发明组合物和融合蛋白的治疗用途

另一方面，本发明还涉及本发明的组合物、融合蛋白和多核苷酸在药品中的用途。

本发明的组合物能够促进的脾内、肝和外周血CD8淋巴细胞的体内增殖（参见本发明的实施例5），在不同结肠直肠腺癌模型中表现出抗肿瘤作用（参见实施例6和7）并且表现出抗-转移效果（参见实施例8）。这些作用再加上IL15促进NK细胞活性的能力的证据，使得本发明的化合物和组合物可用于治疗能够从刺激先天性（NK细胞介导的）或获得性（CD8淋巴细胞介导的）免疫应答中获益的患者。

因此，另一方面，本发明涉及本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体或本发明的宿主细胞用于刺激受试者的免疫应答的用途。

优选的是，本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体或本发明的宿主细胞被用于治疗需要激活针对抗原的免疫系统的疾病。

另外，本发明涉及将本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体或本发明的宿主细胞用于生产用来刺激受试者对抗原的免疫应答的药品或用于治疗需要激活免疫系统的疾病的用途。

另外，本发明涉及一种促进刺激受试者对抗原的免疫应答或用于治疗需要激活免疫系统的疾病的方法，该方法包括给所述受试者施用本发明的组合物、本发明的融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体或本发明的宿主细胞。

用于本发明的表述“刺激受试者的免疫应答”是指在个体内启动针对特异性抗原的免疫应答，其中，所述应答是第一次发生，以及再次激活受试者的免疫应答，其中，所述免疫应答曾经发生过。可以理解的是，所述免疫应答可涉及先天性以及获得性免疫应答，并且可涉及体液应答或细胞应答。

因此，本发明的化合物和组合物增强受试者对特异性抗原的免疫应答的能力可用于治疗与有机体中存在所述抗原相关的疾病，所述疾病包括由病毒感染导致的疾病（如果研究涉及病毒抗原的话）、细菌感染感染导致的疾病（如果研究涉及细菌抗原的话）、真菌感染感染导致的疾病（如果研究涉及真菌抗原的话）、过敏反应（如果研究涉及过敏原的话）、寄生虫感染导致的疾病（如果研究涉及寄生虫抗原的话）和/或肿瘤（如果研究涉及肿瘤细胞特异性抗原的话）。因此，在优选实施方案中，所述需要激活免疫系统的疾病选自传染性疾病和肿瘤性疾病。

可以用本发明的化合物和组合物治疗的病毒感染导致的疾病包括，但不局限于，HIV-1病毒（AIDS）、人疱疹病毒（如单纯疱疹病毒（单纯疱疹，生殖器疱疹））、巨细胞病毒（单核细胞增多症、视网膜炎、肝炎），Epstein Barr病毒（传染性单核细胞增多症、伯基特氏淋巴瘤和鼻咽癌）和水痘带状疱疹病毒（水痘、带状疱疹）感染导致的疾病；肝炎病毒（如乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒）、副粘病毒（如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒）感染导致的疾病；黄病毒（如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传播的脑炎病毒或日本脑炎病毒）以及轮状病毒感染导致的疾病。可以用本发明的化合物和组合物治疗的其他类型的病毒感染详细披露于以下文献中：Fundamental Virology，second edition，eds.Fields，B.N.和Knipe，D.M.（Raven Press，New York，1991）。

可以用本发明的化合物和组合物治疗的细菌感染导致的疾病包括，但不局限于，下列属的微生物导致的疾病：埃希氏菌属（Escherichia）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙门氏菌属（Salmonella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、志贺氏杆菌（Shigella）、李斯特菌属（Listeria）、气杆菌属（Aerobacter）、螺杆菌属（Helicobacter）、克氏杆菌属（Klebsiella）、变形杆菌属（Proteus）、假单胞菌属、链球菌属（Streptococcus）、衣原体属（Chlamydia）、支原体属（Mycoplasma）、肺炎球菌属（Pneumococcus）、奈瑟氏菌属（Neisseria）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、分支杆菌属（Mycobacterium）、弯曲菌属（Campylobacter）、弧菌属（Vibrio）、沙雷氏菌属（Serratia）、普罗威登斯菌属（Providencia）、色杆菌属（Chromobacterium）、布鲁氏菌属（Brucella）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、嗜血杆菌属（Haemophilus）或包特菌属（Bordetella）。

可以用本发明的化合物和组合物治疗的真菌感染导致的疾病包括，但不局限于，念珠菌病、曲霉病、组织胞浆菌病和隐球菌脑膜炎等。

可以用本发明的化合物和组合物治疗的寄生虫感染包括，但不局限于，疟疾、肺囊虫（Pneumocystis jiroveci）感染、肺炎、昏睡病、利什曼病、隐孢子虫病、弓浆虫病和锥虫病。

可以用本发明的化合物和组合物治疗的过敏-型疾病包括，但不局限于，接触花粉引起的过敏反应（来自树木、药草、杂草和禾本科植物的花粉过敏原）、接触昆虫过敏原引起的过敏反应（可吸入过敏原，来自唾液的过敏原和有毒物）、头皮屑和动物毛发过敏原以及食物过敏原。

本发明的缀合物和组合物还适用于治疗过度增生病。用于本发明的表述“增殖性疾病”是指由不适当的高水平细胞分裂和不适当的低水平细胞凋亡或这两者导致或产生的疾病，并包括原发性肿瘤以及转移。术语“原发性肿瘤”是指位于肿瘤发源的原发部位的肿瘤。用于本发明的术语“转移”是指肿瘤发展到除肿瘤的最初原发部位之外的机体组织的过程。

在本发明中，“治疗过度增生病”或“治疗肿瘤”被理解为表示施用本发明的化合物和组合物，以预防或延缓癌症或肿瘤的症状、并发症或生化指标的出现，缓解其症状或阻止或抑制其生长和发展，例如，转移瘤的出现。治疗可以是推迟疾病出现或预防其临床或亚临床症状出现的预防性治疗或在疾病出现之后消除或减轻症状治疗性治疗或涉及其通过手术或放射治疗的治疗。

在本发明中治疗的癌症可以是任何类型的癌症或肿瘤。这些肿瘤或癌症包括，但不局限于，位于结肠、腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、内分泌腺（肾上腺、甲状旁腺、脑垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺）、眼、头颈、神经系统（中枢神经系统和外周神经系统）、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸腔和泌尿生殖器官的恶性肿瘤、更特别是儿童急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人（原发性）肝细胞癌、成人（原发性）肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人急性淋巴细胞白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关的淋巴瘤、AIDS-相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂癌和输尿管癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤，宫颈癌，儿童（原发性）肝细胞癌，儿童（原发性）肝癌、儿童急性淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞肿瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童视路和下丘脑神经胶质瘤、儿童淋巴母细胞白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非-霍奇金淋巴瘤、儿童幕上原发性神经外胚层和松果体肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、内分泌胰腺胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室鼓膜瘤、上皮癌、食道癌、尤文氏肉瘤和相关的肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆道癌、眼癌、女性乳腺癌、高雪氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠期滋养细胞瘤、毛细胞白血病（tricoleukaemia）、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞、胰岛细胞胰癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、口唇癌、肝癌、肺癌、淋巴增生症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状头颈癌、原发性转移性鳞状头颈癌、转移性鳞状头颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤、骨髓发育异常综合征、髓性白血病、髓细胞白血病、脊髓增生症、鼻窦和鼻腔癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、孕期非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、具有隐匿性原发性的转移性鳞状头颈癌、口咽癌、恶性纤维骨肉瘤-Z、骨肉瘤-W、恶性纤维性组织细胞瘤、骨恶性纤维骨肉瘤/组织细胞瘤、上皮性卵巢癌、卵巢生殖细胞肿瘤、低恶性卵巢潜在肿瘤、胰腺癌、异常蛋白血症、紫癫、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体细胞瘤、血浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状头颈癌、胃癌、松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养细胞肿瘤、肾盂和输尿管细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤和任何其他过度增生病、以及位于前面提到过的器官系统的瘤。

本发明的疫苗组合物

本发明的化合物和组合物还可用作疫苗的佐剂，以增强患者对抗原的应答。因此，另一方面，本发明涉及一种疫苗组合物，其包括抗原和本发明的组合物、融合蛋白、多核苷酸、基因构建体、载体或宿主细胞。

用于本发明的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包括至少一种目的抗原的组合物，它能激活受试者对所述抗原的免疫应答。疫苗的目的是激活通过细胞以及抗体介导的免疫性。优选地，细胞介导的免疫主要包括刺激T-细胞应答，由CD4+介导的应答，和/或CD8+T细胞应答。

用于本发明的术语“佐剂”是指能够激活免疫系统的免疫剂，与施用没有佐剂的疫苗获得的结果相比，能产生针对疫苗的更强更有效的免疫应答。对佐剂的典型应答包括，但不局限于，激活、增殖和/或分化免疫系统细胞（B细胞、T细胞、树突状细胞、抗原-呈递细胞、巨噬细胞、NK细胞）、增强或减弱标记物和细胞因子表达、刺激IgA、IgM和/或IgG效价、脾大（脾细胞数增加）、增生，在不同器官中形成浸润和本领域技术人员可以用标准技术量化的其他类型的反应。

因此，可用于与本发明的组合物和化合物组合的疫苗包括提供选自以下组的一种或多种抗原的疫苗：病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、过敏原或环境抗原和肿瘤抗原。

适用于与本发明的化合物和组合物一起使用的疫苗中的病毒抗原包括HIV-1抗原（如tat、nef、gp120或gp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev）、人疱疹病毒（如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其衍生物）或立即早期蛋白（如VHS1或VHS2的ICP27、ICP47、ICP4、ICP36）、巨细胞病毒（特别是人的（如gB或其衍生物））、Epstein-Barr病毒（如gp350或其衍生物）、水痘带状疱疹病毒（如gpl、II、III和IE63）、或肝炎病毒、如乙型肝炎病毒（例如、乙型肝炎的表面抗原或肝炎的细胞核抗原）、丙型肝炎病毒（例如、细胞核抗原、E1、NS3或NS5）、副粘病毒、如呼吸道合胞病毒（如蛋白F和G或其衍生物）、副流感病毒、麻疹病毒（如蛋白El和E2）、水痘病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒（例如HPV6、11、16、18、如LI、L2、El、E2、E3、E4、E5、E6、E7）、黄病毒（例如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传播的脑炎病毒、日本脑炎病毒）或被流感病毒感染的细胞（如蛋白HA、NP、NA或M、或其组合）、轮状病毒抗原（如VP7sc和其他轮状病毒组分）和类似的病毒抗原的其他例子（参见Fundamental Virology，secondedition，eds.Fields，B.N.和Knipe，D.M.（Raven Press，New York，1991））。

适用于与本发明的化合物和组合物一起使用的疫苗中的细菌抗原或衍生物包括奈瑟菌属（Neisseria spp）抗原，包括奈瑟氏淋病（N.gonorrhea）和脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）（转铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PiIC和粘附素）；化脓性链球菌（S.pyogenes）的抗原（如M蛋白或其片段和C5A蛋白酶）；无乳链球菌（S.agalactiae）抗原，变形链球菌（S.mutans）抗原；杜克嗜血杆菌（H.ducreyi）；莫拉菌属（Moraxella spp），包括卡他莫拉菌属（M catarrhalis），又称作粘膜炎布兰汉球菌（Branhamella catarrhalis）（如低和高分子量粘附素和侵袭素）；包特菌属（Bordetella spp）抗原，包括百日咳杆菌（B.pertussis）[例如，副百日咳（Parapertussis）和支气管败血杆菌（B.bronchiseptica）（如百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、纤毛）]；分支杆菌属（Mycobacterium spp.）抗原，包括结核分支杆菌（M.tuberculosis），牛分支杆菌（M.bovis），麻风分支杆菌（M.leprae），鸟分支杆菌（M.avium），副结核分支杆菌（M.paratuberculosis），耻垢分支杆菌（M.smegmatis）；军团菌属（Legionella spp），包括嗜肺军团菌（L.pneumophila）；（例如ESAT6、抗原85A、B或C、MPT 44、MPT59、MPT45、HSPIO、HSP65、HSP70、HSP 75、HSP90、19kDa[Rv3763]的PPD、38kDa[Rv0934]的PPD）；埃希氏菌属（Escherichia spp）抗原，包括产肠毒素的大肠杆菌（E.coli）（例如，定殖因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物），肠出血性大肠杆菌（E.coli）和肠病原体大肠杆菌（E.coli）抗原（例如，类似于志贺毒素或其衍生物的毒素）；弧菌属（Vibrio spp）抗原，包括霍乱弧菌（V.cholera）（例如，霍乱毒素或其衍生物）；志贺氏菌（Shigella spp）抗原，包括宋内志贺氏菌（S.sonnei）、痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexnerii）；耶尔森菌属（Yersinia spp），包括小肠结肠炎耶尔森菌（Y.enterocolitica）（例如，Yop蛋白）；小肠结膜炎耶尔森菌（Y.pestis）抗原，假结核菌（Y.pseudotuberculosis）；弯曲杆菌（Campylobacter spp），包括空肠弯曲杆菌（C.jejuni）（例如，毒素、粘附素和侵袭素）；沙门氏菌属（Salmonella spp）抗原，包括伤寒沙门氏菌（S.typhi）、甲型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）；李斯特菌（Listeria spp.），包括单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）；幽门杆菌（Helicobacter spp），包括幽门螺旋杆菌（H.pylori）（例如，尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素）；假单胞菌属（Pseudomonas spp）抗原，包括铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）；葡萄球菌属（Staphylococcus spp.），包括金黄色葡萄球菌（S.aureus），表皮葡萄球菌（S.epidermidis）；肠球菌属（Enterococcus spp.），包括粪肠球菌（E.faecalis），屎肠球菌（E.faecium）；梭状芽孢杆菌属（Clostridium spp.），包括破伤风梭菌（C.tetani）（例如，破伤风毒素及其衍生物）；肉毒梭菌（C.botulinum）抗原（例如，肉毒杆菌毒毒素及其衍生物），艰难梭状芽孢杆菌（C.difficile）抗原（例如，梭状芽孢杆菌A或B的毒素及其衍生物）；芽孢杆菌属（Bacillus spp.）抗原，包括炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）（例如，炭疽毒素及其衍生物）；棒状杆菌属（Corynebacterium spp.），包括白喉棒状杆菌（C.diphtheriae）（例如，白喉毒素及其衍生物）；螺旋体属（Borrelia spp.）抗原，包括伯疏氏螺旋体（B.burgdorferi）（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB）；伽氏螺旋体（B.garinii）抗原（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），艾氏疏螺旋体（B.afzelii）（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），B.andersonfi抗原（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），赫姆斯螺旋体（B.hermsii）抗原；埃立克体属（Ehrlichia spp.），包括马埃立克体（E.equi）和人粒细胞埃立克体病的制剂；立克次氏体属（Rickettsia spp），包括河立克次氏体（R.rickettsii）；衣原体属（Chlamydia spp.），包括沙眼衣原体（C.trachomatis）（例如MOMP、肝素-结合蛋白）；肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae）抗原（例如MOMP、肝素-结合蛋白），鹦鹉热衣原体（C.psittaci）抗原；钩端螺旋体属（Leptospira spp.），包括肾脏钩端螺旋体（L.interrogans）；密螺旋体菌属（Treponema spp.），包括梅毒螺旋体（T.pallidum）（例如，稀有外膜蛋白），齿密螺旋体（T.denticola）抗原，痢疾密螺旋体（T.hyodysenteriae）；疟原虫属（Plasmodium spp.）抗原，包括恶性疟原虫（P.falciparum）；弓形虫属（Toxoplasma spp.）和弓形虫（T.gondii）（例如SAG2、SAGS、Tg34）；内阿米巴菌属（Entamoebaspp.）抗原，包括阿米巴（E.histolytica）；巴贝虫属（Babesia spp.），包括微小巴贝虫（B.microti）；锥虫属（Trypanosoma spp.），包括克氏锥虫（T.cruzi）；贾第虫属（Giardia spp.），包括贾第虫（G.lamblia）；利什曼原虫属（leishmania spp.），包括硕大利什曼原虫（L.major）；肺囊虫属（Pneumocystis spp.），包括卡氏肺囊虫（P.carinii）；毛滴虫属（Trichomonas spp.），包括阴道毛滴虫（T.vaginalis）；血吸虫属（Schistoma spp.），包括血吸虫（S.Mansoni）。

酵母抗原或源于酵母的抗原，如念珠菌属（Candida spp.），包括白念珠菌（C.albicans）；隐球菌属（Cryptococcus spp.），包括新生隐球菌（C.neoformans）；结合分支杆菌（M.tuberculosis）抗原（如Rv2557、Rv2558、RPFs：Rv0837c、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450、Rv1009、aceA（Rv0467）、PstS1、（Rv0932）、SodA（Rv3846）、16kDal的Rv2031c、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1）；衣原体抗原，如高分子量蛋白（HMWP）、ORF3（文献EP 366412）以及可能的膜蛋白（Pmp）；链球菌属(Streptococcus spp)抗原，包括肺炎链球菌（S.pneumoniae）（PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白、肺炎球菌溶血素抗原蛋白及其突变型解毒衍生物）；源于嗜血杆菌属（Haemophilus spp.）的抗原，包括B型流感嗜血杆菌（H.influenzae）（例如PRP及其缀合物）；无法分类的流感嗜血杆菌抗原（如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D以及菌毛和菌毛衍生的肽，或其多拷贝变体或融合蛋白）；源于恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）的抗原（如RTS.S、TRAP、MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其在疟原虫属中的类似物）。

适用于与本发明的化合物和组合物一起使用的疫苗中的真菌抗原包括，但不局限于，例如，念球菌（Candida）真菌抗原的组分；组织胞浆菌属（Histoplasma）真菌抗原，如热休克蛋白60（HSP60）和组织胞浆菌属真菌抗原的其他组分；隐球菌属（Cryptococcus）真菌抗原，如荚膜多糖和隐球菌属真菌抗原的其他组分；球虫目（Coccidia）真菌抗原，如小球体抗原和球虫目真菌抗原的其他组分；和癣（Tinea）真菌抗原，如发癣菌素和球虫目真菌抗原的其他组分。

适用于与本发明的化合物和组合物一起使用的疫苗中的原生动物抗原包括，但不局限于，恶性疟原虫抗原，如裂殖子表面抗原、孢子体表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、全血抗原pf、55/RESA和血浆抗原的其他组分；弓浆虫抗原，如SAG-I、p30和弓浆虫抗原的其他组分；血吸虫属抗原，如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和血吸虫属抗原的其他组分；利什曼原虫属的抗原和利什曼原虫属的其他抗原，如gp63、脂磷（酸）聚糖及其相关蛋白和利什曼原虫属抗原的其他组分；以及克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的抗原，如75-77kDa的抗原、56kDa的抗原和锥虫属抗原的其他组分。

适用于与本发明的化合物和组合物一起使用的疫中的过敏原或环境抗原包括，但不局限于，源于天然形成的过敏原的抗原，花粉过敏原（来自树木、药草、杂草和禾本科植物的花粉过敏原），昆虫过敏原（来自唾液和有毒物的可吸入过敏原），头皮屑和动物毛发过敏原，以及食物过敏原。来自树木、禾本科植物和药草的许多花粉过敏原源于分类学上的山毛榉目（Fagales）、木樨目（Oleales）、松杉目（Pinales）和悬铃木科（Platanaceae）、尤其包括桦木[桦树桦木属（Betula）]、赤杨[赤杨属（Alnus）]、榛树[榛树属（Corylus）]、鹅耳枥[铁树鹅耳枥属（Carpinus）]和橄榄树[齐墩果属（Olea）]、杉木[（柳杉树（Cryptomeria）和桧属（Juniperus）]、香蕉树（[悬铃木属（Platanus）]、禾本目（Poales）、尤其包括黑麦草属（Lolium）、梯牧草属（Phleum）、早熟禾属（Poa）、狗牙根属（Cynodon）、鸭茅属（Dactylis）、绒毛草属（Holcus）、鹬草属（Phalaris）、黑麦属（Secale）和高粱属（Sorghum）的禾本科植物、菊目（Asterales）和荨麻目（Urticales）、尤其包括豕草属（Ambrosia）、蒿属（Artemisia）和墙草属（Parietaria）的药草。可以使用的其他过敏原性抗原包括尘螨属（Dermatophagoides）和螨属（Euroglyphus）家庭尘螨过敏原、仓储螨、例如嗜鳞螨属（Lepidoglyphys）、嗜甜螨属（Glycyphagus）和食酪螨属（Tyrophagus）、蟑螂过敏原、摇蚊和跳蚤、例如、小蠊属（Blatella）、大蠊属（Periplaneta）、摇蚊属（Chironomus）和栉头蚤属（Ctenocepphalides）、哺乳动物的过敏原（如猫、狗和马、禽、毒物过敏原包括源于昆虫叮咬的过敏原），如分类学上的膜翅目（Hymenoptera），包括蜜蜂[蜜蜂科（Apidae）总科]，黄蜂和蚂蚁[蚊科（Formicoidae总科）]。可以使用的更多的过敏原抗原包括可吸入的真菌过敏原，如来自链格孢属（Alternaria）和分支孢子菌属（Cladosporium）的过敏原。

适用于与本发明的化合物和组合物一起使用的疫苗中的肿瘤抗原包括，但不局限于，MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV（DPPIV）、腺苷脱氨酶结合蛋白（ADAbp）、亲环素b、结肠直肠相关抗原（CRC）-0017-1A/GA733、癌胚（carcinoembrionary）抗原（CEA）及其抗原表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原（PSA）及其抗原表位PSA-1、PSA-2、和PSA-3、前列腺特异性膜抗原（PSMA）、T-细胞/CD3-ζ链受体、肿瘤抗原的MAGE家族（例如、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2（MAGE-B2）、MAGE-Xp3（MAGE-B3）、MAGE-Xp4（MAGE-B4）、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5）、肿瘤抗原的GAGE家族（例如、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9）、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p2lras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘着蛋白、α-连环蛋白、13-连环蛋白、γ-连环蛋白、pl2Octn、gp100Pme1117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、结肠蛋白的腺瘤性息肉病（APC）、胞衬蛋白、连接蛋白37、个体基因型Ig、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物、如人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原（EBNA）-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2（HOM-MEL-40）、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2、急性淋巴细胞性白血病（etv6、amll、亲环素b）、B细胞淋巴瘤（个体基因型Ig）、神经胶质瘤（E-钙粘蛋白、a-连环蛋白、13-连环蛋白、7-连环蛋白、p120ctn）、膀胱癌（p2lras）、胆管癌（p2lras）、乳腺癌（MUC family、HER2/neu、c-erbB-2）、宫颈癌（p53、p2lras）、结肠癌（p2lras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族）、结直肠癌（结肠直肠相关的抗原（CRC）-0017-1A/GA733、APC）、绒毛膜癌（CEA）、上皮细胞癌（亲环素b）、胃癌（HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白）、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤（lmp-1、EBNA-1）、肺癌（CEA、MAGE-3、NY-ESO-1）、淋巴细胞源性白血病（亲环素b）、黑素瘤（p15蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p2lras、gp100Pme1117）、骨髓瘤（MUC家族、p2lras）、非-小细胞肺癌（HER2/neu、c-erbB-2）、鼻咽癌（lmp-1、EBNA-1）、卵巢癌（MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2）、前列腺癌（前列腺特异性抗原（PSA）及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白）、肾癌（HER2/neu、c-erbB-2）、宫颈和食道鳞状细胞癌（病毒产物、如人乳头状瘤病毒蛋白）、睾丸癌（NY-ES0-1）和T-细胞白血病（HTLV-1表位）。

本发明组合物的组分，特别是Apo A和IL15的融合体或编码所述融合体的多核苷酸和IL15受体α链的Sushi结构域或编码所述结构域的核酸可以单一剂型提供（例如，片剂或胶囊，包括固定量的每一种组分）或者能够以独立剂型提供，以便随后组合、依次或独立施用。本发明的组合物还涉及若干部分的试剂盒形式的剂型，其中，所述组分独立配制的，但是包装在同一个容器中。

本领域专业人员可以理解的是，本发明组合物的第一组分和第二组分制备方法可类似，换言之，以类似方法制备（例如，制成片剂或丸剂），允许以相同的途径施用。在一个实施方案中，本发明的不同组分是单独配制的，两种组分可以出现在一个泡罩包装中。每一个泡罩容纳可供整天使用的药剂。如果药剂需要在一天中分若干次施用，可以将对应于一次施用的药剂安排在泡罩包装的单独部分，优选在泡罩包装的每一个单独部分标注一天中需要施用的时间。可替代地，本发明的组合物的组分能够以不同方式制备，以便所述不同组分是分别施用的。因此，例如，所述第一组分可以制备成片剂或胶囊以供口服，所述第二组分可以制备成供静脉内施用。

本发明的组合物是通过本领域技术人员公知的方法施用的，包括，但不限于，静脉内、口服、鼻腔、肠胃外、局部、经由皮肤和直肠等。

下面将通过实施例对本发明进行说明，这些实施例纯粹是用于说明目的，不构成对本发明范围的限定。

具体实施例

实施例1.质粒的来源和构建

1.1RNA提取

用TRI试剂（Sigma，Madrid，Spain）从个体样品中提取总小鼠肝RNA。使用分光光度计（Biophotometer，Eppendorf）根据260和280nm处的吸收值测定样品的浓度和纯度，使用320nm的背景校正。

1.2总cDNA的RT-PCR合成

用DNase I处理总RNA（3μg），并且在存在RNase OUT的条件下用M-MLV RT反转录成cDNA（所有试剂来自Invitrogen，Carfsbed，CA）。获得了25μl的总肝cDNA。反应在37℃下进行1小时，95℃变性1分钟，转至4℃。样品马上用于PCR或在-20℃保存。

1.3 克隆鼠载脂蛋白A-I（mApoA1）的cDNA并且获得质粒 pCMV-mApoA1

pCMV-mApoA1（pApo）包括编码包括鼠载脂蛋白A-I（Apoa1）的多肽的序列SEQ ID NO：1，所述多肽的前面是其自身的信号肽，并且可操作地与巨细胞病毒启动子连接；

设计了正义引物FwATGmApoA1：5’-ATGAAAGCTGTGGTGCTGGC-3’（SEQ ID NO：46），

和反义引物RvTGAmApoA1：5’-TCACTGGGCAGTCAGAGTCT-3’（SEQ ID NO：47）。

使用BioTaq DNA聚合酶（Bioline，London，UK），通过对总肝cDNA进行PCR，扩增mApoA1的cDNA（总共795个核苷酸，72个核苷酸编码信号肽，723个核苷酸编码天然蛋白），PCR过程如下：94℃，5分钟；94℃，40秒，55℃，40秒，和72℃，40秒，30个循环；随后是72℃，7分钟，使用2720热循环仪（Applied Biosystems，Foster City，US）。PCR产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，利用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段。按照生产商的说明书将纯化的mApoA1的cDNA克隆到表达载体pcDNA^TM3.1/V5-His

TA（Invitrogen，Carfsbed，CA）上，称为pCMV-mApoA1或pApo。最后，通过测序验证获得的序列。

1.4克隆人白介素15（hIL15）的cDNA并且获得质粒pCMV-hIL15

pCMV-hIL15（phIL15）包括编码包括人IL15的多肽的序列SEQ IDNO：2，所述多肽的前面是IgVχ链的信号肽，并且其可操作地与巨细胞病毒启动子连接；

设计了正义引物FwAscIhIL15：

5′-AATAATGGCGCGCCGAACTGGATAGATG-3’（SEQ ID NO：48），

它引入了9个核苷酸的序列（GGCGCGCCC），构成了5’末端的AscI酶的限制位点；

和反义引物RvNotIhIL15：

5’-GTTCATCAACACGTCCTGAGCGGCCGC-3’（SEQ ID NO：49），

它引入了8个核苷酸的序列（GCGGCCGC），构成了5’末端的NotI酶的限制位点。

通过对表达质粒pVkL/IL-15IRESneo（Meazza等Eur.J.Immunol.1997；27：1049-1054）进行PCR，扩增hIL15的cDNA（总计345个核苷酸）。该质粒包括编码人成熟IL15的序列，其前面是IgVχ链，受巨细胞病毒启动子控制。称为pCMV-hIL5或phIL15。

用EasyA高保真PCR克隆酶（Stratagene，Cedar Creek，TX，US）进行PCR。扩增条件为：95℃，2分钟；95℃，40秒，57℃，30秒，72℃，45秒，30个循环；随后是72℃，7分钟，使用2720热循环仪（AppliedBiosystems Foster City，US）。所述PCR产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化所述凝胶片段。按照生产商提供的说明书，将纯化的hIL15的cDNA克隆到表达载体pTrcHis2

TA（Invitrogen，Carfsbed，CA）上，称为pTrcHis2-hIL15。最后，通过测序验证获得的序列。

1.5 构建编码mApoA1和hIL15的基因融合体的质粒 pCMV-Apo-hIL15（pApo-hIL 15）

pCMV-Apo-hIL15（pApo-hIL15），包括序列SEQ ID NO：40，其编码包括鼠载脂蛋白A-I的融合蛋白，通过GAP接头连接在人IL15上，并且可操作地与巨细胞病毒启动子连接；和

设计反义引物RvAscImApoA1：

5’-GGCGCGCCCTGGGCAGTCAGAGTCTCGC-3’（SEQ ID NO：50），

它引入了9个核苷酸的序列（GGCGCGCCC），构成了ApoA1基因的3’末端的AscI酶的限制位点，并且取消了终止密码子。所增加的限制序列被翻译成短肽接头GAP，它赋予组成蛋白一定的迁移性。

使用BioTaq DNA聚合酶（Bioline，London，UK），使用模板pCMV-mApoA1（参见实施例1.3）和引物FwATGmApoA1和RvAscImApoA1进行PCR扩增，94℃，5分钟；94℃，40秒，57℃，40秒，72℃，40秒，30个循环；随后是72℃，7分钟，使用2720热循环仪（Applied Biosystems Foster City，US）。PCR产物（804个核苷酸）在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段。按照生产商提供的说明书，将纯化的mApoA1-AscI的DNA克隆到表达载体pcDNA^TM3.1/V5-His

TA（Invitrogen，Carfsbed，CA）上，称为pCMV-mApoA1-AscI。最后，通过测序验证获得的序列。

同时，使用模板pTrcHis2-hIL15（参见例1.4），其用AscI酶和Buffer4（New England Biolabs）37℃下消化50分钟。消化产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段。随后用酶NotI，1xBSA和Buffer 3（New England Biolabs）37℃下将纯化的AscI-hIL15-pTrcHis2的DNA消化50分钟。消化产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段，获得纯化的DNA AscI-hIL15-NotI（345个核苷酸）。

为了进行基因融合，37℃下用AscI酶和Buffer 4（New EnglandBiolabs）将质粒pCMV-mApoA1-AscI消化50分钟。消化产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段。然后，利用存在于pcDNA 3.1V5-His

TA框架上的限制位点，用NotI酶，1xBSA和Buffer 3（New England Biolabs）在37℃下将纯化的pCMV-mApoA1的DNA消化50分钟。消化产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段。将通过AscI和NotI打开的载体pCMV-mApoA1结合在插入片段AscI-hIL15-NotI上，二者的比例为1：3（载体：插入片段），使用高浓度T4DNA连接酶和缓冲液2X快速连接缓冲液（Promega Madison，Wl，U.S.），混合物在室温下孵育10分钟。随后转化Top10细菌（Invitrogen，Carfsbed，CA）。在具有氨苄青霉素的LB培养基的培养皿上对转化的细菌的生长进行筛选，因为载体含有对这种抗生素的抗性基因。利用MiniPrep技术（Qiagen，Germany）从阳性细菌中提取质粒DNA，随后用AscI/PmeI酶（NewEngland Biolabs）消化2μg所述质粒，并且通过在1%琼脂糖凝胶上电泳分离所述消化的产物，检查是否存在插入片段。得到的6669nts质粒在下文被称为pCMV-Apo-hIL15或pApo-hIL15。

1.6pSushi质粒的来源

在本发明中被称为pCMV-Sushi（pSushi）的质粒对应于Duitmann等先前披露的质粒IL-15RΔMD（Duitman，E.H.等，Mol Cell Biol，2008；28：4851-4861），是由该文章的作者惠赠的。

pCMV-Sushi（pSushi）包括编码包括鼠IL15受体α链（IL15ra）的Sushi结构域的多肽的序列SEQ ID NO：20，所述肽前面是Igκ的信号肽，并且其可操作地与巨细胞病毒启动子结合。

1.7克隆鼠白介素15（mIL15）的cDNA并且获得质粒 pCMV-mSushi-mIL 15（pmSushi-mIL 15）

pCMV-mSushi-mIL15（pmSushi-mIL15），包括编码包括鼠IL15受体α链（IL15ra）的Sushi结构域的多肽的序列，通过GGSGGGGSGGGSGGGGSLQ（SEQ ID NO：32）型弹性接头与鼠IL15结合。

通过GENEART AG（GENEART AG，BioPark，Josef-Engert-Straβe11，93053Regensburg，Germany）合成所述基因，该基因编码融合在鼠IL15上的Sushi结构域，随后是两个终止密码子，两侧是一个位于3’末端的NheI限制位点和另一个位于5’末端的XhoI限制位点，并且导入质粒pSecTag2/Hygro A（Invitrogen，Frankfurter Straβe 129B，64293Darmstadt，Germany）。

融合在鼠IL15上的Sushi结构域的表达受巨细胞病毒启动子的控制，其分泌受Igκ-链V-J2信号肽的引导。

1.8构建编码mSushi、mIL15和mApoA1的基因融合体的质粒 pCMV-mSushi-mIL15-mApoA1（pmSushi-mIL15-mApo）

pCMV-mSushi-mIL15-mApoA1，包括编码融合蛋白的序列SEQ IDNO：45，所述融合蛋白包括鼠IL15受体α链（IL15ra）的Sushi结构域，鼠IL15和鼠载脂蛋白A-I。

设计引物，以便扩增融合在鼠IL15上的Sushi序列，同时在它上面结合了9个核苷酸的序列（GGCGCGCCC），构成了位于该基因3’末端的AscI酶限制位点，并且取消了终止密码子。所添加的限制序列允许用在5’末端包括AscI序列的Apo序列进行克隆，并且被翻译成GAP短肽接头，这会赋予组成蛋白一定的移动性。

引物为：

Fw Sushi 5’-ATGGAGACAGACACCCTGCTG-3’（SEQ ID NO：51）

Rv IL15 AscI：5’-GGGCGCGCCGCTGGTGTTGATGAACAT-3’（SEQID NO：52）

通过PCR扩增该序列，使用在前面的实施例中披露的模板pmSushi-mIL15，以及引物Fw Sushi和Rv IL15 AscI，使用酶BioTaq DNA聚合酶（Bioline，London，UK），94℃，1分钟；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，45秒，30个循环；随后是72℃，2分钟，使用2720热循环仪（Applied Biosystems Foster City，US）。所述PCR产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化凝胶片段。按照生产商提供的说明书，将纯化的DNA克隆到表达载体pcDNA^TM3.1/V5-HisTA（Invitrogen，Carfsbed，CA）上，称为pCMV-mSushi-mIL15-AscI。最后，通过测序验证获得的序列。

为了进行基因融合，37℃下用酶AscI和NcoI在Buffer 4（NewEngland Biolabs）中消化质粒pCMV-mIFN-AscI-mApo（参见专利申请WO2009150284，质粒pCMV-mIFN-AscI-mApo包括编码mIFN和mApo的融合蛋白的多核苷酸）50分钟。消化产物在1%琼脂糖D-1低EEO琼脂糖凝胶（Pronadisa，Madrid，Spain）中迁移，使用QIA快速凝胶提取试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）从凝胶中纯化不含IFN序列而包含开放载体的上部的带。用相同的酶和条件消化质粒pCMV-mSushi-mIL15-AscI。在这种情况下，纯化包含mSushi-mIL15片段的下部的带。使用高浓度T4DNA连接酶和缓冲液2X快速连接缓冲液（Promega Madison，Wl，U.S.），以1：3（载体：插入片段）的比例连接两种纯化的片段，混合物在室温下孵育10分钟。随后转化Top10细菌（Invitrogen，Carfsbed，CA）。在具有氨苄青霉素的LB培养基的培养皿上对转化的细菌的生长进行筛选，因为载体含有对这种抗生素的抗性基因。利用MiniPrep技术（Qiagen，Germany）从阳性细菌中提取质粒DNA，随后用AscI/PmeI酶（New England Biolabs）消化2μg所述质粒，并且通过在1%琼脂糖凝胶上电泳分离消化的产物，检查是否存在插入片段。得到的质粒在下文被称为pCMV-mSushi-mIL1-m ApoA1或 pmSushi-mIL 15-mApo。

实施例2.实验模型

2.1 动物

用5-7周龄的雌性有免疫活性的BALB/c和C57BL/6小鼠（Harlan，Barcelona，Spain）进行实验。使用IL15Rα基因“敲除”小鼠（Lodolce等，IL 15receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocytehoming and proliferation.Immunity 1998;9:669-676）。动物按照动物实验的伦理规则，在没有外部病原体的条件下进行处理。

2.2 动物管理

每种DNA质粒（10μg）重新悬浮在1.8ml 0.9%的盐水血清（Braun）中，通过流体力学注射导入尾静脉，使用27.5G针头和2.5ml注射器（Becton-Dickinson，Spain）。用异氟烷（Forane，Abbott）进行呼吸麻醉后，通过眼眶后（retroorbitally）获得血样。通过9.1xg的离心力，5分钟内，连续离心两次回收血清，并在-20℃下保存。肠胃外麻醉是通过以200μl/小鼠的剂量腹膜内9：1的注射氯胺酮（Imalgene）和甲苯噻嗪（Rompun）的混合物实现的。

2.3 细胞系

CT26细胞系源于BALB/C小鼠结肠直肠腺癌，并且通过致癌物质N-亚硝基-N-甲基-尿烷诱导。

MC38细胞系来自鼠腺癌。

两种细胞系均在完全RPMI-1640培养基（Gibco-BRL，Paisley，UK）中培养，培养基中补充了56℃下失活的10%胎牛血清（FCS）、2mM谷氨酰胺、100U/ml链霉素、100mg/ml青霉素、1%β-巯基乙醇5.10-3。所述细胞在湿润的培养箱中在37℃下和含5%CO₂的气氛中培养。培养平板和培养瓶由Greiner Bio-one（Essen，Germany）提供。

2.4 测定hIL15

按照生产商的说明书，使用ELISA试剂盒（Set人IL15，BDBiosiences，San Diego，CA，US），在NUNC MaxiSorp平底96-孔平板上通过ELISA测定hIL15的血清水平。

2.5 流式细胞计量术

通过流式细胞计量术研究细胞群体。为此使用了通过眼眶后以及从动物的脾和肝中获得的血样。实质器官与胶原酶和DNAse溶液一起培养15分钟，以促进细胞分解，所述培养借助于Cell

（BC Falcon，Bedford，MA，US）进行。通过在35%

溶液（GE Heathcare，Uppsala，Sweden）中对细胞悬浮液进行离心分离肝淋巴细胞。对每个肝脏来说，使用以下试剂：1.6mL的PBS 10X、15.8mL的

200U的肝素（Mayne Pharma，Madrid，Spain）和28mL的RPMI（Gibco，Invitrogen，Grand Island，NY，US）。

所有研究的悬浮液用Tris NH₄Cl缓冲液处理5分钟，以裂解红细胞。

细胞重新悬浮在50μL的PBS缓冲液中，并在4℃下与相应的抗体混合物一起遮光培养10分钟。随后洗涤两次，并在

细胞计（BD Bioscience，San Diego，CA，US）上分析。随后的数据分析是利用Flow Jo program Version 5.7.2完成的。

使用的抗体是NK1.1-PE、CD3-FITC、CD8-PE、CD44-APC、CD62L-PE、CD8-PECy7和NK1.1-APC（BD-Pharmamingen，BDBioscience，San Diego，CA，US）。

2.6 统计数据分析

使用Prism 5计算机程序（GraphPad Software，Inc.）对数据进行统计学分析。有关肿瘤外观的数据记录在Kaplan-Meier曲线图上。通过重复测量方差分析分析在不同时间研究的数据，随后进行Bonferroni检验。认为p<0.05是显著值。

实施例3.流体动力学施用质粒构建体之后的hIL15的循环水平

为了研究小鼠血清中人hIL15的水平，安排具有2-3只小鼠的组，并且每只小鼠通过流体力学施用10μg相应的质粒（或质粒的组合）。不同组注射的质粒为：pApo-hIL15、pApo-hIL15+pSushi、phIL15、phIL15+pSushi、pApo或生理盐水（S）。

在8、24、96、168和240小时获得血清样品，并且通过ELISA夹心检测测定其hIL15浓度。接受表达ApoA1的对照质粒的小鼠的血清不包含可检测水平的hIL15（图1）。用表达hIL15的质粒注射的小鼠在第8小时出现最大浓度的hIL15，该浓度随后快速下降（图1）。然而，接受编码ApoA1-hIL15（有或没有pSushi质粒的同时感染）的质粒的小鼠在第8小时出现更高浓度的血清hIL15，该浓度持续升高到第24小时。与用phIL15注射的小鼠不同，在第168小时，在用pApo-hIL15处理的小鼠体内仍然可检测到hIL15（图1）。因此，表达融合蛋白ApoA1-hIL15的构建体获得了更高和持续时间更长的hIL15循环水平。

总之，流体力学施用质粒pApo-hIL15诱导了高血清浓度的hIL15，该浓度远超过通过施用phIL15产生的浓度。

实施例4.CTLL2细胞的功能分析

为了研究pApo-hIL15质粒的药效动力学效果，用CTLL2细胞进行了功能分析，该细胞需要IL-2或IL15以便增殖（Meazza等，Expressionof two interleukin-15 mRNA isoforms in human tumors does not correlatewith secretion:role of different signal peptides.Eur J Immunol 1997;27:1049-1054）。

通过流体力学注射施用质粒，并且在第24小时获得血清样品。通过热变性（56°C，45分钟）使血清分解，并且在48小时内添加到CTLL2细胞培养物中，通过氚化胸腺嘧啶测定细胞增殖。利用商业化ELISA夹心检测方法测定hIL15的血清浓度。对于等摩尔数量的hIL15来说，用pApo-hIL15+pSushi处理的小鼠血清能诱导更强的CTLL2细胞增殖（图2）。

因此，可以得出的结论是共同施用pSushi质粒和pApo-hIL15可增强其生物学作用。与hIL15融合的ApoA1质粒构建体比其与编码IL15Rα的Sushi结构域（pSushi）的质粒一起施用时，可对CTLL2细胞增殖产生更强的诱导作用。

实施例5.刺激CD8淋巴细胞增殖

为了研究通过流体力学注射在肝脏中表达的构建体的潜在免疫刺激作用，首先分析了脾脏中CD8T细胞数量的增加。为此，通过流体力学注射质粒，并且在第3、4、5、6和7天之后，分解脾脏，以便获得单细胞悬浮液，对总细胞进行计数，在用抗-CD3、抗-CD8和抗-CD44抗体标记CD8T淋巴细胞之后，通过多色流式细胞计量术进行分析。质粒pApo-hIL15和pSushi的联合注射使得脾脏中CD8T淋巴细胞数量的增加幅度大于其他处理的增加幅度（图3A）。通过CD3+、CD8+、CD44hi细胞测定的记忆CD8 T淋巴细胞的数量增加与此相同（图3C）。与其他组相比，施用质粒pApo-hIL15和pSushi的小鼠组的CD8T和CD8记忆细胞相对总脾细胞的百分比也较高（图3B和3D）。

还研究了相对用不同质粒处理的小鼠肝脏中存在的淋巴细胞而言，CD8T淋巴细胞的百分比。为此，通过流体力学注射质粒，并且在第3，4、5、6和7天，分解肝脏，通过在

溶液中离心分离淋巴细胞，在用抗-CD3和抗-CD8抗体标记CD8T淋巴细胞之后，通过流式细胞计量术进行分析。与其余组的小鼠相比，同时施用质粒pApo-hIL15和pSushi的小鼠在肝脏中出现更高百分比的CD8T淋巴细胞（图4）。

然后，分析了CD8 T淋巴细胞相对于用不同质粒处理的小鼠外周血中淋巴细胞的百分比。为此，通过流体力学注射质粒，并且在第3、4、5和6天获得血样，用抗-CD3、抗-CD8、抗-CD44和抗-CD62L抗体标记CD8T淋巴细胞。通过流式细胞计量术进行分析。与处理5和6天之后的其余组小鼠相比，同时施用质粒pApo-hIL15和pSushi的小鼠的外周血中CD8T淋巴细胞的百分比更高（图5A）。在该组、以及CD8T效应记忆细胞亚群（CD8+，CD44+，CD62L-）和CD8central中心记忆细胞（CD8+，CD44+，CD62L+）中，也观察到更高百分比的CD8T记忆淋巴细胞（CD8+，CD44+）（图5B）（图5C和5d）。

对CD8 T淋巴细胞数量和百分比的研究表明，与施用其他质粒相比，施用pApo-hIL15和pSushi可在脾脏、肝脏和外周血中诱导更大的CD8T淋巴细胞群体。特别是，与施用构建体phIL15和pSushi相比，施用pApo-hIL15和pSushi可在脾脏、肝脏和血液中产生更大的CD8T淋巴细胞群体。

实施例6.基于ApoA1和hIL15的构建体对皮下CT26肿瘤模型的抗肿瘤作用

为了研究流体力学注射的基于ApoA1和hIL15的构建体的抗肿瘤作用，在通过源于结肠直肠腺癌CT26细胞系诱导的Balb/c小鼠中选择皮下肿瘤模型。皮下注射5x10⁵细胞/小鼠，并且在第3天用基于ApoA1、hIL15和Sushi的不同的构建体处理。每周2次用数显测径器测量肿瘤大小，计算2个直径的积。一旦所述尺寸超过246mm²，就处死小鼠。

在用pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠组中观察到了统计学上不显著的肿瘤生长延迟（图6A）。25%的用pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠在接种肿瘤之后存活了50天，并且没有出现可见的肿瘤（图6B）。14%的用pApo质粒处理的小鼠存活，11%的用pApo-hIL15处理的小鼠存活。没有其他处理组的小鼠接种肿瘤后存活。以上数据表明，在皮下CT26肿瘤模型上，用pApo-hIL15和pSushi处理具有一定的抗癌作用。

实施例7.基于ApoA1和hIL15-的构建体在皮下MC38肿瘤模型上的抗肿瘤作用

为了继续研究基于ApoA1和hIL15的构建体的抗肿瘤作用，选择了另一种皮下肿瘤的模型。用MC38细胞系的5x10⁵个细胞对C57B16小鼠进行皮下注射，并且在第6天用基于ApoA1、hIL15和Sushi的不同的构建体处理携带肿瘤结节的小鼠。每周2次用数显测径器测量肿瘤大小，计算2个直径的积。一旦所述尺寸超过246mm²，就处死小鼠。

在用pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠组中观察到了统计学上不显著的肿瘤生长延迟的（图7a）。37.6%的用pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠从接种所述肿瘤算起存活了64天，并且没有出现可见的肿瘤（图7b）。16.7%的用pApo质粒处理的小鼠存活，40%的用pApo-hIL15处理的小鼠存活，17%的用phIL15处理的小鼠和33%仅接受生理盐水（S）处理的小鼠存活。phIL15+pSushi处理组小鼠没有存活的。

以上数据表明，用pApo-hIL15和pSushi处理，对皮下MC38肿瘤模型具有一定的抗肿瘤作用。

实施例8.基于ApoA1和hIL15的构建体在脾内MC38肿瘤模型上的抗转移作用

使用能产生肝转移瘤的肿瘤细胞的脾内注射模型继续研究基于ApoA1和hIL15的构建体抗肿瘤作用。

以5x10⁵个细胞/小鼠的剂量，用MC38细胞系对C57B16小鼠进行脾内注射，并且在次日用基于ApoA1，hIL15和pSushi的不同的构建体处理。

在第19天处死小鼠，并且观察肝脏中转移瘤的数量。根据转移瘤的数量，将小鼠分成3组：I小鼠因为大量肝转移瘤或普遍转移瘤而死亡（乍看起来，不可能观察到健康的肝组织）；II在部分小鼠肝组织中存在转移瘤；III小鼠无肝转移瘤。

在用pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠组中，71%的小鼠表现出肝脏无转移瘤，与之对应的是，30%的用pApo-hIL15处理的小鼠组的小鼠表现出肝脏无转移瘤，25%的用phIL15+pSushi处理的小鼠组的小鼠的小鼠表现出肝脏无转移瘤，20%的接受生理盐水（S）的小鼠组的小鼠表现出肝脏无转移瘤以及0%的用phIL15和pApo处理小鼠组的小鼠表现出肝脏无转移瘤（图8）。

以上数据表明，与在所述脾内MC38肿瘤模型上研究的其他构建体相比，施用pApo-hIL15和pSushi具有更有效的抗转移作用。

实施例9.施用基于ApoA1和hIL15的构建体在IL15α受体“敲除”小鼠模型上的作用

在缺乏IL15α受体的小鼠上继续研究了基于ApoA1和hIL15的构建体的免疫刺激作用。这些小鼠表现出特有的表型，因为它们缺少NK细胞并且具有少量的记忆CD8T细胞（Lodolce等，Immunity 1998；9：669-676）。

本实验的目的是观察pApo-hIL15和pSushi是否能够改变该表型。对4只小鼠进行注射，一只注射质粒pApo-hIL15和pSushi，一只注射phIL15和pSushi，一只注射pApo，最后一只注射pApo-hIL15。5天后处死小鼠，取出脾脏，并且通过流式细胞计量术研究脾群体的NK细胞和CD8T记忆淋巴细胞（图9）。

用质粒pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠出现的NK细胞的百分比为1.02%，远高于用pApo处理的小鼠（0.39%）。对于用pApo-hIL15和pSushi处理的小鼠的CD8T记忆淋巴细胞来说，相对总脾细胞而言，具有1.47%的CD8+CD44+细胞。该百分比类似于单独使用pApo-hIL15构建体获得的百分比。该实验表明，用pApo-hIL15和pSushi构建体处理，能部分恢复IL15α受体“敲除”小鼠的表型，与用研究的其余构建体获得的结果相比，获得了更高的NK和CD8T记忆细胞脾百分比。

实施例10.施用基于Sushi，IL15和ApoA1融合体的三元构建体的作用

为了研究质粒pmSushi-mIL15-mApo与实施例1.8所述三元构建体的潜在免疫刺激作用，以类似于实施例5所述方法进行了新的CD8淋巴细胞增殖试验。

为此，建立了C57BL/6小鼠组（每个处理组2-3只动物），试验了用待试验的质粒进行流体力学注射（2.5μg/小鼠）。6天后，分解脾脏，以便获得单细胞悬浮液，统计总细胞数，并且，在用抗-CD3、抗-CD8和抗-CD44抗体标记CD8T淋巴细胞，用抗-CD3，抗-NK1.1抗体标记NK细胞之后，通过多色流式细胞计量术进行分析。

要在不同处理组中待试验的质粒如下：

-pmSushi-mIL15-mApo；

-pApo-hIL15与pSushi（pApo-hIL15+pSushi）组合；

-pApo-hIL15；

-phIL15与pSushi（phIL15+pSushi）组合；

-phIL15；和

-pApo.

在该试验中，与其他处理组相比，在用编码三元融合蛋白的pmSushi-mIL15-mApo质粒处理的动物组中观察到明显更高的脾细胞数量的增殖（图10A）。类似地，与其他处理相比，用pmSushi-mIL15-mApo处理诱导了非常明显的更高的CD8T淋巴细胞（图10B）和NK细胞（图10C）数量的增殖。

实施例11.编码鼠IL15的构建体和编码人IL15的构建体在小鼠脾脏中刺激CD8T和NK细胞增殖的作用

通过流体力学注射（10μg/小鼠）同时或不同时施用pSushi质粒，对编码mIL15和hIL15分子的构建体在脾细胞数量方面的刺激活性进行了对比研究。4天后，分解脾脏，以便获得单细胞悬浮液，统计总细胞数，并且，在用抗-CD3和抗-CD8抗体标记CD8T淋巴细胞，用抗-NK1.1和抗-CD3抗体标记NK细胞之后，通过多色流式细胞计量术进行分析。

注射质粒pmIL15和质粒phIL15诱导类似数量的脾细胞，以及类似百分比的CD8T和NK细胞（图11）。同样地，当质粒pmIL15或phIL15与pSushi同时施用时，发现用编码人蛋白的质粒注射的小鼠出现了更高百分比的CD8T和NK细胞，尽管该倾向在统计学上被证实是不显著的（Kruskall-Wallis试验）。

实施例12.mSushi与mIL15和Apo的融合体对脾脏和肝脏中NK细胞的百分比的作用

与质粒pApo和质粒pmSushi-mIL15同时施用相比，施用编码所述三元融合蛋白的质粒pmSushi-mIL15-mApo，可更大程度地增加脾脏和肝脏中NK细胞的数量。

建立C57BL/6小鼠组，用待试验质粒进行流体动力学注射：

-pmSushi-mIL15-mApo，剂量为1μg/小鼠；

-pmSushi-mIL15-mApo，剂量为2.5μg/小鼠；

-pmSushi-mIL15-mApo，剂量为5μg/小鼠；

-pmSushi-mIL15与pApo组合，剂量为1μg/小鼠；

-pmSushi-mIL15与pApo组合，剂量为2.5μg/小鼠；和

-pmSushi-mIL15与pApo组合，剂量为5μg/小鼠；

4天后，分解脾脏，以便获得单细胞悬浮液，并且通过用

离心分离肝淋巴细胞。统计总细胞数，并且，用抗-NK1.1和抗-CD3抗体标记NK细胞，并且通过多色流式细胞计量术进行分析。与同时施用pmSushi-mIL15和pApo（pSushi-mIL-15+pApo）相比，注射pmSushi-mIL15-mApo在脾脏和肝脏中诱导了更高百分比的NK细胞的出现（图12）。

实施例13.基于Sushi、IL15和ApoA1的融合体的三元构建体在皮下MC38肿瘤模型上的抗癌作用.

为了继续研究pmSushi-mIL15-mApo质粒与实施例1.8所述三元构建体的抗癌作用，选择了皮下肿瘤模型。以5x10⁵个细胞的剂量用MC38细胞系对C57B16小鼠进行皮下注射，并且在第8和19天用不同的构建体处理。要在不同的处理组中待试验的质粒如下：

-pApo；

-pmSushi-mIL 15-mApo；

-pApo-hIL15与pSushi（pApo-hIL15+pSushi）组合；

为此，建立了携带肿瘤结节的C57BL/6小鼠组：5只小鼠用pApo处理；8只小鼠用pmSushi-mIL15-mApo处理，9只小鼠用pApo-hIL15+pSushi处理，通过流体力学注射要试验的质粒：pApo（1μg/小鼠），pmSushi-mIL15-mApo（1μg/小鼠）和pApo-hIL15+pSushi（各10μg/小鼠）。每周2次用数显测径器测量肿瘤大小，计算2个直径的积。一旦所述尺寸超过246mm²，就处死小鼠。

在用编码三元融合蛋白的pmSushi-mIL15-mApo处理的小鼠组中观察到了在统计学上不显著的肿瘤生长延迟（图13）。33.3%的用pmSushi-mIL15-mApo处理的小鼠在本研究结束时（接种后29天）没有出现可见的肿瘤，仅有33.3%的小鼠表现出>40mm²的表面肿瘤。20%的用pApo质粒处理的小鼠在处死当日（接种后29天）表现出可见的肿瘤，80%的小鼠表现出>40mm²的肿瘤，用pApo-hIL15+pSushi处理的小鼠在本研究结束时（接种后29天）没有出现无肿瘤现象，80%的小鼠具有>40mm²的肿瘤，尽管接受的独立的质粒的剂量高出三元融合体的剂量10倍。

以上数据表明，用pmSushi-mIL15-mApo处理对皮下MC38肿瘤模型具有一定的抗癌作用。

Claims (17)

1.一种组合物，同时或分别包括，

(i) 选自以下组的第一组分 

(a) 包括Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多肽，和

(b) 编码Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸，和

(ii) 选自以下组的第二组分 

(a)    IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(b) 编码IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸，和

(iii)选自以下组的第三组分

(a) 所述 IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体，和

(b) 编码所述IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述第一组分和第二组分构成单分子的一部分，并且，其中 

a)  如果所述第一组分和第二组分是多肽，所述单分子是包括Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体和IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体的融合蛋白，和

b)  如果所述第一组分和第二组分是多核苷酸，所述单分子是编码包括Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体的多肽，和IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体的融合蛋白的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述单分子的第一组分和第二组分的排列选自以下组：

a)  所述第一组分位于相对所述第二组分的N末端或5’位置，和

b)  所述第一组分位于相对所述第二组分的C末端或3’位置。

4.一种融合蛋白，包括

(i)    由Apo A多肽或其与所述Apo A多肽具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域A，

(ii)   由IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域B，和 

(iii)  由IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体形成的区域C。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述区域A、B和C在所述融合蛋白中沿N末端到C末端方向的排列选自以下组：A-B-C、A-C-B、B-A-C、B-C-A、C-A-B和C-B-A。

6.如权利要求4或5所述的融合蛋白，其中，区域A、B和C之间的至少一个连接是由肽接头形成的。

7.如权利要求1-3中任一项所述的组合物或如权利要求4-6中任一项所述的融合蛋白，其中

a)  Apo A或其与Apo A具有至少70%同一性的功能等效变体是人源性或鼠源性的，

b)  IL15或其与IL15具有至少70%同一性的功能等效变体是人源性或鼠源性的和/或

c)  包括所述IL15受体α链的Sushi结构域或其与所述IL15受体α链的Sushi结构域具有至少70%同一性的功能等效变体的多肽是人源性或鼠源性的。

8.一种编码如权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。

9.一种载体或基因构建体，包括如权利要求8所述的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，包括如权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的载体或如权利要求9所述的基因构建体。

11.一种药用组合物，包括如权利要求1-3或7中任一项所述的组合物、如权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的载体或基因构建体或如权利要求10所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。

12.一种用于促进抗原特异性T淋巴细胞扩增的体外方法，包括让预先在体内暴露于所述抗原的淋巴细胞群体与如权利要求1-3或7中任一项所述的组合物、如权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的载体或基因构建体或如权利要求10所述的宿主细胞接触。

13.如权利要求12 所述的方法，其中，所述淋巴细胞预先进行过体外激活，激活方法是让所述淋巴细胞与曾暴露于上述T-淋巴细胞的抗原接触。

14.将如权利要求1-3或7中任一项所述的组合物、如权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的载体或基因构建体或如权利要求10所述的宿主细胞在药品中的用途。

15.将如权利要求1-3或7中任一项所述的组合物、如权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白、如权利要求8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的载体或基因构建体或如权利要求10所述的宿主细胞用于生产用来治疗需要刺激受试者的免疫应答的疾病的药品中的用途。

16.如权利要求15所述的用途，其中，所述需要刺激受试者的免疫应答的疾病选自由传染性疾病和肿瘤性疾病组成的组中。

17.如权利要求16所述的用途，其中，所述肿瘤性疾病选自由肿瘤和转移瘤组成的组中。

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