CN101528258A - 治疗肺癌的药物组合物，抑制肺癌生长或侵入的方法和治疗肺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开的是抑制肺癌细胞的增殖或转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM——其是存在于肺癌细胞表面上的蛋白——活性或阻抑L1CAM表达的物质，以及使用该组合物的治疗方法。识别SCLC细胞表面上的L1CAM蛋白并特异性地结合SCLC组织的小鼠单克隆抗体，或siRNAs、反义寡核苷酸或shRNAs可通过抑制肺癌细胞的生长、侵入和迁移用于肺癌治疗。

Description

治疗肺癌的药物组合物，抑制肺癌生长或侵入的方法和治疗肺癌的方法
技术领域
【1】本发明涉及抑制肺癌生长或转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM——肺癌细胞表面上存在的蛋白质——的活性或表达的物质，和涉及使用所述组合物的治疗方法。
【2】
背景技术
【3】肺癌主要是由于暴露于致癌剂引起的，肺癌的发生率在全世界稳步上升。实际上，肺癌是韩国癌症死亡的主要原因。出于治疗的目的，肺癌被分为两类：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC包括几种不同的组织亚型，包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、腺鳞癌和其它的癌症。临床特征——包括疾病易发作的位置、进展模式和速度以及症状，和治疗方法根据肺癌的不同组织类型而变化(Brambilla等人，Eur Respir J.18(6)：1059-68，2001)。
【4】大多数肺癌不能通过化学疗法和放射疗法来治疗。化学疗法和放射疗法可以应用于SCLC，这通过减小肿瘤的大小来治疗，但是不期望其完全治疗所述癌症。很少通过单独的化学疗法来治疗NSCLC，原因在于相对于SCLC而言，抗癌剂的效果较差，因此，唯一有效的方法涉及通过手术完全除去肿瘤。然而，少于30％的肺癌患者在诊断时具有不能通过手术切除术完全去除的肿瘤，并且他们中三分之一以下的患者在手术切除后存活5年。因此，非常需要能够早期诊断肺癌、更精确地诊断转移的程度并且更有效的治疗的方法。
【5】在另一方面，L1细胞粘附分子(L1CAM)是220kDa的整合膜糖蛋白，其是细胞粘附分子(CAM)的免疫球蛋白超家族成员，其介导细胞表面上的细胞与细胞粘附。L1CAM——最初在神经元中鉴定(Bateman等，EMBO J.15：6050-6059；1996)——在神经迁移、神经突起和细胞迁移中发挥关键作用。L1CAM主要在脑中表达，其表达也可以在肾小管中检测到并且最近也可以在几种类型的癌中检测到(Huszar，M.等人，Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1(CD171)as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy.HumanPathology 37，1000-1008，2006)。
【6】L1CAM和癌症之间似乎存在联系。已报道L1CAM在许多肿瘤细胞类型中表达，包括黑色素瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌和直肠癌(Takeda等，J.Neurochem.66：2338-2349，1996；Thies等，Eur.J.Cancer，38：1708-1716，2002；Arlt等，Cancer Res.66：936-943，2006；Gavert等，J.Cell Biol.168：633-642，2005)。已发现L1CAM不但以膜结合形式，而且还作为切割产物被分泌到细胞外基质(Gutwein等，FASEP J.17(2)：292-4，2003)。最近，已经显示L1CAM是在肿瘤细胞生长中发挥重要作用的分子(Primiano等，Cancer Cell.4(1)：41-532003)。因此，L1CAM已经成为癌症治疗的新靶标(2004年6月17日提交的US2004/0115206A1)。
【7】关于L1CAM在肺癌，特别是在小细胞肺癌(SCLC)中的表达，已显示L1CAM在SCLC组织中表达(Huszar，M.等人，Human Pathology 37，1000-1008，2006；Miyahara，R.等人，J.Surg.Oncol.77，49-54，2001)，但是据报导，L1CAM的表达独立于SCLC的增殖状态(Miyahara，R.等人，J.Surg.Oncol.77，49-54，2001)。在非小细胞肺癌(NSCLC)的情况下，当检查10个鳞状细胞癌样品和5个腺癌样品的L1CAM表达时，没有检测到L1CAM(Huszar，M.等，Human Pathology 37，1000-1008，2006)。因而，L1CAM与肺癌细胞的生长和转移有关在本发明以前是未知的。同样，也不知道抗L1CAM的抗体具有作为抑制肺癌增殖和转移的治疗药物的潜力。
【8】美国专利申请US2004/0115206公开了使用特异结合到L1CAM的抗体诱导肿瘤细胞死亡的试剂，使用所述抗体从而诱导细胞死亡的方法，以及包含所述L1CAM抗体的药物组合物。该申请描述了使肿瘤细胞接触足以抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞死亡的浓度的、有效量的抗L1CAM抗体，从而在肿瘤细胞中抑制生长或诱导细胞死亡。该申请提及乳腺癌、结肠癌和宫颈癌细胞，作为表达L1CAM的肿瘤细胞的例子，但是没有描述L1CAM与肺癌的任何关系。同样，该申请提及肿瘤细胞与抗L1CAM抗体接触以抑制细胞生长和诱导细胞死亡，但是没有说明所述抗L1CAM抗体能够抑制肿瘤细胞的迁移、侵入和转移。
【9】
公开内容
技术问题
【10】本发明人进行了深入透彻的研究以开发用于癌症诊断和治疗的抗体。用最近建立的胆管癌细胞系免疫小鼠(Kim等人，Genes，chromosome&Cancer30：48-56，2001)，从而获得特异结合到胆管癌细胞表面上的L1CAM的单克隆抗体。所获得的单克隆抗体被命名为“A10-A3”。通过用单克隆抗体A10-A3对小细胞肺癌组织进行免疫组织化学染色来评价肺癌细胞中L1CAM的表达。结果，在58个来自小细胞肺癌(SCLC)的组织样品的49个样品(大约85％)中L1CAM表达为阳性，而在非小细胞肺癌(NSCLC)中，在37个组织样品的4个样品(大约10％)中L1CAM表达为阳性。还发现L1CAM在SCLC和NSCLC细胞的表面上表达。由于没有鉴定L1CAM在NSCLC中的表达，并且已知L1CAM与SCLC中的细胞增殖不相关，本发明人意图鉴定L1CAM在肺癌细胞的生长和转移中的作用。当使用siRNA抑制L1CAM表达或采用A10-A3抗体抑制L1CAM的活性时，肺癌细胞显示出减少的增殖和迁移。这些结果表明，L1CAM在肺癌细胞的肿瘤进展中发挥了重要作用。
【11】此外，本发明人发现A10-A3抗体具有抑制SCLC细胞增殖或迁移的作用。另一个单克隆抗体4-63，其由获自用人胚胎干细胞免疫的小鼠的杂交瘤(KCTC10966BP)产生，和已知的抗L1CAM抗体UJ127也识别癌细胞表面上的L1CAM，并且抑制SCLC的生长。还发现已知的抗L1CAM抗体UJ127结合到SCLC细胞并且抑制其生长。因而，本发明人发现抗L1CAM抗体能使具有高死亡率的肺癌转移的早期诊断和治疗成为可能，从而获得了增强的治疗效果，因此完成本发明。
【12】
技术方案
【13】因此，本发明的目标是提供抑制肺癌细胞生长或转移的药物组合物，所述药物组合物包含抑制L1CAM活性或阻抑L1CAM表达的物质。
【14】本发明的另一个目标是提供基于使用所述药物组合物治疗肺癌的方法。
【15】本发明进一步的目标是提供抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗体。
【16】本发明的还有另一个目标是提供抑制L1CAM表达的寡核苷酸。
【17】本发明的依然另一个目标是提供基于使用所述药物组合物抑制肺癌细胞增殖或转移的方法。
附图简述
【19】图1显示了小鼠单克隆抗体A10-A3(A)和4-63(B)以及已知抗体5G3(C)和UJ127(D)与包括胆管癌和肺癌的各种癌细胞系和正常细胞的细胞表面结合能力的荧光细胞染色和流式细胞术结果。
【20】图2显示了免疫沉淀和蛋白质印迹的结果，表明A10-A3结合抗原是L1CAM蛋白。A：Choi-CK胆管癌的细胞表面被生物素化，并用A10-A3抗体或已知的抗L1CAM单克隆抗体(UJ127)进行免疫沉淀。被沉淀的蛋白用于10％SDS-PAGE和用链酶抗生物素-HRP的蛋白质印迹。通过蛋白质印迹检测L1CAM。B：用A10-A3抗体免疫沉淀蛋白，在10％SDS-PAGE上分离并使用已知的抗L1CAM抗体(UJ127)进行蛋白质印迹。通过蛋白质印迹检测L1CAM。作为阴性对照“预清除”表示不存在抗体的情况下进行的免疫沉淀(IP)，“用A10-A3的IP”表示使用A10-A3抗体进行的IP，“用抗-L1CAM的IP”表示使用已知的抗L1CAM单克隆抗体进行的IP以及“仅A10-A3”表示只有抗体的SDS-PAGE。C：可溶性L1-表达HEK293T细胞用于使用已知的抗体UJ127和5G3，以及A10-A3和4-63抗体进行的蛋白质印迹。“-”表示不携带L1表达载体的细胞培养液，以及“+”表示含有可溶性L1表达载体的细胞培养液。
【21】图3显示了Q-TOF分析的结果。来自Choi-CK细胞的蛋白使用A10-A3抗体进行免疫沉淀，在SDS-PAGE上分离，并且用胰蛋白酶消化。使用Q-TOF分析所获得的肽，Q-TOF分析显示免疫沉淀的蛋白是L1CAM。下面的氨基酸序列代表全长L1CAM，上面的氨基酸序列代表所分析的肽的序列，并且在下面部分的全长L1CAM序列上加下划线。
【22】图4显示了使用A10-A3(A和C)以及4-63(B)抗体对来自癌症患者的癌组织免疫组织化学染色的结果。发现抗体结合NSCLC和SCLC组织，但不结合正常肺组织。
【23】图5显示了L1CAM表达的抑制导致SCLC细胞的活性降低。A：用抗L1CAM的siRNA或非特异siRNA转染DMS114和DMS53细胞，并且在72小时后进行流式细胞分析。B和C：用抗L1CAM的siRNA转染肺癌细胞并且在72小时之后对其迁移或增殖进行评价。
【24】图6显示了抗L1CAM抗体对SCLC细胞生长的抑制作用。A：评价了A10-A3抗体对DMS53细胞生长的抑制作用。所述抗体的阴性对照没有用抗体处理(模拟品)，或热灭活的抗体(煮沸的A10-A3)或正常小鼠IgG被用作阴性对照。B：评价了A10-A3抗体对DMS114细胞生长的抑制作用。C：评价了已知抗体UJ127和5G3对DMS114细胞生长的抑制作用。细胞生长的程度被表示为相对于不含任何抗体的对照的百分比。
【25】图7显示了抗L1CAM抗体对SCLC细胞侵入和迁移的抑制作用。图A示出了A10-A3抗体对DMS114和DMS53细胞侵入的抑制作用。图B示出了A10-A3抗体对DMS114和DMS53细胞迁移的抑制作用。图C示出了UJ127、4-63和5G3抗体对DMS114和DMS53细胞的侵入的抑制作用。图D示出了UJ127、4-63和5G3抗体对DMS114和DMS53细胞的迁移的抑制作用。抗体的阴性对照没有用任何抗体处理(对照)，或正常小鼠IgG(mIgG)被用作阴性对照。细胞侵入和迁移的程度被表示为相对于不含任何抗体的对照的百分比。
【26】图8显示了A10-A3抗体抑制与DMS114和DMS53细胞的生长、迁移和生存有关的信号转导。用抗体处理细胞，并且在30、60和120分钟后收集细胞。裂解所收集的细胞，并且用抗磷酸(phospho)-ERK1/2、磷酸-AKT和磷酸-FAK的抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹。抗-β-肌动蛋白抗体被用于检测作为加样对照的β-肌动蛋白。
【27】图9显示了A10-A3抗体对A549和NCI-H522NSCLC细胞的生长(A)和迁移(B)的抑制作用。所述抗体的阴性对照没有用任何抗体处理(PBS)，或正常小鼠IgG(mIgG)被用作阴性对照。
【28】
最佳实施方式
【29】在一方面，本发明涉及抑制肺癌细胞生长或转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM的活性或表达的物质。
【30】在详细的方面，本发明的药物组合物可以包括抑制L1CAM活性的物质。优选地，所述抑制活性的物质是可特异识别肺癌细胞表面抗原或分泌的表面抗原(L1CAM)的抗体。所述抗体包括所有的单克隆抗体和其嵌合抗体、人源化抗体及人抗体，并且可以包括新型抗体和在本领域已知的抗体。优选地，所述抗体是新型的抗L1CAM单克隆抗体A10-A3或4-63，或已知的抗L1CAM单克隆抗体UJ127或其嵌合抗体、人源化抗体或其人抗体。A10-A3和4-63抗体分别由具有KCTC登录号KCTC 10909BP和KCTC 10966BP的杂交瘤分泌。
【31】所述抗体——只要它们具有特异的L1CAM-结合活性——包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，以及抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少保留抗原结合功能的片段，并包括Fab、F(ab)、F(ab′)2和Fv。
【32】在另一详细的方面，药物组合物可以包括阻抑L1CAM表达的物质。当应用阻抑L1CAM表达的物质在表达L1CAM的肿瘤细胞中阻抑L1CAM表达时，L1CAM对肿瘤细胞生长和转移的刺激作用降低，因而在癌症治疗中是有效的。优选地，所述L1CAM表达阻抑物选自siRNAs、shRNAs和反义寡核苷酸，并且优选地是含有5′-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3′或5′-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3′的序列的siRNA。
【33】如本文所用，术语“siRNA”指约20个核苷酸的小核酸分子，其介导RNA干涉或基因沉默。“shRNA”指短发夹RNA，其中siRNA靶向序列的正义和反义序列被5至9个碱基的环状结构分隔开。最近，已研究RNA干涉(RNAi)现象以应用于在基因水平控制蛋白表达的方法。典型地，已显示siRNA通过特异性结合mRNA来阻抑蛋白表达，所述mRNA具有与靶向基因互补的序列。
【34】包含在根据本发明的组合物中的小干扰RNA分子(siRNA)可用直接化学合成(Sui G等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520)或体外转录(Brummelkamp TR等，(2002)Science 296：550-553)制备，但本发明不限于这些方法。而且，shRNAs被设计以克服siRNAs的缺点，其包括昂贵的siRNA生物合成和低转染效率，导致RNA干涉作用的短期持续，shRNAs可由包含在腺病毒、慢病毒或质粒表达载体系统中的基于RNA聚合酶III的启动子来表达，所述系统已被引入细胞。使用细胞中的siRNA加工酶(Dicer或RNase III)，shRNA分子被加工成功能siRNA分子，并随后诱导靶向基因的沉默。
【35】如本文所用，术语“反义”指具有核苷酸碱基序列和亚基-至-亚基骨架的寡聚体，其使反义寡聚体与RNA中的目标序列通过Watson-Crick碱基配对而杂交，以在目标序列内形成RNA：寡聚体异源双链体，通常是与mRNA。寡聚体可与目标序列具有精确的序列互补性或与其接近的互补性。这些反义寡聚体可阻断或抑制mRNA的翻译，和/或修饰mRNA加工以产生该mRNA的剪接变体。因此，本发明的反义寡聚体是与L1CAM基因的mRNA互补的反义寡聚体。
【36】优选地，本组合物可以包括已知的治疗剂，其直接地或间接地与抗体偶联或以非偶联形式存在。能够结合到抗体的治疗剂包括，但不限于放射性核素、药物、淋巴因子、毒素和双特异性抗体。当偶联至抗体或与siRNA、shRNA或反义寡核苷酸组合施用时，能够具有癌症治疗效果的已知治疗剂是可用的。
【37】放射性核素的例子包括，但不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
【38】药物和毒素包括但不限于：表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、阿霉素、柔红霉素、洋红霉素、氨喋呤、更生霉素、丝裂霉素、顺铂以及顺铂的类似物、博来霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、氮芥。
【39】优选地，根据给药方式本组合物可以包括可接受的载体。适合给药方式的制剂在本领域是已知的。同样，本发明的药物组合物可以以药学上有效的量给药，用于癌治疗。可以采用标准临床技术将典型的剂量最小化。
【40】在另一方面，本发明涉及基于使用药物组合物治疗肺癌的方法。详细地，该方法包括将所述药物组合物以药学上有效的量施用给机体。所述药物组合物可以肠胃外、皮下、肺内或鼻内施用。对于局部免疫抑制治疗，如果需要，可以应用包括损伤区施用的合适方法施用所述组合物。肠胃外注射包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下途径。优选的施用方式包括静脉内、皮下、皮内、肌肉和点滴注射。
【41】可以通过将本发明的药物组合物施用给机体治疗肺癌，其中包含在组合物内的L1CAM特异性抗体与癌细胞表面抗原L1CAM结合，导致肺癌细胞增殖或转移的抑制。
【42】同样，可以通过将本发明的药物组合物施用给机体，以使所述抗体与分泌的L1CAM结合而导致阻断癌细胞生长和转移来治疗肺癌。也可以通过使所述抗体与癌细胞表面抗原L1CAM结合来治疗小细胞肺癌，其中免疫细胞识别这种结合并且吞噬肺癌细胞，诱导癌细胞凋亡或杀死癌细胞。
【43】还可以通过使用包含在本发明药物组合物中的L1CAM表达抑制物质抑制L1CAM的表达来治疗肺癌。在这种情况下，L1CAM对肺癌细胞的生长和转移的刺激作用降低。
【44】在进一步的方面，本发明涉及抑制L1CAM活性的抗L1CAM的抗体或阻抑L1CAM表达的抗L1CAM的寡核苷酸。
【45】在一个详细的方面，如在根据本发明的组合物中所述，所述抗体——只要其具有特异的L1CAM-结合活性——包括具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形式以及抗体分子的功能片段。所述抗体分子的功能片段是指至少保留抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab)、F(ab′)2和Fv。
【46】优选地，抗体识别肺癌细胞表面抗原或分泌的表面抗原(L1CAM)。所述抗体的特征为其结合到肺癌细胞表面蛋白L1CAM，从而抑制或中和L1CAM的作用，并且其通过结合到癌细胞而抑制细胞的生长和转移，吞噬细胞，在细胞内诱导凋亡，或杀死所述细胞。
【47】如申请US20040115206中所述，抗L1CAM抗体不总是抑制L1CAM的作用。本抗体的特征是它不刺激L1CAM的作用而是抑制L1CAM的活性。
【48】更优选地，抗体是新的单克隆抗体A10-A3或4-63。
【49】在另一详细的方面，具有抑制L1CAM表达的作用的本发明抗L1CAM的寡核苷酸选自抗L1CAM的siRNAs、shRNAs和反义寡核苷酸，其在本发明组合物中被提及。
【50】在一个实施方式中，胆管癌细胞被大规模培养并且注射到小鼠的足垫中。从小鼠的淋巴结中分离出淋巴细胞并且将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生小鼠杂交瘤，所述杂交瘤产生与胆管癌细胞结合的抗体。
【51】详细地，将胆管癌细胞系SCK和Choi-CK注射至小鼠的爪垫，并且从小鼠的淋巴结提取淋巴细胞。所分离的淋巴细胞与F0骨髓瘤细胞融合，并且选择表达抗体的克隆。在所选择的克隆中，测试相对稳定地分泌单克隆抗体的杂交瘤上清液结合胆管癌和肺癌细胞的能力。由此建立的单克隆抗体-分泌杂交瘤命名为“杂交瘤A10-A3”。该杂交瘤于2006年2月20日保藏于国际保藏机构KCTC(韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)；韩国生物科学和生物技术研究所(Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)，韩国)并给予登录号KCTC10909BP。分别地，使用人胚胎干细胞获得识别L1CAM的另一个抗体4-63，并发现该抗体结合胆管癌和肺癌细胞。分泌4-63抗体的杂交瘤保藏于KCTC并给予登录号KCTC10966BP。所述单克隆抗体由根据本发明的杂交瘤分泌，并且特异地结合胆管癌和肺癌细胞的表面蛋白L1CAM。详细地，发现单克隆抗体结合癌细胞系——例如胆管癌和肺癌(参见图1)，但不结合正常细胞——包括肝细胞、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)或外周血淋巴细胞(参见图1)。该抗体抑制肺癌的生长、迁移或侵入。而且，观察到已知的抗L1CAM抗体5G3结合肺癌细胞，但不抑制癌症生长(见图5和图6)，发现另一已知的抗L1CAM抗体UJ127结合肺癌细胞并因此抑制所述细胞的生长。这些结果表明抗L1CAM抗体不总是抑制L1CAM的作用。
【52】如上所述，到目前为止已知L1CAM在肺癌中表达，但是其表达独立于细胞的增殖。与以前的发现相反的是，本发明人第一次确定了L1CAM与肺癌细胞的增殖和迁移有关，以及在肺癌中表达，并且因此在肺癌细胞的肿瘤进程中发挥重要作用。
【53】因此，抑制L1CAM的活性或表达的物质，如L1CAM特异性抗体或siRNAs、shRNAs和反义寡核苷酸，和包含根据本发明的物质的药物组合物能够诊断和治疗肺癌，尤其是具有高死亡率的肺癌的转移的早期诊断和治疗，因而提高治疗效果。
【54】
发明实施方式
【55】通过下列实施例可以获得对本发明的更好地理解，所述实施例是用来说明本发明而不被解释为本发明的限制。
【56】
【57】实施例1：癌细胞的培养
【58】
【59】使用如下培养基——含有10％胎牛血清(FBS；Gibco)——在37℃、5％CO2的培养箱中培养癌细胞系。使用MEM培养基(Gibco)培养SH-J1(肝细胞癌)、SCK(胆管癌)、Choi-CK(胆管癌)和ACHN(肾细胞腺癌)细胞；和使用McCoy 5A培养基(Gibco)培养SK-OV3(卵巢腺癌)细胞。在Ham′s F12K培养基中培养A549(非小细胞肺癌)细胞，以及在RPMI1640培养基中培养CI-H522(非小细胞肺癌)、DMS114(小细胞肺癌)、DMS53(小细胞肺癌)和NCI-H69(小细胞肺癌)细胞。SH-J1、SCK和Choi-CK细胞系获赠自Daegon Kim博士(全北国立大学医学院(Medical School，Chonbuk National University))以及其它癌细胞系购自ATCC。正常肝细胞和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)均购自Cambrax，使用含有10％FBS(Gibco)的EGM-2培养基(Hyclone)在37℃、5％CO2的培养箱中培养。通过Ficoll-梯度离心从人血分离外周淋巴细胞(PBL)。
【60】
【61】实施例2：A10-A3单克隆抗体的制备
【62】
【63】使用细胞解离缓冲液(Invitrogen)分离培养的Choi-CK和SCK癌细胞，并且5×105个细胞悬浮于30μl的PBS。用Choi-CK细胞注射Balb/c小鼠的右爪垫，并且3天后用SCK细胞注射左爪垫。然后以3-4天的间隔，小鼠被加强6次，并且最后在细胞融合的前一天进行免疫。在细胞融合前两周，待与淋巴结细胞融合的F0骨髓瘤细胞(ATCC，USA)的培养在含有10％FBS的DMEM(Gibco)中开始。从用Choi-CK和SCK细胞免疫的小鼠去除腘淋巴结，用DMEM培养基(Gibco)充分洗涤并精细切片。将细胞悬浮液转移至15-ml管。通过离心收集F0骨髓瘤细胞，悬浮于10ml的DMEM培养基中，并连同淋巴结细胞一起计数。然后，将106个F0骨髓瘤细胞和107个淋巴结细胞在50-ml管中混合，并且以200×g离心5min。弃除上清液后，将管在含有水的烧杯在37℃中温育2min。轻打管以松动细胞沉淀后，将1ml的PEG(Gibco)在超过一分钟的时间里缓慢地加入管中，同时在37℃水浴中轻摇管。在100×g离心细胞2min后，将5ml的DMEM培养基以超过3min缓慢地加入管中，并且将5ml的DMEM培养基以超过2min进一步地缓慢加入。然后通过200×g离心收集细胞。为了增加细胞融合效率和细胞存活率，基本培养基(DMEM+20％FBS)预先补充10％杂交瘤克隆因子(BioVeris，USA)。回收的细胞被小心地悬浮在30ml补充杂交瘤克隆因子的正常培养基(DMEM+20％FBS)中。将细胞悬浮液在37℃在CO2培养箱中温育30min后，105个细胞(70μl)被等分至96孔板并在37℃在CO2培养箱中温育。第二天，将70μl的HAT培养基加入每个孔，并且以3天为间隔在超过2周的时间内，观察板内是否在HAT培养基中形成集落。通过淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤集落的培养上清液用于下面的测试，其中淋巴细胞从用Choi-CK细胞免疫的小鼠淋巴结中和从用SCK细胞免疫的小鼠的淋巴结中分离。
【64】使用夹层ELISA(酶联免疫吸附分析)选择表达抗体的克隆。将100μl的杂交瘤培养物加入用2μg/ml的抗-小鼠IgG或IgM抗体包被的板，并使其在37℃反应1小时。然后在1∶5,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP；Sigma)-偶联的抗-小鼠IgG或IgM抗体中温育板1小时。用含有0.08％Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤板后，将含有OPD(Sigma)和H2O2的底物溶液加至每个孔，并且使用分光光度计在492nm测定吸光率用以选择产生抗体的克隆。
【65】在所选择的克隆中，测试相对稳定地分泌单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液与SCK和Choi-CK细胞的结合能力。详细地，用细胞解离缓冲液(Gibco)在37℃处理培养的Choi-CK细胞20min以将其解离至单个细胞，并将其通过40-μm的渗滤器。5×105个细胞用于流式细胞术。将解离至单个细胞的SCK和Choi-CK细胞悬浮于PBA(PBS中1％BSA)，并使抗体上清液在4℃反应30min。以1200rpm离心细胞5min后，弃除100μl的上清液，并且使细胞与1∶200稀释的抗-小鼠Ig-FITC(BD)在4℃反应30min。用PBA洗涤细胞两次后，选择碘化丙锭(propidium iodide，PI)阴性细胞并使用流式细胞仪(FACS caliber)评价与SCK和Choi-CK细胞的结合能力。
【66】选择分泌与SCK和Choi-CK细胞结合的抗体的各种杂交瘤，其通过连续亚培养(传代培养)来稳定，然后亚克隆。选择分泌抗体A10-A3的杂交瘤，其通过亚克隆稳定地保持对SCK和Choi-CK细胞的特异性。
【67】分泌A10-A3抗体的杂交瘤命名为“杂交瘤A10-A3”。该杂交瘤于2006年2月20日保藏于KCTC(韩国典型培养物保藏中心；韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)，52，Oun-dong，Yusong-ku，韩国大田市)并指定登录号KCTC10909BP。
【68】
【69】实施例3：单克隆抗体A10-A3识别的抗原的分离和鉴定
【70】
【71】实施例3-1：抗原分离
【72】
【73】按如下分离单克隆抗体A10-A3识别的细胞表面蛋白。首先，用PBS洗涤Choi-CK细胞并用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)生物素化该细胞。在裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 7.5，250mM NaCl，5mM EDTA，1％Nonidet P-40，2μg/ml牛胰蛋白酶抑制剂，100μg/ml苯甲基磺酰氟，5μg/ml抑蛋白酶醛肽)中4℃下温育细胞20min。离心细胞去除细胞碎片后，回收上清液，并使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度。
【74】在4℃将细胞裂解物与20μl G蛋白plus-琼脂糖(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz)反应2小时，并离心去除非特异性结合G蛋白plus-琼脂糖的蛋白。回收上清液并将其与约1μg抗体在4℃反应12小时。将20μl的G蛋白plus-琼脂糖加入反应混合物，然后在4℃温育2小时。离心反应混合物并回收沉淀物。用细胞裂解缓冲液洗涤回收的沉淀物十次以上，并使用10％SDS-PAGE分离保留的蛋白。
【75】将蛋白转移至硝酸纤维素膜上并进行蛋白质印迹。用含有5％脱脂奶的PBST(PBS+0.1％Tween 20)封闭硝酸纤维素膜1小时，并用PBST洗涤两次以上。然后，将印迹(blot)与链酶抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(1∶1,500；Amersham Biosciences)温育1小时。用PBST洗涤印迹五次后，用ECL试剂(Amersham Biosciences)显影生物素化的蛋白。
【76】发现A10-A3抗体结合约200kDa的蛋白(图2中的图A)。为了收集被A10-A3抗体免疫沉淀的蛋白，将1×108Choi-CK细胞的细胞裂解物根据如上所述的相同方法进行免疫沉淀，并在SDS-PAGE凝胶上电泳。用考马斯G250(Biorad)染色凝胶。
【77】
【78】实施例3-2：应用质谱鉴定抗原
【79】
【80】用考马斯G250(Coomassie G250)(BIO-RAD)染色含有被A10-A3抗体免疫沉淀的蛋白的SDS凝胶。从凝胶上切割蛋白条带，用30％甲醇洗涤5min，并精细切割。凝胶片用100％乙腈脱水10min，并在真空离心机中完全干燥30min。将干燥的凝胶片与50mM碳酸氢铵中的300ng胰蛋白酶(Promega)在37℃下温育16小时。用100μl的50mM碳酸氢铵提取消化的肽三次，并在真空离心机中干燥。使用电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(electrospray quadrupole time-of-flighttandem mass spectrometry，ESI Q-TOF MS/MS)(Q-TOF micro，MicroMass)分析肽混合物。A10-A3抗体识别的蛋白被鉴定为L1细胞粘附分子(L1CAM)(图3)。图3中，下划线区域表示由Q-TOF实际鉴定的氨基酸序列。因此，如实施例3-1所述，用购自Chemicon(USA)的抗L1CAM单克隆抗体JU127.11免疫沉淀生物素标记的Choi-CK细胞裂解物，并用ECL显影印迹。如图2(A)所示，发现A10-A3抗体和抗L1CAM抗体免疫沉淀了约200kDa的相同分子量的蛋白。
【81】
【82】实施3-3：应用蛋白质印迹鉴定L1CAM抗原
【83】
【84】为了确定A10-A3抗体识别L1CAM，使用A10-A3抗体在Choi-CK细胞裂解物中进行免疫沉淀。
【85】在4℃将细胞裂解物与20μl G蛋白plus-琼脂糖(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz)反应2小时，并离心去除非特异性结合G蛋白plus-琼脂糖的蛋白。回收上清液并将其与约1μg抗体在4℃反应12小时。将20μl的G蛋白plus-琼脂糖加入反应混合物，然后在4℃温育2小时。离心反应混合物并回收沉淀物(图2的预洗)。用细胞裂解缓冲液洗涤回收的沉淀物多于十次，并使用不含巯基乙醇的10％SDS-PAGE分离保留的蛋白。
【86】将蛋白转移至硝酸纤维素膜上并进行蛋白质印迹。用含有5％脱脂奶的PBST(PBS+0.1％Tween 20)封闭硝酸纤维素膜1小时，并用PBST洗涤两次以上。然后，用作为初次抗体的已知抗L1CAM抗体UJ127(Chemicon)温育印迹1小时。用PBST洗涤五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶联物(1∶1,500；Sigma)温育印迹1小时。用PBST洗涤印迹五次后，用ECL试剂(Amersham Biosciences)显影生物素化的蛋白。发现抗L1CAM抗体结合约200kDa的蛋白，该蛋白用A10-A3抗体免疫沉淀(图2的图B)。该结果证实A10-A3抗体识别L1CAM。
【87】
【88】实施例3-4：可溶性L1CAM的表达
【89】
【90】为了构建表达可溶性L1CAM的表达载体，使用RNA提取试剂盒(Rocheco.)从Choi-CK癌细胞分离总RNA。使用RT-PCR试剂盒(Roche Co.)进行PCR，该PCR使用该分离的总RNA作为模板，两个末端引物为Ig-dom-F(5′-GAG GAGGAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-3′，38mer)和L1-Fn-Stop-R(5′-CTC TAG AGT TCT CGA GTC AGA GCC TCA CGC GGC C-3′，34mer)以及pfu聚合酶(Solgent Co.)。PCR条件包括在95℃预温育5min，以95℃30sec、58℃30sec和72℃2min进行25个循环，以及最终在72℃延伸10min。
【91】用EcoR I和Xho I消化被扩增的可溶性L1DNA片段，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。将L1DNA片段从凝胶上切离，并用凝胶纯化试剂盒(Intron co.)纯化。使用T4DNA连接酶(Roche co.)，在16℃将消化的L1DNA片段与用EcoRI和Xho I消化的pJK-dhfr2表达载体(Aprogen)连接30min，并通过热击转化至大肠杆菌DH5α。从转化的细胞分离质粒DNA，并测定其DNA序列。DNA测序显示成功克隆可溶性L1CAM的cDNA。如此获得的表达载体被命名为“pJK-dhfr2-L1-单体”。
【92】为了以单体形式表达可溶性L1CAM，将pJK-dhfr2-L1-单体DNA转染至HEK293T细胞(ATCC CRL11268，下文中称为293T)。
【93】将10μg的表达载体DNA和Lipofectamine 2000(脂转染试剂)(Invitrogenco.)单独地加至500μl Opti-MEM培养基(Gibco BRL)，并使其在室温静置5min。然后，将该载体DNA与lipofectamine混合，并且使混合物在室温反应15min。在DNA-lipofectamine复合物形成过程中，小心地用PBS(pH 7.4)洗涤293T细胞，并将Opti-MEM培养基小心地加至细胞，然后去除。将DNA-lipofectamine复合物与4ml Opti-MEM培养基混合，并小心地滴在细胞上。将细胞于37℃在培养箱内温育。6小时后，细胞再次给予5ml Opti-MEM培养基，并进一步培养3天。
【94】
【95】实施例3-5：抗体与可溶性L1CAM的结合特异性的评价
【96】
【97】将表达可溶性L1CAM的293T细胞的培养液和另一种不表达可溶性L1CAM的293T细胞培养液进行10％SDS-PAGE，然后进行蛋白质印迹。用含有5％脱脂奶的TBST(TBS+0.05％Tween 20)在4℃封闭硝酸纤维素膜1小时，并用TBST洗涤两次以上。然后，用初次抗体——已知的抗L1CAM抗体UJ127(Chemicon)和5G3(Pharmingen)以及A10-A3和4-63抗体温育印迹1小时，每种抗体在含有5％脱脂奶的TBST中稀释1∶10,000。用TBST洗涤五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶联物(1∶1,500；Sigma)温育印迹1小时。用PBST洗涤印迹五次，并用ECL试剂(Amersham Biosciences)显影。发现每种抗体结合约200kDa的可溶性L1CAM(图2(C))。而且，使用上述抗体对表达L1的细胞培养物的ELISA显示，每种抗体对表达的可溶性L1CAM具有结合特异性。
【98】
【99】实施例4：肺癌细胞系中L1CAM的细胞表面表达的评价
【100】
【101】在无血清培养基(PFHM，Invitrogen)中培养杂交瘤A10-A3细胞系，并且使用G蛋白-琼脂糖柱(Pharmacia，Sweden)纯化分泌的A10-A3抗体(Fike等，Focus 12：79，1990)。使用荧光染色，根据与实施例2相同的方法评价纯化的A10-A3抗体对各种癌细胞的结合能力(图1)。图1中，用实线描绘轮廓的空峰代表用单克隆抗体A10-A3和4-63以及已知的抗L1CAM抗体5G3(Pharmingen，San Diego，USA)和UJ127(Chemicon)处理的样品，而实峰是单独第二抗体的背景荧光。使用流式细胞仪分析A10-A3、4-63、5G3和UJ127抗体对各种癌细胞的结合能力。FACS分析揭示，单克隆抗体结合NCI-H522、A549、DMS114、DMS53和NCI-H69肺癌细胞(图1的图A、B、C和D)，而它们不结合ACHN癌细胞、正常细胞、肝细胞、HUVEC或外周淋巴细胞(PBL)。
【102】
【103】实施例5：在肺癌组织中L1CAM表达的评价
【104】
【105】制备来自每种肿瘤的3μm厚的切片用于免疫组织化学染色。将切片放置在用聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，并在60℃干燥3小时。然后将切片在二甲苯中于室温脱蜡三次，每次5min，并在100％、90％、80％醇并随后在70％醇中水合，每种1min。将载玻片浸泡在靶标恢复液(target retrieval solution)(DAKO，Carpinteria，CA)中来恢复抗原性，并用TBST(Tris-缓冲盐水-Tween 20)洗涤，使用压力锅将TBST预先煮沸4min。将无生物素的酪胺信号扩增系统，CSA II(DAKO，Carpinteria，CA)用于免疫组织化学染色的高灵敏检测。将载玻片在3％过氧化氢中温育5min以阻断抗体的非特异性结合。用TBST洗涤两次，每次5min后，用充分地无血清的蛋白封闭液温育切片5min以阻断蛋白的非特异性结合。用初次抗体(A10-A3和4-63，1∶50稀释)温育组织切片15min，然后用抗小鼠免疫球蛋白-HRP温育15min。然后用扩增试剂和抗-荧光素-HRP温育切片，每种温育15min。最后，用DAB染色切片5min，并且用Meyer′s苏木精复染，随后用TBST洗涤两次，每次5min。根据如上所述的相同方法来染色阴性对照，除了用不含有初次抗体的正常绵羊血清或正常小鼠IgG1血清代替初次抗体。
【106】发现A10-A3和4-63抗体不结合正常组织，但结合鳞状细胞癌和腺癌组织——其占了大部分的非小细胞肺癌，以及结合小细胞肺癌组织(图4的图A和B)。在来自SCLC患者的58个组织样品中有49个样品(约85％)的L1CAM表达为阳性，并且在NSCLC患者的37个组织样品中有4个样品(约10％)的L1CAM表达为阳性。如图4的图C所示，发现与左侧充分分化的SCLC相比，在右侧A10-A3抗体与分化不完全的SCLC结合良好。这些结果表明，L1CAM在SCLC的进展过程中表达，并且抗L1CAM抗体可能是SCLC的有效治疗剂，原因在于它们阻断SCLC的进展。因此，本发明测试抑制L1CAM表达的siRNAs是否降低SCLC细胞的增殖或迁移。
【107】
【108】实施例6：针对L1CAM的siRNAs对肺癌细胞抑制作用的评价
【109】
【110】实施例6-1：在SCLC细胞中使用siRNAs抑制L1CAM的表达
【111】
【112】在细胞表面表达L1CAM的DMS114和DMS53SCLC细胞中，L1CAM的表达被敲除，如下所述。用L1CAM的两种siRNA寡核苷酸(5′-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3′和5′-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3′)或非特异寡核苷酸(5′-CAGTCGCGTT TGCGACTGGdtdt-3′)转染癌细胞并培养72小时。用流式细胞术、RT-PCR和使用A10-A3抗体的蛋白质印迹来评价L1CAM的敲除。结果，与用非特异siRNA处理的对照相比，当用针对L1CAM的siRNAs处理DMS114和DMS53细胞时，它们显示出在L1CAM总表达和细胞表面L1CAM水平的降低(图5A)。
【113】
【114】实施例6-2：L1CAM表达抑制后SCLC细胞活性的评价
【115】
【116】该测试比较用针对L1CAM的siRNA转染的肺癌细胞与用非特异siRNA转染的肺癌细胞之间的细胞增殖或迁移程度。72小时后通过用台盼蓝染色相同数目的细胞来评价增殖程度。用QCM 24孔细胞侵入分析试剂盒(Chemicon)和QCM 24孔比色细胞迁移分析试剂盒(Chemicon)分析迁移程度。用siRNA降低L1CAM表达的癌细胞与以正常水平表达L1CAM的癌细胞相比，显示出降低的迁移(图5B)和增殖(图5C)。这些结果表明，L1CAM在SCLC细胞的生长和迁移中发挥作用。
【117】
【118】实施例7：使用L1CAM特异抗体对SCLC细胞的生长抑制
【119】
【120】评价抗L1CAM抗体对SCLC细胞生长的抑制作用。DMS53(图6A)和DMS114(图6B)细胞，其被A10-A3抗体结合，被用于该测试。将细胞(1×104)接种在24孔板上，每孔含有1ml培养基，并培养。将A10-A3、4-63、UJ127和5G3抗体以10μg/ml分别加至每个孔，并将细胞在培养箱中于37℃温育10天。每两天用含有抗体的新鲜培养基来更换培养基。以2天间隔收集细胞，并使用0.2％台盼蓝计数存活细胞的数目并以总细胞数目的百分比表示。当用A10-A3抗体处理时，DMS114和DMS53细胞显示出约30％的生长降低。
【121】当用4-63抗体以及已知的UJ127(Chemicon)和5G3(Pharmingen)抗体处理DMS114细胞时——所有抗体均特异地结合L1CAM，发现4-63和UJ127抗体结合癌细胞(图1B和D)并随后抑制细胞生长约30％；而发现5G3抗体结合DMS114细胞(图1C)，没有生长抑制(图6C)。这些结果显示，抗L1CAM抗体与肿瘤细胞的结合不一定抑制肿瘤细胞的生长。如图7B所示，5G3抗体不抑制DMS114细胞的侵入。
【122】
【123】实施例8：L1CAM特异性抗体对SCLC细胞侵入和迁移的抑制作用
【124】
【125】使用QCM 24孔细胞侵入分析试剂盒(CHEMICON)进行细胞侵入分析。使用300μl的预热无血清培养基(RPMI，10mM HEPES，pH 7.4)在室温再水合每个插入物(insert)的ECM层30min。用PBS洗涤DMS 114和DMS53细胞两次，并用3ml胰蛋白酶-EDTA在培养箱中于37℃下处理。收集分开的细胞并在200μl侵入培养基(RPMI，10mM HEPES，pH 7.4，0.5％BSA)中调整至密度1×105细胞。然后将细胞插入至每个插入物，并与A10-A3抗体、4-63抗体、5G3抗体(10μg/ml)和正常小鼠IgG(10μg/ml)温育。用含有10％FBS的侵入培养基填充下室(lower chamber)，并在培养箱中于37℃温育72小时。然后，去除保留在每个插入物中的细胞和培养基，并将每个插入物转移至新孔。将每个插入物置于225μl预热的细胞脱离溶液(detachment solution)，并在培养箱中于37℃温育30min。振荡插入物以使保留的细胞完全脱离，并将75μl的裂解缓冲液/染液加入到每个含有细胞和细胞脱离溶液的孔，然后在室温温育15min。将200μl的混合物转移至96孔板，在480/520nm读取荧光。发现A10-A3抗体诱导对DMS114和DMS53细胞侵入约30％的抑制(图7A)。而且4-63和UJ127抗体降低两种细胞类型的侵入约30％。相反，已知的5G3抗体不能抑制DMS114细胞的侵入(图7C)。
【126】使用QCM 24孔比色细胞迁移分析试剂盒(Chemicon)进行细胞迁移分析。测试方法与细胞侵入分析相同。发现A10-A3抗体抑制DMS114和DMS53细胞迁移约30％(图7B)。而且，4-63和UJ127抗体抑制两种细胞类型的迁移约20％(图7D)。
【127】
【128】实施例9：A10-A3抗体对SCLC细胞中信号转导的抑制作用
【129】
【130】实施例9-1：ERK磷酸化的抑制
【131】
【132】进行蛋白质印迹以检测A10-A3抗体是否降低涉及肿瘤细胞生长、迁移和存活的胞外信号调节激酶(ERK)1/2磷酸化。用10μg/ml的A10-A3温育DMS114和DMS53细胞30、60和120min，收集并用细胞裂解缓冲液裂解。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，并使用12％SDS-PAGE分离40μg的蛋白。以25V 90min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。将印迹用5％脱脂奶于4℃过夜封闭，并用在1％脱脂奶中兔多克隆抗磷酸ERK1/2抗体(Abcam，1∶1000稀释)过夜温育。根据如上所述的相同方法处理相同量的蛋白，以研究非磷酸化ERK1/2的表达，并且用抗ERK1/2抗体(Abcam，1∶1000稀释)温育被封闭的硝酸纤维素膜1小时。用抗兔HRP偶联抗体(Cell Signaling，1∶10000稀释)温育印迹1小时。用PBST洗涤印迹后，使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)检测磷酸ERK1/2和ERK1/2。只有在用A10-A3抗体处理的、表达相同ERK1/2的DMS114和DMS53细胞中，磷酸-ERK1/2水平显著降低(图8)。
【133】
【134】实施例9-2：A10-A3抗体对AKT磷酸化的抑制
【135】
【136】进行蛋白质印迹以检测A10-A3抗体是否降低涉及肿瘤细胞存活的AKT磷酸化。用10μg/ml的A10-A3抗体温育DMS114和DMS53细胞30、60和120min，收集并用细胞裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，并在12％SDS-PAGE上分离40μg的蛋白。以25V 90min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶将印迹于4℃过夜封闭，并用在1％脱脂奶中的兔多克隆抗磷酸Akt抗体(Abcam，1∶1000稀释)和兔多克隆抗Akt(Abcam，1∶1000稀释)过夜温育。随后用抗兔IgG HRP(Santa Cruz，1∶1000稀释)温育印迹1小时。用PBST洗涤印迹后，使用增强的化学发光试剂(ECL)(AmershamPharmacia Biotech)检测磷酸-Akt和总Akt。用A10-A3抗体处理的细胞中，磷酸-AKT水平显著降低(图8)。
【137】
【138】实施例9-3：A10-A3抗体抑制FAK激活
【139】
【140】进行蛋白质印迹以检测A10-A3抗体是否降低在肿瘤细胞的生长和迁移中发挥重要作用的黏着斑激酶(FAK)的磷酸化。用10μg/ml的A10-A3抗体温育DMS114和DMS53细胞30、60和120min，收集并用细胞裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，并在7.5％SDS-PAGE上分离40μg的蛋白。以25V 90min将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶将印迹于4℃过夜封闭，并用在1％脱脂奶中的兔多克隆抗磷酸FAK抗体(Abcam，1∶1000稀释)温育过夜和然后用抗β-肌动蛋白(Oncogene，1∶4000稀释)温育1小时。然后印迹用抗兔HRP-偶联抗体(Cell Spring，1∶10000稀释)温育1小时。用TBST洗涤印迹后，使用增强的化学发光试剂(ECL)(Amersham Pharmacia Biotech)检测磷酸-FAK和β-肌动蛋白水平。用A10-A3抗体处理的DMS114和DMS53细胞中，磷酸-FAK水平降低(图8)。
【141】
【142】实施例10：L1CAM特异性抗体对NSCLC细胞生长的抑制作用
【143】
【144】由于L1CAM也在NSCLC细胞中表达，所以，如实施例5所述，评价抗L1CAM抗体以确定它们是否抑制NSCLC细胞的生长或迁移。
【145】
【146】实施例10-1：抗L1CAM抗体对NSCLC细胞生长的抑制作用
【147】
【148】为了确定抗L1CAM抗体是否抑制NSCLC细胞的生长，使用A10-A3抗体结合的A549和NCI-H522细胞进行细胞增殖抑制分析，如实施例7中所述。将10μg/ml的A10-A3抗体加入培养的细胞，并且每两天用含有抗体的新鲜培养基来更换培养基。以2天间隔收集细胞，并使用0.2％台盼蓝计数存活细胞的数目并以总细胞数目的百分比表示。发现，A10-A3抗体降低A549和NCI-H522细胞的生长，但这些生长抑制作用低于对其它癌细胞的抑制作用(例如，胆管癌或SCLC细胞)(图9A)。已知的JU127抗体也显示出几乎相同的结果。
【149】
【150】实施例8：抗L1CAM抗体对NSCLC细胞迁移的抑制作用
【151】
【152】根据与实施例8相同的方法，评价A10-A3抗体对A549和NCI-H522细胞迁移的抑制作用。A10-A3抗体显著降低A549和NCI-H522细胞的迁移(图9B)。已知的JU127抗体也显示出几乎相同的结果。这些结果显示，抗L1CAM抗体可能通过抑制NSCLC的转移对NSCLC具有治疗作用。
【153】
工业实用性
【154】如上文所述，本发明人鉴定了L1CAM在SCLC的进展中发挥重要作用，这与以往已知的发现相反。抗体——识别SCLC细胞表面的L1CAM蛋白并特异性地结合SCLC组织，或siRNAs、反义寡核苷酸或shRNAs——在SCLC细胞中阻抑L1CAM表达，以及包含根据本发明的抗体、siRNAs、反义寡核苷酸或shRNAs的药物组合物可通过抑制SCLC细胞的生长、侵入和迁移来用于SCLC治疗。另外，还发现L1CAM在NSCLC中表达，并且发现抗L1CAM抗体降低NSCLC的增殖和迁移。因此，特异性地结合在NSCLC中表达的L1CAM并且由此抑制L1CAM活性的抗体可用于NSCLC的治疗。

Claims (8)

1.抑制肺癌细胞的生长或转移的药物组合物，其包括抑制L1CAM活性或表达的物质，其中所述抑制L1CAM活性的物质选自抑制L1CAM活性的L1CAM特异性抗体、抗L1CAM抗体的抗原结合片段和抗L1CAM抗体或其抗原结合片段的变体，并且所述抑制L1CAM表达的物质是抑制L1CAM表达的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抑制L1CAM活性的物质识别膜结合形式或可溶形式。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抑制L1CAM表达的寡核苷酸选自针对编码L1CAM基因的反义寡核苷酸、siRNA和shRNA。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体是4-63，其由具有登录号KCTC 10966BP或UJ127的杂交瘤分泌。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述siRNA具有5′-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3′或5′-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3′的序列。
6.一种治疗肺癌的方法，其包括施用权利要求1所述的组合物。
7.一种抑制肺癌细胞的增殖或转移的方法，通过抑制L1CAM的表达或活性来进行。
8.一种诊断肺癌的方法，其使用抗L1CAM抗体。
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