CN115867584A - 用于减少嵌合抗原受体强直信号传导的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及与嵌合抗原受体(“CAR”)有关的方法和组合物，以及对框架序列的修饰以消除强直信号传导。所述组合物包含对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的经修饰结合成员，并且在制备成单链抗体(scFv)并纳入CAR时是稳定的。所述方法进一步包含用于CSPG4CAR表达的核酸构建体，以及CSPG4CAR用于治疗癌症的治疗方法的应用。本公开还涉及人源化框架序列的修饰。

Description

用于减少嵌合抗原受体强直信号传导的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119要求于2020年6月29日提交的美国临时申请第63/045,646号的利益，该申请通过引用整体并入本文，包含其相应的序列表。
关于联邦资助的研究或开发的声明
这项工作得到了美国国立卫生研究院、Passan基金会(NVD)、美国国防部W81XWH-16-1-0500(SF)和Il Fondo di Gio Onlus(SP)的R01 CA193140(GD)、1R35 GM134864(NVD)、UL1 TR002014(NVD)、RO1DE028172(SF)、RO3CA239193(SF)和RO3CA216114(SF)的支持。GD还得到了Cell Medica的支持。内容完全由作者负责，并且不必然代表NIH的官方观点。763.74单克隆抗体及其人源化形式的序列已作为临时专利提交。
序列表的并入
序列表特此通过引用整体并入，包含名为P35071WO00_ST25.txt的文件，该文件大小为249,328字节并且创建于2021年6月27日，同样通过引用整体并入本文。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)在其最初的概念中是融合蛋白，其中单克隆抗体的重链(VH)可变区和轻链(VL)可变区与不可裂解的柔性接头组装以形成单链抗体(scFv)，所述单链抗体与T细胞受体的信号传导分子和共刺激胞内域融合。参见Eshhar等人，“通过由抗体结合结构域和免疫球蛋白和T细胞受体的γ或ζ亚基组成的嵌合单链特异性激活和靶向细胞毒淋巴细胞”，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)》90:720-724(1993)；Finney等人，“在单一基因产物的T细胞中提供初级和共刺激信号传导的嵌合受体”，《免疫学杂志(J.Immunol.)》161:2791-2797(1998)；Imai等人，“具有4-1BB信号传导能力的嵌合受体引发对急性淋巴细胞白血病的强大细胞毒性”，《白血病(Leukemia)》18:676-684(2004)。当将CD19特异性CAR移植到T细胞中，并将这些细胞输注到患有急性B细胞白血病的儿科患者中时，获得了明显和持续的抗肿瘤活性。参见Maude等人，“用于白血病的持续缓解的嵌合抗原受体T细胞”，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》371:1507-1517(2014)。
CAR与肿瘤细胞表达的抗原的接合促进了T细胞的快速和深度激活，其特点是细胞溶解、细胞因子的分泌和增殖。参见Dotti等人，“使用表达嵌合抗原受体的T细胞进行治疗的设计和开发”，《免疫学综述(Immunol.Rev.)》257:107-126(2014)。然而，事实表明CAR可以引起T细胞的强直信号传导，这表示持续的抗原独立激活会导致T细胞迅速耗竭和抗肿瘤活性受损(Long等人，“4-1BB共刺激改善了嵌合抗原受体的强直信号传导引起的T细胞耗竭”，《自然医学(Nat.Med.)》21:581-590(2015)(“Long等人(2015)”)。第一篇描述CAR-T细胞强直信号传导的报告将这种效应归因于某些scFv的自我聚集倾向，该倾向导致细胞表面的CAR成簇和随之而来的信号传导。参见同上。在其他免疫细胞(包含NKT细胞)中也观察到类似的强直信号传导。参见Xu等人，“共表达GD2特异性嵌合抗原受体和IL-15的NKT细胞显示出体内持久性和对神经母细胞瘤的抗肿瘤活性增强”，《临床癌症研究(Clin.CancerRes.)》25(23):7126-7138(2019)。
众所周知，VH和VL结构域偶联形成的scFv有展开的趋势，导致scFv寡聚。参见Worn和Pluckthun，“抗体单链Fv片段的稳定性工程”，《分子生物学杂志(J Mol.Biol.)》305:989-1010(2001)(“Worn和Pluckthun(2001)”)。为了努力稳定scFv，已经开发了多种策略，包含在VH和VL结构域之间工程化二硫键，在VH和VL结构域内引入带电氨基酸，或将互补决定区(CDR)植入到不同的框架区(FWR)。参见Young等人，“通过引入二硫键实现单链Fv抗体片段的热稳定”，《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)》377:135-139(1995)；Miller等人，“用于开发双特异性和多价抗体的scFv的稳定性工程”，《蛋白质工程设计与选择(ProteinEng Des Sel)》23:549-557(2010)；和Kugler等人，“通过设计的点突变和将CDR移植到人的框架上来稳定和人源化人类淋巴细胞抗原CD19特异性的单链Fv抗体片段”，《蛋白质工程设计与选择》22:135-147(2009)。在组装成CAR形式的scFv的背景下，由小鼠14g2a单克隆抗体衍生的scFv引起的强直信号传导被特别归因于该抗体的FWR。参见Long等人(2015)。值得注意的是，将衍生自FMC63单克隆抗体(mAb)的scFv的CDR移植到14g2a抗体的FWR中足以引起FMC63 scFv的强直信号传导，当将这种scFv用于生成CAR时，表明FWR在引起CAR形式的scFv的强直信号传导方面起着关键作用。参见同上。
TCR介导的强直信号传导是初始T细胞的特征明确的稳态特性，并且在促进其长期持久性方面起着关键作用。参见Myers等人，“强直信号：淋巴细胞为什么烦恼？”《免疫学趋势(Trends Immunol.)》38:844-857(2017)。然而，TCR介导的强直信号传导需要TCR与以I类或II类呈现的自体肽的接合，并且严格限制在位于淋巴器官的T细胞。参见Hochweller等人，“树突状细胞控制对外来抗原反应性所需的T细胞强直信号传导”，《美国国家科学院院刊》107:5931-5936(2010)。与此形成鲜明对比的是，T细胞中CAR介导的强直信号传导，从严格意义上讲，是指独立于任何特定CAR接合并且定义为细胞因子如IFNγ的自发释放的CAR信号传导。参见Long等人(2015)。触发CAR介导的强直信号传导的事件已被确定为足够数量的CAR分子的自发聚集，这会导致信号传导的启动。参见Long等人(2015)。在这里，我们证实了强直信号传导是由于CAR分子的自我聚集，并进一步证明了CAR-CD3ζ链专门负责自发的细胞因子释放，因为CAR-CD3ζ链的功能丧失完全取消了INFγ的自发释放。自发的细胞因子释放，而不是检测与T细胞耗竭相关的细胞表面标志物，似乎是界定CAR强直信号传导的存在和功能降低的最有力和可靠的测定。
已经认识到合成scFv的不稳定性导致其自发聚集，阻碍了可溶性试剂的产生。参见Worn和Pluckthun(2001)；Miller等人，“用于开发双特异性和多价抗体的scFv的稳定性工程”，《蛋白质工程设计与选择》23:549-557(2010)。我们先前已经证明了结构建模和计算蛋白设计驱动的诱变可以用来恢复因融合VL和VH结构域而扭曲的scFv的特异性。参见Krokhotin等人“计算指导的单链可变片段设计提高了嵌合抗原受体的特异性”，《分子疗法肿瘤学(Mol.Ther.Oncolytics.)》15:30-37(2019)。一般来说，蛋白质的热力学稳定性(ΔG)对其生物功能至关重要。蛋白质中的氨基酸突变可以破坏重要的残基相互作用，改变蛋白质活性位点和蛋白质稳定性。这些不稳定的突变蛋白构象是众多人类病症本来源。参见Redler等人，“作为各种遗传性病症的共同因素的蛋白质不稳定”，《分子进化杂志(JMol.Evol.)》82:11-16(2016)。因此，量化突变对蛋白质结构的影响对估计蛋白质的稳定性并因此估计其功能是重要的。
对于在使用含有不同铰链/间隔区或不同载体/启动子的CAR的T细胞中，共刺激CD28和4-1BB胞内域在加剧或减弱CAR强直信号传导方面的作用，已经有相互矛盾的数据报道。参见Long等人，(2015)；Frigault等人，“介导T细胞组成性或诱导性增殖的嵌合抗原受体的鉴定”，《癌症免疫研究(Cancer Immunol.Res.)》3:356-367(2015)；和Watanabe等人，“对CAR间隔子进行微调提高了T细胞的效力”，《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》5:e1253656(2016)。尽管有这些相互矛盾的数据，但还是可以得出结论，scFv的内在不稳定性不能通过使用的共刺激类型或修改CAR结构的其他组分来纠正。事实上，尽管原始抗体在抗原特异性和亲和力方面有优异表现，但CAR强直信号传导经常被认为是从进一步CAR开发中放弃特定scFv的好理由。
技术领域
本公开涉及工程化结合结构域、嵌合抗原受体以及用工程化结合结构域和嵌合抗原受体转化的宿主细胞，以防止免疫细胞中的强直信号传导。本公开进一步涉及工程化结合结构域、嵌合抗原受体和宿主细胞，其具有含有来自小鼠的氨基酸取代以提供人和小鼠的相容性的人源化框架区。
发明内容
本公开提供并包含一种对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的结合成员，所述结合成员包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ IDNO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ IDNO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)。
本公开提供并包含一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，所述构建体包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的核酸序列，所述编码序列包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包括：胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段。
本公开提供并包含一种编码CAR的核酸分子，所述CAR包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段。
本公开提供并包含一种用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，所述方法包括从供体中分离外周血单核细胞("PBMC")，从PBMC中分离自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞以制备分离的免疫细胞，和将分离的免疫细胞扩增1至20天以通过内源性T细胞受体的刺激以及共刺激受体、细胞因子或两者的组合的共刺激制备用于基因工程的扩增的免疫细胞，以及引入嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，所述构建体包括胞外域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:61至109组成的群组的可变轻链和选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的可变重链。
本公开提供并包含一种基因工程化免疫细胞，所述基因工程化免疫细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的表达构建体，所述编码序列包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ IDNO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种细胞群，所述细胞群包括多个基因工程化免疫细胞，所述基因工程化免疫细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的表达构建体，所述编码序列包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述CAR包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ IDNO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种抑制个体中硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)阳性细胞的方法，所述方法包括使细胞与治疗有效量的基因工程化免疫细胞接触的步骤，其中所述免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ IDNO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ IDNO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用基因工程化免疫细胞的步骤，所述基因工程化免疫细胞包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ IDNO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ IDNO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种试剂盒，所述试剂盒包括载体、宿主细胞或其组合，所述试剂盒包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的核酸序列，所述编码序列包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ IDNO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种在表达嵌合抗原受体(CAR)编码序列的NKT细胞中维持NKT细胞扩增潜力的方法，所述编码序列包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ IDNO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)；所述方法包括表达包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，和培养工程化NKT细胞以制备具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群。
一种减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，所述方法包括识别当作为CAR的一部分在小鼠免疫细胞中表达时具有强直信号传导的scFv，生成scFv的结构模型，和进行计算诱变以制备一系列诱变的scFv，计算诱变的scFv的自由能，将诱变的scFv与包括框架1.4(FW1.4)的人源化scFv进行比对，从而识别关键的鼠残基；以及引入一个或多个人到小鼠残基变化，以增加scFv的稳定性和制备用于小鼠模型的经修饰人源化scFv。
附图说明
参考附图公开了本公开，其中：
图1呈现了表达编码scFv 763.74(A)(SEQ ID NO:28)的CAR的CAR-T细胞的实施例的强直信号传导结果。图1A呈现了流式细胞术的代表图，其显示了在培养的第8天评估的T细胞中的CAR表达。763.74(A)CD28和763.74(A)4-1BB表示T细胞中表达的特定CAR。图1B呈现了由在没有任何CAR特异性激活的情况下表达对照CAR(CTR)、763.74(A)CD28或763.74(A)4-1BB CAR的T细胞释放的IFNγ的量化。在2mL不含细胞因子的完全培养基中以106个细胞/孔在24孔板中铺板后24小时收集的上清液中测量IFNγ。数据表示为平均值±SD，n＝10，*P＝0.0184，***P＝0.0003(CTR相对于763.74(A)CD28)，P＝0.0004(763.74(A)CD28相对于763.74(A)4-1BB)，配对t检验。图1C呈现了由在没有任何CAR特异性激活的情况下表达对照CAR(CTR)、763.74(A)CD28ζY6F或763.74(A)4-1BBζY6F CAR的T细胞释放的IFNγ的量化。数据表示为平均值±SD，n＝4。图1D呈现了代表性共聚焦显微镜图像，其显示了表达GFP标记的CAR的T细胞中的GFP聚集(箭头)，其中CAR是使用scFv 763.74(A)和CD28或4-1BB胞内域获得的。表达CAR(CTR)或GFP的T细胞是对照。显示了单个场的代表细胞(放大倍数63倍)。
图2呈现了比对，其显示了逆转CAR-T细胞中的强直信号传导的scFv 763.74(A)的FWR中的氨基酸取代。图2A呈现了scFv 763.74(A)(SEQ ID NO:28)和scFv 763.74(B)(分别为SEQ ID NO:68、115和29)的VL(SEQ ID NO:67)和VH(SEQ ID NO:110)的序列。框表示氨基酸取代的位置。图2B呈现了代表性流式细胞术图，其显示了用编码CD28或4-1BB胞内域的scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR工程化的T细胞中的CAR表达。非转导(NT)T细胞显示为阴性对照。图2C呈现了由在没有任何CAR特异性激活的情况下表达不同CAR的T细胞释放的IFNγ的量化结果。CTR表示对照CAR-T细胞。在2mL不含细胞因子的完全培养基中以106个细胞/孔在24孔板中铺板后24小时收集的上清液中测量IFNγ。数据表示为平均值±SD，n＝5，*P＝0.0154 763.74(A)CD28相对于4-1BB；*P＝0.194 763.74(A)相对于(B)4-1BB，配对t检验。图2D呈现了代表性共聚焦显微镜图像，其显示了表达GFP标记的CAR的T细胞中的GFP聚集，其中CAR是使用scFv 763.74(A)或scFv 763.74(B)和CD28或4-1BB胞内域获得的。显示了单个场的代表细胞(放大倍数63倍)。
图3呈现了破坏scFv稳定性的scFv 763.74(A)的FWR中的氨基酸取代。图3A呈现了通过计算建模生成的scFv 763.74(B)的结构构象的带状图，其中显示了FWR突变。图3B呈现了选定的氨基酸突变，评价它们对scFv 763.74(B)稳定性的影响。ΔΔGmut>0的scFv763.74(B)结构突变不稳定，随后影响T细胞中CAR形式的scFv的自发聚集。图3C呈现了V123(SEQ ID NO:256至274)处突变的计算ΔΔG。图3D呈现了E127(SEQ ID NO:275至295)处突变的计算ΔΔG。
图4呈现了表达具有CD28的763.74(B)CAR的T细胞在黑色素瘤肿瘤模型中介导肿瘤消除的效果结果。图4A呈现了代表性流程图(A)，并且图4B呈现了实验的残余肿瘤细胞的量化总结，其中使对照T细胞(CTR)和用编码CD28或4-1BB胞内域的scFv763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR工程化的T细胞与黑色素瘤细胞系(E:T＝1:5)共培养5天。将细胞收集并用CD3和CD276(B7-H3)mAb染色以通过流式细胞术分别识别T细胞和黑色素瘤细胞。数据表示为平均值±SD，n＝6，****P<0.0001，双因素方差分析与Bonferroni校正。图4C呈现了黑色素瘤异种移植模型的实验方案。皮下注射(s.c.)eGFP-FFLuc WM115(5×105个细胞)，并在7天后向小鼠静脉内注射(i.v.)对照T细胞(CTR)或用编码CD28或4-1BB胞内域的scFv763.74(A)CAR和scFv763.74(B)CAR工程化的T细胞(5×106个细胞)。图4D呈现了按照方案(C)治疗的小鼠的代表性肿瘤生物发光(BLI)(标度：最小＝5×106；最大＝5×108)。图4E呈现了(D)中移植的小鼠的肿瘤体积代表图。虚线代表个体小鼠，并且加粗实线代表组的平均值。4个独立实验的总结(对于每种条件，n＝12)，***P＝0.00012；****P<0.0001，双因素方差分析与Bonferroni校正。
图5呈现了表达具有CD28的763.74(B)CAR的T细胞在胶质母细胞瘤肿瘤模型中的抗肿瘤活性结果。图5A呈现了胶质母细胞瘤(GBM)异种移植模型的实验方案。将GBM-NS(1×105个细胞)注入尾状核(i.c)，并在15天后向小鼠瘤内注射对照T细胞(CTR)或用编码CD28或4-1BB胞内域的scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR工程化的T细胞(2×106个细胞)。用磁共振成像(MRI)监测肿瘤生长。图5B至5F呈现了利用注射造影剂的T1加权图像(T1-wi)和T2加权图像(T2-wi)进行的代表性MRI，其显示了如(A)中所述治疗的小鼠的肿瘤进展和浸润模式。图5G呈现了如(A)中所述治疗的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。对于CTR、763.74(A)CD28、763.74(B)4-1BB，n＝7只小鼠/组。对于763.74(B)CD28和763.74(A)4-1BB，n＝15只小鼠/组。总存活统计分析使用Mantel-Cox对数秩检验进行。图5H呈现了在肿瘤内递送T细胞后的指定时间点，从肿瘤中分离出的CAR-T细胞中CD69表达的代表性时间过程。数据表示为平均值±SD，n＝2。
图6呈现了scFv 763.74(A)的FWR人源化对CAR强直信号传导和抗肿瘤活性的影响的结果。图6A呈现了代表性流式细胞术图，其显示了在培养的第8天评估的用编码CD28(h763.74(#2)CD28和h763.74(#5)CD28)的h763.74(#2)(SEQ ID NO:111)和h763.74(#5)(SEQ ID NO:114)CAR工程化的T细胞中的CAR表达。非转导(NT)T细胞显示为阴性对照。图6B呈现了在2mL不含细胞因子的培养基中以5×105个细胞/孔铺板后，使对照(CTR)、h763.74(#2)CD28和h763.74(#5)CD28 CAR-T细胞静置24小时收集的上清液中IFNγ的代表性量化。数据表示为平均值±SD，n＝6。图6C呈现了共培养实验的代表性流程图，其中使对照(CTR)或表达h763.74(#2)CD28 CAR或h763.74(#5)CD28 CAR的T细胞与黑色素瘤细胞系(E:T＝1:5)一起铺板5天。将细胞收集并用CD3和CD276(B7-H3)mAb染色以通过流式细胞术分别识别T细胞和黑色素瘤细胞。图6D呈现了黑色素瘤异种移植模型的实验方案。皮下注射(s.c.)eGFP-FFLuc WM115(5×105个细胞)，并在7天后向小鼠静脉内注射(i.v.)对照T细胞(CTR)或用763.74(B)CD28 CAR或h763.74(#2)CD28 CAR或h763.74(#5)CD28 CAR工程化的T细胞(5×106个细胞)。图6呈现了根据方案(D)治疗的小鼠的肿瘤BLI动力学。虚线代表个体小鼠，并且加粗实线代表组的平均值。2个独立实验的总结(对于每组，n＝10)。图6F呈现了将如(D)中所述治疗的eGFP-FFLuc WM115荷瘤小鼠安乐死时外周血、肝和脾中人CD3+CD45+细胞的量化。数据表示为平均值±SD，n＝6。G.处死如(D)中所述治疗的eGFP-FFLuc WM115荷瘤小鼠时外周血中对人CD3+CD45+细胞门控的CAR-T细胞的百分比。数据表示为平均值±SD，n＝6。
图7呈现了使用衍生自763.74抗体的scFv生成的CAR的构建体和在T细胞中的表达特征。图7A呈现了763.74(A)CAR构建体的图。图7B呈现了在培养第8天评估的在用763.74(A)CD28ζY6F CAR或763.74(A)4-1BBζY6F CAR工程化的T细胞中CAR表达的代表性流程图和总结。数据表示为平均值±SD，n＝4。非转导(NT)T细胞显示为阴性对照。
图8呈现了根据本公开的表达scFv 763.74(A)CAR或763.74(B)CAR的T细胞的特征。图7A呈现了在培养第8天评估的在对照CAR-T细胞(CTR)和用编码CD28或4-1BB胞内域的scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR工程化的T细胞中的CAR表达的总结。数据表示为平均值±SD，n＝8。非转导(NT)T细胞显示为阴性对照。图8B呈现了如(A)所示的CTR和CAR-T细胞在培养的第6天和第10天的总细胞数。数据表示为平均值±SD，n＝4。图8C呈现了代表性细胞的显微镜图像，其显示了CAR分子在表达GFP标记的763.74(A)CD28 CAR、763.74(A)4-1BB CAR、763.74(B)CD28 CAR和763.74(B)4-1BB CAR的T细胞的细胞表面上的分布。显示了通过共聚焦显微镜拍摄的单个场的代表性图像(放大倍数，63倍)。图8D呈现了由抗独特型抗体介导的CAR交联后，如(C)所述，GFP标记的CAR分子在T细胞表面上的分布。显示了通过共聚焦显微镜拍摄的单个场的代表性图像(放大倍数，63倍)。图8E呈现了显示在培养的第10天时通过流式细胞术评估的如(A)所示的CTR和CAR-T细胞的细胞亚组组成的图。数据表示为平均值±SD，n＝4。图8F是代表性图，其呈现了在培养的第10天时通过流式细胞术评估的如(A)所示的CTR和CAR-T细胞中的耗竭相关标志物的表达。数据表示为平均值±SD，n＝4。
图9呈现了对氨基酸突变对scFv 763.74(B)稳定性影响的评价。图9A呈现了763.74(A)V-轻的第3位(SEQ ID NO:159至1831的第3位)处突变的自由能变化(ΔΔG)。B.T5(SEQ ID NO:184至202)处突变的ΔΔG。C.A9(SEQ ID NO:203至221)处突变的ΔΔG。D.E83(SEQ ID NO:232至249)处突变的ΔΔG。E.Q124(SEQ ID NO:256至274)处突变的ΔΔG。F.V126(SEQ ID NO:315至333)处突变的ΔΔG。G.L230(SEQ ID NO:276至295)处突变的ΔΔG。
图10呈现了表达scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR的T细胞的抗肿瘤活性的代表性结果。图10A呈现了通过流式细胞术评估的硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)抗原在黑色素瘤细胞系中的表达。虚线和实线分别代表同种型和CSPG4 mAb。图10B呈现了对照CAR-T细胞(CTR)和用编码CD28或4-1BB胞内域的scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR工程化的T细胞与黑色素瘤细胞系(E:T＝1:5)共同培养24小时后，收集的上清液中IFNγ和IL-2产生的代表性量化结果。数据表示为平均值±SD，n＝5。图10C呈现了用eGFP-FFLucWM115肿瘤细胞(5×105个细胞/小鼠)s.c.移植并用CTR或表达编码CD28或4-1BB胞内域的scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR的T细胞(5×106个细胞/小鼠)治疗后7天的小鼠的肿瘤BLI动力学的代表性结果。虚线代表个体小鼠，并且加粗实线代表组的平均值。四个独立实验的总结(对于每种条件，n＝12)，****，P<0.0001，双因素方差分析与Bonferroni校正。
图11呈现了表达编码CD28的763.74(B)CAR的T细胞的代表性结果，其显示在最早的时间点消除了大部分的GBM-NS。图11A是代表性实验中不同时间点(2、4、6和24小时)肿瘤细胞的量化总结，其中将对照(CTR)和表达编码CD28或4-1BB胞内域的scFv 763.74(A)CAR和scFv 763.74(B)CAR的细胞与GBM-NS共培养(E:T＝1:5)。数据表示为平均值±SD，n＝5。图11B呈现了CAR-T细胞与GBM-NS共培养两小时后的代表性FSC-SSC点阵图。CAR-T细胞和肿瘤细胞分别通过评价表达CD45和CSPG4的细胞百分比来测量。图11C呈现了与GBM-NS共培养的CAR-T细胞中CD69表达的代表性流式细胞术叠加直方图。
图12呈现了scFv 763.74(A)的人源化过程和突变体的测试。图12A呈现了ScFv人源化和工程化的工作流程。图12B呈现了通过流式细胞术分析的人源化scFv h763.74(#2)、h763.74(#3)、h763.74(#4)和h763.74(#5)的代表性结合结果。将CSPG4+MDA-MB-231和CSPG4-MDA-MB-468与scFv(10μg/ml)一起孵育，然后用蛋白-L-生物素(0.3μg/ml)和藻红素标记的链霉亲和素(SAV-PE)进行染色。图12C呈现了在培养的第8天评估的CTR T细胞和使用不同h763.74 CAR生成的T细胞中CAR表达的总结。数据表示为平均值±SD，n＝3。非转导(NT)T细胞显示为阴性对照。图12D呈现了实验的残留肿瘤细胞的量化总结，其中将对照(CTR)或不同类型的h763.74 CAR-T细胞与WM155黑色素瘤细胞系(E:T＝1:5)共培养5天。数据表示为平均值±SD，n＝3。然后收集细胞，并用CD3和CD276(B7-H3)mAb染色以通过流式细胞术分别识别T细胞和黑色素瘤细胞。图12E呈现了如(D)所示的24小时共培养(E:T＝1:5)后收集的上清液中IFNγ和IL-2产生的量化。数据表示为平均值±SD，n＝5。
图13呈现了人源化scFv的氨基酸序列和代表性的稳定性分析。图13A呈现了人源化scFv h763.74(#2)(SEQ ID NO:37)和h763.74(#5)(SEQ ID NO:57)的VL(SEQ ID NO:69和72)和VH(SEQ ID NO:72和114)链的序列。氨基酸取代(人至鼠)被框起来。图13B呈现了在PBS中以1mg/ml配制并在4℃和37℃下储存2天的人源化scFv h763.74(#2)和h763.74(#5)蛋白的物理稳定性的代表性结果。单体的百分比通过分析型HPLC进行分析。
图14呈现了表达基于人源化scFv 763.74的CAR构建体的T细胞的抗肿瘤活性的代表性结果。图14A呈现了在培养的第8天评估的对照T细胞(CTR)和使用h763.74(#2)CD28CAR和h763.74(#5)CD28 CAR生成的T细胞中CAR表达的总结。数据表示为平均值±SD，n＝10。图14B呈现了实验的残留肿瘤细胞的量化总结，其中将CTR、h763.74(#2)CD28和h763.74(#5)CD28 CAR-T细胞与黑色素瘤细胞系(E:T＝1:5)共培养5天。数据表示为平均值±SD，n＝4/6。将细胞收集并用CD3和CD276(B7-H3)mAb染色以通过流式细胞术分别识别T细胞和黑色素瘤细胞。图14C呈现了如(B)所示的24小时共培养(E:T＝1:5)后收集的上清液中IFNγ和IL-2产生的代表性量化结果。数据表示为平均值±SD，n＝5。图14D呈现了用eGFP-FFLucWM115肿瘤细胞(5×105个细胞/小鼠)s.c.移植并用对照CART细胞(CTR)和表达h763.74(#2)CD28 CAR或h763.74(#5)CD28 CAR的T细胞(5×106个细胞/小鼠)治疗7天后的小鼠的肿瘤BLI(色标：最小＝5×106；最大＝5×108)的代表性结果。图14E呈现了在用CTR、h763.74(#2)CD28或h763.74(#5)CD28 CAR-T细胞治疗的WM115荷瘤小鼠中，在不同时间点(第13天：n＝15，第25、31和43天：n＝5)收集的小鼠外周血中人CD3+CD45+细胞的代表性量化。数据表示为平均值±SD，n＝5。图14F呈现了在如代表性实验(E)所述的不同时间点(第13天：n＝15，第25、31和43天：n＝5)收集的外周血中对人CD3+CD45+细胞门控的PD-1+细胞的百分比。数据表示为平均值±SD，n＝5。图14G呈现了在如代表性实验(E)所述处死时外周血、肝和脾中对人CD3+CD45+细胞门控的PD-1+细胞的百分比。数据表示为平均值±SD，n＝6-10。
具体实施方式
最初定义的CAR强直信号传导归因于T细胞中的负面作用，并且特别是由于快速耗竭而导致抗肿瘤效果不佳。参见Long等人(2015)。我们在体外和体内的数据支持这一概念。值得注意的是，在我们的异种移植模型中，纠正scFv稳定性和消除CAR强直信号传导显著增强了编码CD28胞内域的CAR-T细胞的抗肿瘤作用，这显示出快速的抗肿瘤作用。这一观察结果与先前的工作一致，表明4-1BB显示出缓慢的抗肿瘤作用，这可能与我们最近发现的4-1BB通过募集CAR突触中的磷酸酶复合物而减弱CAR-CD3γ信号传导的机制有关。参见Zhao等人，“工程化共刺激的结构设计决定了肿瘤排斥动力学和CAR T细胞的持久性”，《癌细胞(Cancer Cell)》28:415-428(2015)；Sun等人，“4-1BB募集的THEMIS-SHP1调节LCK介导的嵌合抗原受体导向的T细胞的引发”《癌细胞》37(2):216-225(2020)(“Sun等人2020”)。此外，我们想建议确定为CAR-T细胞因scFv的自我聚集而自发释放IFNγ的强直信号传导应被视为与CAR-T细胞的自发增殖不同的现象。参见Frigault等人，“介导T细胞组成性或诱导性增殖的嵌合抗原受体的鉴定”，《癌症免疫研究》3:356-367(2015)。后者反而可能是CAR-T细胞的积极属性，它可能在没有即时抗原刺激的情况下持续存在，尤其是在实体瘤患者中，在该患者中肿瘤细胞在外周血中无法大量获得。编码4-1BB的CAR-T细胞的自发增殖和增强存活可能是由于持续的NF-KB途径，而不是近端CAR信号传导，并且这种现象需要充分在机制上定义的进一步研究。参见Gomes-Silva等人，“嵌合抗原受体中的强直4-1BB共刺激阻碍了T细胞的存活并依赖于载体”，《细胞报道(Cell Rep.)》21:17-26(2017)；Li等人，“4-1BB增强CAR T功能需要NF-κB和TRAF”，《JCI洞察(JCI.Insight.)》3(2018)；和Philipson等人，“4-1BB共刺激通过非经典NF-κB信号传导促进CAR T细胞存活”，《科学信号(Sci.Signal.)》13(2020)。
嵌合抗原受体(CAR)强直信号传导(定义为用CAR基因植入的T细胞eous激活和释放促炎细胞因子)被认为是负面属性，因为它导致免疫细胞耗竭和抗肿瘤效果不佳。不稳定的鼠scFv会引起自我聚集，并且鼠序列可诱发人类受试者的免疫反应。这里我们证明了当scFv被组装成CAR形式并且CAR在T细胞中表达时，scFv的不稳定性对引起强直信号传导至关重要。此外，我们证明强直信号传导可以通过取代导致scFv的鼠FWR内不稳定性的氨基酸或者通过FWR的人源化而得到纠正。纠正强直信号传导增强了CAR-T细胞的抗肿瘤作用。
这里我们报告了CAR强直信号传导由单克隆抗体单链Fv的内在不稳定性引起，该单链Fv通过包含在CAR中的CD3γ链促进自我聚集和信号传导。这种现象在编码CD28或4-1BB共刺激胞内域的CAR中被检测到。单克隆抗体单链Fv的不稳定性由可以通过计算建模来识别的框架区内的特定氨基酸引起。导致框架区不稳定或人源化的氨基酸取代可以纠正CAR的强直信号传导，而不会导致抗原特异性的改变，并增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果。
这里我们证明了不稳定的scFv会导致CAR分子的自我聚集，从而导致CAR在T细胞中的强直信号传导。我们生成的CSPG4特异性CAR使用了来自763.74mAb的鼠scFv。在大肠杆菌中表达的这种scFv显示出聚集的趋势，并且scFv不能以可溶形式生产。
这里我们表明scFv的不稳定性是CAR自我聚集和强直信号传导的唯一原因，因为建模驱动的FWR内稳定scFv的特定氨基酸取代会废除CAR强直信号传导。下面呈现的结果通过结构和功能分析证明，scFv的不稳定性导致CAR自我聚集和强直信号传导。氨基酸取代或FWR的人源化废除强直信号传导并增强CAR-T细胞的功能性。
在Eris工具的帮助下，采用计算诱变来描述FWR突变对scFv 763.74(A)结构的影响。计算建模证明了FWR内的氨基酸取代如何影响scFv的稳定性，表明可以实施计算分析来评估和纠正scFv的稳定性而不影响其特异性。最后，我们证明用稳定的人FWR(如框架rFW1.4)取代鼠FWR还纠正了CAR强直信号传导，而不改变抗原特异性。参见Borras等人，“从兔单克隆抗体中生成稳定的人源化单链Fv片段的通用方法”，《生物化学杂志(JBiol.Chem.)》285:9054-9066(2010)。稳定的人框架rFW1.4可以容纳不同来源的CDR，并允许对可溶性scFv蛋白进行分析，以评估其物理化学稳定性。因此，这种方法可用于选择具有最佳物理和结合特性的scFv来设计CAR。综上所述，数据表明稳定的和单体的scFv适用于生成避免抗原独立性强直信号传导的CAR。用人框架rFW1.4工程化的ScFv也可能具有低的免疫原性可能性，并有可能以完全有效的方式反复输注给患者。
我们的数据表明，使用CAR，CD28和4-1BB都会引起强直信号传导，其中唯一的区别在于细胞质内的共刺激胞内域尾。
重要的是，无论CAR中使用何种共刺激，scFv的稳定化都会废除强直信号传导，这表明不稳定的scFv可以通过FWR的突变或人源化得到拯救，并且CD28和4-1BB共刺激都可以使用。
这里我们显示了对FWR的氨基酸取代可以稳定scFv并纠正CAR的强直信号传导。我们还显示了用稳定的人FWR取代鼠FWR也会防止CAR-T细胞的抗原独立性激活。因此，我们将CAR强直信号传导的原因定位为用于CAR构建的不稳定scFv，并提供基于结构的策略来纠正强直信号传导。
总的来说，我们证明CAR的强直信号传导是由于不稳定scFv的自我聚集，并且它可以通过由稳定氨基酸取代或人源化获得的scFv的FWR来废除。纠正scFv的稳定性和消除CAR的强直信号传导能增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用。
本公开提供并包含对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)(基因ID：1464(人)和121021(小鼠))具有结合特异性的结合成员。
如本文所用，结合成员通常包括抗体VH和VL结构域。还提供了特定结合成员的VH结构域供本发明使用。在每个VH和VL域内有互补决定区，(分别为"CDR"、"HCDR"和"LCDR")，以及框架区(分别为"FR"、"VH-FR"和"VL-FR")。VH结构域包括HCDR1至HCDR3，并且VL结构域包括LCDR1至LCDR3。抗体分子可以包括抗体VH结构域，其包括VH CDR1、CDR2和CDR3以及框架序列VH-FR1至VH-FR4。其可替代地可以包括或者也可以包括抗体VL结构域，包括VLCDR1、CDR2和CDR3以及框架序列VL-FR1至VL-FR4。本文公开的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组以及LCDR组都代表了特定结合成员的实施例。如本文所述，“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDR组是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且LCDR组是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。如本文所用，框架序列可从任何来源获得，包含但不限于小鼠、人、兔和大鼠。在某些方面，框架序列被修饰为包括来自两个物种的序列。在某些方面，框架序列是经修饰的人框架序列，其具有引入小鼠残基来增加稳定性的一个或多个修饰。此类修饰的人源化框架使同一构建体在小鼠和人细胞中都能使用。
如本文所用，结合成员包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列和SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列。
本公开提供并包含对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的结合成员，并且包括框架序列。在某些方面，轻链框架序列(“VL-FR”)选自由SEQ ID NO:153至255组成的群组，其中轻链框架序列1(VL-FR1)选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组，轻链框架序列2(VL-FR2)选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组，轻链框架序列3(VL-FR3)选自由SEQID NO:226至249组成的群组，轻链框架序列4(VL-FR4)选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组。在某些方面，重链框架序列(“VH-FR”)选自由SEQ ID NO:256至382组成的群组，其中重链框架序列1(VH-FR1)选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组，重链框架序列2(VH-FR2)选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组，重链框架序列3(VH-FR3)选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组，并且重链框架序列4(VH-FR4)选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组。
本公开提供并包含一种对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中轻链框架序列1(VL-FR1)选自由SEQ ID NO:153至158组成的群组，轻链框架序列2(VL-FR2)选自由SEQ IDNO:222至225组成的群组，轻链框架序列3(VL-FR3)选自由SEQ ID NO:226至231组成的群组，轻链框架序列4(VL-FR4)选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组，重链框架序列1(VH-FR1)选自由SEQ ID NO:347至349组成的群组，重链框架序列2(VH-FR2)选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组，重链框架序列3(VH-FR3)选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组，并且重链框架序列4(VH-FR4)选自由SEQ ID NO:361至362组成的群组。在某些方面，可变轻链序列选自由SEQ ID NO:69至72组成的群组，并且可变重链序列选自由SEQ ID NO:111至114组成的群组。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:69，并且可变重链序列是SEQ ID NO:111。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:70，并且可变重链序列是SEQ ID NO:112。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:71，并且可变重链序列是SEQ ID NO:113。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:71，并且可变重链序列是SEQ ID NO:114。
本公开提供并包含编码对CSPG4具有结合特异性的多肽的核酸序列，其中可变轻链序列选自由SEQ ID NO:67至109组成的群组，并且可变重链序列选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组。在某些方面，可变轻链序列选自由SEQ ID NO:69至72组成的群组，并且可变重链序列选自由SEQ ID NO:111至114组成的群组。在一个方面，可变轻链序列是SEQ IDNO:69，并且可变重链序列是SEQ ID NO:111。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:70，并且可变重链序列是SEQ ID NO:112。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:71，并且可变重链序列是SEQ ID NO:113。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:71，并且可变重链序列是SEQ ID NO:114。
在某些方面，核酸序列编码包括可变轻链序列的多肽，所述可变轻链序列包括SEQID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:69。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:70。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:71。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:72。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:73。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:74。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:76。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:77。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:78。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:79。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:80。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:83。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:96。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:97。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:102。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:103。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:104。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:105。在一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:106。在另一个方面，可变轻链序列是SEQ ID NO:107。在某些方面，编码可变轻链序列的核酸序列可以与编码选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的重链序列的核酸序列组合。
在某些方面，核酸序列编码包括重链序列的多肽，所述重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)，和选自由SEQ IDNO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。在一个方面，可变重链序列是SEQ IDNO:111。在另一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:112。在一个方面，可变重链序列是SEQID NO:113。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:114。在另一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:115。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:116。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:117。在另一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:118。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:119。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:120。在另一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:121。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:122。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:123。在另一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:135。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:136。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:137。在另一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:138。在一个方面，可变重链序列是SEQ ID NO:145。在某些方面，编码可变重链序列的核酸序列可以与编码选自由SEQ ID NO:67至109组成的群组的轻链序列的核酸序列组合。
本公开提供并包含嵌合抗原受体(“CAR”)和对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的CAR的表达构建体。如本文所提供的CDR区如上所述。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工T细胞受体，其被工程化为在免疫效应细胞上表达并特异性地结合抗原。在某些方面，CAR包括胞外域、跨膜结构域和胞内域。在某些方面，额外的“间隔子”或“铰链区”被包含在CAR中。在某些方面，CAR可以包括胞外域和跨膜结构域，而没有胞内域，但本申请的更多CAR包含胞内域并提供细胞内信号传导。
如本文所用，术语“胞外域”是指CAR的细胞外部分，并且涵盖信号肽、抗原识别结构域(例如结合成员)和连接抗原识别结构域与跨膜结构域的间隔子或铰链区。当表达时，信号肽可以被去除，通常使用内源性的细胞途径来去除。
如本文所用，“抗原识别结构域”通常包括对特定癌症抗原具有特异性的单链可变片段(scFv)。在某些方面，当同一细胞中有两个或更多个CAR时，第二个CAR可包括对另一特定抗原具有特异性的scFv。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是由免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区共价连接形成VH::VL异二聚体的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或者通过肽编码接头(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，该接头连接VH的N末端与VL的C末端，或者VH的C末端与VL的N末端。接头通常富含甘氨酸以用于柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以用于溶解性。合适但非限制性实例是SEQ ID NO:11。尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达，如Huston等人(《美国国家科学院院刊》,85:5879-5883,1988)所述。还参见美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号；美国专利公开第20050196754号和第20050196754号所述。合适的VH和VL编码序列已在上文确定。
如本文所用，“间隔子”或“铰链区”是重组蛋白的任选接头部分，该部分还是跨膜结构域和抗体识别结构域之间的短肽片段。间隔子或铰链区可以是1至20个氨基酸。胞外域的铰链区的实例包含免疫球蛋白的CH2CH3区、IgG1的铰链区和CD3的部分。
如本文所用，“跨膜结构域”是主要为非极性氨基酸残基的区域，当蛋白质被表达时，该区域至少要穿越一次双分子层。一般来说，跨膜结构域由18至21个氨基酸残基编码，并且采用α螺旋结构。如本文所用，跨膜结构域可以是本领域中已知的任何种类。在某些方面，跨膜结构域选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940，12487)、CD3-ζ(基因ID：919；12503CD247)、CD4(基因ID：920，12504)、CD8(基因ID：924，12525)、CD16(基因ID：2214；14131；Fcgr3)、NKp44(基因ID：9436，NCR2)、NKp46(基因ID：9437，17086，NCR1)和NKG2d(基因ID：22914；27007KLRK1)。在某些方面，跨膜结构域是CD28(基因ID：940，12487)跨膜结构域。
如本文所用，术语“胞内域”是指CAR的细胞内结构域，其提供细胞内的信号传输。一般来说，胞内域可以进一步分为两个部分：刺激结构域和任选的共刺激结构域。在某些方面，胞内域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如，DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)。最常用的胞内域组分是CD3-ζ，其含有3个ITAM并且在抗原结合后向NKT细胞传递激活信号。另一种常用的胞内域是TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如4-1BB或CD137)胞内域。其他合适的刺激结构域可以获自2B4(CD244)、TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如4-1BB或CD137)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)。
本公开提供并包含编码嵌合抗原受体(“CAR”)的核酸表达构建体和由其产生的CAR蛋白，所述构建体和CAR蛋白对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性，包括胞外域、跨膜结构域序列和胞内域序列。在某些方面，胞外域可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的LCDR1至LCDR3序列和SEQ ID NO:4至6所示的HCDR1至HCDR3。如本文提供的，胞外域包括选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ IDNO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)。如本文提供的，胞外域包括选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。本公开的CAR包含选自由SEQ ID NO:67至109组成的群组的可变轻链序列和选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的可变重链序列。在某些方面，胞外域包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv多肽序列。在一个方面，胞外域包括SEQ ID NO:28的scFv多肽序列。在一个方面，胞外域包括SEQ ID NO:34的scFv多肽序列。在一个方面，胞外域包括SEQ ID NO:46的scFv多肽序列。在一个方面，胞外域包括SEQ ID NO:47的scFv多肽序列。在一个方面，胞外域包括SEQ ID NO:57的scFv多肽序列。
对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的编码嵌合抗原受体(“CAR”)的核酸表达构建体和由其产生的CAR蛋白包括胞外域、跨膜结构域序列和胞内域序列，包括选自由CD28(基因ID：940，12487)、CD3-ζ(基因ID：919；12503CD247)、CD4(基因ID：920，12504)、CD8(基因ID：924，12525)、CD16(基因ID：2214；14131；Fcgr3)、NKp44(基因ID：9436，NCR2)、NKp46(基因ID：9437，17086，NCR1)和NKG2d(基因ID：22914；27007KLRK1)组成的群组的跨膜结构域。在一个方面，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQID NO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。胞外域和跨膜结构域可以与选自由CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)组成的群组的任一胞内域序列组合。
对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的编码嵌合抗原受体(“CAR”)的核酸表达构建体和由其产生的CAR蛋白包括胞外域、跨膜结构域序列和胞内域序列，包括选自由CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)组成的群组的胞内域序列。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是2B4胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是CD28跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD3-ζ胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD4胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD4胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是CD8跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD4胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是CD16跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD4胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是NKp44跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD4胞内域，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是NKp46跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
在一个方面，胞内域是CD28胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是4-1BB胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD247胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是CD4胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是IL-21胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是HCST胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在一个方面，胞内域是TYROBP胞内域，跨膜结构域是NKG2d跨膜结构域，并且胞外域选自scFv序列，该scFv序列选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组。在某些方面，编码CAR的核酸表达构建体进一步编码至少一个生长因子的蛋白编码序列、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列或两者，其中每个编码序列与CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
本公开提供并包含编码上面提供的嵌合抗原受体的核酸表达构建体，该构建体进一步包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列。还提供并包含表达构建体，该构建体编码多蛋白，其包括CAR、Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列和最多三个额外的蛋白编码序列。在一个方面，Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列和最多三个额外的蛋白编码序列由自主核糖体内自加工肽隔开。在一个方面，自主核糖体内自加工是口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)。在某些方面，Wnt信号传导途径中转录激活因子选自由淋巴增强子结合因子1(LEF1，基因ID 51176)、β-连环蛋白(CTNNB1，基因ID 1499)、Smad3(基因ID 4088)、HNF1同源框A(HNF1A，基因ID：6927(alt.TCF1))、转录因子7(TCF7，基因ID：6932(alt.TCF1))和转录辅阻遏物TLE家族成员1(TLE 1，基因ID 7088))组成的群组。
在一个方面，表达构建体包括选自scFv序列(选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组)的胞外域，选自由CD28、CD3-ζ、CD4、CD8、CD16、NKp44、NKp46和NKG2d组成的群组的跨膜结构域以及选自由CD28、4-1BB、CD3-ζ、2B4、白细胞介素21、HCST和TYROBP组成的群组的胞内域，并且该胞内域进一步包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，该Wnt信号传导途径中转录激活因子选自由淋巴增强子结合因子1、β-连环蛋白、Smad3、HNF1同源框A、转录因子7和转录辅阻遏物TLE家族成员1组成的群组。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1，其中LEF1选自由参考序列(RefSeq)ID NO:NP_057353.1、NP_001124185.1和NP_001124186.1组成的群组。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、4-1BB胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1。
本公开提供并包含上述表达构建体，该表达构建体包括选自scFv序列(选自由SEQID NO:28至66组成的群组)的胞外域，选自由CD28、CD3-ζ、CD4、CD8、CD16、NKp44、NKp46和NKG2d组成的群组的跨膜结构域以及选自由CD28、4-1BB、CD3-ζ、2B4、白细胞介素21、HCST和TYROBP组成的群组的胞内域，并且该胞内域进一步包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，并且进一步包括至少一种生长因子的蛋白编码序列，该生长因子选自由白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素27(IL-27)、白细胞介素33(IL-33)及其组合组成的群组。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15，其中LEF1选自由参考序列(RefSeq)ID NO:NP_057353.1、NP_001124185.1和NP_001124186.1组成的群组，LEF1和IL-15各自由自主核糖体内自加工肽隔开。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。
在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD28胞内域以及由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21，其中LEF1选自由参考序列(RefSeq)ID NO:NP_057353.1、NP_001124185.1和NP_001124186.1组成的群组，LEF1和IL-21各自由自主核糖体内自加工肽隔开。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ IDNO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-21。
在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD28胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、4-1BB胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1和IL-15。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD28跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD3-ζ跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD4跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD8跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、CD16跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp44跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKp46跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。在一个方面，表达构建体包括选自由SEQ ID NO:28至66组成的群组的scFv胞外域序列、NKG2d跨膜结构域、CD3-ζ胞内域以及各自由自主核糖体内自加工肽隔开的LEF1、IL-15和IL-21。
本公开还包含并提供了表达构建体，其编码上面提供的CAR，并进一步包括编码靶向MHC I类或MHC II类基因的小发夹RNA(shRNA)序列的DNA序列，其中shRNA序列被嵌入人工微小RNA(amiR)支架中。
本公开包含并提供了包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列的嵌合抗原受体，该胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组，每个序列如上对核酸表达构建体所述的。在一个方面，胞外域序列选自由SEQ ID NO:34、46、47和57组成的群组。在另一个方面，胞外域序列包括SEQ ID NO:34。在另一个方面，胞外域序列包括SEQ ID NO:46。在另一个方面，胞外域序列包括SEQ ID NO:47。在另一个方面，胞外域序列包括SEQ ID NO:57。上面记载了胞外域、跨膜结构域和胞内域的适当组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD28跨膜结构域和CD28胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD28跨膜结构域和CD3-ζ胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD28跨膜结构域和4-1BB胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD3-ζ跨膜结构域和CD28胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD3-ζ跨膜结构域和CD3-ζ胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD3-ζ跨膜结构域和4-1BB胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD4跨膜结构域和CD28胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD4跨膜结构域和CD3-ζ胞内域的组合。在一个方面，本公开提供了选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组的胞外域序列与CD4跨膜结构域和4-1BB胞内域的组合。
本说明书进一步提供并包含用上述定义的表达构建体和核酸序列转化或转染的宿主细胞。优选地，对宿主细胞进行基因工程化以引入外源核酸序列，转录和翻译该外源核酸序列以表达一种或多种蛋白质。引入外源核酸序列可以用本领域已知的方法进行，包含转化、转染和转导。在一个方面，宿主细胞是细菌。在其他方面，宿主细胞是选自自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫细胞。在一个方面，宿主细胞是T细胞。在另一个方面，宿主细胞是NKT细胞。在进一步的方面，宿主细胞是I型NKT细胞。在又一个方面，宿主细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。如本文所提供的，宿主细胞是宿主细胞群的一部分。
本说明书提供并包含包括多个基因工程化免疫细胞的细胞群，该免疫细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的表达构建体，该编码序列包括胞外域序列，该胞外域序列包括与上述硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段。表达构建体的具体组合已在上文描述并特此通过引用并入。
在本公开的某些方面，细胞群包括基因工程化免疫细胞，其包括自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一个方面，群体中的基因工程化免疫细胞包括多个CD62L阳性的I型NKT细胞。在一个方面，群体包括多个CD62L阳性的I型NKT细胞，其至少占所述多个细胞的50％。
本公开提供并包含一种用于生产免疫细胞的方法，该方法包括上面详细描述的用于表达CAR的表达构建体。如本文提供的，该方法包括从供体中分离PBMC，从PBMC中分离自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞以制备分离的免疫细胞，将分离的免疫细胞扩增1至20天以通过内源性T细胞受体的刺激以及共刺激受体、细胞因子或两者的组合的共刺激制备用于基因工程化的扩增的免疫细胞，和引入嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，该构建体包括胞外域序列，该胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:61至109组成的群组的可变轻链和选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的可变重链。在一个方面，制备用于基因工程化的免疫细胞的步骤进一步包括使用抗T细胞、抗NK细胞或抗NKT微珠从PBMC中分离免疫细胞。在一个方面，刺激包括用选自IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、TNF-α或其组合的生长因子进行培养。在一个方面，免疫细胞是NKT细胞。在进一步的方面，NKT细胞是I型NKT细胞，并且扩增分离的NKT细胞的步骤包括在至少aGalCer和生长因子的存在下，将I型NKT细胞培养至少1天以制备用于基因工程化的NKT细胞。
在一个方面，用于扩增分离的免疫细胞1至20天以制备用于基因工程化的扩增的免疫细胞的培养期为1至2天、1至3天、1至4天、1至5天、1至6天、1至7天、1至8天、1至9天、1至10天、1至11天、1至12天、1至13天、1至14天、1至15天、1至16天、1至17天、1至18天、1至19天、1至20天、2至3天、2至4天、2至5天、2至6天、2至7天、2至8天、2至9天、2至10天、2至11天、2至12天、2至13天、2至14天、2至15天、2至16天、2至17天、2至18天、2至19天、2至20天、3至4天、3至5天、3至6天、3至7天、3至8天、3至9天、3至10天、3至11天、3至12天、3至13天、3至14天、3至15天、3至16天、3至17天、3至18天、3至19天、3至20天、4至5天、4至6天、4至7天、4至8天、4至9天、4至10天、4至11天、4至12天、4至13天、4至14天、4至15天、4至16天、4至17天、4至18天、4至19天、4至20天、5至6天、5至7天、5至8天、5至9天、5至10天、5至11天、5至12天、5至13天、5至14天、5至15天、5至16天、5至17天、5至18天、5至19天、5至20天、6至7天、6至8天、6至9天、6至10天、6至11天、6至12天、6至13天、6至14天、6至15天、6至16天、6至17天、6至18天、6至19天、6至20天、7至8天、7至9天、7至10天、7至11天、7至12天、7至13天、7至14天、7至15天、7至16天、7至17天、7至18天、7至19天、7至20天、8至9天、8至10天、8至11天、8至12天、8至13天、8至14天、8至15天、8至16天、8至17天、8至18天、8至19天、8至20天、9至10天、9至11天、9至12天、9至13天、9至14天、9至15天、9至16天、9至17天、9至18天、9至19天、9至20天、10至11天、10至12天、10至13天、10至14天、10至15天、10至16天、10至17天、10至18天、10至19天、10至20天、11至12天、11至13天、11至14天、11至15天、11至16天、11至17天、11至18天、11至19天、11至20天、12至13天、12至14天、12至15天、12至16天、12至17天、12至18天、12至19天、12至20天、13至14天、13至15天、13至16天、13至17天、13至18天、13至19天、13至20天、14至15天、14至16天、14至17天、14至18天、14至19天、14至20天、15至16天、15至17天、15至18天、15至19天、15至20天、16至17天、16至18天、16至19天、16至20天、17至18天、17至19天、17至20天、18至19天、18至20天或19至20天以制备用于基因工程化的基因工程化NKT细胞群。在一个方面，用于生产包括该表达CAR的表达构建体的免疫细胞的方法中的分离的免疫细胞是T细胞。在另一个方面，分离的免疫细胞是NK细胞。在一个方面，分离的免疫细胞是I型NKT细胞。在进一步的方面，扩增的免疫细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。如本文所提供的，用于生产免疫细胞的方法包含分离为I型NKT细胞的免疫细胞，并通过在至少aGalCer、IL-2和IL-21存在下的培养来扩增I型NKT细胞。如上所提供的，表达构建体可进一步包含表达外源性生长因子。在另一个方面，表达构建体包含Wnt信号传导途径中的转录激活因子。还包含和提供了加入编码靶向MHC I类或MHC II类基因的小发夹RNA(shRNA)序列的DNA序列，其中shRNA序列被嵌入人工微小RNA(amiR)支架中。在某些方面，蛋白编码序列可以由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
本公开提供并包含用于抑制个体中硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)阳性细胞的方法，包括使细胞与治疗有效量的基因工程化免疫细胞接触的步骤，其中所述免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包括跨膜结构域序列、胞内域序列和胞外域序列，该胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ IDNO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列和选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。如本文所用，抑制个体中硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)阳性细胞包括抑制增殖、抑制活性或两者的组合。
在根据本公开的某些方面，用于抑制个体中硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)阳性细胞的方法包括基因工程化免疫细胞，其为自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一个方面，基因工程化免疫细胞是T细胞。在另一个方面，基因工程化免疫细胞是NKT细胞。在又一个方面，NKT细胞是I型NKT细胞。在进一步的方面，I型NKT细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。在某些方面，基因工程化的I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化免疫细胞。在进一步的方面，基因工程化的I型NKT细胞包括大部分的CD62L阳性的I型NKT细胞。
本公开提供并包含一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用基因工程化免疫细胞的步骤，所述免疫细胞包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括跨膜结构域序列、胞内域序列和胞外域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ IDNO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本文提供了治疗表达CPSPG4的癌症的方法。在一个方面，该方法提供了对癌症的治疗，所述癌症选自由黑色素瘤、转移性黑色素瘤疾病胶质母细胞瘤、未分化甲状腺癌、软组织肉瘤、胶质瘤和白血病组成的群组。在一个方面，使用本公开的方法进行治疗的癌症是转移性黑色素瘤疾病，该转移性黑色素瘤疾病选自浅表扩散性黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤或结节性黑色素瘤。在一个方面，该方法提供了对软组织肉瘤的治疗，该软组织肉瘤选自平滑肌肉瘤、去分化脂肪肉瘤、未分化多形性肉瘤(UPS)、恶性纤维组织细胞瘤、高级别梭形细胞肉瘤、黏液纤维肉瘤、恶性周围神经鞘膜瘤(MPNST)和滑膜肉瘤。参见PMID:32900797。在一个方面，使用所公开的方法进行治疗的癌症是胶质母细胞瘤。参见PMID：34113233。在另一个方面，该方法提供了对未分化甲状腺癌的治疗。参见PMID：34078123。根据权利要求71所述的方法，其中所述癌症是胶质瘤、星形细胞瘤或少突神经胶质瘤。参见PMID：32599896。在一个方面，使用所公开的方法进行治疗的癌症是白血病，包含但不限于B细胞前体白血病和MLL-易位白血病。参见PMID：31195686。
本公开提供并包含通过向有此需要的受试者施用治疗量的本文公开的基因工程化免疫细胞来治疗表达CPSPG4的癌症。在一个方面，基因工程化免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一个方面，基因工程化免疫细胞是T细胞。在另一个方面，基因工程化免疫细胞是NKT细胞。在进一步的方面，基因工程化NKT细胞是I型NKT细胞。在又一个方面，基因工程化I型NKT细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。在某些方面，基因工程化I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化免疫细胞。在某些方面，基因工程化I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化CD62L阳性的I型NKT细胞。
本公开提供并包含包括上述表达载体、宿主细胞或其组合的试剂盒。在一个方面，该试剂盒包括具有编码跨膜结构域序列、胞内域序列和胞外域序列的核酸序列的载体或细胞，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
本公开提供并包含一种用于在表达嵌合抗原受体(CAR)编码序列的NKT细胞中维持NKT细胞扩增潜力的方法，所述编码序列包括胞外域序列、跨膜结构域序列和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)，选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)，选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)，选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)，选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)；所述方法包括表达包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，和培养所述工程化NKT细胞以制备具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群。
在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群占总细胞群的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群占至少10％至高达80％、10％至90％、10％至95％、10％至98％、10％至99％以及高达100％，其中非工程化NKT细胞占总群体的低于99.9％。在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群占总细胞群的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群占至少50％至高达70％、50％至高达80％、50％至90％、50％至95％、50％至98％、50％至99％以及高达100％，其中非工程化NKT细胞占总群体的低于99.9％。在某些方面，工程化NKT细胞进一步表达CAR。在其他方面，工程化NKT细胞表达CAR和外源性生长因子。
在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群包括至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CD62L(+)NKT细胞。在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群包括50％至55％、50％至60％、约50％至65％、50％至70％、50％至75％、50％至80％、50％至85％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、55％至60％、55％至65％、55％至70％、55％至75％、55％至80％、55％至85％、55％至90％、55％至95％、55％至100％、60％至65％、60％至70％、60％至75％、60％至80％、60％至85％、60％至90％、60％至95％、60％至100％、65％至70％、65％至75％、65％至80％、65％至85％、65％至90％、65％至95％、65％至100％、70％至75％、70％至80％、70％至85％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、75％至80％、75％至85％、75％至90％、75％至95％、75％至100％、80％至85％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、85％至90％、85％至95％、85％至100％、90％至95％、90％至100％或95％至100％的CD62L(+)NKT细胞。在某些方面，根据本公开的具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群包括50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的CD62L(+)NKT细胞。在某些方面，工程化的CD62L(+)NKT细胞进一步表达CAR。在其他方面，工程化的CD62L(+)NKT细胞表达CAR和外源性生长因子。
本公开提供并包含维持NKT细胞扩增潜力的方法，所述方法包括以下步骤：工程化NKT细胞以至少表达包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，和培养工程化NKT细胞以制备具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群，其中培养所述工程化NKT细胞一段时间。
在某些方面，包括工程化NKT细胞步骤的用于维持NKT细胞扩增潜力的方法进一步包括从具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群中分离出所需的细胞。在一个方面，该方法进一步包括通过CD62L的表达分离工程化NKT细胞，以产生选定的CD62L(+)基因工程化NKT细胞群。在一个方面，该方法进一步包括通过4-1BB的表达来分离工程化NKT细胞，以产生选定的4-1BB(+)基因工程化NKT细胞群。
本公开的用于维持NKT细胞扩增潜力的方法提供并包含具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群在浸润到人源化NSG小鼠中神经母细胞瘤异种移植物时表现出体内持久性。
本公开提供并包含用于减少NKT细胞耗竭的方法，所述方法包括以下步骤：工程化NKT细胞以至少表达包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，和培养工程化NKT细胞以制备具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群，以产生细胞群，其中基因工程化NKT细胞包括总细胞群中大于10％的CD62L(+)NKT细胞。在某些方面，10％或更多的具有持续扩增潜力的基因工程化CD62L(+)NKT细胞群包括I型NKT细胞。在某些方面，总群体包括I型NKT细胞、II型NKT细胞、辐照的PBMC细胞、非NKT细胞和非工程化细胞。在某些方面，工程化的CD62L(+)NKT细胞进一步表达CAR。在其他方面，工程化的CD62L(+)NKT细胞表达CAR和外源性生长因子。
本公开提供并包含一种减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，所述方法包括：识别当作为CAR的一部分在小鼠免疫细胞中表达时具有强直信号传导的scFv；生成所述scFv的结构模型，和进行计算诱变以制备一系列诱变的scFv；计算所述诱变的scFv的自由能；将所述诱变的scFv与包括框架1.4(FW1.4)的人源化scFv进行比对，从而识别关键的鼠残基；以及引入一个或多个人到小鼠残基变化，以增加所述scFv的稳定性和制备用于小鼠模型的经修饰的人源化scFv。在一个方面，该方法包括经修饰的人源化FW1.4，其包括SEQID NO:7至10的轻链框架区(VL-FR)1至4、SEQ ID NO:11的接头区或SEQ ID NO:12至15的重链框架区(VH-FR)1至4中的至少一者。在一个方面，经修饰的人源化scFv包括选自由SEQ IDNO:16至27组成的群组的经修饰的FR区。如本文所用，强直信号传导通过细胞因子如INFγ的自发释放来测量。在根据本公开的某些方面，减少小鼠模型中作为CAR一部分的scFv的强直信号传导的方法导致INFγ水平与相同培养条件下含有非CAR的细胞释放的INFγ水平不可区分。在其他方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少至少两倍。在另一个方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少至少五倍。在另一个方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少至少十倍。在另一个方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少至少五十倍。在某些方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少100倍。在一个方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少10至100倍。在一个方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少5至50倍。在一个方面，与作为CAR一部分的非突变scFv相比，强直信号传导减少10至200倍。在其他方面，通过INFγ的自发释放测量的强直信号传导减少，其中INFγ的水平低于200pg/ml/5×105个细胞。在其他方面，通过INFγ的自发释放测量的强直信号传导减少，其中INFγ的水平低于100pg/ml/5×105个细胞。在其他方面，通过INFγ的自发释放测量的强直信号传导减少，其中INFγ的水平低于10pg/ml/5×105个细胞。在某些方面，作为根据本公开的CAR的一部分的scFv突变后，强直信号传导的水平达到或接近INFγ的检测水平。在某些方面，具有减少的强直信号传导的免疫细胞具有持续的扩增潜力和增加的功能性。在某些方面，具有减少的强直信号传导的免疫细胞具有持续的扩展潜力、减少的免疫细胞耗竭和提高的体内抗肿瘤效果。
如本说明书提供的用于减少小鼠模型的强直信号传导的方法包括，小鼠免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一个方面，小鼠免疫细胞是T细胞。在另一个方面，小鼠免疫细胞是NKT细胞。在进一步的方面，NKT细胞是I型NKT细胞。在又一个方面，NKT细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义。Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology)》(第2版，1994)；《剑桥科技词典(The Cam bridge Dictionaryof Science and Technology)》(Walker编辑,1988)；《遗传学术语(The Glossary ofGenetics)》,第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，《哈珀-柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology)》(1991)。除非另有说明，否则如本文所用的以下术语具有以下赋予它们的含义。
术语“包括(comprises/comprising)”、“包含(includes/including)”、“具有(Having)”及其同源词意味着“包含但不限于”。术语“由...组成(consisting of)”意指“包含但限于”。术语“基本上由...组成”是指组合物、方法或结构可以包含其它成分、步骤和/或部分，但条件是另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
除非上下文清楚地另外指明，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包含复数指示物。例如，术语“细胞”或“至少一个细胞”可以包含多个细胞，包含其混合物。
贯穿本申请，本公开的各个实施例可以以范围格式呈现。应当理解的是，采用范围格式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应当解释为是对本公开的范围的硬性限制。因此，对范围的描述应被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，例如1至6的范围描述应被视为已经具体地公开了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及所述范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所使用的，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包含但不限于化学、药理学、生物学、生物化学以及医学领域的从业者已知的或容易依据已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，“治疗”是指试图改变接受治疗的个体或细胞的病程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程中进行。治疗的疗效包含但不限于防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。通过防止疾病或病症的进展，治疗可以防止受影响或被诊断的受试者或被怀疑患有病症的受试者因病症而恶化，而且治疗还可以防止有病症风险或被怀疑患有病症的受试者的病症或病症症状的发生。
对本发明的方法有用的核酸分子包含编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但会编码与所述序列相同的多肽。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，并指任何脊椎动物受试者，包含但不限于哺乳动物，优选人类和其他灵长类动物，包含非人类灵长类动物，如实验室动物，包含啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；该术语并不表示特定年龄。因此，成人和新生儿个体都意图被涵盖在内。
“有效量”是指足以具有治疗效果的量。在一个实施例中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制肿瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵入或迁移)的量。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指不同程度地不含在其天然状态中发现的正常伴随的组分的材料。“分离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示比分离更高的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其它材料，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学性质或引起其他不良后果。也就是说，如果本发明的核酸或肽在通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品，则本发明的核酸或肽是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以单独纯化该蛋白质。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指连接两个或更多个生物分子从而至少保留与生物分子相关的生物学功能、活性和/或结构。提及多肽，该术语是指两个或更多个多肽的连接得到保留各个多肽组分的至少一些各自单独活性的融合多肽。两个或更多个多肽可以直接连接或经由接头连接。提及核酸，该术语是指第一多核苷酸与第二多核苷酸邻近，当合适的分子(例如，转录激活蛋白)结合到第二多核苷酸时，第二多核苷酸指导第一多核苷酸的转录。
如本文所用，“细胞群”是指多个细胞，并且可进一步包括不同细胞类型的混合物以及同质群体。
术语“识别”是指选择性地结合靶标。识别细胞的免疫细胞通常表达与该细胞表达的抗原结合的受体。在根据本公开的某些方面，免疫细胞表达与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的CAR。
如本文所用，“自主核糖体内自加工肽”是18个氨基酸的小肽，其避免了蛋白酶将多肽处理成独立的蛋白质的需要。这些肽首次在口蹄疫病毒中被发现，当作为两种蛋白质之间的接头引入时，这些肽提供了多肽的自主核糖体内自加工。类似的序列已经在皮可比那病毒(pircornaviradae)的其他成员中被确认。参见de Felipe，“跳过共表达问题：新的2A‘CHYSEL’技术”，《基因疫苗和疗法(Genetic Vaccines and Therapy)》2:13(2004)。
如本文所用，术语“工程化”是指对细胞进行基因修饰，以引入一个或多个外源核酸序列。优选地，工程化引入的外源核酸序列被转录和翻译以表达蛋白质。引入外源核酸序列可以用本领域已知的方法进行，包含转化、转染和转导。
如本文所用，术语“Wnt信号传导途径中转录激活因子”一般是指当外源性地在细胞中表达时，激活Wnt/β-连环蛋白信号传导途径下游的基因的蛋白质。Wnt信号传导途径中转录激活因子包含表达Wnt信号传导的正向调节因子如LEF1，以及抑制负向调节因子如GSK3β。Wnt信号传导的转录激活因子还包含小分子激活因子，包含但不限于Blagodatski等人“天然来源的小分子Wnt途径调节剂：历史、现有技术和前景”，《细胞(Cells)》9:589(2020)和Verkaar等人，“β-连环蛋白信号传导的新型小分子激活因子的发现”，《公共科学图书馆(PLoS ONE)》6(4):e19185(2011)中描述的那些，并且包含Wnt信号传导的负向调节因子的抑制剂，如TWS119(参见Ding等人，“控制干细胞命运的合成小分子”，《美国国家科学院院刊》100(13):7632-7(2003))。
如本文所用，短语“表达生长因子”是指一种或多种生长因子的外源性表达，其一般在异源启动子的控制下并且更常常作为CHYSEL序列下游多蛋白的一部分。
虽然已经参考某些实施例描述了本公开，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物替换其元件以适应特定情况。因此，意图是本公开不限于作为预期用于实施本公开的最佳模式而公开的特定实施例，而是本公开将包含落入所附权利要求的范围和精神内的所有实施例。
本文引用的任何参考文献通过引用以其整体并入。
实施例：
实施例1：一种对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的结合成员，所述结合成员包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例2：根据实施例1所述的对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中所述轻链框架序列1(VL-FR1)选自由SEQ ID NO:153至158组成的群组；所述轻链框架序列2(VL-FR2)选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组；所述轻链框架序列3(VL-FR3)选自由SEQ ID NO:226至231组成的群组；并且所述轻链框架序列4(VL-FR4)选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组；所述重链框架序列1(VH-FR1)选自由SEQ ID NO:347至349组成的群组；所述重链框架序列2(VH-FR2)选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组；所述重链框架序列3(VH-FR3)选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组；并且所述重链框架序列4(VH-FR4)选自由SEQ IDNO:361至362组成的群组。
实施例3：根据实施例1或2所述的对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中所述可变轻链序列包括选自由SEQ ID NO:67至109组成的群组的序列，并且所述可变重链序列包括选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的序列。
实施例4：一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ IDNO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)。
实施例5：一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例6：一种嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，所述构建体包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的核酸序列，所述编码序列包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例7：根据实施例6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述跨膜结构域选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940，12487)、CD3-ζ(基因ID：919；12503CD247)、CD4(基因ID：920，12504)、CD8(基因ID：924，12525)、CD16(基因ID：2214；14131；Fcgr3)、NKp44(基因ID：9436，NCR2)、NKp46(基因ID：9437，17086，NCR1)和NKG2d(基因ID：22914；27007KLRK1)。
实施例8：根据实施例6或7所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述胞内域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如，DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)。
实施例9：根据实施例6至8中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其进一步包括编码Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列的序列。
实施例10：根据实施例6至9中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述表达构建体编码多蛋白，所述多蛋白包括所述Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列和最多三个额外的蛋白编码序列。
实施例11：根据实施例6至10中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列和最多三个额外的蛋白编码序列由自主核糖体内自加工肽隔开。
实施例12：根据实施例6至11中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述自主核糖体内自加工是口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)。
实施例13：根据实施例6至12中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述转录激活因子选自由淋巴增强子结合因子1(LEF1，基因ID 51176)、β-连环蛋白((CTNNB1，基因ID 1499))、Smad3(基因ID 4088)、HNF1同源框A(HNF1A，基因ID：6927(alt.TCF1))、转录因子7(TCF7，基因ID：6932(alt.TCF1))和转录辅阻遏物TLE家族成员1(TLE 1，基因ID 7088)组成的群组。
实施例14：根据实施例6至13中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述LEF1选自由参考序列(RefSeq)ID NO:NP_057353.1、NP_001124185.1和NP_001124186.1组成的群组。
实施例15：根据实施例6至14中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其进一步包括至少一个生长因子的蛋白编码序列。
实施例16：根据实施例6至15中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述生长因子选自由白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素27(IL-27)、白细胞介素33(IL-33)及其组合组成的群组。
实施例17：根据实施例6至16中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述生长因子的蛋白编码序列与所述CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
实施例18：根据实施例6至17中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述胞外域序列进一步包括间隔子结构域。
实施例19：根据实施例6至18中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述胞内域包括与CD3-ζ链框内融合的4-1BB信号序列。
实施例20：根据实施例6至19中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其进一步包括编码靶向MHC I类或MHC II类基因的小发夹RNA(shRNA)序列的DNA序列，其中shRNA序列被嵌入人工微小RNA(amiR)支架中。
实施例21：一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括：胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组。
实施例22：根据实施例21所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞外域序列选自由SEQ ID NO:34、46、47和57组成的群组。
实施例23：根据实施例21或22所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:34。
实施例24：根据实施例2或221所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:46。
实施例25：根据实施例21或22所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:47。
实施例26：根据实施例21或22所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:57。
实施例27：根据实施例21至26中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述跨膜结构域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940，12487)、CD3-ζ(基因ID：919；12503CD247)、CD4(基因ID：920，12504)、CD8(基因ID：924，12525)、CD16(基因ID：2214；14131；Fcgr3)、NKp44(基因ID：9436，NCR2)、NKp46(基因ID：9437，17086，NCR1)和NKG2d(基因ID：22914；27007KLRK1)。
实施例28：根据实施例21至27中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞内域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如，DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)。
实施例29：一种编码CAR的核酸分子，所述CAR包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自由SEQ ID NO:28至65组成的群组。
实施例30：根据实施例29所述的编码CAR的核酸分子，其中所述胞外域序列选自由SEQ ID NO:34、46、47和57组成的群组。
实施例31：根据实施例29或30所述的编码CAR的核酸分子，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:34。
实施例32：根据实施例29或30所述的编码CAR的核酸分子，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:46。
实施例33：根据实施例29或30所述的编码CAR的核酸分子，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:47。
实施例34：根据实施例29或30所述的编码CAR的核酸分子，其中所述胞外域序列包括SEQ ID NO:57。
施例35：根据实施例29至34中任一项所述的编码CAR的核酸分子，其中所述跨膜结构域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940，12487)、CD3-ζ(基因ID：919；12503CD247)、CD4(基因ID：920，12504)、CD8(基因ID：924，12525)、CD16(基因ID：2214；14131；Fcgr3)、NKp44(基因ID：9436，NCR2)、NKp46(基因ID：9437，17086，NCR1)和NKG2d(基因ID：22914；27007KLRK1)。
实施例36：根据实施例29至35中任一项所述的编码CAR的核酸分子，其中所述胞内域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如，DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)。
实施例37：一种宿主细胞，其用根据实施例6至20中任一项所定义的表达构建体和根据实施例29至35中任一项所定义的核酸序列转化或转染。
实施例38：根据实施例37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由细菌、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的群组。
实施例39：根据实施例37或38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是T细胞。
实施例40：根据实施例37或38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是NKT细胞。
实施例41：根据实施例37、38或40中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是I型NKT细胞。
实施例42：一种用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，所述方法包括从供体中分离PBMC；从所述PBMC中分离自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞以制备分离的免疫细胞；和将所述分离的免疫细胞扩增1至20天以通过内源性T细胞受体的刺激以及共刺激受体、细胞因子或两者的组合的共刺激制备用于基因工程化的扩增的免疫细胞；以及引入嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，所述构建体包括胞外域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:61至109组成的群组的可变轻链和选自由SEQ ID NO:110至152组成的群组的可变重链。
实施例43：根据实施例42所述的用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，其中所述分离的免疫细胞是T细胞。
实施例44：根据实施例41或42所述的用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，其中所述分离的免疫细胞是NK细胞。
实施例45：根据实施例41或42所述的用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，其中所述分离的免疫细胞是I型NKT细胞。
实施例46：根据实施例41、42或43中任一项所述的用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，其中所述扩增的免疫细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例47：根据实施例45或46所述的用于生产包括CAR的免疫细胞的方法，其中所述分离的免疫细胞是I型NKT细胞，并且所述扩增包括在至少aGalCer、IL-2和IL-21存在下进行培养。
实施例48：一种基因工程化免疫细胞，所述细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的表达构建体，所述编码序列包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ IDNO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例49：根据实施例47或48所述的基因工程化免疫细胞，其中所述基因工程化免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
实施例50：根据实施例47或49所述的基因工程化免疫细胞，其中所述宿主细胞是T细胞。
实施例51：根据实施例47或49所述的基因工程化免疫细胞，其中所述宿主细胞是NKT细胞。
实施例52：根据实施例47、49或51中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中所述宿主细胞是I型NKT细胞。
实施例53：根据实施例47、49、51或52中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中所述宿主细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例54：根据实施例48所述的基因工程化免疫细胞，其中所述基因工程化免疫细胞包括多个细胞。
实施例55：根据实施例48或54所述的基因工程化免疫细胞，其中所述基因工程化免疫细胞包括多个CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例56：根据实施例48、54或55中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其中所述多个CD62L阳性的I型NKT细胞包括所述多个细胞的至少50％。
实施例57：根据实施例48至56中任一项所述的基因工程化免疫细胞，其进一步包括编码靶向MHC I类或MHC II类基因的小发夹RNA(shRNA)序列的DNA序列，其中shRNA序列被嵌入人工微小RNA(amiR)支架中。
实施例58：一种细胞群，所述细胞群包括多个基因工程化免疫细胞，所述基因工程化免疫细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的表达构建体，所述编码序列包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述CAR包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例59：根据实施例58所述的细胞群，其中所述基因工程化免疫细胞包括自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
实施例60：根据实施例58或59所述的细胞群，其中所述基因工程化免疫细胞包括多个CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例61：根据实施例58、59或60所述的细胞群，其中所述多个CD62L阳性的I型NKT细胞包括所述多个细胞的至少50％。
实施例62：一种抑制个体中硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)阳性细胞的方法，所述方法包括使细胞与治疗有效量的基因工程化免疫细胞接触的步骤，其中所述免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例63：根据实施例62所述的方法，其中所述抑制包括抑制增殖、抑制活性或两者的组合。
实施例64：根据实施例62或63所述的方法，其中所述基因工程化免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
实施例65：根据实施例62至64中任一项所述的方法，其中所述基因工程化免疫细胞是T细胞。
实施例66：根据实施例62至64中任一项所述的方法，其中所述基因工程化免疫细胞是NKT细胞。
实施例67：根据实施例62至64或66中任一项所述的方法，其中所述NKT细胞是I型NKT细胞。
实施例68：根据实施例62至64、66或67中任一项所述的方法，其中所述I型NKT细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例69：根据实施例62至64或66至68中任一项所述的方法，其中所述I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化免疫细胞。
实施例70：根据实施例62至64或66至69中任一项所述的方法，其中所述I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例71：一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用基因工程化免疫细胞的步骤，所述基因工程化免疫细胞包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括：可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例72：根据实施例71所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、转移性黑色素瘤疾病[浅表扩散性黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤和结节性黑色素瘤]；胶质母细胞瘤、未分化甲状腺癌、软组织肉瘤、胶质瘤和白血病组成的群组。
实施例73：根据实施例71或72所述的用于治疗癌症的方法，其中所述基因工程化免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
实施例74：根据实施例71至73中任一项所述的用于治疗癌症的方法，其中所述基因工程化免疫细胞是T细胞。
实施例75：根据实施例71、72或73中任一项所述的用于治疗癌症的方法，其中所述基因工程化免疫细胞是NKT细胞。
实施例76：根据实施例71、72或75中任一项所述的用于治疗癌症的方法，其中所述NKT细胞是I型NKT细胞。
实施例77：根据实施例71、72、75或76中任一项所述的用于治疗癌症的方法，其中所述I型NKT细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例78：根据实施例71、72或75至77中任一项所述的用于治疗癌症的方法，其中所述I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化免疫细胞。
实施例79：根据实施例71、72或75至78中任一项所述的用于治疗癌症的方法，其中所述I型NKT细胞包括大部分的所述基因工程化CD62L阳性的I型NKT细胞。
实施例80：一种试剂盒，所述试剂盒包括载体、宿主细胞或其组合，所述试剂盒包括编码嵌合抗原受体(CAR)编码序列的核酸序列，所述编码序列包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
实施例81：一种在表达嵌合抗原受体(CAR)编码序列的NKT细胞中维持NKT细胞扩增潜力的方法，所述编码序列包括胞外域序列；跨膜结构域序列；和胞内域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列以及选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；选自由SEQID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)；所述方法包括表达包括Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白编码序列，和培养所述工程化NKT细胞以制备具有持续扩增潜力的基因工程化NKT细胞群。
实施例82：一种减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，所述方法包括：识别当作为CAR的一部分在小鼠免疫细胞中表达时具有强直信号传导的scFv；生成所述scFv的结构模型，和进行计算诱变以制备一系列诱变的scFv；计算所述诱变的scFv的自由能，将所述诱变的scFv与包括框架1.4(FW1.4)的人源化scFv进行比对，从而识别关键的鼠残基；以及引入一个或多个人到小鼠残基变化，以增加所述scFv的稳定性和制备用于小鼠模型的经修饰的人源化scFv。
实施例83：根据实施例82所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中FW1.4包括SEQ ID NO:7至10的轻链框架区(VL-FR)1至4，SEQ ID NO:11的接头区，和SEQ IDNO:12至15的重链框架区(VH-FR)1至4。
实施例84：根据实施例82或83所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中所述经修饰的人源化scFv包括经修饰的选自由SEQ ID NO:16至27组成的群组的经修饰FR区。
实施例85：根据实施例82至84中任一项所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
实施例86：根据实施例82至85中任一项所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
实施例87：根据实施例82至85中任一项所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中所述免疫细胞是NKT细胞。
实施例88：根据实施例82至85或87中任一项所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中所述NKT细胞是I型NKT细胞。
实施例89：根据实施例82至85、87或88中任一项所述的减少小鼠模型中scFv强直信号传导的方法，其中所述I型NKT细胞是CD62L阳性的I型NKT细胞。
实例：
细胞系。肿瘤细胞系WM115(黑色素瘤)和SK-MEL-2获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(CRL-1675)。M14细胞由Ferrone博士提供。肿瘤细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231获自德国微生物及细胞保藏中心GmbH(ACC 738和ACC 732)。用于生产逆转录病毒载体的293T细胞获自ATCC。在含有5％ CO2的湿润气氛中，在37℃下，用适当培养基(RPMI-1640(吉毕科公司(Gibco))或DMEM(吉毕科公司))将所有细胞维持培养，该培养基补充有10％ FBS(希格玛公司(Sigma))、1％ L-谷氨酰胺(吉毕科公司)和1％青霉素/链霉素(吉毕科公司)。用编码萤火虫荧光素酶基因和融合蛋白增强型GFP(eGFP-FFluc)的SFGγ逆转录病毒载体转导WM115细胞。参见Hoyos等人，“用白细胞介素15和自杀基因工程化CD19特异性T淋巴细胞，以增强其抗淋巴瘤/白血病的效果和安全性”，《白血病(Leukemia)》24:1160-1170(2010)。使细胞保持培养低于6个连续月，之后使用来自原扩增小瓶的等分试样。常规测试所有肿瘤细胞系以排除支原体污染，并通过流式细胞术评估转基因和肿瘤标志物的表达以确认身份。如前所述生成胶质母细胞瘤衍生的神经球。参见Pellegatta等人，“胶质母细胞瘤和神经球中硫酸软骨素蛋白多糖4的组成型和TNFα诱导型表达：对CAR-T细胞疗法的影响”，《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》10(2018)(“Pellegatta等人，(2018)”)。
逆转录病毒上清液的生成、T细胞的分离、转导和体外扩增。逆转录病毒上清液通过对293T细胞的瞬时转染制备并用于转导T细胞。参见Diaconu等人，“诱导型胱天蛋白酶-9选择性地调节CD19特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞的毒性”，《分子治疗学(Mol.Ther.)》25:580-592(2017)(“Diaconu等人2017”)。健康志愿献血者的血沉棕黄层(buffy coat)购自墨西哥湾沿岸地区血液中心(Gulf Coast Regional Blood Center)(德克萨斯州休斯顿)。根据制造商的方案，通过Lymphoprep(精确化学和科学公司(Accurate Chemical andScientific Corporation))密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)。T细胞在由以下组成的完全培养基中培养：45％ Click's培养基(尔湾科学公司(Irvine Scientific)、45％ RPMI-1640(海克隆公司(Hyclone))、10％ FBS(海克隆公司)、1％ L-谷氨酰胺(吉毕科公司)和1％青霉素/链霉素(吉毕科公司)。在含有IL7(10ng/mL，派普泰克(PeproTech))和IL15(5ng/mL，派普泰克)的完全培养基中将T细胞激活、转导并扩增，如先前所报道的。参见Diaconu等人2017。
免疫表型。T细胞用来自BD生物科学公司(BD Biosciences)的针对CD3(APC-H7，克隆SK7)、CD45Ra(PE，克隆HI100)、CCR7(FITC，克隆150503)、CTLA4(BV421，克隆BNI3)、PD-1(PE-Cy7，克隆EH12.1)、LAG3(PE，克隆T47-530)、TIM3(BV711，克隆7D3)和CD45(APC，克隆2D1)的抗体(Ab)染色。抗CD45(PerCP，克隆REA747)和抗CD69(APC，克隆REA824)来自美天旎生物公司(Miltenyi Biotec)的REAffinity。肿瘤细胞用来自BD生物科学公司的针对CD276(BV421，克隆7-517)的Ab和763.74mAb(抗CSPG4)染色，然后用来自BD生物科学公司的大鼠抗小鼠IgG1二抗(PE，克隆X56)染色。763.74(A)和(B)CAR的表达使用抗独特型抗体评估，CTR CAR(抗CD19 CAR)的表达使用抗独特型抗体(获自Ferrone博士)评估，然后用来自BD生物科学公司的大鼠抗小鼠IgG1二抗(PE，克隆X56)染色。表达h763.74 CAR后，用英杰公司(Invitrogen)的链霉亲和素蛋白RPE缀合物进行染色。数据采集在BD LSRFortessa或CantoII流式细胞仪上使用BD FACS-Diva软件或在MACSQuant(美天旎生物公司)上进行。数据分析用FlowJo软件(版本9或10)或FlowLogic软件(版本7.2，美天旎生物公司)进行。
共聚焦显微镜。根据制造商的说明(Abcam免疫荧光方案)制备T细胞。简言之，CAR-GFP+细胞用cytofix缓冲液(BD生物科学公司)固定，并用一滴含DAPI的ProLong Diamond抗淬灭封片剂(英杰公司)安装在盖玻片上。数据采集在LSM700 Zeiss共聚焦显微镜上使用ZEN软件(ZEISS显微镜)进行。数据分析用Fiji软件进行。
共培养实验和ELISA。对于自发的IFNγ释放测定，在2mL不含细胞因子的完全培养基中将1×106个T细胞置于24孔板中。在不含细胞因子的完全培养基中，以1:5的效靶(E:T)比在24孔板中共培养T细胞(2×104个细胞/孔)与肿瘤细胞系(M14-wt或WM115；105个细胞/孔)。培养5天后，收获细胞并对CD3(APC-H7，克隆SK7，来自BD生物科学公司)和CD276(BV421，克隆7-517，来自BD生物科学公司)单克隆抗体(mAb)染色，以分别检测T细胞和肿瘤细胞。参见Landoni等人，“高亲和力的T细胞受体使自然杀伤T细胞特异性重定向并超越内源性不变T细胞受体”，《癌症免疫研究》8:57-69(2020)。通过流式细胞术计算培养物中残留的肿瘤细胞的百分比。培养24小时后收获自发释放和培养上清液，用DuoSet人IFNγELISA试剂盒(安迪生物公司(R&D Systems))测量100mL上清液中的IFNγ。数据采集在Synergy2酶标仪(美国宝特(BioTek))上使用Gen5软件进行。在不含血清但含B27补充剂的GBM-NS培养基中，以1:5的E:T比将GBM-NS(5×105个细胞)与T细胞一起铺板于24孔板中。将T细胞在GBM-NS培养基中维持3天后，然后铺板共培养物。参见Pellegatta等人(2018)。在共培养2、4、6和24小时后的不同时间点收集GBM-NS和T细胞，并通过流式细胞术分别根据CSPG4和CD45的表达测量残留的肿瘤细胞和T细胞。CAR-T细胞的激活通过评价CD69的表达来测量。
计算分析。为了生成scFv的3D构象，针对RCSB数据库对scFv的主序列进行BLAST搜索，以识别具有高序列相似性的同源模板结构。BLASTp分析识别scFv片段1696为潜在的模板，分辨率为
Figure BDA0004047589090000571
序列同一性为70.51％。参见Rezacova等人，“单克隆抗体抑制HIV-1和HIV-2蛋白酶的结构基础”，《结构(Structure.)》9:887-895(2001)(“Rezacova等人，(2001)”)。scFv片段1696(PDB ID：1jp5)的晶体结构用作模板以通过同源建模对scFv进行建模。同上。使用Modeller-9v19生成四十个模型，并选择分子目标函数得分最小的结构作为scFv的代表构象。参见Webb和Sali，“使用MODELLER进行比较蛋白质结构建模”，《当前蛋白质科学方案(Curr.Protoc.Protein Sci.)》86:2(2016)。由于立体冲突在建模的和低分辨率的结构中是常见的，因此采用Chiron来优化scFv的结构。参见Kota等人，“Gaia：蛋白质结构模型的自动质量评估”，《生物信息(Bioinformatics.)》27:2209-2215(2011)。Chiron通过对蛋白质结构进行短DMD模拟来解决原子冲突，其中对骨架的扰动最小或无扰动。参见Ding等人，“用全原子离散分子动力学进行蛋白质的从头折叠”，《结构》16:1010-1018(2008)；Shirvanyants等人，“离散分子动力学：用于精细蛋白质表征的高效和通用型模拟方法”，《物理化学杂志(J Phys.Chem.)》B 116:8375-8382(2012)；和Dokholyan等人，“蛋白质类模型折叠的离散分子动力学研究”，《折叠描述(Fold.Des)》3:577-587(1998)。随后考虑将松弛的scFv1结构用于使用Eris分子套件的电子诱变研究。参见Yin等人，“Eris：蛋白质稳定性的自动估计器”，《自然方法(Nat.Methods)》4:466-467(2007)。Eris方案诱导蛋白质的突变，并估计突变体(ΔGmut)和野生型(ΔGwt)构象的自由能。Eris使用Monte-Carlo算法在突变位点周围进行快速的侧链重新包装和骨架松弛，随后使用Medusa力场评价ΔGwt和ΔGmut。参见同上；和Yin等人，“MedusaScore：准确的基于力场的虚拟药物筛选的评分函数”，《化学信息与建模杂志(J Chem.Inf.Model.)》48:1656-1662(2008)。Eris算法通过采用下式计算蛋白质突变后的自由能变化。ΔΔGmut＝ΔGmut-ΔGwt。评价ΔΔGmut值以估计稳定化(ΔΔGmut<0)或去稳定(ΔΔGmut>0)突变。Eris得到了广泛的验证，并被用于设计新型蛋白质。参见Zhu等人，“合理设计的碳水化合物封闭的表位引发HIV-1Env特异性抗体”，《自然通讯(Nat.Commun.)》10:948(2019)；Dagliyan等人，“工程化外在病症以控制活细胞中的蛋白质活性”，《科学(Science)》354:1441-1444(2016)；和Dagliyan等人，“配体控制的蛋白质构象转换的合理设计”，《美国国家科学院院刊》110:6800-6804(2013)。
异种移植模型。黑色素瘤小鼠实验按照UNC动物饲养和机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行，并得到UNC IACUC(ID：17029)的批准。GBM小鼠实验根据意大利实验动物护理原则(D.Lgs.26/2014)和欧盟理事会指示(86/609/EEC和2010/63/UE)，按照米兰的Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta的指示进行。对于黑色素瘤模型，向雌性和雄性NSG小鼠(7-9周龄，获自UNC动物中心)皮下(s.c.)注射0.5×106个eGFP-FFluc标记的WM115肿瘤细胞。肿瘤细胞注射后七天(第0天)，向小鼠i.v.注射5×106个CAR-T细胞。每周用卡尺测量s.c.肿瘤，并使用IVIS动力学体内成像系统(珀金埃尔默(PerkinElmer))通过生物发光(BLI；总流量，光子/秒)来监测黑色素瘤肿瘤细胞生长。根据UNC指南，将肿瘤生长或出现不适迹象的小鼠处死。当处死小鼠后，从在细胞过滤器上粉碎的心脏、脾和肝收集外周血，并用2mL PBS洗涤。分析外周血、脾和肝以通过流式细胞术使用CountBright绝对计数珠(英杰公司)检测T细胞的存在[用针对CD3(APC-H7，克隆SK7)、CD45(APC，克隆2D1)、PD-1(PE/Cy7，克隆EH12.1)和CAR特异性抗独特型的抗体染色]。对于GBM模型，使用移植有GBM-NS的裸鼠来评价CAR-T细胞的抗肿瘤活性。向5至6周龄小鼠以2μLPBS1X尾状核内(i.c.)注射0.1×106个GBM-NS。相对于前囟，坐标为后0.7mm，左侧3mm，深3.5mm，并在尾状核内。肿瘤细胞注射后第15天，使用相同的肿瘤坐标，以5μL PBS1X i.c.注射CAR-T细胞。对于存活研究，每周对小鼠进行三次监测，并且根据机构指南在出现不适症状时对其进行安乐死。
磁共振成像(MRI)。MRI使用水平孔径的临床前扫描仪(BioSpec 70/20USR，布鲁克公司(Bruker)，埃特林根，德国)进行。系统的磁场强度为7T(1H频率300MHz)，并且孔径为20cm。扫描仪配备有主动屏蔽的梯度系统，其集成垫片设置为二阶。最大梯度幅值为440mT/m。所有的采集都使用交叉线圈配置进行：72mm线性鸟笼线圈用于射频激发，并且小鼠脑表面线圈接收信号。用1.5％-2％的异氟烷(60:40N2O:O2(vol:vol)，流速0.8L/min)对小鼠进行麻醉。为了检测研究期间的麻醉深度和动物健康状况，用气动传感器监测呼吸频率。将小鼠安置在配备有气体麻醉用鼻锥和三点固定系统(牙棒和耳塞)的动物床上。用GBM-NS注射和用CAR-T细胞治疗的小鼠在不同的时间点接受高分辨率的MRI调查，方案如下：在腹膜内施用钆基造影剂之前和之后获取T2加权快速采集回波减少(RARE)序列(TR＝3360ms，TE＝35ms，面内分辨率＝100×100um2，片厚＝400um，4个平均值，总采集时间为5分36秒)和两个T1加权RARE序列(TR＝510ms，TE＝8ms，面内分辨率＝78×78um2，片厚＝400um，6个平均值，总采集时间为9分47秒)。所有的序列都沿着相同的冠状几何图形(400um厚的连续切片)获得，切片包在嗅球的后方和小脑的前方。造影剂引起的T1信号增强被解释为是由于血脑屏障病变引起的。
scFv 763.74(A)的人源化。鼠scFv 763.74(A)的人源化通过将其CDR移植到稳定的人框架rFW1.4中进行。参见Borras等人，“从兔单克隆抗体中生成稳定的人源化单链Fv片段的通用方法”，《生物化学杂志》285:9054-9066(2010)。FW(在此称为rFW1.4)的序列如下：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(SEQ ID NO:7)*LCDR1*
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:8)*LCDR2*
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(SEQ ID NO:9)*LCDR3*
FGQGTKLTVLG(SEQ ID NO:10)
(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASG(SEQ ID NO:12)*HCDR1*
WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:13)*HCDR2*
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:14)*HCDR3*
WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)。
星号将框架的氨基酸序列与CDR序列分开。由(Gly4Ser)4组成的多肽接头用于连接VL和VH链并在圆括号中显示。763.74(A)的人源化版本通过用关键的鼠残基替代人框架残基来设计。参见Yin,S.、Ding,F.和Dokholyan,N.V.2007。Eris：蛋白质稳定性的自动估计器。《自然方法》4:466-467。
scFv片段的表达和纯化。使用相应的表达质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)在含有适当抗生素的LB培养基中于37℃下生长。在吸光度(A600)为1的情况下，通过加入1mM的异丙基-1-硫代-β-d半乳糖吡喃糖苷来启动蛋白质表达。诱导后四小时，收获大肠杆菌细胞并通过超声处理破坏。包涵体通过反复洗涤和离心步骤分离，并在6M盐酸胍的存在下以10mg/mL的浓度溶解。通过加入20mM的二硫苏糖醇来减少溶解的包涵体。重折叠在重折叠缓冲液(4M尿素，50mM甘氨酸，2mM胱氨酸，2mM半胱氨酸pH 10.0)中在室温下过夜进行。以10kDa为截止值，使用切向流过滤进行浓度提升和缓冲液交换后，使用疏水相互作用色谱法，然后使用尺寸排除色谱法纯化scFv。
scFv的结合研究。通过流式细胞术使用CSPG4+MDA-MB-231和CSPG4-MDA-MB-468细胞进行结合研究。使细胞与各自的scFv、生物素化的蛋白L以及最后与链霉亲和素-藻红蛋白一起孵育。在FACSAria III(BD生物科学公司)仪器上使用FACSDiva软件采集细胞。
scFv的稳定性。在PBS pH-7.2中以1mg/ml配制人源化scFv。在4℃或37℃下储存48小时后，对样品进行目测检查，并在280nm处测量蛋白质浓度。通过SEC-HPLC分析样品以确定单体、二聚体和高分子量低聚体就总峰面积而言的百分比。使用TSKgel G2000 SWXL柱，二醇相，L×I.D.30cm×7.8mm，5μm粒径(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，08540)进行尺寸排除色谱法。以1mg/mL装入五(5)μL的scFv。流动相为PBS pH 7.2.
统计分析。数据总结为平均值±SD。使用学生t检验或双因素方差分析来确定治疗组之间的统计学上的显著差异，适当时采用Bonferroni的多重比较校正(Prism6:GraphPad软件)。使用Kaplan-Meier方法进行存活分析，并应用Mantel-Cox对数秩检验(Prism 6:GraphPad软件)。所有小于0.05的P值都被认为是统计上显著的。
结果：
scFv的框架工作区(FWR)内的氨基酸取代废除了CAR强直信号传导。CAR靶向硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)抗原，其中抗原结合部分是获自在体外和体内均表达CSPG4的763.74鼠单克隆抗体(mAb)靶向肿瘤细胞的scFv 763.74(A)。参见Pellegatta等人，(2018)和Geldres等人，“针对硫酸软骨素蛋白多糖4重定向的T淋巴细胞在体外和体内均控制多种实体瘤的生长”，《临床癌症研究》20:962-971(2014)。然而，表达编码CD28或4-1BB共刺激胞内域的scFv 763.74(A)CAR(图1A)的T细胞在没有抗原刺激的情况下显示出IFNγ的释放，这一现象被定义为CAR强直信号传导(图1B)。参见Long等人(2015)。表达scFv 763.74(A)CAR的T细胞的自发IFNγ释放严格依赖于CAR信号传导，因为阻止酪氨酸磷酸化的CAR-CD3γ链的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的酪氨酸突变完全废除了自发的IFNγ释放(图1C和图7A、B)。为了研究CAR分子在T细胞的细胞表面上的分布，生成了scFv 763.74(A)CAR，其中CAR的CD3ζ链在COOH末端与GFP融合。使用共聚焦显微镜成像，scFv 763.74(A)CAR显示在没有CAR交联的情况下形成膜簇，可能表明CAR分子的自我聚集(图1D)。scFv 763.74(A)的序列获自分泌鼠IgG1 mAb的杂交瘤763.74的早期代次，其识别人CSPG4的肽表位。参见Reinhold等人，“受体移植的T细胞对黑色素瘤细胞的特异性裂解被针对受体scFv结构域的抗独特型单克隆抗体所增强”，《调查性皮肤病学杂志(J Invest Dermatol.)》112:744-750(1999)。众所周知，杂交瘤的培养传代会影响杂交瘤的生长速度和分泌抗体的产量。参见Correa等人，“传代数对分泌MRSA抗PBP2a单克隆抗体的杂交瘤的生长和生产力的影响”，《细胞技术学(Cytotechnology)》68:419-427(2016)。还描述了在培养传代过程中，从杂交瘤衍生出来的亚克隆中的CDR和FWR都可能发生氨基酸取代。参见Xin和Cutler，“体外杂交瘤传代可能导致甘露聚糖结合凝集素抗体对传播性念珠菌病的预防能力下降”，《感染与免疫(Infect.Immun.)》74:4310-4321(2006)。鉴于这种可能性，对763.74杂交瘤的后期代次的VL和VH结构域进行测序。我们得到了两个VL和VH序列，其中在VL和VH两者的FWR(FR1和FR3)中均识别到氨基酸取代(图2A)。组装新的scFv，称为scFv 763.74(B)，生成新的scFv763.74(B)CAR，并将得到的序列与scFv 763.74(A)CAR进行并行比较，以获得强直信号传导的证据。所有的CAR在T细胞中同样表达(图2B和图8A)，并且CAR-T细胞在体外同样扩增(图8B)。然而，表达编码CD28或4-1BB共刺激胞内域的scFv 763.74(B)CAR的T细胞没有显示出IFNγ的自发释放(图2C)。使用GFP标记的CAR的共聚焦显微镜观察到scFv 763.74(B)CAR在T细胞膜上更均匀地分布(图1D和图8C)。值得注意的是，无论表达的scFv类型如何，由抗独特型mAb(MK2-23 mAb)介导的在T细胞中表达的CAR交联都会引起CAR分子的显著簇形成，进一步表明共聚焦显微镜识别的簇真正反映了CAR聚集体的形成(图8D)。对表达scFv 763.74(A)CAR或scFv 763.74(B)CAR的T细胞的表型分析没有显示记忆和耗竭标志物表达的差异，表明在制造用于临床使用的CAR-T细胞通常需要的10-14天的培养期间，强直信号传导可能不会诱发耗竭表型(图8E、F)。参见Ramos等人，“靶向恶性肿瘤相关的κ轻链的T淋巴细胞的临床反应”，《临床研究杂志(J.Clin.Invest)》126:2588-2596(2016)；Ramos等人，“CD30特异性嵌合抗原受体重定向的淋巴细胞后的临床和免疫学反应”，《临床研究杂志》127:3462-3471(2017)。总的来说，这些数据表明，scFv抗体的FWR内的氨基酸取代足以导致CAR形式的scFv的自我聚集和定义为IFNγ的基础释放的T细胞中的强直信号传导。
scFv的FWR内的氨基酸取代会导致蛋白质去稳定化。为了研究scFv 763.74(A)和scFv 763.74(B)之间的氨基酸差异是否会导致scFv去稳定化，通过同源建模生成scFv763.74(B)的3D构象，并对结构进行优化以供电子诱变(图3A)。Eris工具被用来描述FWR突变、L3K、T5S、A9S、E83Q、I123V、Q124K、V126K、Q127E和L230V对scFv 763.74(B)结构的影响。Eris估计上述突变的ΔΔGmut分别为2.41、1.26、2.29、0.47、0.79、1.87、4.58、2.70和0.67kcal/mol(图3B)。具体地，该突变使scFv 763.74(A)结构去稳定化(ΔΔGmut>0)，随后影响CAR的自发聚集。此外，为了交叉验证scFv 763.74(B)的结构构象，进行Eris分析以识别FWR突变位点的稳定化突变(ΔΔGmut<0)。分析表明，突变如E83L、E83I、T5M和Q124M导致了负的ΔΔGmut，说明它们具有潜在的稳定能力(图9)。此外，残基如I123和Q127被识别为scFv 763.74(B)结构稳定性的关键。在I123或Q127位置取代其他19个氨基酸中的任何一个，都会极大地使scFv 763.74(B)结构去稳定化(ΔΔG>0)，从而影响蛋白质的聚集(图3C)。总的来说，这些数据表明，scFv mAb的FRW内的氨基酸取代会使蛋白质去稳定化并导致scFv的自我聚集，并且计算引导的分析可以用来稳定蛋白质结构。
scFv的FWR内的氨基酸取代增强了CAR-T细胞的功能。scFv的FWR内的氨基酸取代的作用影响CAR-T细胞对黑色素瘤细胞系WM115(CSPG4+)和M14(CSPG4-)的抗肿瘤活性(图10A)。与IFNγ的自发释放同时，当CAR-T细胞和肿瘤细胞以1比5的比例铺板时，在第4天共培养结束时，表达具有4-1BB的763.74(A)CAR的T细胞显示出体外消除肿瘤细胞的能力受到影响(残留肿瘤细胞43.6％±26.0％)(图4A、B)。相比之下，CD28共刺激似乎使763.74(A)CAR和763.74(B)CAR完全消除肿瘤(残留的肿瘤细胞分别为2.2％±2.7％和2.9％±2.6％)。值得注意的是，与表达具有4-1BB的763.74(A)CAR的T细胞相比，表达具有4-1BB共刺激的763.74(B)CAR的T细胞显示出改善的抗肿瘤效果，但并没有完全消除肿瘤细胞(残留的肿瘤细胞分别为14.1％±8.0％和43.6％±26.0％)(图4A、B)。CAR-T细胞没有消除缺乏CSPG4表达的黑色素瘤细胞系M14，表明抗原特异性不受FWR内氨基酸取代的影响。值得注意的是，只有表达763.74(B)CAR的T细胞在含WM115肿瘤细胞的培养上清液中持续释放可检测量的Th1细胞因子(图10B)。使用eGFP-FFLuc WM115异种NSG小鼠模型，763.74(B)CAR-T细胞的优越抗肿瘤效果在体内更加明显(图4C)。表达具有CD28的763.74(B)CAR的T细胞表现出最突出的以肿瘤生物发光(图4D和图10C)和肿瘤大小(图4E)形式测量的抗肿瘤效果。表达763.74(B)CAR的CAR-T细胞的增强功能在我们先前描述的胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤模型中得到了证实，其中裸鼠的大脑中移植了原发性GBM衍生的神经球(GBM-NS)，并通过CAR-T细胞的瘤内接种进行治疗。参见Pellegatta等人，“胶质母细胞瘤和神经球中硫酸软骨素蛋白多糖4的组成型和TNFα诱导型表达：对CAR-T细胞疗法的影响”，《科学转化医学》10(2018)(“Pellegatta等人2018”)；参见图5A。在这个模型中，通过磁共振成像(MRI)监测肿瘤移植和进展。在用对照T细胞或表达编码CD28的763.74(A)CAR的T细胞治疗的小鼠中，观察到快速的肿瘤进展，并且在这些动物中，肿瘤块占据了整个半球并渗透到对侧半球(图5B、C)。用表达编码CD28的763.74(B)CAR的T细胞治疗的小鼠显示出最明显的抗肿瘤效果，这表现为更小和更受限的病变(图5D)，但用表达编码4-1BB的763.74(A)CAR或763.74(B)CAR的T细胞治疗的小鼠也能观察到肿瘤控制，即使抗肿瘤效果不太明显(图5E、F)。与使用对照T细胞治疗的小鼠相比，表达编码4-1BB的763.74(A)CAR或763.74(B)CAR的T细胞延长了存活(P<0.0001)。然而，表达编码CD28的763.74(B)CAR的T细胞对延长存活最为有效(与CTR相比，p<0.0001；与具有4-1BB的763.74(A)相比，p＝0.04；与具有4-1BB的763.74(B)相比，p＝0.01)。观察到表达编码CD28的763.74(A)CAR的T细胞的适度活性，因为没有小鼠存活超过110天。Pellegatta等人2018(图5G)。为了进一步表征表达编码CD28的763.74(B)CAR的T细胞在该GBM模型中的显著抗肿瘤作用，研究了紧接颅内输注后的T细胞的激活状态。在CAR-T细胞输注后的2、4、6、12、24和48小时，移植肿瘤块。观察到表达具有CD28的763.74(B)CAR的T细胞在接种后2小时内上调了CD69(42.5±2.1％的CD69+ T细胞)，并在24小时内保持高CD69水平(22.5±1.5％的CD69+T细胞)，这与先前表明编码CD28胞内域的CAR-T细胞快速活跃的报告一致。参见Zhao等人“工程化共刺激的结构设计决定了肿瘤排斥动力学和CAR T细胞的持久性”《癌细胞》28:415-428(2015)；Sun等人2020。(图5H)。体外的其他实验进一步证明了表达具有CD28的763.74(B)CAR的T细胞的快速抗肿瘤作用(图11)。
scFv的FWR的人源化废除了CAR强直信号传导。鼠源scFv的人源化是提出以防止对CAR的体液和T细胞反应的策略。参见Sun等人，“新型人源化HER2特异性嵌合受体的构建和评价”，《乳腺癌研究(Breast Cancer Res.)》16:R61(2014)；Johnson等人，“用于胶质母细胞瘤的人源化抗EGFR变体III嵌合抗原受体T细胞的合理开发和表征”，《科学转化医学》7:275ra22(2015)。用人FWR取代scFv的鼠FWR可以用来废除CAR强直信号传导。将763.74(A)的序列和稳定的人框架rFW1.4进行比对，并识别关键氨基酸。参见Ewert等人，“细胞外和细胞内应用的抗体的稳定性改进：CDR移植到稳定框架和基于结构的框架工程化”，《方法(Methods)》34:184-199(2004).在第一轮工程化中，设计了一个在rFW1.4序列中没有突变的CDR移植物和七个在关键区域有多达24个突变的变体(图12A)。单独的人源化scFv变体(即只有CAR的细胞外结构域)和野生型鼠scFv在大肠杆菌中表达，重新折叠并通过尺寸排除色谱法(SEC)纯化。野生型鼠scFv变体由于聚集而不能重折叠。因此，我们无法以可溶形式对其进行纯化。这一结果进一步表明，鼠763.74(A)scFv是不稳定的。在rFW1.4中没有突变的人源化变体被表达，但不与CSPG4结合。几乎所有其他人源化scFv变体都被成功表达并能结合CSPG4+细胞。在接下来的几轮工程化中，使具有最小的763.74(A)鼠FW残基数量的人源化变体进一步进行VH和VL的链改组。共产生了26种人源化scFv。具有最小鼠FWR残基数量和保留CSPG4结合活性的四种人源化scFv(h763.74#2、h763.74#3、h763.74#4和h763.74#5)被选择用于进一步研究(图12B)。生成带有含CD28胞内域的所有四种人源化scFv763.74(A)的CAR，并与肿瘤细胞进行体外共培养实验。表达h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5的T细胞在体外表现出更好的抗肿瘤活性和更高的IFNγ和IL-2产量的趋势，并被选择用于进一步研究(图12C-E)。为了表征两种选定的人源化scFv h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5(图13A)，用纯化的可溶性scFv进行储存稳定性研究。蛋白质以1mg/ml制备并在4℃和37℃下储存48小时。孵育后，通过SEC分析样品以估计单体蛋白的百分比。在测试条件下，没有观察到可检测到的蛋白质损失，并且单体的百分比保持高于91％-97％(图13B)。这种方法表明所有四种选定的人源化scFv在测试条件下都是单体的，并且在4℃和37℃下储存时不会二聚或聚集。h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5在T细胞中的表达是充分的(图6A和图14A)，并且T细胞没有显示出IFNγ的自发释放(图6B)。表达h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5的T细胞在体外成功地控制了CSPG4+WM115黑色素瘤细胞的生长(残留的肿瘤细胞分别为11％±15％和10％±17％)，同时它们不靶向CSPG4-M14黑色素瘤细胞系，表明抗原特异性得到保持(图6C和图14B)。表达h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5的T细胞的抗肿瘤活性被IFNγ和IL-2的具体产量所证实(图14C)。在异种WM115黑色素瘤小鼠模型中，将表达h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5的T细胞与表达编码CD28胞内域的763.74(B)CAR的T细胞进行比较(图6D)。表达h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5的T细胞显示出强大的抗肿瘤活性(图6E和图14D)。此外，在不同时间点在治疗小鼠的外周血中可以检测到T细胞(图14E)，并且在安乐死时在肝和脾中可以检测到T细胞(图6F)，并且T细胞保留了CAR表达(图6G)。值得注意的是，与具有CD28的763.74(B)CAR相比，表达h763.74.CAR#2和h763.74.CAR#5的T细胞并没有显示出PD-1的表达增加(图14F、G)。总的来说，这些数据表明scFv的人源化可以用来消除CAR分子的强直信号传导，从而保持特定的抗肿瘤效果。
序列表
<110> 细胞医学公司
北卡罗来纳大学教堂山分校
G·多蒂
E·兰多尼
M·德罗斯特
A·沙姆谢夫
<120> 用于减少嵌合抗原受体强直信号传导的方法和组合物
<130> P35071WO00/1104431.00064
<150> US 63/045,646
<151> 2020-06-29
<160> 381
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 11
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Ser
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<211> 113
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Gly Trp Ile Asn Thr Ala Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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1 5 10 15
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<223> 重组
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<223> 重组
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20
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<220>
<223> 重组
<400> 163
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20
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<223> 重组
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<223> 重组
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<223> 重组
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<223> 重组
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<223> 重组
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<223> 重组
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<223> 重组
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20
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<213> 未知
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<223> 重组
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
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<223> 重组
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20
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<220>
<223> 重组
<400> 174
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<223> 重组
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<223> 重组
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<223> 重组
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Asp Ile Arg Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
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<211> 23
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<213> 未知
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<223> 重组
<400> 178
Asp Ile Ser Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 179
Asp Ile Thr Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 180
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
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<223> 重组
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20
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<223> 重组
<400> 182
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
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<223> 重组
<400> 183
Asp Ile Lys Leu Ala Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
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<213> 未知
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<223> 重组
<400> 184
Asp Ile Lys Leu Cys Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 185
Asp Ile Lys Leu Asp Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 186
Asp Ile Lys Leu Glu Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 187
Asp Ile Lys Leu Phe Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 188
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 188
Asp Ile Lys Leu Gly Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 189
Asp Ile Lys Leu His Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
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<223> 重组
<400> 190
Asp Ile Lys Leu Ile Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 191
Asp Ile Lys Leu Lys Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 192
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 192
Asp Ile Lys Leu Leu Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 193
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 193
Asp Ile Lys Leu Met Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 194
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 194
Asp Ile Lys Leu Asn Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 195
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 195
Asp Ile Lys Leu Pro Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 196
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 197
<211> 23
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<220>
<223> 重组
<400> 197
Asp Ile Lys Leu Arg Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
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<220>
<223> 重组
<400> 198
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 199
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 199
Asp Ile Lys Leu Val Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 200
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<212> PRT
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<220>
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Asp Ile Lys Leu Trp Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 201
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 201
Asp Ile Lys Leu Trp Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 202
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 202
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Cys Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 203
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Asp Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 204
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 204
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Glu Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 205
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 206
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Gly Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 207
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro His Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 208
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Ile Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 209
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Lys Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
<210> 210
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 210
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Leu Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 211
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Met Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 212
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Asn Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
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Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Pro Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 214
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Gln Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 215
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Arg Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 216
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 217
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 218
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 219
Asp Ile Lys Leu Ser Gln Ser Pro Trp Ile Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 220
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Glu Thr Val Ser Leu Ser Cys
20
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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<213> 未知
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<223> 重组
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 224
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His
1 5
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 225
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 226
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 227
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 228
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Gln Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 229
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 230
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 231
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 232
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Cys Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 233
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Asp Gly Ile Tyr Tyr Cys
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 234
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 235
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Gly Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 236
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp His Gly Ile Tyr Tyr Cys
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 237
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
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Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 238
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Lys Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 239
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 240
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 241
<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 241
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 242
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Pro Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 243
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Arg Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 244
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 245
<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 245
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 246
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 247
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Trp Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 248
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ile Asn Ser Val Lys Pro Glu Asp Tyr Gly Ile Tyr Tyr Cys
20 25 30
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 249
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 250
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 251
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
1 5 10
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<211> 11
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 252
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 253
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 254
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
1 5 10
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<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 255
Gln Ala Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 256
Gln Cys Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
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20 25
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<211> 29
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<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 257
Gln Asp Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
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20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 258
Gln Glu Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 259
Gln Phe Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 260
Gln Gly Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 261
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 261
Gln His Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 262
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 262
Gln Lys Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 263
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 263
Gln Leu Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 264
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 264
Gln Met Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 265
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 265
Gln Asn Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 266
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 266
Gln Pro Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 267
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 267
Gln Gln Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 268
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 268
Gln Arg Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 269
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 269
Gln Ser Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
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20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 270
Gln Thr Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 271
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 271
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 272
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 272
Gln Trp Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 273
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 273
Gln Tyr Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 274
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 274
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 275
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 275
Gln Val Lys Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 276
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 276
Gln Val Lys Leu Lys Ala Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 277
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 277
Gln Val Lys Leu Lys Cys Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 278
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 278
Gln Val Lys Leu Lys Asp Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 279
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 279
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 280
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 280
Gln Val Lys Leu Lys Phe Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 281
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 281
Gln Val Lys Leu Lys Gly Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 282
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 282
Gln Val Lys Leu Lys His Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 283
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 283
Gln Val Lys Leu Lys Ile Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 284
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 284
Gln Val Lys Leu Lys Lys Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 285
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 285
Gln Val Lys Leu Lys Leu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 286
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 286
Gln Val Lys Leu Lys Met Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 287
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 287
Gln Val Lys Leu Lys Asn Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 288
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 288
Gln Val Lys Leu Lys Pro Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 289
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 289
Gln Val Lys Leu Lys Arg Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 290
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 290
Gln Val Lys Leu Lys Ser Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 291
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 291
Gln Val Lys Leu Lys Thr Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 292
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 292
Gln Val Lys Leu Lys Val Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 293
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 293
Gln Val Lys Leu Lys Trp Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 294
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 294
Gln Val Lys Leu Lys Tyr Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 295
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 295
Gln Val Ala Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 296
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 296
Gln Val Cys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 297
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 297
Gln Val Asp Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 298
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 298
Gln Val Glu Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 299
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 299
Gln Val Phe Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 300
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 300
Gln Val Gly Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 301
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 301
Gln Val His Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 302
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 302
Gln Val Ile Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 303
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 303
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 304
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 304
Gln Val Leu Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 305
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 305
Gln Val Met Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 306
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 306
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 307
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 307
Gln Val Pro Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 308
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 308
Gln Val Arg Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 309
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 309
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 310
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 310
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 311
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 311
Gln Val Val Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 312
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 312
Gln Val Trp Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 313
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 313
Gln Val Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 314
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 314
Gln Val Lys Leu Ala Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 315
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 315
Gln Val Lys Leu Cys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 316
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 316
Gln Val Lys Leu Asp Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 317
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 317
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 318
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 318
Gln Val Lys Leu Phe Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 319
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 319
Gln Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 320
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 320
Gln Val Lys Leu His Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 321
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 321
Gln Val Lys Leu Ile Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 322
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 322
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 323
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 323
Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 324
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 324
Gln Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 325
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 325
Gln Val Lys Leu Asn Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 326
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 326
Gln Val Lys Leu Pro Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 327
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 327
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 328
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 328
Gln Val Lys Leu Arg Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 329
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 329
Gln Val Lys Leu Ser Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 330
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 330
Gln Val Lys Leu Thr Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 331
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 331
Gln Val Lys Leu Trp Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 332
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 332
Gln Val Lys Leu Tyr Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 333
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 333
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 334
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 334
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 335
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 335
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 336
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 336
Gln Ile Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 337
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 337
Gln Ile Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 338
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 338
Gln Ile Lys Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 339
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 339
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 340
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 340
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 341
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 341
Gln Val Lys Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 342
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 342
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 343
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 343
Gln Ile Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 344
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 344
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 345
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 345
Gln Ile Lys Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 346
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 346
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 347
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 347
Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 348
<211> 29
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 348
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 349
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 349
Trp Val Lys Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 350
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 350
Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 351
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 351
Trp Val Arg Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val Gly
1 5 10
<210> 352
<211> 14
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 352
Trp Val Lys Lys Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 353
<211> 31
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 353
Arg Phe Ala Ile Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Phe
20 25 30
<210> 354
<211> 31
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 354
Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Phe
20 25 30
<210> 355
<211> 31
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 355
Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
20 25 30
<210> 356
<211> 31
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 356
Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
20 25 30
<210> 357
<211> 31
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 357
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
20 25 30
<210> 358
<211> 31
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 358
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
20 25 30
<210> 359
<211> 32
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 359
Arg Phe Ala Ile Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Phe Ser
20 25 30
<210> 360
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 360
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
1 5 10
<210> 361
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 361
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 362
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 362
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 363
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 363
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Cys Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 364
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 364
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Asp Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 365
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 365
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Glu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 366
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 366
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Phe Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 367
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 367
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Gly Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 368
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 368
Trp Gly Gln Gly Thr Thr His Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 369
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 369
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 370
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 370
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Lys Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 371
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 371
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Met Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 372
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 372
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Asn Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 373
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Pro Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 374
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 374
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Gln Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 375
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 375
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Arg Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 376
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 376
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ser Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 377
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 377
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 378
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 378
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 379
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Trp Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 380
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 380
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Tyr Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 381
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 重组
<400> 381
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (20)

1.一种对硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)具有结合特异性的结合成员，所述结合成员包括
可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，以及
选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；
选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；
选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和
选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；
可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列，以及
选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；
选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；
选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和
选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
2.根据权利要求1所述的对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中所述轻链框架序列1(VL-FR1)选自由SEQ ID NO:153至158组成的群组；
所述轻链框架序列2(VL-FR2)选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组；
所述轻链框架序列3(VL-FR3)选自由SEQ ID NO:226至231组成的群组；并
且
所述轻链框架序列4(VL-FR4)选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组；
所述重链框架序列1(VH-FR1)选自由SEQ ID NO:347至349组成的群组；
所述重链框架序列2(VH-FR2)选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组；
所述重链框架序列3(VH-FR3)选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组；并
且
所述重链框架序列4(VH-FR4)选自由SEQ ID NO:361至362组成的群组。
3.根据权利要求1所述的对CSPG4具有结合特异性的结合成员，其中所述可变轻链序列包括选自由SEQ ID NO:67至109组成的群组的序列，并且所述可变重链序列包括选自由SEQID NO:110至152组成的群组的序列。
4.一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ IDNO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，以及
选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；
选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；
选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和
选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)。
5.一种编码多肽的核酸，所述核酸包括可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ IDNO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列，以及
选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；
选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；
选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和
选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)。
6.一种嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，所述构建体包括编码
嵌合抗原受体(CAR)编码序列的核酸序列，所述CAR编码序列包括胞外域序列，所述胞外域序列包括与硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括
可变轻链序列，所述可变轻链序列包括SEQ ID NO:1-3所示的轻链互补决定区(“LCDR”)LCDR1至LCDR3序列，
选自由SEQ ID NO:153至221组成的群组的轻链框架序列1(VL-FR1)；
选自由SEQ ID NO:222至225组成的群组的轻链框架序列2(VL-FR2)；
选自由SEQ ID NO:226至249组成的群组的轻链框架序列3(VL-FR3)；和
选自由SEQ ID NO:250至255组成的群组的轻链框架序列4(VL-FR4)；
可变重链序列，所述可变重链序列包括SEQ ID NO:4至6所示的重链互补决定区(“HCDR”)HCDR1至HCDR3序列，以及
选自由SEQ ID NO:256至349组成的群组的重链框架序列1(VH-FR1)；
选自由SEQ ID NO:350至353组成的群组的重链框架序列2(VH-FR2)；
选自由SEQ ID NO:354至360组成的群组的重链框架序列3(VH-FR3)；和
选自由SEQ ID NO:361至382组成的群组的重链框架序列4(VH-FR4)；
跨膜结构域序列；和
胞内域序列。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述跨膜结构域选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940，12487)、CD3-ζ(基因ID：919；12503CD247)、CD4(基因ID：920，12504)、CD8(基因ID：924，12525)、CD16(基因ID：2214；14131；Fcgr3)、NKp44(基因ID：9436，NCR2)、NKp46(基因ID：9437，17086，NCR1)和NKG2d(基因ID：22914；27007KLRK1)。
8.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述胞内域序列选自由以下组成的群组：CD28(基因ID：940)、TNF受体超家族成员9(基因ID 3604，例如，4-1BB或CD137)、CD247(基因ID 919，CD3-ζ)、2B4(基因ID：51744，CD244)、白细胞介素21(IL-21，基因ID 59067)、造血细胞信号转导蛋白(HCST，基因ID 10870，例如，DAP10)和跨膜免疫信号传导衔接子(TYROBP，基因ID 7305；DAP12)。
9.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其进一步包括编码Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列的序列。
10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述表达构建体编码多蛋白，所述多蛋白包括所述Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列和最多三个额外的蛋白编码序列。
11.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述Wnt信号传导途径中转录激活因子的蛋白序列和最多三个额外的蛋白编码序列被自主核糖体内自加工肽隔开。
12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述自主核糖体内自加工是口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)。
13.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述转录激活因子选自由淋巴增强子结合因子1(LEF1，基因ID 51176)、β-连环蛋白((CTNNB1，基因ID 1499))、Smad3(基因ID 4088)、HNF1同源框A(HNF1A，基因ID：6927(alt.TCF1))、转录因子7(TCF7，基因ID：6932(alt.TCF1))和转录辅阻遏物TLE家族成员1(TLE 1，基因ID 7088)组成的群组。
14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述LEF1选自由参考序列(RefSeq)ID NO:NP_057353.1、NP_001124185.1和NP_001124186.1组成的群组。
15.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其进一步包括至少一个生长因子的蛋白编码序列。
16.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述生长因子选自由白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素27(IL-27)、白细胞介素33(IL-33)及其组合组成的群组。
17.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述生长因子的蛋白编码序列与所述CAR编码序列由口蹄疫病毒(FMDV)2A序列或FMDV 2A相关的顺式作用水解酶元件(CHYSEL)序列隔开。
18.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述胞外域序列进一步包括间隔子结构域。
19.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其中所述胞内域包括与CD3-ζ链框内融合的4-1BB信号序列。
20.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体(CAR)表达构建体，其进一步包括编码靶向MHCI类或MHC II类基因的小发夹RNA(shRNA)序列的DNA序列，其中所述shRNA序列被嵌入人工微小RNA(amiR)支架中。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPS6412935A (en) 1987-07-02 1989-01-17 Mitsubishi Electric Corp Constant-speed travel device for vehicle
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
WO2016077638A1 (en) * 2014-11-12 2016-05-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-chondroitin sulfate proteoglycan 4 antibodies and uses thereof
WO2016164408A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 The General Hospital Corporation Anti-cspg4 reagents and methods of treating cancer
US20210252067A1 (en) * 2018-06-13 2021-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for chimeric antigen receptor targeting cancer cells

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