JP2023532347A - キメラ抗原受容体の緊張性シグナル伝達を減少させる方法および組成物 - Google Patents

キメラ抗原受容体の緊張性シグナル伝達を減少させる方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023532347A
JP2023532347A JP2022581554A JP2022581554A JP2023532347A JP 2023532347 A JP2023532347 A JP 2023532347A JP 2022581554 A JP2022581554 A JP 2022581554A JP 2022581554 A JP2022581554 A JP 2022581554A JP 2023532347 A JP2023532347 A JP 2023532347A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
sequence
nos
group
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022581554A
Other languages
English (en)
Inventor
ドッティ，ギアンピエトロ
ランドニ，エリザ
ドロステ，ミリアム
シャムシーブ，アディジャパー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of North Carolina at Chapel Hill
Original Assignee
University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of North Carolina at Chapel Hill filed Critical University of North Carolina at Chapel Hill
Publication of JP2023532347A publication Critical patent/JP2023532347A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/47—Brain; Nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）と、緊張性シグナル伝達を排除するフレームワーク配列への修飾とに関する、方法および組成物に関する。組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する修飾された結合メンバーを含み、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）として調製されてＣＡＲに組み込まれる場合に安定である。本方法は、ＣＳＰＧ４ ＣＡＲの発現用の核酸コンストラクトと、がんの処置に向けた治療方法へのＣＳＰＧ４ ＣＡＲの適用とをさらに含む。本開示はまた、ヒト化フレームワーク配列の修飾に関する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年６月２９日に出願された米国仮出願第６３／０４５，６４６号の米国特許法１１９条に基づく利益を主張し、その全体を、それぞれの配列表を含め参照により本明細書に組み込む。
連邦政府の出資を受けた研究または開発に関する報告
本研究は、国立衛生研究所、パッサン財団（ＮＶＤ）、米国国防省Ｗ８１ＸＷＨ－１６－１－０５００（ＳＦ）、およびイル・フォンド・ディ・ジオ・オンルス（Ｉｌ Ｆｏｎｄｏ ｄｉ Ｇｉｏ Ｏｎｌｕｓ）（ＳＰ）から、Ｒ０１ ＣＡ１９３１４０（ＧＤ）、１Ｒ３５ ＧＭ１３４８６４（ＮＶＤ）、ＵＬ１ ＴＲ００２０１４（ＮＶＤ）、ＲＯ１ＤＥ０２８１７２（ＳＦ）、ＲＯ３ＣＡ２３９１９３（ＳＦ）、およびＲＯ３ＣＡ２１６１１４（ＳＦ）の助成を受けてなされた。また、ＧＤは、セル・メディカ（Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａ）からの助成を受けた。内容はあくまで執筆者のみが責任を負うものであり、必ずしもＮＩＨの公式見解を代表するものではない。７６３．７４モノクローナル抗体およびそのヒト化体の配列は、仮特許として提出された。
配列表の組み込み
配列表は、Ｐ３５０７１ＷＯ００＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられたファイルを含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、このファイルは、サイズが２４９，３２８バイトであり、２０２１年６月２７日に作成されたもので、このファイルも同様に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本来の概念におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、モノクローナル抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域が、非切断性の柔軟なリンカーとともに組み立てられて単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を形成し、これが、Ｔ細胞受容体のシグナル伝達分子および共刺激細胞内領域と融合した、融合タンパク質である。Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｏｒ ｚｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９０：７２０－７２４（１９９３）；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｂｏｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２７９１－２７９７（１９９８）；Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ４－１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｐｒｏｖｏｋｅ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８：６７６－６８４（２００４）を見られたい。ＣＤ１９特異的ＣＡＲをＴ細胞に生着させ、この細胞を急性Ｂ細胞白血病の小児患者に注入すると、顕著かつ持続的な抗腫瘍活性が得られる。Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７１：１５０７－１５１７（２０１４）を見られたい。
腫瘍細胞によって発現される抗原とのＣＡＲの係合は、細胞溶解、サイトカイン分泌、および増殖を特徴とするＴ細胞の急速で重大な活性化を促進する。Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１０７－１２６（２０１４）を見られたい。しかし、ＣＡＲがＴ細胞において緊張性シグナル伝達を引き起こし、これが、急速なＴ細胞の消耗および抗腫瘍活性化の低下につながる持続的な抗原非依存性活性化を示すということが浮上してきた（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“４－１ＢＢ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｏｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１：５８１－５９０（２０１５）（“Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）”）。ＣＡＲ－Ｔ細胞における緊張性シグナル伝達を記載した最初の報告では、この効果が、細胞表面でのＣＡＲのクラスタリングとその結果生じるシグナル伝達を引き起こすという自己凝集する特定のｓｃＦｖの性質に起因するとされている。同文献を見られたい。同様の緊張性シグナル伝達は、ＮＫＴ細胞を含む他の免疫細胞でも観察されている。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ＧＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＩＬ－１５ ｓｈｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，”Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２５（２３）：７１２６－７１３８（２０１９）を見られたい。
結合してｓｃＦｖを形成するＶＨおよびＶＬ領域が、アンフォールディングしてｓｃＦｖオリゴマー化をもたらす傾向を有することはよく知られている。Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，”Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５：９８９－１０１０（２００１）（“Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）”）を見られたい。ＶＨ領域とＶＬ領域との間のジスルフィド結合の操作、ＶＨ領域およびＶＬ領域内への荷電アミノ酸の導入、または異なるフレームワーク領域（ＦＷＲ）への相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフト化を含む、ｓｃＦｖを安定化させる試みにおいて、様々な戦略が開発されている。Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄ，”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７７：１３５－１３９（１９９５）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｃＦｖｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３：５４９－５５７（２０１０）；およびＫｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ１９ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｎｔｏ ａ ｈｕｍａｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２２：１３５－１４７（２００９）を見られたい。ＣＡＲフォーマットに組み立てられたｓｃＦｖの論争では、マウス１４ｇ２ａモノクローナル抗体由来のｓｃＦｖによって引き起こされる緊張性シグナル伝達は、詳細には抗体のＦＷＲに起因していた。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を見られたい。驚くべきことに、１４ｇ２ａ抗体のＦＷＲへの、ＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来であるｓｃＦｖのＣＤＲの生着は、このｓｃＦｖを使用してＣＡＲを生成した場合にＦＭＣ６３ ｓｃＦｖの緊張性シグナル伝達を引き起こすのに充分であったことから、ＣＡＲフォーマットでのｓｃＦｖの緊張性シグナル伝達を引き起こす上でＦＷＲが基本的に重要な役割を果たしていることを示している。同文献を見られたい。
ＴＣＲ媒介性緊張性シグナル伝達は、ナイーブＴ細胞をよく特徴付ける恒常的特性であり、その長期持続性を促進する上で基本的に重要な役割を果している。Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｏｎｉｃ Ｓｉｇｎａｌｓ：Ｗｈｙ Ｄｏ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｂｏｔｈｅｒ？ Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：８４４－８５７（２０１７）を見られたい。しかし、ＴＣＲ媒介性緊張性シグナル伝達は、クラスＩまたはＩＩのいずれかで表される自己ペプチドとのＴＣＲの結合を必要とし、リンパ系器官内位置するＴ細胞に厳密に限定される。Ｈｏｃｈｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｆｏｒｅｉｇｎ ａｎｔｉｇｅｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０７：５９３１－５９３６（２０１０）を見られたい。これとは際立って対照的に、Ｔ細胞におけるＣＡＲ媒介性緊張性シグナル伝達は、その厳密な本質として、いずれの特定のＣＡＲの結合にも依存しないＣＡＲシグナル伝達を指すものであり、ＩＦＮγなどのサイトカイン類の自発放出として定義されている。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を見られたい。ＣＡＲ媒介性緊張性シグナル伝達を誘発する事象は、充分な数のＣＡＲ分子の自発的な凝集として特定されており、この凝集がシグナル伝達の開始につながる。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）を見られたい。今回我々は、緊張性シグナル伝達がＣＡＲ分子の自己凝集に起因することを確認し、さらには、ＣＡＲ－ＣＤ３ζ鎖が自発サイトカイン放出に専ら関与し、この理由が、ＣＡＲ－ＣＤ３ζ鎖の機能喪失によってＩＮＦγの自発放出が完全に抑制されるからであることを実証している。Ｔ細胞の消耗に関連する細胞表面マーカーの検出ではなく自発サイトカイン放出が、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達の存在と機能性低下を定義する最も強固で信頼できるアッセイであると思われる。
合成ｓｃＦｖの不安定性は、可溶性試薬の生成を妨げるそれらの自発的な凝集を引き起こすものとして長い間認識されてきた。Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｃＦｖｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３：５４９－５５７（２０１０）を見られたい。我々は以前、構造モデリングおよび計算タンパク質設計によって駆動される変異誘発を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域の融合により歪を生じたｓｃＦｖの特異性を回復させることができるのを実証している。Ｋｒｏｋｈｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｇｕｉｄｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．１５：３０－３７（２０１９）を見られたい。一般にタンパク質の熱力学的安定性（ΔＧ）は、その生物学的機能性にとって極めて重要である。タンパク質中のアミノ酸変異は、重要な残基相互作用を破壊し、タンパク質の活性部位を変化させ、タンパク質安定性を変化させる可能性がある。これらの不安定な変異タンパク質立体配座は、多くのヒト障害の根底にある原因である。Ｒｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”Ｊ Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．８２：１１－１６（２０１６）を見られたい。よって、タンパク質構造に及ぼす変異の効果を定量化することは、タンパク質安定性、そしてそれによる機能性を見積もるには重要である。
異なるヒンジ／スペーサー領域または異なるベクター／プロモーターを含有するＣＡＲを使用するＴ細胞におけるＣＡＲ緊張性シグナル伝達を悪化または減衰させる際の共刺激ＣＤ２８および４－１ＢＢ細胞内領域の役割について、矛盾するデータが報告されている。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）；Ｆｒｉｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：３５６－３６７（２０１５）；およびＷａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｉｎｅ－ｔｕｎｉｎｇ ｔｈｅ ＣＡＲ ｓｐａｃｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｏｔｅｎｃｙ，”Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：ｅ１２５３６５６（２０１６）を見られたい。しかし、これらの矛盾するデータにもかかわらず、ｓｃＦｖの本質的な不安定性は、使用する共刺激のタイプによっては、またはＣＡＲ構造の他の構成成分を変更することによっては修正できないと結論することが可能である。実際、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達は、元の抗体が抗原の特異性と親和性の点で優れたプロファイルを有するにもかかわらず、特定のｓｃＦｖについてさらなるＣＡＲ開発を断念することの正当な理由になると見なされることが多い。
開示の分野
本開示は、結合領域、キメラ抗原受容体を操作し、操作された結合領域とキメラ抗原受容体とを用いて形質転換されて免疫細胞における緊張性シグナル伝達を防止する宿主細胞を操作することに関する。本開示はさらに、結合領域、キメラ抗原受容体を操作し、ヒトとマウスの互換性を規定するマウスからのアミノ酸置換を含有するヒト化フレームワーク領域を有する宿主細胞を操作することに関する。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する結合メンバーを規定しこれを含む。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、を含んでなるポリペプチドをコードする核酸を規定しこれを含む。
本開示は、配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなるポリペプチドをコードする核酸を規定しこれを含む。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする核酸配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトを規定しこれを含む。
本開示は、配列番号２８から６５からなる群から選択されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を規定しこれを含む。
本開示は、配列番号２８から６５からなる群から選択されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるＣＡＲをコードする核酸分子を規定しこれを含む。
本開示は、ドナーから末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を単離することと、ＰＢＭＣからナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を単離して単離免疫細胞を準備することと、単離免疫細胞を１日から２０日の間、増殖させ、内因性Ｔ細胞受容体の刺激によって、および共刺激受容体、サイトカイン類、またはその両方の組み合わせによる共刺激によって、遺伝子操作用の増殖免疫細胞を準備することと、配列番号６１から１０９からなる群から選択される可変軽鎖と、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される可変重鎖と、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトを導入することと、を含んでなる、ＣＡＲを含んでなる免疫細胞の産生させる工程を規定しこれを含む。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする発現コンストラクトを含んでなる遺伝子操作された免疫細胞を規定しこれを含む。
本開示は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする発現コンストラクトを含んでなる複数の遺伝子操作された免疫細胞を含んでなる細胞の集団であって、ＣＡＲが、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなる、細胞の集団を規定しこれを含む。
本開示は、個体におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）陽性細胞を阻害する方法であって、細胞を治療有効量の遺伝子操作された免疫細胞と接触させるステップを含んでなり、免疫細胞が、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでなる、方法を規定しこれを含む。
本開示は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでなる遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを処置する方法であって、ＣＡＲが、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなる、方法を規定しこれを含む。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする核酸配列を含んでなる、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせを含んでなるキットを規定しこれを含む。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列；ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列を発現するＮＫＴ細胞においてＮＫＴ細胞増殖能を維持する方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子を含んでなるタンパク質コード配列を発現させることと、操作されたＮＫＴ細胞を培養して、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を準備することと、を含む方法を規定しこれを含む。
マウスモデルにおけるｓｃＦｖの緊張性シグナル伝達を低減させる方法であって、ＣＡＲの一部としてマウス免疫細胞において発現させた場合に、緊張性シグナル伝達を有するｓｃＦｖを特定することと；ｓｃＦｖの構造モデルとして生成し、計算機による変異誘発を実行して、一連の変異させたｓｃＦｖを準備することと；変異させたｓｃＦｖの自由エネルギーを計算することと；変異させたｓｃＦｖを、フレームワーク１．４（ＦＷ１．４）を含んでなるヒト化ｓｃＦｖに配向させ、基本的に重要なマウス残基を特定することと；ヒトからマウスへの一つまたは複数の残基変化を導入して前記ｓｃＦｖの安定性を高め、マウスモデルにおいて使用するための修飾されたヒト化ｓｃＦｖを準備することと、を含んでなる方法。
本開示は、添付図面を参照しつつ開示され、ここで：
図１は、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）（配列番号２８）をコードするＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の一実施形態の緊張性シグナル伝達の結果を表す。図１Ａは、培養８日目に評価されたＴ細胞におけるＣＡＲ発現を示すフローサイトメトリーの代表的なプロットを表す。７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８および７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢは、Ｔ細胞において発現する特異的ＣＡＲを表す。 図１Ｂは、いかなるＣＡＲ特異的活性化もなしに対照ＣＡＲ（ＣＴＲ）、７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８、または７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢ ＣＡＲを発現するＴ細胞によって放出されたＩＦＮγの定量化を表す。ＩＦＮγは、サイトカイン類を含まない２ｍＬの完全培地中、２４ウェルプレートに１０６個／ウェルの細胞を播いてから２４時間後に採集した上清中で測定される。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝１０、＊Ｐ＝０．０１８４、＊＊＊Ｐ＝０．０００３（ＣＴＲ対７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８）、Ｐ＝０．０００４（７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８対７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢ）、対応のあるｔ検定として表されている。 図１Ｃは、いかなるＣＡＲ特異的活性化もなしに対照ＣＡＲ（ＣＴＲ）、７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８ζＹ６Ｆ、または７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢζＹ６ＦのＣＡＲを発現するＴ細胞によって放出されるＩＦＮγの定量化を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝４として表されている。 図１Ｄは、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）、およびＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかを使用してＣＡＲが得られる、ＧＦＰタグＣＡＲ（矢印）を発現するＴ細胞におけるＧＦＰ凝集を示す代表的な共焦点顕微鏡画像を表す。対照ＣＡＲ（ＣＴＲ）またはＧＦＰ発現Ｔ細胞。示されているのは、単視野の代表的な細胞である（倍率６３×）。 図２は、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）のＦＷＲにおけるアミノ酸置換であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞における緊張性シグナル伝達を逆転させるものを示す配向を表す。図２Ａは、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）（配列番号２８）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）（それぞれ、配列番号６８、１１５、および２９）の、ＶＬ（配列番号６７）およびＶＨ（配列番号１１０）の配列を表す。ボックスは、アミノ酸置換の場所を示す。 図２Ｂは、ＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞におけるＣＡＲ発現を示す代表的フローサイトメトリーのプロットを表す。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞は、陰性対照として示されている。 図２Ｃは、ＣＡＲ特異的活性化なしに異なるＣＡＲを発現するＴ細胞によって放出されたＩＦＮγの定量化の結果を示す。ＣＴＲは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞を示す。ＩＦＮγは、サイトカイン類を含まない完全培地２ｍＬ中、２４ウェルプレートに１０６個／ウェルの細胞を播いてから２４時間後に採集した上清中で測定される。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５、＊Ｐ＝０．０１５４ ７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８対４－１ＢＢ；＊Ｐ＝０．１９４ ７６３．７４（Ａ）対（Ｂ）４－１ＢＢ、対応のないｔ検定として表されている。 図２Ｄは、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）またはｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のいずれか、およびＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかを使用してＣＡＲが得られる場合の、ＧＦＰタグＣＡＲを発現するＴ細胞におけるＧＦＰ凝集を示す代表的な共焦点顕微鏡画像を表す。示されているのは、単視野の代表的な細胞である（倍率６３×）。 図３は、ｓｃＦｖを不安定化させるｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）のＦＷＲにおけるアミノ酸置換を表す。図３Ａは、示されたＦＷＲ変異を用いた計算機モデリングを通じて生成されたｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の構造の立体配座のリボンプロットを表す。 図３Ｂは、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の安定性に及ぼす影響について評価された選択アミノ酸変異を表す。ΔΔＧｍｕｔ＞０を有するｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）構造への変異は不安定化しており、続いてＴ細胞におけるＣＡＲフォーマットでのｓｃＦｖの自発的凝集に影響を及ぼす。 図３Ｃは、Ｖ１２３（配列番号２５６から２７４）における変異の計算されたΔΔＧを表す。 図３Ｄは、Ｅ１２７（配列番号２７５から２９５）における変異の計算されたΔΔＧを表す。 図４は、悪性黒色腫腫瘍モデルにおける腫瘍排除を媒介するＣＤ２８を有する７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞の効果の結果を表す。図４Ａは、代表的なフロープロット（Ａ）を表し、 図４Ｂは、対照Ｔ細胞（ＣＴＲ）、およびＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞を、悪性黒色腫細胞株（Ｅ：Ｔ＝１：５）と５日間共培養する実験の残存腫瘍細胞の定量化のまとめを表す。細胞は収集して、ＣＤ３およびＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーによってＴ細胞および悪性黒色腫細胞をそれぞれ特定する。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝６、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ補正による二元配置分散分析として表されている。 図４Ｃは、悪性黒色腫異種移植モデルの実験スキーマを表す。ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５（５×１０５個の細胞）を亜急性注射（ｓ．ｃ．）し、７日後にマウスに、対照Ｔ細胞（ＣＴＲ）、またはＣＤ２８もしくは４－１ＢＢ細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞を、静脈内注射（ｉ．ｖ．）する（５×１０６個の細胞）。 図４Ｄは、スキーム（Ｃ）に従って処置されたマウスにおける代表的な腫瘍生物発光（ＢＬＩ）（スケール：最小＝５×１０６；最大＝５×１０８）を表す。 図４Ｅは、（Ｄ）において生着を受けたマウスにおける腫瘍体積の代表的なグラフを表す。点線は、個々のマウスを表し、太い実線は、群の平均を表す。四つの独立した実験のまとめ（各条件についてｎ＝１２）、＊＊＊Ｐ＝０．０００１２；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ補正による二元配置分散分析。 図５は、ＣＤ２８を有する７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを発現するＴ細胞の膠芽腫腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性の結果を表す。図５Ａは、膠芽腫（ＧＢＭ）異種移植モデルの実験スキーマを表す。ＧＢＭ－ＮＳ（１×１０５個の細胞）を尾状核に注射（ｉ．ｃ．）し、１５日後にマウスに対照Ｔ細胞（ＣＴＲ）、またはＣＤ２８もしくは４－１ＢＢ細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞を腫瘍内に注射する（２×１０６個の細胞）。腫瘍の成長は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で監視する。 図５Ｂから図５Ｆは、造影剤注入によるＴ１強調画像（Ｔ１－ｗｉ）、およびＴ２強調画像（Ｔ２－ｗｉ）を用いて実行した代表的なＭＲＩを表し、（Ａ）のとおりに処置されたマウスにおける腫瘍の進行および浸潤のパターンを示している。 図５Ｇは、（Ａ）のとおりに処置されたマウスのカプラン－マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）生存曲線を示す。ＣＴＲ、７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８、７６３．７４（Ｂ）４－１ＢＢについてのｎ＝７マウス／群。７６３．７４（Ｂ）ＣＤ２８、７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢについてのｎ＝１５マウス／群。全生存統計分析は、マンテル－コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）法によるログランク検定（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）を使用して実行する。 図５Ｈは、Ｔ細胞の腫瘍内送達後の示された時点における、腫瘍から単離されたＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現の代表的な経時変化を示す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝２として表されている。 図６は、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達および抗腫瘍活性に対するｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）のＦＷＲのヒト化の効果の結果を表す。図６Ａは、培養８日目に評価した、ＣＤ２８（（ｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８およびｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８））をコードする、ｈ７６３．７４（＃２）（配列番号１１１）およびｈ７６３．７４（＃５）（配列番号１１４）のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞におけるＣＡＲ発現を示す代表的なフローサイトメトリーのプロットを表す。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞は、陰性対照として示されている。 図６Ｂは、サイトカイン類を含まない培地２ｍＬ中、５×１０５個／ウェルの細胞を播いた後、２４時間静置させた、対照（ＣＴＲ）、ｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８、およびｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲ－Ｔ細胞の収集した上清中でのＩＦＮγの代表的な定量化結果を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝６として表されている。 図６Ｃは、対照（ＣＴＲ）、またはｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８もしくはｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞を、悪性黒色腫細胞株（Ｅ：Ｔ＝１：５）とともに５日間播いた共培養実験の代表的なフロープロットを表す。細胞を収集し、ＣＤ３およびＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）ｍＡｂで染色して、フローサイトメトリーによってＴ細胞および悪性黒色腫細胞をそれぞれ特定する。 図６Ｄは、悪性黒色腫異種移植モデルの実験スキーマを表す。ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５（５×１０５個の細胞）を亜急性注射（ｓ．ｃ．）し、７日後にマウスに対照Ｔ細胞（ＣＴＲ）、または７６３．７４（Ｂ）ＣＤ２８のＣＡＲ、もしくはｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８もしくはｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞を静脈内注射（ｉ．ｖ．）する（５×１０６個の細胞）。 図６は、スキーム（Ｄ）に従って処置されたマウスの腫瘍ＢＬＩ動態を表す。点線は個々のマウスを表し、太い実線は群の平均を表す。二つの独立した実験のまとめ（各群についてｎ＝１０）。 図６Ｆは、（Ｄ）のとおりに処置したｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５腫瘍保有マウスの安楽死時の、末梢血、肝臓、および脾臓におけるヒトＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の定量化の結果を表す。データは平均±ＳＤ、ｎ＝６として表されている。 Ｇ．（Ｄ）のとおりに処置したｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５腫瘍保有マウスの安楽死時の、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞上でゲーティングした末梢血中のＣＡＲ－Ｔ細胞の百分率。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝６として表されている。 図７は、７６３．７４抗体由来のｓｃＦｖを用いて生成されたＣＡＲのＴ細胞における発現のコンストラクトおよび特性評価を表す。図７Ａは、７６３．７４（Ａ）ＣＡＲコンストラクトの図を表す。 図７Ｂは、培養８日目に評価した７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８ζＹ６Ｆまたは７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢζＹ６ＦのＣＡＲを用いて操作したＴ細胞におけるＣＡＲ発現の代表的なフロープロットとまとめを表す。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝４として表されている。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞は、陰性対照として示されている。 図８は、本開示に準拠するｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）または７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを発現するＴ細胞の特性評価結果を表す。図７Ａは、培養８日目に評価した、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＴＲ）、およびＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを用いて操作したＴ細胞におけるＣＡＲ発現のまとめを表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝８として表されている。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞は、陰性対照として示されている。 図８Ｂは、（Ａ）に示される培養の６日目および１０日目におけるＣＴＲ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の総細胞数を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝４として表されている。 図８Ｃは、ＧＦＰタグ７６３．７４（Ａ）ＣＤ２８、７６３．７４（Ａ）４－１ＢＢ、７６３．７４（Ｂ）ＣＤ２８、および７６３．７４（Ｂ）４－１ＢＢのＣＡＲを発現するＴ細胞の細胞表面上のＣＡＲ分子の分布を示す代表的な細胞の顕微鏡画像を表す。示されているのは、共焦点顕微鏡を介して撮影された単視野の代表的な画像である（倍率、６３×）。 図８Ｄは、抗イディオタイプ抗体により媒介されたＣＡＲの架橋後の、（Ｃ）と同じくＴ細胞の細胞表面上のＧＦＰタグＣＡＲ分子の分布を表す。示されているのは、共焦点顕微鏡を介して撮影された単視野の代表的な画像である（倍率、６３×）。 図８Ｅは、フローサイトメトリーにより評価した、培養１０日目の（Ａ）に示されたＣＴＲ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞サブセット組成を示すグラフを表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝４として表されている。 図８Ｆは、フローサイトメトリーにより評価した、培養１０日目の（Ａ）に示されたＣＴＲ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞における消耗関連マーカーの発現を表す代表的なグラフである。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝４として表されている。 図９は、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の安定性に及ぼす影響についてのアミノ酸変異の評価結果を表す。図９Ａは、７６３．７４（Ａ）Ｖ軽鎖の３位での変異（３位での配列番号１５９から１８３１）の自由エネルギーの変化（ΔΔＧ）を表す。Ｂ．Ｔ５（配列番号１８４から２０２）での変異のΔΔＧ。Ｃ．Ａ９（配列番号２０３から２２１）での変異のΔΔＧ。Ｄ．Ｅ８３（配列番号２３２から２４９）での変異のΔΔＧ。 Ｅ．Ｑ１２４（配列番号２５６から２７４）での変異のΔΔＧ。Ｆ．Ｖ１２６（配列番号３１５から３３３）での変異のΔΔＧ。Ｇ．Ｌ２３０（配列番号２７６から２９５）での変異のΔΔＧ。 図１０は、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを発現するＴ細胞の抗腫瘍活性の代表的な結果を表す。図１０Ａは、フローサイトメトリーによって評価した悪性黒色腫細胞株におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）抗原の発現を表す。点線および実線は、それぞれアイソタイプおよびＣＳＰＧ４ ｍＡｂを表す。 図１０Ｂは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＴＲ）、およびＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲで操作したＴ細胞と、悪性黒色腫細胞株（Ｅ：Ｔ＝１：５）との２４時間の共培養後に収集した上清中でのＩＦＮγおよびＩＬ－２の産生量の定量化の代表的な結果を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５として表されている。 図１０Ｃは、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５腫瘍細胞（５×１０５個／マウス）の細胞をｓ．ｃ．により生着させ、７日後にＣＴＲ、またはＣＤ２８もしくは４－１ＢＢ細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いて処置したマウスの腫瘍ＢＬＩ動態の代表的な結果を表す（５×１０６個／マウスの細胞）。点線は個々のマウスを表し、太い実線は群の平均を表す。四つの独立した実験のまとめ（各条件についてｎ＝１２）、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニの補正による二元配置分散分析。 図１１は、ＣＤ２８をコードする７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞が、最も早い時点でＧＢＭ－ＮＳの大部分を排除することを示す代表的な結果を表す。図１１Ａは、対照（ＣＴＲ）、およびＣＤ２８または４－１ＢＢの細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）およびｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）のＣＡＲを発現する細胞を、ＧＢＭ－ＮＳと共培養（Ｅ：Ｔ＝１：５）する代表的な実験における、異なる時点（２、４、６、および２４時間）での腫瘍細胞の定量化結果のまとめである。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５として表されている。 図１１Ｂは、ＧＢＭ－ＮＳとの共培養における２時間後のＣＡＲ－Ｔ細胞の代表的なＦＳＣ－ＳＳＣドットプロットを表す。ＣＡＲ－Ｔ細胞および腫瘍細胞はそれぞれ、ＣＤ４５およびＣＳＰＧ４発現細胞の百分率を評価することによって測定される。 図１１Ｃは、ＧＢＭ－ＮＳと共培養したＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現の代表的なフローサイトメトリーの積み上げヒストグラムのグラフを表す。 図１２は、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）のヒト化工程、および変異体の試験を表す。図１２Ａは、ＳｃＦｖのヒト化および操作のワークフローを表す。 図１２Ｂは、フローサイトメトリーによって分析されたヒト化ｓｃＦｖ ｈ７６３．７４（＃２）、ｈ７６３．７４（＃３）、ｈ７６３．７４（＃４）、ｈ７６３．７４（＃５）の代表的な結合結果を表す。ＣＳＰＧ４＋ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＣＳＰＧ４－ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８を、ｓｃＦｖ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、その後、タンパク質－Ｌ－ビオチン（０．３μｇ／ｍｌ）、およびフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（ＳＡＶ－ＰＥ）で染色する。 図１２Ｃは、培養８日目に評価した、ＣＴＲ Ｔ細胞および異なるｈ７６３．７４ ＣＡＲを使用して生成したＴ細胞におけるＣＡＲ発現のまとめを表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３として表されている。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞は、陰性対照として示されている。 図１２Ｄは、対照（ＣＴＲ）または異なるタイプのｈ７６３．７４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＷＭ１５５悪性黒色腫細胞株と５日間共培養（Ｅ：Ｔ＝１：５）した実験の残存腫瘍細胞の定量化結果のまとめを表す。データは平均±ＳＤ、ｎ＝３として表されている。次いで細胞を収集し、ＣＤ３およびＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーによりＴ細胞および悪性黒色腫細胞をそれぞれ特定する。 図１２Ｅは、（Ｄ）に例示した、２４時間の共培養（Ｅ：Ｔ＝１：５）の後に収集した上清中でのＩＦＮγおよびＩＬ－２の産生の定量化結果を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５として表されている。 図１３は、ヒト化ｓｃＦｖのアミノ酸配列、および代表的な安定性分析結果を示す。図１３Ａは、ヒト化ｓｃＦｖｓ ｈ７６３．７４（＃２）（配列番号３７）および ｈ７６３．７４（＃５）（配列番号５７）のＶＬ（配列番号６９および７２）およびＶＨ（配列番号７２および１１４）鎖の配列を表す。アミノ酸置換（ヒトからマウス）は、ボックスで囲んである。 図１３Ｂは、ヒト化ｓｃＦｖの物理的安定性の代表的な結果を表す。ｈ７６３．７４（＃２）およびｈ７６３．７４（＃５）タンパク質は、ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌに製剤化し、４℃および３７℃で２日間保存する。単量体の百分率は、分析用ＨＰＬＣにより分析する。 図１４は、ヒト化ｓｃＦｖ ７６３．７４に基づくＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞の抗腫瘍活性の代表的な結果を表す。図１４Ａは、培養８日目に評価した、対照Ｔ細胞（ＣＴＲ）、ならびにｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８およびｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲを使用して生成したＴ細胞におけるＣＡＲ発現のまとめを表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝１０として表されている。図１４Ｂは、ＣＴＲ、ｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８、およびｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲ－Ｔ細胞を、悪性黒色腫細胞株と５日間共培養（Ｅ：Ｔ＝１：５）した実験における残存腫瘍細胞の定量化のまとめを示す図である。データは平均±ＳＤ、ｎ＝４／６として表されている。細胞を収集し、ＣＤ３およびＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーによってＴ細胞および悪性黒色腫細胞をそれぞれ特定する。 図１４Ｃは、（Ｂ）に例示した２４時間の共培養（Ｅ：Ｔ＝１：５）の後に収集した上清中でのＩＦＮγおよびＩＬ－２産生の定量化の代表的な結果を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５として表されている。 図１４Ｄは、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５腫瘍細胞（５×１０５個／マウス）の細胞をｓ．ｃ．生着させ、７日後に、対照ＣＡＲＴ細胞（ＣＴＲ）、およびｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８またはｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲを発現するＴ細胞（５×１０６個／マウス）細胞を用いて処置したマウスの腫瘍ＢＬＩ（カラースケール：最小＝５×１０６；最大＝５×１０８）の代表的な結果を表す。 図１４Ｅは、ＣＴＲ、ｈ７６３．７４（＃２）ＣＤ２８またはｈ７６３．７４（＃５）ＣＤ２８のＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて処置したＷＭ１１５腫瘍保有マウスにおける、異なる時点で収集した末梢血中のヒトＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞の代表的な定量化結果を表す（１３日目：ｎ＝１５、２５、３１、および４３日目：ｎ＝５）。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５として表されている。 図１４Ｆは、代表的な実験の（Ｅ）と同じく異なる時点で収集した末梢血中の、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞上でゲーティングしたＰＤ－１＋細胞の百分率を表す（１３日目：ｎ＝１５、２５、３１、および４３日目：ｎ＝５）。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝５として表されている。 図１４Ｇは、代表的な実験の（Ｅ）と同じく、安楽死時の末梢血、肝臓、および脾臓における、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞上でゲーティングしたＰＤ－１＋細胞の百分率を表す。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝６～１０として表されている。
もともと定義されているＣＡＲ緊張性シグナル伝達は、Ｔ細胞においては負の効果に帰され、詳細には、急速な消耗に起因して、その生じる抗腫瘍効果は貧弱である。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を見られたい。我々のインビトロおよびインビボのデータは、この考えを支持している。驚くべきことに、我々の異種移植モデルにおいて、ｓｃＦｖの安定性の補正およびＣＡＲ緊張性シグナル伝達の抑制は、速やかな抗腫瘍効果を示すＣＤ２８細胞内領域をコードするＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を著しく増強させた。この観察結果は、４－１ＢＢが遅い抗腫瘍効果を示すことを示唆する以前の成果と一致しており、この遅い抗腫瘍効果は、４－１ＢＢがＣＡＲシナプスにホスファターゼ複合体を補充することによってＣＡＲ－ＣＤ３γシグナル伝達を減弱させるという我々の最近の発見と機構的に関連づけることができるものである。Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８：４１５－４２８（２０１５）；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，“ＴＨＥＭＩＳ－ＳＨＰ１ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｂｙ ４－１ＢＢ Ｔｕｎｅｓ ＬＣＫ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．３７（２）：２１６－２２５（２０２０）（“Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０２０”）を見られたい。さらに我々は、ｓｃＦｖの自己凝集に起因するＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮγの自発放出と判断される緊張性シグナル伝達が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の自発的増殖とははっきり異なる現象として見なすのが望ましいと提案したい。Ｆｒｉｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：３５６－３６７（２０１５）を見られたい。後者はむしろ、特に末梢血中の腫瘍細胞が大量に手に入らない固形腫瘍の患者において、即時の抗原刺激の非存在下でも持続する場合があるという、ＣＡＲ－Ｔ細胞の正の属性である場合がある。４－１ＢＢをコードするＣＡＲ－Ｔ細胞の自発的な増殖と生存率の向上は、近接したＣＡＲシグナル伝達に起因するものではなく、持続的なＮＦ－ΚＢ経路に起因するものかもしれず、この現象を完全に機構的に定義するためには、さらなる研究が必要である。Ｇｏｍｅｓ－Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｏｎｉｃ ４－１ＢＢ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｉｍｐｅｄｅｓ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｉｓ Ｖｅｃｔｏｒ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，”Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１：１７－２６（２０１７）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“４－１ＢＢ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ＴＲＡＦｓ，”ＪＣＩ．Ｉｎｓｉｇｈｔ．３（２０１８）；およびＰｈｉｌｉｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“４－１ＢＢ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．１３（２０２０）を見られたい。
ＣＡＲを遺伝的に移植したＴ細胞による炎症性サイトカイン類の活性化および放出として定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）緊張性シグナル伝達は、負の属性とみなされるが、これは、免疫細胞の消耗および貧弱な抗腫瘍効果につながるからである。不安定なマウスｓｃＦｖは自己凝集を引き起こし、マウス配列はヒト対象に免疫反応を誘発させ得る。今回我々は、ｓｃＦｖがＣＡＲフォーマットに組み立てられ、ＣＡＲがＴ細胞において発現する場合に、ｓｃＦｖの不安定性が緊張性シグナル伝達に非常に重要であることを実証した。さらに我々は、ｓｃＦｖのマウスＦＷＲ内の不安定性を生じるアミノ酸の置換またはＦＷＲのヒト化のいずれかによって、緊張性シグナル伝達を補正できることを証明した。緊張性シグナル伝達を補正することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果が増強される。
今回我々は、ＣＡＲに含まれるＣＤ３γ鎖を介して自己凝集とシグナル伝達を促進するモノクローナル抗体単鎖Ｆｖの本質的な不安定性により、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達が引き起こされることを報告する。この現象は、ＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激細胞内領域のいずれかをコードするＣＡＲに検出される。モノクローナル抗体単鎖Ｆｖの不安定性は、計算機モデリングによって特定することができるフレームワーク領域内の特定のアミノ酸によって引き起こされる。不安定性を引き起こすアミノ酸の置換、またはフレームワーク領域のヒト化は、抗原特異性の修飾を引き起こすことなくＣＡＲの緊張性シグナル伝達を補正し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強する。
今回我々は、不安定なｓｃＦｖが、Ｔ細胞におけるＣＡＲ緊張性シグナル伝達につながるＣＡＲ分子の自己凝集を引き起こすことを実証している。我々が生成したＣＳＰＧ４特異的ＣＡＲは、７６３．７４ ｍＡｂからのマウスｓｃＦｖを使用する。大腸菌中で発現させたこのｓｃＦｖは凝集傾向を示し、ｓｃＦｖは可溶性の形態では産生不可能であった。
今回我々は、ｓｃＦｖを安定化させるＦＷＲ内のモデリング駆動の特異的アミノ酸置換によってＣＡＲ緊張性シグナル伝達が抑制されることから、ｓｃＦｖの不安定性が、専らＣＡＲの自己凝集および緊張性シグナル伝達の原因であることを示している。以下に提示される結果は、構造的および機能的分析を通じて、ｓｃＦｖの不安定性がＣＡＲの自己凝集と緊張性シグナル伝達を引き起こすことを実証したものである。ＦＷＲのアミノ酸置換またはヒト化は、緊張性シグナル伝達を抑制し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性を増強する。
計算機による変異誘発の使用では、エリス（Ｅｒｉｓ）ツールによって、ｓｃＦｖ７６３．７４（Ａ）の構造に及ぼすＦＷＲ変異の効果を明らかにすることが容易になった。計算機モデリングによって、ＦＷＲ内のアミノ酸置換がｓｃＦｖの安定性にどのように影響するかが実証され、計算機解析を実施して、ｓｃＦｖの特異性に影響を与えることなくその安定性を評価し補正できることが示されている。最後に我々は、マウスＦＷＲをフレームワークｒＦＷ１．４などの安定なヒトＦＷＲで置換することによっても、抗原特異性を修飾することなくＣＡＲ緊張性シグナル伝達を補正できることを実証している。Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：９０５４－９０６６（２０１０）を見られたい。安定なヒトフレームワークｒＦＷ１．４は、由来の異なるＣＤＲを収容することができ、その物理化学的安定性を評価する可溶性ｓｃＦｖタンパク質の分析が可能になる。よって、この手法は、ＣＡＲを設計するための最適な物理的特性や結合特性を有するｓｃＦｖを選択するのに使用することができる。これらのデータを総合すると、安定な単量体ｓｃＦｖは、抗原に依存しない緊張性シグナル伝達を回避するＣＡＲの生成に適用可能であることが示唆される。またヒトフレームワークｒＦＷ１．４を用いて設計されたＳｃＦｖは、免疫原性の可能性が低く、最大限の有効性をともなって患者に繰り返し注入できる可能性がある。
我々のデータは、唯一の違いが共刺激細胞内領域の細胞質内尾部によって表されるＣＡＲを使用して、ＣＤ２８および４－１ＢＢの両方が緊張性シグナル伝達を引き起こしたことを示している。
重要なことには、ｓｃＦｖの安定化は、ＣＡＲ内で使用される共刺激に関係なく緊張性シグナル伝達を抑制したが、これは、不安定なｓｃＦｖが、ＦＷＲの変異またはヒト化のいずれかによって救済され得ること、およびＣＤ２８と４－１ＢＢの両方の共刺激を使用できることを示している。
今回我々は、ＦＷＲへのアミノ酸置換が、ｓｃＦｖを安定化させＣＡＲの緊張性シグナル伝達を補正することができることを示している。加えて、マウスＦＷＲを安定なヒトＦＷＲに置換することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原非依存性活性化も防止できることを示している。よって、我々は、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達の原因を、ＣＡＲコンストラクト形成に使用される不安定なｓｃＦｖに限局しており、緊張性シグナル伝達を構造に基づいて補正する戦略を提供する。
全体として、我々は、ＣＡＲの緊張性シグナル伝達が、不安定なｓｃＦｖの自己凝集に起因するものであること、そしてアミノ酸置換またはヒト化によって得られるｓｃＦｖのＦＷＲの安定化によってそれを抑制できることを実証している。ｓｃＦｖの安定性を補正し、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達を排除することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強することができる。
本開示は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１４６４（ヒト）および１２１０２１（マウス））を有する結合メンバーを規定しこれを含む。
本明細書で使用されるとおり、結合メンバーは通常、抗体ＶＨおよびＶＬ領域を含んでなる。特定の結合メンバーのＶＨ領域もまた、本発明における使用に提供される。ＶＨおよびＶＬ領域の各内部には、相補性決定領域、（それぞれ「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ」、および「ＬＣＤＲ」）、およびフレームワーク領域、（それぞれ「ＦＲ」、「ＶＨ－ＦＲ」、および「ＶＬ－ＦＲ」）がある。ＶＨ領域はＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３を含んでなり、ＶＬ領域はＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３を含んでなる。抗体分子は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワーク配列ＶＨ－ＦＲ１からＶＨ－ＦＲ４を含んでなる抗体ＶＨ領域を含んでなる場合がある。これはまた、ＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワーク配列ＶＬ－ＦＲ１からＶＬ－ＦＲ４を含んでなる抗体ＶＬ領域を、かわりにまたはともに含んでなる場合がある。本明細書に開示される全てのＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、およびＨＣＤＲのセット、およびＬＣＤＲのセットは、特定の結合メンバーの実施形態を表している。本明細書に記載されるとおり、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。よって、ＨＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。本明細書で使用されるとおり、フレームワーク配列は、マウス、ヒト、ウサギ、およびラットを含むがこれらには限定されないいずれかの供給源から得ることができる。複数の態様では、フレームワーク配列は、２つの種からの配列を含んでなるように修飾される。複数の態様では、フレームワーク配列は、安定性を高めるためにマウス残基を導入する一つまたは複数の修飾を有する修飾されたヒトフレームワーク配列である。そのような修飾されたヒト化フレームワークは、マウスとヒトの両方の細胞において同一コンストラクトの使用を可能にする。
本明細書で使用されるとおり、結合メンバーは、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列、および配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲｓ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列を含んでなる。
本開示は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する、そしてフレームワーク配列を含んでなる結合メンバーを規定しこれを含む。複数の態様では、軽鎖フレームワーク配列（「ＶＬ－ＦＲ」）は、配列番号１５３から２５５からなる群から選択され、ここで軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）は、配列番号１５３から２２１からなる群から選択され、軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）は、配列番号２２２から２２５からなる群から選択され、軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）は、配列番号２２６から２４９からなる群から選択され、軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）は、配列番号２５０から２５５から成る群から選択される。複数の態様では、重鎖フレームワーク配列（「ＶＨ－ＦＲ」）は、配列番号２５６から３８２からなる群から選択され、重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）は、配列番号２５６から３４９からなる群から選択され、重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）は、配列番号３５０から３５３からなる群から選択され、重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）は、配列番号３５４から３６０からなる群から選択され、そして重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）は、配列番号３６１から３８２からなる群から選択される。
本開示は、ＣＳＰＧ４に対する結合特異性を有する結合メンバーであって、軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）が、配列番号１５３から１５８からなる群から選択され、軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）が、配列番号２２２から２２５からなる群から選択され、軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）が、配列番号２２６から２３１からなる群から選択され、軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）が、配列番号２５０から２５５からなる群から選択され、重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）が、配列番号３４７から３４９からなる群から選択され、重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）が、配列番号３５０から３５３からなる群から選択され、重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）が、配列番号３５４から３６０からなる群から選択され、そして重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）が、配列番号３６１から３６２からなる群から選択される結合メンバーを規定しこれを含む。複数の態様では、可変軽鎖配列は、配列番号６９から７２からなる群から選択され、可変重鎖配列は、配列番号１１１から１１４からなる群から選択される。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号６９であり、可変重鎖配列は配列番号１１１である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７０であり、可変重鎖配列は配列番号１１２である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７１であり、可変重鎖配列は配列番号１１３である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７１であり、可変重鎖配列は配列番号１１４である。
本開示は、ＣＳＰＧ４に対する結合特異性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、可変軽鎖配列が、配列番号６７から１０９からなる群から選択され、可変重鎖配列が、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される核酸配列を規定しこれを含む。複数の態様では、可変軽鎖配列は、配列番号６９から７２からなる群から選択され、可変重鎖配列は、配列番号１１１から１１４からなる群から選択される。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号６９であり、可変重鎖配列は配列番号１１１である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７０であり、可変重鎖配列は配列番号１１２である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７１であり、可変重鎖配列は配列番号１１３である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７１であり、可変重鎖配列は配列番号１１４である。
複数の態様では、核酸配列は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、を含んでなるポリペプチドをコードする。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号６９である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号７０である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７１である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７２である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号７３である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７４である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７６である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号７７である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７８である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号７９である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号８０である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号８３である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号９６である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号９７である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号１０２である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号１０３である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号１０４である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号１０５である。一態様では、可変軽鎖配列は配列番号１０６である。別の態様では、可変軽鎖配列は配列番号１０７である。複数の態様では、可変軽鎖配列をコードする核酸配列は、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される重鎖配列をコードする核酸配列と組み合わせることができる。
複数の態様では、核酸配列は、配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる重鎖配列、を含んでなるポリペプチドをコードする。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１１１である。別の態様では、可変重鎖配列は配列番号１１２である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１１３である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１１４である。別の態様では、可変重鎖配列は配列番号１１５である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１１６である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１１７である。別の態様では、可変重鎖配列は配列番号１１８である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１１９である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１２０である。別の態様では、可変重鎖配列は配列番号１２１である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１２２である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１２３である。別の態様では、可変重鎖配列は配列番号１３５である。一態様では、可変重鎖配列は、配列番号１３６である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１３７である。別の態様では、可変重鎖配列は配列番号１３８である。一態様では、可変重鎖配列は配列番号１４５である。複数の態様では、可変重鎖配列をコードする核酸配列は、配列番号６７から１０９からなる群から選択される軽鎖配列をコードする核酸配列と組み合わせることができる。
本開示は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）およびＣＡＲのための発現コンストラクトを規定しこれを含む。本明細書で提供されるとおり、ＣＤＲ領域は、上記の通りである。
本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞上に発現するように、そして抗原と特異的に結合するように操作された人工Ｔ細胞受容体を指す。複数の態様では、ＣＡＲは、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域を含んでなる。複数の態様では、追加の「スペーサー」または「ヒンジ領域」が、ＣＡＲに含まれる。特定の態様では、ＣＡＲは、細胞内領域を伴わずに細胞外領域および膜貫通領域を含んでなり得るが、本出願のさらに多くのＣＡＲは、細胞内領域を含み、細胞内シグナル伝達を規定する。
本明細書で使用されるとおり、用語「細胞外領域」は、ＣＡＲの細胞外部分を指し、シグナルペプチド、抗原認識領域（例えば、結合メンバー）、および抗原認識領域を膜貫通領域に連結するスペーサーまたはヒンジ領域を包含する。シグナルペプチドは、発現すると、典型的には内因性の細胞経路を使用して除去される場合がある。
本明細書で使用されるとおり、「抗原認識領域」は概して、特定のがん抗原に特異的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含んでなる。いくつかの態様では、同一細胞内に二つ以上のＣＡＲが存在する場合、第２のＣＡＲは、別の特定の抗原に特異的なｓｃＦｖを含んでなる場合がある。
本明細書で使用されるとおり、用語「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、共有結合してＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを形成する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）は直接結合するか、ペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５アミノ酸）によって結合し、このリンカーは、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端、またはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端を接続する。リンカーは通常、柔軟性に適したグリシンを多く含むとともに、溶解性に適したセリンまたはスレオニンを多く含む。好適な、しかし非限定的な例が、配列番号１１である。ｓｃＦｖタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎら（Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３，１９８８）による記載のとおり、ＶＨ－およびＶＬ－コード配列を含む核酸から発現させることができる。また、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号、および同第２００５０１９６７５４号を見られたい。好適なＶＨおよびＶＬ－コード配列は、上で特定されている。
本明細書で使用されるとおり、「スペーサー」または「ヒンジ領域」はさらに、膜貫通領域と抗体認識領域との間の短いペプチド断片である組換えタンパク質の随意のリンカー部分である。スペーサーまたはヒンジ領域は、１から２０個の間のアミノ酸とすることができる。細胞外領域の場合のヒンジ領域の例には、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧ１からのヒンジ領域、およびＣＤ３の部分などが挙げられる。
本明細書で使用されるとおり、「膜貫通領域」は、タンパク質が発現する場合に、少なくとも一回は二重層を横断する、主に非極性アミノ酸残基の領域である。概して膜貫通領域は、１８から２１個のアミノ酸残基によってコードされ、αヘリックス立体配置をとっている。本明細書で使用されるとおり、膜貫通領域は、当技術分野で公知のいずれの種類であってもよい。複数の態様では、膜貫通領域は、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０，１２４８７）、ＣＤ３－ζ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９；１２５０３ ＣＤ２４７）、ＣＤ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２０、１２５０４）、ＣＤ８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２４、１２５２５）、ＣＤ１６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２１４；１４１３１；Ｆｃｇｒ３）、ＮＫｐ４４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３６、ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３７、１７０８６、ＮＣＲ１）、およびＮＫＧ２ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９１４；２７００７ ＫＬＲＫ１）からなる群から選択される。複数の態様では、膜貫通領域は、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０、１２４８７）膜貫通領域である。
本明細書で使用されるとおり、用語「細胞内領域」は、細胞内のシグナル伝達を規定するＣＡＲの細胞内領域を指す。概して、細胞内領域は、刺激領域および随意に共刺激領域の二つ部分にさらに分割することができる。複数の態様では、細胞内領域配列は、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば、４－１ＢＢ、またはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ １０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）からなる群から選択される。最も広く使用される細胞内領域成分はＣＤ３－ゼータであり、これは、三つのＩＴＡＭを含有しており、抗原が結合した後、ＮＫＴ細胞に活性化シグナルを伝達するものである。別の広く使用される細胞内領域は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば４－１ＢＢまたはＣＤ１３７）細胞内領域である。他の適切な刺激領域は、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（遺伝子ＩＤ ３６０４、例えば４－１ＢＢ、またはＣＤ１３７）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、遺伝子ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、遺伝子ＩＤ １０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、遺伝子ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）から得ることができる。
本開示は、細胞外領域、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含む、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）およびそれから生成されるＣＡＲタンパク質をコードする核酸発現コンストラクトを規定しこれを含む。複数の態様では、細胞外領域可変軽鎖配列は、配列番号１～３に記載されるＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列、および配列番号４から６に記載されるＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３を含んでなる。本明細書で提供されるとおり、細胞外領域は、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）を含んでなる。本明細書で提供されるとおり、細胞外領域は、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）を含んでなる。本開示のＣＡＲは、配列番号６７から１０９からなる群から選択される可変軽鎖配列、および配列番号１１０から１５２からなる群から選択される可変重鎖配列を含む。複数の態様では、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖポリペプチド配列を含んでなる。複数の態様では、細胞外領域は、配列番号２８のｓｃＦｖポリペプチド配列を含んでなる。一態様では、細胞外領域は、配列番号３４のｓｃＦｖポリペプチド配列を含んでなる。一態様では、細胞外領域は、配列番号４６のｓｃＦｖポリペプチド配列を含んでなる。一態様では、細胞外領域は、配列番号４７のｓｃＦｖポリペプチド配列を含んでなる。一態様では、細胞外領域は、配列番号５７のｓｃＦｖポリペプチド配列を含んでなる。
細胞外領域、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）、およびそれから産生されるＣＡＲタンパク質をコードする核酸発現コンストラクトは、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０、１２４８７）、ＣＤ３－ζ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９；１２５０３ ＣＤ２４７）、ＣＤ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２０、１２５０４）、ＣＤ８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２４、１２５２５）、ＣＤ１６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２１４；１４１３１；Ｆｃｇｒ３）、ＮＫｐ４４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３６、ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３７、１７０８６、ＮＣＲ１）、およびＮＫＧ２ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９１４；２７００７ ＫＬＲＫ１）からなる群から選択される膜貫通領域を含んでなる。一態様では、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。細胞外領域および膜貫通領域は、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３６０４、例えば４－１ＢＢまたはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ：５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、遺伝子ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）からなる群から選択される細胞内領域配列のいずれか一つと組み合わせてもよい。
細胞外領域、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）、およびそれから産生されるＣＡＲタンパク質をコードする核酸発現コンストラクトは、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３６０４、例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ：５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５：ＤＡＰ１２）からなる群から選択される細胞内領域を含んでなる。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、２Ｂ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ））２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ｃｉｓ ａｃｔｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＨＹＳＥＬ））配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ３－ζ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域はＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域はＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域はＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ１６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４４膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫｐ４６膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
一態様では、細胞内領域は、ＣＤ ２８細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ２４７細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＣＤ４細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＩＬ－２１細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。一態様では、細胞内領域は、ＨＣＳＴ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、細胞内領域は、ＴＹＲＯＢＰ細胞内領域であり、膜貫通領域は、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域であり、細胞外領域は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される。複数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸発現コンストラクトは、成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列、またはそれらの両方をさらにコードし、この場合、それぞれは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によってＣＡＲコード配列から分離されている。
本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子のタンパク質コード配列をさらに含んでなる、上に提供されたとおりのキメラ抗原受容体をコードする核酸発現コンストラクトを規定しこれを含む。また、規定され含まれるのは、ＣＡＲと、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質配列と、最高三つの追加のタンパク質コード配列とを含んでなるポリタンパク質をコードする発現コンストラクトである。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質配列および最高三つの追加のタンパク質コード配列は、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されている。複数の態様では、自律的リボソーム内自己プロセシングは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列または関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）である。複数の態様では、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子は、リンパ球エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１１７６）、ベータ－カテニン（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ：１４９９）、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（ａｌｔ．ＴＣＦ１））、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（ａｌｔ．ＴＣＦ１））、およびＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ １、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８））からなる群から選択される。
一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ 配列からなる群から選択される細胞外領域、ＣＤ２８、ＣＤ３－ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２ｄからなる群から選択される膜貫通領域、ならびにＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３－ζ、２Ｂ４、インターロイキン２１、ＨＣＳＴ、およびＴＹＲＯＢＰからなる群から選択される細胞内領域を含んでなり、さらには、リンパ球エンハンサー結合因子１、ベータ－カテニン、Ｓｍａｄ３、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ、転写因子７、およびＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサーからなる群から選択されるＷｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなり、この場合、ＬＥＦ１は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、Ｎｋｐ４４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなる。
本開示は、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ配列から選択される細胞外領域、ＣＤ２８、ＣＤ３－ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２ｄからなる群から選択される膜貫通領域、ならびにＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３－ζ、２Ｂ４、インターロイキン２１、ＨＣＳＴ、およびＴＹＲＯＢＰからなる群から選択される細胞内領域を含んでなり、さらにはＷｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質コード配列をさらに含んでなり、そしてさらには、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列を含んでなる、上記の発現コンストラクトを規定しこれを含む。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなり、この場合、ＬＥＦ１は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１、ならびにＩＬ－１５からなる群から選択され、それぞれが、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されている。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。
一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、および自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されたＬＥＦ１を含んでなり、この場合、ＬＥＦ１は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１、ならびにＩＬ－２１からなる群から選択され、それぞれが、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されている。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－２１を含んでなる。
一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ２８細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１およびＩＬ－１５を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ３－ζ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＣＤ１６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４４膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫｐ４６膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。一態様では、発現コンストラクトは、配列番号２８から６６からなる群から選択されるｓｃＦｖ細胞外領域配列、ＮＫＧ２ｄ膜貫通領域、ＣＤ３－ζ細胞内領域、ならびに自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによってそれぞれ分離された、ＬＥＦ１、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を含んでなる。
また、本開示に含まれ規定されるのは、上に提供されるとおりのＣＡＲをコードする発現コンストラクトであって、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含んでなる発現コンストラクトであり、この場合、ｓｈＲＮＡ配列は、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場中に埋め込まれている。
本開示は、核酸発現コンストラクトについてそれぞれ上記された、配列番号２８から６５からなる群から選択される、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体を含みこれを規定する。一態様では、細胞外領域配列は、配列番号３４、４６、４７、および５７からなる群から選択される。別の態様では、細胞外領域配列は、配列番号３４を含んでなる。別の態様では、細胞外領域配列は、配列番号４６を含んでなる。別の態様では、細胞外領域配列は、配列番号４７を含んでなる。別の態様では、細胞外領域配列は、配列番号５７を含んでなる。細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域の好適な組み合わせが、上に詳述されている。一態様では、本開示は、ＣＤ２８膜貫通領域およびＣＤ２８細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ２８膜貫通領域およびＣＤ３－ζ細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ２８膜貫通領域および４－１ＢＢ細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域およびＣＤ２８細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域およびＣＤ３－ζ細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ３－ζ膜貫通領域および４－１ＢＢ細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ４膜貫通領域およびＣＤ２８細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ４膜貫通領域およびＣＤ３－ζ細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。一態様では、本開示は、ＣＤ４膜貫通領域および４－１ＢＢ細胞内領域との組み合わせで、配列番号２８から６５からなる群から選択される細胞外領域配列を規定する。
本明細書はさらに、上に定義された発現コンストラクトおよび核酸配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を規定しこれを含む。好ましくは、宿主細胞は、転写および翻訳されて一つまたは複数のタンパク質を発現する外因性核酸配列を導入するように遺伝子操作される。外因性核酸配列の導入は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含む当術分野で公知の方法を用いて実行することができる。一態様では、宿主細胞は、細菌である。他の態様では、宿主細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される免疫細胞である。一態様では、宿主細胞は、Ｔ細胞である。別の態様では、宿主細胞は、ＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、宿主細胞は、タイプＩのＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、宿主細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である。本明細書で提供されるとおり、宿主細胞は、宿主細胞の集団の一部である。
本明細書は、上記のとおり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする発現コンストラクトを含んでなる複数の遺伝子操作された免疫細胞を含んでなる細胞の集団を規定しこれを含む。発現コンストラクトの特定の組み合わせが、上記されており、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の態様では、細胞の集団は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含んでなる遺伝子操作された免疫細胞を含んでなる。一態様では、集団内の遺伝子操作された免疫細胞は、複数のＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞を含んでなる。一態様では、集団は、前記複数の細胞の少なくとも５０％を含んでなる複数のＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞を含んでなる。
本開示は、上で詳細に記載されるとおりのＣＡＲを発現するその発現コンストラクトを含んでなる免疫細胞を産生する工程を規定しこれを含む。本明細書で提供されるとおり、工程は、ドナーからＰＢＭＣを分離することと、ＰＢＭＣからナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を単離して、単離免疫細胞を準備することと、単離免疫細胞を１から２０日間増殖させ、内因性のＴ細胞受容体の刺激によって、および共刺激受容体、サイトカイン類、またはその両方の組み合わせによる共刺激によって、遺伝子操作用の増殖免疫細胞を準備することと、配列番号６１から１０９からなる群から選択される可変軽鎖と、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される可変重鎖と、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトを導入することと、を含んでなる。一態様では、遺伝子操作用の免疫細胞を準備するステップは、抗Ｔ細胞、抗ＮＫ細胞、または抗ＮＫＴマイクロビーズを用いてＰＢＭＣから免疫細胞を分離することを、さらに含んでなる。一態様では、刺激は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、またはそれらの組み合わせから選択される成長因子を用いて培養することを含んでなる。一態様では、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、ＮＫＴ細胞は、タイプＩのＮＫＴ細胞であり、分離されたＮＫＴ細胞を増殖させるステップは、少なくともａＧａｌＣｅｒ、および成長因子の存在下で少なくとも１日間、Ｉ ＮＫＴ細胞を培養して、遺伝子操作用のＮＫＴ細胞を準備することを含んでなる。
一態様では、単離免疫細胞を１から２０日間増殖させて遺伝子操作用の増殖免疫細胞を準備するための培養期間は、遺伝子操作用の遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を準備するための１から２日、１から３日、１から４日、１から５日、１から６日、１から７日、１から８日、１から９日、１から１０日、１から１１日、１から１２日、１から１３日、１から１４日、１から１５日、１から１６日、１から１７日、１から１８日、１から１９日、１から２０日、２から３日、２から４日、２から５日、２から６日、２から７日、２から８日、２から９日、２から１０日、２から１１日、２から１２日、２から１３日、２から１４日、２から１５日、２から１６日、２から１７日、２から１８日、２から１９日、２から２０日、３から４日、３から５日、３から６日、３から７日、３から８日、３から９日、３から１０日、３から１１日、３から１２日、３から１３日、３から１４日、３から１５日、３から１６日、３から１７日、３から１８日、３から１９日、３から２０日、４から５日、４から６、４から７、４から８、４から９、４から１０、４から１１、４から１２、４から１３日、４から１４日、４から１５日、４から１６日、４から１７日、４から１８日、４から１９日、４から２０日、５から６日、５から７日、５から８日、５から９日、５から１０日、５から１１日、５から１２日、５から１３日、５から１４日、５から１５日、５から１６日、５から１７日、５から１８日、５から１９日、５から２０日、６から７日、６から８日、６から９日、６から１０日、６から１１日、６から１２日、６から１３日、６から１４日、６から１５日、６から１６日、６から１７日、６から１８日、６から１９日、６から２０日、７から８日、７から９日、７から１０日、７から１１日、７から１２日、７から１３、７から１４、７から１５、７から１６、７から１７、７から１８、７から１９日、７から２０日、８から９日、８から１０日、８から１１日、８から１２日、８から１３日、８から１４日、８から１５日、８から１６日、８から１７日、８から１８日、８から１９日、８から２０日、９から１０日、９から１１日、９から１２日、９から１３日、９から１４日、９から１５日、９から１６日、９から１７日、９から１８日、９から１９日、９から２０日、１０から１１日、１０から１２日、１０から１３日、１０から１４日、１０から１５日、１０から１６日、１０から１７日、１０から１８日、１０から１９日、１０から２０日、１１から１２日、１１から１３日、１１から１４日、１１から１５日、１１から１６日、１１から１７日、１１から１８日、１１から１９日、１１から２０日、１２から１３日、１２から１４日、１２から１５日、１２から１６日、１２から１７日、１２から１８日、１２から１９日、１２から２０日、１３から１４日、１３から１５日、１３から１６日、１３から１７日、１３から１８日、１３から１９日、１３から２０日、１４から１５日、１４から１６日、１４から１７日、１４から１８日、１４から１９日、１４から２０日、１５から１６日、１５から１７日、１５から１８日、１５から１９日、１５から２０日、１６から１７日、１６から１８日、１６から１９日、１６から２０日、１７から１８日、１７から１９日、１７から２０日、１８から１９日、１８から２０日、または１９から２０日の間である。一態様では、ＣＡＲを発現するその発現コンストラクトを含んでなる免疫細胞を産生する工程で使用するための単離免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の態様では、単離免疫細胞は、ＮＫ細胞である。一態様では、単離免疫細胞は、タイプＩのＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、増殖免疫細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である。本明細書で提供されるとおり、免疫細胞を産生する工程は、タイプＩのＮＫＴ細胞である免疫細胞を単離することと、少なくともａＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で培養することによってタイプＩのＮＫＴ細胞を増殖させることと、を含む。上に提供されるとおり、発現コンストラクトは、外因性成長因子の発現をさらに含んでいてもよい。別の態様では、発現コンストラクトは、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子を含む。また、含まれ規定されるのは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列を追加することであり、この場合、ｓｈＲＮＡ配列は、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場に埋め込まれている。複数の態様では、タンパク質コード配列は、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によって分離され得る。
本開示は、個体におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）陽性細胞を阻害する方法であって、前記細胞を、治療有効量の遺伝子操作された免疫細胞と接触させるステップを含んでなり、前記免疫細胞が、膜貫通領域配列、細胞内領域配列、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでなり、前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、方法を規定しこれを含む。本明細書で使用されるとおり、個体におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）陽性細胞の阻害は、増殖の阻害、活性の阻害、またはその両方の組み合わせを含んでなる。
本開示による複数の態様では、個体におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）陽性細胞を阻害する方法は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である遺伝子操作された免疫細胞を含んでなる。一態様では、遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の態様では、遺伝子操作された免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。さらに別の態様では、ＮＫＴ細胞は、タイプＩのＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、タイプＩのＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である。複数の態様では、遺伝子操作されたタイプＩのＮＫＴ細胞は、前記遺伝子操作された免疫細胞の過半数を含んでなる。さらなる態様では、遺伝子操作されたタイプＩのＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞の過半数を含んでなる。
本開示は、膜貫通領域配列、細胞内領域配列、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでなる遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを処置する方法であって、前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、方法を規定しこれを含む。
本明細書で提供されるとおり、ＣＰＳＰＧ４を発現するがんを処置する方法。一態様では、この方法は、悪性黒色腫、転移性黒色腫疾患、膠芽腫、組織非形成性甲状腺癌、悪性軟部腫瘍、神経膠腫、および白血病からなる群から選択されるがんの処置を規定する。一態様では、本開示の方法を用いる処置に適したがんは、表在拡大型黒色腫、悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、または結節性黒色腫から選択される転移性黒色腫疾患である。一態様では、方法は、平滑筋肉腫、脱分化型脂肪肉腫、未分化多形肉腫（ＵＰＳ）、悪性線維性組織球腫、高グレード紡錘細胞肉腫、粘液線維肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、および滑膜肉腫から選択される悪性軟部腫瘍の処置を規定する。ＰＭＩＤ：３２９００７９７を見られたい。一態様では、開示された方法を用いる処置に適したがんは、膠芽腫である。ＰＭＩＤ：３４１１３２３３を見られたい。別の態様では、方法は、組織非形成性甲状腺癌の処置を規定する。ＰＭＩＤ：３４０７８１２３を見られたい。前記がんが、神経膠腫、星細胞腫、または乏突起膠腫である、請求項７１に記載の方法。ＰＭＩＤ：３２５９９８９６を見られたい。一態様では、開示された方法を用いる処置に適したがんは、Ｂ細胞前駆体白血病およびＭＬＬ転座白血病を含むがこれらに限定されない白血病である。ＰＭＩＤ：３１１９５６８６を見られたい。
本開示は、本明細書に開示される遺伝子操作された治療有効量の免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することによる、ＣＰＳＰＧ４を発現するがんの処置を規定しこれを含む。一態様では、遺伝子操作された免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一態様では、遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の態様では、遺伝子操作された免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞は、タイプＩのＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、遺伝子操作されたタイプＩのＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である。特定の態様では、遺伝子操作されたタイプＩのＮＫＴ細胞は、前記遺伝子操作された免疫細胞の過半数を含んでなる。特定の態様では、遺伝子操作されたタイプＩのＮＫＴ細胞は、前記遺伝子操作されたＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞の過半数を含んでなる。
本開示は、上に記載されるとおりの発現ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせを含んでなるキットを規定しこれを含む。一態様では、キットは、膜貫通領域配列、細胞内領域配列、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列をコードする核酸配列を有するベクターまたは細胞を含んでなり、前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる。
本開示は、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）、および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列を発現するＮＫＴ細胞におけるＮＫＴ細胞増殖能を維持する方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子を含んでなるタンパク質コード配列を発現させることと、前記操作されたＮＫＴ細胞を培養して、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を準備することと、を含んでなる方法を含んでなる方法を規定しこれを含む。
特定の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、全細胞集団の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含んでなる。特定の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、少なくとも１０％から最高８０％、１０％と９０％の間、１０％と９５％の間、１０％と９８％の間、１０％と９９％の間、および最高１００％を含んでなり、操作されていないＮＫＴ細胞は、全集団の９９．９％未満を含んでなる。複数の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、全細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含んでなる。特定の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、少なくとも５０％から最高７０％、５０％から８０％の間、５０％と９０％の間、５０％と９５％の間、５０％と９８％の間、５０％と９９％の間、および最高１００％を含んでなり、操作されていないＮＫＴ細胞は、全集団の９９．９％未満を含んでなる。複数の態様では、操作されたＮＫＴ細胞は、さらにＣＡＲを発現する。他の態様では、操作されたＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外因性成長因子を発現する。
特定の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を含んでなる。特定の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、５０％から５５％、５０％から６０％、約５０％から６５％、５０％から７０％、５０％から７５％、５０％から８０％、５０％から８５％、５０％から９０％、５０％から９５％、５０％から１００％、５５％から６０％、５５％から６５％、５５％から７０％、５５％から７５％、５５％から８０％、５５％から８５％、５５％から９０％、５５％から９５％、５５％から１００％、６０％から６５％、６０％から７０％、６０％から７５％、６０％から８０％、６０％から８５％、６０％から９０％、６０％から９５％、６０％から１００％、６５％から７０％、６５％から７５％、６５％から８０％、６５％から８５％、６５％から９０％、６５％から９５％、６５％から１００％、７０％から７５％、７０％から８０％、７０％から８５％、７０％から９０％、７０％から９５％、７０％から１００％、７５％から８０％、７５％から８５％、７５％から９０％、７５％から９５％、７５％から１００％、８０％から８５％、８０％から９０％、８０％から９５％、８０％から１００％、８５％から９０％、８５％から９５％、８５％から１００％、９０％から９５％、９０％から１００％、または９５％から１００％のＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を含んでなる。特定の態様では、本開示による持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を含んでなる。複数の態様では、操作されたＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、さらにＣＡＲを発現する。他の態様では、操作されたＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外因性成長因子を発現する。
本開示は、ＮＫＴ細胞を操作して、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子を含んでなる少なくとも一つのタンパク質コード配列を発現させるステップと、操作されたＮＫＴ細胞を培養して、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を準備するステップとを含んでなる、ＮＫＴ細胞増殖能を維持する方法であって、前記操作されたＮＫＴ細胞を、ある期間培養する方法を規定しこれを含む。
複数の態様では、ＮＫＴ細胞を操作するステップを含んでなる、ＮＫＴ細胞増殖能を維持する方法は、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団から所望の細胞を分離することをさらに含んでなる。一態様では、方法は、ＣＤ６２Ｌの発現によって、操作されたＮＫＴ細胞を分離して、ＣＤ６２Ｌ（＋）の遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の選択された集団を産生することをさらに含んでなる。一態様では、方法は、４－１ＢＢの発現によって、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞を分離し、４－１ＢＢ（＋）の遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の選択された集団を産生することをさらに含んでなる。
本開示のＮＫＴ細胞増殖能を維持する方法は、ヒト化ＮＳＧマウスにおける神経芽細胞異種移植片への浸潤としてインビボ持続性を示す、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を規定しこれを含む。
本開示は、ＮＫＴ細胞を操作して、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子を含んでなる少なくとも一つのタンパク質コード配列を発現させるステップと、操作されたＮＫＴ細胞を培養して、細胞集団を産生する持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を準備するステップとを含んでなる、ＮＫＴ細胞の消耗を低減させる方法であって、細胞の全集団の１０％より多いＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞が含んでなる、方法を規定しこれを含む。複数の態様では、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞の１０％以上の集団は、タイプＩのＮＫＴ細胞を含んでなる。複数の態様では、全集団は、タイプＩのＮＫＴ細胞、タイプＩＩのＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および操作されていない細胞を含んでなる。複数の態様では、操作されたＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、さらにＣＡＲを発現する。他の態様では、操作されたＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外因性成長因子を発現する。
本開示は、マウスモデルにおけるｓｃＦｖの緊張性シグナル伝達を低減させる方法であって：ＣＡＲの一部としてマウス免疫細胞において発現させた場合に、緊張性シグナル伝達を有するｓｃＦｖを特定することと；前記ｓｃＦｖの構造モデルを生成し、計算機による変異誘発を実行して、一連の変異させたｓｃＦｖを準備することと；変異させたｓｃＦｖの自由エネルギーを計算することと；前記変異させたｓｃＦｖを、フレームワーク１．４（ＦＷ１．４）を含んでなるヒト化ｓｃＦｖに配向させ、基本的に重要なマウス残基を特定することと；ヒトからマウスへの一つまたは複数の残基変化を導入して前記ｓｃＦｖの安定性を高め、マウスモデルにおいて使用するための修飾されたヒト化ｓｃＦｖを準備することと、を含んでなる、方法を規定しこれを含む。一態様では、方法は、配列番号７から１０の軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ）１から４の少なくとも一つ、配列番号１１のリンカー領域、または配列番号１２から１５の重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ）１から４を含む修飾ヒト化ＦＷ１．４を含んでなる。一態様では、修飾されたヒト化ｓｃＦｖは、配列番号１６から２７からなる群から選択される修飾ＦＲ領域を含んでなる。本明細書で使用されるとおり、緊張性シグナル伝達は、ＩＮＦγなどのサイトカイン類の自発放出によって測定される。本開示による複数の態様では、ＣＡＲの一部としてのｓｃＦｖにおいてマウスモデルにおける緊張性シグナル伝達を低減させる方法により、同じ培養条件下での非ＣＡＲ含有細胞によるＩＮＦγ放出のレベルと区別できないＩＮＦγレベルという結果が得られる。他の態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、少なくとも２倍低減する。別の態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、少なくとも５倍低減する。別の態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、少なくとも１０倍低減する。別の態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、少なくとも５０倍低減する。複数の態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、１００倍低減する。複数の態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、１０倍から１００倍の間で低減する。一態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、５倍から５０倍の間で低減する。一態様では、緊張性シグナル伝達は、ＣＡＲの一部である非変異ｓｃＦｖと比較して、１０倍から２００倍の間で低減する。他の態様では、ＩＮＦγの自発放出で測定される緊張性シグナル伝達が低減し、この場合、ＩＮＦγのレベルは２００ｐｇ／ｍｌ／５×１０５個の細胞未満である。他の態様では、ＩＮＦγの自発放出で測定される緊張性シグナル伝達が低減し、この場合、ＩＮＦγのレベルは１００ｐｇ／ｍｌ／５×１０５個の細胞未満である。他の態様では、ＩＮＦγの自発放出で測定される緊張性シグナル伝達が低減し、この場合、ＩＮＦγのレベルは１０ｐｇ／ｍｌ／５×１０５個の細胞未満である。複数の態様では、本開示によるＣＡＲの一部としてのｓｃＦｖの変異後の、緊張性シグナル伝達のレベルは、ＩＮＦγの検出レベルのところまたはその近傍である。複数の態様では、低減した緊張性シグナル伝達を有する免疫細胞は、持続的増殖能および増加した機能性を有する。複数の態様では、低減した緊張性シグナル伝達を有する免疫細胞は、持続的増殖能、免疫細胞消耗の低減、およびインビボでの抗腫瘍効果の向上を有する。
本明細書によって提供されるとおり、マウスモデルの緊張性シグナル伝達を低減させる方法は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であるマウス免疫細胞を含んでなる。一態様では、マウス免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の態様では、マウス免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、ＮＫＴ細胞は、タイプＩのＮＫＴ細胞である。さらなる態様では、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である。
他に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者によって一般に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用されるとおり、以下の用語は、他に指定されていない限り、以下でそれらに付与された意味を有する。
用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの活用形は、「含んでいるがそれには限定されない」ことを意味する。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含んでおりそれに限定される」ことを意味する。用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、追加の成分、ステップ、および／または部分が、特許請求される組成物、方法、または構造体の基本的そして新規の特性を実質的に変化させない場合にのみ、その組成物、方法、または構造が、それらの追加の成分、ステップ、および／または部分を含んでいてもよいことを意味する。
本明細書で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しているのでない限り、複数形への言及をも含む。例えば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」または「少なくとも一つの細胞（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｅｌｌ）」は、それらの混合物を含む複数の細胞を含んでいてもよい。
本出願全体を通じて、本開示の様々な実施形態は、範囲の形式で提示されている場合がある。範囲の形式での記載は、単に便宜上および簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する杓子定規な限定として解釈されないのが望ましいことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、あらゆる可能な部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるのが望ましい。例えば、１から６などの範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲のみならず、例えば１、２、３、４、５、６など、その範囲内の個々の数を具体的に開示したものと見なされるのが望ましい。これは、範囲の広さに関係なく当てはまる。
本明細書で使用されるとおり、用語「方法」は、化学、薬学、生物学、生化学、および医学の専門家に知られているか、または公知のやり方、手段、技術、および手順からそれらの専門家によって容易に開発されるかのいずれかであるやり方、手段、技術、および手順を含むがこれらには限定されない、所与の課題を達成するやり方、手段、技術、および手順を指す。
本明細書で使用されるとおり、「処置」は、処置されている個体または細胞の疾患経過を変化させる試みにおける臨床介入を指し、予防のためか、または臨床病理の経過中かのいずれかに実行することができる。処置の治療効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理学的結果の軽減、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、寛解または予後の改善などが挙げられるが、これらには限定されない。疾患または障害の進行を防止することにより、処置は、罹患したもしくは診断された対象、または障害を有する疑いのある対象における障害に起因する悪化を防止することができるが、処置は、障害のリスクのある対象、または障害を有する疑いのある対象における障害または障害の症状の始まりを防止する場合もある。
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするいずれかの核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、詳述された配列と同一であるポリペプチドをコードすることになる。
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書では交換可能に用いられ、いずれかの脊椎動物対象、例えば、限定されるものではないが、マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物などの、非ヒト霊長類を含む哺乳類、好ましくはヒトおよび他の霊長類を指す；この用語は、特定の齢を示すものではない。したがって、成体と新生仔の両方の個体が対象範囲となることが意図される。
「有効量」は、治療効果を有するのに充分な量を意味する。一実施形態では、「有効量」は、新生物の継続的な増殖、成長、または転移（例えば、浸潤、または移動）を停止、改善、または阻害するのに充分な量である。
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、材料から、その本来の状態で見出されるような通常付随する成分が、様々な程度にまで除かれていることを指す。「単離」は、元の源または周囲からの分離の程度を示す。「精製」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質からは、いかなる不純物もそのタンパク質の生物学的特性に重大な影響を与えない、または他の有害な結果を引き起こさないように、充分な程度にまで他の材料が除かれている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地、または化学的に合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含んでいないならば、精製されている。純度および均一性は典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に一つのバンドを生じることを意味し得る。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化を受け得るタンパク質については、異なる修飾によって、異なる単離されたタンパク質が生じ、これらは個別に精製することができる。
本明細書で使用されるとおり、用語「動作可能に連結された」は、生体分子に関連する生物学的機能、活性、および／または構造が少なくとも保持されるように二つ以上の生体分子を連結することが意図される。ポリペプチドに関しては、この用語は、二つ以上のポリペプチドが連結する結果として、各ポリペプチド成分のそれぞれ個々の活性の少なくとも一部を保持する融合ポリペプチドが生じることを意味する。二つ以上のポリペプチドは、直接またはリンカーを介して連結することができる。核酸に関しては、この用語は、第１のポリヌクレオチドの転写を指示する第２のポリヌクレオチドに、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が結合している場合に、第１のポリヌクレオチドが、その第２のポリヌクレオチドに隣接して配置されることを意味する。
本明細書で使用されるとおり、「細胞の集団」は、複数の細胞を指し、均一な集団のみならず、異なる細胞タイプの混合物をさらに含んでいてもよい。
用語「認識する」は、標的を選択的に結合することを意味する。細胞を認識する免疫細胞は典型的には、その細胞によって発現される抗原と結合する受容体を発現する。本開示による態様における免疫細胞は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合するＣＡＲを発現する。
本明細書で使用されるとおり、「自律的リボソーム内自己プロセシングペプチド」は、ポリタンパク質をプロセシングして個別のタンパク質にするプロテイナーゼの必要性を回避する、１８個のアミノ酸の小さなペプチドである。これらのペプチドは、手足口病ウイルスで初めて発見され、二つのタンパク質間のリンカーとして導入される場合に、ポリタンパク質の自律的リボソーム内自己プロセシングを規定する。同様の配列が、ピコナウィルス科（ｐｉｒｃｏｒｎａｖｉｒａｄａｅ）の他の構成メンバーにも特定されている。ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，“Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍ：ｔｈｅ ｎｅｗ ２Ａ ‘ＣＨＹＳＥＬ’ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１３（２００４）を見られたい。
本明細書で使用されるとおり、用語「操作」は、一つまたは複数の外因性核酸配列を導入するための細胞の遺伝子修飾を指す。好ましくは、操作は、転写および翻訳されてタンパク質を発現する外因性核酸配列を導入した。外因性核酸配列の導入は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含む、当技術分野で公知の方法を用いて実行することができる。
本明細書で使用されるとおり、用語「Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子」は概して、細胞内で外因的に発現するとＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の下流の遺伝子を活性化するタンパク質を指す。Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子には、ＬＥＦ１などのＷｎｔシグナル伝達の正の制御因子の発現や、ＧＳＫ３βなどの負の制御因子の阻害が含まれる。また、Ｗｎｔシグナル伝達における転写活性化因子には、小分子活性化因子であって、Ｂｌａｇｏｄａｔｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｗｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｏｕｒｃｅｓ：Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，”Ｃｅｌｌｓ ９：５８９（２０２０）、および Ｖｅｒｋａａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ β－ｃａｔｅｎｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）：ｅ１９１８５（２０１１）に記載されるものなどが挙げられるがこれらには限定されず、またＷｎｔシグナル伝達の負の制御因子、例えばＴＷＳ１１９（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ，”ＰＮＡＳ １００（１３）：７６３２－７（２００３）を見られたい）などが挙げられる。
本明細書で使用されるとおり、句「成長因子を発現する」は、概して異種プロモーターの制御下での、そしてさらに一般的にはＣＨＹＳＥＬ配列の下流のポリタンパク質の一部としての、一つまたは複数の成長因子の外因性発現を指す。
本開示を、特定の実施形態を参照しつつ記載してきたが、様々な変更を行い、均等物をその構成要素について置換して、本開示の範囲から逸脱することなく特定の状況に適応させてもよいことは、当業者には理解されよう。したがって、本開示が、本開示を実施するために企図された最良の態様として開示された特定の実施形態に限定されるのではないこと、むしろ、本開示が、添付の請求項の範囲および趣旨に収まるすべての実施形態を含むことが意図される。
本明細書で引用されるいずれの参考文献も、その全体が参照により組み込まれる。
実施形態
実施形態１： 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と；配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列；ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する結合メンバー。
実施形態２： 前記軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）が、配列番号１５３から１５８からなる群から選択され；前記軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）が、配列番号２２２から２２５からなる群から選択され；前記軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）が、配列番号２２６から２３１からなる群から選択され；そして前記軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）が、配列番号２５０から２５５からなる群から選択され；前記重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）が、配列番号３４７から３４９からなる群から選択され；前記重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）が、配列番号３５０から３５３からなる群から選択され；前記重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）が、配列番号３５４から３６０からなる群から選択され；そして前記重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）が、配列番号３６１から３６２からなる群から選択される、実施形態１のＣＳＰＧ４に対する結合特異性を有する結合メンバー。
実施形態３： 前記可変軽鎖配列が、配列番号６７から１０９からなる群から選択される配列を含んでなり、前記可変重鎖配列が、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される配列を含んでなる、実施形態１または２のＣＳＰＧ４への結合特異性を有する結合メンバー。
実施形態４： 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸。
実施形態５： 配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸。
実施形態６： 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）、および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする核酸配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態７： 前記膜貫通領域が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０，１２４８７）、ＣＤ３－ζ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９；１２５０３ ＣＤ２４７）、ＣＤ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２０、１２５０４）、ＣＤ８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２４、１２５２５）、ＣＤ１６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２１４；１４１３１；Ｆｃｇｒ３）、ＮＫｐ４４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３６、ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３７、１７０８６、ＮＣＲ１）、およびＮＫＧ２ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９１４；２７００７ ＫＬＲＫ１）からなる群から選択される、実施形態６のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態８： 前記細胞内領域配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば、４－１ＢＢ、またはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ １０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）からなる群から選択される、実施形態６または７のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態９： Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質配列をコードする配列をさらに含んでなる、実施形態６から８のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１０： Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対する前記タンパク質配列と、最高三つの追加のタンパク質コード配列とを含んでなるポリタンパク質をコードする、実施形態６から９のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１１： Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対する前記タンパク質配列および最高三つの追加のタンパク質コード配列が、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されている、実施形態６から１０のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１２： 前記自律的リボソーム内自己プロセシングが、手足口病ウイルス（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ））２Ａ配列、または関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ｃｉｓ ａｃｔｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＨＹＳＥＬ））である、実施形態６から１１のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１３： 前記転写活性化因子が、リンパ球エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、ベータ－カテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（ａｌｔ．ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（ａｌｔ．ＴＣＦ１）、およびＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）からなる群から選択される、実施形態６から１２のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１４： 前記ＬＥＦ１が、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、実施形態６から１３のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１５： 成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列をさらに含んでなる、実施形態６から１４のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１６： 前記成長因子が、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態６から１５のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１７： 成長因子に対する前記タンパク質コード配列が、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によって前記ＣＡＲコード配列から分離されている、実施形態６から１６のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１８： 前記細胞外領域配列が、スペーサー領域さらに含んでなる、実施形態６から１７のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態１９： 前記細胞内領域が、ＣＤ３－ゼータ鎖にインフレームで融合した４－１ＢＢのシグナル配列を含んでなる、実施形態６から１８のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態２０： ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含んでなり、ｓｈＲＮＡ配列が、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場に埋め込まれている、実施形態６から１９のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
実施形態２１： 配列番号２８から６５からなる群から選択されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列；膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２２： 前記細胞外領域配列が、配列番号３４、４６、４７、および５７からなる群から選択される、実施形態２１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２３： 前記細胞外領域配列が、配列番号３４を含んでなる、実施形態２１または２２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２４： 前記細胞外領域配列が、配列番号４６を含んでなる、実施形態２または２２１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２５： 前記細胞外領域配列が、配列番号４７を含んでなる、実施形態２１または２２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２６： 前記細胞外領域配列が、配列番号５７を含んでなる、実施形態２１または２２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２７： 前記膜貫通領域配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０，１２４８７）、ＣＤ３－ζ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９；１２５０３ ＣＤ２４７）、ＣＤ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２０、１２５０４）、ＣＤ８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２４、１２５２５）、ＣＤ１６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２１４；１４１３１；Ｆｃｇｒ３）、ＮＫｐ４４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３６、ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３７、１７０８６、ＮＣＲ１）、およびＮＫＧ２ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９１４；２７００７ ＫＬＲＫ１）からなる群から選択される、実施形態２１から２６のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２８： 前記細胞内領域配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば、４－１ＢＢ、またはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ １０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）からなる群から選択される、実施形態２１から２７のいずれか一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態２９： 配列番号２８から６５からなる群から選択されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列；膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３０： 前記細胞外領域配列が、配列番号３４、４６、４７、および５７からなる群から選択される、実施形態２９のＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３１： 前記細胞外領域配列が、配列番号３４を含んでなる、実施形態２９または３０のＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３２： 前記細胞外領域配列が、配列番号４６を含んでなる、実施形態２９または３０のＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３３： 前記細胞外領域配列が、配列番号４７を含んでなる、実施形態２９または３０のＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３４： 前記細胞外領域配列が、配列番号５７を含んでなる、実施形態２９または３０のＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３５： 前記膜貫通領域配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０，１２４８７）、ＣＤ３－ζ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９；１２５０３ ＣＤ２４７）、ＣＤ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２０、１２５０４）、ＣＤ８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２４、１２５２５）、ＣＤ１６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２１４；１４１３１；Ｆｃｇｒ３）、ＮＫｐ４４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３６、ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３７、１７０８６、ＮＣＲ１）、およびＮＫＧ２ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９１４；２７００７ ＫＬＲＫ１）からなる群から選択される、実施形態２９から３４のいずれか一つのＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３６： 前記細胞内領域配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば、４－１ＢＢ、またはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ １０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）からなる群から選択される、実施形態２９から３５のいずれか一つのＣＡＲをコードする核酸分子。
実施形態３７： 実施形態６から２０のいずれか一つに規定される発現コンストラクトを用いて、または実施形態２９から３５のいずれか一つに規定される核酸配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
実施形態３８： 前記宿主細胞が、細菌、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、実施形態３７の宿主細胞。
実施形態３９： 前記宿主細胞がＴ細胞である、実施形態３７または３８の宿主細胞。
実施形態４０： 前記宿主細胞がＮＫＴ細胞である、実施形態３７または３８の宿主細胞。
実施形態４１： 前記宿主細胞が、タイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態３７、３８、または４０のいずれか一つの宿主細胞。
実施形態４２： ドナーからＰＢＭＣを分離することと；前記ＰＢＭＣからナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を単離して、単離免疫細胞を準備することと；前記単離免疫細胞を１から２０日間増殖させ、内因性Ｔ細胞受容体の刺激によって、および共刺激受容体、サイトカイン類、またはその両方の組み合わせによる共刺激によって、遺伝子操作用の増殖免疫細胞を準備することと；配列番号６１から１０９からなる群から選択される可変軽鎖と、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される可変重鎖と、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトを導入することと、を行う、ＣＡＲを含んでなる免疫細胞を産生する工程。
実施形態４３： 前記単離免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態４２のＣＡＲを含んでなる免疫細胞を産生する工程。
実施形態４４： 前記単離免疫細胞が、ＮＫ細胞である、実施形態４１または４２のＣＡＲを含んでなる免疫細胞を産生する工程。
実施形態４５： 前記単離免疫細胞が、タイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態４１または４２のＣＡＲを含んでなる免疫細胞を産生する工程。
実施形態４６： 前記増殖免疫細胞が、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態４１、４２、または４３のいずれか一つのＣＡＲを含んでなる免疫細胞を産生する工程。
実施形態４７： 前記単離免疫細胞が、タイプＩのＮＫＴ細胞であり、前記増殖が、少なくともａＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で培養することを含んでなる、実施形態４５または４６のＣＡＲを含んでなる免疫細胞を産生する工程。
実施形態４８： 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列；ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列；膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする発現コンストラクトを含んでなる遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態４９： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態４７または４８の遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５０： 前記宿主細胞が、Ｔ細胞である、実施形態４７または４９の遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５１： 前記宿主細胞が、ＮＫＴ細胞である、実施形態４７または４９の遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５２： 前記宿主細胞が、タイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態４７、４９、または５１のいずれか一つの遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５３： 前記宿主細胞が、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態４７、４９、５１、または５２のいずれか一つの遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５４： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、複数の細胞を含んでなる、実施形態４８の遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５５： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、複数のＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞を含んでなる、実施形態４８または５４の遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５６： 前記複数のＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞が、前記複数の細胞の少なくとも５０％を含んでなる、実施形態４８、５４、または５５のいずれか一つの遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５７： ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含んでなり、前記ｓｈＲＮＡ配列が、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場に埋め込まれている、実施形態４８から５６のいずれか一つの遺伝子操作された免疫細胞。
実施形態５８： コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列を含んでなる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする発現コンストラクトを含んでなる複数の遺伝子操作された免疫細胞を含んでなる細胞の集団であって、前記ＣＡＲが、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と；配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなる、細胞の集団。
実施形態５９： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含んでなる、実施形態５８の細胞の集団。
実施形態６０： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、複数のＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞を含んでなる、実施形態５８または５９の細胞の集団。
実施形態６１： 前記複数のＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞が、前記複数の細胞の少なくとも５０％を含んでなる、実施形態５８、５９、または６０の細胞の集団。
実施形態６２： 個体におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）陽性細胞を阻害する方法であって、細胞を治療有効量の遺伝子操作された免疫細胞と接触させるステップを含んでなり、前記免疫細胞が、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでなる、方法。
実施形態６３： 前記阻害することが、増殖を阻害すること、活性を阻害すること、または両方の組み合わせを含んでなる、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態６２または６３に記載の方法。
実施形態６５： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態６２から６４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６６： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ＮＫＴ細胞である、実施形態６２から６４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６７： 前記ＮＫＴ細胞が、タイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態６２から６４、または６６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６８： 前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態６２から６４、６６、または６７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６９： 前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、前記遺伝子操作された免疫細胞の過半数を含んでなる、実施形態６２から６４、または６６から６８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７０： 前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、前記遺伝子操作されたＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞の過半数を含んでなる、実施形態６２から６４、または６６から６９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７１： コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでなる遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを処置する方法であって、前記ＣＡＲが、配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列、ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる細胞外領域配列、膜貫通領域配列、および細胞内領域配列を含んでなる、方法。
実施形態７２： 前記がんが、悪性黒色腫、転移性黒色腫疾患［表在拡大型黒色腫、悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、および結節性黒色腫］；膠芽腫、組織非形成性甲状腺癌、悪性軟部腫瘍、神経膠腫、および白血病からなる群から選択される、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態７１または７２のがんを処置する方法。
実施形態７４： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態７１から７３のいずれか一つのがんを処置する方法。
実施形態７５： 前記遺伝子操作された免疫細胞が、ＮＫＴ細胞である、実施形態７１、７２、または７３のいずれか一つのがんを処置する方法。
実施形態７６： 前記ＮＫＴ細胞がタイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態７１、７２、または７５のいずれか一つのがんを処置する方法。
実施形態７７： 前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態７１、７２、７５、または７６のいずれか一つのがんを処置する方法。
実施形態７８： 前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、前記遺伝子操作された免疫細胞の過半数を含んでなる、実施形態７１、７２、または７５から７７のいずれか一つのがんを処置する方法。
実施形態７９： 前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、前記遺伝子操作されたＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞の過半数を含んでなる、実施形態７１、７２、または７５から７８のいずれか一つのがんを処置する方法。
実施形態８０： 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列；ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列；膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする核酸配列を含んでなるベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせを含んでなるキット。
実施形態８１： 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）とを含んでなる可変軽鎖配列；ならびに配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）とを含んでなる可変重鎖配列、を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列；膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列、を発現するＮＫＴ細胞におけるＮＫＴ細胞増殖能を維持する方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子を含んでなるタンパク質コード配列を発現させることと、前記遺伝子操作されたＮＫＴ細胞を培養して、持続的増殖能を有する遺伝子操作されたＮＫＴ細胞の集団を準備することと、を含んでなる方法。
実施形態８２： ｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法であって、ＣＡＲの一部としてマウス免疫細胞において発現させた場合に、緊張性シグナル伝達を有するｓｃＦｖを特定することと；前記ｓｃＦｖの構造モデルを生成することと、計算機による変異誘発を実行して、一連の変異させたｓｃＦｖを準備することと、前記変異させたｓｃＦｖの自由エネルギーを計算することと、前記変異させたｓｃＦｖを、フレームワーク１．４（ＦＷ１．４）を含んでなるヒト化ｓｃＦｖに配向させ、基本的に重要なマウス残基を特定することと；ヒトからマウスへの一つまたは複数の残基変化を導入して前記ｓｃＦｖの安定性を高め、マウスモデルにおいて使用するための修飾されたヒト化ｓｃＦｖを準備することと、を含んでなる、方法。
実施形態８３： ＦＷ１．４が、配列番号７から１０の軽鎖フレームワーク領域（ＶＬ－ＦＲ）１から４、配列番号１１のリンカー領域、および配列番号１２から１５の重鎖フレームワーク領域（ＶＨ－ＦＲ）１から４を含んでなる、実施形態８２のｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
実施形態８４： 前記修飾されたヒト化ｓｃＦｖが、配列番号１６から２７からなる群から選択される修飾ＦＲ領域を含んでなる、実施形態８２または８３のｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
実施形態８５： 前記免疫細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態８２から８４のいずれか一つのｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
実施形態８６： 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態８２から８５のいずれか一つのｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
実施形態８７： 前記免疫細胞が、ＮＫＴ細胞である、実施形態８２から８５のいずれか一つのｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
実施形態８８： 前記ＮＫＴ細胞が、タイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態８２から８５、または８７のいずれか一つのｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
実施形態８９：前記タイプＩのＮＫＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌ陽性のタイプＩのＮＫＴ細胞である、実施形態８２から８５、８７、または８８のいずれか一つのｓｃＦｖにおけるマウスモデルにおいて緊張性シグナル伝達を低減させる方法。
細胞株。腫瘍細胞株ＷＭ１１５（悪性黒色腫）およびＳＫ－ＭＥＬ－２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））（ＣＲＬ－１６７５）から入手する。Ｍ１４細胞は、フェローネ博士（Ｄｒ Ｆｅｒｒｏｎｅ）から提供された。腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオルガニズム・アンド・セル・カルチャー社（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ）から入手する（ＡＣＣ ７３８およびＡＣＣ ７３２）。レトロウイルスベクターの産生に使用する２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから入手する。すべての細胞は、３７℃で５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気下、適切な培地、１０％のＦＢＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１％のＬ－グルタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ）を補充した、ＲＰＭＩ－１６４０（ギブコ）またはＤＭＥＭ（ギブコ）のいずれかを用いて培養維持する。ＷＭ１１５細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子および融合タンパク質強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ）をコードするＳＦＧガンマレトロウイルスベクターを用いて形質導入する。Ｈｏｙｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ａｎｄ ａ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ，”Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２４：１１６０－１１７０（２０１０）を見られたい。細胞を、連続６カ月未満の間培養維持し、その後、元の増殖させたバイアルからのアリコートを使用した。すべての腫瘍細胞株は、マイコプラズマの混入を排除するために定期的に試験し、同一性を確認するために、フローサイトメトリーによって導入遺伝子および腫瘍マーカーの発現について評価する。膠芽腫由来ニューロスフィアを、これまでの記載のとおりに生成する。Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ＴＮＦａｌｐｈａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１０（２０１８）（“Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）”）を見られたい。
レトロウイルス上清の生成、Ｔ細胞の単離、形質導入、およびインビトロ増殖。レトロウイルス上清を、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって調製し、Ｔ細胞の形質導入に使用する。Ｄｉａｃｏｎｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃａｓｐａｓｅ－９ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＤ１９－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５：５８０－５９２（２０１７）（“Ｄｉａｃｏｎｕ ｅｔ ａｌ．２０１７”）を見られたい。健康なボランティア献血者からのバフィーコートは、ガルフ・コースト・リージョナル・ブラッド・センター（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（ヒューストン、テキサス州））から購入する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション社（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））密度勾配遠心分離によって、製造元のプロトコルに従って単離する。Ｔ細胞を、４５％のクリック培地（アーバイン サイエンティフィック社（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、４５％のＲＰＭＩ－１６４０（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））、１０％のＦＢＳ（ハイクローン）、１％のＬ－グルタミン（ギブコ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ）からなる完全培地中で培養する。Ｔ細胞は、これまでに報告されているとおり、ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍＬ、ぺプロテック社（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））およびＩＬ１５（５ｎｇ／ｍＬ、ぺプロテック社）を含む完全培地で活性化、形質導入、および増殖させる。Ｄｉａｃｏｎｕ ｅｔ ａｌ．２０１７を見られたい。
イムノフェノタイピング。Ｔ細胞は、ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手したＣＤ３（ＡＰＣ－Ｈ７、クローンＳＫ７）、ＣＤ４５Ｒａ（ＰＥ、クローンＨＩ１００）、ＣＣＲ７（ＦＩＴＣ、クローン１５０５０３）、ＣＴＬＡ４（ＢＶ４２１、クローンＢＮＩ３）、ＰＤ－１（ＰＥ－Ｃｙ７、クローンＥＨ１２．１）、ＬＡＧ３（ＰＥ、クローンＴ４７－５３０）、ＴＩＭ３（ＢＶ７１１、クローン７Ｄ３）、ＣＤ４５（ＡＰＣ、クローン２Ｄ１）に対する抗体（Ａｂ）を用いて染色する。ミルティニーバイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のＲＥＡｆｆｉｎｉｔｙからは、抗ＣＤ４５（ＰｅｒＣＰ、クローンＲＥＡ７４７）および抗ＣＤ６９（ＡＰＣ、クローンＲＥＡ８２４）。腫瘍細胞は、ＢＤバイオサイエンス社から入手したＣＤ２７６に対するＡｂ（ＢＶ４２１、クローン７－５１７）、および７６３．７４ ｍＡｂ（抗ＣＳＰＧ４）で染色し、その後、ＢＤバイオサイエンス社から入手した二次ラット抗マウス（Ｒａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ１（ＰＥ、クローンＸ５６）を用いて染色する。７６３．７４（Ａ）ＣＡＲ、および（Ｂ）ＣＡＲの発現を、抗イディオタイプ抗体を用いて評価し、ＣＴＲ ＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）の発現を、抗イディオタイプ抗体（フェローネ博士から入手）を用いて評価し、その後、ＢＤバイオサイエンス社から入手した二次ラット抗マウスＩｇＧ１（ＰＥ、クローンＸ５６）を用いて染色する。ｈ７６３．７４ ＣＡＲの発現に続いて、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のストレプトアビジン・タンパク質ＲＰＥコンジュゲート（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）で染色する。データ取得は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａまたはＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターでＢＤ ＦＡＣＳ－ＤｉｖａソフトウェアまたはＭＡＣＳＱｕａｎｔ（ミルティニーバイオテク社）を用いて実行する。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン９または１０）またはＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェア（バージョン７．２、ミルティニーバイオテク社）を用いて実行する。
共焦点顕微鏡検査。Ｔ細胞は、製造元の指示（アブカム社（Ａｂｃａｍ）の免疫蛍光プロトコル）に従って調製する。簡単には、ＣＡＲ－ＧＦＰ＋細胞をサイトフィックス（ｃｙｔｏｆｉｘ）バッファー（ＢＤバイオサイエンス社）で固定し、ＤＡＰＩを含むプロロング・ダイアモンド・アンチフェード・マウント液（ＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ）（インビトロジェン社）を１滴垂らしてカバースリップ上にマウントする。データ取得は、ＺＥＮソフトウェア（ツァイス・マイクロスコピー社（ＺＥＩＳＳ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ））を用いて、ＬＳＭ７００ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡法で実行する。データ分析は、Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて実行する。
共培養実験およびＥＬＩＳＡ。自発的ＩＦＮγ放出アッセイのために、サイトカイン類を含まない完全培地２ｍＬ中、１×１０６個のＴ細胞を、２４ウェルプレートに播く。Ｔ細胞（２×１０４個／ウェルの細胞）と腫瘍細胞株（Ｍ１４－ｗｔまたはＷＭ１１５；１０５個／ウェルの細胞）をエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比１：５で２４ウェルプレート、完全培地、サイトカイン類の非存在下で共培養する。５日間の培養後、細胞を採取し、ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｈ７、ＢＤバイオサイエンス社のクローンＳＫ７）およびＣＤ２７６（ＢＶ４２１、ＢＤバイオサイエンス社のクローン７－５１７）モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）に対して染色して、Ｔ細胞および腫瘍細胞をそれぞれ検出する。Ｌａｎｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｈｉｇｈ－Ａｖｉｄｉｔｙ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｄｉｒｅｃｔｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅｓ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．８：５７－６９（２０２０）を見られたい。培養中の残存腫瘍細胞の百分率は、フローサイトメトリーにより数える。自発放出と培養上清を培養２４時間後に採取し、ＤｕｏＳｅｔ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社）を用いて１００ｍＬの上清中のＩＦＮγを測定する。データ取得は、Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダー（バイオテク社（ＢｉｏＴｅｋ））上でＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行する。血清を含まないＧＢＭ－ＮＳ培地中、Ｂ２７サプリメントの存在下、２４ウェルプレートに、ＧＢＭ－ＮＳを、５×１０５個の細胞、Ｔ細胞とのＥ：Ｔ比１：５で播く。Ｔ細胞は、共培養物を播く前に、ＧＢＭ－ＮＳ培地中で３日間維持する。Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）を見られたい。ＧＢＭ－ＮＳ細胞およびＴ細胞を、共培養の２、４、６、および２４時間後の異なる時点で採集し、残存腫瘍細胞およびＴ細胞を、それぞれＣＳＰＧ４およびＣＤ４５発現に基づくフローサイトメトリーによって測定する。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ６９の発現を評価することにより測定する。
計算機による分析。ｓｃＦｖの３Ｄ立体配座を生成するために、ｓｃＦｖの一次配列をＲＣＳＢデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索し、高い配列類似性を有する相同テンプレート構造を特定する。ＢＬＡＳＴｐ分析により、解像度２．７０ÅのｓｃＦｖ断片１６９６が、７０．５１％の配列同一性を有する潜在的なテンプレートとして特定される。Ｒｅｚａｃｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ａｎｄ ＨＩＶ－２ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．９：８８７－８９５（２００１）（“Ｒｅｚａｃｏｖａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）”）を見られたい。ｓｃＦｖ断片１６９６の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ｊｐ５）をテンプレートとして、ホモロジーモデリングによりｓｃＦｖをモデリングする。同文献。Ｍｏｄｅｌｌｅｒ－９ｖ１９を用いた４０とおりのモデルを生成し、分子目的関数スコアが最も低い構造をｓｃＦｖの代表的な立体配座として選択する。Ｗｅｂｂ ａｎｄ Ｓａｌｉ，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＭＯＤＥＬＬＥＲ，”Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８６：２（２０１６）を見られたい。モデリングされた低分解能の構造では立体衝突がよく生じるので、ｓｃＦｖの構造を最適化するためにキロン（Ｃｈｉｒｏｎ）を採用する。Ｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｉａ：ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２７：２２０９－２２１５（２０１１）を見られたい。キロンは、骨格への摂動を最小限にしか、または全く与えずにタンパク質構造に対して短ＤＭＤシミュレーションを行うことによって、原子の衝突を解決する。Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｌｌ－ａｔｏｍ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１６：１０１０－１０１８（２００８）；Ｓｈｉｒｖａｎｙａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｊ Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ １１６：８３７５－８３８２（２０１２）；およびＤｏｋｈｏｌｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｅｌ，”Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ ３：５７７－５８７（１９９８）を見られたい。次いで、エリス分子スイートを用いたインシリコ変異誘発研究用に、緩和されたｓｃＦｖ１構造を考慮する。Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｒｉｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：４６６－４６７（２００７）を見られたい。エリスのプロトコルは、タンパク質に変異を誘発し、立体配座の自由エネルギーを、変異型（ΔＧｍｕｔ）と野生型（ΔＧｗｔ）について見積もる。エリスは、モンテカルロアルゴリズムを用いて、変異部位の周辺での側鎖の再充填と骨格の緩和を速やかに実行し、次いで、メドゥーサ（Ｍｅｄｕｓａ）力場を使ってΔＧｗｔとΔＧｍｕｔを評価する。同文献；およびＹｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＭｅｄｕｓａＳｃｏｒｅ：ａｎ ａｃｃｕｒａｔｅ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ－ｂａｓｅｄ ｓｃｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖｉｒｔｕａｌ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｊ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．４８：１６５６－１６６２（２００８）を見られたい。エリスのアルゴリズムは、以下の式：ΔΔＧｍｕｔ＝ΔＧｍｕｔ－ΔＧｗｔを採用することにより、変異時のタンパク質の自由エネルギー変化を計算する。このΔΔＧｍｕｔの値を評価して、安定化（ΔΔＧｍｕｔ＜０）または不安定化（ΔΔＧｍｕｔ＞０）する変異を見積もる。エリスは広範囲にその妥当性が検証されており、新規タンパク質の設計に使用されている。Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｏｃｃｌｕｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：９４８（２０１９）；Ｄａｇｌｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５４：１４４１－１４４４（２０１６）；およびＤａｇｌｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｌｉｇａｎｄ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｔｃｈ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １１０：６８００－６８０４（２０１３）を見られたい。
異種移植モデル。悪性黒色腫マウス実験は、ＵＮＣ畜産および動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））のガイドラインに準拠して実行し、これは、ＵＮＣ ＩＡＣＵＣ（ＩＤ：１７０２９）により承認済みである。ＧＢＭマウス実験は、実験動物飼育のイタリア原則（Ｉｔａｌｉａｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）（Ｄ．Ｌｇｓ．２６／２０１４）および欧州共同体理事会指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ）（８６／６０９／ＥＥＣおよび２０１０／６３／ＵＥ）に準拠し、ミラノの財団ＩＲＣＣＳカルロ・ベスタ神経学研究所（Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ ＩＲＣＣＳ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃｏ Ｃａｒｌｏ Ｂｅｓｔａ）の指示に従って実行する。悪性黒色腫モデルについては、雌雄ＮＳＧマウス（７～９週齢、ＵＮＣアニマル・コア（ＵＮＣ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅ）から入手）に、０．５×１０６個のｅＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ標識ＷＭ１１５腫瘍細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）する。腫瘍細胞注入（０日目）の７日後に、マウスに５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞をｉ．ｖ．注入する。悪性黒色腫腫瘍細胞の成長は、ｓ．ｃ．腫瘍についてはノギス測定を用い、そしてＩＶＩＳキネティック・インビボ・イメージング・システム（ｋｉｎｅｔｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた生物発光（ＢＬＩ；全光束、光子／秒）により、毎週監視する。マウスは、腫瘍の成長または不快感の徴候の発生に関してＵＮＣガイドラインに従って安楽死させる。マウスを安楽死させると、心臓、脾臓、肝臓をセルストレーナーで潰し、２ｍＬのＰＢＳで洗浄したものから、末梢血を採取する。末梢血、脾臓、および肝臓を分析し、Ｔ細胞の存在［ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｈ７、クローンＳＫ７）、ＣＤ４５（ＡＰＣ、クローン２Ｄ１）、ＰＤ－１（ＰＥ／Ｃｙ７、クローンＥＨ１２．１）、およびＣＡＲ特異的抗イディオタイプに対してＡｂで染色］を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対細胞数カウントビーズ（インビトロジェン社）を用いたフローサイトメトリーにより検出する。ＧＢＭモデルについては、ＧＢＭ－ＮＳを移植したヌードマウスを用いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価する。５から６週齢のマウスに、２μＬの１×ＰＢＳ中、０．１×１０６個のＧＢＭ－ＮＳを尾状核内（ｉ．ｃ．）注射する。座標は、ブレグマを基準として、０．７ｍｍ後、３ｍｍ左外側、３．５ｍｍ深さ、そして尾状核内である。腫瘍細胞注入後１５日目に、５μＬの１×ＰＢＳ中、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、同じ腫瘍座標を使用してｉ．ｃ．注射する。生存研究のため、マウスを週３回監視し、機関のガイドラインに準拠して不快の徴候が現れた時点で安楽死させる。
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）。ＭＲＩは、水平ボア前臨床スキャナ（ＢｉｏＳｐｅｃ ７０／２０ ＵＳＲ、ブルカー社（Ｂｒｕｋｅｒ）、エットリンゲン（Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ）、ドイツ）を用いて実行する。このシステムは、７Ｔ（１Ｈ周波数３００ＭＨｚ）の磁場強度、および２０ｃｍのボア径を有する。スキャナは、二次まで設定されたシムを内蔵したアクティブシールド型勾配システムを備えている。最大勾配振幅は４４０ｍＴ／ｍである。すべての取得は交差コイル構成で行い、高周波励起には７２ｍｍのリニアバードケージコイルを使用し、マウス脳表面コイルでシグナルを受信した。マウスを、１．５～２％のイソフルラン（６０：４０のＮ２Ｏ：Ｏ２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）、流量０．８Ｌ／ｍｉｎ）で麻酔する。麻酔の深さと試験中の動物の健康状態を検出するために、空気圧センサーによって呼吸数をモニターする。マウスを、ガス麻酔用のノーズコーンと三点固定装置（トゥース・バー（ｔｏｏｔｈ ｂａｒ）、耳栓）を備えた動物用ベッドに置く。ＧＢＭ－ＮＳを注射され、ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスを、以下のプロトコルを用いて異なる時点での高解像度ＭＲＩ調査にかける：Ｔ２強調ＲＡＲＥ（Ｔ２－ｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｒａｐｉｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｅｃｈｏｅｓ）シーケンス（ＴＲ＝３３６０ｍｓ、ＴＥ＝３５ｍｓ、面内分解能＝１００×１００ｕｍ２、スライス厚＝４００ｕｍ、４平均、全取得時間５分３６秒）、および２回のＴ１強調ＲＡＲＥシーケンス（ＴＲ＝５１０ｍｓ、ＴＥ＝８ｍｓ、面内分解能＝７８×７８ｕｍ２、スライス厚＝４００ｕｍ、６平均、全取得時間９分４７秒）を、ガドリウニウム系造影剤を腹腔内に投与する前および投与後のそれぞれの時点で取得。すべてのシーケンスは、スライスパッケージを嗅球より後方、小脳より前方として、同一のコロナル形状（４００ｕｍ厚の連続スライス）に沿って取得する。造影剤により誘起されるＴ１シグナル増強は、血液脳関門病変に起因するものと解釈される。
ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）のヒト化。マウスｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）のヒト化を、そのＣＤＲを安定なヒトフレームワークｒＦＷ１．４にグラフト化することによって実行する。Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：９０５４－９０６６（２０１０）を見られたい。ここで、ｒＦＷ１．４を指すＦＷの配列は、以下の通りである：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（配列番号７）＊ ＬＣＤＲ１ ＊
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号８）＊ ＬＣＤＲ２＊
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号９）＊ ＬＣＤＲ３＊
ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１０）
（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧ（配列番号１２）＊ＨＣＤＲ１＊
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ（配列番号１３）＊ ＨＣＤＲ２＊
ＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１４）＊ ＨＣＤＲ３＊
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）。
アスタリスクは、フレームワークのアミノ酸配列をＣＤＲ配列から分離している。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなるポリペプチドリンカーは、ＶＬおよびＶＨ鎖を結合するのに使用され、丸括弧で示されている。７６３．７４（Ａ）のヒト化バージョンは、ヒトフレームワーク残基を基本的に重要なマウス残基で置き換えることによって設計されている。Ｙｉｎ，Ｓ．，Ｄｉｎｇ，Ｆ．，ａｎｄ Ｄｏｋｈｏｌｙａｎ，Ｎ．Ｖ．２００７．Ｅｒｉｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：４６６－４６７を見られたい。
ｓｃＦｖ断片の発現および精製。対応する発現プラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を、適切な抗生物質を含むＬＢ培地中、３７℃で成長させる。タンパク質の発現は、１ｍＭのイソプロピル１－チオ－β－ｄ－ガラクトピラノシドを加えることにより、１の吸光度（Ａ６００）で開始される。誘導から４時間後、大腸菌細胞を採取し、超音波処理で破砕する。洗浄と遠心分離のステップを繰り返すことにより封入体を単離し、６ＭのグアニジンＨＣｌの存在下、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶化させる。可溶化された封入体を、２０ｍＭのジチオスレイトールを加えることにより還元する。リフォールディングを、リフォールディングバッファー（４Ｍの尿素、５０ｍＭのグリシン、２ｍＭのシステイン、ｐＨ１０．０）中、室温で一晩かけて行う。カットオフを１０ｋＤａとしたタンジェンシャルフローろ過を使用した濃縮およびバッファー交換の後、ｓｃＦｖを、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製する。
ｓｃＦｖの結合研究。結合研究は、フローサイトメトリーにより、ＣＳＰＧ４＋ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＣＳＰＧ４－ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を用いて実行する。それぞれｓｃＦｖ、ビオチン化タンパク質Ｌ、最後にストレプトアビジン－フィコエリトリンとともに細胞をインキュベートする。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））装置上で細胞を取得する。
ｓｃＦｖの安定性。ヒト化ｓｃＦｖを、ｐＨ－７．２のＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌで製剤化する。試料を４℃または３７℃で４８時間保存した後、目視検査し、タンパク質濃度を２８０ｎｍで測定する。試料はＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析し、全ピーク面積に対する単量体、二量体、高分子量オリゴマーの百分率を決定する。ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷＸＬカラム、相 ジオール、Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｃｍ×７．８ｍｍ、粒子径 ５μｍ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０８５４０）を、サイズ排除クロマトグラフィー用に使用する。１ｍｇ／ｍＬのｓｃＦｖを５μＬをロードする。移動相はｐＨ７．２のＰＢＳである。
統計分析。データは、平均±ＳＤとしてまとめる。処置群間の統計的有意差の判定には、スチューデントｔ検定または二元配置分散分析を使用し、適切な場合には多重比較のためのボンフェローニ補正を行う（Ｐｒｉｓｍ ６：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。生存率分析はカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）法を用いて実行し、マンテル・コックス・ログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ ｌｏｇ ｒａｎｋ）検定を適用する（Ｐｒｉｓｍ ６：グラフパッドソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））。０．０５未満のＰ値はすべて統計的に有意とみなす。結果
ｓｃＦｖのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ Ｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎ（ＦＷＲ））内のアミノ酸置換は、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達を抑制する。ＣＡＲは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）抗原を標的としており、その抗原結合部分が、インビトロおよびインビボの両方でＣＳＰＧ４を発現する腫瘍細胞を標的とした７６３．７４マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から得られたｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）である。Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）ａｎｄ Ｇｅｌｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ－４ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｂｏｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０：９６２－９７１（２０１４）を見られたい。しかし、ＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）ＣＡＲ（図１Ａ）を発現するＴ細胞は、抗原刺激の非存在下でＩＦＮγの放出を示し、これはＣＡＲ緊張性シグナル伝達（図１Ｂ）として定義されている現象である。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を見られたい。ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）ＣＡＲを発現するＴ細胞による自発的なＩＦＮγ放出は、ＣＡＲシグナル伝達に厳密に依存しており、これは、チロシンのリン酸化を防ぐＣＡＲ－ＣＤ３γ鎖の免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のチロシンの変異が、自発的なＩＦＮγ放出を完全に抑制するからである（図１Ｃおよび図７Ａ、Ｂ）。Ｔ細胞の細胞表面上でのＣＡＲ分子の分布を研究するために、ＣＡＲのＣＤ３ζ鎖をＣＯＯＨ末端のところでＧＦＰと融合させたｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）ＣＡＲを生成する。共焦点顕微鏡撮像を用いると、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）ＣＡＲがＣＡＲ架橋の非存在下で膜クラスターを形成していることが示され、ＣＡＲ分子の自己凝集を示している可能性が高い（図１Ｄ）。ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）の配列が、ヒトＣＳＰＧ４のペプチドエピトープを認識するマウスＩｇＧ１ ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ７６３．７４の初期継代から得られる。Ｒｅｉｎｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｒａｆｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｃＦｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：７４４－７５０（１９９９）を見られたい。ハイブリドーマの培養継代が、ハイブリドーマの成長速度および分泌された抗体の収量に影響を与えることは、充分に確立されている。Ｃｏｒｒｅａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ＭＲＳＡ ａｎｔｉ－ＰＢＰ２ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６８：４１９－４２７（２０１６）を見られたい。また、継代培養時に、ハイブリドーマに由来するサブクローンのＣＤＲとＦＷＲの両方においてアミノ酸置換が起こる可能性があることが記載されている。Ｘｉｎ ａｎｄ Ｃｕｔｌｅｒ，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｐａｓｓａｇｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｙ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｍａｎｎａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ，”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：４３１０－４３２１（２００６）を見られたい。この可能性に鑑み、７６３．７４ハイブリドーマの後期継代のＶＬおよびＶＨ領域は配列である。我々は、二つのＶＬとＶＨ配列を得、ＶＬとＶＨの両方のＦＷＲ（ＦＲ１、ＦＲ３）においてアミノ酸置換を特定した（図２Ａ）。ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）と呼ばれる新しいｓｃＦｖを集合化させ、新しいｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを生成し、得られた配列をｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）ＣＡＲと並べて比較して、緊張性シグナル伝達の証拠を求める。すべてのＣＡＲはＴ細胞中で等しく発現し（図２Ｂおよび図８Ａ）、ＣＡＲ－Ｔ細胞はインビトロで等しく増殖した（図８Ｂ）。しかし、ＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激細胞内領域のいずれかをコードするｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＩＦＮγの自発放出を示さなかった（図２Ｃ）。ＧＦＰタグＣＡＲの共焦点顕微鏡を用いて、Ｔ細胞膜上でのｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲのさらに均質な分布が観察されている（図１Ｄおよび図８Ｃ）。注目すべきは、抗イディオタイプｍＡｂ（ＭＫ２－２３ ｍＡｂ）の媒介によりＴ細胞中に発現したＣＡＲの架橋は、発現したｓｃＦｖのタイプにかかわらずＣＡＲ分子の著しいクラスター形成を引き起こしたこと、そしてさらに、共焦点顕微鏡によって特定されたクラスターがＣＡＲ凝集体の形成を実際に反映していることを示していることである（図８Ｄ）。ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）ＣＡＲまたはｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞の表現型分析では、記憶マーカーおよび消耗マーカーの発現に違いが示されないことから、臨床使用のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の製造に通常必要な１０～１４日間の培養中に緊張性シグナル伝達が消耗表現型を誘発しない場合のあることが示される（図８Ｅおよび図Ｆ）。Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ，” Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １２６：２５８８－２５９６（２０１６）；Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｆｔｅｒ ＣＤ３０－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １２７：３４６２－３４７１（２０１７）を見られたい。全体として、これらのデータは、ｓｃＦｖ抗体のＦＷＲ内のアミノ酸置換が、ＣＡＲフォーマットにおけるｓｃＦｖの自己凝集と、ＩＦＮγの基底放出として定義されるＴ細胞における緊張性シグナル伝達とを引き起こすのに充分であることを示している。
ｓｃＦｖのＦＷＲ内のアミノ酸置換は、タンパク質の不安定化を引き起こす。ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）とｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の間のアミノ酸の違いがｓｃＦｖの不安定化を引き起こすかどうかを研究するために、ホモロジーモデリングによるｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の立体配座と、インシリコ変異誘発に最適化された構造（図３Ａ）とを生成する。エリス（Ｅｒｉｓ）ツールを採用して、ＦＷＲ変異、Ｌ３Ｋ、Ｔ５Ｓ、Ａ９Ｓ、Ｅ８３Ｑ、Ｉ１２３Ｖ、Ｑ１２４Ｋ、Ｖ１２６Ｋ、Ｑ１２７Ｅ、およびＬ２３０Ｖが、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の構造に与える効果を明らかにする。エリスにより、上記の変異のΔΔＧｍｕｔをそれぞれ、２．４１、１．２６、２．２９、０．４７、０．７９、１．８７、４．５８、２．７０、０．６７ｋｃａｌ／ｍｏｌと見積もった（図３Ｂ）。詳細には、これらの変異は、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）の構造を不安定化させ（ΔΔＧｍｕｔ＞０）、次いで、ＣＡＲの自然凝集に影響を与えている。さらには、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）の構造の立体配座を相互検証するために、エリス分析を実行して、ＦＷＲ変異部位での変異の安定化（ΔΔＧｍｕｔ＜０）を特定している。分析からは、Ｅ８３Ｌ、Ｅ８３Ｉ、Ｔ５Ｍ、Ｑ１２４Ｍなどの変異の結果、ΔΔＧｍｕｔが負になることを示しており、その潜在的な安定化能力を知らしめている（図９）。さらには、Ｉ１２３およびＱ１２７などの残基が、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）構造の安定性に非常に重要であるとして特定される。Ｉ１２３またはＱ１２７の位置で他の１９個のアミノ酸のいずれかを置換することで、ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ｂ）構造が高度に不安定化し（ΔΔＧ＞０）、それによってタンパク質凝集が影響される（図３Ｃ）。全体として、これらのデータは、ｓｃＦｖ ｍＡｂのＦＲＷ内のアミノ酸置換が、タンパク質を不安定化させてｓｃＦｖの自己凝集を引き起こすこと、そして計算誘導分析をタンパク質構造の安定化に使用できることを示している。
ｓｃＦｖのＦＷＲ内のアミノ酸置換は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を増強する。ｓｃＦｖのＦＷＲ内のアミノ酸置換の効果は、悪性黒色腫細胞株ＷＭ１１５（ＣＳＰＧ４＋）およびＭ１４（ＣＳＰＧ４－）に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性に影響を与える（図１０Ａ）。ＩＦＮγの自発放出と並行して、４－１ＢＢを伴う７６３．７４（Ａ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と腫瘍細胞を１対５の比で播いた場合に、４日間の共培養終了時ではインビトロで腫瘍細胞を排除する能力が低下した（残存腫瘍細胞４３．６±２６．０％）（図４Ａ、Ｂ）。一方、ＣＤ２８共刺激は、７６３．７４（Ａ）ＣＡＲおよび７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲの両方で完全な腫瘍排除を可能にするように見えた（残存腫瘍細胞はそれぞれ２．２％±２．７％および２．９％±２．６％）。注目すべきは、４－１ＢＢ共刺激を伴う７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、４－１ＢＢを伴う７６３．７４（Ａ）ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較して抗腫瘍効果の向上を示すが、腫瘍細胞を完全には排除しない（残存腫瘍細胞１４．１％±８．０％、４３．６％±２６．０％）（図４Ａ、Ｂ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＳＰＧ４の発現が見られない悪性黒色腫細胞株Ｍ１４を排除しないことから、ＦＷＲ内のアミノ酸置換によって抗原特異性が影響を受けないことが示されている。注目すべきは、７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞のみが、検出可能量のＴｈ１サイトカイン類を、ＷＭ１１５腫瘍細胞を伴う培養上清中に一貫して放出したことである（図１０Ｂ）。７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲ－Ｔ細胞の優れた抗腫瘍効果は、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ ＷＭ１１５異種移植ＮＳＧマウスモデルを用いインビボで、より明らかである（図４Ｃ）。ＣＤ２８を有する７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍生物発光（図４Ｄおよび図１０Ｃ）および腫瘍サイズ（図４Ｅ）の両方として測定される最も顕著な抗腫瘍効果を示している。７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の増強された機能を、我々が先に記載した膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍モデルにおいて確認するが、この腫瘍モデルでは、ヌードマウスに原発性ＧＢＭ由来ニューロスフィア（ＧＢＭ－ＮＳ）を脳に移植し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍内接種を通じて処置する。Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ＴＮＦａｌｐｈａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１０（２０１８）（“Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．２０１８”）を見られたい；図５Ａを見られたい。このモデルでは、腫瘍の生着および進行を、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって監視する。対照Ｔ細胞、またはＣＤ２８をコードする７６３．７４（Ａ）ＣＡＲを発現するＴ細胞を用いて処置されたマウスにおける急速な腫瘍進行が観察され、これらの動物では、腫瘍塊が全半球を占め、対側の半球に浸潤している（図５Ｂ、Ｃ）。ＣＤ２８をコードする７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞を用いて処置されたマウスは、より小さくより境界明瞭な病変によって示されているとおり、最も明白な抗腫瘍効果を示した（図５Ｄ）が、しかし腫瘍抑制は、それほど劇的な抗腫瘍効果ではないにしても、４－１ＢＢをコードする７６３．７４（Ａ）ＣＡＲまたは７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞を用いて処置されたマウスにも観察されている（図５Ｅ、Ｆ）。４－１ＢＢをコードする７６３．７４（Ａ）または７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、対照Ｔ細胞を用いて処置したマウスと比較して、生存期間を延長させた（ｐ＜０．０００１）。しかしながら、ＣＤ２８をコードする７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞が、生存期間の延長において最も有効であった（ＣＴＲに対しｐ＜０．０００１；４－１ＢＢを用いた７６３．７４（Ａ）に対しｐ＝０．０４、４－１ＢＢを用いた７６３．７４（Ｂ）に対しｐ＝０．０１）。１１０日より長く生存するマウスがいないので、ＣＤ２８をコードする７６３．７４（Ａ）ＣＡＲを発現するＴ細胞の活性が中等度であることが観察される。Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ ｅｔ ａｌ．２０１８（図５Ｇ）。このＧＢＭモデルにおけるＣＤ２８をコードする７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞の顕著な抗腫瘍効果をさらに特性評価するために、頭蓋内注入直後のＴ細胞の活性化状態を調査する。ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後、２、４、６、１２、２４、４８時間後に腫瘍塊を摘出する。ＣＤ２８を有する７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、接種後２時間以内にＣＤ６９を増加させているのが観察され（４２．５±２．１％のＣＤ６９＋Ｔ細胞）、２４時間の間、高いＣＤ６９レベル（２２．５±１．５％のＣＤ６９＋Ｔ細胞）を維持しており、これはＣＤ２８細胞内領域をコードするＣＡＲ－Ｔ細胞の高速の活性を示すこれまでの報告と整合している。Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８：４１５－４２８（２０１５）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０２０を見られたい。（図５Ｈ）。インビトロでの追加の実験は、ＣＤ２８を有する７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞の速やかな抗腫瘍効果をさらに実証している（図１１）。
ｓｃＦｖのＦＷＲのヒト化は、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達を抑制する。マウス由来のｓｃＦｖのヒト化は、ＣＡＲに対する体液性応答およびＴ細胞応答を防止するために提案された戦略である。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＨＥＲ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：Ｒ６１（２０１４）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７：２７５ｒａ２２（２０１５）を見られたい。ｓｃＦｖのマウスＦＷＲをヒトＦＷＲで置換することで、ＣＡＲ緊張性シグナル伝達を抑制できる可能性がある。７６３．７４（Ａ）の配列と、安定なヒトフレームワークｒＦＷ１．４を配向させ、基本的に重要なアミノ酸が特定された。Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｔｏ ｓｔａｂｌｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：１８４－１９９（２００４）を見られたい。ｒＦＷ１．４配列に変異を伴わない一つのＣＤＲグラフトと、非常に重要な領域に最高２４個の変異を伴う七つのバリアントを、操作の第１ラウンドで設計した（図１２Ａ）。ヒト化ｓｃＦｖバリアント単独（すなわちＣＡＲの細胞外領域のみ）および野生型マウスｓｃＦｖを、大腸菌内に発現させ、リフォールディングし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。野生型マウスｓｃＦｖバリアントは、凝集に起因してリフォールディングが不可能であった。したがって、我々は、それを可溶性の形態で精製することができなかった。この結果は、マウス７６３．７４（Ａ）ｓｃＦｖが不安定であることをさらに示唆している。ｒＦＷ１．４に変異を伴わないヒト化バリアントが発現しているが、ＣＳＰＧ４に結合しない。他のほぼすべてのヒト化ｓｃＦｖ変異体は、正常に発現し、ＣＳＰＧ４＋細胞と結合することができる。次の操作ラウンドでは、最小数の７６３．７４（Ａ）マウスＦＷ残基を有するヒト化バリアントを、さらにＶＨおよびＶＬの鎖シャッフリングにかける。合計２６個のヒト化ｓｃＦｖが産生される。最小数のマウスＦＷＲ残基を有しＣＳＰＧ４結合活性を保持する４つのヒト化ｓｃＦｖ（ｈ７６３．７４＃２、ｈ７６３．７４＃３、ｈ７６３．７４＃４、およびｈ７６３．７４ ＃５）を、さらなる研究用に選択する（図１２Ｂ）。ＣＤ２８細胞内領域を有する四つのヒト化ｓｃＦｖ ７６３．７４（Ａ）すべてを有するＣＡＲを生成し、腫瘍細胞とのインビトロ共培養実験を実行する。ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５を発現するＴ細胞は、より優れた抗腫瘍活性と、インビトロでのＩＦＮγおよびＩＬ－２の高い産生の傾向を示したので、さらなる研究用としてこれを選択する（図１２Ｃ～Ｅ）。選択された２つのヒト化ｓｃＦｖ ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５（図１３Ａ）を特性評価するために、精製した可溶性ｓｃＦｖを用いた保存安定性研究を実行する。タンパク質を１ｍｇ／ｍｌで準備し、４℃および３７℃で４８時間保存する。インキュベーション後、試料をＳＥＣによって分析して、単量体タンパク質の百分率を見積もる。試験された条件下では、検出可能なタンパク質損失は観察されず、単量体の百分率は９１％～９７％より高い値のままであった（図１３Ｂ）。この方法は、選択された４つのヒト化ｓｃＦｖすべてが、試験された条件下で単量体であって、４℃および３７℃での保存時に二量体化または凝集しないことを実証している。Ｔ細胞におけるｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５の発現は適切であり（図６Ａおよび図１４Ａ）、Ｔ細胞はＩＦＮγの自発放出を示していない（図６Ｂ）。ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５を発現するＴ細胞は、インビボでＣＳＰＧ４＋ ＷＭ１１５悪性黒色腫細胞の成長を正常に抑制した（残存腫瘍細胞はそれぞれ１１％±１５％、１０％±１７％）一方、ＣＳＰＧ４－ Ｍ１４悪性黒色腫細胞株は標的にしておらず、抗原特異性が維持されていることを示している（図６Ｃおよび図１４Ｂ）。ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５を発現するＴ細胞の抗腫瘍活性は、ＩＦＮγおよびＩＬ－２の特異的産生によって裏付けられている（図１４Ｃ）。異種ＷＭ１１５悪性黒色腫マウスモデルにおいて、ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５を発現するＴ細胞を、ＣＤ２８細胞内領域をコードする７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較している（図６Ｄ）。ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５を発現するＴ細胞は、強力な抗腫瘍活性を示した（図６Ｅ、図１４Ｄ）。さらに、Ｔ細胞は、異なる時点で処置されたマウスの末梢血（図１４Ｅ）、および安楽死時の肝臓および脾臓（図６Ｆ）において検出可能であり、Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現を保持している（図６Ｇ）。注目すべきは、ｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃２およびｈ７６３．７４．ＣＡＲ＃５を発現するＴ細胞が、ＣＤ２８を有する７６３．７４（Ｂ）ＣＡＲと比較して、ＰＤ－１の発現増加を示していないことである（図１４Ｆ、Ｇ）。全体として、これらのデータは、特異的な抗腫瘍効果を維持するＣＡＲ分子の緊張性シグナル伝達を排除するのにｓｃＦｖのヒト化が使用できることを示している。

Claims (20)

  1. 配列番号１から３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、
    配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；
    配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；
    配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および
    配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）と
    を含んでなる可変軽鎖配列；ならびに
    配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、
    配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；
    配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；
    配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および
    配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）と
    を含んでなる可変重鎖配列、
    を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に対する結合特異性を有する結合メンバー。
  2. 前記軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）が、配列番号１５３から１５８からなる群から選択され；
    前記軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）が、配列番号２２２から２２５からなる群から選択され；
    前記軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）が、配列番号２２６から２３１からなる群から選択され；
    前記軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）が、配列番号２５０から２５５からなる群から選択され；
    前記重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）が、配列番号３４７から３４９からなる群から選択され；
    前記重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）が、配列番号３５０から３５３からなる群から選択され；
    前記重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）が、配列番号３５４から３６０からなる群から選択され；
    前記重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）が、配列番号３６１から３６２からなる群から選択される、
    請求項１に記載のＣＳＰＧ４に対する結合特異性を有する結合メンバー。
  3. 前記可変軽鎖配列が、配列番号６７から１０９からなる群から選択される配列を含んでなり、前記可変重鎖配列が、配列番号１１０から１５２からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１に記載のＣＳＰＧ４に対する結合特異性を有する結合メンバー。
  4. 配列番号１から３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、
    配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；
    配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；
    配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および
    配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）と
    を含んでなる可変軽鎖配列、を含んでなるポリペプチドをコードする核酸。
  5. 配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、
    配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；
    配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；
    配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；
    および配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）と
    を含んでなる可変重鎖配列、を含んでなるポリペプチドをコードする核酸。
  6. 配列番号１～３に記載の軽鎖相補性決定領域（「ＬＣＤＲ」）ＬＣＤＲ１からＬＣＤＲ３の配列と、
    配列番号１５３から２２１からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列１（ＶＬ－ＦＲ１）；
    配列番号２２２から２２５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列２（ＶＬ－ＦＲ２）；
    配列番号２２６から２４９からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列３（ＶＬ－ＦＲ３）；および
    配列番号２５０から２５５からなる群から選択される軽鎖フレームワーク配列４（ＶＬ－ＦＲ４）と
    を含んでなる可変軽鎖配列；ならびに
    配列番号４から６に記載の重鎖相補性決定領域（「ＨＣＤＲ」）ＨＣＤＲ１からＨＣＤＲ３の配列と、
    配列番号２５６から３４９からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列１（ＶＨ－ＦＲ１）；
    配列番号３５０から３５３からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列２（ＶＨ－ＦＲ２）；
    配列番号３５４から３６０からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列３（ＶＨ－ＦＲ３）；および
    配列番号３６１から３８２からなる群から選択される重鎖フレームワーク配列４（ＶＨ－ＦＲ４）と
    を含んでなる可変重鎖配列、
    を含んでなる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる細胞外領域配列；膜貫通領域配列；および細胞内領域配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列をコードする核酸配列を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  7. 前記膜貫通領域が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０，１２４８７）、ＣＤ３－ζ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１９；１２５０３ ＣＤ２４７）、ＣＤ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２０、１２５０４）、ＣＤ８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９２４、１２５２５）、ＣＤ１６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２１４；１４１３１；Ｆｃｇｒ３）、ＮＫｐ４４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３６、ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４３７、１７０８６、ＮＣＲ１）、ＮＫＧ２ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９１４；２７００７ ＫＬＲＫ１）からなる群から選択される、請求項６に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  8. 前記細胞内領域配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば、４－１ＢＢ、またはＣＤ１３７）、ＣＤ２４７（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１９、ＣＤ３－ζ）、２Ｂ４（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７４４、ＣＤ２４４）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ １０８７０、例えばＤＡＰ１０）、および膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）からなる群から選択される、請求項６に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  9. Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対するタンパク質配列をコードする配列をさらに含んでなる、請求項６に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  10. Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対する前記タンパク質配列と、最高三つの追加のタンパク質コード配列とを含んでなるポリタンパク質をコードする、請求項９に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  11. Ｗｎｔシグナル伝達経路における転写活性化因子に対する前記タンパク質配列および最高三つの追加のタンパク質コード配列が、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって分離されている、請求項９に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  12. 前記自律的リボソーム内自己プロセシングが、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ））２Ａ配列、または関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ｃｉｓ ａｃｔｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＨＹＳＥＬ））である、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  13. 前記転写活性化因子が、リンパ球エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、ベータ－カテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（ａｌｔ．ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（ａｌｔ．ＴＣＦ１）、ＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）からなる群から選択される、請求項９に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  14. 前記ＬＥＦ１が、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）番号ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  15. 成長因子に対する少なくとも一つのタンパク質コード配列をさらに含んでなる、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  16. 前記成長因子が、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  17. 成長因子に対する前記タンパク質コード配列が、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によって前記ＣＡＲコード配列から分離されている、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  18. 前記細胞外領域配列が、スペーサー領域をさらに含んでなる、請求項６に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  19. 前記細胞内領域が、ＣＤ３－ゼータ鎖にインフレームで融合した４－１ＢＢのシグナル配列を含んでなる、請求項６に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
  20. ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含んでなり、ｓｈＲＮＡ配列が、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場に埋め込まれている、請求項６に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクト。
JP2022581554A 2020-06-29 2021-06-29 キメラ抗原受容体の緊張性シグナル伝達を減少させる方法および組成物 Pending JP2023532347A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063045646P 2020-06-29 2020-06-29
US63/045,646 2020-06-29
PCT/US2021/039672 WO2022006147A1 (en) 2020-06-29 2021-06-29 Methods and compositions for the reduction of chimeric antigen receptor tonic signaling

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023532347A true JP2023532347A (ja) 2023-07-27

Family

ID=77071752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022581554A Pending JP2023532347A (ja) 2020-06-29 2021-06-29 キメラ抗原受容体の緊張性シグナル伝達を減少させる方法および組成物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230242666A1 (ja)
EP (1) EP4172213A1 (ja)
JP (1) JP2023532347A (ja)
KR (1) KR20230037574A (ja)
CN (1) CN115867584A (ja)
AU (1) AU2021300112A1 (ja)
CA (1) CA3184394A1 (ja)
WO (1) WO2022006147A1 (ja)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPS6412935A (en) 1987-07-02 1989-01-17 Mitsubishi Electric Corp Constant-speed travel device for vehicle
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
WO2016077638A1 (en) * 2014-11-12 2016-05-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-chondroitin sulfate proteoglycan 4 antibodies and uses thereof
WO2016164429A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 The General Hospital Corporation Anti-cspg4 chimeric antigen receptors
WO2019240935A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for chimeric antigen receptor targeting cancer cells

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230037574A (ko) 2023-03-16
AU2021300112A1 (en) 2023-02-16
EP4172213A1 (en) 2023-05-03
WO2022006147A1 (en) 2022-01-06
CA3184394A1 (en) 2022-01-06
CN115867584A (zh) 2023-03-28
AU2021300112A8 (en) 2023-02-23
US20230242666A1 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7451627B2 (ja) キメラ受容体及びその使用方法
KR102223873B1 (ko) 단일 도메인 항체에 기반한 bcma 키메라 항원 수용체 및 응용
JP7333104B2 (ja) Ｂ７－ｈ３に対するモノクローナル抗体および細胞治療におけるその使用
JP7280827B2 (ja) Ａｘｌまたはｒｏｒ２に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法
JP7048494B2 (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
AU2021221880A1 (en) Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US20210277119A1 (en) Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
JP2022533621A (ja) 認識分子を含む操作された免疫細胞
JP2022521750A (ja) カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
JP7203904B2 (ja) 抗ｃｃｒ４抗体を用いてサイトカイン発現を媒介する方法
US20230242638A1 (en) Chimeric antigen receptor targeting cldn18.2 and use thereof
CN114026122A (zh) 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2024514246A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用
JP2021536256A (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
JP2022542443A (ja) 多発性骨髄腫治療用の抗ｂｃｍａ ｃａｒ ｔ細胞
JP2022501074A (ja) 血液腫瘍を治療するための遺伝子操作しているγδ−Ｔ細胞及び遺伝子操作していないγδ−Ｔ細胞に関する組成物及び方法
CN116284389A (zh) 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途
US20230242666A1 (en) Methods and Compositions for the Reduction of Chimeric Antigen Receptor Tonic Signaling
WO2024140641A1 (zh) 靶向ror1的抗原结合蛋白
WO2023134718A1 (zh) 靶向gprc5d的嵌合抗原受体及其用途
US11802159B2 (en) Humanized anti-GDNF family alpha-receptor 4 (GRF-alpha-4) antibodies and chimeric antigen receptors (CARs)
WO2024035341A1 (en) Cd30 antigen-binding molecules
JP2024522279A (ja) ＣＤ３００ｃ抗原またはその受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体
WO2024035342A1 (en) B7-h3 antigen-binding molecules

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240628