KR20120021713A - Ｌ１ｃａｍ의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암 치료용 약학적 조성물 및 ｌ１ｃａｍ을 이용한 담낭암의 성장 또는 전이 억제, 진단 및 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L1CAM의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암 치료용 조성물 및 L1CAM을 이용한 담낭암의 성장 또는 전이 억제, 진단 및 치료방법에 관한 것으로, 구체적으로, L1CAM은 담낭암의 종양 특히, 그 침윤적 경계면(invasive front)에서 고발현되고, 세포 성장, 이동, 침윤, 부착, 및 세포 내 신호전달의 강화를 통하여 담낭암 종양의 증식에 중요한 역할을 수행하며, L1CAM이 잠재적으로 종양의 성장을 촉진시키고, 동물 모델에서 담낭암 세포의 종양형성능을 갖는 것을 확인함으로써, L1CAM을 담낭암 진단에 유용한 마커로 활용할 수 있으며, L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제은 담낭암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｌ１ＣＡＭ의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암 치료용 약학적 조성물 및 Ｌ１ＣＡＭ을 이용한 담낭암의 성장 또는 전이 억제, 진단 및 치료방법{A pharmaceutical composition for treating gallbladder carcinoma containing expression or activity inhibitors of L1CAM as an effective ingredient, a method for inhibiting growth or invasion of gallbladder carcinoma and a method for diagnosing and treating gallbladder carcinoma using L1CAM}

본 발명은 L1CAM의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암의 치료용 약학적 조성물, 및 L1CAM을 이용한 진단 및 치료방법에 관한 것이다.

담낭관이라고 하는 가느다란 나선상의 관을 매개로 하여 담즙을 일시적으로 저장해 두는 주머니상의 부분을 담낭이라고 하고, 담낭 및 담낭관에서 생기는 암을 담낭암이라고 한다. 담낭암은 우리나라 전체 암의 약 1.3% 정도를 차지하며 전체 소화기암의 3-4%를 차지하는 것으로 알려져 있으며, 주로 50세 이상의 중년 노년층에서 5?9%의 발병률을 보이며 50세 이하의 발병률은 0.3?0.7%이다. 여성이 남성보다 3배 가량 발병률이 높으며 발병원인은 아직 밝혀지지 않았으나 일반적으로 오랫동안 담낭결석에 의한 감염과 관계가 있는 것으로 추측되고 있다. 담낭암에 있어 5년 생존율은 2?5 %이고, 3년 생존율은 6.9?14.3%이며, 수술적 절제술 후에도 그 생존률이 12%에 불과하다. 초기 담낭암에 있어서, 완벽한 절제술이 효과가 있음에도 불구하고, 대부분의 진행된 단계의 담낭암은 수술 후에도 자주 재발하고, 화학요법 및 방사선 치료의 결과 또한 예후가 좋지 않다. p53 및 KRAS의 돌연변이와 같은 초기 암과 관계된 몇 가지 분자적 메카니즘이 세포-주기 조절의 소실을 설명해주고 있지만, 아직까지 발암의 진행과 연관된 인자들은 여전히 불명확한 실정이다.

또한, 담낭암의 주요 치료방법은 수술적 요법이나, 담낭암은 진행속도와 전이가 비교적 빠르기 때문에 담낭암으로 인한 증상들이 나타날 때는 수술요법의 시기를 놓친 이후가 많아, 담낭암 환자의 생존률은 절반에도 미치지 못하고 있는 실정으로, 담낭암을 조기에 진단할 수 있는 방법이 무엇보다 중요하다. 하지만, 현재 담낭암 진단을 위하여 임상에서 사용되는 검사들은 초음파검사, 전산화단층촬영, 자기공명영상, 내시경적 초음파검사 및 양성자방출단층촬영 등의 담낭암 특이적 진단이 아닌 일반적 암 진단 방법이다. 또한, 담낭암 특이적 혈청종양표지자로 가장 흔히 쓰이고 있는 CA19-9는 특이도가 낮고, 조기 암에서는 정상인 경우가 많아 조기진단에 사용할 수 없을 뿐 아니라, 췌장암을 포함한 소화기계의 암에서 모두 상승될 수 있으며 악성 종양이 없는 담관염과 담도폐색이 있는 경우에도 상승할 수 있다는 단점이 있다. 따라서, 담낭암을 진단할 수 있는 새로운 마커의 개발이 시급할 뿐 아니라, 아직까지 담낭암 특이적으로 효과적인 항암제가 존재하지 않으므로, 이를 위한 치료제의 개발 또한 필요한 실정이다.

한편, L1CAM(L1 cell adhesion molecule)은 막통과 당단백질 제 1형으로, 면역글로불린 수퍼패밀리의 하나로, 6 개의 면역글로불린 유사 도메인과 5 개의 피브로넥틴(fibronectin) 제 3형 반복, 단일 통과 막통과 도메인, 및 세포질 내 꼬리를 포함하는 세포외 영역으로 이루어져 있다. L1CAM은 일반적으로 신경세포에서 발현되고 신경계와 세뇨관의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 또한 조혈 세포, 내피 세포 및 창자샘 세포와 같은 다양한 정상 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 그 기능은 명확하게 밝혀지지 않았다. 최근의 연구에서 L1CAM의 세포질내 도메인이 종양 세포의 성장, 이동 및 침윤에 기여하는 세포외 신호 조절 키나제(ERK) 및 ERK 조절 발현 유전자의 활성에 의한 발암에 중요한 역할을 하고, ERK, AKT 및 FAK의 활성은 종양 세포에서 L1CAM에 의해 유도되는 생존과 연관된다는 것이 밝혀졌다. 또한, L1CAM은 세포와 다양한 종류의 ECM 단백질 및 그 수용체(인테그린(integrin))의 이종 상호작용간 동종친화성 결합을 유도하고, 이것은 L1CAM이 세포와 ECM의 상호작용의 유도에 의한 암의 진행과 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 수용체 티로신 키나제(RTK) 패밀리와 L1CAM 기능과의 관계에 대해서도 보고되었다. 전장 L1CAM 및 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 간 직접적 상호작용이 밝혀지지는 않았지만, 난소암에서 FGFR의 활성은 L1CAM에 의해 유도된 세포 증식 및 침윤과 분명히 연관되어 있음이 확인되었다. 단백질 분해효소 절단을 통해 세포 표면으로부터 나온 L1CAM의 세포외 도메인이 인테그린(integrin)과 자가분비(autocrine)/주변분비(paracrine) 결합을 통해 종양 세포의 전이와 생존을 유도한다는 것이 밝혀졌으며, 이것은 L1CAM에 직접적으로 결합하는 항체가 L1CAM의 기능을 방해할 수 있다는 사실을 제시한다.

또한, 최근의 연구에서 L1CAM의 발현이 신경교종, 흑색종, 자궁내막 및 난소암, 대장암, 신장암, 신경내분비암 및 간외담관암을 포함한 몇 가지 악성 종양에서 확인되고, 그 발현이 종양의 진행과 전이에 연관된다는 것이 증명되었다. 특히, L1CAM의 발현이 난소암, 대장암 및 간외담관암 환자에서 나쁜 예후와 짧은 생존을 확인하는 데 유용한 마커임이 밝혀졌으나, 아직까지 담낭암에서 L1CAM의 발현과 임상적 효과에 대해서는 연구된 바 없으며, 더욱이 담낭암의 성장과 전이에 중요하게 작용하는지도 알려져 있지 않으며, L1CAM이 고발현되어 있는 담낭암 환자의 사망률이 저발현되어 있는 담낭암 환자의 사망률보다 더 높은지, 즉 L1CAM이 담낭암의 나쁜 예후 인자임이 아직 알려지지 않았으며, 더욱이 L1CAM의 shRNA 또는 L1CAM을 인지하는 항체가 담낭암의 증식이나 전이를 억제함으로써 치료제로서 가능성이 있다는 사실은 아직 알려지지 않았다.

유럽 특허출원 EP 1 172 654 A1 및 미국 특허출원 US 2004/0259084호는, L1CAM이 난소암, 자궁내막암 또는 그러한 암의 소인의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후를 위해 환자의 샘플에서 L1CAM의 항체를 통해 L1CAM 수준을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체 및 그 부분을 결합시켜 충분한 양으로 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나 이 문헌들은 단지 L1CAM 단백질이 체액 또는 조직에서 난소암 또는 자궁내막암의 매우 특이적인 마커임을 기재하고 있을 뿐이다.

미국 특허출원 US 2004/0115206호는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 암세포 사멸을 유도하는 제제, 세포 사멸을 위해 상기 항체를 사용하는 수단 및 L1CAM 항체가 포함된 약제학적 조성물에 관하여 개시하면서, 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉(contacting)시키는 것에 의해 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다. 그러나 이 문헌 역시 L1CAM이 발현되는 암의 예로서 유방암, 대장암, 자궁경부암에 대해서만 언급하고 있고, 인 비트로 시험만 했을 뿐 인 비보 결과는 뒷받침되어 있지 않으며, 담낭암과의 관련성에 대해서는 언급하고 있지 않다. 또한, 항 L1CAM 항체를 암세포에 접촉시킴으로써 세포 성장 억제 및 세포 사멸을 유도하는 것에 대해서만 개시하고 있을 뿐, 암세포의 이동, 침투 및 전이를 억제할 수 있다는 것은 개시하고 있지 않다.

또한, 국제출원 PCT/EP2005/008148은 난소 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기능을 억제하여 암세포의 이동 및 진전을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다. 그러나 이 문헌 역시 단지 난소암 및 자궁내막암에서 세포 표면 또는 수용성 형태의 L1CAM이 암세포의 이동을 촉진한다는 것에 대해서만 기재하고 있을 뿐이다.

대한민국 특허출원 KR 10-2007-0084868에서는 담도암에서 L1CAM이 고발현되어 담도암의 성장과 전이에 중요하게 작용하고, L1CAM의 발현율이 높을수록 담도암 환자의 사망률이 높으며, L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 항체나 siRNA가 담도암 세포의 성장, 침윤을 감소시키는 것을 통해, L1CAM이 담도암 치료의 유용한 타겟이 될 수 있음에 대해 밝힘으로써, L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 담도암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물로 이용할 수 있음에 대해 기재하고 있다.

담낭도 담도계의 일환으로 넓은 의미로는 담낭암과 담도암이 유사하게 판단될 수 있으나, 그 발생 부위가 완전히 다르고, 이로 인한 증상과 경과에 차이가 있으며, 여러 측면에서 암의 특성에 차이가 있기 때문에 담낭암과 담도암은 분명히 차이가 있는 다른 암이다. 또한, 단백질이 암세포에서 발현되는 것만으로 상기 단백질이 암의 예후 인자일 것임은 쉽게 유추할 수 있는 것이 아니고, 이와 같은 발현 및 암의 예후와의 관련성은 암 종류마다 다름이 종래에 잘 알려져 있으므로, 담도암과 담낭암에서 L1CAM의 고발현 양상이 동일하게 나타나, 이를 암의 예후 인자로 이용할 수 있음은 예측하기 어렵다.

요컨대, 종래 공지된 문헌들에는 L1CAM이 담낭암에서 높은 발현율로 발현되고, 담낭암에 특이적인 나쁜 예후 인자(poor prognositic factor)로서 작용하며, 따라서 L1CAM에 대한 shRNA 또는 항체와 같이 L1CAM의 활성을 억제하는 물질은 특히 담낭암에 대해 탁월한 진단 또는 치료 효과를 가질 수 있음에 대해서는 전혀 개시하지 않고 있다.

이에, 본 발명자들은 L1CAM이 담낭암의 종양 특히, 그 침윤적 경계면(invasive front)의 63.8%에서 고발현되고, 시험관 내에서 세포 성장, 이동, 침윤, 부착, 및 세포 내 신호전달의 강화를 통하여 담낭암 종양의 증식에 중요한 역할을 수행한다는 것을 확인하였고, L1CAM이 잠재적으로 종양의 성장을 촉진시키고, 동물 모델에서 담낭암 세포의 종양형성능을 갖게 함을 확인하였다. 또한, L1CAM 발현과 다양한 종류의 임상병리학적인 인자 간 연관성 분석을 통해 L1CAM 발현이 높은 조직학적 등급과 현저하게 연관되고, 병리학적 T 단계 및 임상학적 단계를 증진시키고, 정맥/림프의 침윤을 양성화하며, L1CAM의 발현이 무재발 생존 기간동안의 위험 인자에 독립적임을 확인하였다. 이를 통해 L1CAM이 환자의 생존을 예측할 수 있는 유용한 진단 마커로 활용할 수 있고, L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제이 담낭암을 치료하기 위한 약학적 조성물의 유효성분으로 효과적으로 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L1CAM의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 L1CAM을 이용한 담낭암의 성장 또는 전이 억제, 진단 및 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L1CAM(L1 cell adhesion molecule)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) L1CAM의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 L1CAM의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 L1CAM의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, L1CAM의 발현 억제제를 선별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) L1CAM에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 L1CAM의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 L1CAM의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 L1CAM의 활성 억제제를 선별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체 유래 시료에서 L1CAM의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

2) L1CAM의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 담낭암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 담낭암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 L1CAM은 담낭암 세포에서 고발현하고, 이의 발현 또는 활성 억제제는 담낭암의 성장, 전이 및 침윤을 억제하므로, L1CAM의 발현 또는 활성 억제제는 담낭암의 치료를 위한 약학적 조성물에 효과적으로 응용될 수 있을 뿐 아니라, L1CAM 발현이 환자의 생존을 예측할 수 있는 유용한 마커가 될 수 있으므로, L1CAM의 발현을 담낭암의 진단에 응용할 수 있다.

도 1은 담낭암에서 L1CAM 발현 확인을 위한 면역화학염색을 수행한 결과이다;
(A) 정상 담낭 상피세포에서 L1CAM이 검출되지 않았음을 나타냄;
(B) 내부 대조군으로써 말초신경에서 L1CAM이 면역염색됨을 나타냄;
(C-E) L1CAM의 발현이 종양의 침윤적 경계면에서 현저히 검출됨을 나타냄; 및
(F) L1CAM이 담낭암의 세포막에 두드러지게 위치함을 나타냄.
도 2의 A 및 E는 L1CAM이 담낭암 세포의 성장을 조절 효과가 있음을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. CTL은 대조군을 가리킨다. 도 2의 B 및 F는 세포 증식 분석의 결과를 나타낸 것으로, 안정적인 형질전화체는 1%(B 및 F) 또는 3%(F) FBS를 포함하는 2 ml 배지에서 6 웰 디쉬에 2×10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하고 도면에 나타낸 시간(B) 또는 72시간(F)동안 배양한 후, 살아있는 세포를 세포 카운터로 수를 세어 나타내었다. 도 2의 C 및 G는 [³H]Thymidine incorporation 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2의 D 및 H는 연한천 배지 콜로니 생성 분석법의 결과를 나타낸 것이다. 각 실험은 세 번의 독립된 실험을 두 개로 하여 수행하였으며, 결과는 CTL sh(B 내지 C) 또는 mock(E 내지 F)와 대비하여 평균±표준편차;^**P <0.01로 나타내었다.
도 3의 A 내지 C는 L1CAM이 담낭암 세포의 전이, 침윤 및 접착 분석을 수행한 결과를 나타낸다(A 내지 C). 세 번의 독립된 실험을 두 개로 반복하여 수행하였으며, 결과는 CTL sh (A 내지 C) 또는 mock (B 내지 D)와 대비하여 평균±표준편차;^**P <0.01로 나타내었고, mock 군에 대비하여 ^* P <0.05로 나타내었다. 도 3의 D는 SNU308 세포의 세포외 매트릭스 단백질에 접착하는 것에 있어서 L1CAM 과발현 효과를 그래프로 나타낸 결과이다. M은 mock을 나타내고, 결과는 세 개의 동일한 실험의 평균값±표준편차로 나타내었다.
도 4는 담낭암 세포에서 세포내 신호전달 분자의 활성에 대한 L1CAM의 효과를 나타낸 결과이다;
(A) 1% FBS가 포함된 배지에 접종된 안정적인 형질전환체. 48시간 후에, FAK, AKT, 및 ERK의 인산화를 분석하였다. 블랏은 3 번의 개별적인 실험으로 나타내었다;
(B) 덴시토메트릭(densitomeric) 분석은 P-FAK:FAK, P-AKT:AKT, 및 P-ERK:ERK의 상대적 비로 나타내었다.
도 5는 담낭암 이종이식 마우스 모델에서 L1CAM shRNA의 종양 성장 억제 효과를 나타낸 결과이다;
(A 및 D) 종양 성장은 나타낸 일수에서 모니터링되었으며, 8 마리 동물의 결과를 평균 종양 크기 ±표준편차로 나타내었다. CTL sh 군과 비교하여 ^** P <0.01이고, mock 군에 대비하여 ^* P <0.05 로 계산하였다;
(B) 담낭암 베어링(bearing) 마우스; 및
(C) 생존률 분석.
도 6은 69명의 담낭암 환자에서 L1CAM의 발현과 생존율의 상관관계를 나타낸 결과이다. 전체 생존율(A)과 무재발 생존율(B)의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 L1CAM의 발현에 따라 로그 순위검정/통계법과 비교하여 위치한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 L1CAM(L1 cell adhesion molecule)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 L1CAM은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 L1CAM의 발현 억제제는 L1CAM 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 L1CAM의 활성 억제제는 L1CAM에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, "shRNA"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop) 사이에 두고 위치한 짧은 헤어친 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 최근 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있으며, 일반적으로 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 조성물에 포함되는 siRNA를 제조하는 방법에는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brumme lkamp TR 등, Sciecne 296:550-553) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(DIcer or Rnase III)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

상기 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 MRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 L1CAM 유전자의 MRAN에 상보적인 안티센스 올리고머이다.

상기 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 키메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함되는 것이 바람직하며, L1CAM에 대한 단일클론항체인 A10-A3 또는 4-63, 공지의 항체 UJ127 및 이들의 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 A10-A3 및 항체는 각각 수탁번호 KCTC10909BP 및 KCTC 10966BP에 의해 분비되어 생산된다.

상기 항체는 L1CAM을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab'₂) 및 Fv 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 담낭암 조직에서 L1CAM을 인지할 수 있는 항체를 이용한 면역화학염색을 통하여, 담낭암 환자의 63.8%에서 L1CAM에 면역양성 반응을 나타냄을 확인하였고(표 1), 정상 담남 세포에서는 검출되지 않는 L1CAM이 종양의 침윤적 경계면에서 진하게 염색되었음을 확인하였으며(도 1 참조), 이를 통해 L1CAM이 담낭암 세포주에서만 특이적으로 과발현되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, L1CAM의 shRNA를 이용한 발현 저해 및 과발현을 유도하고, 이러한 발현 변화가 담낭암 종양 증식에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 세포 증식 분석 및 [³H] 티미딘 인코포레이션 분석, 및 연한천 배지 콜로니 생성 분석법을 수행하고, 이를 통해 L1CAM이 담낭암의 성장을 조절할 수 있고, L1CAM의 발현 억제는 담낭암의 성장을 억제시킬 수 있음을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, L1CAM이 담낭암 세포의 전이, 침윤 및 부착에 대해 어떠한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 투과웰 필더 분석을 통한 담낭암 세포주의 이동 및 침윤을 확인하고, 여러가지 매트릭스 구성성분에 대한 세포 접착 분석을 수행하였으며, 이를 통해, 담낭암 세포에서 L1CAM의 발현이 이동, 침윤 및 접착에 중요한 역할을 수행함을 확인하였다(도 3 참조)

또한, 본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, L1CAM의 발현이 담낭암 세포 내 신호전달 분자의 인산화에 대해 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, L1CAM의 발현이 조절된 담낭암 세포주에서 각 신호전달 인자를 인식할 수 있는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하고, 이를 통해, L1CAM이 FAK 및 AKT의 인산화를 조절할 수 있으며, L1CAM의 억제는 담안남 세포의 FAK, AKT의 인산화를 억제함을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, 담낭암 이종이식 마우스 모델을 이용한 종양 발생시 L1CAM의 생체 내 효과를 확인하였으며, 이를 통해, L1CAM이 담낭암의 성장 및 종양생성능을 증진시키는 강력한 잠재력을 가지고 있음을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, L1CAM의 발현과 임상 병리학적 인자 및 생존율간 상관 관계를 통계학적으로 분석한 결과, L1CAM의 발현이 전체 생존율 및 무재발 생존율을 현저히 감소시킴을 확인하고(도 6 참조), L1CAM의 발현이 환자의 생존을 예측할 수 있는 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였으며(표 2 내지 4 참조), 이러한 결과는 현재 담낭암의 진단에 사용되고 있는 임상학적 단계보다 통계학적으로 더 유의적임을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 L1CAM의 활성 및 발현을 억제하는 물질은 L1CAM과 결합하여 암세포의 성장, 전이를 차단시킴으로써, 담낭암을 치료할 수 있을 뿐 아니라, 이의 투여를 통하여 암세포 표면 항원인 L1CAM에 결합시켜 이를 인지하는 면역세포가 암세포를 포식, 자살 또는 살해시킴으로써 담낭암을 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 성인 남성을 60 kg으로 가정하였을 때(미국 FDA 기준) 0.738 ug ~ 7.38 g이며, 바람직하게는 7.38 ug ~ 0.738 g (12.3 mpk)이며, 이틀에 한번 투여하는 것이 바람직하나 투여 방법은 환자 필요에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 공지의 치료제를 직접 또는 간접적으로 결합시키거나, 함께 포함시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소 및 이중특이적 항체 등을 포함되나, 본 발명의 조성물에 포함되는 치료제는 이에 한정되는 것은 아니며, 항체와 결합시킬 수 있거나 항체, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 투여하여 암 치료 효과를 얻을 수 있는 공지의 치료제라면 모두 가능하다.

상기 방사선핵종에는 ³H, ¹¹C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I 및 ¹⁸⁶Re 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 약제 및 독소에는 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신,카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플로오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 L1CAM 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 담낭암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명의 L1CAM은 담낭암의 종양 특히, 그 침윤적 경계면(invasive front)에서 고발현되고, 세포 성장, 이동, 침윤, 부착, 및 세포 내 신호전달의 강화를 통하여 담낭암 종양의 증식에 중요한 역할을 수행하며, L1CAM은 잠재적으로 종양의 성장을 촉진시키고, 동물 모델에서 담낭암 세포의 종양형성능을 가지므로, L1CAM의 발현 또는 활성 억제제는 담낭암의 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) L1CAM의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 L1CAM의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 L1CAM의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, L1CAM 발현 억제제를 선별하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 L1CAM은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏(western blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은

1) L1CAM에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 L1CAM의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 L1CAM의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 L1CAM의 활성 억제제를 선별하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 L1CAM은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은

1) 피검체 유래 시료에서 L1CAM의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

2) L1CAM의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 담낭암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 담낭암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 L1CAM은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 L1CAM은 담낭암의 종양 특히, 그 침윤적 경계면(invasive front)에서 고발현되고, 세포 성장, 이동, 침윤, 부착, 및 세포 내 신호전달의 강화를 통하여 담낭암 종양의 증식에 중요한 역할을 수행하며, L1CAM은 잠재적으로 종양의 성장을 촉진시키고, 동물 모델에서 담낭암 세포의 종양형성능을 가짐을 확인하였다. 또한, L1CAM shRNA를 이용하여, 실제 담낭암의 억제 효과가 있음을 확인하였을 뿐 아니라, L1CAM 발현이 높은 조직학적 등급과 현저하게 연관되고, 병리학적 T 단계 및 임상학적 단계를 증진시키고, 정맥/림프의 침윤을 양성화하며, L1CAM의 발현이 무재발 생존 기간동안의 위험 인자에 독립적임을 확인함하였다. 이를 통해 L1CAM의 발현 또는 억제 변화를 확인함으로써 L1CAM의 발현 또는 활성 억제제를 선별할 수 있을 뿐 아니라, L1CAM 발현 수준을 확인함으로써 담낭암의 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 암세포주 제작 및 배양

경미하게 분화된 담낭암으로부터 확립된 JCRB1033 세포 및 잘 분화된 담낭암으로부터 확립된 SNU-308 세포는 각각, 10% 우태아 혈청(Hyclone)이 포함된 William's 배지(invitrogen) 및 RPMI1640 배지(Invitrogen)에서 배양하였다. 모든 세포는 37℃에서 95% 습도, 5% CO₂의 조건에서 유지하였다.

<실시예 2> 담낭암 환자 및 샘플의 조직학적 등급 분류

<2-1> 환자 및 샘플

담낭암 환자의 조직을 얻기 위하여, 충남대학교 병원에서 1998년 1월부터 2009년 3월까지 사이에 절제술을 받은 담낭암 환자 69명(30명 남자 및 39명 여자)에 대하여 각각 조사를 수행하였다. 환자의 평균 나이는 67세였고(범위, 35-87), 모든 표본은 통상적으로 10% 포르말린(formaline)으로 고정하고, 파라핀에 임베디드하였다. 모든 암은 악성 종양으로 진단되었고, 담낭에서 유래한 원발성 종양으로 확인되었다. 종양의 단계는 미국공동암위원회(American Joint committee on Cancer (AJCC))의 시스템에 따라 분류하였다.

<2-2> 조직학적 등급

담낭암 조직은 통상적인 H&E 염색에 의해 수행하였다. 표본은 세계 보건 기구(WHO) 분류법에 따라 잘 분화된 종양(G1), 경미하게 분화된 종양(G2), 잘 분화되지 않은 종양(G3) 및 분화가 되지 않은 종양(G4)으로 분류하였다. 그 결과, 9개는 잘 분화되었고, 42개는 경미하게 분화되었으며, 17개는 잘 분화되지 않았고, 한개는 분화되지 않은 종양임을 확인하였다.

<실험예 1> 담낭암 조직에서 L1CAM의 발현 확인

담낭암 증식에서 L1CAM의 기능을 분석하기 위하여, 9명의 잘 분화된 종양, 44명의 경미하게 분화된 종양, 17명의 거의 분화되지 않은 종양, 및 1명의 분화가 되지 종양을 포함한, 69명의 담낭암 환자로부터 종양 표본의 면역화학염색법에 의해 L1CAM의 발현을 평가하였다.

구체적으로, L1CAM의 면역화학염색은 Envision-HRP 검출 시스템(Dakocytomation, Carpinteria, CA) 및 대한민국 공개특허 2008-0018149에 기재된 것과 동일한 방법으로 제조된 A10-A3, L1CAM에 대한 쥐과 단일클론 항체를 이용하여 수행하였다. 4℃에서 A10-A3와 반응하는 조직 절편을 제외한 모든 과정은 상온에서 수행하였으며, 종양 조직으로부터 잘라낸 4 um 두께의 절편은 슬라이드에 마운팅(mount)하고, 56℃에서 1-2시간동안 건조한 다음, 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거하고, 파라핀이 제거된 조직 절편을 알코올로 다시 수화시켰다. target retrieval solution(DAKOCytomation s1699)으로 압력솥에서 4분 동안 항원 검색을 한 후, 내인성 과산화효소를 막을 수 있도록 조직 절편을 3% 과산화수소로 10분 동안 처리하였다. 이후, 절편은 백그라운드 감소 희석제(background reducing diluent, DakoCytomation s3022)로 희석한 A10-A3(80 ng/ml)와 습기가 있는 챔버(chamber)에서 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 슬라이드는 DAB 크로모젠(chromogen)으로 5분 반응시킨 후에 Envision 반응액과 30분 동안 반응시킨 다음, Mayer's hemotoxylin으로 대조염색하고, 마운팅(mount)하였다. 일차 항체를 제외하고 마우스 IgG1 대조군이 음성 대조군으로 사용된 반면, 절편에 존재하는 말초 신경 번들(bundle)이 내부 양성 대조군으로 사용되었다. 암 세포의 5% 이상이 L1CAM 면역염색되었을 때, L1CAM에 대해 면역양성 반응을 보이는 것으로 간주하였다.

그 결과, 담낭암 환자의 63.8%에서 L1CAM에 면역양성반응을 나타냄을 확인하였다(표 1). 또한, L1CAM 발현은 정상 담낭의 상피세포에서는 검출되지 않았고(도 1A), 침윤적 종양 경계면에서 L1CAM이 진하게 염색되었으며(도 1C-1E), L1CAM은 대부분 담낭암의 세포막(도 1F) 또는 내부 양성 대조군인신경 섬유(도 1B)에 위치하고 있음을 확인하였다(도 1).

따라서, L1CAM은 정상 담낭의 상피세포에서는 검출되지 않지만, 담낭암 세포주에서 과발현된다는 것을 확인하였다.

<실험예 2> L1CAM shRNA에 의한 담낭암 세포의 성장 억제 효과 확인

상기 <실시예 1>의 L1CAM을 고발현하는 JCRB1033 및 L1CAM을 발현하지 않는 SNU-308 세포주를 이용하여, L1CAM이 담낭암의 종양 증식에 어떠한 역할을 수행하는지 확인하였다.

<2-1> L1CAM 녹다운(knock-down) 및 L1CAM의 과발현 유도

L1CAM의 녹다운(knock-down)은 Mission RNAi 시스템 클론(Sigma-aldrich)을 사용한 렌티바이러스 벡터에 의해 유도되는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 간섭에 의해 유도되었다.

L1CAM의 과발현을 위해, 인간 L1CAM의 비신경계 동종체를 암호화하는 cDNA를 합성하고 이를 렌티바이러스 벡터(마크로젠, 한국)내로 서브클로닝하였다. 안정적인 형질전환제를 제조하기 위하여, 상기 벡터를 제조사의 방법에 따라, 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용한 벡터 패키지를 통해 HEK293T 세포내로 도입하였다. 다음 날, 상기 세포의 상등액에서 제조된 바이러스를 5 ug/ml 폴리브렌(polybrene)과 함께 JCRB1033 또는 SNU-308 세포에 첨가하였다. 24시간 후에, 상기 배지를 제거하고, 1.2 ug/ml의 퓨로마이신(puromycin)이 포함된 새로운 배지로 교체하였다. 퓨로마이신이 있는 배지에서 1주일동안 배양에 의해 퓨로마이신에 내성을 갖는 클론을 선별하였다.

<2-2> 웨스턴 블랏 분석

JCRB1033 세포주에는 L1CAM shRNA를 처리하고, SNU-308 세포주에는 L1CAM 전장을 발현시킨 다음, 각 세포로부터 얻은 세포 용해물을 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로 웨스턴 블랏은 세포 용해물을 SDS-PAGE를 수행하고, 겔 내 단백질 밴드를 PCDF 막(Chemicon)으로 전달한 다음, 상기 막을 일차 항체와 반응시킨 후, HRP가 접합되어 있는 이차 항체(Santa Cruz)와 반응시키고, 화학발광 기질(GE Life Sciences)를 이용하여 면역반응 밴드를 시각화하였다.

그 결과, L1CAM을 고발현하는 세포주였던 JCRB1033 세포주는 L1CAM shRNA 처리에 의해 L1CAM을 낮은 농도로 발현하였고, L1CAM을 발현하지 않는 SNU-308 세포주는 L1CAM 전장의 발현에 의해 L1CAM을 높은 농도로 발현하는 것을 확인하여, L1CAM의 shRNA 및 L1CAM 전장은 L1CAM의 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다(도 2A 및 도 2E).

<2-3> 세포 증식 분석 및 [ ³ H]티미딘 인코포레이션 분석

세포 증식 분석은 세포(2 X 10⁵/ml)를 1% 또는 3% 우태아 혈청이 포함된 2 ml 배지에서 6-웰 디쉬에 시딩(seeding)하고, 24시간 후, 살아있는 세포는 세포 개수기(Innovatis AG, 독일)로 카운팅하여 수행하였고, 상기 결과의 통계학적 분석은 스튜던트 t(Student's t) 검정법을 사용하여 평가하였다.

[³H]티미딘(Thymidine) 인코포레이션(incorporation) 분석법은 Min JK, Han KY, Kim EC, Kim YM, Lee SW, et al. (2004) Capsaicin inhibits in vitro and in vivo angiogenesis. Cancer Res 64(2): 644-651에 기재된 방법에 의해 수행되었다.

구체적으로, 담낭암 세포는 1% 우태아혈청이 포함된 배지가 들어있는 24-웰 플레이트에 2 ×10⁴ 세포/웰의 농도로 시딩하였고, 36시간 후, [³H]티미딘 0.5uCi/ml로 6시간 동안 반응시켰다. 고분자 DNA를 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 4℃에서 30분간 처리하여 침전시켰다. 세포는 차가운 H₂O로 두 번 세척하고, 0.2N NaOH/0.1% SDS로 용해하였다. ³H 방사능은 액체 신틸레이션(scintillation) 카운터로 측정하였다.

그 결과, L1CAM의 안정적인 제거는 JCRB1033 세포의 성장 속도와 DNA 합성을 현저한 감소를 유발하였고, 반면에, L1CAM을 과발현한 세포의 성장 속도와 DNA 합성은 그렇지 않은 세포에 비하여 훨씬 빨랐다(도 2F 및 2G). 이러한 효과는 10% FBS를 첨가하였을 때는 나타나지 않았고, 낮은 혈청 조건에서 관찰되었다.

<2-4> 연한천 배지 콜로니 생성 분석법

추가적으로, 담낭암 세포의 콜로니 형성능에서 L1CAM의 효과를 측정하기 위하여 시험관 내(in vitro) 연한 한천(soft agar) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 앵커리지-비의존적(Anchorage-independent) 성장 분석은 세포 형질전환 어쎄이 키트(Cell biolabs, 미국)로 CytoSelect^TM 96 웰에서 수행하였다. 매트릭스(base agar matrix) 레이어(layer) 사이에 있는 세포 부유액 아가 매트릭스(agar matrix)에 10% 우태아 혈청을 포함한 DMEM에 JCRB1033 세포(5 X 10⁴) 또는 SNU-308 세포(1 X 10⁵)를 분주하였다. 2주 후에, 아가 매트릭스(agar matrix)를 용해시키고 MTT 용액으로 세포를 염색한 다음, 570nm의 흡광도에서 플레이트 리더로 결과를 측정하였다.

그 결과, L1CAM을 하향조절한 경우, 담낭암 세포의 성장이 감소하였고, 반면에 L1CAM을 상향조절한 경우, 그 성장이 증가하였다(도 2D 및 2H).

따라서, L1CAM 발현의 조절은 암세포의 성장에 영향을 미침을 확인하였고, L1CAM의 과발현은 암세포의 성장을 증가시키고, 반대로 L1CAM의 억제는 암세포의 성장을 저해하는 것을 확인하였다.

<실험예 3> L1CAM shRNA에 의한 담낭암 세포의 전이, 침윤 및 부착 억제 효과 확인

<3-1> 전이 및 침윤 분석

투과웰 필터 분석(transwell filter assay)을 통한 담낭암 세포주의 이동 및 침윤을 확인하였다. 담낭 세포의 전이 및 침윤에 대한 분석은 6.5mm 지름의 폴리카보네이트(polycarbonate) 필터(8 um 기공 크기)를 가진 트랜스웰(Transwell, Corning Costar, Cambridge, MA)을 사용하여 수행하였다.

구체적으로, 필터의 낮은 표면은 전이 분석을 위해 10 ug의 젤라틴으로 코팅하고, 위쪽 부분은 침윤 분석을 위해 25ug의 재구성된 하부 막 물질로 코팅하였다(Matrigel; BD Biosciences). 2% 우태아혈청(JCRB1033) 또는 5% 우태아 혈청(SNU-308)이 포함되어 있는 새로운 배지를 하층 웰에 놓았다. 담낭 세포는 1% 우태아혈청이 포함된 배지에서 24시간동안 배양하고, 트립신 처리하여, 1% FBS가 포함된 배지에 최종 농도가 1 x 10⁶ 세포/ml의 농도가 되도록 재부유하였다. 세포 부유액 100ul를 상층 웰의 각각에 로딩(loading)하고, 챔버(chamber)를 37℃에서 전이를 위해서는 18시간 또는 침윤을 위해서는 24시간 동안 배양하였다. 세포는 고정한 다음 H&E로 염색하였다. 필터 상층 표면의 비전이(nonmigrating) 세포는 면봉으로 닦아 제거하였다. 키모탁시스(chemotaxis)는 광학현미경(x200)으로 확인되는 필터의 하층 부분에 전이된 세포를 개수하여 정량하였다. 각 어쎄이마다 8개 부분을 무작위로 선별하여 개수하였다.

<3-2> 세포 접착 분석

L1CAM의 과발현이 세포외 매트릭스 (matrix) 단백질의 세포 부착에 어떠한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 96 웰 배양 플레이트에 정제된 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 및 비트로넥틴(vitronectin)을 2ug/ml로 코팅하고 37℃에서 18시간동안 반응시켰다. 이후 웰을 PBS로 세척하고, 1% BSA가 포함된 무혈청 RPM11640 배지에서 2X10⁴ 세포와 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 세 번 세척하여 결합하지 않은 세포를 제거하였다. 접착된 세포는 WST1 어쎄이(assay)를 통해 측정하였다.

구체적으로, 세포를 WST1 반응액(Roche, Cincinnati, OH)과 37℃에서 30분간 반응시키고, 450nm의 흡광도에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.결과는 세번 실험의 평균±표준편차 값으로 나타내었다.

그 결과, 안정적인 L1CAM의 녹-다운(knock-down)은 CTL sh 세포와 비교했을 때, 이동성이 현저히 감소했고, CTL sh 세포보다 매트리겔(matrigel)에 코팅된 필터를 통한 침윤이 줄어들었다. SNU-308 세포에서 L1CAM의 과발현은 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 및 비트로넥틴(vitronectin)과 같은 매트릭스 구성성분의 이동 및 접착을 증가시켰다(도 3A 및 도 3B).

따라서, 담낭암 세포에서 L1CAM의 발현이 세포의 성장, 이동, 침윤력 및 접착력에 중요한 역할을 할 것이라는 것을 확인하였다.

<실험예 4> L1CAM shRNA에 의한 담낭암 세포 내 신호전달 분자 활성 억제 효과 확인

최근의 연구에서 L1CAM이 종양 증식에 관여하는 다양한 신호 전달 체계의 활성화에 의해 암에서 역할을 수행한다는 것이 증명되었고, 사실상, ERK, AKT, 및 FAK 키나제(kinase)는 종양 세포의 성장, 전이, 침윤 및 생존을 전달하는데 관여하는 중요한 신호전달 인자로서, L1CAM을 통한 신호전달에도 관련하는 것이 알려져 있다. 이를 통해 본 발명자들은 L1CAM의 녹다운(knock-down) 또는 과발현 세포에서 이러한 신호 분자들의 인산화에 L1CAM이 어떠한 효과를 나타내는지 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였다.

구체적으로, 웨스턴 블랏은 세포로부터 얻은 세포 용해물 또는 면역침전물을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 겔 내 단백질 밴드를 PVDF 막(Chemicon)으로 전달하였다. 상기 막은 각 신호전달 인자를 인식할 수 있는 일차 항체(cell signaling)와 반응시킨 후, HRP가 접합되어 있는 이차 항체(Santa Cruz)와 반응시키고, 화학발광 기질(GE Life Sciences)를 이용하여 면역반응 밴드를 시각화하였다.

그 결과, L1CAM 녹다운(konck-down) 세포에서는 FAK 및 AKT의 인산화가 억제된 반면, L1CAM이 과발현된 세포에서는 FAK 및 AKT의 인산화가 증진되었다. 하지만, ERK의 인산화에서는 L1CAM에 의한 인산화 변화가 관찰되지 않았다(도 4).

이러한 결과는, 세포외 신호전달에서 L1CAM의 영향이 암종에 따라 다르게 나타날 수 있음을 나타낸다.

<실험예 5> 담낭암 이종이식 마우스 모델에서 L1CAM shRNA의 종양 성장 억제 효과 확인

종양 발생에서 L1CAM의 효과를 생체 내(in vivo)에서 확인하기 위하여, 담낭암 이종이식 마우스 모델을 제조하였다.

구체적으로, 6주령된 누드 마우스를 Charles River 연구실(Boston, MA, USA)로부터 입수한 다음, 무균 조건에서 한국생명공학연구원의 동물 보호 위원회의 지침에 따라 사육하였다. JCRB1033 세포(5 X 10⁶) 또는 SNU-308 세포(1 X 10⁷)를 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사한 다음, 캘리퍼스(caliper)로 종양의 길이와 폭을 측정하고, 수학식: 크기=0.523Lw ²의 공식으로 종양 크기를 계산하여 3-7일 간격으로 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 성장하는 것(종양 크기>2000　mm³)을 30일 동안 모니터링함으로써, 살아있는 마우스의 퍼센트를 측정하였다. 생존 곡선은 세포의 주입 후 시간에 따라(Kaplan-Meier 생존 함수) 그렸고, Log-rank 테스트 분석법을 통하여 유의한 차이가 있는지 분석하였다(StatView software; Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA, USA). 생존에서의 차이는 P값이 <0.05일 때, 통계학적으로 유의하다고 간주하였다.

그 결과, 대조군 shRNA가 형질도입된 세포와 비교하여 L1CAM이 녹다운된 세포가 이식된 마우스에서 종양 성장의 현저한 지연이 관찰되었다. 세포를 주사한지 20일 후에, 대조군으로 shRNA를 주사한 마우스의 평균 종양 크기는 1580.4±360 mm³에 달했으나, L1CAM shRNA를 주사한 마우스에서는 434.8±251 mm³였으며, 종양 크기에서 73%(P < 0.05)의 현저한 감소에 이르렀다(도 5A 내지 도 5D). L1CAM 녹다운에 의해 주어진 생존기간 제고효과(survival advantage)가 대조군과 대비하여 통계학적으로 유의하게 나타났으며(CTL sh군에 대비하여 P<0.05), L1CAM 과발현 세포를 접종한 모든 마우스에서 종양이 형성된 반면, 이를 처리하지 않은 마우스에서는 종양이 형성되지 않음을 확인하였다(도 5D).

따라서, 이러한 결과는 L1CAM이 담낭암의 성장 및 종양생성능을 증진시키는 강력한 잠재력을 가지고 있다는 것을 나타낸다.

<실험예 6> 통계학적 상관 관계 분석

<6-1> L1CAM 발현과 임상병리학적 인자 간 상관 관계

L1CAM의 발현과 담낭암 환자의 예후에 영향을 줄 수 있는 다양한 임상병리학적 인자들간의 상관관계를 분석하였다.

구체적으로, 통계학적 분석은 카테고리별 변이에 대한 그룹의 비교는 χ² 분석 또는 선형 대 선형 결합(linear by linear association)을 사용하여 분석하였으며, 평균값은 개별 샘플의 T-test 또는 일원분산분석(one-way ANOVA)를 수행하여 비교하였다. 분석 결과는 P<0.05일 때, 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였으며, 모든 통계학적 분석은 SPSS 버전 16.0 통계 분석 소프트웨어 프로그램으로 수행하였다.

그 결과는 하기의 [표 1]에서 요약한 바와 같다. [표 1]에서 보는 바와 같이, L1CAM 음성 및 L1CAM 양성 군 간에 연령 및 성별에 따른 차이는 없었지만, 잘 분화된 담낭암에 비해 경미하거나 거의 분화되지 않은 담낭암에서 L1CAM의 발현이 현저하게 높았으며(P < 0.01), 이것은 L1CAM 발현과 담낭암의 조직학적 등급 간 상관 관계가 있음을 나타내는 결과이다. 또한, L1CAM의 발현은 진행된 병리학적 T 단계, 진행된 임상학적 단계, 및 양성 정맥/림프 침윤과 현저히 연관되어 있는 반면, 림프절 전이, 원격 전이, 및 신경주위 침윤과 같은 다른 임상병리학적 인자들은 L1CAM의 발현과 현저하게 연관되어 있지 않았다.

카테고리	L1		P
	음성	양성
	수 (%)	수 (%)
연령(세)	65.5±1.9	67.8±1.6	0.792
성별
남성	9 (36.0%)	21 (47.7%)	0.345
여성	16 (64.0%)	23 (52.3%)
조직학적 등급
G1	7 (28.0%)	2 (4.5%)	0.01
G2	14 (56.0%)	28 (63,6%)
G3	4 (16.0%)	13 (29.5%)
G4	0 (0.0%)	1 (2.3%)
G1	7 (28.0%)	2 (4.5%)	0.009
G2+G3+G4	18 (72%)	42 (95.5%)
병리학적 T 단계
T1	11 (44.0%)	5 (11.4%)	0.132
T2	7 (28.0%)	25 (56.8%)
T3	5 (20.0%)	13 (29.5%)
T4	2 (8.0%)	1 (2.3%)
T1	11 (44.0%)	5 (11.4%)	0.002
T2+T3+T4	14 (56.0%)	39 (88.6%)
임상학적 단계
I	18 (72.0%)	20 (45.4%)	0.408
II	4 (16.0%)	20 (45.5%)
III	0 (0.0%)	1 (2.3%)
IV	3 (12.0%)	3 (6.8%)
I	18 (72.0%)	20 (45.5%)	0.033
II+III+IV	7 (28.0%)	24 (54.5%)
임파절 전이
음성	21 (84.0%)	30 (68.2%)	0.253
양성	4 (16.0%)	14 (31.8%)
원격 전이
음성	22 (88.0%)	41 (93.2%)	0.66
양성	3 (12.0%)	3 (6.8%)
정맥/임파 침윤
음성	13 (52.0%)	11 (25.0%)	0.024
양성	12 (48.0%)	33 (75.0%)
신경주위 침윤
음성	13 (52.0%)	20 (45.5%)	0.601
양성	12 (48.0%)	24 (54.5%)

<6-2> L1CAM의 발현과 생존 간 상관 관계

담낭암에서 L1CAM의 발현의 임상학적 효과를 추가로 조사하기 위해서, 담낭암 수술일로부터 사망일까지를 전체 생존기간으로, 수술일로부터 이미징 모달리티(imaging modality)를 통해 최초 재발이 확정된 날까지를 무재발 생존기간으로 정의하여, L1CAM의 발현 수준을 포함한 다양한 임상병리학적 인자에 따른 전체 생존기간 및 무재발 생존기간을 비교하였다. 그 결과를 하기의 [표 2]에 나타내었다.

카테고리	생존 기간		무재발 생존기간
	(개월)		(개월)
	평균	P	평균	P
연령
< 67세 (n=34)	27.76±5.0	0.364a	21.97±4.5	0.734 a
≥ 67세 (n=35)	27.74±4.7		27.77±4.7
성별
남성 (n=30)	19.77±4.7	0.225 a	18.00±4.7	0.446 a
여성 (n=39)	28.26±4.9		23.03±5.0
조직학적 등급
G1 (n=9)	59.11±14.8	0.001b	59.11±14.8	<0.001 b
G2 (n=42)	21.21±3.7		16.62±3.1
G3 (n=17)	15.82±3.4		12.12±2.5
G4 (n=1)	3		2
G1 (n=9)	59.11±14.3	<0.001 a	59.11±14.3	<0.001 a
G2+G3+G4 (n=60)	19.38±2.8		15.10±2.3
병리학적 T 단계
T1 (n=16)	41.25±10.0	0.055 b	41.12±10.0	0.005 b
T2 (n=32)	20.72±3.9		15.38±2.6
T3 (n=18)	18.94±5.9		14.44±5.7
T4 (n=3)	10.33±3.2		9.33±2.7
T1 (n=16)	41.25±10.0	0.007 a	41.12±10.0	<0.001 a
T2+T3+T4 (n=53)	19.53±3.1		14.72±2.5
임상학적 단계
I (n=38)	30.47±5.2	0.165 b	27.66±5.0	0.128 b
II (n=24)	18.29±5.0		13.42±4.4
III (n=1)	45		17
IV (n=6)	8.33±1.7		8.00±1.6
I (n=38)	30.47±5.2	0.057 a	27.66±5.0	0.019 a
II+III+IV (n=31)	17.32±4.0		12.48±3.4
림프절 전이
음성 (n=51)	28.92±4.4	0.032 a	24.75±4.2	0.042 a
양성 (n=18)	12.22±2.8		9.78±1.9
원격 전이
음성 (n=63)	26.06±3.7	0.161 a	22.06±3.5	0.224 a
양성 (n=6)	8.83±1.7		8.00±1.6
정맥/임파 침윤
음성 (n=24)	34.21±7.5	0.040 a	34.08±7.5	0.002 a
양성 (n=45)	19.42±3.3		13.78±2.5
신경주위 침윤
음성 (n=33)	27.48±5.8	0.422 a	27.18±5.8	0.060 a
양성 (n=36)	21.89±4.0		15.03±3.0
L1CAM
음성 (n=25)	39.20±7.8	0.001 a	35.64±7.7	<0.001 a
양성 (n=44)	16.25±2.4		12.43±1.7

상기 [표 2]에서 보는 바와 같이, 전체 생존기간과 무재발 생존 기간에 연령 및 성별에 따른 영향은 없었다. 하지만, 조직학적 등급, 진행된 병리학적 T 단계, 임상학적 단계, 림프절 전이, 양성 정맥/임파 침윤, 및 L1CAM의 발현에서 높은 양상을 지닌 환자들은 짧은 생존률과 매우 높은 상관관계를 나타내었다.

또한, 담낭암 환자의 평균 생존 시간은 37 개월이었으며(범위, 1- 1117개월), L1CAM 발현에 따른 생존 곡선은 도 6에 나타내었다.

L1CAM 음성 및 L1CAM 양성에서 전체 생존율은 각각 45.9% 및 15.4%이고(도 6A, P=0.016), L1CAM 음성 및 L1CAM 양성에서 무재발 생존율은 각각 48.4% 및 19.4%였다(도 6B,P=0.012)(도 6). Kaplan-Meier 법을 통한 이러한 분석은 임상 결과에서 L1CAM 발현의 현저한 효과를 명확히 보여준다.

전체 생존 기간 및 무재발 생존기간에 관한 단변량 및 다변량 분석을 수행하기 위하여, 몇 가지 변수로 분류하였으며, 다양한 예후 인자의 임상학적 중요성이 생존 및 재발에 영향을 주는지 평가하기 위하여, 단변량 분석을 수행하였다.

그 결과, 하기의 [표 3]에서 요약한 바와 같이, 진행된 병리학적 T 단계(P=0.009), 진행된 임상학적 단계(P=<0.0001), 임파선 전이(P=0.001), 원격 전이(P=0.001), 양성 정맥/임파 침윤(P=0.001), 양성 신경주위 침윤(P=0.010), 및 L1CAM 발현(P=0.017)이 담낭암 환자의 전체 생존 기간에 영향을 주는 통계학적으로 유의한 위험 인자임을 확인하였다.

카테고리	총적인 생존율			무재발 생존율
	HR	95% CI	P	HR	95% CI	P
노년기 (≥67)	0.613	0.300-1.253	0.179	0.7	0.317-1.543	0.376
여성	0.683	0.334-1.396	0.296	1.078	0.474-2.452	0.857
조직학적 등급 (G2+G3+G4)	35.295	0.920-1353.826	0.055	41.48	0.769-2236.526	0.067
병리학적 T 단계 (T2+T3+T4)	6.901	1.621-29.373	0.009	12.222	1.639-91.151	0.015
임상학적 단계 (II+III+IV)	4.205	1.959-9.027	<0.001	4.386	1.893-10.165	0.001
임파절 전이	3.837	1.758-8.374	0.001	1.859	0.711-4.858	0.206
원격 전이	7.5	2.271-24.770	0.001	4.119	1.037-16.358	0.044
정맥/임파 침윤	11.874	2.790-50.533	0.001	10.504	2.431-45.383	0.002
신경주위 침윤	2.909	1.287-6.576	0.01	8.468	2.507-28.607	0.001
L1CAM 양성	2.903	1.212-6.954	0.017	3.502	1.269-9.668	0.016

무재발 생존기간의 경우에 있어서, 진행된 병리학적 T 단계(P=0.015), 진행된 임상학적 단계(P=0.001), 원격 전이(P=0.044), 양성 정맥/임파 침윤(P=0.002), 양성 신경주위 침윤(P=0.001) 및 L1CAM 발현(P=0.016)은 통계학적으로 유의한 위험 인자임을 확인하였다.

이러한 다양한 인자들의 독립적인 예후의 효과를 확인하기 위하여, Cox의 비례위험 모델을 이용한 다변량 분석을 수행하였다. 본 발명에서 잘 분화된 담낭암 조직의 수가 적어 어떠한 의미있는 하위분석을 할 수 없기 때문에 다변량 분석에서부터 조직학적 등급 변수는 제외시켰다.

원격 전이(위험비 (HR), 4.479; 95% 신뢰 구간 (CI), 1.101-18.231), P=0.036) 및 양성 정맥/임파 침윤(HR, 35.582; 95% CI, 1.002-1263.712, P=0.050)를 나타내는 다변량 분석은 짧은 전체 생존률을 예측하는 독립적인 위험 인자이다.

무재발 생존율의 경우에 있어서, 진행된 임상학적 단계(HR, 3.091; 95% CI, 1.043-9.160, P=0.042) 및 L1CAM 발현(HR, 3.503; 95% CI, 1.148-10.689, P=0.028)은 짧은 무재발 생존 기간을 예측하는 독립적인 위험 인자였다(표 4).

카테고리	총적인 생존율			무재발 생존율
	HR	95% CI	P	HR	95% CI	P
병리학적 T 단계 (T2+T3+T4)	0.204	0.006-6.914	0.377	1.551	0.095-25.188	0.758
임상학적 단계 (II+III+IV)	1.366	0.491-3.802	0.551	3.091	1.043-9.160	0.042
임파절 전이	1.258	0.453-3.494	0.66	0.529	0.157-1.782	0.304
원격 전이	4.479	1.101-18.231	0.036	3.71	0.737-18.672	0.112
정맥/임파 침윤	35.582	1.002-1263.712	0.05	0.741	0.039-13.942	0.841
신경주위 침윤	0.647	0.225-1.861	0.42	4.796	0.594-38.750	0.141
L1CAM 양성	1.766	0.675-4.672	0.244	3.503	1.148-10.689	0.028

따라서, 상기 결과들을 통해, L1CAM 발현이 환자의 생존을 예측할 수 있는 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였고, L1CAM의 발현에 있어 통계학적으로 유의적인 효과는 현재 널리 사용되고 있는 임상학적 단계보다 더 유의적인 것임을 확인하였다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사제의 제조

L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

5. 환의 제조

L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

6. 과립의 제조

L1CAM의 발현 또는 활성을 억제제 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명을 통해 L1CAM의 발현 또는 활성 억제제를 이용한 담낭암의 치료제 개발이 가능하고, L1CAM을 바이오마커로 이용하여 담낭암을 모니터링 또는 진단할 수 있는 방법을 개발할 수 있으며, 담낭암 성장 또는 전이 억제제를 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A pharmaceutical composition for treating gallbladder carcinoma contatining expression or activity inhibitors of L1CAM as an effective ingredient, a method for inhibiting growth or invasion of gallbladder carcinoma and a method for diagnosing and treating gallbladder carcinoma using L1CAM <130> 10p-06-42 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Val Ala Leu Arg Tyr Val Trp Pro Leu Leu Leu Cys Ser Pro 1 5 10 15 Cys Leu Leu Ile Gln Ile Pro Glu Glu Leu Met Glu Pro Pro Val Ile 20 25 30 Thr Glu Gln Ser Pro Arg Arg Leu Val Val Phe Pro Thr Asp Asp Ile 35 40 45 Ser Leu Lys Cys Glu Ala Ser Gly Lys Pro Glu Val Gln Phe Arg Trp 50 55 60 Thr Arg Asp Gly Val His Phe Lys Pro Lys Glu Glu Leu Gly Val Thr 65 70 75 80 Val Tyr Gln Ser Pro His Ser Gly Ser Phe Thr Ile Thr Gly Asn Asn 85 90 95 Ser Asn Phe Ala Gln Arg Phe Gln Gly Ile Tyr Arg Cys Phe Ala Ser 100 105 110 Asn Lys Leu Gly Thr Ala Met Ser His Glu Ile Arg Leu Met Ala Glu 115 120 125 Gly Ala Pro Lys Trp Pro Lys Glu Thr Val Lys Pro Val Glu Val Glu 130 135 140 Glu Gly Glu Ser Val Val Leu Pro Cys Asn Pro Pro Pro Ser Ala Glu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ile Tyr Trp Met Asn Ser Lys Ile Leu His Ile Lys Gln 165 170 175 Asp Glu Arg Val Thr Met Gly Gln Asn Gly Asn Leu Tyr Phe Ala Asn 180 185 190 Val Leu Thr Ser Asp Asn His Ser Asp Tyr Ile Cys His Ala His Phe 195 200 205 Pro Gly Thr Arg Thr Ile Ile Gln Lys Glu Pro Ile Asp Leu Arg Val 210 215 220 Lys Ala Thr Asn Ser Met Ile Asp Arg Lys Pro Arg Leu Leu Phe Pro 225 230 235 240 Thr Asn Ser Ser Ser His Leu Val Ala Leu Gln Gly Gln Pro Leu Val 245 250 255 Leu Glu Cys Ile Ala Glu Gly Phe Pro Thr Pro Thr Ile Lys Trp Leu 260 265 270 Arg Pro Ser Gly Pro Met Pro Ala Asp Arg Val Thr Tyr Gln Asn His 275 280 285 Asn Lys Thr Leu Gln Leu Leu Lys Val Gly Glu Glu Asp Asp Gly Glu 290 295 300 Tyr Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ser Leu Gly Ser Ala Arg His Ala Tyr 305 310 315 320 Tyr Val Thr Val Glu Ala Ala Pro Tyr Trp Leu His Lys Pro Gln Ser 325 330 335 His Leu Tyr Gly Pro Gly Glu Thr Ala Arg Leu Asp Cys Gln Val Gln 340 345 350 Gly Arg Pro Gln Pro Glu Val Thr Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Val 355 360 365 Glu Glu Leu Ala Lys Asp Gln Lys Tyr Arg Ile Gln Arg Gly Ala Leu 370 375 380 Ile Leu Ser Asn Val Gln Pro Ser Asp Thr Met Val Thr Gln Cys Glu 385 390 395 400 Ala Arg Asn Arg His Gly Leu Leu Leu Ala Asn Ala Tyr Ile Tyr Val 405 410 415 Val Gln Leu Pro Ala Lys Ile Leu Thr Ala Asp Asn Gln Thr Tyr Met 420 425 430 Ala Val Gln Gly Ser Thr Ala Tyr Leu Leu Cys Lys Ala Phe Gly Ala 435 440 445 Pro Val Pro Ser Val Gln Trp Leu Asp Glu Asp Gly Thr Thr Val Leu 450 455 460 Gln Asp Glu Arg Phe Phe Pro Tyr Ala Asn Gly Thr Leu Gly Ile Arg 465 470 475 480 Asp Leu Gln Ala Asn Asp Thr Gly Arg Tyr Phe Cys Leu Ala Ala Asn 485 490 495 Asp Gln Asn Asn Val Thr Ile Met Ala Asn Leu Lys Val Lys Asp Ala 500 505 510 Thr Gln Ile Thr Gln Gly Pro Arg Ser Thr Ile Glu Lys Lys Gly Ser 515 520 525 Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Phe Asp Pro Ser Leu Gln Pro 530 535 540 Ser Ile Thr Trp Arg Gly Asp Gly Arg Asp Leu Gln Glu Leu Gly Asp 545 550 555 560 Ser Asp Lys Tyr Phe Ile Glu Asp Gly Arg Leu Val Ile His Ser Leu 565 570 575 Asp Tyr Ser Asp Gln Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Thr Glu Leu 580 585 590 Asp Val Val Glu Ser Arg Ala Gln Leu Leu Val Val Gly Ser Pro Gly 595 600 605 Pro Val Pro Arg Leu Val Leu Ser Asp Leu His Leu Leu Thr Gln Ser 610 615 620 Gln Val Arg Val Ser Trp Ser Pro Ala Glu Asp His Asn Ala Pro Ile 625 630 635 640 Glu Lys Tyr Asp Ile Glu Phe Glu Asp Lys Glu Met Ala Pro Glu Lys 645 650 655 Trp Tyr Ser Leu Gly Lys Val Pro Gly Asn Gln Thr Ser Thr Thr Leu 660 665 670 Lys Leu Ser Pro Tyr Val His Tyr Thr Phe Arg Val Thr Ala Ile Asn 675 680 685 Lys Tyr Gly Pro Gly Glu Pro Ser Pro Val Ser Glu Thr Val Val Thr 690 695 700 Pro Glu Ala Ala Pro Glu Lys Asn Pro Val Asp Val Lys Gly Glu Gly 705 710 715 720 Asn Glu Thr Thr Asn Met Val Ile Thr Trp Lys Pro Leu Arg Trp Met 725 730 735 Asp Trp Asn Ala Pro Gln Val Gln Tyr Arg Val Gln Trp Arg Pro Gln 740 745 750 Gly Thr Arg Gly Pro Trp Gln Glu Gln Ile Val Ser Asp Pro Phe Leu 755 760 765 Val Val Ser Asn Thr Ser Thr Phe Val Pro Tyr Glu Ile Lys Val Gln 770 775 780 Ala Val Asn Ser Gln Gly Lys Gly Pro Glu Pro Gln Val Thr Ile Gly 785 790 795 800 Tyr Ser Gly Glu Asp Tyr Pro Gln Ala Ile Pro Glu Leu Glu Gly Ile 805 810 815 Glu Ile Leu Asn Ser Ser Ala Val Leu Val Lys Trp Arg Pro Val Asp 820 825 830 Leu Ala Gln Val Lys Gly His Leu Arg Gly Tyr Asn Val Thr Tyr Trp 835 840 845 Arg Glu Gly Ser Gln Arg Lys His Ser Lys Arg His Ile His Lys Asp 850 855 860 His Val Val Val Pro Ala Asn Thr Thr Ser Val Ile Leu Ser Gly Leu 865 870 875 880 Arg Pro Tyr Ser Ser Tyr His Leu Glu Val Gln Ala Phe Asn Gly Arg 885 890 895 Gly Ser Gly Pro Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Thr Pro Glu Gly Val 900 905 910 Pro Gly His Pro Glu Ala Leu His Leu Glu Cys Gln Ser Asn Thr Ser 915 920 925 Leu Leu Leu Arg Trp Gln Pro Pro Leu Ser His Asn Gly Val Leu Thr 930 935 940 Gly Tyr Val Leu Ser Tyr His Pro Leu Asp Glu Gly Gly Lys Gly Gln 945 950 955 960 Leu Ser Phe Asn Leu Arg Asp Pro Glu Leu Arg Thr His Asn Leu Thr 965 970 975 Asp Leu Ser Pro His Leu Arg Tyr Arg Phe Gln Leu Gln Ala Thr Thr 980 985 990 Lys Glu Gly Pro Gly Glu Ala Ile Val Arg Glu Gly Gly Thr Met Ala 995 1000 1005 Leu Ser Gly Ile Ser Asp Phe Gly Asn Ile Ser Ala Thr Ala Gly Glu 1010 1015 1020 Asn Tyr Ser Val Val Ser Trp Val Pro Lys Glu Gly Gln Cys Asn Phe 1025 1030 1035 1040 Arg Phe His Ile Leu Phe Lys Ala Leu Gly Glu Glu Lys Gly Gly Ala 1045 1050 1055 Ser Leu Ser Pro Gln Tyr Val Ser Tyr Asn Gln Ser Ser Tyr Thr Gln 1060 1065 1070 Trp Asp Leu Gln Pro Asp Thr Asp Tyr Glu Ile His Leu Phe Lys Glu 1075 1080 1085 Arg Met Phe Arg His Gln Met Ala Val Lys Thr Asn Gly Thr Gly Arg 1090 1095 1100 Val Arg Leu Pro Pro Ala Gly Phe Ala Thr Glu Gly Trp Phe Ile Gly 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Ala Ile Ile Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Ile Leu Cys 1125 1130 1135 Phe Ile Lys Arg Ser Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Val Lys Asp Lys Glu 1140 1145 1150 Asp Thr Gln Val Asp Ser Glu Ala Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr Phe 1155 1160 1165 Gly Glu Tyr Ser Asp Asn Glu Glu Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gln Pro 1170 1175 1180 Ser Leu Asn Gly Asp Ile Lys Pro Leu Gly Ser Asp Asp Ser Leu Ala 1185 1190 1195 1200 Asp Tyr Gly Gly Ser Val Asp Val Gln Phe Asn Glu Asp Gly Ser Phe 1205 1210 1215 Ile Gly Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Glu Lys Glu Ala Ala Gly Gly Asn 1220 1225 1230 Asp Ser Ser Gly Ala Thr Ser Pro Ile Asn Pro Ala Val Ala Leu Glu 1235 1240 1245

Claims (10)

1. L1CAM(L1 cell adhesion molecule)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 L1CAM은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, L1CAM의 발현 억제제는 L1CAM 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, L1CAM의 활성 억제제는 L1CAM에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 항체는 수탁번호 KCTC 10966BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 4-63, 또는 UJ1237인 것을 특징으로 하는 담낭암의 성장 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
   
6. 1) L1CAM의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
   2) 상기 세포주에서 L1CAM의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 L1CAM의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, L1CAM의 발현 억제제를 선별하는 방법.
   
7. 제 6항에 있어서, 단계 2)의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 1) L1CAM에 피검물질을 처리하는 단계;
   2) 상기 L1CAM의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 L1CAM의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 L1CAM의 활성 억제제를 선별하는 방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 단계 2)의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 1) 피검체 유래 시료에서 L1CAM의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    2) L1CAM의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 담낭암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 담낭암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
    
    
    

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