KR20160029053A

KR20160029053A - Hoxb5의 유방암 진단 및 치료 용도

Info

Publication number: KR20160029053A
Application number: KR1020160023346A
Authority: KR
Inventors: 김명희; 이지연; 호 허
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2016-03-14

Abstract

본 발명은 HOXB5 유전자의 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료용 조성물 또는 이를 이용한 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 HOXB5를 유방암 진단용 마커로 이용하는 경우, 전체 유방암 환자의 50~80% 이상을 차지하는 에스트로겐 수용기 양성 유방암을 진단할 수 있어 유방암의 조기 발견 및 효과적인 치료에 진단에 큰 활용이 기대된다.

Description

HOXB5의 유방암 진단 및 치료 용도 {Use of HOXB5 for diagnosis and treatment of breast cancer}

유전자의 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료용 조성물 또는 이를 이용한 진단용 조성물에 관한 것이다.

전 세계에서 유방암은 여성에게 있어 첫 번째로 흔히 발생되는 암이며, 남녀를 포함한 전체 암 발생 중 사망률 5위에 해당하는 위험한 암이다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에, 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.

유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 조기 진단하고, 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 진단하여 적절한 부가 치료(Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다. 현재 유방암 진단에는 1차 촉진에 의한 자가 진단 외에, 유방 X-선 조영술, 초음파검사법 등이 예방 차원에서의 검진방법으로 사용되고 있으며, 이 방법은 초기의 유방암을 진단하는 데에도 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나 유방 X-선 조영술은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어진다. 또한, X-선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 생길 가능성도 배제할 수 없다. 그래서 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있지만 이 역시 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구별하기는 쉽지 않다. 실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있다. 그러나 이 방법들을 사용하더라도 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확정진단을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다. 이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다.

그러나 현재 유방암의 진단 및 치료에 가장 유용하게 사용되는 유방암 특이 진단 마커인 HER2/neu(Human Epidermal growth factor Receptor 2, ErbB-2 또는 ERBB2라고도 알려져 있다) 유전자의 증폭 및 과발현 분석은 침습성 유방암의 20~35%에서만 유용성이 있다. 유방암의 50~80%를 차지하는 에스트로겐 수용기 양성(Estrogen receptor positive, ER+) 유방암은 그 진단 및 진행에 있어서 유전자 마커의 개발이 진행되지 못한 상태이다.

유방암은 에스트로겐 수용기 및 HER2/neu 유전자의 음성/양성 유무에 따라 치료 방법이 달라지며, 적절한 치료 방법이 적용되어야지만 완치 및 생존율이 향상되므로, 에스트로겐 수용기의 유전자 진단법 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, HOXB5(hemeobox B5) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스트로겐 수용기 양성 타입 유방암 진단용 조성물과 상기 조성물을 포함하는 에스트로겐 수용기 양성 타입 유방암 진단용 키트를 제공하고, 이를 이용한 에스트로겐 수용기 양성 타입 유방암 진단방법 및 스크리닝 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명에서 용어 “HOX”는 호메오박스 유전자라고 불리는 전사 조절인자 부류를 코딩하는 유전자로, 척추동물에서는 다른 염색체 상에 4개의 군, 즉 HOX A, B, C, D가 있어 같은 전사방향을 가진 39개의 독립한 호메오박스 유전자가 있다(Krumlauf R. Hox genes in vertebrate development. Cell 1994. 78:191-201). 각각의 HOX 유전자는 호메오 영역의 아미노산 배열의 유사성에 따라 이들은 13개 그룹으로 분류하며 HOXA1, HOXD13 등으로 기재된다. HOX 유전자는 동식물의 발생 과정에서 작동하는 유전자로 돌연변이가 생길 경우 형태 형성에 이상을 가져온다. HOX 유전자들의 조절장애발현(dysregulated expression)은 암에서 조직-특이적 성향으로 발견된다(tissue-specific manner). 예를 들어, HOXB 패밀리의 경우, HOXB2는 췌장암 및 유방암, HOXB3은 급성 골수성 백혈병, HOXB5 급성 골수성 백혈병 및 선천성낭성선 종양 기형(congenital cystic adenomatoid malformation, CCAM), HOXB6는 급성 골수성 백혈병 및 대장암, HOXB7은 흑색종 및 난소암, HOXB8은 대장암, HOXB9는 전립선암 및 폐암, HOXB13은 전립선암과 관계된 것으로 알려져 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). 또한 형태 형성 이상을 야기하는 HOX 유전자들의 조절장애는 유전자의 발현 방법에 따라 음성조절(negative regulation, 유전자 활성 억제) 및 양성조절(positive regulation, 유전자 활성 촉진) 조절 장애로 구분될 수 있다(Shah N, Sukumar S. The Hox genes and their roles in oncogenesis. Nat Rev Cancer 2010;10:361-71). 예를 들어, HOXB2는 음성조절 이상으로 유방암이 발생하지만(Boimel 등, A functional in vivo screen for regulators of tumor progression identifies HOXB2 as a regulator of tumor growth in breast cancer. Genomics. 2011; 98(3):164-72), HOXB9는 양성조절 이상으로 폐암을 발생시킨다(Calvo 등, Altered HOX and WNT7A expression in human lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(23):12776-81). 따라서, HOX 유전자의 새로운 기능은 같은 패밀리간에도 예측하기 힘든 실정이고, 다양한 암을 특이적으로 진단할 수 있는 HOX 유전자 마커의 지속적인 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 발현 억제제 또는 Hoxb5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 및 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 암의 성장 및 전이 차단을 목적으로 하는 혈관신생 및 전이 억제용 약제학적 조성물이고, 상기 유전자의 발현 억제제는 HOXB5 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물이며, 상기 단백질의 활성 억제제는 Hoxb5 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 조성물을 제공한다.

본 발명에서의“신생혈관”이란, 혈관 내피세포가 증식하고 재구성되어 기존에 존재하는 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 세포 현상을 의미한다. 암세포가 증식 및 성장하기 위해서는 산소와 영양을 공급하는 새로운 혈관이 필요하므로, 신생혈관의 억제를 통해서 암의 전이 억제를 유도할 수 있다. 또한“전이”란, 암세포가 원발장기를 떠나 다른 장기로 가는 것이다. 암이 신체의 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암조직이 성장하여 직접적으로 주위장기를 침윤하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격전이를 하는 것으로 나눈다. 전이는 암 발생과 관련된 유전자의 발현 억제 또는 상기 유전자의 단백질 활성 억제를 통해 조절될 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자는 HOXB5에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA 등으로 발현 억제될 수 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(HOXB5 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(HOXB5 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 HOXB5 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.

상기 shRNA(short hairpin RNA)은 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.

상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.

또한 본 발명에서 상기 단백질은 Hoxb5 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편으로 활성 억제될 수 있다.

상기 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 HOXB5 유전자로부터 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA(서열번호 1) 또는 단백질(서열번호 2)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단용 조성물을 제공한다. 상기 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물이고, 상기 유전자의 단백질 발현수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물을 제공한다.

본 발명에서의“진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 에스트로겐 수용기 양성 (ER+) 타입 유방암 발병 여부를 확인하는 것이다.

또한 본 발명에서의 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커"란, 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 암 진단 마커는 정상 대상 조직의 세포에 비하여, 에스트로겐 수용기 양성 (ER+) 타입 유방암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 HOXB5 유전자의 mRNA 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

상기 "mRNA 발현 수준 측정”이란, 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 암 세포에서 발현이 증가하는 HOXB5 유전자의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다. HOXB5의 폴리뉴클레오타이드 서열을 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서의 "프라이머" 란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 HOXB5 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

또한 "프로브”란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 HOXB5 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한 본 발명에서의“단백질 발현수준 측정”이란, 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 HOXB5 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것일 수 있다. HOXB5 유전자로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 당업자는 상기 단백질에 특이적인 항체를 디자인할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, "항체"란, 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고, 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 어느 하나 이상의 조성물을 포함하는, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 마이크로어레이, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석(immunoassay)용 키트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키트를 제공한다.

본 발명에서의“키트”란 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 암 진단 마커인 HOXB5의 발현수준을 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 키트에는 암 진단 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 발현 억제제 또는 Hoxb5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 및 전이 억제용 약제학적 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 치료하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 암의 성장 및 전이 차단을 목적으로 하는 혈관신생 및 전이 억제용 약제학적 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 치료하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법이고, 상기 유전자의 발현 억제제는 HOXB5 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 치료하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법이며, 상기 단백질의 활성 억제제는 HOXB5 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 치료하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서의 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 치료 방법은 상기 약제학적 조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 서열번호 1 또는 2의 유효성분을 0.1 내지 50중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단용 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법이고, 상기 mRNA 발현수준의 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법이며, 상기 유전자의 단백질 발현수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법이며, 상기 단백질 발현수준의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩을 이용하는 것인 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 어느 하나 이상의 조성물을 포함하는, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단용 키트를 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 키트는 마이크로어레이, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석(immunoassay)용 키트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키트를 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 진단하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 치료할 수 있을 것으로 기대되는 후보 물질의 투여 후 HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 발현 억제를 위하여 유효성분으로 HOXB5 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 혈관신생 억제는 유방암 성장 억제인 약제학적 조성물을 제공하고, 유방암은 에스트로겐 수용기가 양성인 약제학적 조성물을 제공하며, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, Hoxb5 (Homeobox B5) 단백질 억제를 위하여 유효성분으로 Hoxb5 특이적인 항체를 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 혈관신생 억제는 유방암 성장 억제인 약제학적 조성물을 제공하고, 유방암은 에스트로겐 수용기가 양성인 약제학적 조성물을 제공하며, Hoxb5 단백질은 서열번호 2로 표시되는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 발현 억제를 위하여 유효성분으로 HOXB5 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 암전이 억제는 유방암 성장 억제인 약제학적 조성물을 제공하고, 유방암은 에스트로겐 수용기가 양성인 약제학적 조성물을 제공한다,

본 발명의 일 구체예에서, Hox5 (Homeobox B5) 단백질 억제를 위하여 유효성분으로 Hox5 특이적인 항체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 암전이 억제는 유방암 성장 억제인 약제학적 조성물을 제공하고, 유방암은 에스트로겐 수용기가 양성인 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단용 조성물을 제공하고, 상기 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, Hoxb5 (Homeobox B5) 단백질 억제를 위하여 유효성분으로 Hoxb5 특이적인 항체를 포함하는 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단용 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, Hoxb5 단백질은 서열번호 2로 표시되는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브로 피검체의 HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA의 수준을 측정하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, HOXB5 (Homeobox B5) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, Hoxb5 (Homeobox B5) 단백질 억제를 위하여 유효성분으로 Hoxb5 특이적인 항체를 포함하는 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, Hoxb5 단백질은 서열번호 2로 표시되는 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 치료용 후보 물질의 투여 후 HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준이 억제되는 경우에 후보물질을 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 치료제로 결정하는 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

유방암은 발생률이 높고 증식 속도가 빠르기 때문에 정확하고 빠른 유전자 이용 진단법이 요구되고 있으나, 유방암 환자의 80% 이상이 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암인 것에 비하여, 전체 유방암 환자 중 20~30%에서 과발현되는 HER2 유전자의 진단법만이 개발된 상태이다. 그러나 본 발명은 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입의 유방암 조직 및 유방암 세포주와, 여기서 유의적으로 높게 발현되는 HOXB5의 mRNA 및 단백질의 연관성을 다각도로 확인하였다. 따라서 본 발명의 HOXB5 유전자 발현을 이용하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암을 진단하는 방법은, 진단의 정확성을 높이고 전체 유방암 중 넓은 범위를 포용할 수 있으므로, 용이하게 효율이 높은 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단에 큰 활용이 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 9종류의 유방암세포주에서의 HOXB5 발현량을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 5개의 비암성 및 5개의 암성 유방 조직에서의 HOXB5 발현량을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유방조직에서의 Hoxb5 면역조직화학염색 결과의 구분을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Hoxb5 발현과 유방암 예후 관계의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 HOXB5 발현 저해된 유방암 세포주에서의 암 증식능 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 HOXB5 과발현된 유방암 세포주에서의 암 증식능 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 HOXB5 과발현된 유방암 세포에서의 형태학적 변화 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유방암 세포주 및 조직에서 HOXB5 발현량 조사

실시예 1.1. 유방암 세포주 및 조직에서 HOXB5의 mRNA 발현량 분석

유방암과 HOXB5의 관련성을 입증하기 위하여, 9종류의 유방유래 세포주 및 유방암조직/비암성유방조직 각각 5개씩을 취하여 트리졸(Trizol)을 이용하여 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR 방법으로 HOXB5의 발현양을 확인하였다.

9종류의 유방암세포주 (도 1) 및 각각 5개씩의 비암성 및 암성 유방 조직 (도 2)에서 HOXB5의 발현을 조사해 본 결과 에스트로겐 수용기 양성 타입의 유방암 세포주 및 조직에서 HOXB5의 발현 정도가 높음을 확인하였다. 실시예에 사용된 유방암세포주와 비암성 및 암성 유방조직의 에스트로겐 수용기, 프로게스테론 수용기 및 사람의 표피성장인자 2 (human epidermal growth factor, HER2)와 관련된 성상을 각각 [표 1]과 [표 2]에 기재하였다.

세포주	에스트로겐 수용기	프로게스테론 수용기	인간 표피성장인자 2
MCF10A	음성	음성	음성
BT474	양성	양성	양성
MCF7	양성	양성	음성
T47D	양성	양성	음성
HCC1428	양성	양성	음성
MDA-MB-453	음성	음성	음성
SKBR3	음성	음성	양성
MDA-MB-231	음성	음성	음성
HCC70	음성	음성	음성

조직	병소	에스트로겐 수용기	프로게스테론 수용기	인간 표피성장인자 2
N1	선암 (Adenosis tumor)
N2	섬유선종 (Fibroadenoma)
N3	정상 (Normal)
N4	유두종증 (Papillomatosis)
N5	유두종 (Papilloma)
T1	침습성 관암종 (IDC)	>50%	>50%	음성
T2	침습성 관암종 (IDC)	>50%	>50%	약한 양성
T3	침습성 관암종 (IDC)	>50%	10-50%	음성
T4	침습성 관암종 (IDC)	<10%	<10%	약한 양성
T5	침습성 관암종 (IDC)	음성	음성	강한 양성
N: 비침습성 인간 유방암 조직 (non-malignant human breast tissue) T: 인간 유방암 조직 (human breast cancer tissue) IDC: 침습성 관암종 (invasive ductal carcinoma)

실시예 1.2. 유방암 세포주 및 조직에서 HOXB5의 단백질 발현량 분석

실시예 1.1의 결과를 바탕으로 보다 많은 수의 조직샘플에 대한 분석을 시도하기 위하여 63개의 유방암조직과 34개의 정상유방조직이 포함된 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA)를 제작하였고 면역조직화학염색(immunohistochemistry)방법으로 조직내 Hoxb5 단백질 발현양을 조사하여 해당조직의 유방암 타입 및 임상병리학적 요인을 비교 분석하였다. Hoxb5의 발현정도에 따라 음성, 약한 양성, 중간 양성 및 강한 양성으로 구분하였고, 각각의 대표적인 발색 정도를 [도 3]에 나타내었다. 또한 전체 조직을 2가지 기준에 따라 분류하여 각각의 수를 확인하였으며, 그 결과를 [표 3]에 나타내었다. 기준 1 은 Hoxb5 발현에 따라 조직을 음성 및 양성(약한 양성, 중간 양성 및 강한 양성을 모두 포함)으로 구분하였으며, 기준 2 는 역시 Hoxb5 발현에 따라 조직을 음성 및 약한 양성을 포함하는 군과 중간 양성 및 강한 양성을 포함하는 군으로 구분하였다. 그 결과로서, 기준 1에 의한 구분과 기준 2에 의한 구분 모두에서 정상유방조직에 비해 유방암조직에서 Hoxb5의 발현이 유의적으로 높게 나타남을 알 수 있었다.

기준	Hoxb5 발현	정상	유방암	표준편차
1	음성 양성 (약한, 중간, 강한)	27 (73.5%) 9 (26.5%)	28 (45.2%) 34 (54.8%)	0.008
2	음성 및 약한 양성 중간 양성 및 강한 양성	34 (100%) 0 (0%)	54 (87.1%) 8 (12.9%)	0.047

실시예 1.3. HOXB5 발현과 임상병리학적 요인과의 관계 분석

온라인 데이터베이스(www.kmplot.com)를 이용하여 HOXB5 발현 정도와 유방암 환자 예후 관계를 분석하였다. 조직 마이크로어레이에 포함시킨 시료수는 타입별 암의 예후와 HOXB5의 발현과의 상관관계를 분석하기에는 부족하였기 때문에 온라인 데이터베이스인 카플란 메이어 플러터(Kaplan Meier Plotter)를 이용하여 생존 분석(survival analysis)을 수행하였다 (www.kmplot.com).

해당조직의 유방암 타입 및 임상병리학적 요인을 비교 분석해 본 결과 HOXB5 발현 정도는 에스트로겐 수용기 상태(ER status)와 상관관계가 있어서 에스트로겐 수용기 음성 타입에 비해 에스트로겐 수용기 양성 타입의 유방암조직에서 HOXB5 발현이 높게 나타났다(표 4). 다른 임상적 요인들과의 상관관계는 나타나지 않았다.

변수		*HOXB5* 음성 (n=28)	*HOXB5* 양성 (n=33)	표준편차
나이 (Age)		48.4 ± 12.5	50.4 ± 12.9	0.542
종양 크기 (Tumor size)	≤ 2 cm	3 (10.7%)	3 (9.1%)	1.000
종양 크기 (Tumor size)	> 2 cm	25 (89.3%)	30 (90.9%)	1.000
결절 상태 (Node status)	비전이	13 (46.4%)	15 (45.5%)	0.939
결절 상태 (Node status)	전이	15 (53.6%)	18 (54.5%)	0.939
단계 (Stage)	Ⅰ and Ⅱ	19 (67.9%)	26 (78.8%)	0.333
단계 (Stage)	Ⅲ and Ⅳ	9 (32.1%)	7 (21.2%)	0.333
조직학적 단계 (Histologic grade)	Ⅰ	6 (24.0%)	8 (24.2%)	0.983
조직학적 단계 (Histologic grade)	Ⅱ and Ⅲ	19 (76.0%)	25 (75.8%)	0.983
에스트로겐 수용기 상태 (ER status)	음성	16 (57.1%)	10 (30.3%)	0.035
에스트로겐 수용기 상태 (ER status)	양성	12 (42.9%)	23 (69.7%)	0.035
프로겐스테론 수용기상태 (PR status)	음성	7 (25.0%)	8 (24.2%)	0.945
프로겐스테론 수용기상태 (PR status)	양성	21 (75.0%)	25 (75.8%)	0.945
인간 표피성장인자2 (HER2 status)	음성	19 (67.9%)	26 (78.8%)	0.333
인간 표피성장인자2 (HER2 status)	양성	9 (32.1%)	7 (21.2%)	0.333

또한, HOXB5 발현과 유방암 예후와의 관계를 분석하여 [도 4]에 나타내었다. HOXB5는 전체 환자를 대상으로 하였을 때는 원격 전이가 없는 생존(distant metastasis free survival, DMFS)과의 관련성이 보이지 않으나(도 4-가), 에스트로겐 수용기 양성 환자만을 대상으로 하여 원격 전이가 없는 생존을 보면 HOXB5 발현이 높은 경우 예후가 좋지 않음을 알 수 있다(도 4-나). 에스트로겐 수용기 양성이면서 림프절(lymph node) 전이 음성, 조직학적 단계(histologic grade, HG) I인 환자를 대상으로 했을 때에도 HOXB5 발현이 높을수록 예후가 좋지 않으며(도 4-다), 모든 환자를 대상으로 하여 전체 생존(overall survival, OS)을 봤을 때 HOXB5의 높을 발현은 적은 내분비 반응성(poor endocrine responsiveness)과 관련이 있었다(도 4-라).

실시예 2. 유방암 세포주를 이용한 HOXB5의 기능 연구

유방암 세포주에 HOXB5를 과발현 또는 발현저해를 유도한 후 유방암세포의 증식, 세포사멸, 침윤능, 콜로니 형성능을 조사함으로써 유방암의 발달 및 진행에 있어서 HOXB5의 역할을 연구하였다.

실시예 2.1. HOXB5 발현 저해 및 과발현 유도 세포주 제작

에스트로겐 수용기 양성 타입의 유방암 세포주 중에서 BT474, MCF-7, T47D, 에스트로겐 수용기 음성 타입의 세포주 중에서 SKBR3, MDA MB 231을 사용하였다. 정상 유방 세포주로는 MCF10A를 사용하였다. MCF-7, BT474, MDA MB 231은 10% 소혈청(FBS)이 포함된 DMEM배지에서, T47D는 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하였다. SKBR3는 McCoy’s 5a 배지를 이용하였으며, MCF10A는 DMEM/F12 배지에 말 혈청(horse serum) 5%, 내피세포 증식 인자(endothelial growth factor, EGF) 20 ng/ml, 하이드로코르티손(Hydrocortisone) 0.5 μg/ml, 콜레라 독소(Cholera toxin) 100 ng/ml 및 인슐린(Insulin) 10 μg/ml을 첨가하여 배양하였다. 발현저해 효과를 보기 위한 siRNA는 제노루션에 의뢰 제작하였고 shRNA를 써모(Thermo)에서 구입하였다. siRNA에 의한 일시적인 효과를 검증하거나 shRNA 도입 후 항생물질 처리 선별(antibiotics selection) 과정을 거쳐 특정 유전자가 발현 저해(knockdown)된 세포주를 확립하였다. 유전자의 발현 저해 효과는 RT-PCR 및 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통하여 확인하였다. 반대로 과발현을 위해서는 해당 유전자의 전체 코딩 서열(coding sequence)이 포함되도록 pCDNA3-HA 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)한 후 유전형질주입(transfection)시켜 과발현 정도를 확인하고 항생물질 처리 선별 과정을 거쳐 해당 유전자가 안정하게 발현하는 세포주를 확보하였다.

실시예 2.2. 사람의 유방암 및 비암성 유방조직에서의 조직 마이크로어레이(TMA) 제작

사람 유방 조직은 일산병원에서 2012년 6-7월 사이에 유방암 수술을 받은 환자로부터 임상연구이용 동의서 서명 후 제공받았으며 수술 후 즉시 RNA 보존용액(RNA later)에 넣고 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 포르말린에 고정시켜 파라핀에 포매한 조직에 대해서는 조직 어레잉 기구(tissue-arraying instrument, AccuMax_ Array; Petagen Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 조직 마이크로어레이(TMA)를 제작하였다.

실시예 2.3. 유방암 세포주 및 유방암 조직에서의 RNA 분리 및 Real-time PCR

트리졸 시약(Trizol-Reagent, Invitrogen)을 이용하여 유방암 세포주로부터 RNA를 추출하였고 임프론 역전화효소(Improm-Ⅱ™ RT Reverse transcriptase) 시약을 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 반응은 기본적으로 95℃에서 2분 후 95℃에서 30초, 55-58℃에서 20초, 72℃에서 30초로 25-30 사이클(cycle) 진행하되 각각의 유전자에 대해 조건의 최적화를 위해 온도 및 사이클수를 변화시켰다. 대조군으로는 베타-엑틴(β-actin) 또는 GAPDH를 이용하였다. 사람의 유방조직은 막자사발에서 액체 질소를 이용하여 조직을 분쇄한 후 트리졸 시약을 이용하여 위와 동일한 방법으로 전체 RNA 를 추출하고 cDNA를 합성하여 Real-time PCR에 이용하였다. Real-time PCR은 마스터믹스(Power SYBR Green PCR Master Mix, AppliedBiosystems) 시약을 이용하여 바이오시스템 7300 피시알(Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System) 장비에서 실시하였다. 데이터는 동사(Applied Biosystems)의 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 형광 출력 결과(Fluorescent output)은 역가(Ct)로 전환하고 정상치에 대한 실험치 전환법(Sample ratio to normal sample, 2-ΔΔCt)을 이용하여 분석하였다.

실시예 2.4. 웨스턴 블랏팅(Western blotting)과 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)

웨스턴 블랏팅을 하기 위해서 세포를 리파 버퍼(RIPA buffer, 50 mM Tris-Cl, pH7.5, 150 mM NaCl, 0.1% DSD, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Triton X-100 and 단백질 가수분해 효소 억제 칵테일)를 사용하여 분해시켜서 단백질 분해액(protein lysate)를 만들었으며 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트 (Thermo, #23227)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 전기영동을 통해 단백질을 젤상에 분리한 후, PVDF 멤브레인에 단백질을 이동시켰다. 5% 스킴 밀크(skim milk) 로 블럭킹(blocking) 한 후, 각 단백질을 탐지할 수 있는 일차 항체(1st antibody)를 넣고 4°C에서 밤새도록 인큐베이션 하였다. 2차 항체(2nd antibody) 인큐베이션 후 피어스사의 웨스턴 피코 검출(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce Cat# 34080) 시약을 사용하여 발색반응 시킨 후, 감광시켰다. 면역조직화학염색(Immunohistochemistry) 실험시는 벡터(Vector)사의 안티젠 언마스킹(antigen unmasking solution) 시약 처리 후 정상 염소 혈청(normal goat serum 3 % in PBST, 0.05 % Tween 20)으로 블럭킹하였다. 조직 단편(section)은 해당 항체와 인큐베이션하고 알렉사 형광(Alexa Fluor)이 결합(conjugate)되어 있는 이차 항체로 검출하였다. 형광 이미지는 올림푸스 형광 현미경(Olympus IX70)으로 관찰하였다.

실시예 2.5. 세포 증식(Cell proliferation )과 세포사(Apoptosis) 분석

세포의 생존율 정도는 엠티티(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT) 시약을 이용하여 측정하였다. 세포에 5 mg/ml 농도의 엠티티 용액(MTT solution in PBS)을 20 μl 넣어주고 37℃에서 3.5시간 동안 배양하였다. 엠티티 반응 정지 용액(stop solution, 4 mM HCl, 0.1% Nondet P-40 (NP40) in isopropanol)으로 반응을 정지시키고,결과는 560 nm에서의 흡광도 측정하였다. 세포사(Apoptosis)는 아넥신V-FITC키트(EzWay Annexin V-FITC apoptosis detection kit, Komabiotech)을 이용하여 아넥신V-FITC 및 프로피디움 아이오다인(propidium iodide)을 염색하고 유세포분석 (Flow cytometry)을 시행하여 분석하였다.

실시예 2.6. 앵커리지 비의존 콜로니 형성(anchorage-independent colony formation) 측정을 위한연한천 분석(Soft agar assay)

기존 한천 배지는 아가로즈 최종 농도 0.5%로, 상층 한천 배지는 최종 농도 0.35%로 사용하였다. 분석할 세포는 5 x 10³ cells 의 세포가 100μl 의 배양배지 내에 존재하도록 준비하여 기저 한천 배지 위에 이식하였다. 37°C 배양기에서 15~21일 배양한 후 나이트로블루 테트라졸륨(Nitroblue Tetrazolium, NBT) 0.5 mg/ml 로 염색하여 콜로니를 관찰하였다.

실시예 2.7. 마트리젤 침습 분석(Matrigel invasion assay)

마트리젤(Matrigel™, BD)은 코팅 버퍼(0.01 M Tris, pH 8.0 and 0.7% NaCl)에 최종 농도 300 μg/ml이 되도록 섞은 후 24-웰 배양접시(24-well plate)에 장착한 각각의 삽입 접시(individual insert)에 100 μl씩 넣어주었다. 세포는 5 x 10⁴ 개의 세포가 500 μl 무혈청 배지 내에 포함되도록 준비하여 삽입 접시 내에 이식하였다. 삽입 접시 바깥쪽 하위 챔버(lower chamber)에는 10% 소 혈청(Fetal bovine serum, FBS)이 함유된 배양 배지를 750 μl 첨가하였다. 37°C에서 적정시간 동안 (1~3 DAY) 배양한 후 마트리젤을 통과하여 침습한 세포(삽입 접시의 바닥 표면에 부착되어 있는 세포)의 수를 답피 염색(DAPI staining)으로 확인하였다. 얻어진 이미지는 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

실시예 2.8. HOXB5 발현 저해에 의한 효과

실시예 2.1 내지 2.7의 방법으로 HOXB5에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 에스트로겐 수용기 양성 유방암세포주인 T47D에 감염시켜 HOXB5 발현 저해된 유방암 세포주(#1, #2, #3)를 제작하였고, 이의 mRNA 발현양(도 5-가), 단백질 발현양(도 5-나), 세포증식 효과(도 5-다) 및 연한천 배지에서의 콜로니 형성능(도 5-라)을 분석하였다. 이들 세포주는 세포증식의 감소, 콜로니 형성능의 감소를 보였다.

실시예 2.9. HOXB5 과발현에 의한 효과

실시예 2.1 내지 2.7의 방법으로 HOXB5를 에스트로겐 수용기 양성 유방암세포주인 MCF7에 과발현시킨 HOXB5 과발현된 유방암 세포주(#1, #2, #3)를 제작하고, 이의 mRNA 발현양(도 6-가 및 6-나), 세포증식 효과(도 6-다), 연한천 배지에서의 콜로니 형성능(도 6-라) 및 마트리젤에서의 암세포 침윤능(도 6-마)을 분석하였다. 이 경우 실시예 2.8의 HOXB5 발현 저해와는 반대로 세포증식의 증가, 콜로니 형성능의 증가, 암세포의 침윤능 증가효과를 보였다.

특히, HOXB5가 과발현된 MCF7 세포주는 발현양이 낮은 세포주에 비해 세포모양의 형태학적인 변화가 유발되며, 이를 [도 7]에 나타내었다. HOXB5가 과발현된 MCF7 세포주는 상피세포 마커(epithelial marker)인 E-cadherin의 감소, 간엽세포 마커(mesenchymal marker)인 Vimentin의 증가와 더불어 β-catenin의 발현위치 변화 등 암세포의 전이에서 중요한 역할을 하는 상피-간엽 전환(epithelilal-mesenchymal transition, EMT) 현상이 나타난다. 이러한 결과들은 HOXB5가 유방암의 발생 및 진행에 중요한 역할을 함을 보여준다.

<110> Yonsei Industry Academic Cooperation Foundation <120> Use of HOXB5 for diagnosis and treatment of breast cancer <130> DPB140015 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1830 <212> DNA <213> human <400> 1 gtgaagcaca gggttataac gaccacgatc cacaaatcaa gccctccaaa atcacccaaa 60 tgagctcgta ctttgtaaac tccttctcgg ggcgttatcc aaatggcccg gactatcagt 120 tgctaaatta tggcagtggc agctctctga gcggctctta cagggatccc gctgccatgc 180 acaccggctc ttacggctac aattacaatg ggatggacct cagcgtcaac cgctcctcgg 240 cctcctccag ccactttggg gcggtgggcg agagctcgcg cgccttcccc gcgcccgccc 300 aggagccccg cttcaggcaa gcggcttcga gctgctccct gtcctcgccc gagtccctgc 360 cctgcaccaa cggcgacagc cacggcgcca agccctctgc ttcgtccccc tccgaccagg 420 cgacctcagc cagctccagc gccaatttca ccgaaataga cgaggccagc gcgtcctcgg 480 agcctgagga agcggcaagc cagctaagca gccccagcct agctcgggcg cagccagagc 540 ccatggccac ctccacagcc gcgcccgagg ggcagactcc gcaaatattc ccctggatga 600 ggaagcttca catcagccat gatatgaccg ggccggacgg gaaaagggcc cggaccgcgt 660 atacccgcta ccagaccctg gagctggaaa aggagttcca cttcaaccgc tacctgaccc 720 ggcgacggcg catcgagatc gcccacgcac tctgcctgtc cgagcgccag atcaagatct 780 ggttccagaa ccggcgcatg aagtggaaga aggacaacaa attgaaaagt atgagcctgg 840 ctacagctgg cagcgccttc cagccctgag cccgcccaga ggagcccagc ggcccaagag 900 cccgtgccac ccccagccct ggcccctcca atcctccccg ctctgccgcc gcccgctggg 960 gaccggttcc cacaagcctg cctcgccttg tgttacgata tttcgtttgg tcttaggtct 1020 tcctgtggct ccctctctcc tggactggtt atcttgttat tattgttaat aataattatt 1080 attattattt tccttccatg ctcccaactc ccttctgctt gtcccaaatc cgccagtgtt 1140 tctgaatgtt tgtgtctgtg gttgcagtct ttcccccagg aaaaaaaaaa aaagaaattc 1200 gcatgtttaa tgtgaactct cccctcccca tctgtgttct aacttattta taaaaagatg 1260 atcgctgtat tttgagtttc agctggaaac ttctgtaagg ggcagcagtt gaggtggggt 1320 agtgccgcag tggggtcaag ctgagctggc ttcggagatg gagtcccttt tcattctcct 1380 cctcctccct cctcactccc taggcccaag tctcctaggg gcttggtcct agggtgggaa 1440 ggggctaggg aggaccaaag ggatggtatt gagaagagag aaagaagata gtgagattta 1500 agttcctgct gcctgggtag gccccacaag gcctggtctg ggagtatacg gaaacaaaaa 1560 tgatcctcag tgcaaaatgt cttgtgtatt tctctgtgaa tccatgggtc tggctagagg 1620 gcccaaagct tgtaaatatg gggatagtct gggtcagacc catctctccc ttacccatct 1680 tgcttccaag accatttgta gtgagcgagt ggatgctgtg ctacgtgtga aatctgtctt 1740 tgcggggcct gtctcagtga ttcgcttttg gtatttgttt gtagctttcc tggaagtcaa 1800 ataaatgttt cccccactcc aaaaaaaaaa 1830 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Ser Ser Tyr Phe Val Asn Ser Phe Ser Gly Arg Tyr Pro Asn Gly 1 5 10 15 Pro Asp Tyr Gln Leu Leu Asn Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Leu Ser Gly 20 25 30 Ser Tyr Arg Asp Pro Ala Ala Met His Thr Gly Ser Tyr Gly Tyr Asn 35 40 45 Tyr Asn Gly Met Asp Leu Ser Val Asn Arg Ser Ser Ala Ser Ser Ser 50 55 60 His Phe Gly Ala Val Gly Glu Ser Ser Arg Ala Phe Pro Ala Pro Ala 65 70 75 80 Gln Glu Pro Arg Phe Arg Gln Ala Ala Ser Ser Cys Ser Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Glu Ser Leu Pro Cys Thr Asn Gly Asp Ser His Gly Ala Lys Pro 100 105 110 Ser Ala Ser Ser Pro Ser Asp Gln Ala Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ala 115 120 125 Asn Phe Thr Glu Ile Asp Glu Ala Ser Ala Ser Ser Glu Pro Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Ser Gln Leu Ser Ser Pro Ser Leu Ala Arg Ala Gln Pro Glu 145 150 155 160 Pro Met Ala Thr Ser Thr Ala Ala Pro Glu Gly Gln Thr Pro Gln Ile 165 170 175 Phe Pro Trp Met Arg Lys Leu His Ile Ser His Asp Met Thr Gly Pro 180 185 190 Asp Gly Lys Arg Ala Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu 195 200 205 Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg 210 215 220 Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Ser Glu Arg Gln Ile Lys Ile 225 230 235 240 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp Asn Lys Leu Lys 245 250 255 Ser Met Ser Leu Ala Thr Ala Gly Ser Ala Phe Gln Pro 260 265

Claims

HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브로 피검체의 HOXB5 (Homeobox B5) 유전자의 mRNA의 수준을 측정하여 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 1항에 있어서,
HOXB5 (Homeobox B5) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 정보를 제공하는 방법.
Hoxb5 (Homeobox B5) 단백질 억제를 위하여 유효성분으로 Hoxb5 특이적인 항체를 포함하는 에스트로겐 수용기 양성 (Estrogen receptor positive, ER+) 타입 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
제 3항에 있어서,
Hoxb5 단백질은 서열번호 2로 표시되는 정보를 제공하는 방법.