ES2384932T3

ES2384932T3 - Agente anti-angiogénico y su utilización en el marco del tratamiento de los cánceres

Info

Publication number: ES2384932T3
Application number: ES04786012T
Authority: ES
Inventors: Jean Plouet; Maryvonne Laurent-Beubry; Cécile MARTINERIE-KRYCEVE
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2012-07-16
Anticipated expiration: 2024-07-30
Also published as: FR2858234A1; JP2007501203A; ATE546154T1; WO2005011725A3; US7507712B2; JP4960091B2; PT1648494E; FR2858234B1; EP1648494B1; EP1648494A2; US20070059314A1; WO2005011725A2; JP2011231113A

Abstract

Utilización:- de una proteína, caracterizada porque está constituida por:* la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o* un fragmento de esta proteína, representado por la secuencia SEC ID nº 12,- de una secuencia nucleotídica caracterizada porque comprende, o está constituida por, una secuencianucleotídica que codifica:* o bien para la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente,* o bien para un fragmento de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente,correspondiendo dicha secuencia nucleotídica a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SECID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12,- de un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV representada por la secuencia SEC ID nº 2, imitando dichoanticuerpo las funciones de la proteína NOV reconociendo el VEGF,para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento:- de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en el marco de las patologías siguientes:la degenerescencia macular relacionada con la edad; las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, losangiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi, o- las patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en el marco de las patologías siguientes: elrechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación deinjertos entre la extracción y el trasplante.

Description

Agente anti-angiogénico y su utilización en el marco del tratamiento de los cánceres.

La presente invención tiene por objeto un nuevo agente anti-angiogénico, así como su utilización, en particular en el marco del tratamiento de los cánceres.

La angiogénesis es un proceso de crecimiento de nuevos capilares sanguíneos a partir de vasos preexistentes. Tres fenómenos particulares son en particular la base de este proceso: la proliferación, la migración y la diferenciación (la tubulogénesis) de las células endoteliales. La angiogénesis se activa por ciertos factores de crecimiento, denominados factores angiogénicos, tales como el VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, factor de crecimiento endotelial vascular), el FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, factor de crecimiento de los fibroblastos 1) o el FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, factor de crecimiento de los fibroblastos 2).

En tiempo normal, la angiogénesis está esencialmente restringida al sistema reproductor femenino y a la cicatrización de heridas. Sin embargo, la angiogénesis está asimismo implicada en numerosos casos patológicos, tales como la retinopatía diabética, la psoriasis, la poliartritis reumatoide, la degenerescencia macular relacionada con la edad, y los cánceres. En efecto, en este último caso, se ha demostrado que el crecimiento tumoral estaba altamente favorecido por la aparición, en el seno de estos tumores, de una neo-vascularización que resulta, en particular, de la secreción por los tumores de factores angiogénicos.

Están en curso numerosas tentativas de tratamiento terapéuticos basados en la utilización de proteínas antiangiogénicas. Entre estos compuestos, uno de los más prometedores es la endostatina (O'Reilly et al., 1997), que está actualmente en ensayos clínicos de fase I (Herbst et al., 2002). La endostatina es una proteína de 20 kDa que corresponde a un fragmento del colágeno XVIII. El mecanismo de acción de la endostatina sigue siendo desconocido.

Ciertas tentativas terapéuticas se basan en la elucidación de mecanismos de acción conocidos. Así, las células endoteliales en proliferación expresan la integrina avb3, mientras que las células endoteliales quiescentes no la expresan (Nrooks, 1994). Esta observación ha permitido desarrollar unos inhibidores de esta molécula actualmente en curso de ensayos clínicos.

Entre todos los actores moleculares implicados en la activación de la angiogénesis, sólo el VEGF ha demostrado su eficacia en prácticamente todos los modelos experimentales de medición de actividad de la angiogénesis (Ortéga, 1999). Además, en la primavera de 2003, se hizo público por la compañía Genentech que unos anticuerpos anti-VEGF ejercían una actividad antitumoral en los enfermos que padecen cáncer de colon. Así, es de suma importancia buscar unas moléculas que puedan unirse al VEGF y, por lo tanto, ejercer una actividad anti-tumoral comparable a la de los anticuerpos anti-VEGF.

El gen nov, en primer lugar identificado en unos nefroblastomas aviares (Joliot et al., 1992; Martinerie y Perbal, 1991), se ha clonado en el ser humano (novH) (Martinerie et al., 1994), el ratón (novM) (Snaith et al., 1996) y Xenopus laevis (Ying y Ling, 1996). La proteína NOV, codificada por el gen nov, cuya función es hoy en día desconocida, pertenece a la familia CCN (Bork, 1993) que comprende las proteínas siguientes: CYR61 (Lau y Nathans, 1985), CTGF (Bradham et al., 1991), ELM-1 o WISP-1 (Pennica et al., 1998; Hashimoto et al., 1998), R-COP o WISP-2 (Pennica et al., 1998; Kumar et al., 1999; Brigstock, 1999) y WISP-3 (Pennica et al., 1998). Estas proteínas están todas constituidas de cuatro dominios distintos: una proteína que se une a un factor de crecimiento análogo a la insulina (IGFBP), un dominio de repetición del factor Willebrand de tipo C, un dominio de repetición de trombospondina de tipo I y un dominio COOH-terminal. Las proteínas de la familia CCN regulan diferentes procedimientos celulares normales que comprenden la proliferación, la adhesión, la apoptosis y la quimiotaxia. Están asimismo implicadas en la implantación, la formación esquelética, el desarrollo embrionario y en diferentes enfermedades tales como la fibrosis, la cicatrización y los cánceres (Chevalier et al., 1998).

La proteína NOV humana (NOVH) se puede detectar en los tejidos normales (riñones, músculos, cartílago, cerebro, pulmones, ovarios, corazón y corticosurenal) a diferentes niveles (Joliot et al., 1992; Martinerie et al., 2001; Kocialkowski et al., 2001; Perbal et al., 1999) y su expresión varía durante el desarrollo.

A día de hoy, las funciones ejercidas por la proteína NOV no están claramente establecidas. Se ha propuesto recientemente que la NOV podría ejercer una acción proangiogénica (Lin, 2003) permitiendo que se unan ciertas integrinas (avb3, a6b1 y a5b1). Además, estos autores muestran que la NOV ejerce una actividad proangiogénica en el modelo de córnea de conejo. Sin embargo, se ha demostrado que este ensayo puede conducir a resultados falsamente positivos por liberación de factores angiogénicos sintetizados y almacenados en la córnea (Plouët, 1997).

Así, la presente invención resulta de la puesta en evidencia de la actividad anti-angiogénica de NOV debido a su unión a VEGF.

La presente invención tiene por objetivo proporcionar un nuevo agente anti-angiogénico que tiene un nuevo mecanismo de acción.

La presente invención se basa en la constatación hecha por los inventores de se puede prever la utilización:

5 -de una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

*: la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

*: un fragmento de esta proteína, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y estando representado en particular por una de las secuencias siguientes SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o

*: cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido

15 anteriormente, en particular por sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, siempre que esta secuencia derivada presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, o

* cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, que tiene como referencia una homología de por lo menos aproximadamente 80%, y en particular 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis,

-: de una secuencia nucleotídica, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica que codifica:

25 * o bien para la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para un fragmento de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia derivada de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia homóloga de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica en particular a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1, que codifica para la SEC ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 3 que codifica para la SEC ID nº 4, o a la secuencia SEC ID nº 5 que codifica para la SEC ID nº 6, o a la secuencia SEC ID nº 7 que codifica para la SEC ID nº 8, o a la secuencia SEC ID nº 9 que codifica para la SEC ID nº 10, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12,

-: de un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV,

para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento:

-: de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: la degenerescencia macular relacionada con la edad; las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi, o

45 - de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: el rechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de injertos entre la extracción y el trasplante.

Asimismo, la invención se refiere a la utilización:

-: de una proteína caracterizada porque está constituida por:

* la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

* un fragmento de esta proteína, representada por la secuencia SEC ID nº 12 55

* o bien para la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente,

* o bien para un fragmento de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12,

65 - de un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV representada por la secuencia SEC ID nº 2, imitando dicho anticuerpo las funciones de la proteína NOV reconociendo el VEGF,

para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento:

*: de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en el marco de las patologías siguientes: la degenerescencia macular relacionada con la edad, las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi, o

*: de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en el marco de las patologías siguientes: el rechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de injertos entre la extracción y el trasplante.

Por otra parte, la presente invención se basa en la constatación anterior de que la utilización de una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

*: la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

*: un fragmento de esta proteína, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC IDnº 12, o

*: cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, en particular por sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, siempre que esta secuencia derivada presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, o

*: cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente el 80%, y en particular el 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis,

puede ser considerada para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento:

-: de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: el rechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de injertos entre la extracción y el trasplante.

La secuencia SEC ID nº 2 corresponde a la proteína humana NOV codificada por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1.

La secuencia SEC ID nº 4 corresponde al fragmento IGFBP (proteína que se une a un factor de crecimiento análogo a la insulina) de la proteína humana NOV, estando dicho fragmento codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 3. Este fragmento comprende 72 aminoácidos y corresponde al fragmento de la proteína NOV que va del resto 33 al resto 104 de la secuencia SEC ID nº 2.

La secuencia SEC ID nº 6 corresponde al fragmento VWC (dominio de repetición del factor Willebrand de tipo C) de la proteína humana NOV, estando dicho fragmento codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 5. Este fragmento comprende 67 aminoácidos y corresponde al fragmento de la proteína NOV que va del resto 108 al resto 174 de la secuencia SEC ID nº 2.

La secuencia SEC ID nº 8 corresponde al fragmento TSP-1 (dominio de repetición de trombospondina de tipo I) de la proteína humana NOV, estando dicho fragmento codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 7. Este fragmento comprende 45 aminoácidos y corresponde al fragmento de la proteína NOV que va del resto 206 al resto 250 de la secuencia SEC ID nº 2.

La secuencia SEC ID nº 10 corresponde al fragmento CT (dominio COOH-terminal) de la proteína humana NOV, estando dicho fragmento codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9. Este fragmento comprende 75 aminoácidos y corresponde al fragmento de la proteína NOV que va del resto 264 al resto 338 de la secuencia SEC ID nº 2.

La secuencia SEC ID nº 12 corresponde al fragmento C-terminal de la proteína humana NOV, estando dicho

fragmento codificado por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 11. Este fragmento comprende 170 aminoácidos y corresponde al fragmento de la proteína NOV que va del resto 188 al resto 357 de la secuencia SEC ID nº 2.

La actividad de inhibición de la angiogénesis se designa también anti-angiogénica. Esta actividad puede ser, por ejemplo puesta en evidencia in vitro demostrando la inhibición al mismo tiempo de la multiplicación, de la migración y de la diferenciación, de células endoteliales por las secuencias peptídicas de la invención. La medición de la inhibición de la multiplicación de las células endoteliales se puede realizar cultivando unas células endoteliales en presencia de la secuencia peptídica cuya actividad se desea evaluar. La medición de la inhibición de la migración de las células endoteliales se puede realizar efectuando una "herida" en un tapiz de células endoteliales e incubando después las células en presencia de la secuencia peptídica a ensayar. Se mide entonces el número de células que han migrado sobre la herida. La medición de la inhibición de la diferenciación (tubulogénesis) de las células endoteliales se puede realizar midiendo la longitud de los túbulos formados por unas células endoteliales cultivadas sobre gel en presencia de la secuencia peptídica a ensayar.

Entre los modelos clásicos de medición de angiogénesis, se pueden citar los modelos por suministro local tal como:

-: la inyección subcutánea de Matrigel (Becton Dickinson) impregnada del compuesto de la invención (Inoki et al., 2002), o

-: el depósito sobre la membrana corio-alantoidea de pollo de un implante que contiene un compuesto de la invención (Celerier et al., 2002).

El compuesto de la invención se puede inyectar por vía sistémica (intravenosa, intraperitoneal, subcutánea) a animales en los que se ha creado una enfermedad angiogénica experimental. El compuesto de la invención se puede inyectar también directamente en un tumor. Alternativamente, la proteína NOV o los fragmentos o los anticuerpos anti-idiotípicos según la invención (descritos a continuación) pueden ser suministrados mediante un método de terapia génica por vía local o sistémica mediante cualquier método que permita la expresión de la proteína o de los fragmentos o de los anticuerpos anti-idiotípicos según la invención (virus o plásmido que contiene la secuencia de NOV). Alternativamente, la secuencia de NOV o de los fragmentos o de los anticuerpos antiidiotípicos según la invención se puede insertar en un plásmido que está transfectado en las células cancerígenas (en este caso la medición consiste en medir la evolución de tumores desarrollados a partir de células cancerígenas transfectadas por un plásmido que contiene o no la secuencia de NOV o de un fragmento). Todos estos procedimientos de medición están descritos en particular en el artículo de Jain et al., (1997).

Se designa por actividad anti-tumoral, una actividad que permite inhibir el crecimiento tumoral y/o inducir la regresión, incluso la desaparición, de tumores. Esta actividad se puede poner en evidencia, por ejemplo, in vivo midiendo la masa de los tumores, de los cuales se ha inducido el desarrollo en el ratón mediante inyección de células tumorales, en presencia y ausencia de administración de secuencias peptídicas de la invención y/o de ácidos nucleicos que expresan las secuencias peptídicas de la invención.

La expresión "inhibición de la proliferación endotelial" designa cualquier sustancia capaz de frenar la proliferación de células endoteliales según el ensayo descrito más adelante (parte experimental).

La expresión "activación endotelial" corresponde a cualquier patología que implica unas células endoteliales sometidas a una concentración incrementada en VEGF con respecto al estado no patológico.

Según un modo de realización ventajoso, la presente invención se refiere a la utilización, tal como se ha definido anteriormente, de una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2.

Una utilización ventajosa según la presente invención consiste en la utilización, tal como se ha definido anteriormente, de una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: la degenerescencia macular relacionada con la edad, las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi.

Una utilización ventajosa según la presente invención consiste en la utilización, tal como se ha definido anteriormente, de una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: el rechazo de aloinjerto y xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de injertos entre la extracción y el trasplante.

La presente invención se basa asimismo en la constatación hecha por lo inventores en lo que se refiere a que se puede utilizar tal como se ha definido anteriormente una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

* un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de

5 aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o

*: cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente el 80%, y en particular el 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia

15 SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis.

La presente invención se basa asimismo en la constatación hecha por los inventores en lo que se refiere a que se puede utilizar tal como se ha definido anteriormente una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

* un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o

35 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: la degenerescencia macular relacionada con la edad, las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi.

La presente invención se basa asimismo en la constatación hecha por los inventores en lo que se refiere a que se puede utilizar una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

45 aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o

55 SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis,

para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: rechazo de aloinjerto y xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de injertos entre la extracción y el trasplante.

La presente invención se basa asimismo en la observación hecha por los inventores, en lo que se refiere a que se puede utilizar una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

* un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, siempre que este fragmento

65 presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o

* cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento, tal como se ha definido

anteriormente, en particular por sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, siempre que esta 5 secuencia derivada presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, o

* cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento, tal como se ha definido anteriormente, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente el 80%, y en particular el 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis,

para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los cánceres.

Asimismo, la invención se refiere a la utilización de una proteína, caracterizada porque está constituida por un 15 fragmento de la proteína NOV, estando dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los cánceres.

Asimismo la utilización:

-: de una proteína, caracterizada porque comprende o está constituida por:

*: la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

*: un fragmento de esta proteína, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la

25 angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, o

*: cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento, tal como se ha definido anteriormente, en particular por sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, siempre que esta secuencia derivada presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, o

*: cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento, tal como se ha definido anteriormente, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente el 80%, y en

35 particular el 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis,

-: una secuencia nucleotídica, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica que codifica:

* o bien para la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para un fragmento de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia derivada de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

45 * o bien para una secuencia homóloga de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica en particular a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 3 que codifica para la SEC ID nº 4, o a la secuencia SEC ID nº 5 que codifica para la SEC ID nº 6, o a la secuencia SEC ID nº 7 que codifica para la SEC ID nº 8, o a la secuencia SEC ID nº 9 que codifica para la SEC ID nº 10,

-: de un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV,

se puede utilizar para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la

55 inhibición de la proliferación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: la degenerescencia macular relacionada con la edad; las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi.

De la misma manera:

-: una proteína, caracterizada porque comprende o está constituida por:

* la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

65 * un fragmento de esta proteína, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, o

* cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido

5 anteriormente, en particular por sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, siempre que esta secuencia derivada presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, o

* cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente el 80%, y en particular el 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la angiogénesis,

-: una secuencia nucleotídica, caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica 15 que codifica:

* o bien para la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente, * o bien para un fragmento de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia derivada de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia homóloga de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica en particular a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 3 que codifica para la SEC ID nº 4, o a la secuencia SEC ID nº 5 que codifica para la SEC ID nº 6, o a la secuencia SEC ID nº 7 que codifica para la SEC ID nº 8, o a la secuencia

25 SEC ID nº 9 que codifica para la SEC ID nº 10,

-: un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV,

se pueden utilizar para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el marco de las patologías siguientes: rechazo de aloinjerto y xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de injertos entre la extracción y el trasplante.

Los inventores han constatado asimismo que era posible preparar una composición farmacéutica, caracterizada 35 porque contiene como sustancia activa:

-: una proteína, caracterizada porque comprende o está constituida por:

*: la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

*: un fragmento de esta proteína, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, preferentemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID

45 nº 10 o SEC IDnº 12, o

*: cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente el 80%, y en particular el 85%, con la región comprendida entre los aminoácidos en la posición (33) y (338) de la secuencia SEC ID nº 2, siempre que esta secuencia homóloga presente una actividad de inhibición de la

55 angiogénesis,

* o bien para la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para un fragmento de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia derivada de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, * o bien para una secuencia homóloga de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica en particular a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 3 que codifica para la SEC ID nº 4, o a la secuencia SEC ID nº 5

que codifica para la SEC ID nº 6, o a la secuencia SEC ID nº 7 que codifica para la SEC ID nº 8, o a la secuencia SEC ID nº 9 que codifica para la SEC ID nº 10, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12,

-: un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV,

en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable.

Asimismo, es posible preparar una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene como sustancia activa una proteína caracterizada porque comprende o está constituida por:

*: un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, siempre que este fragmento presente una actividad de inhibición de la angiogénesis, comprendiendo dicho fragmento en particular de aproximadamente 40 a aproximadamente 180 aminoácidos, y estando en particular representado por una de las secuencias siguientes: SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o

en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere así a una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene como sustancia activa:

-: una proteína caracterizada porque está constituida por un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, estando dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12.

-: una secuencia nucleotídica caracterizada porque comprende o está constituida por una secuencia nucleotídica que codifica:

* o bien para la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

* o bien para un fragmento de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12.

-: un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV representada por la secuencia SEC ID nº 2, imitando dicho anticuerpo las funciones de la proteína NOV reconociendo el VEGF,

en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable.

En un modo de realización ventajoso, la invención se refiere a una composición farmacéutica definida anteriormente, caracterizada porque contiene como sustancia activa una proteína caracterizada porque está constituida por un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, estando dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12, en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable.

Asimismo, se puede preparar una composición farmacéutica ventajosa que contiene, como sustancia activa, el fragmento TSP-1 mencionado anteriormente (SEC ID nº 8).

Una composición ventajosa según la invención se caracteriza porque la actividad de inhibición de la angiogénesis se mide según el ensayo de proliferación, de migración o de diferenciación, y porque esta actividad de inhibición corresponde a un porcentaje de inhibición comprendido entre el 20% y el 100% de la angiogénesis obtenida en presencia del vehículo solo.

Los ensayos de proliferación, de migración y de diferenciación (angiogénesis in vitro) se describen más adelante en la parte experimental.

La presente invención se refiere asimismo a una composición tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque contiene como sustancia activa la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2.

Según un modo de realización ventajoso de la presente invención, la composición tal como se ha definido anteriormente está caracterizada porque es susceptible de ser administrada a razón de aproximadamente 0,1 a

aproximadamente 20 mg/kg/día.

La presente invención se refiere asimismo a la utilización, tal como se ha definido anteriormente, para la preparación de una composición tal como se ha definido anteriormente, destinada a ser administrada a razón de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg/día.

Es también posible preparar una composición tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque se administra en forma de un gen, de una proteína o de un péptido que contiene la secuencia de tipo TSP-1 (SEC ID nº 8).

Una composición ventajosa de la invención se administra en particular preferentemente en forma inyectable.

Descripción de las figuras

La figura 1 corresponde al enlace de la forma yodada de VEGF165 sobre la proteína NOV.

La proteína NOV (4 !g/ml) se inmoviliza sobre un plástico según las condiciones descritas en la parte experimental, y después se incuba con VEGF165 yodado (1 ng/pocillo) en ausencia (columna PBS) o en presencia de 2 !g/ml de VEGF165 (columna 0) o de NOV (columna NOV). Los resultados están expresados en cpm de VEGF165 yodado fijado por pocillo, después del lavado.

La figura 2 corresponde al enlace de la forma yodada de VEGF189 sobre la proteína NOV.

La proteína NOV (4 !g/ml) se inmoviliza sobre un plástico según las condiciones descritas en la parte experimental, y después se incuba con VEGF189 yodado (1 ng/pocillo) en ausencia (columna PBS) o en presencia de 2 !g/ml de VEGF189 (columna 0) o de NOV (columna NOV). Los resultados están expresados en cpm de VEGF189 yodado fijado por pocillo, después del lavado.

La figura 3 corresponde al ensayo de migración de las células. Las células son contadas en 8 campos y la media se representa en el eje de las ordenadas. El eje de las abscisas corresponde a la concentración de la proteína NOV en !g/ml. Los puntos representados por unos rombos corresponden a las células no incubadas con VEGF y los puntos representados por unos cuadrados corresponden a las células tratadas previamente con VEGF.

La figura 4 corresponde al ensayo de proliferación de las células. El eje de las abscisas corresponde a la concentración de la proteína NOV en !g/ml y el eje de las ordenadas a la densidad óptica medida a 595 nm. Los puntos representados por unos rombos corresponden a las células que no han sido estimuladas por el VEGF y los puntos representados por unos cuadrados corresponden a las células que han sido estimuladas por el VEGF.

La figura 5 corresponde al ensayo de adhesión de las células FBAE. El eje de las abscisas corresponde a la concentración de la proteína NOV en !g/ml y el eje de las ordenadas a la densidad óptica medida a 595 nm. Los puntos representados por unos rombos corresponden a las células no incubadas con VEGF y los puntos representados por unos cuadrados corresponden a las células tratadas previamente con VEGF.

Las figuras 6A y 6B representan el efecto de NOV y de sus fragmentos sobre la migración de las células HUAEC estimuladas con VEGF165. La figura 6A corresponde a los ensayos control con unas células no estimuladas con VEGF165 y la figura 6B corresponde a los ensayos con unas células estimuladas con VEGF165. Las columnas representan el número de células/campos. Las columnas blancas corresponden a las células control (sin adición de NOV o de uno de sus fragmentos); las columnas negras corresponden a las células estimuladas en presencia de NOV; las columnas rayadas verticalmente corresponden a las células estimuladas en presencia del fragmento Nterminal de NOV (aminoácidos 1 a 187 de NOV) y las columnas rayadas horizontalmente corresponden a las células estimuladas en presencia del fragmento C-terminal de NOV.

La figura 7A representa el efecto de la proteína NOV o de su fragmento C-terminal sobre la proliferación de las HUAEC (células endoteliales arteriales umbilicales humanas) estimuladas con VEGF165. El eje de las abscisas corresponde a la concentración de la proteína NOV o del fragmento C-terminal (SEC ID nº 12) en !g/ml y el eje de las ordenadas a la densidad óptica medida a 595 nm. La curva en trazo continuo con los cuadrados blancos corresponde a la proteína NOV y la curva en trazo punteado con los cuadrados negros corresponde al fragmento SEC ID nº 12.

La figura 7B representa el efecto de la proteína NOV o de su fragmento C-terminal sobre la proliferación de las HUAEC estimuladas con bFGF. El eje de la abscisas corresponde a la concentración de la proteína NOV o del fragmento C-terminal (SEC ID nº 12) en !g/ml y el eje de las ordenadas a la densidad óptica medida a 595 nm. La curva en trazo continuo con los cuadrados blancos corresponde a la proteína NOV y la curva en trazo punteado con los cuadrados negros corresponde al fragmento SEC ID nº 12.

Las figuras 8A y 8B representan el efecto del fragmento C-terminal de la proteína NOV (SEC ID nº 12) sobre la

angiogénesis corneana. La figura 8A corresponde a la inyección de LPS solo y la figura 8B a la inyección de LPS y de dicho fragmento C-terminal.

Parte experimental

Materiales:

La molécula NOV está producida mediante infección de células de insecto SF9 por un baculovirus recombinante que contiene el ADNc correspondiente (SEC ID nº 1) (Thibout et al, 2003).

Las isoformas de 165 y 189 aminoácidos de VEGF se producen mediante infección de células de insecto SF9 por un baculovirus recombinante que contiene el ADNc correspondiente (Plouët et al., 1997).

Unas células endoteliales arteriales umbilicales humanas (HUAEC) se han aislado a partir de arterias umbilicales perfusionadas con colágeno (Sigma) para digerir la membrana basal. Las células HUAEC se han mantenido en SFM (Life Sciences) adicionado con 20% de suero de ternera fetal (SVF) inactivado por el calor. Los cultivos cepas han recibido 1 ng/ml de VEGF cada día.

Unas células endoteliales de aorta fetal bovina (FBAE) se han aislado a partir de aortas fetales obtenidas de un matadero local. Las células se han mantenido en DMEM glutamax (Life Sciences) adicionado con 10% de suero de ternera recién nacida (NBCS) inactivado por el calor, 100 !g/ml de penicilina y 100 !g/ml de estreptomicina a 37ºC en 10% de CO2 y 1 ng/ml de VEGF cada 2 días.

Interacción directa entre VEGF y NOV

Para el enlace con la proteína NOV inmovilizada, se han recubierto unas placas ELISA de 96 pocillos con 4 !g/ml de proteína NOV en un tampón carbonato 0,05 M a pH 9,6 durante la noche a 4ºC. Los sitios de unión no específicos se han bloqueado con 5 mg/ml de BSA en tampón carbonato. Después de lavar dos veces los pocillos con PBS a pH 7,4, se añadió 1 ng de VEGF yodado a cada pocillo en presencia o no de 2 !g/ml de VEGF165 o de NOV, diluidos en PBS que contiene 0,05% de Tween 20, 0,5% de BSA, 1 mM de MgCl2 y 1mM de CaCl2.

Los pocillos se lavaron 3 veces con una mezcla de PBS-Tween 20 al 0,1%, BSA al 0,5% y las proteínas unidas se solubilizaron en NaOH al 0,2M.

Los resultados de estos experimentos están representados en las figuras 1 y 2.

La figura 1 muestra que el VEGF165 yodado se asocia específicamente a NOV puesto que la adición de VEGF no radiomarcado (VEGF) inhibe esta unión. Asimismo, la adición de NOV inhibe la unión de VEGF165 radiomarcado con NOV.

Ensayos de migración

Se inoculan unas células FBAE en unos pocillos de 4 cm3 a alta densidad (50.000 células/pocillo). Cuando la monocapa es confluente, la proliferación se detiene mediante la incubación, durante una noche, en presencia de DMEM sin suero. Se práctica entonces una herida en la monocapa con la ayuda de un raspador de espuma, que permite delimitar una superficie libre de cualquier célula. Las monocapas se lavan a continuación 3 veces mediante DMEM para quitar las células no adherentes. Se toma entonces una fotografía para delimitar la superficie antes de cualquier migración celular. Los pocillos se incuban a continuación en DMEM solo o en presencia de 50 ng/ml de VEGF en presencia de concentraciones variables de NOV. Después de 24 horas, los pocillos se lavan 3 veces y se colorean con May-Grunwald-Giemsa, y se fotografían. Las fotografías tomadas antes y después del experimento se superponen entonces para permitir el recuento de las células que han migrado.

Los resultados de estos ensayos se indican en la figura 3.

La adición de NOV en ausencia de VEGF no tiene ningún efecto sobre la migración basal de las células. Por el contrario, NOV inhibe la actividad de VEGF y el 50% del efecto máximo se obtiene con una concentración de 50100 ng/ml de NOV.

Ensayos de proliferación

Unas placas de cultivo de 96 pocillos se inseminaron con 1.000 células FBAE por pocillo en DMEM adicionado con 5% de NBCS. Las células se estimularon o no con 2 ng/ml de VEGF165 y diferentes concentraciones de NOV. Tras 5 días, se aclaran los pocillos lentamente con DMEM y se fijan las células en 1% de glutaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se cuantifican mediante incorporación de violeta cristalizado (Kueng et al, 1989); las células se incubaron en 0,1% de violeta cristalizado (Sigma) diluido en 0,2 M de tampón borato a pH 9,5 durante 20 minutos a temperatura ambiente, el colorante no incorporado se eliminó lavando completamente los

pocillos con grandes cantidades de agua y el colorante violeta cristalizado incorporado se solubilizó después mediante 100 !l de 10% de ácido acético por pocillo. Las lecturas de densidad óptica se efectuaron a 595 nm. Unos resultados similares se obtuvieron en tres experimentos separados (véase la figura 4). Los valores indicados son unas densidades ópticas medias de 6 pocillos ± SD.

La proteína NOV utilizada sola no tiene efecto significativo sobre la proliferación basal (debida al suero solo). Sin embargo, la proteína NOV inhibe la proliferación inducida por el VEGF sobre un modo dependiente de la dosis. Se obtiene el 50% del efecto máximo con una concentración de 100-200 ng/ml de NOV.

Ensayos de adhesión celular

Unas placas ELISA de 96 pocillos (Nunc) se han recubierto de proteína VEGF165 según el protocolo descrito en el artículo de Hutchings et al. (2003), diluida en tampón carbonato 0,05 M a pH 0,6 durante la noche a 4ºC. Los sitios de unión no específicos se han bloqueado durante 1 hora a 37ºC con 5 mg/ml de BSA en un tampón carbonato y lavados dos veces con DMEM antes de los experimentos. Las células han sido tripsinadas, lavadas y resuspendidas en 5 ml de DMEM con 10% de SVF en un tubo de plástico no tratado durante 1 hora a 37ºC con 10% de CO2. Las células han sido concentradas después mediante centrifugación y resuspendidas en una mezcla DMEM + 0,2% BSA sin suero, y la suspensión celular se ha tratado durante 20 minutos (37ºC, 10% de CO2) con la proteína NOV utilizada para modular la adhesión. Se han distribuido 40.000 células por pocillo en los pocillos en un volumen de 100 !l de DMEM + 0,2 de BSA. Las células se han dejado adherir a 37ºC con 10% de CO2 durante el tiempo deseado. Los pocillos se han lavado lentamente tres veces con DMEM para retirar las células no adherentes y las células adherentes se han fijado con 1% de glutaraldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se han cuantificado mediante incorporación de cristal violeta (Kueng et al., 1989); las células se han incubado con 0,1% de violeta cristalizado (Sigma) diluido en 0,2 M de tampón borato a pH 9,5 durante 20 minutos a temperatura ambiente, el colorante no incorporado se ha eliminado lavando completamente los pocillos con grandes cantidades de agua y el colorante cristal violeta incorporado se ha solubilizado después mediante 100 !l de 10% de ácido acético por pocillo (véase la figura 5).

Angiogénesis in vitro

Cuatro colas de rata se han despellejado y disecado para recuperar los haces blancos que están constituidos en su mayor parte por colágeno de tipo I. El colágeno se extrae de estas fibras en 50 ml de ácido acético 0,5 M frío y se agitan durante una noche. El líquido se centrifuga después a 5.000 g durante 40 minutos y se recupera el sobrenadante. La extracción se rehace una vez con 20 ml de ácido acético, los sobrenadantes se mezclan y después se dializan contra 1 l de ácido acético 0,2 M. La concentración en colágeno se ajusta a 3 mg/ml por pesaje. La preparación de los geles para la angiogénesis in vitro se efectúa sobre hielo para conservar la disolución de colágeno en forma líquida. Un ml de colágeno (5 mg/ml) se mezcla con 0,5 ml de DMEM 10X (que contiene una concentración 10X en antibióticos y en glutamina), 0,9 ml de H2O estéril y 0,1 ml de bicarbonato de sodio 1M. Una vez ajustado el pH a 7,4, éste se ajusta a un volumen igual de matrigel (Becton Dickinson). El gel se vierte en unos pocillos de cultivo (2 mm de grosor) y se incuba a 37ºC para solidificarlo. Las células se añaden después de 15 minutos (100.000 células/cm2) sobre la superficie del gel. Después de 2 horas, se añaden los diferentes factores solubles y se observan y fotografían las células después de 24 horas.

Producción de anticuerpos anti-idiotípicos

En un primer momento, se prepara un anticuerpo neutralizante de NOV inyectando a un animal, en particular un ratón, de la proteína NOV mezclada con el adyuvante completo de Freund (1 volumen por volumen de proteína NOV). Se seleccionará una cantidad de NOV comprendida entre 1 y 200 !g/kg de peso corporal para inmunizar al animal. La misma operación se efectúa con 15 y 30 días de intervalo, salvo que el adyuvante completo es sustituido por adyuvante incompleto. En el día 40, se practica una sangría, el suero se separa y las inmunoglobulinas se purifican mediante cualquier método de fraccionamiento habitual, en particular precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad para la proteína A o G. Se mide la actividad neutralizante de las inmunoglobulinas mediante cualquier ensayo descrito (unión del VEGF yodado, proliferación, migración, adhesión celular). Un lote de inmunoglobulinas se denominará neutralizante cuando tenga la capacidad de inhibir la interacción de NOV con el VEGF.

En un segundo momento, se preparan unos anticuerpos anti-idiotípicos de NOV inyectando a ratones por vía subcutánea 1-100 !g de la preparación de las inmunoglobulinas que neutralizan la actividad de NOV descritas anteriormente en asociación con 100 !l de adyuvante, en particular adyuvante completo de Freund (Sigma). La inyección se repite 15, 30 y 45 días después. Cincuenta y cinco días después de la primera inyección, se inyectan a unos ratones 10 !g del mismo anticuerpo por vía intraperitoneal. Cincuenta y ocho días después de la primera inyección, los ratones son sacrificados y sus bazos son extraídos y dilacerados en un medio ISCOVE para liberar los esplenocitos. Los esplenocitos son fusionados con unas células de mieloma de ratón, en particular unas células AG8X 63 (Kearney et al., 1979), e incubados a razón de 100.000 células/pocillo. La fusión se efectúa mediante adición de 20 veces 50 !l de polietilenglicol (PEG) con 30 segundos de intervalo. Cuatro ml de medio ISCOVE precalentado a 37ºC se añaden entonces gota a gota sobre la suspensión celular, y después, tras un periodo de

incubación de 4 minutos a 37ºC, se añaden 4 ml. La suspensión se centrifuga y después el residuo celular se recoge en 100 ml de medio ISCOVE complementado con 20% de suero de ternera fetal y de HAT 1X (50X: Hipoxantina 5 mM, aminopterina 20 !M y Timidina 0,8 mM) y se distribuye a razón de 100 !l por pocillo sobre los macrófagos. Después de 5 días, se añaden 100 !l de medio HAT, y entre 8 y 14 días el medio acondicionado de cada hibridoma se recoge para medir mediante ELISA los anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos que han servido de agente inmunógeno, es decir los anticuerpos anti-NOV. Se mide entonces la actividad de los anticuerpos anti-idiotípicos mediante un ensayo ELISA.

Los fragmentos Fab de las inmunoglobulinas anti-NOV, preparados mediante cualquier técnica convencional, en particular una digestión con papaína, se inmovilizan sobre unas placas de microtitulación (0,1-20 !g/ml en un tampón carbonato 50 mM pH 9,6). Después de la saturación de los sitios no específicos mediante una disolución de suero-albúmina diluida a 5 mg/ml en el mismo tampón, se añaden los sobrenadantes de cultivos de hibridomas, diluidos a la mitad en un tampón PBS que contiene 0,05% de Tween 20. Después del aclarado, se revelan los anticuerpos anti-idiotípicos mediante la adición de una concentración apropiada de anticuerpos anti-Fc de ratón acoplado con peroxidasa. La cantidad de anticuerpos anti-idiotípicos fijada se mide entonces mediante revelación de la peroxidasa y es proporcional a la intensidad de la reacción colorimétrica.

Los hibridomas seleccionados por su capacidad para segregar unos anticuerpos dirigidos contra unos anticuerpos anti-NOV son entonces clonados, es decir que las células son inseminadas en condición de dilución límite (5 células/ml) bajo un volumen de 0,1 ml por pocillo. El medio se cambia después de 10 días. Después de 15 días, algunos pocillos contienen unos focos de células que se han multiplicado a partir de la célula inseminada al principio, por lo tanto todas estas células son idénticas y proceden del mismo clon. Cuando la superficie ocupada por las células representa por lo menos la mitad de la superficie total del pocillo, el medio se extrae y se analiza como anteriormente mediante ELISA sobre Fab anti-NOV. En esta etapa, se pueden seleccionar los clones productores de anticuerpos y conocer su especificidad.

Una vez identificados los clones, su naturaleza monoclonal se afirma mediante la operación clásica que consiste en inseminar una placa de 96 pocillos con unas células procedentes del mismo clon diluidas en condiciones límite, como anteriormente. Los clones segregantes deben por lo tanto segregar todos un anticuerpo de la misma especificidad para que se declare este anticuerpo monoclonal. Se efectúa entonces una tercera clonación exactamente en las mismas condiciones para asegurar que los clones son efectivamente monoclonales.

Los anticuerpos anti-idiotípicos se criban mediante una batería de ensayos, en particular un ensayo ELISA sobre VEGF inmovilizado. El VEGF se inmoviliza (0,1-10 !g/ml) en un tampón carbonato como anteriormente, y todas las etapas de este ELISA son idénticas a las descritas en ELISA sobre Fab anti-NOV. Este ensayo permite cribar entre todos los anticuerpos anti-idiotípicos los que imitan las funciones de la proteína NOV (SEC ID nº 2) o unos fragmentos de tipo TSP-1 (SEC ID nº 8), es decir unos anticuerpos que reconocen el VEGF.

Construcción de mutantes de NOV

Se han construido unos mutantes de deleción de la proteína NOV según la referencia (Perbal et al., 1999) y producidos en un sistema de expresión de baculovirus:

-: N-ter (corresponde a una secuencia que comprende los aminoácidos 1-187 de NOV), y

-: C-ter, que contiene los aminoácidos 188 a 357 (esta secuencia contiene el dominio de tipo trombospondina (SEC ID nº 8) y el dominio C-terminal rico en cisteínas (SEC ID nº 10).

Ensayos de migración (figura 6)

Se inoculan unas células HUAEC en unos pocillos de 4 cm2 con alta densidad (50.000 células/pocillo). Cuando la monocapa es confluente, la proliferación se detiene mediante la incubación, durante una noche, en presencia de SFM con 1% de NBCS. Se practica entonces una herida en la monocapa con la ayuda de un raspador de espuma, que permite delimitar una superficie libre de cualquier célula. Las monocapas se lavan a continuación 3 veces mediante SFM para quitar las células no adherentes. Se toma entonces una fotografía para delimitar la superficie antes de cualquier migración celular. Los pocillos se incuban después en SFM solo o en presencia de 50 ng/ml de VEGF en presencia de concentraciones variables de NOV o de sus fragmentos N-ter o C-ter- Después de 24h, los pocillos se lavan 3 veces y se colorean con May-Grunwald-Giemsa, y se fotografían. Las fotografías tomadas antes y después del experimento se superponen entonces para permitir el recuento de las células que han migrado.

Los resultados de este ensayo se indican en la figura 6.

La adición de NOV o del fragmento N-ter en ausencia de VEGF no tiene ningún efecto sobre la migración basal de las células. NOV inhibe la actividad de VEGF y el 50% del efecto máximo se obtiene con una concentración de 50100 ng/ml de NOV. El fragmento N-ter no ejerce ninguna actividad inhibidora. Por el contrario, el fragmento C-ter inhibe la migración de las células HUAEC.

Estos experimentos demuestran que la secuencia de NOV que comprende los aminoácidos 188 a 357 es responsable de la actividad de inhibición de la angiogénesis debida al VEGF y que induce una actividad que inhibe la migración incluso en ausencia de VEGF.

5 Ensayos de proliferación (figura 7)

Unas placas de cultivo de 96 pocillos se han inseminado con 2.000 células HUAEC por pocillo en un medio SFM adicionado con 10% de NBCS. Las células se han estimulado o no con 2 ng/ml de VEGF165 y diferentes 10 concentraciones de NOV o del fragmento C-ter. Al cabo de 5 días, los pocillos se han aclarado lentamente con un medio SFM y las células se han fijado en 1% de glutaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se han cuantificado mediante incorporación de violeta cristalizado: las células se han incubado en 0,1% de violeta cristalizado (Sigma) diluido en 0,2 M de tampón borato a pH 9,5 durante 20 minutos a temperatura ambiente, el colorante no incorporado se ha eliminado lavando completamente los pocillos con grandes cantidades

15 de agua y el colorante violeta cristalizado incorporado se solubilizó después mediante 100 !l de 10% de ácido acético por pocillo. Los lectores de densidad óptica se han efectuado a 595 nm. Unos resultados similares se han obtenido en tres experimentos separados (véase la figura 7). Los valores indicados son unas densidades ópticas medias de 6 pocillos ± SD.

20 La proteína NOV inhibe la proliferación inducida por VEGF y FGF sobre un modo dependiente de la dosis. Se obtiene el 50% del efecto máximo con una concentración inhibidora de 50% de 200 ng/ml de NOV frente a VEGF y FGF. Asimismo, el fragmento C-ter inhibe la proliferación inducida por el VEGF o el FGF con una concentración de 200 ng/ml.

25 Estos experimentos demuestran que la secuencia de NOV que comprende los aminoácidos 188 a 357 es responsable de la actividad de inhibición de la angiogénesis. La observación según la cual la actividad mitógena de FGF está inhibida asimismo por el fragmento NOV 188-357 demuestra que la actividad inhibidora no está restringida al único factor VEGF.

30 Angiogénesis de córnea

Se anestesian unas ratas Wistar. Las corneas son seccionadas y se obtiene una bolsa de córnea dilacerando el grosor del estroma con la ayuda de una espátula de espuma. En el fondo de la bolsa se inserta un implante de Elvax (DuPont) que contiene lipopolisacárido, un agente inflamatorio que inicia una reacción angiogénica dependiente de

35 varios factores angiogénicos. Después de 8 días, una reacción angiogénica es visible con respecto al limbo. Cuando el fragmento C-ter se inyecta en la bolsa de córnea (5 !g cada 2 días entre D4 y D8), la reacción angiogénica está totalmente inhibida (figura 8).

Estos experimentos demuestran que el fragmento C-ter de NOV ejerce una actividad anti-angiogénica principal 40 debido a que depende de la activación de varios factores angiogénicos.

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Listado de secuencias

<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE 5

<120> NUEVO AGENTE ANTI-ANGIOGÉNICO Y SU UTILIZACIÓN, EN PARTICULAR EN EL MARCO DEL TRATAMIENTO DE LOS CÁNCERES

<130> WOB 03 AW CNR GIOG 10

<150> FR 03/09506

<151>

<160> 12 15

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211>2389 20 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> CDS 25 <222> (73)..(1143)

<223>

<400> 1

<210>2 <211>357

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

<210>3

<211> 216

5: <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de la proteína NOV

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(216)

<223>

15

<400> 3

<210>4

<211> 72

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de la proteína NOV

<400> 4

<210>5

<211> 201

<212> ADN 15 <213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de la proteína NOV

20 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(201)

<223>

25 <400>5

<210>6 30 <211> 67

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220> 35 <223> fragmento de la proteína NOV

<400> 6

5 <210>7

<211> 135

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> fragmento de la proteína NOV

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(135)

<223>

<400> 7

<210>8

<211> 45

<212> PRT 25 <213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de la proteína NOV

30 <400> 8

<210>9 35 <211>225

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de la proteína NOV

5 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(225)

<223>

10 <400> 9

<210> 10 15 <211> 75

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220> 20 <223> fragmento de la proteína NOV

<400> 10 <210> 12 <211>170

25

<210> 11

<211> 510

<212> ADN

<213> Homo sapiens

30

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(510)

<223>

35

<400> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Claims

REIVINDICACIONES

1. Utilización:

5 -de una proteína, caracterizada porque está constituida por:

*

la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o

*

un fragmento de esta proteína, representado por la secuencia SEC ID nº 12,

10 - de una secuencia nucleotídica caracterizada porque comprende, o está constituida por, una secuencia nucleotídica que codifica:

* o bien para la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente,

* o bien para un fragmento de la proteína NOV, tal como se ha definido anteriormente, 15

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC

ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12,

-

de un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV representada por la secuencia SEC ID nº 2, imitando dicho 20 anticuerpo las funciones de la proteína NOV reconociendo el VEGF,

para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento:

-

de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en el marco de las patologías siguientes:

25 la degenerescencia macular relacionada con la edad; las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi, o

-

las patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en el marco de las patologías siguientes: el

rechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de 30 injertos entre la extracción y el trasplante.
2. Utilización según la reivindicación 1, de una proteína caracterizada porque está constituida por:

* la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, o 35 * un fragmento de esta proteína, representada por la secuencia SEC ID nº 12

para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento:

* de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en el marco de las patologías siguientes:

40 la degenerescencia macular relacionada con la edad, las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi, o

* de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en el marco de las patologías siguientes: el

rechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el marco de la preparación de 45 injertos entre la extracción y el trasplante.
3. Utilización según la reivindicación 2, de una proteína caracterizada porque está constituida por la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2.

50 4. Utilización según la reivindicación 2, de una proteína caracterizada porque está constituida por un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, estando dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12.
5. Utilización de una proteína caracterizada porque está constituida por un fragmento de la proteína NOV, estando

55 dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los cánceres.
6. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene a título de sustancia activa:

60 - una proteína caracterizada porque está constituida por un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, estando dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12,

-

una secuencia nucleotídica, caracterizada porque comprende, o está constituida por, una secuencia nucleotídica

que codifica: 65

* o bien para la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente, * o bien para un fragmento de la proteína NOV tal como se ha definido anteriormente,

correspondiendo dicha secuencia nucleotídica a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1 que codifica para la SEC 5 ID nº 2, o a la secuencia SEC ID nº 11 que codifica para la SEC ID nº 12,

-

un anticuerpo anti-idiotípico de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, imitando dicho anticuerpo las funciones de la proteína NOV reconociendo el VEGF,

10 en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable.
7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, caracterizada porque contiene, a título de sustancia activa, una proteína caracterizada porque está constituida por un fragmento de la proteína NOV, representada por la secuencia SEC ID nº 2, estando dicho fragmento representado por la secuencia SEC ID nº 12, en asociación con un

15 vector farmacéuticamente aceptable.
8. Utilización según las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de una composición según una de las reivindicaciones 6 a 7, destinada a ser administrada a razón de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg/día.