JP2008253265A - GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質を用いる、Nesfatin−1作用調節物質またはNesfatin−1様作用物質のスクリーニング方法 - Google Patents
GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質を用いる、Nesfatin−1作用調節物質またはNesfatin−1様作用物質のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質に試験物質を作用させる工程、およびNesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1様作用物質を特定する工程を含む、Nesfatin-1様作用物質のスクリーニング方法。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は以下のものに関する。
(1)GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質に試験物質を作用させる工程、および
Nesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1様作用物質を特定する工程を含む、
Nesfatin-1様作用物質のスクリーニング方法。
(2)前記受容体タンパク質が、GPR12である(1)記載のスクリーニング方法。
(3)前記試験物質が、配列番号1〜3、または11〜37のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを改変してなるペプチドまたはペプチド類似化合物である(1)または(2)記載のスクリーニング方法。
(4)受容体タンパク質に試験物質を作用させる工程が、前記受容体タンパク質を発現する、細胞または非ヒト動物に、試験物質を作用させる工程である、(1)〜(3)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(5)GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質と、Nesfatin-1との共存系に、試験物質を作用させる工程、および
Nesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1作用調節物質を特定する工程を含む、
Nesfatin-1作用調節物質のスクリーニング方法。
(6)前記受容体タンパク質が、GPR12である(5)記載のスクリーニング方法。
(7)前記受容体タンパク質とNesfatin-1との共存系に、試験物質を作用させる工程が、試験物質をNesfatin-1と共に、前記受容体タンパク質を発現する、細胞または非ヒト動物に作用させる工程である、(5)または(6)記載のスクリーニング方法。
(8)Nesfatin-1受容体構造を、既知のGPR3、GPR6、またはGPR12の構造情報に基づきシミュレーションし、そのシミュレーションされたNesfatin-1受容体構造、またはリガンド構造に基づいて、Nesfatin-1作用調節物質またはNesfatin-1様作用物質をin silicoスクリーニングする方法、またはデザインする方法。
さらに本発明は、摂食調節および/または体重調節の関連因子、特に肥満症候群、摂食障害、代謝異常、糖尿病などの疾患の治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
本発明は、GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質と、Nesfatin-1との共存系に、試験物質を作用させる工程、およびNesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1作用調節物質を特定する工程を含む、Nesfatin-1作用調節物質のスクリーニング方法に関する。
なお、以下、便宜上、GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質を、まとめて「Nesfatin-1受容体」という。
本発明で用いるNesfatin-1受容体発現細胞としては、例えば遺伝子組換えによって作製された「Nesfatin-1受容体導入細胞」、または動物より取得した、Nesfatin-1受容体を発現する細胞もしくは培養細胞株などが挙げられる。
また、Nesfatin-1受容体発現細胞としては、動物の臓器より取得した細胞を用いることもでき、かかる臓器としては、哺乳類の臓器、より好ましくは脳(視床下部、海馬)、肝臓、脂肪組織、筋組織などが挙げられる。また後述のNesfatin-1受容体発現非ヒト動物の臓器から分離した細胞なども用いることが可能である。
なお、本発明のスクリーニング方法に供される「試験物質」は特に制限されるものではなく、その他のペプチド、抗体、および化合物等を用いてもよい。
本発明は、Nesfatin-1受容体に試験物質を作用させる工程、およびNesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1様作用物質を特定する工程を含む、Nesfatin-1様作用物質のスクリーニング方法にも関する。
本発明において「Nesfatin-1様作用物質」とは、前述の「Nesfatin-1作用」と同様の作用を有する物質をいい、より強力なNesfatin-1作用を有する物質、スーパーアゴニスト等があげられる。
本発明において、「Nesfatin-1作用」とは、<Nesfatin-1作用調節物質のスクリーニング方法>に記載したとおりであり、「Nesfatin-1様作用物質」は、例えば「Nesfatin-1受容体との結合能」または「Nesfatin-1受容体のシグナル伝達能」に基づいてスクリーニングすることができる。
「Nesfatin-1受容体との結合能」は、試験物質のNesfatin-1受容体への結合の亢進事象を検出することより評価することができる。Nesfatin-1のNesfatin-1受容体への結合への亢進の測定は、前述の通り、当技術分野における一般的な解析方法、たとえば、FACSやBIACORE、FRET、古典的な直接結合アッセイ等の結合能解析により実施することができる。
「Nesfatin-1受容体のシグナル伝達能」は、直接的または間接的な方法を用いて行うことができ、直接的な方法とは、受容体と共役しているGタンパク質におけるGDP/GTP交換の状態の検出や、細胞内のcAMP量の増減、フォスフォリパーゼCの作用によるイノシトール−3リン酸の生成、細胞内カルシウムイオンの増減、Nesfatin-1受容体のインターナリゼーションなどを指標し、また間接的な方法としては、細胞の増殖、形態変化、遊走、発光などの指標を介して測定することが可能である。「Nesfatin-1受容体との結合能」や「Nesfatin-1受容体のシグナル伝達能」の測定は、前述の<Nesfatin-1作用調節物質のスクリーニング方法>に記載したとおりである。
本発明は、さらに、Nesfatin-1受容体構造を、既知のGPR3、GPR6、またはGPR12の構造情報に基づきシミュレーションし、そのシミュレーションされたNesfatin-1受容体構造、またはリガンド構造に基づいて、Nesfatin-1作用調節物質またはNesfatin-1様作用物質をin silicoスクリーニングする方法、またはデザインする方法に関する。
<組換えNesfatin-1の作製>
マウスNesfatin-1をコードする遺伝子を取得し、そのN末端にGST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)とヒスチジンタグの遺伝子を結合し、翻訳後のタンパク質においてヒスチジンタグのアミノ酸配列とマウスNesfatin-1のアミノ酸配列の間にトロンビンによる切断部位(-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-)が介在する形となるように、発現ベクターを構築した。マウスNesfatin-1の遺伝子の取得は、mouse Brain cDNA(Clontech社)を用いて2回のPCR(Nested PCR)を行うことで行った。1回目のPCRは以下のForward(mNucB2-F337:配列番号38)およびReverse(mNucB2-R712:配列番号39)を各100pMの濃度で、Pyrobest DNA polymerase(タカラバイオ(株)R005A)、添付の反応バッファーおよびdNTPを使用し、添付のプロトコールに従って反応を行った。PCR反応は90℃1分の反応の後、98℃10秒・68℃1分の温度サイクルを30サイクル、その後68℃で2分間反応させる温度条件で行った。
Forward Primer (mNucB2-F337):5’-GCACGCTGAC CGCTC TGGAAG-3’(配列番号38)
Reverse Primer (mNucB2-R712):5’-CAAATGTGTT AGGAT TCTGGTGGTTCA-3’(配列番号39)
Forward Primer (mNucB2-N3[SacII-Thr]):
5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA -3’(配列番号40)
Reverse Primer (mNucB2-R589[NotI]):
5’-GGTTGCGGCCGCTTACCTCT TCAGCTCATCCAGTCTCG-3’(配列番号41)
摂食調節に関わるペプチドに対する受容体は、レプチン受容体に代表されるCytokine Receptor Typeとα-MSH受容体(=MC4R, MC3R)に代表されるGPCRとに大きく分けられる。そこで、まず、GPCRについて解析を進めた。
以下の3種の方法(実施例2および3)でそれぞれピックアップされてきたGPCRをNesfatin-1受容体の候補としてNesfatin-1の作用解析を実施した(実施例5および6に記載)。
<Nesfatin-1投与により発現変動するGPCRのピックアップ>
ICRマウス(日本エス・エル・シー)へ、暗期直前に組換えマウスNesfatin-1(0.5mg/head)あるいは生理食塩水を腹腔内投与し、2時間後に視床下部を採取した。採取した組織からISOGEN(Nippon Gene社)を使用し、添付プロトコールに従ってRNA抽出を実施した。抽出したRNAを使用してイルミナ社のマウスDNAアレイ(47000遺伝子)にて発現解析を実施(イルミナ社に外注)した。その結果、生理食塩水投与と比較して組換えマウスNesfatin-1投与により発現変動が確認されたGPCRをピックアップした。
<視床下部で発現の高いGPCRのピックアップ>
マウスの全脳と視床下部のtotal RNA(BD Bioscience社)を購入し、Agilent Technologies社のマウスDNAマイクロアレイ「Whole Mouse Genome Oligo Array」(Cat.No.G4122A (10.Oct.2005のVersion), 約4万遺伝子を搭載、遺伝子リストはAgilent Technologies社ホームページ参照のこと、RefSeq, RIKEN Build7.1, USCS GoldenPath, Ensemble, NIA Mouse Gene Index, UniGene Build 135, MGI, NCBI Mouse genome Build 32)にて解析を実施(北海道システムサイエンス社に外注)し、発現強度が全脳より視床下部で高いオーファンGPCRをピックアップした。
<候補GPCR発現ベクター構築>
実施例2および3でピックアップされた33種のGPCRに関して、GenBankのcDNA配列に基づき視床下部cDNAを鋳型としてPCRクローニングを実施した。増幅DNAフラグメントをpEF1/MycHisA(Invitrogen社)、あるいはpEF4/MycHisA(Invitrogen社)発現ベクターに連結して塩基配列を決定し候補GPCR発現ベクターを構築した。
<HeLa細胞一過性発現系におけるcAMP産生評価>
実施例4で作製したGPCR発現ベクターをリポフェクションによりHeLa細胞に導入し、一過性発現させた。
HeLa細胞をトリプシンEDTAではがして回収した。7×105cells/2mL/wellにて6well plateにまき、CO2インキュベーターにてオーバーナイト培養をおこなった。翌日、4μgのPlasmidに対して250μLの無血清培地OPTI-MEMに添加してPlasmid溶液を作製した。一方、10μL のLipofectamin2000 (Invitrogen社)を250μLの無血清培地OPTI-MEMに添加してLipofectamine2000溶液を作製した。これらを室温で5分インキュベーションしてLipofectamine2000溶液をPlasmid溶液に少しずつ添加して混合し、室温で20分インキュベーションしリポフェクション用の溶液を作製した。HeLa細胞は上清を除いてOPTI-MEMで一回洗浄し、2mLのOPTI-MEMを添加した後、上記、リポフェクション用の溶液をHeLa細胞の培地中にゆるやかに揺らしながら少しずつ加えた。5時間、CO2インキュベーターにて培養して、その後、培地を血清入りの培地に交換し、さらにCO2インキュベーターにて培養をおこなった。翌日、トランスフェクション細胞をトリプシンではがし、血清ありの培地にて懸濁して遠心により細胞を沈殿させ、無血清培地にて懸濁してさらに遠心し、再度無血清培地にて懸濁してさらに遠心し、無血清培地にて1×106cells/mLの細胞懸濁液を調製した。
<CHO-K1細胞定常的発現系におけるcAMP産生評価>
実施例5においては、HeLa細胞にGPR12を一過性に発現させ、該細胞にNesfatin-1を接触させて、細胞内のシグナルの変化をcAMPの濃度変化で測定できることを示した。今度は、GPR12をコードする遺伝子が導入され、GPR12を定常的に発現するCHO-K1細胞を作製して、細胞内のシグナルをcAMPの濃度変化で測定できることを検証した。また、ここでの被検物質としては、実施例5ではNesfatin-1(82アミノ酸)をもちいたのに対し、そのMid-segmentであるNesfatin-1M30(配列番号11)を用いて検討を行った。さらに、Nesfatin-1やNesfatin-1M30の改変ペプチドの例として、ヒトNesfatin-1M30(Mid Segment)の配列のうち、N末端側から11番目(Leu)及び13番目から17番目(Gln-Val-Ile-Glu-Val)のアミノ酸配列を全てアラニン(Ala)に置換したペプチドであるM30_Ag-A(配列番号50)、N末端から22番目から25番目(Lys-His-Phe-Arg)のアミノ酸配列を全てアラニンに置換したペプチドであるM30_MSH-A(配列番号51)を用い、該改変ペプチドの細胞内のcAMP濃度変化に対する影響についても検討した。
<CHO-K1細胞定常的発現系におけるCREBリン酸化評価>
細胞内でcAMPの上昇が起こったあとの代表的なシグナル伝達系としては、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の活性化、PKAによるCRE結合タンパク質(CREB)のリン酸化、cAMP反応性転写制御部位(CRE)を上流にもつ遺伝子群の発現上昇という経路が知られている。したがって、細胞のシグナルの測定の指標としては、細胞内のcAMP濃度変化のみではなく、それ以降のシグナル伝達系の反応も利用が可能かどうか、まずCREBのリン酸化による反応について検討を実施した。
また、図4のBでは、M30ペプチドの濃度依存的にCREBのリン酸化が亢進していることが示された。このことから、CREBのリン酸化の検出も、GPR12発現細胞を用いたシグナルの検出に用いることが可能であることが示された。
<内因性GPR12発現NB41A3細胞におけるCRE-レポーター遺伝子発現評価>
実施例7においてはcAMPの上昇によって引き起こされる細胞内でのシグナルの一つとして、CREBのリン酸化を指標にシグナルを検出して、Nesfatin-1M30の評価の実例について示した。cAMPの上昇に伴うシグナルとしては、リン酸化CREBがゲノム上のCRE(cAMP responsive element)と呼ばれる部位に結合して、CREの下流にある遺伝子の発現を活性化すると言われている。また、CREによる転写活性化を調べる方法としてはレポーター遺伝子による方法がある。CREの下流部分に、酵素(例えばルシフェラーゼなど)や蛍光タンパク質(例えばGFPなど)などのレポーター遺伝子を結合させることで、CREを介して転写が活性化されたレポーター遺伝子が、最終的に細胞内で機能を持つタンパク質として発現される。その酵素活性や蛍光強度などを測定することによって、CREの転写活性化の程度を測定することができる。そこで、GPR12とNesfatin-1関連ペプチドの反応を、CRE-レポーター遺伝子を用いた系で測定できるか検討を行った。
図5のAの結果から、ペプチドを接触させなかった場合(Vehicle)に対して、Nesfatin-M30(Mid-segment)、M30_MSH-Aを、レポータープラスミド(レポーター遺伝子)が導入された細胞に接触させた場合はルシフェラーゼ活性の亢進が認められたが、M30_MSH-Aを接触させた場合にはVehicleとの差は全く認められなかった。この結果は、実施例6における細胞内cAMP濃度の変化及び実施例7のCREBのリン酸化と同様の結果であった。
M30_Ag-Aの濃度を変えてレポータープラスミド(レポーター遺伝子)を含む細胞に接触させた場合は、濃度に依存したルシフェラーゼ活性の亢進は認められなかった(図5のB)。一方、M30_MSH-Aの濃度を変えてレポータープラスミド(レポーター遺伝子)を含む細胞に接触させた場合は、濃度に依存したルシフェラーゼ活性の亢進が認められた(図5のC)。
<Nesfatin-1改変ペプチドのマウス腹腔内投与による摂餌量への影響>
実施例6〜8においては、GPR12発現細胞における細胞シグナルの検出による、Nesfatin-1関連ペプチドの活性の評価の可能性について示した。一方、国際公開第WO2006/137597号パンフレットにおいては、Nesfatin関連ペプチドを投与された動物の摂餌量や体重増加の抑制を調べることで、Nesfatinの活性を評価できることを開示している。このことから、Nesfatin-1改変ペプチドについて、GPR12を介した細胞シグナルによる評価結果と動物による評価結果に、整合性がみられるか検討した。
図6に示されるように、Nesfatin-1M30(Mid-segment)およびM30_MSH-Aが投与されたマウスにおいては、コントロール群(Vehicle)に比較して有意に摂餌量の低下が観察された。それに対して、M30_Ag-Aが投与されたマウスの摂餌量は、コントロール群との差が認められなかった。
以上より、GPR12に関連する細胞シグナルに基づいて、Nesfatin-1関連物質(Nesfatin-1様作用物質およびNesfatin-1作用調節物質)をスクリーニングすることができることが示された。
(1)配列番号1 ヒト由来Nesfatin-1のアミノ酸配列
(2)配列番号2 マウス由来Nesfatin-1のアミノ酸配列
(3)配列番号3 ラット由来Nesfatin-1のアミノ酸配列
(4)配列番号4 ヒト由来Nesfatin-1の塩基配列
(5)配列番号5 マウス由来Nesfatin-1の塩基配列
(6)配列番号6 ラット由来Nesfatin-1の塩基配列
(7)配列番号7 マウス由来GPR12の塩基配列およびそのCDSのアミノ酸配列
(8)配列番号8 マウス由来GPR12のCDSのアミノ酸配列
(9)配列番号9 ヒト由来MC3Rの塩基配列およびそのCDSのアミノ酸配列
(10)配列番号10 ヒト由来MC3RのCDSのアミノ酸配列
(11)配列番号11 ヒト由来Nesfatin-1M30のアミノ酸配列
(12)配列番号12 ラット由来Nesfatin-1M30のアミノ酸配列
(13)配列番号13 マウス由来Nesfatin-1M30のアミノ酸配列
(14)配列番号14 ヒト由来Nesfatin-1M16のアミノ酸配列
(15)配列番号15 ヒト由来Nesfatin-1M14のアミノ酸配列
(16)配列番号16 ヒト由来Nesfatin-1M10Mのアミノ酸配列
(17)配列番号17 ラット由来Nesfatin-1M16のアミノ酸配列
(18)配列番号18 ラット由来Nesfatin-1M14のアミノ酸配列
(19)配列番号19 ラット由来Nesfatin-1M10Mのアミノ酸配列
(20)配列番号20 マウス由来Nesfatin-1M16のアミノ酸配列
(21)配列番号21 マウス由来Nesfatin-1M14のアミノ酸配列
(22)配列番号22 マウス由来Nesfatin-1M10Mのアミノ酸配列
(23)配列番号23 ヒト由来NUCB1−1のアミノ酸配列
(24)配列番号24 ラット由来NUCB1−1のアミノ酸配列
(25)配列番号25 マウス由来NUCB1−1のアミノ酸配列
(26)配列番号26 ヒト由来NUCB1−M30のアミノ酸配列
(27)配列番号27 ラット由来NUCB1−M30のアミノ酸配列
(28)配列番号28 マウス由来NUCB1−M30のアミノ酸配列
(29)配列番号29 ヒト由来NUCB1−M16のアミノ酸配列
(30)配列番号30 ヒト由来NUCB1−M14のアミノ酸配列
(31)配列番号31 ヒト由来NUCB1−M10Mのアミノ酸配列
(32)配列番号32 ラット由来NUCB1−M16のアミノ酸配列
(33)配列番号33 ラット由来NUCB1−M14のアミノ酸配列
(34)配列番号34 ラット由来NUCB1−M10Mのアミノ酸配列
(35)配列番号35 マウス由来NUCB1−M16のアミノ酸配列
(36)配列番号36 マウス由来NUCB1−M14のアミノ酸配列
(37)配列番号37 マウス由来NUCB1−M10Mのアミノ酸配列
(38)配列番号38 NESFATIN-1 1stPCR Primer mNucB2-F337
(39)配列番号39 NESFATIN-1 1stPCR Primer mNucB2-R712
(40)配列番号40 NESFATIN-1 2ndPCR Primer mNucB2-N3
(41)配列番号41 NESFATIN-1 2ndPCR Primer mNucB2-R589
(42)配列番号42 ヒト由来NESFATINのアミノ酸配列
(43)配列番号43 ヒト由来NESFATIN(Mature)のアミノ酸配列
(44)配列番号44 マウス由来NESFATINのアミノ酸配列
(45)配列番号45 マウス由来NESFATIN(Mature)のアミノ酸配列
(46)配列番号46 ラット由来NESFATINのアミノ酸配列
(47)配列番号47 ラット由来NESFATIN(Mature)のアミノ酸配列
(48)配列番号48 マウス由来GPR3のCDSのアミノ酸配列
(49)配列番号49 マウス由来GPR6のCDSのアミノ酸配列
(50)配列番号50 ヒト由来Nesfatin-1M30の改変ペプチド(M30_Ag-A)アミノ酸配列
(51)配列番号51 ヒト由来Nesfatin-1M30の改変ペプチド(M30_MSH-A)アミノ酸配列
Claims (8)
- GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質に試験物質を作用させる工程、および
Nesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1様作用物質を特定する工程を含む、
Nesfatin-1様作用物質のスクリーニング方法。 - 前記受容体タンパク質が、GPR12である請求項1記載のスクリーニング方法。
- 前記試験物質が、配列番号1〜3、または11〜37のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを改変してなるペプチドまたはペプチド類似化合物である、請求項1または2記載のスクリーニング方法。
- 受容体タンパク質に試験物質を作用させる工程が、前記受容体タンパク質を発現する、細胞または非ヒト動物に、試験物質を作用させる工程である、請求項1〜3のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- GPR3、GPR6、およびGPR12からなる群から選ばれる受容体タンパク質と、Nesfatin-1との共存系に、試験物質を作用させる工程、および
Nesfatin-1作用の変化に基づいてNesfatin-1作用調節物質を特定する工程を含む、
Nesfatin-1作用調節物質のスクリーニング方法。 - 前記受容体タンパク質が、GPR12である請求項5記載のスクリーニング方法。
- 前記受容体タンパク質と、Nesfatin-1との共存系に、試験物質を作用させる工程が、試験物質をNesfatin-1と共に、前記受容体タンパク質を発現する、細胞または発現非ヒト動物に作用させる工程である、請求項5または6記載のスクリーニング方法。
- Nesfatin-1受容体構造を、既知のGPR3、GPR6、またはGPR12の構造情報に基づきシミュレーションし、そのシミュレーションされたNesfatin-1受容体構造、またはリガンド構造に基づいて、Nesfatin-1作用調節物質またはNesfatin-1様作用物質をin silicoスクリーニングする方法、またはデザインする方法。
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