KR20080003929A - 골수 적혈구 전구 세포 분화 촉진제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제, 및 당해 분화 촉진제를 함유하는 빈혈 치료제에 관한 것이다. 당해 분화 촉진제는, 안전성이 높고, 경구 투여 가능하고, 범용성이 있는 우수한 것이다.
골수 적혈구 전구 세포, 분화 촉진제, 조혈 인자 생산 촉진제, 에리스로포에틴, 빈혈 치료제

Description

골수 적혈구 전구 세포 분화 촉진제 {Myeloerythroid progenitor differentiation inducer}
본 발명은 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제, 이를 사용한 빈혈 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조혈 인자 생산 촉진제 및 조혈 인자 생산 촉진제의 증강 물질이나 저해 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
적혈구 조혈은 적혈구 수의 항상성 유지를 위해 필수적인 프로세스이다. 적혈구의 평균 수명은 사람인 경우는 약 120일이고, 노화 적혈구는 순환계에서 계속적으로 제거되기 때문에, 매일, 약 1000억개의 적혈구가 성인 체내에서 새롭게 생산되고 있다. 적혈구의 발생에 관해서는 잘 연구되어 있으며, 수많은 해설서에 기재되어 있지만, 대표예로서「혈액학 중외의학사」로부터 발췌한 개요를 하기했다.
골수중에는 여러 가지 혈구계로 분화가 가능한 다능성 줄기세포가 존재하며, 다능성 줄기세포의 일부는 적혈구계로의 분화 방향이 결정된 적혈구 전구 세포로 분화된다. 적혈구 전구 세포로서 동정되는 가장 원시적인 것은, BFU-E(세포 집락 형성 단위-적혈구, burst forming unit-erythroid)와, 약간 분화가 진행된 CFU- E(콜로니 형성 단위-적혈구, colony forming unit-erythroid)이다. CFU-E 이후는, 전적아구, 호염기성 적아구, 다염성 적아구, 정염성 적아구로 분열하면서 분화되고, 망상 적혈구는 탈핵에 의해 적혈구로 성숙된다. BFU-E, CFU-E의 단계가 되면, 적혈구계로의 분화의 방향이 완전히 결정되어 있고, 적혈구 이외의 혈구계로에 분화되는 경우는 없다. 이로 인해, BFU-E, CFU-E수가 증가하면, 적혈구 조혈이 촉진된다.
적혈구 조혈은, 주로 조혈 인자인 에리스로포에틴(Erythropoetin; EPO)에 의해서 항상성 유지되고 있다. EPO는 주로 신장에서 생산되어 혈액 내를 순환하여, 골수중의 CFU-E에 작용하여 증식, 분화를 자극함으로써 적혈구 조혈을 촉진시킨다. EPO가 정상 수준으로 생산되지 않고 부족하면, CFU-E가 감소하여 적혈구 조혈이 저하되어, 빈혈이 된다. 빈혈은 헤모글로빈 농도가 불충분하고 신체의 산소 수송 요구를 만족할 수 없는 병적 상태이고, 노동 의욕의 저하, 피로감, 숨이 참, 갑자기 일어섰을 때 일어나는 현기증 및 가슴 두근거림의 임상 증상을 나타내기 때문에, 증상을 개선을 위한 요구가 있다. 각종 질환이 EPO 부족에 의한 빈혈을 초래하는 것이 알려져 있지만, 가장 고전적인 예는 신장병이다. 만성신부전 환자는 신장이 손상됨으로써 EPO 생산이 저하되기 때문에, 빈혈을 나타낸다. 만성신부전 환자의 대부분은 신장능 대체를 위해 빈번한 투석을 필요로 하는 투석 환자이지만, 투석 환자의 90%는 빈혈이다. 현재, 빈혈의 치료법으로서, 재조합 사람 EPO(rHuEPO)의 투여가 널리 사용되고 있다. 투석 환자의 90%는 rHuEPO를 투여받고 있고, 이들 중 대부분은 빈혈 개선 효과가 확인되고 있다.
rHuEPO의 빈혈 개선 효과는 높지만, 임상적 이용의 확대와 연관된 몇 가지 문제점이 발생했다. 그 중 하나는 장기간 치료의 비용이다. 전형적 rHuEPO 투여량은 최대로 9000 IU/주이고, 약 가격이 약 12,000엔이지만, 근본적인 질병 원인인 빈혈이 치료되지 않는한 투여는 장기간에 걸치며, 비용면에서의 환자 및 보험 제도의 부담은 크다. 또한, EPO는 정맥내 투여를 필요로 하므로, 투여할 때마다 통원을 해야하는 등 환자의 부담이 큰 것도 문제이다. 또한, rHuEPO의 투여에 의해서 혈액 내 EPO 농도가 상승함에도 불구하고, EPO에 대한 반응이 약하여, 빈혈 개선에 고투여량 rHuEPO가 필요하거나, 거의 빈혈 개선을 볼 수 없는 환자(이들 환자는 EPO 불응성 환자라고 불린다)도 1 내지 20% 정도 존재하는 것이 알려져 있다. EPO 불응성 환자의 빈혈 개선에는, EPO와 다른 작용 기작으로 CFU-E를 증가시키는 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제가 유효하다고 생각된다. 또한 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제를 병용함으로써 rHuEPO 투여 필요량을 감소시키는 효과도 기대된다.
또한, 자기의 혈액을 채취하여, 장래의 사용을 위해 저장하고 있는 사람(자기 혈액 저장자)에 대해 혈액 채취 후에 조혈 작용을 신속히 촉진시키는 수단도 이용될 수 있다.
한편, 적혈구 전구 세포는 EPO 이외에도 다양한 조혈 인자에 의해서 증식 및 분화가 촉진되는 것이 알려져 있다. 조혈 인자인 악티빈 및 IGF-1는 EPO와 협조적으로 CFU-E에 작용하여 증식 및 분화를 촉진시키는 것이 알려져 있다[참조: Blood, 1992, Nov 15; 80(10): 2503-12.]. 또한, 조혈 인자인 SCF는 CFU-E보다 미분화된 적혈구 전구 세포인 BFU-E에 작용하여 증식 및 분화를 촉진시키는 것이 알려져 있다[참조: Blood, 1991, Oct 15; 78(8) 1975-80.].
이러한 악티빈, IGF-1 및 SCF는 EPO와 상이한 수용체에 작용하여 CFU-E를 증가시키므로, EPO 불응성 환자에게 투여하여 빈혈을 개선시키는 것이 기대된다. 그러나, 조혈 인자의 재조합 단백질 투여는 EPO과 동일하게 비경구 투여가 되기 때문에, 투여할 때마다 통원 등, 환자의 부담이 크다. 또한, 일반적으로 다양한 조혈 인자를 동시에 적용시킨 경우에 상승 작용을 나타내는 것이 알려져 있지만, 다양한 조혈 인자의 병용은 비용면에서 환자의 부담이 크다.
따라서, 악티빈, IGF-1 및 SCF의 생산을 동시에 촉진시키는 작용을 갖는 약제를 밝혀내면, 현재의 임상적 문제점을 개선하는 빈혈 치료제가 될 것이 기대된다.
비특허문헌 1은, 정상 래트에 아르기닌을 반복 투여한 결과, 헤모글로빈 및 적혈구수가 증가한 것을 나타내고 있지만, 적혈구 신생(조혈)을 항진하는 효과인지, 적혈구 수명을 항진하는 효과인지, 작용 기작이 불분명하기 때문에, 어떠한 빈혈증에 유효한가와 같은 임상 유용성이 불명료하다. 비특허문헌 2는 신장 빈혈 환자에게 아르기닌을 투여한 결과, 빈혈 상태가 개선(적혈구 수가 정상 수준에 가까워진) 되었으며, 이의 작용 기작이 아르기닌에 의한 신장 EPO의 생산 촉진인 것으로 기술했다. 따라서, 비특허문헌 1의 정상 래트에서 관찰된 적혈구수의 증가 현상은, 아르기닌이 래트 신장의 EPO 생산을 촉진에 의한 것임을 당연하고 용이하게 유추할 수 있다. 즉, 당업자가 아르기닌이 골수에 직접 작용하여 적혈구 전구 세 포의 증식을 촉진시키는 조혈 작용을 갖는 것을 예상하기는 어렵다. 또한, 아르기닌이 유효한 빈혈증을 EPO 생산 촉진이 치료 효과에 관련되는 것에 한정한 것도 당연한 결과이다. 이상으로부터, 아르기닌이 골수 조혈 작용을 갖고, EPO에 대한 불응답성 환자의 빈혈 치료에도 적응할 수 있으며, EPO와의 상승 효과에 의해 EPO 투여량을 감소시킬 수 있는 것 등은 전혀 생각하지 못했다.
비특허문헌 3에는, 돼지 초대 간세포 배양의 배지에, 아르기닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판을 고농도로 첨가하면, IGF-1의 유전자 발현이 증가하는 것이 보고되었다. 이는 간세포에 대한 아미노산의 작용에 한정하여 이루어진 연구이고, 간 이외의 세포에 대한 작용 또는 적혈구 조혈에 대한 작용에 대해 어떠한 시사도 하지 않는다.
비특허문헌 4는 골아 세포-유사 세포주인 MC3T3-E1 세포에 아르기닌을 첨가하면, IGF-1의 분비량이 증가하고, 더욱 고농도 첨가하면 유전자 발현이 증가하는 것을 보고하고 있다. 골아 세포는 골 형성에 관계하는 점에서, 아르기닌이 IGF-1 생산의 항진을 통해, 골 형성을 촉진시킬 가능성이 있음을 기술하고 있다. 즉, 이 연구는 골대사 조절에 대한 작용에 주목하여 이루어진 것이며, 논문 중에는 적혈구 조혈에 대한 작용에 관해서 전혀 기술하지 않았다.
비특허문헌 1: Int. J. Toxicol., 2004, 23: 101-105
비특헌문헌 2: 의약의 발자취, 2004, 211, No.8
비특허문헌 3: J.Nutr., 1999, 129; 1298-1306
비특허문헌 4: Bone, 1998, 23; 103-109
본 발명은, 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 또한, 빈혈 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 또한, 조혈 인자 생산 촉진제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 또한, 조혈 인자 생산 촉진제의 증강 물질이나 저해 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결할 수 있는 약제를 탐색, 검토한 결과, 아미노산인 아르기닌에, CFU-E 증가 작용이 있는 것을 새롭게 밝혀내어, 본 발명을 완성했다.
본 발명자들은, 또한, 아미노산인 아르기닌에, 골수 세포의 악티빈, IGF-1 및 SCF 생산 촉진을 통한 CFU-E 증가 작용이 있는 것을 새롭게 밝혀내어, 본 발명을 완성했다.
보다 상세하게는, CFU-E를 측정하는 방법에는, 메틸셀룰로스 반고형 배지를 사용한 시험관 내 콜로니 분석법이 일반적으로 사용되고 있고, CFU-E 증가 작용을 발견하기 위해서는 가장 적합한 실험계이다. 본 발명자는 이러한 방법을 사용하여, 분리한 마우스 골수 세포에 아르기닌 600μM 첨가시의 CFU-E 콜로니수를 측정한 결과, 혈액 중 평균 아르기닌 농도의 170μM과 비교하여, CFU-E 수가 유의적으로 증가하는 것을 밝혀냈다. 래트 경구 투여에서는 1.2g/kg의 아르기닌 1회 투여로 혈액 중 농도가 600μM 정도에 이르는 점에서, 경구 투여에서는 투여량 의존적인 CFU-E수 증가가 기대된다. 사람에 있어서도, 경구 투여에 의해, 혈액 중 아르기닌 농도 의존적인 CFU-E수 증가가 기대된다.
따라서, 이하에 나타내는 발명을 제공한다.
(1) 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제.
(2) 상기 항목 (1)에 따르는 분화 촉진제를 함유하는 빈혈 치료제.
(3) 상기 항목 (2)에 있어서, 혈액·복막 투석시의 투여용인 빈혈 치료제.
(4) 상기 항목 (2)에 있어서, 경구 투여용인 빈혈 치료제.
(5) 상기 항목 (2)에 있어서, 경장 투여용인 빈혈 치료제.
(6) 상기 항목 (2) 내지 (5) 중의 어느 한 항목에 있어서, 신장 빈혈의 치료용인 빈혈 치료제.
(7) 상기 항목 (2) 내지 (5) 중의 어느 한 항목에 있어서, 에리스로포에틴 불응성 환자용인 빈혈 치료제.
(8) 상기 항목 (2) 내지 (7) 중의 어느 한 항목에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 추가로 배합된 빈혈 치료제.
(9) 상기 항목 (8)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 빈혈 치료제.
(10) 상기 항목 (8)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 빈혈 치료제.
(11) 상기 항목 (8)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 빈혈 치료제.
(12) 상기 항목 (8) 내지 (11) 중의 어느 한 항목에 있어서, 배합제임을 특징으로 하는 빈혈 치료제.
(13) 상기 항목 (8)에 있어서, 아르기닌을 함유하는 약제와 에리스로포에틴-유사 물질을 함유하는 약제로 이루어진 키트임을 특징으로 하는 빈혈 치료제.
(14) 상기 항목 (13)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 빈혈 치료제.
(15) 상기 항목 (13)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 빈혈 치료제.
(16) 상기 항목 (13)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 빈혈 치료제.
(17) 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 에리스로포에틴-유사 물질 효과 증강제.
(18) 상기 항목 (17)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 효과 증강제.
(19) 상기 항목 (17)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 효과 증강제.
(20) 상기 항목 (17)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 효과 증강제.
(21) 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 에리스로포에틴-유사 물질 투여량 감량제.
(22) 상기 항목 (21)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 투여량 감량제.
(23) 상기 항목 (21)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 투여량 감량제.
(24) 상기 항목 (21)에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 투여량 감량제.
(25) 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는, 자기 혈액 저장자용 조혈 촉진제.
(26) 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 조혈 인자 생산 촉진제.
(27) 상기 항목 (26)에 있어서, 조혈 인자가, 악티빈, SCF 및 IGF-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 조혈 인자 생산 촉진제.
(28) 상기 항목 (26)에 있어서, 골수내 조혈 인자의 생산을 촉진시키는 조혈 인자 생산 촉진제.
(29) 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정하기 위한 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계에, 아르기닌 또는 아르기닌 및 피검 물질을 첨가했을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 비교하는 단계 및
피검 물질을 첨가했을 때에 높은 조혈 인자 생산 촉진 활성을 나타내는 피검 물질을 선택하는 단계
를 포함하는, 상기 항목 (26)에 따르는 조혈 인자 생산 촉진제의 증강 물질을 스크리닝하는 방법.
(30) 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정하기 위한 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계에 아르기닌 또는 아르기닌 및 피검 물질을 첨가했을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 비교하는 단계 및
피검 물질을 첨가했을 때에 낮은 조혈 인자 생산 촉진 활성을 나타내는 피검 물질을 선택하는 단계
를 포함하는, 상기 항목 (26)에 따르는 조혈 인자 생산 촉진제의 저해 물질을 스크리닝하는 방법.
발명의 실시를 위한 최선의 양태
본 발명에 따르는, 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제 및 조혈 인자 생산 촉진제는, 아르기닌을 유효성분으로 포함한다. 아르기닌은 아르기닌 및/또는 생리학적으로 허용 가능한 이의 염이 될 수 있다. 염의 예는 염산염, 시트르산염, 글루탐산염 등이 있지만 이들에 한정되지 않는다. 유효성분의 이성체에 관해서는, L-체, D-체 및 DL체 중 어느 것이나 사용 가능하지만, 천연에 존재한다는 점에서 L-체가 바람직하다. 예를 들면, 아르기닌으로서 유리체의 L-아르기닌과 L-아르기닌-염산염을 함께 함유하는 것이라도 양호하다.
본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제 및 조혈 인자 생산 촉진제는, 공지된 또는 장래 개발될 여러 가지 의약 제제의 형태, 예를 들면, 경구 투여, 복강내 투여, 경피적 투여, 피하 투여, 경정맥 투여, 흡입 투여 등, 각종 투여 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제 및 조혈 인자 생산 촉진제는 아르기닌 단독으로 사용할 수 있지만, 아르기닌을 유효성분으로 하는 의약 제제로서, 공지된 또는 장래 개발되는 방법을 적절하게 이용하여, 여러 가지 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 의한 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제 및 조혈 인자 생산 촉진제의 투여법은 각각 특별히 제한은 없지만, 경구 투여가 바람직하다. 이 경우, 투여량은 투여되는 환자의 빈혈 지표가 되는 헤모글로빈 농도, 연령 등에 따라서 다르지만, 일반 성인의 경우, 1일당 약 0.1 내지 12g, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 6g이다.
본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제 및 조혈 인자 생산 촉진제는, 적혈구 조혈의 저하로 인한 각종 질환의 치료 또는 예방에 사용하는 의약품의 유효성분이나 식품, 의약 식품의 구성 성분으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제가 유효한 것이 기대되는 질환은, 신장 빈혈, 철 결핍성 빈혈, 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈, 악성 빈혈, 실혈성 빈혈 및 항암제 치료에 동반되는 빈혈이다. 이 중, 신장 빈혈 특히, EPO 불응성의 신장 빈혈의 치료에 유용하다.
본 발명에 있어서의 EPO 불응성이란, 효과가 기대되는 양의 EPO를 투여하더라도 충분한 효과가 발현되지 않는 상태를 말하며, EPO의 투여량에 특히 한정되는 것이 아니다. 바람직하게는, EPO 투여량이 9000 IU(국제단위)/주 이상에서도, 충분한 효과가 발현되지 않는 상태를 말한다. 충분한 효과가 발현되지 않는 상태란, 바람직하게는 4 내지 8주간에 Ht값의 상승이 3% 미만인 상태를 말한다. 일반적으로, EPO 불응성 환자의 정의는 인종, 생활 습관 등에 따라 다르지만, 본 발명은 특별히 이러한 정의에도 한정되지 않는다. 예를 들면, 미국 가이드라인에서는 EPO를 300 내지 450IU/kg/주로 4 내지 6개월 투여하더라도 Hb가 10 내지 12g/dl에 도달하지 않는 것으로 규정하고 있지만[참조: Am J Kidney Dis 30 Suppl. 3 1997], 일반적인 용법 용량에서는, 150 내지 300IU/kg/주로 2개월 투여하더라도 Hb가 2g/dl 상승하지 않고, Hb가 10 내지 12g/dl에 도달하지 않는 사람을 EPO 불응성 환자로 정의한다 [참조: EPOGEN 첨부 문서]. 또한 유럽 가이드라인에서는, 300IU/kg/주 이상 피하 투여하더라도 목표로 하는 Ht값에 도달하지 않는 환자로 규정하고 있다[참조: Nephrol Dial Transplant(1999) 14 Supp 15. 25-27]. 또한 일본에서는, EPO 필요 투여량이 9000 IU/주 이상이고, 4 내지 8주간에 Ht값의 상승이 3% 미만인 경우에 있어서 EPO 불응성으로 생각한다. 상기 이외의 나라에서도, 추정되는 최대 용법 용량으로도 빈혈 개선 효과를 기대할 수 없는 경우에 관해서 EPO 불응성 환자로 규정한다. 이러한 EPO 불응성 환자에 있어서는, 본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제의 투여가 필수이다.
EPO 불응성 이외의 EPO 투여 환자중 EPO 필요 투여량이, 최대 용법 용량 미만, 바람직하게는, 1500 내지 9000IU/주의 환자에 있어서는, 본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제에 의한 빈혈 개선의 증강이 기대된다. 따라서, EPO 단독 빈혈 개선 치료시의 EPO의 필요 투여량을 감소하는 것이 기대된다. 본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제의 투여에 의한 EPO 증강 및 EPO 감량은, EPO 투여 개시시의 표준 EPO 투여량에서는 통상적인 기간 동안 충분한 빈혈 개선(4 내지 8주 동안 Ht값의 상승이 약 3% 미만)이 확인되지 않는 경우에도 유효한 것으로 기대되고, 그 후 EPO의 투여량을 통상 투여되는 최고 투여량에서도 통상적인 기간 동안 충분한 빈혈 개선이 확인되지 않는 경우에도 유효한 것으로 기대된다. 상기, EPO 증강 및 EPO 감량 투여법으로서 경구 투여 및 비경구 투여가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제의 투여에 의해, 신장 빈혈 환자 중, 투석 비도입 환자 및 투석 도입 환자에 대해 빈혈 개선이 기대되고 투여법으로서 경구 투여 및 비경구 투여를 사용할 수 있다.
에리스로포에틴-유사 물질이란, 생체 내에 투여·섭취된 경우에 생체 내에서 에리스로포에틴-유사 작용을 발휘·유도하는 물질을 말한다.
예를 들면, 에리스로포에틴, 에리스로포에틴 모사 펩타이드, 에리스로포에틴 생산 촉진제 등을 포함하지만, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다.
에리스로포에틴은 천연형, 유전자 재조합형 또는 변이형 중 어느 것도 가능하다. 예를 들면 유전자 재조합형의 경우, 사람 간세포의 mRNA로부터 유래된 사람 에리스로포에틴 cDNA의 발현에 의해 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산되는 165개의 아미노산 잔기(C809H1301N2290240S5; 분자량: 18,235.96)로 이루어진 당단백질(분자량: 약 30,000)인, 에포에틴알파(유전자 재조합) 또는 에포에틴베타(유전자 재조합)등이 될 수 있다.
에리스로포에틴 모사 펩타이드란, EPO 수용체에 결합하고, 활성화시키거나, EPO 효능제로서 작용하는 펩타이드를 말한다. 예를 들면, WO96/40749에 공개되어 있는, 아미노산 서열 X3X4GPX6TWX7X8를 포함하는 길이 10 내지 40 아미노산 잔기의 펩타이드를 포함하고, 여기서 각각의 아미노산은 표준적인 1문자 약자로 나타내고; X3은 C이고; X4는 R, H, L 또는 W이고; X5는 M, F, 또는 I이고; X6은 유전적으로 암호화된 20개의 L-아미노산으로부터 독립하여 선택되며: X7은 D, E, I, L 또는 V이고; X8은 C이다.
더욱 상세하게는, EPO 모사 펩타이드는 하기의 요건을 만족시키는 펩타이드를 성분으로서 포함한다.
1. 에리스로포에틴 수용체에 결합하여, 아미노산 서열 X3X4GPX6TWX7X8를 포함하며, 여기에, 각각의 아미노산은 표준적인 1문자 약자로 나타내고, X6은 유전자 암호화된 20개의 L-아미노산 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택되고; X3은 C이고; X4는 R, H, L 또는 W이고; X5는 M, F 또는 I이고; X7은 D, E, I, L 또는 V이고; X8은 C인 길이 10 내지 40 아미노산 잔기의 펩타이드.
2. 1 항목에 있어서, 각각의 아미노산이 표준적인 1문자 약자로 나타내는 아미노산 서열 YX2X3X4X5GPX6TWX7X8로 이루어지며, X2 및 X6의 각각은 유전자 암호화된 20개의 L-아미노산 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택되고; X3은 C이고; X4는 R, H, L 또는 W이고; X5는 M, F 또는 I이고, X7은 D, E, I, L 또는 V이며; X8은 C인 펩타이드.
3. 2 항목에 있어서, 아미노산 서열 X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11로 이루어지며, 여기서 각각의 아미노산은 표준적인 1문자 약자로 나타내며, X1, X2, X6, X9, X10 및 X11의 각각은 유전자 암호화된 20개의 L-아미노산 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택되며; X3은 C이고; X4는 R, H, L 또는 W이고; X5는 M, F 또는 I이고; X7은 D, E, I, L 또는 V이고; X8은 C인 펩타이드.
4. 3 항목에 있어서, X4가 R 또는 H이고; X5가 F 또는 M이고; X6이 I, L, T, M, E 또는 V이고; X7은 D 또는 V이고; X9가 G, K, L, Q, R, S 또는 T이고; X10이 A, G, P, R 또는 Y인 펩타이드.
5. 4 항목에 있어서, X1이 D, E, L, N, S, T 또는 V이고; X2가 A, H, K, L, M, S 또는 T이고; X4가 R 또는 H이고; X9가 K, R, S 또는 T이고; X10이 P인 펩타이드.
6. 1 항목에 있어서, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드.
Figure 112007084794014-PCT00001
7. 1 항목에 있어서, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드.
Figure 112007084794014-PCT00002
8. 1 항목에 있어서, 당해 아미노산 서열이 환화되는 펩타이드.
9. 8 항목에 있어서, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드.
Figure 112007084794014-PCT00003
10. 1 항목에 있어서, 당해 아미노산 서열이 이량체화 된 펩타이드.
11. 10 항목에 있어서, 당해 펩타이드가 다음의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
Figure 112007084794014-PCT00004
또한 EPO 모사 펩타이드에는 AFFYMAX사가 개발한 HEMATIDETM이나, 실시예 2에 기재되어 있는 EMP1도 포함된다.
또한, EPO 생산 촉진제란, 생체내에 투여함으로써, 생체내인성 EPO의 생산을 유도하는 약제를 말하며, 예를 들면 HIF(저산소 유발 인자) 안정화제 등이고, HIF 안정화 작용을 갖는 것이면 어떠한 구조의 것도 가능하다. 예를 들면, 구체적으로, FibroGen사가 개발한 FG2216(일본명 YM311) 등을 말한다. 또한, 저산소 유발 인자 프롤린수산화 효소 저해제 이외의 작용 기구를 갖는 EPO 생산 촉진제도 될 수 있다.
한편, 본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제는, 적혈구 조혈의 저하에 기인하는 각종 질환의 치료 또는 예방에 사용하는 의약품의 유효성분이나 식품, 의약 식품의 구성 성분으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제가 유효할 것으로 기대되는 질환은, 신장 빈혈, 철 결핍성 빈혈, 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈, 악성 빈혈, 실혈성 빈혈 및 항암제 치료에 따른 빈혈이다.
본 발명의 유효성분의 의약으로의 적용방법으로서, 경구 투여 또는 비경구 투여를 이용할 수 있지만, 투여시에는, 유효성분을 경구 투여, 주사 등의 투여방법에 적합한 고체 또는 액체의 의약용 무독성 담체와 혼합하여, 통상의 의약 제제의 형태로 투여할 수 있다. 이러한 제제로서는, 예를 들면, 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 고형제, 용액제, 현탁제, 유제 등의 액제, 동결 건조 제제 등을 들 수 있으며, 이들 제제는 제제상의 통상적인 수단에 의해 제조할 수 있다. 상기의 의약용 무독성 담체로서는, 예를 들면, 글루코스, 유당, 자당, 전분, 만니톨, 덱스트린, 지방산글리세리드, 폴리에틸렌글리콜, 하이드록시에틸 전분, 에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 아미노산, 젤라틴, 알부민, 물, 생리식염수 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 안정화제, 습윤제, 유화제, 결합제, 등장화제 등의 통상의 첨가제를 적절하게 첨가할 수도 있다.
본 발명에 의해, 안전성이 높고, 경구 투여 가능하며, 범용성이 있는 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제가 제공된다.
본 발명의 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제는, 빈혈 환자의 빈혈의 예방 또는 치료를 가능하게 하여, 빈혈에 따르는 노동 의욕의 저하, 피로감, 숨이 참, 갑자기 일어섰을 때 일어나는 현기증, 동계 등의 임상 증상을 개선할 것으로 기대된다. 또한, 경구 투여를 하면, 피하 또는 정맥 주사의 통증을 동반하지 않고, 또한 통원하지 않고서 집에서 매일 간단하게 복용할 수 있는 점에서, 확실한 빈혈 개선을 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 생체에 존재하는 아미노산인 점에서 복용에 따르는 부작용 발현이 없고, 신기능의 악화를 우려하지 않고 치료할 수 있는 것이 기대된다.
예를 들면 이미 rHuEPO에 의한 치료를 받고 있는 환자에 관해서는, 필요 투여량이 최대 용법 용량 미만, 바람직하게는, 1500 내지 9000IU/주의 환자에게 본 발명의 유효성분을 첨가하여 투여함으로써, EPO 필요 투여량을 감소시켜, 비용면이나, 피하 또는 정맥 주사에 의한 통증 등의 환자의 부담을 감소시키는 것이 기대된다. 또한, EPO 필요 투여량이 최대 용법 용량 이상, 바람직하게는 9000IU/주 이상의 EPO 불응성 환자에 대한 빈혈 개선도 기대된다. 또한, 앞으로 EPO 모사 펩타이드 또는 EPO 생산 촉진제에 의한 치료가 보급되는 경우에도, 본 발명의 유효성분을 첨가하여 투여함으로써, 필요 투여량의 감소 등이 기대된다.
본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제를 사용하여, 이에 대한 효능제, 즉 본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제가 갖는 조혈 인자 생산 촉진 활성을 촉진시키는 물질(이하, 조혈 인자 생산 촉진 활성 촉진제)을 스크리닝할 수 있다. 이러한 조혈 인자 생산 촉진 활성 촉진제는 생체 내에 존재하는 아르기닌에 의해서 조혈 인자 생산 촉진되므로 조혈 촉진의 부족 등으로 인한 질환이 관계하는 경우에, 그 질환에 대한 치료약을 개발하는 것을 기대할 수 있다. 여기에서, 조혈 인자 생산 촉진 활성이란, 어떤 분자가 조혈 인자 유전자 발현을 통해 생산이 상승되는 작용을 말한다.
조혈 인자 생산 촉진 활성 촉진제는, 예를 들면 다음의 단계에 의해 스크리닝할 수 있지만, 이러한 공정에 한정되는 것이 아니다.
i) 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정하기 위한 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계에, 아르기닌 또는 아르기닌과 피검 물질을 첨가하여, 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정한다.
ii) 상기 측정계에 아르기닌만 첨가하였을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성과, 아르기닌과 피검 물질을 첨가하였을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 비교한다.
iii) 피검 물질을 첨가하였을 때에 높은 조혈 인자 생산 촉진 활성을 나타내는 피검 물질을 선택한다.
본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제를 사용하여, 이것에 대한 길항제, 즉 본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제가 갖는 조혈 인자 생산 촉진 활성을 억제하는 물질(이하, 「조혈 인자 생산 촉진 활성 억제제」)을 스크리닝할 수 있다. 이러한 조혈 인자 생산 촉진 활성 억제제는, 생체내에 존재하는 아르기닌에 의해서 조혈 인자 생산 촉진되는 조혈 촉진이 질환과 관련된 경우에, 이 질환에 대한 치료약으로서 개발하는 것을 기대할 수 있다.
조혈 인자 생산 촉진 활성 억제제는, 예를 들면 다음의 단계에 의해 스크리닝할 수 있지만, 이러한 공정에 한정되는 것이 아니다.
i) 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정하기 위한 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계에, 아르기닌, 또는 아르기닌과 피검 물질을 첨가하여, 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정한다.
ii) 상기 측정계에 아르기닌만 첨가하였을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성과, 아르기닌과 피검 물질을 첨가하였을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 비교한다.
iii) 피검 물질을 첨가하였을 때에 낮은 조혈 인자 생산 촉진 활성을 나타내는 피검 물질을 선택한다.
조혈 인자 생산 촉진 활성의 측정은, 예를 들면, 동물로부터 분리한 세포를 사용하여 이루어지며, 상기 세포 및 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계는 피검 물질 첨가 후의 유전자 발현, 단백질 생산을 검출할 수 있는 것이면, 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계로서는, 실시예에 기재된 정량 PCR법 등 외에도, 유전자 칩 법, 마이크로어레이법, 원위치 혼성화법, RNase 보호 분석법, 노던 블로팅법, 차별적 전시법, SDS 아크릴 아미드 겔 전기영동법, 웨스턴 블로팅법, 컬럼 크로마토그래피법 등의 방법을 사용할 수 있다.
조혈 인자 생산 촉진제는 아르기닌 및 생리학적으로 허용 가능한 이의 염을 함유하는 어느 것이라도 가능하며, 이들의 임의의 혼합물이 될 수 있다. 또한, 피검 물질의 농도는, 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계에 영향을 주지 않는 한, 임의의 것도 될 수 있다. 또한, 피검 물질은 단일 화합물도 될 수 있으므로, 여러 화합물을 포함하는 혼합물 또는 조성물이 될 수 있다. 한편, 아르기닌 및 피검 물질의 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계로의 첨가는, 통상적으로 동시에 이루어지지만, 아르기닌의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 검출할 수 있는 한, 동시에 이루어지지 않을 수 있다.
상기의 조작에 의해, 또는 상기의 조작을 반복함으로써, 본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제가 갖는 조혈 인자 생산 촉진 활성을 억제하는 물질 또는 촉진시키는 물질 및 이를 포함하는 조성물 등을 스크리닝할 수 있다.
상기와 같이 하여 선택된 조혈 인자 생산 촉진 활성 억제제 및 조혈 인자 생산 촉진 활성 촉진제는, 아르기닌의 조혈 인자 생산 촉진 활성의 새로운 조절 물질로서, 조혈 인자 생산 촉진 활성이 관련된 각종 질환의 치료약 또는 이의 후보로서 기대된다.
본 발명에 의해, 안전성이 높고, 경구 투여 가능하고, 범용성이 있는 조혈 인자 생산 촉진제가 제공된다.
본 발명의 조혈 인자 생산 촉진제는, 빈혈 환자의 빈혈의 예방 또는 치료를 가능하게 하여, 빈혈에 따르는 노동 의욕의 저하, 피로감, 숨이 참, 갑자기 일어섰을 때 일어나는 현기증, 동계 등의 임상 증상을 개선하는 것이 기대된다. 또한, 경구 투여라고 하면, 피하 또는 정맥 주사의 통증을 동반하지 않고, 또한 통원하지 않고 집에서 매일 간단하게 복용할 수 있는 점에서, 확실한 빈혈 개선을 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 생체에 존재하는 아미노산인 점에서 복용에 따르는 부작용 발현이 없고, 신기능의 악화를 걱정하지 않고 치료할 수 있는 것이 기대된다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
실시예 1 아르기닌의 CFU-E 증가 작용
시험관 내 마우스 CFU-E 콜로니 분석법은 이하의 방법으로 실시하였다. BDF-1 마우스 암컷 10주령[참조: 니혼찰스리버 가부시키가이샤]을 경추탈구법로 치사시킨 후, 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하여, 10% FCS[참조: JRH 바이오사이언스]를 함유하는 IMDM 배지[참조: 인비트로겐 가부시키가이샤]에 현탁하였다. 골수 세포를 1500rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 침전된 골수 세포를 아미노산을 함유하지 않은 IMDM 배지로 치환하여 세포수를 측정하였다. 직경 3.5cm의 접시[참조: Nalge Nunc International K.K.]에, 골수 세포가 현탁된 아르기닌 농도 170μM의 메틸셀룰로스 반고형 배지{1IU/mL rHuEPO[참조: 츄가이세야쿠 가부시키가이샤], 100μM 2-머캅토에탄올[참조: 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤], 24% FCS[참조: JRH 바이오사이언스], 0.8% 메틸셀룰로스(스템셀테크놀로지사 메틸셀룰로스 함유 IMDM 용액 M3134), 2% BSA[참조: 시그마알드리치재팬 가부시키가이샤], 골수 세포 2.2×105개/ml}를 1mL 첨가하였다(24% FCS를 함유하는 아미노산 조성이 1/3 농도의 IMDM 배지와 동등). 상기의 조성에 가하여, 아르기닌을 최종 농도 600μM이 되도록 추가 첨가한 것을 제조하여, 37℃, 5% CO2 조건으로 48시간 배양후, 도립현미경을 사용하여, CFU-E 콜로니수를 측정하였다. 각 조건에 관해서 N=4로 실시하였다. 통계학적 검정은 독립 t-test로 실시하였다.
CFU-E 콜로니 분석의 결과를 도 1(A)에 도시한다. 도면 중, * P<O.05. 데이터는 평균치±SEM으로 나타내었다. 세로축은 2.2×105개의 골수 세포당 CFU-E 콜로니수이다.
도 1은, 아르기닌을 최종 농도 600μM이 되도록 첨가한 경우, CFU-E수가 증가함을 나타낸다. 이로부터, 아르기닌은 골수 세포에 직접 작용하여, CFU-E수를 증가시키는 것이 분명해졌다.
EPO가 충분량 존재하는 조건에서 아르기닌이 CFU-E수를 증가시켰기 때문에, EPO 효과 증강 작용 및 EPO 투여량 감량 효과를 기대할 수 있다. 1U/ml의 EPO가 충분량인 것은, 도 1(A)과 동일 조건으로 실시한 도 1(B)의 결과로 나타낸 바와 같이, 0.5U/ml 이상에서 최대 작용량인 점에서 분명하다. EPO 모사 펩타이드 및 EPO 생산 촉진제와의 배합도 동일하다. 이하에 상세하게 기술한다.
EPO는 적혈구 줄기세포막 상에 존재하는 EPO 수용체와 결합함으로써 적혈구 조혈에 작용한다고 생각되고 있다. 도 1(B)에 도시한 바와 같이, EPO는 농도 의존적으로 적혈구 줄기세포 CFU-E를 증가시켜, 각각 일정 농도에 달하면 최대 활성이 되고, 그 이상으로 농도를 높게 하더라도 최대 활성이 유지된다. 본건 발명에서 밝혀낸 아르기닌은, 이러한 충분량의 EPO가 존재함에도 불구하고, 동시에 작용시키면 CFU-E를 더욱 증가시킨다. 이로부터, EPO와 아르기닌은 작용점이 상이하고, 양자가 상승 효과를 발휘하는 것을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, EPO 불응성이란, 효과가 기대되는 양의 EPO를 투여하더라도 충분한 효과가 발현되지 않는 상태를 말하지만, 이러한 EPO 단독으로 효과가 충분하지 않은 경우에도, 아르기닌을 투여함으로써, EPO의 최대 활성을 초과한 높은 효과를 수득할 수 있다. 또한, EPO 불응성이 아닌 환자라도, EPO 필요 투여량이 많은 경우에는, 아르기닌을 병용함으로써 EPO 효과를 증강시키고, 그 결과 EPO 투여량을 감소시킬 수 있다. 즉, 「EPO 효과 증강제」또는「EPO 투여량 감량제」로서 이용할 수 있다.
EPO와 EPO 모사 펩타이드의 작용점은 동일한 EPO 수용체이므로, 상기한 EPO와 아르기닌과의 관계는 EPO 모사 펩타이드에서도 완전히 동일하다고 말할 수 있다. 즉, 「EPO 모사 펩타이드 효과 증강제」또는「EPO 모사 펩타이드 투여량 감량제」로서 이용할 수 있다.
생체 내에서는 EPO는 신장에서 생산되고 있지만, 신장 빈혈증 등의 질환에 따라, 적혈구 조혈에 필요한 EPO가 부족한 경우, 의약품으로서의 EPO가 투여된다. 그러나, 신장 빈혈증이라도, 신장이 EPO를 생산할 수 없게 된 것은 아니며, 신장 EPO 생산 촉진제를 사용하여 EPO 생산을 증가시키면, EPO 투여와 동일한 치료 효과를 기대할 수 있다. 본원의 아르기닌은 EPO가 의약품으로서 투여된 EPO이지만 신장으로부터 생산 촉진된 내인성 EPO와 동등하므로 상기한 FG2216 등의 EPO 생산 촉진제와의 병용이 가능하다. 이 경우, 도 1에서 도시한 효과가 기대되며, 단독 투여보다도 효과를 증강시키거나 투여량을 경감시키는 것이 가능해진다. 즉, 「EPO 생산 촉진제 효과 증강제」또는「EPO 생산 촉진제 투여량 감량제」로서 이용할 수 있다.
실시예 2 아르기닌의 CFU-E 증가 작용(EPO 모사 펩타이드)
EPO 모사 펩타이드의 대표예로서 인용문헌[참조: Science Vol.273, 458-463, 1996의 표 1 외]에 기재되어 있는 EMP1(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-NH2, C6-C15디설파이드 결합)을, 인용문헌[참조: Biochemistry Vol.37(11), 3699-3710의 3700-3701 페이지]에 기재되어 있는 방법을 사용하여 제조하였다.
BDF-1 마우스 암컷 10주령[참조: 니혼찰스리버 가부시키가이샤]를 경추탈구법으로 치사시킨 후, 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하여, 10% FCS[참조: JRH 바이오사이언스]를 함유하는 IMDM 배지[참조: 인비트로겐 가부시키가이샤]에 현탁하였다. 골수 세포를 1500rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여, 침전된 골수 세포를 아미노산을 함유하지 않는 IMDM 배지로 치환하여 세포수를 측정하였다. 직경 3.5cm의 접 시[참조: 날제 눈크 인터내셔널 가부시키가이샤]에, 골수 세포가 현탁된 아르기닌 농도 170μM의 메틸셀룰로스 반고형 배지{30μM의 EMP1, 100μM의 2-머캅토에탄올[참조: 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤], 24% FCS[참조; JRH 바이오사이언스], 0.8% 메틸셀룰로스(스템셀테크놀로지사메틸셀룰로스 함유 IMDM 용액 M3134), 2% BSA[참조: 시그마알드리치재팬 가부시키가이샤], 골수 세포 2.2×105개/ml}를 1ml 첨가하였다(24% FCS를 함유하는 아미노산 조성이 1/3 농도의 IMDM 배지와 동등). 상기의 조성에 첨가하여, 30μM의 EMP1 존재하에서 아르기닌을 최종 농도 770μM이 되도록 추가 첨가한 것을 제조하여, 37℃, 5% CO2 조건으로 48시간 배양후, 도립현미경을 사용하여, CFU-E 콜로니수를 측정하였다. 각 조건에 관해서 N=4로 실시하였다. 통계학적 검정은 독립 t-test로 실시하였다.
CFU-E 콜로니 분석의 결과로부터, 최대 작용 농도의 EMP1 존재하에서 아르기닌이 증가 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다.
EPO 모사 펩타이드가 충분량 존재하는 조건에서 아르기닌이 CFU-E수를 증가시켰기 때문에, EPO 모사 펩타이드 효과 증강 작용 및 EPO 모사 펩타이드 투여량 감량 효과를 기대할 수 있다. 30μM의 EPO 모사 펩타이드가 충분량인 것은, 도 2(A)과 동일 조건으로 실시한 도 2(B)의 결과로 나타낸 바와 같이, 10μM 이상에서 최대 작용량인 점에서 분명하다.
실시예 3 아르기닌에 의한 신부전 래트 분리 골수 세포의 악티빈, SCF 및 IGF-1 생 산 촉진 작용
신부전 래트(5/6 부분 신장 적출 래트)의 제작은 이하와 같이 실시하였다. 위스타 래트 수컷 8주령[참조: 니혼찰스리버 가부시키가이샤]을 넴부탈(Nembutal) 마취하에서 우측 신장을 전적출하고 좌측 신장 피질의 2/3 부분을 적출하여 봉합하였다. 수술 후, 통상적인 사육 조건하에서 사육(CRF-1식 니혼찰스리버 가부시키가이샤)하여, 수술 후 6주째에, 디에틸에테르에 의해 신부전 래트를 치사시킨 후, 양다리 대퇴골을 적출하여, 골수 세포를 분리하였다. 분리한 골수 세포를 10% FCS 함유 혈중 아미노산 농도 IMDM 배지에 현탁하였다. 혈중 아미노산 농도의 IMDM 배지를 위해, IMDM 배지의 아미노산 조성만을 표 1에 기재한 조성으로 변화시킨 것을 제조하여 사용하였다.
2×106개/ml로 제조한 골수 세포 용액 10ml을, 직경 10cm 접시[참조: 날제 넝크 인터내셔널 가부시키가이샤]에서, 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후, 아르기닌 HCl을 첨가하여, 2시간 후에 접시내의 골수 세포를 회수하여, 총 RNA의 정제 및 cDNA 합성에 사용하였다.
Figure 112007084794014-PCT00005
총 RNA 제조 및 cDNA 합성은 아래의 방법으로 실시하였다. 대퇴골 1개당 골수 세포를, Isogen[참조: 가부시키가이샤 니혼진] 1.5ml에 현탁하여, 균질화(바이오 101 FastPrep)하였다. 균질화물 1mL를 사용하여, Isogen에 기재된 방법에 따라서, 총 RNA를 정제하였다. 총 RNA의 품질을 생분석기[참조: 니혼벡톤·딕킨슨 가부시키가이샤]에 의해 확인하였다. 총 RNA 5㎍를 주형으로 하고, 올리고 DT20mer 프라이머[참조: 인비트로겐사], Super Script III[참조: 인비트로겐사]를 사용하여 cDNA 합성을 실시하였다. cDNA 합성법은 Super Script III에 기재된 방법에 따랐다.
조혈 인자 mRNA의 정량은 다음의 정량 PCR법으로 수행했다. NCBI에 등록되어 있는 악티빈(rat Inhibin betaA), SCF 및 IGF-1 서열(각각 순차적으로 GenBank 수탁번호 M37482, NM021843, NM178886)을 바탕으로, 정량 PCR법에 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다. 악티빈 유전자에 대해 표 2의 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머를, SCF에 대해 표 2의 서열번호 3 및 4에 기재된 프라이머를, IGF-1에 대해 표 2의 서열번호 5 및 6에 기재된 프라이머를 사용하였다. 정량 PCR법은 SybrGreen PCR 키트[참조: TOYOBO 가부시키가이샤]에 기재된 방법에 따랐다. 즉, cDNA 용액 1㎕을 주형으로 하여, 500nM의 상기 프라이머, SybrGreen PCR 키트를 사용하여, ABI7700[참조: 어플라이드바이오시스템즈재팬 가부시키가이샤]로 PCR 반응(94℃에서 1분후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분을 40회), 및 증폭 산물의 검출을 실시하여, mRNA의 상대 농도를 산출하였다. 정량 PCR후, 증폭 산물의 유무 및 크기를 아가로스 전기영동법에 의해 확인하였다.
Figure 112007084794014-PCT00006
신부전 래트로부터 골수 세포를 분리하여, 아르기닌 첨가하기 2시간 후의 골수 세포를 회수하여, 악티빈, SCF 및 IGF-1의 mRNA를 정량 PCR법에 의해 정량한 결과를 도 3에 도시한다. 데이터는 평균치±SEM로 나타내었다. 세로축은, 총 RNA당 상대적인 mRNA 양이다.
Pre: 아르기닌 첨가전 아르기닌 농도 100μM
Ctrl: 아르기닌 비첨가 2시간 후 아르기닌 농도 100μM
A400μM: 아르기닌 첨가 2시간 후 아르기닌 농도 400μM
A600μM: 아르기닌 첨가 2시간 후 아르기닌 농도 600μM
이 결과로부터, 아르기닌이 골수 세포에 직접 작용하여, 악티빈, SCF 및 IGF-1의 생산을 촉진시키는 것이 밝혀졌다.
실시예 4 악티빈, SCF 및 IGF-1 저해제에 의한 아르기닌의 CFU-E 증가 작용 저해
실시예 1에 기재된 방법에 따라, BDF-1 마우스 10주령 암컷 [참조: 니혼찰스리버사]으로 세포 외 마우스 CFU-E 콜로니 분석법을 실시하였다. 170μM의 아르기닌 HCl 존재하에, 최종 농도 600μM의 아르기닌 HCl을 추가로 첨가하고, 또한, 폴리스태틴(FSN; follistatin, 항악티빈 R&D사 10Ong/ml), 항SCF 항체 (페프로텍사 1㎍/ml), 항 IGF-1 항체(페프로텍사 2㎍/ml)를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 조건으로 28시간 배양후, 도립현미경을 사용하여, CFU-E 콜로니수를 측정하였다. 각 조건에 관해서 N=4로 실시하였다. 통계학적 검정은 독립 t-test로 실시하였다. * P<0.05, ** P<0.005. 데이터는 평균치±SEM으로 나타내었다.
CFU-E 콜로니 분석의 결과를 도 4에 도시한다. 세로축은 2.2×105개의 골수 세포당 CFU-E 콜로니수이다.
도 4로부터 아르기닌의 CFU-E 증가 작용은, 폴리스태틴, 항 SCF 항체 및 항IGF-1 항체에 의해서 저해되는 것을 알 수 있다. 이상으로부터, 아르기닌은 골수 세포에 작용하여, 조혈 인자인 악티빈, SCF 및 IGF-1의 생산 촉진을 통해, CFU-E를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
도 1은 아르기닌의 CFU-E 증가 작용을 도시한 것이다. 도 1(A)는 최대 작용 농도인 1U/ml의 EPO 존재하에서의 아르기닌의 CFU-E 증가 작용을 도시한다. 도 1(B)는, EPO 농도의 존재에서 O.5U/ml 이상에서 EPO가 최대 작용량인 것을 나타낸다.
도 2는 EPO 모사 펩타이드 존재하의 아르기닌의 CFU-E 증가 작용을 도시한다. 도 2(A)는 최대 작용 농도인 30μM의 EPO 모사 펩타이드 존재하에서의 아르기닌의 CFU-E 증가 작용을 도시한다. 도 2(B)는, EPO 모사 펩타이드의 농도 존재에서 10μM 이상에서 EPO 모사 펩타이드가 최대 작용량인 것을 나타낸다.
도 3은 아르기닌에 의한 신부전 래트 분리 골수 세포의 악티빈, SCF 및 IGF-1 생산 촉진 작용을 도시한다.
도 4는 조혈 인자 저해제에 의한 아르기닌의 CFU-E 증가 작용 저해를 도시한다.
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Claims (30)

  1. 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 골수 적혈구 전구 세포의 분화 촉진제.
  2. 제1항에 따르는 분화 촉진제를 함유하는 빈혈 치료제.
  3. 제2항에 있어서, 혈액·복막 투석시의 투여용인 빈혈 치료제.
  4. 제2항에 있어서, 경구 투여용인 빈혈 치료제.
  5. 제2항에 있어서, 경장 투여용인 빈혈 치료제.
  6. 제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 신장 빈혈의 치료용인 빈혈 치료제.
  7. 제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 에리스로포에틴 불응성 환자용인 빈혈 치료제.
  8. 제2항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 추가로 배합된 빈혈 치료제.
  9. 제8항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 빈혈 치료제.
  10. 제8항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 빈혈 치료제.
  11. 제8항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 빈혈 치료제.
  12. 제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 배합제임을 특징으로 하는 빈혈 치료제.
  13. 제8항에 있어서, 아르기닌을 함유하는 약제와 에리스로포에틴-유사 물질을 함유하는 약제를 포함하는 키트임을 특징으로 하는 빈혈 치료제.
  14. 제13항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 빈혈 치료제.
  15. 제13항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이 드인 빈혈 치료제.
  16. 제13항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 빈혈 치료제.
  17. 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 에리스로포에틴-유사 물질 효과 증강제.
  18. 제17항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 효과 증강제.
  19. 제17항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 효과 증강제.
  20. 제17항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 효과 증강제.
  21. 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 에리스로포에틴-유사 물질 투여량 감량제.
  22. 제21항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴인 투여량 감량제.
  23. 제21항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 모사 펩타이드인 투여량 감량제.
  24. 제21항에 있어서, 에리스로포에틴-유사 물질이 에리스로포에틴 생산 촉진제인 투여량 감량제.
  25. 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는, 자기 혈액 저장자용 조혈 촉진제.
  26. 아르기닌을 유효성분으로서 함유하는 조혈 인자 생산 촉진제.
  27. 제26항에 있어서, 조혈 인자가, 악티빈, SCF 및 IGF-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 조혈 인자 생산 촉진제.
  28. 제26항에 있어서, 골수내 조혈 인자의 생산을 촉진시키는 조혈 인자 생산 촉진제.
  29. 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정하기 위한 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정 계에, 아르기닌, 또는 아르기닌 및 피검 물질을 첨가하였을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 비교하는 단계 및
    피검 물질을 첨가하였을 때에 높은 조혈 인자 생산 촉진 활성을 나타내는 피검 물질을 선택하는 단계
    를 포함하는, 제26항에 따르는 조혈 인자 생산 촉진제의 증강 물질을 스크리닝하는 방법.
  30. 조혈 인자 생산 촉진 활성을 측정하기 위한 조혈 인자 생산 촉진 활성 측정계에, 아르기닌, 또는 아르기닌 및 피검 물질을 첨가하였을 때의 조혈 인자 생산 촉진 활성을 비교하는 단계 및
    피검 물질을 첨가하였을 때에 낮은 조혈 인자 생산 촉진 활성을 나타내는 피검 물질을 선택하는 단계
    를 포함하는, 제26항에 따르는 조혈 인자 생산 촉진제의 저해 물질을 스크리닝하는 방법.
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