WO2013178008A1 - 一种促红细胞生成素模拟肽、其制备方法和用途 - Google Patents

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WO2013178008A1
WO2013178008A1 PCT/CN2013/075295 CN2013075295W WO2013178008A1 WO 2013178008 A1 WO2013178008 A1 WO 2013178008A1 CN 2013075295 W CN2013075295 W CN 2013075295W WO 2013178008 A1 WO2013178008 A1 WO 2013178008A1
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leu
fmoc
cys
pro
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刘克良
梁远军
常少华
许笑宇
宫泽辉
颜玲娣
董华进
贾启燕
孟庆斌
郄建坤
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中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • the present invention relates to an erythropoietin peptidomimetic, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition containing the same and its use in the treatment of a disease characterized by a deficiency or deficiency of erythropoietin or red blood cells.
  • Erythropoietin is a hematopoietic growth factor (HGF) that is required for erythropoiesis. Containing 165 amino acids, the molecular weight is about 30.4kD, 40% of the molecular weight is the result of glycosylation, the glycosylation sites are 24, 38, 83 asparagine side chain N-glycosylation and 126 The serine side chain hydroxyl group is 0-glycosylated.
  • EPO is mainly produced in the liver of the kidneys and fetuses, and is synthesized and dried by the perivascular capillary endothelial cells of the renal tubules.
  • EPO acts to promote erythropoiesis in osteophytes, thereby increasing the concentration of hemoglobin to ensure adequate oxygen transport from the lungs to aerobic tissue.
  • the production of EPO is inversely related to the oxygen concentration in the tissue.
  • tissue is hypoxic, the production of EPO is increased to ensure that all tissues and organs receive sufficient oxygen supply.
  • the plasma EPO concentration is in the range of 10-25 mU/mL, the normal level of hemoglobin (12-17 g/dL) can be maintained with a half-life of about 5 h.
  • EPO In addition to promoting red blood cell production in hematopoietic tissue, EPO also plays an important role in non-hematopoietic tissues and organs, such as promoting the growth and development of some tissues and organs, participating in cardiovascular formation, repair and repair of myocardial membrane damage, and EPO is also involved in brain-pairing. The response process of neuronal damage and the process of wound healing.
  • hematopoietic progenitor cells are first produced from osteophytes, and granulocytes (Granulocyte, G)-Erythroid (E)-monocyte (Monocyte, M)-megakaryocytes are formed by various cytokines.
  • the colony forming units of ( Megakaryocyte, M ) are further differentiated into erythroid colony forming units (CFUe) by Erythroid burst-forming units (BFUe).
  • EPO binds to the EPOR of the CFUe surface, forming young red blood cells, and the young red blood cells further differentiate into nets Cells, and finally red blood cells.
  • This process requires not only nutrients such as iron, folic acid, and vitamin B12, but also many cytokines, and EPO is the most important regulator of erythropoiesis. Therefore, lack of EPO is likely to cause anemia. A variety of secondary anemias are caused by insufficient production of cytokine EPO.
  • ESAs Erythropoietic-stimulating Agents
  • phage display technology was used to scan EPO receptors using a combinatorial library consisting of random peptide sequences, and many short peptides with no sequence correlation with endogenous EPO were obtained. These short peptides can bind to EPO receptors and trigger A series of signal transductions promote the proliferation of i3 ⁇ 4f cell lines and have the same mechanism of action as EPO.
  • the half effective concentration (EC 50 ) of these short peptides is 200 nM, which is much higher than the EC 5 of the EPO measured at the same time. (20pM), in addition, their in vivo stability is also poor, therefore, can not meet the drug.
  • the discovery of these peptide sequences has served as a guide for subsequent research.
  • the present invention provides a erythropoietin mimetic peptide with good biological activity and better drug-forming properties, and a usable salt thereof by the introduction of a non-naturally active amino acid, and a preparation method and use thereof .
  • L is introduced into Exendin-4 to contain a specific, such as a non-authentic acid residue, to obtain an EPO receptor agonistic activity, thereby utilizing the non-natural acid resistance to enzymatic ability to obtain good in vivo behavior. It is possible.
  • the problem to be solved by the present invention is to obtain an active peptide having EPO receptor agonistic activity, and to provide a method for introducing non-natural acid to resist in vivo biological degradation and still maintain EPO receptor agonistic activity and corresponding erythropoietin mimetic peptide .
  • the inventor surprisingly It was found that the replacement of the individual amino acids in the peptide chain with the non-natural amino acid resulted in the erythropoietin mimetic peptide, which has good EPO receptor agonistic activity.
  • the novel structural mimetic peptides obtained by the present invention have a marked ability to increase red blood cells. The present invention has been completed based on the above findings.
  • a first aspect of the invention relates to a peptidomimetic represented by formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • Cys-Cys form an intramolecular disulfide bond
  • XI is a Tyr, D-Tyr, or a D-type, L-type non-natural aromatic amino acid.
  • the aromatic ring in the non-natural aromatic amino acid may be a pyridyl group or a phenyl group.
  • the aromatic ring when it is a phenyl group, it may be substituted at one of the halogen, nitro, ureido, methoxy or short chain alkyl groups at the 2, 3, 4 or 5 position.
  • a base substitution preferably a mono- or di-substitution;
  • X2 is Ala, D-Ala or Sar
  • X3 is Met or D-Met
  • X4 is Pro, MeAla, MeLeu, MeVal or Sar;
  • X5 is a 1-Nal, or D-type, L-type non-natural aromatic amino acid, preferably wherein the aromatic ring in the non-natural aromatic amino acid is 2, 3, 4 if it is a phenyl group. Or at position 5 substituted by one or more selected from the group consisting of halogen, nitro, ureido, methoxy or short-chain alkyl, preferably mono- or di-substituted;
  • X6 is Pro, MeAla, MeLeu, MeVal or Sar;
  • X7 is Arg, D-Cit or L-Cit
  • X8 is Sar, Pro, MeAla, MeLeu or MeVal
  • the peptidomimetic of the first aspect of the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein XI is Tyr, D-Tyr, D- or L-type 3-Pal, D- or L-type 4-Pal, D- or L-type Phe (2-F), D- or L-type Phe (3) -F), D- or L-type Phe (4-F), D- or L-type Phe (2-Cl), D- or L-type Phe (3-Cl), D- or L-type Phe (4-Cl), D- or L-type Phe (4-Br);
  • X2 is Ala or D-Ala
  • X3 is Met or D-Met
  • X4 is Pro, MeAla or Sar
  • X5 is 1-NaK D- or L-type Phe (2-F), D- or L-type Phe (3-F), D- or L-type Phe (4-F), D- or L-type Phe (2-Cl), D- or L-type Phe (3-Cl), D- or L-type Phe (4-Cl), D- or L-type Phe (4-Br);
  • X6 is Pro, MeAla or Sar
  • X7 is Arg or Cit
  • X8 is Sar or Pro
  • the peptidomimetic of the present invention is selected from the following peptidomimetics:
  • a second aspect of the invention relates to a method for producing a peptidomimetic represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising the steps of:
  • a Rink-amide resin as a solid phase carrier, preferably HBTU-HOBt as a condensing agent
  • the suitable lysate in step (2) is a mixture of trifluoroacetic acid, thioanisole, methane, ethanedithiol and water, preferably trifluoroacetic acid, thioanisole, methylene chloride,
  • the volume ratio of acetyl alcohol and water is 7 ⁇ 10:0.3 ⁇ 0.7: 0.3-0.7:0.1-0.4:0.3-0.7, and the more preferable volume ratio is 8 ⁇ 9:0.4 ⁇ 0.6: 0.4-0.6:0.2-0.3 : 0.4-0.6, the most preferred volume ratio is 8.25:0.5:0.5:0.25:0.5;
  • the suitable condition in the step (2) is to remove the protecting group at a temperature of 0-40 ° C, and the cleavage step is carried out at a temperature of about 0 ° C for 20 to 40 minutes (for example, about 30 minutes). ), then react at room temperature for 80 ⁇ 100 minutes (for example, about 90 minutes).
  • a third aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the peptidomimetic represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of a peptidomimetic represented by formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is useful as a substitute for erythropoietin.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the peptidomimetic represented by the formula (I) or the pharmaceutical composition of the invention, for the preparation of a medicament as an agonist for an EPO receptor; or for the preparation for prevention and/or treatment Use in medicines for diseases and/or conditions associated with low activity of EPO or EPO receptors.
  • a sixth aspect of the invention relates to a method of activating an EPO receptor which comprises administering a peptidomimetic represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject or a patient in need thereof.
  • a seventh aspect of the invention relates to a method of preventing and/or treating a disease and/or a symptom associated with low activity of an EPO or EPO receptor, which method is administered to a subject or patient in need thereof (I) A peptidomimetic or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the diseases and/or symptoms associated with low activity of EPO or EPO receptors are selected from blood diseases such as anemia, renal anemia, erythrocyte defects or hypoxia, low hemoglobin content, tumor radiotherapy or chemotherapy-induced anemia.
  • any aspect of the invention or any one of the aspects of the invention is equally applicable to any of the other aspects or any of the other aspects, as long as they do not contradict each other, of course, when applied to each other If necessary, the corresponding features can be appropriately modified.
  • the "any” refers to any of the sub-aspects of the first aspect of the invention; when otherwise mentioned in a similar manner, It also has the same meaning.
  • the term "effective amount” refers to a dose that can achieve treatment, prevention, alleviation, and/or alleviation of a disease or condition described herein in a subject.
  • the term “pharmaceutical composition,” refers to a substance that can be used to effect treatment, prevention, alleviation, and/or alleviation of the diseases, disorders, and conditions of the invention in a subject.
  • the term "subject,” or “patient,” may refer to an animal that receives the compositions and extracts of the invention to treat, prevent, ameliorate, and/or alleviate the diseases, disorders, symptoms of the invention. , especially mammals, such as humans, dogs, monkeys, cows, horses, etc.
  • disease or condition refers to a subject's condition in the subject that is associated with the disease or condition described herein.
  • erythropoietin mimetic peptide means that the sequence is
  • amino acid of the present invention is an L-type amino acid, and the D-type amino acid is specifically indicated.
  • the term "disease and/or symptom associated with an EPO receptor” refers to a disease associated with prophylaxis and/or treatment by activating an EPO receptor, primarily a renal anemia, red blood cell defect or depression, Low blood hemoglobin content, tumor radiotherapy and chemotherapy lead to blood diseases such as anemia.
  • the preparation of the compound of the present invention adopts a conventional polypeptide synthesis method, including a solid phase polypeptide synthesis method, a liquid phase polypeptide synthesis method, and a solid phase liquid phase polypeptide synthesis method, and the amino acid adopts Fmoc.
  • connection method adopts the sequential connection from the N-terminus to the C-terminus, or the synthesis of the fragment first, and then the fragment is connected.
  • the solid phase synthesis adopts various amide end groups.
  • Resin as a carrier such as MBHA, PAL, Rink amide resin, etc.
  • a common condensing agent is subjected to a condensation reaction (such as DCC/HOBT, BOP/DIEA, HBTU/HOBt, TBTU, etc.), and after the reaction, the peptide is cleaved from the resin with trifluoroacetic acid or anhydrous HF.
  • the crude peptide forms a cyclic peptide by oxidizing two thiol groups in the molecule, and the product is isolated and purified, and the final product is determined by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • some preferred compounds have an agonistic effect on the EPO receptor at the cellular level.
  • a partially preferred compound has an effect of increasing the number of red blood cells and the hemoglobin content in normal mice.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient an effective amount of at least one polypeptide modification and / or a stereoisomer thereof or a non-physiologically toxic salt thereof, and a conventional pharmaceutical excipient or adjuvant.
  • a conventional pharmaceutical excipient or adjuvant includes any or all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial or antifungal agents, isotonic and slow-drying agents, and similar physiologically compatible preparations, suitable for intravenous injection , intramuscular, subcutaneous, or other non-digestive administration is preferred.
  • the active compound may be coated to protect the compound from the effects of acid or other natural conditions.
  • pharmaceutically acceptable salt means a salt which retains the intended physiological activity of the parent compound without causing any unexpected toxic side effects, or a composition containing the same, for example: hydrochloride, hydrobromide, Sulfate, phosphate, nitrate, and acetate, oxalate, tartrate, succinate, malate, benzoate, pamoate, alginate, methanesulfonate, acid Salt and so on.
  • the cation according to the salt may be: an inorganic salt such as a potassium salt, a lithium salt, a zinc salt, a copper salt, a cerium salt, a cerium salt or a calcium salt, or an organic salt such as a trialkylammonium salt.
  • an inorganic salt such as a potassium salt, a lithium salt, a zinc salt, a copper salt, a cerium salt, a cerium salt or a calcium salt
  • an organic salt such as a trialkylammonium salt.
  • the peptidomimetic or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutical composition containing the same may be administered in any manner known in the art, such as oral, intramuscular, subcutaneous, nasal administration, etc., for administration of a pharmaceutical form such as a tablet, a capsule, or a mouth. Tablets, chewable tablets, tinctures, suspensions, transdermal agents, microcapsules, implants, syrups, and the like. It may be a common preparation, a slow-drying preparation, a controlled release preparation, and various microparticle delivery systems. In order to form a unit dosage form into tablets, various biodegradable or biocompatible carriers well known in the art can be widely used.
  • Examples of the carrier are, for example, a saline base and various buffered aqueous solutions, ethanol or other polyols, liposomes, polylactic acid, vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and the like.
  • the dosage of the peptidomimetic administered in the present invention depends on many factors such as the nature and severity of the disease to be prevented or treated, the sex, age, weight, sensitivity and individual response of the patient or animal, the particular compound used, the route of administration. , the number of administrations, and the desired therapeutic effect.
  • the above dosages may be administered in a single dosage form or divided into several, for example two, three, four dosage forms.
  • Ala means alanine Arg means quartic acid
  • Cys represents cysteine Gin represents glutamine
  • Glu means Gly means glycine
  • Leu means leucine
  • Lys means lysine
  • Phe means phenylalanine Pro means sulphuric acid
  • Tyr represents tyrosine acid
  • Val represents valine
  • Phe(3-F) means Phe(4-F)
  • Phe(2-Cl), Phe(3-Cl), Phe(4-Cl) are similar to Phe(2-F) Phe(3-F) Phe(4-F), but are replaced by fluorine instead of chlorine. , representing the replacement position
  • Fmoc means ⁇ methoxy
  • DMF stands for dimethylformamide
  • DCC stands for dicyclohexylcarbodiimide
  • HOBt stands for 1-hydroxy shy and triazole
  • TFA stands for trifluoroacetic acid
  • EDT stands for mercaptoethanol
  • HBTU stands for 2-(1 ⁇ -1-hydroxybenzotriazole)-1,1,3,3-tetramethylurea hexa-phosphate
  • the solid phase synthesis carrier used in the examples Rink-amide resin is a product of Tianjin Nankai Synthetic Co., Ltd.; HOBT, HBTU, DIEA and Fmoc-protected natural amino acids are provided by Shanghai Jier Biochemical Company. If no specific conditions are specified in the examples, they are carried out according to the general conditions or the conditions recommended by the manufacturer. The reagents or instruments used are not indicated by the manufacturer, and are conventional products that are commercially available.
  • Example 1 Synthesis of SEO-01 (structure sequence see Table 1)
  • the solution was purified by RP-HPLC, RP-HPLC conditions, phase A: 0.05% TFA / water; phase B: 0.05% TFA ⁇ 0% ACN / water; color column: C18 300A 4.6 x 250 mm; Gradient: 0-17 min B % 35-85, 17-21 minutes B% 85-35, ending in 25 minutes; flow rate: lmL/min; column temperature: 25.
  • the results of MALDI-Tof mass spectrometry are shown in Table 1. The molecular weight determined by MALDI-Tof mass spectrometry was 2339.2.
  • TF-1 cells are such an EPO-sensitive cell.
  • the TF-1 cell line was first isolated from human erythroblastic leukemia cells, which express EPOR.
  • the proliferation of TF-1 cells is dependent on granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or interleukin 3 (IL-3).
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • IL-3 interleukin 3
  • EPO also induces proliferation of TF-1 cells and has been widely accepted as a method for detecting EPO activity in vitro (T Kitamura, et al. Blood. 1989, 73: 375-380. S Chretien, et al.
  • the present invention first establishes a TF-1 cell proliferation assay using EPO, and then measures the erythropoietin mimetic peptide to stimulate EPO receptor-mediated TF-1 cell proliferation activity.
  • Fetal bovine serum FBS, Gibco/Invitrogen, Cat. No. 1043-7036
  • TF-1 cells are resuscitated, and cells are counted by trypan blue staining. After the viability assay, the cell suspension was added to the culture J ⁇ and cultured overnight in a 37 ° C / 5% CO 2 incubator. TF-1 cells were maintained in RPMI-1640 complete medium (containing 2 ng/mL recombinant human GM-CSF and 10% FBS) according to the method provided on the ATCC website. The cells were exchanged and maintained at a reasonable density one day before the experiment.
  • the cells in the logarithmic growth phase were collected by centrifugation; after the original medium was taken out, the cells were re-selected with GM-CSF-free complete medium and collected by centrifugation. Cell viability was counted by trypan blue staining and plated onto experimental well plates. Cells with more than 99% cell viability were allowed for this study.
  • Proliferation experiment After collecting TF-1 cells as described above, adjust the cell concentration; finally, spread to a 96-well experimental plate at a density of 50 10000 cells; prepare the prepared test compound (Examples 1 - 15) The peptidomimetic shown in SEQ. 01 to SEQ. 15 or ⁇ (50) was added to the cells, and gently shaken to post 37. CI 5% C0 2 incubator was cultured for 72 h; 72 h later, cell viability was measured using CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit. Data were collected after reading with PHERAStar Plus; data was read by PHERAStar Plus to remove the average experimental background reading. (Culturing solution) Data analysis was performed using GraphPad Prism version 4.0. The results are shown in Table 2.
  • the erythropoietin mimetic peptide represented by the formula (I) of the present invention all mediates cell proliferation activity by the EPO receptor.
  • Test method Animals were administered continuously for 7 days, once per day, subcutaneously (sc), and the test was completed; ⁇ peripheral blood red blood cells (RBC), hemoglobin (Hb), and reticulocytes (RET) were measured.
  • RBC peripheral blood red blood cells
  • Hb hemoglobin
  • RET reticulocytes
  • mice had a certain degree of increasing trend after administration of SEQ-01, SEQ-03 and SEQ-09, respectively. It is indicated that the present invention provides a compound having a reddening effect.
  • rhEPO is a very highly active substance, but is prone to produce antibodies, resulting in serious side effects.
  • the present invention has found a novel agonist, i.e., a peptidomimetic represented by formula (I), which maintains erythropoiesis on the one hand.
  • the peptidomimetic has a small molecular weight, and the small peptide is relatively low in immunogenicity, so that the side effect caused by the antigen-antibody reaction is lower than that of rhEPO.

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Abstract

本发明涉及式（I）所示的促红细胞生成素模拟肽及其用途。该促红细胞生成素模拟肽，或其可药用盐，可作为促红细胞生成素替代品，用于预防和/或治疗与EPO或EPO受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途。

Description

一种促红细胞生成素模拟肽、 其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一种促红细胞生成素模拟肽、其制备方法， 以及含它们 的药物组合物及其在治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞缺少或缺陷为 特征的疾病中的用途。 背景技术
促红细胞生成素 （EPO )是一种造血生长因子 ( Hematopoietic growth factor, HGF )， 是红细胞生成过程所必须的一种糖蛋白。 含有 165个氛基酸， 分子量约为 30.4kD， 40%的分子量为糖基化修饰结果， 糖基化位点分别是 24，38，83位的天冬酰胺侧链 N-糖基化及 126位 丝氨酸侧链羟基 0-糖基化。 在人体中， EPO主要是在腎脏和胎儿的肝 中产生的， 由腎小管的管周毛细血管内皮细胞合成并幹放。 EPO作为 一种细胞因子在骨髄^组织中发挥促进红细胞生成的作用，从而提高 血红蛋白的浓度，以保证足够的氧气从肺运输到需氧组织。正常情况下， EPO的生成与组织中氧气浓度成反比关系， 组织缺氧时， EPO生成增 多， 以保证各组织器官得到足够的氧气供给。 当血浆 EPO 浓度在 10-25mU/mL 范围内， 即可维持血红蛋白的正常水平（ 12-17g/dL ) ， 半衰期约为 5h。 EPO除了能够在造血组织促进红细胞的生成， 在非造 血组织器官中也发挥着重要作用，如促进一些组织器官的生长发育， 参 与心血管形成、 修复及心肌膜损伤修复过程， EPO还参与大脑对神经 元损伤的应答过程及伤口愈合过程。
在红细胞生成过程中， 首先由骨髄产生造血祖细胞，在多种细胞因 子的作用下形成粒细胞（Granulocyte, G ) -幼红细胞（ Erythroid, E ) -单核细胞 ( Monocyte, M ) -巨核细胞（ Megakaryocyte， M ) 的集落 形成单位， 再经过爆式红系集落形成单位 ( Erythroid burst-forming units, BFUe )， 进一步分化为红细胞系集落形成单位（ CFUe )。 EPO 结合到 CFUe表面的 EPOR， 形成幼红细胞， 幼红细胞进一步分化为网 状细胞， 最后形成红细胞。 这个过程不仅需要铁、 叶酸、 维生素 B12 等营养物质， 还需要许多细胞因子的参与， 而 EPO是红细胞生成过程 中最主要的调控因子。 因此， 缺乏 EPO, 就容易引发贫血症。 多种继 发性贫血症都是由于细胞因子 EPO生成不足而引起的。
20世纪 80年代， 对继发性贫血治疗方法的研究才逐渐引起重视， 通过对其病理生理学的研究， 研制了一些红细胞生成刺激因子 ( Erythropoietic-stimulating Agents, ESAs )类药物， 主要是 EPO受 体激动剂。 自此， EPO药物一直是药物研究的一个热点， EPO产品的 销量持续处于销售量最好药物的第四位，并且 EPO市场仍在持续增长。
ESAs类药物在继发性贫血的治疗市场上已经占有了主导地位。
1996 年， 采用噬菌体展示技术用一些由随机肽序列组成的组合库 对 EPO受体进行扫描，得到了许多与内源性 EPO没有序列相关性的短 肽， 这些短肽能结合 EPO受体， 引发一系列信号转导， 促 i¾f应细胞 系的增殖， 并且作用机制与 EPO相同。 但是这些短肽中半数有效浓度 ( EC50 )最小的为 200nM， 远高于同时测得的 EPO的 EC5。 ( 20pM )， 另外， 它们的体内稳定性也较差， 因此， 不能满足成药 。 然而， 这 些肽序列的发现却为后续研究起到了指导作用。
为了克服现有短肽的不足，本发明通过非天然氛基酸的引入，提供 了一种生物活性好，成药性更好的促红细胞生成素模拟肽及其可用盐以 及它们的制备方法和用途。 发明内容
本发明的目的在于提供一类促红细胞生成素模拟肽，有助于开发肾 性贫血治疗药物及制剂。 本发明 L现， 在 Exendin-4中引入含有特定 的， 如非天氛基酸残基， 使其获得 EPO受体激动活性， 进而利用非天 然 ^酸抗酶解能力为获得良好的体内行为提供了可能。
本发明要解决的问题是获得具有 EPO受体激动活性的活性肽， 提 供一种引入非天然 ^酸对抗体内生物学降解并仍然保持 EPO受体激 动活性的方法以及相应的促红细胞生成素模拟肽。本发明人令人惊奇地 发现，对肽链中的个别氛基酸替换为非天然氛基酸，得到促红细胞生成 素模拟肽，这些促红细胞生成素模拟肽具有良好的 EPO受体激动活性。 而且， 本发明人发现， 本发明获得的新结构模拟肽， 具有明显的升高红 细胞的能力。 本发明基于上述发现而得以完成。
本发明的第一方面涉及式 (I)所示的模拟肽或其可药用盐，
Ac-Gly-Gly-Leu-Xl-X2-Cys-His-X3-Gly-X4-Ile-Thr-X5-Val-Cys-Gln-X 6-Leu-X7-X8-Lys-NH2
(I)
其中，
Cys - Cys形成分子内二硫键；
XI为 Tyr， D-Tyr,或 D型、 L型的非天然芳香性氛基酸，优选地， 所述的非天然芳香性氛基酸中的芳香环可以为吡啶基团或苯基，更优选 地， 当芳香环为苯基时， 则其可在 2、 3、 4或 5位上被选自卤素、硝基、 脲基、 甲氧基或短链烷基中的一个或多个取代基取代，优选为单取代或 二取代；
X2为 Ala、 D-Ala或 Sar;
X3为 Met或 D-Met;
X4为 Pro, MeAla、 MeLeu, MeVal或 Sar;
X5为 1-Nal、 或 D型、 L型的非天然芳香性氛基酸， 优选地， 其中 非天然芳香性氛基酸中的芳香环如果是苯基， 则其可在 2、 3、 4或 5位 上被选自卤素、硝基、脲基、 甲氧基或短链烷基中的一个或多个取 取代， 优选为单取代或二取代；
X6为 Pro、 MeAla、 MeLeu、 MeVal或 Sar;
X7为 Arg、 D- Cit或 L-Cit;
X8为 Sar、 Pro, MeAla、 MeLeu或 MeVal;
但式（ I )不为 XI = Tyr, X2 = Ala, X3 = Met, X4 = Pro, X5 = 1-Nal, X6 = Pro, X7 = Arg, X8 = Sar的组合。
在一个优选的实施例中，本发明第一方面所述的模拟肽或其可药用 盐， 其中， XI为 Tyr、 D-Tyr、 D-或 L-型 3-Pal、 D-或 L-型 4-Pal、 D-或 L- 型 Phe (2-F) 、 D-或 L-型 Phe (3-F) 、 D-或 L-型 Phe (4-F) 、 D-或 L-型 Phe ( 2-Cl ) 、 D-或 L-型 Phe ( 3-Cl ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-Cl ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-Br ) ；
X2为 Ala或 D-Ala;
X3为 Met或 D-Met;
X4为 Pro、 MeAla或 Sar;
X5为 1-NaK D-或 L-型 Phe (2-F) 、 D-或 L-型 Phe (3-F) 、 D- 或 L-型 Phe (4-F)、 D-或 L-型 Phe ( 2-Cl )、 D-或 L-型 Phe ( 3-Cl )、 D-或 L-型 Phe ( 4-Cl ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-Br ) ；
X6为 Pro、 MeAla或 Sar;
X7为 Arg或 Cit;
X8为 Sar或 Pro;
但式（ I )不为 XI = Tyr, X2 = Ala, X3 = Met, X4 = Pro, X5 = 1-Nal, X6 = Pro, X7 = Arg, X8 = Sar的组合。
在一个具体的实施例中，本发明所述的模拟肽或其可药用盐， 其选 自以下模拟肽：
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
本发明的第二方面涉及一种式 (I)所示的模拟肽或其可药用盐的制 备方法， 包括以下步骤：
( 1 )根据待获得的模拟肽的氛基酸序列， 以 Fmoc保护的相应氨 基酸为原料， 按标准的 Fmoc固相多肽合成方法合成肽树脂；
( 2 )选择合适的裂解液， 在合适的条件下， 将步骤（1 )中获得的 肽树脂脱除保护基， 并从树脂上裂解， 获得线性肽分子；
( 3 )将步骤（2 )中获得的线性肽分子中的两个半胱氛酸的游离巯 基氧化而形成环肽；
( 4 ) ffi 的分离纯化步骤。
上述制备方法， 其中步骤（1 ) 中合成肽树脂时， 优选以 Rink-酰 胺树脂为固相载体， 优选以 HBTU-HOBt为缩合剂；
优选地， 步骤（2 ) 中合适的裂解液为三氟乙酸、 苯甲硫醚、 间甲 盼、 乙二硫醇和水的混合物， 优选地， 三氟乙酸、 苯甲硫醚、 间甲盼、 乙二疏醇和水的体积比为 7~10:0.3~0.7： 0.3-0.7:0.1-0.4:0.3-0.7,更优选 的体积比为 8~9:0.4~0.6： 0.4-0.6:0.2-0.3: 0.4-0.6, 最优选的体积比为 8.25:0.5:0.5:0.25:0.5；
优选地， 步骤（ 2 )中合适的条件为在 0-40°C的温度下使肽脱除保 护基， 裂解步骤的条件是在约 0°C的温度反应 20 ~ 40分钟（例如约 30 分钟） ， 然后在室温下反应 80 ~ 100分钟（例如约 90分钟） 。
本发明的第三方面涉及一种药物组合物，其包含式 (I)所示的模拟肽 或其可药用盐， 以及任选的药学可接受的载体。
本发明的第四方面涉及式 (I)所示的模拟肽或其可药用盐的用途，其 可作为促红细胞生成素替代品。
本发明的第五方面涉及式 (I)所示的模拟肽或本发明所述的药物组 合物， 在制备作为 EPO受体激动剂的药物中的用途； 或在制备用于预 防和 /或治疗与 EPO或 EPO受体活性低下相关的疾病和 /或症状的药物 中的用途。
本发明的第六方面涉及一种激活 EPO受体的方法， 该方法是在有 需要的受试者或患者中施用式 (I)所示的模拟肽或其可药用盐。
本发明的第七方面涉及一种预防和 /或治疗与 EPO或 EPO受体活 性低下相关的疾病和 /或症状的方法， 该方法是在有需要的受试者或患 者中施用式 (I)所示的模拟肽或其可药用盐。
其中所述的与 EPO或 EPO受体活性低下相关的疾病和 /或症状选 自贫血、 腎性贫血、 红细胞缺陷或低下、血红蛋白含量低、 肿瘤放疗或 化疗导致的贫血等血液疾病。
以上各式所示化合物中，各种氛基酸或非天然赛基酸所表示的含义 是， 如非特指手性， 均为 L-型， 氛基酸符号按照通用规定表述， 非天 然赛基酸符号在说明书进行了说明。
本发明任一方面或该任一方面的任一项所具有的特征同样适用于 其它任一方面或该其它任一方面的任一项， 只要它们不会相互矛盾， 当 然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。在本发明中， 例如，提及"本发明第一方面任一项，，时，该"任一项 "是指本发明第一方 面的任一子方面； 在其它方面以类似方式提及时， 亦具有相同含义。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。 本发明所引述的所有文献， 它们的全部内容通过引用并入本文， 并 且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时， 以本发明的表述为 准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一 般含义， 即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的 说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的， 以本发明所 表述的含义为准。
如本文所述的， 术语"有效量 "是指可在受试者中实现治疗、 预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病或病症的剂量。
如本文所述的， 术语"药物组合物，，，是指可用于在受试者中实现治 疗、 预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病、 病症、 症状的物质。
如本文所述的， 术语"受试者，，或 "患者，，，可以指接受本发明组合物 和提取物以治疗、 预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病、 病症、 症状 的动物， 特别是哺乳动物， 例如人、 狗、 猴、 牛、 马等。
如本文所述的， 术语"疾病或症状，，是指所述受试者的一种身体状 态， 该身体状态与本发明所述疾病或症状有关。
如本文所述的， 术语 "促红细胞生成素模拟肽" 是指序列为
Ac-Gly-Gly-Leu-Xl-X2-Cys-His-X3-Gly-X4-Ile-Thr-X5-Val-Cys-Gln-X 6-Leu-X7-X8-Lys-NH2的二十一环肽。
如未特殊说明， 本发明所述氛基酸均为 L-型氛基酸， D-型氛基酸 进行特别标明。
如本文所述的， 术语"与 EPO受体相关的疾病和 /或症状，，是指与通 过激动 EPO受体达到预防和 /或治疗相关疾病， 主要是指腎性贫血、 红 细胞缺陷或低下、 血红蛋白含量低、 肿瘤放化疗导致贫血等血液疾病。 本发明化合物的制备采用常规的多肽合成方法，包括固相多肽合成 方法、 液相多肽合成法以及固相-液相多肽合成方法， 氨基酸采用 Fmoc-/tBu-或 Boc-/Bzl-保护策略， 连接方式采用从 N-末端向 C-末端顺 序连接， 或先合成片段， 再将片段连接的方式， 固相合成采用各种可形 成酰胺末端的树脂为载体 (如 MBHA、 PAL, Rink酰胺树脂等)， 以各 种常用缩合剂进行缩合反应（如 DCC/HOBT、 BOP/DIEA、 HBTU/HOBt、 TBTU等)， 反应完后以三氟醋酸或无水 HF将肽从树脂 上切割下来。粗肽经氧化分子内两个巯基形成环肽，分离纯化得到产物， 最终产物用 MALDI-TOF质谱测定分子量。
根据本发明，部分优选化合物在细胞水平对 EPO受体有激动作用。 根据本发明，部分优选化合物在正常小鼠体内具有升高红细胞数量 和血红蛋白含量的作用。
本发明还涉及含有作为活性成分的有效剂量的至少一种多肽修饰 物和 /或其立体异构体或其无生理毒性盐以及常规药物赋形剂或辅剂的 药物组合物。 t "常规药物赋形剂或辅剂"包括任一种或所有溶剂，分 散介质， 包衣， 抗菌剂或抗真菌剂， 等渗及緩幹试剂， 以及类似的生理 配伍制剂， 以适合静脉注射， 肌肉注射， 皮下注射， 或其它非消化道给 药方式为佳。根据给药的方式，可将活性化合物包衣以保护化合物免受 酸或其它自然条件的影响而失活。
本发明所用术语"可药用盐"是指可保留母体化合物预期生理活性 而不会产生任何意料之外毒副作用的盐， 或者含它们的组合物， 例如： 盐酸盐， 氢溴酸盐， 硫酸盐， 磷酸盐， 硝酸盐， 以及醋酸盐， 草酸盐， 酒石酸盐， 琥珀酸盐， 苹果酸盐， 苯甲酸盐， 双羟萘酸盐， 海藻酸盐， 甲磺酸盐， 酸盐等。 根据盐中含有的阳离子又可为： 钾盐， 锂盐， 锌盐， 铜盐， 钡盐， 铋盐， 钙盐等无机盐， 还可为诸如三烷基铵盐等有 机盐。
本发明中模拟肽或其可药用盐或含有它的药物组合物可以以已知 的任何方式给药， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔给药等， 给药剂型例如片 剂、 胶囊、 口含片、 咀嚼片、 酏剂、 混悬剂、 透皮剂、 微囊包埋剂、 埋 植剂、 糖浆剂等。 可以是普通制剂、 緩幹制剂、 控释制剂及各种微粒给 药系统。为了将单位给药剂型制成片剂， 可以广泛使用本领域公知的各 种生物可降解的或生物相容载体。 关于载体的例子， 如盐水基及各种緩 冲水溶液、 乙醇或其它多元醇、 脂质体、 聚乳酸、 乙酸乙烯酯、 聚酐、 聚羟乙酸、 胶原、 聚原酸酯等。 本发明中模拟肽的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗 疾病的性质和严重程度， 患者或动物的性别、 年龄、 体重， 敏感性及个 体反应， 所用的具体化合物， 给药途径， 给药次数以及所希望达到的治 疗效果等。 上述剂量可以单一剂量形式或分成几个， 例如二、 三、 四个 剂量形式给药。
本发明中使用的一些缩写词具有下面的含义：
X 表示 ^酸
Ala 表示 丙氨酸 Arg 表示 精氛酸
Asn 表示 天冬酰胺 Asp 表示 天冬氨酸
Cys 表示 半胱氨酸 Gin 表示 谷氛酰胺
Glu 表示 Gly 表示 甘氨酸
His 表示 组氨酸 lie 表示 异亮氨酸
Leu 表示 亮氨酸 Lys 表示 赖氨酸
Met 表示 甲疏氛酸 MeAla 表示 N-甲 J
Phe 表示 苯丙氨酸 Pro 表示 脯氛酸
Sar 表示 Ν-甲基甘氨 g Thr 表示 苏氨酸
Tyr 表示 酪氛酸 Val 表示 缃氨酸
Cit 表示 瓜氨酸
1-Nal表示 3-Pal 表示
4-Pal表示 Phe(2-F)表示
Phe(3-F)表示 Phe(4-F)表示
Phe(2-Cl)、 Phe(3-Cl)、 Phe(4-Cl)表示类似于 Phe(2-F) Phe(3-F) Phe(4-F), 只是由氟取代变成氯取代， 代表取代位置
Fmoc 表示 芴甲氧
DMF 表示 二甲基甲酰胺 DCC 表示 二环己基碳二亚胺
HOBt 表示 1-羟羞 ^并三唑
TFA 表示 三氟乙酸
EDT表示 巯基乙醇
HBTU 表示 2-(1Η-1-羟基苯并三唑 )-1，1，3，3-四甲基脲六氣磷酸盐
RP-HPLC表示 反相高效液相色谱
其它未标示的缩写具有本领域公知的含义。 具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述， 然而， 本发明 的范围并不限于下述实施例。 本领域的专业人员能够理解，在不背离本 发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。 本发 明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和 /或具体的描 述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知 的， 但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
实施例所用固相合成载体 Rink-酰胺树脂为天津南开合成责任有限 公司产品； HOBT、 HBTU, DIEA以及 Fmoc-保护的天然氨基酸由上 海吉尔生化公司提供。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或 制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可 以通过市购获得的常规产品。 实施例 1 ： SEO-01 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-MeAla-OH ， Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根 据 SEQ-01的 列， 按标准的 Fmoc固相多肽合成方法合成肽树 脂。 以 20ml三氟乙酸： 苯甲硫醚： 间甲盼： 乙二硫醇： 7j (8.25: 0.5: 0.5: 0.25: 0.5，体积比)作裂解液， 0。C反应 30分钟， 室温 90反应分钟， 将肽脱除保护基并从树脂上裂解下来。 粗肽溶于 20%DMSO/H2O溶液 作为氧化形成二硫键媒介、粗肽浓度为 O.lmM,室温搅拌反应 1 ~ 3天。 溶液经 RP-HPLC纯化， RP-HPLC条件， A相： 0.05%TFA/水； B相： 0.05%TFA〃0%ACN/水； 色傳柱： C18 300A 4.6x250mm; 梯度： 0-17 分钟 B% 35-85, 17-21分钟 B%85-35， 25分钟结束； 流速： lmL/min; 柱温： 25。C。 MALDI-Tof质谱分析结果见表 1。 MALDI-Tof质谱测定 分子量为 2339.2。
实施例 2 ： SEQ-02 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-l-Nal-OH ， Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-02的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-02o MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 3 ： SEQ-03 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-MeAla-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH， Fmoc-Tyr(OtBu)-OH， Fmoc-Val-OH 为原料， HBTU-HOBt为缩合剂，根据 SEQ-03的氛基酸序列，按实施例 1方法，
SEQ-03„ MALDI-Tof质谱分析结 ^^ 1。
实施例 4 ： SEQ-04 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH ， Fmoc-Ser(tBu)-OH ， Fmoc-Sar-OH ， Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-04的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-04。 MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 5 ： SEQ-05 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-Phe(4-Br)-OH ， Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-05的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-05„ MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 6 ： SEQ-06 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-Phe(4-Cl)-OH ， Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-06的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-06„ MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 7 ： SEQ-07 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-Phe(4-F)-OH ， Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-07的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-07„MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 8 ： SEQ-08 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH ， Fmoc-Ser(tBu)-OH ， Fmoc-MeAla-OH ， Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-08的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-08„MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 9 ： SEQ-09 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Cit-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH , Fmoc-l-Nal-OH , Fmoc-Phe-OH , Fmoc-Pro-OH , Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Sar-OH， Fmoc-Val-OH 为原料， HBTU-HOBt为缩合剂，根据 SEQ-09的氛基酸序列，按实施例 1方法， 获得 SEQ-09。 MALDI-Tof质谱分析结果见表 1。
实施例 10 ： SEO-10 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 （0.25mmol) 为 固 目 载体 ， 以 Fmoc-D-Ala-OH ， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-10的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-lOo MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 11 ： SEQ-11 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-l-Nal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH ， Fmoc-Ser(tBu)-OH ， Fmoc-Sar-OH ， Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH , Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合 剂， 根据 SEQ-11 的氛基酸序列， 按实施例 1 方法， 获得 SEQ-llo MALDI-Tof质谱分析结果见表 1。
实施例 12 ： SEQ-12 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-l-Nal-OH ，
Fmoc-Phe(4-F)-OH ， Fmoc-Phe-OH ， Fmoc-Pro-OH ， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Sar-OH， Fmoc-Val-OH 为原料， HBTU-HOBt为缩合剂，根据 SEQ-12的氛基酸序列，按实施例 1方法， 获得 SEQ-12。 MALDI-Tof质谱分析结果见表 1。
实施例 13 ： SEQ-13 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-l-Nal-OH ，
Fmoc-3-Pal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根 据 SEQ-13的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-13„ MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。 实施例 14 ： SEQ-14 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-Met-OH ， Fmoc-l-Nal-OH ，
Fmoc-4-Pal-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根 据 SEQ-14的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-14e MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
实施例 15 ： SEQ-15 (结构序列见表 1 ) 的合成
以 l.Og Rink-酰胺树脂 (0.25mmol)为固 目载体， 以 Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Cys(Trt)-OH ， Fmoc-Gln(Trt)-OH ， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH , Fmoc-Leu-OH , Fmoc-Lys(Boc)-OH ， Fmoc-D-Met-OH ， Fmoc-l-Nal-OH ， Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Sar-OH, Fmoc-Tyr(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据 SEQ-15的氛基酸序列，按实施例 1方法，获得 SEQ-15o MALDI-Tof 质谱分析结果见表 1。
表 1. 肽序列 谱分析数据
化合物 一级结构 MALDI-Tof - MS (分子量）
SEQ - 01 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala- ys-His-Met-Gly-Me 2339.2
Ala-Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sa
r-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 02 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-^ys-His-Met-Gly-Sar- 2326.3
Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar-L
ys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 03 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-^ys-His-Met-Gly-Pro- 2340.1
Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-MeAla-Leu-Arg-Sar
-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内 · ^键 )
SEQ - 04 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^Cys-His-Met-Gly-Pro- 2326.4
Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-Sar-Leu-Arg-Sar-Ly
Figure imgf000017_0001
生物学实验例 1: EPO受体介导的细胞增殖活性评价
体外检测 EPO活性的方法主要基于研究 EPO诱导 EPO敏感细胞 的增殖和 /或者分化。 TF-1 细胞正是这样一种 EPO敏感细胞。 最早从 人红细胞白血病患者身上分离得到 TF-1细胞系，该细胞高表达 EPOR。 TF-1细胞的增殖依赖于粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF )或者白 介素 3 ( IL-3 )。 而 EPO同样可以诱导 TF-1细胞的增殖， 并且已经作 为普遍接受的体外检测 EPO 活性的方法（ T Kitamura, et al. Blood. 1989， 73: 375-380. S Chretien, et al. The EMBO J. 1996 , 15 : 4174-4181 )。基于此，本发明首先使用 EPO建立 TF-1 细胞增殖实验， 然后测定促红细胞生成素模拟肽刺激 EPO受体介导的 TF-1细胞增殖活 性。
( 1 )细胞系：
• TF-1 (美国标准菌库（ATCC ) ， 货号 CRL2003 )
( 2 )试剂及材料：
• RPMI1640培养基（Gibco/Invitrogen, 货号 22400 )
• 胎牛血清（FBS， Gibco/Invitrogen, 货号 1043-7036 )
• 青霉素-链霉素 （Gibco/Invitrogen, 货号 10378 )
• 磷酸盐緩冲液（ Gibco/Invitrogen, 货号 10010-023 )
• 重组人 GM-CSF ( Genscript )
• 125mL聚碳酸酯圆口瓶（Corning, 货号 430421 )
( 3 )检测试剂盒：
• CellTiter-Glo 荧光细胞活力检测试剂盒（ Promega公司， 货号 G7571 )
( 4 )检测仪器：
• PHERAstar Plus酶标仪 ( BMG labtech公司）
( 5 )样品配制:
• 待测样品和 EPO使用不含生长因子如 GM-CSF 的完全培养基 溶解和稀释。
( 6 )试验方法： 首先 TF-1细胞复苏， 通过台盼蓝染色细胞记数 并进行活力测定后， 将细胞悬液加入培养 J ^中， 于含 37°C / 5% C02培 养箱中培养过夜。 TF-1 细胞根据 ATCC 网站提供的方法使用 RPMI-1640 完全培养基 (含 2 ng/mL重组人 GM-CSF和 10% FBS ) 进 ^养。 实验前一天细胞进行换液并保持合理的密度。 实验开始， 离 心收集对数生长期的细胞； 取出原培养基后用无 GM-CSF 的完全培养 基重选漂洗细胞， 并离心收集。 细胞活力用台盼蓝染色法进行计数后铺 到实验孔板上。 细胞活力超过 99%以上的细胞才允许用于本研究。
( 7 )增殖实验： 按上述方法收集 TF-1 细胞后， 调整细胞浓度； 最终以 50 10000 细胞的密度铺到 96 孔实验板上； 将准备好的待测 化合物 (实施例 1 - 15制备的 SEQ-01至 SEQ-15所示的模拟肽）或者 ΕΡΟ ( 50 )加入到细胞上， 轻轻摇匀后置 37。CI 5% C02培养箱培 养 72h; 72h后使用 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit 检测细胞活力用 PHERAStar Plus进行读值收集数据后进行数据分析； PHERAStar Plus读取的数据去除平均实验背景读值（培养液）后采用 GraphPad Prism version4.0 进行数据分析。 结果见表 2。
表 2.促红细胞生成素模拟肽细胞增殖活性
化合物 一级结构 EC50(uM)
SEQ - 01 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-^ys-His-Met-Gly-Me 0.026
Ala-Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-S
ar-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二 )
SEQ - 02 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-^ys-His-Met-Gly-Sar- 0.031
Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar-L
ys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 03 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-^ys-His-Met-Gly-Pro- 0.012
Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-MeAla-Leu-Arg-Sar
-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 04 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^Cys-His-Met-Gly-Pro- 0.042
Ile-Thr-1-Nal-Val-Cys-Gln-Sar-Leu-Arg-Sar-L
ys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 05 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro- 0.54
Ile-Thr-Phe(4-Br)-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-S
ar-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 06 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro- 0.24
Ile-Thr-Phe(4-Cl)-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sa r-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 07 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro- 0.54
Ile-Thr-Phe(4-F)-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sa
r-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 08 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^ys-His-Met-Gly-Pro- 0.46
Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys^Gln-Pro-Leu-Arg-MeAla
-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 09 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^ys-His-Met-Gly-Pro- 0.031
Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Cit-Sar-Ly
s-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二^: )
SEQ - 10 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-D-Ala-Cys-His-Met-Gly-P 0.089
ro-Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar
-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 11 Ac-Gly-Gly-Leu-D-Tyr-Ala^Cys-His-Met-Gly-P 0.13
ro-Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar
-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 12 Ac-Gly-Gly-Leu-Phe(4-F)-Ala-^.ys-His-Met-Gly 0.094
-Pro-Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-S
ar-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 13 Ac-Gly-Gly-Leu-3-Pal-Ala-^.ys-His-Met-Gly-Pr 0.19
o-Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar- Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 14 Ac-Gly-Gly-Leu-4-Pal-Ala-^ys-His-Met-Gly-Pr 0.66
o-Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar- Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
SEQ - 15 Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala- ys-His-D-Met-Gly-P 0.63
ro-Ile-Thr-l-Nal-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Sar
-Lys-NH2 ( Cys - Cys形成分子内二硫键 )
从表 2可以看出， 本发明式（I )所示的促红细胞生成素模拟肽均 EPO受体介导细胞增殖活性。
生物学实验例 2: 正常小鼠升红细胞活性评价
动物： 小鼠（KM，雄性， 18-22g，军事医学科学院实验动物中心）； 药物配制： 药物现配现用， 以 0.1 % BSA生理盐水为溶媒。 全自动血液分析仪（法国 YODER公司） 。
试验方法： 动物连续给药 7天， 1次 /天， 皮下注射（sc )， 试验结 束；^测定外周血红细胞（ RBC )、血红蛋白（ Hb )， 网织红细胞（ RET )。 成年雄性小鼠， 随机分组， 每组约 10只。 以 rhEPO (重组 EPO， 环尔 博， 5000IU/mL， 四环生物制药有限公司）为阳性对照。
实验结果： 见表 3.
表 3 化合物对外周红细胞、 血红蛋白及网织红细胞生成的影响 剂量 RBC Hb RET
药物
(mg/kg) (1012/L) (g/L) (1012/L) 溶媒 - 8.74±0.58 135.1±9.5 0.455±0.107 rhEPO 5xl0-3 10.01±0.59** 159.0±4.5** 0.985±0.163***
SEQ - 01 5 9.15±0.46 144.4±7.4 0.658±0.071**#
SEQ - 03 5 9.14±0.57 146.4±6.0*# 0.652±0.095**#
SEQ - 09 5 9.67±0.64* 158.1±11.3** 0.893±0.083*** 注： 溶媒为 0.1 % BSA的生理盐水； 动物连续给药 7d, 1次 /d, sc; */ 0.05; **/ 0.01; ***/ 0.001 与溶 ^ i比较； <0.05与溶 ^ i有差异的組别与 rhEPO組比较
结果显示： 与溶媒组比较， 分别给予 SEQ - 01、 SEQ - 03, SEQ - 09后， 小鼠的红细胞， 血红蛋白及网织红细胞均具有一定程度的升 高趋势。 说明本发明是获得的化合物具有升红作用。
rhEPO是非常高活性物质， 但易产生抗体， 从而导致严重的副作 用， 本发明寻找到一种新的激动剂， 即式 (I)所示的模拟肽， 该模拟肽一 方面保持了促红细胞生成素的活性， 另一方面， 该模拟肽分子量较小， 小肽相比较而言，免疫原性较低， 因而由抗原抗体反应导致的毒副作用 会比 rhEPO低。

Claims

1、 式 (I)所示的模拟肽或其可药用盐，
Ac-Gly-Gly-Leu-Xl-X2-Cys-His-X3-Gly-X4-Ile-Thr-X5-Val-Cys-Gln-X 6-Leu-X7-X8-Lys-NH2
(I)
其中，
Cys - Cys形成分子内二硫键；
XI为 Tyr， D-Tyr,或 D型、 L型的非天然芳香性氛基酸，优选地， 所述的非天然芳香性氛基酸中的芳香环可以为吡啶基团或苯基， 更优选 地， 当芳香环为苯基时， 则其可在 2、 3、 4或 5位上被选自卤素、硝基、 脲基、 甲氧基或短链烷基中的一个或多个取代基取代， 优选为单取代或 二取代；
X2为 Ala、 D-Ala或 Sar;
X3为 Met或 D-Met;
X4为 Pro, Me Ala, MeLeu、 MeVal或 Sar;
X5为 1-Nal、 或 D型、 L型的非天然芳香性氛基酸， 优选地， 其中 非天然芳香性氛基酸中的芳香环如果是苯基， 则其可在 2、 3、 4或 5位 上被选自卤素、 硝基、 脲基、 甲氧^ ^短链烷基中的一个或多个取 取代， 优选为单取代或二取代；
X6为 Pro、 Me Ala, MeLeu、 MeVal或 Sar;
X7为 Arg、 D- Cit或 L-Cit;
X8为 Sar、 Pro, MeAla、 MeLeu或 MeVal;
但式（ I )不为 XI = Tyr, X2 = Ala, X3 = Met, X4 = Pro, X5 = 1-Nal, X6 = Pro, X7 = Arg, X8 = Sar的组合。
2、 权利要求 1的模拟肽或其可药用盐， 其中，
XI为 Tyr、 D-Tyr, D-或 L-型 3-Pal、 D-或 L-型 4-Pal、 D-或 L- 型 Phe ( 2-F ) 、 D-或 L-型 Phe ( 3-F ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-F ) 、 D-或 L-型 Phe ( 2-C1 ) 、 D-或 L-型 Phe ( 3-C1 ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-C1 ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-Br ) ；
X2为 Ala或 D-Ala;
X3为 Met或 D-Met;
X4为 Pro、 MeAla或 Sar;
X5为 1-NaK D-或 L-型 Phe ( 2-F ) 、 D-或 L-型 Phe ( 3-F ) 、 D- 或 L-型 Phe ( 4-F ) 、 D-或 L-型 Phe ( 2-Cl ) 、 D-或 L-型 Phe ( 3-Cl ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-C1 ) 、 D-或 L-型 Phe ( 4-Br )；
X6为 Pro、 MeAla或 Sar;
X7为 Arg或 Cit;
X8为 Sar或 Pro;
但式（ I )不为 XI = Tyr, X2 = Ala, X3 = Met, X4 = Pro, X5 = 1-Nal, X6 = Pro, X7 = Arg, X8 = Sar的组合。
3、 权利要求 1或 2的模拟肽或其可药用盐， 其选自以下模拟肽：
SEQ-01: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-MeAla-Ile-
Thr-1-Nal-Val-Cyi^hirp^-Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-02: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Sar-Ile-Thr- l-Nal-Val-Cys=Gii^Proieu-Arg-Sar-Lys-NH2 SEQ-03: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr- l-Nal-Val-Cys-Gln-MeAla-Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-04: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr- l-Nal-Val-(^Gh¾ar^Leu-Arg-Sar-Lys-NH2 SEQ-05: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^ ys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr-
Phe(4-Br)-Val-Cys¾ iiro-Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-06: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr-
Phe(4-Cl)-Val-CyTGhiiro-Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-07: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala^ys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr-
Phe(4-F)-Val ys=Giiiiro-Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-08: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr- l-Nal-Val-Cy^Gii^Pr0^Leu-Arg-MeAla-Lys-NH2
SEQ-09: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Thr- l-Nal-Val ys^hiir0^Leu-Cit-Sar-Lys-NH2 SEQ-10: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-D-Ala Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-T hr-l-Nal-Val-Cys=Ginir0^Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-11： Ac-Gly-Gly-Leu-D-Tyr-Ala=Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-T
hr-l-Nal-Val-Cys=GhT?r0ieu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-12: Ac-Gly-Gly-Leu-Phe^-r Ala Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile
-Thr-l-Nal-Val-(^Gii 5r0-Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
SEQ-13: Ac-Gly-Gly-Leu-S-Pal-Ala^Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Th r-l-Nal-Val-C S^3n5ro^Leu-Arg-Sar-Lys-NH2 SEQ-14: Ac-Gly-Gly-Leu-4-Pal-Ala Cys-His-Met-Gly-Pro-Ile-Th r-l-Nal-Val-Cys=Giiiir0ieu-Arg-Sar-Lys-NH2 SEQ-15: Ac-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-D-Met-Gly-Pro-Ile-T
hr-l-Nal-Val-Cys=Giiiiro^Leu-Arg-Sar-Lys-NH2
4、 权利要求 1至 3任一项的模拟肽或其可药用盐的制备方法， 包 括以下步骤：
( 1 )根据待获得的模拟肽的氛基酸序列， 以 Fmoc保护的相应氨 基酸为原料， 按标准的 Fmoc固相多肽合成方法合成肽树脂；
( 2 )选择合适的裂解液， 在合适的条件下， 将步骤（1 ) 中获得的 肽树脂脱除保护基， 并从树脂上裂解， 获得线性肽分子；
( 3 )将步骤（2 )中获得的线性肽分子中的两个半胱氛酸的游离巯 基氧化而形成环肽；
( 4 )任选的分离纯化步骤。
5、 权利要求 4 的制备方法， 其中步骤（1 ) 中合成肽树脂时， 以 Rink-酰胺树脂为固相载体， 以 HBTU-HOBt为缩合剂；
优选地， 步骤（2 ) 中合适的裂解液为三氟乙酸、 苯甲硫醚、 间甲 盼、 乙二硫醇和水的混合物， 优选地， 三氟乙酸、 苯甲硫醚、 间甲盼、 乙二疏醇和水的体积比为 7~10:0.3~0.7： 0.3-0.7:0.1-0.4:0.3-0.7, 更优选 的体积比为 8~9:0.4~0.6： 0.4-0.6:0.2-0.3: 0.4-0.6, 最优选的体积比为 8.25:0.5:0.5:0.25:0.5；
优选地， 步骤（ 2 ) 中合适的 为在 0-40°C的温度下使肽脱除保 护基， 裂解步骤的条件是在约 0°C的温度反应 20 ~ 40分钟（例如约 30 分钟 ) ， 然后在室温下反应 80 ~ 100分钟 (例如约 90分钟 ) 。
6、 一种药物组合物， 其包含权利要求 1至 3任一项的模拟肽或其 可药用盐， 以及任选的药学可接受的载体。
7、 权利要求 1至 3任一项的模拟肽或其可药用盐， 其作为促红细 胞生成素替代品的用途。
8、 权利要求 1至 3任一项的模拟肽或权利要求 ό的药物组合物， 在制备作为 ΕΡΟ受体激动剂的药物中的用途； 或在制备用于预防和 /或 治疗与 ΕΡΟ或 ΕΡΟ受体活性低下相关的疾病和 /或症状的药物中的用 途。
9、 权利要求 8所述的用途， 其中所述的与 ΕΡΟ或 ΕΡΟ受体活性 低下相关的疾病和 /或症状选自贫血、 腎性贫血、 红细胞缺陷或低下、血 红蛋白含量低、 肿瘤放疗或化疗导致的贫血等血液疾病。
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