JP5078124B2 - ヒト破骨細胞形成抑制活性を有する新規のペプチド - Google Patents

Description

本発明はヒト破骨細胞形成抑制活性を有する新規のペプチドに関する。詳しくは、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（以下、ＧＱＮとする）からなるアミノ酸配列を含むヒト破骨細胞形成抑制活性を有するペプチドに関する。さらに、このペプチドを含む破骨細胞形成抑制組成物に関する。

骨代謝の異常を伴う疾患として、骨粗鬆症、関節リウマチ、高カルシウム血症、変形性関節炎等が知られている。このうち、骨粗鬆症、関節リウマチ等は、破骨細胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上回ることにより発生する疾患である。このような疾患は、骨形成を促進すること、又は破骨細胞の骨吸収活性等の機能を抑制することにより改善されると考えられる。

骨代謝に関するホルモン、サイトカイン等として、様々な物質が知られている。例えば、インターフェロン−ｇaｍｍａ、インターロイキン−４、顆粒球マクロファージ刺激因子が破骨細胞の分化・活性化を抑制し、骨吸収を抑制するサイトカインとして報告されている。またカルシトニンは破骨細胞の分化・活性化を抑制し、骨吸収を抑制するホルモンとして報告されている。

これらは、骨代謝改善剤として利用されており、例えばカルシトニンは、骨粗鬆症の治療薬、疼痛軽減薬として市販されている。又、活性型ビタミンＤ₃、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、イプリフラボン又はカルシウム製剤等が、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、臨床で使用されている。
しかし、これらを用いた治療法はその効果並びに治療結果において必ずしも満足できるものではなく、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の開発が期待されている（例えば、特許文献１、参照）。

近年、破骨細胞形成において、ＲＡＮＫＬ及びＮＦＡＴｃ１分子が転写因子として必須であることが確認されている（例えば、非特許文献１、２参照）。本発明では、これらのＲＡＮＫＬシグナルやＮＦＡＴｃ１分子を標的として、破骨細胞形成抑制活性を有する物質を得ることを目的としている。そして、これらの転写因子を特異的に制御することで骨粗鬆症や関節リウマチ等の治療に有効な破骨細胞形成抑制組成物を得ることを目的としている。
特開平１１−３３２５８１号公報 Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ２８５， １９９９， ｐ．２１２９−２１３３． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ｖｏｌ１１４， Ｎｏ．１， ２００４， ｐ．４７５−４８４．

本発明はヒト破骨細胞形成抑制活性を有する新規のペプチドを得ることを課題とする。さらに、当該ペプチドを含むヒト破骨細胞形成抑制組成物を得ることを課題とする。

本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト滑膜組織からヒト破骨細胞形成抑制活性を有する新規のペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明で見出された新規のペプチドは、破骨細胞形成において必須の転写因子である、ＲＡＮＫＬ又はＮＦＡＴｃ１分子の存在下において、いずれにおいても破骨細胞形成抑制活性を有することから、これらの転写因子の活性を制御して、破骨細胞の形成を抑制していることが示唆された。これより、本発明のペプチドを含む破骨細胞形成抑制組成物は、ＲＡＮＫＬシグナルやＮＦＡＴｃ１分子を標的として、特異的に制御することが可能であり、骨粗鬆症や関節リウマチ等の治療に有効な組成物となり得ることが示唆された。

すなわち、本発明は次の（１）〜（７）に記載のペプチド、組成物等に関する。
（１） ヒト破骨細胞形成抑制活性を有するＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ＧＱＮ）からなるアミノ酸配列を含むペプチド。
（２） ＴＣＴＡ遺伝子タンパク質由来である上記（１）に記載のペプチド。
（３） 配列表配列番号１及び７〜１０のいずれかに示される上記（１）又は（２）に記載のペプチド。
（４） Ｎ末端にＧＱＮからなるアミノ酸配列を含む上記（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド。
（５） 上記（３）に記載のペプチドをコードする配列表配列番号２および１２〜１５のいずれかに示される塩基配列。
（６） 上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを含むヒト破骨細胞形成抑制組成物。
（７） 上記（６）に記載の破骨細胞形成抑制組成物を用いる、骨粗鬆症又は関節リウマチの治療方法。

本発明の破骨細胞形成抑制活性を有する新規のペプチドを用いることにより、ＲＡＮＫＬシグナルやＮＦＡＴｃ１分子を標的として、特異的に制御することが可能となる。これにより、破骨細胞形成を抑制することで、骨粗鬆症や関節リウマチ等の治療に用いることができる。

本発明のペプチドが有する「ヒト破骨細胞形成抑制活性」とは、破骨細胞へのＲＡＮＫＬやＮＦＡＴｃ１分子等の、破骨細胞分化に関わる転写因子の活性を抑制することで、破骨細胞の形成を抑制することをいう。

本発明のペプチドはヒト破骨細胞形成抑制活性を有するペプチドであって、ＧＱＮからなるアミノ酸配列を含むペプチドであればいずれのものでも該当する。単にＧＱＮからなるペプチドであっても良い。
ＧＱＮからなるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、ＴＣＴＡ遺伝子タンパク質由来の場合が挙げられ、Ｎ末端にＧＱＮからなるアミノ酸配列を含むことが好ましい。このようなペプチドとして、例えば、配列表配列番号１及び７〜１０に該当するペプチドが好ましく、特に、配列表配列番号７に記載のペプチドはヒト破骨細胞形成抑制活性が高いため、好ましい。

本発明のヒト破骨細胞形成抑制組成物は、ヒト破骨細胞形成抑制活性を有するペプチドであって、ＧＱＮからなるアミノ酸配列を含むペプチドを含んでいればいずれの組成物も含むことができる。ペプチド以外に、ペプチドのヒト破骨細胞形成抑制活性を保持できる物質であれば、組成物を形成するための成分等を含むこともできる。
本発明のヒト破骨細胞形成抑制組成物は、ヒト破骨細胞形成を抑制することにより、生物学的製剤として、骨粗鬆症や関節リウマチ等の治療に用いることができる。本発明のヒト破骨細胞形成抑制組成物を、生物学的製剤としてヒトに投与する場合には、組成物を含む注射液を作成し、皮下に注射することで全身投与する方法や、疾患部位への輸送能を有する物質と組み合わせることで、ドラックデリバリーシステムによって遺伝子投与する方法等を用いることができる。
以下、本発明の詳細を実施例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．精製タンパク質の調整
インフォームドコンセントの後、人工膝関節置換術を施術した２０人の関節リウマチ（ＲＡ： ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）患者から滑膜組織を得た。株式会社東レ リサーチセンターにより、この滑膜組織からゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びマススペクトルにより精製タンパク質を得た。これらの精製タンパク質について、ヒト破骨細胞形成におけるタンパク質の抑制活性を評価した。

２．破骨細胞形成抑制活性の評価
インフォームドコンセントの後、５人の健康なボランティアから１０００Ｕ／ｍｌへパリン（保存剤フリー）を含むシリンジにヒト抹消血を集めた。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（シグマ社）による密度勾配によって、ＰＢＭＣを単離した後、洗浄し、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＯＣＯ社製）に１．３×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。
このＰＢＭＣ細胞を５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように、４８ウェルプレートに入れ、Ｍ−ＣＳＦ（Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ製）１００ｎｇ／ｍＬ存在下で３日間培養した。プレートに付着していない細胞を除き、付着しているＰＭＢＣ細胞に上記１で得た精製タンパク質（１０μｇ／ｍＬ）を添加して、ヒト可溶化ＲＡＮＫＬ（以下、ヒトｓＲＡＮＫＬと略することがある）（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣＬｔｄ）１００ｎｇ／ｍＬ存在下で培養した。１０日間培養後、破骨細胞を形成している細胞の数を数えた（ｎ＝４）。
その結果、上記１で得られた精製蛋白質のうち、Ｎ末端にＧＱＮからなるアミノ酸配列を含む１０００Ｄａよりも小さい蛋白質が、ヒト破骨細胞形成抑制活性を有することが確認された。

３．合成ペプチドＧＱＮにおける破骨細胞形成抑制活性の評価
本発明者らは合成ペプチドＧＱＮを調製した。
上記２と同様の評価方法を用いて、精製タンパク質の替わりに合成ペプチドＧＱＮを０、０．３、３．０、３０．０μＭとなるようにそれぞれ加えることにより、合成ペプチドＧＱＮの破骨細胞形成抑制活性を調べた。合成ペプチドは株式会社東レ リサーチセンターに合成を委託したものを用いた。その結果、図１に示すように、ｓＲＡＮＫＬのみを加えた場合と比較して、合成ペプチドＧＱＮも添加した場合には、破骨細胞数が減少することが確認された。また、合成ペプチドＧＱＮの添加濃度に依存して、破骨細胞数が減少することが示された。これにより、合成ペプチドＧＱＮは濃度依存的に破骨細胞形成抑制活性を有することが示唆された。

ＧＱＮを含むペプチドの調整及び抑制活性の評価（１）
ＦＡＳＴＡを用いてＧＱＮを含むペプチドをサーチしたところ、ＴＣＴＡ（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子タンパク質由来のペプチド（配列表配列番号１：ＧＱＮＧＳＴ）と、ＣＤＷ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）抗原由来のペプチド（配列表配列番号３〜６：ＳＧＱＮ、ＧＱＮＤＴ、ＧＱＮＤＴＳＱＴ及びＧＱＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳＡ）を得た。配列表配列番号１のペプチドをコードする塩基配列は配列表配列番号２に示した。
上記、実施例１、２．と同様の評価方法を用いて、これらのペプチドの破骨細胞形成抑制活性を調べたところ、ＴＣＴＡ遺伝子タンパク質由来のペプチドはヒト破骨細胞形成を抑制したが、ＣＤＷ５２抗原由来のペプチドはいずれも抑制しなかった。

ＧＱＮを含むペプチドの調整及び抑制活性の評価（２）
ＴＣＴＡ遺伝子タンパク質のシークエンスにより、表１に記載のペプチドＡ〜Ｄ（配列表配列番号７〜１１）を得た。これらのうちペプチドＡ〜Ｃをコードする塩基配列を配列表配列番号１２〜１５に示した。
図２に示すように、ペプチドＡ〜ＤはいずれもＴＣＴＡ遺伝子におけるヒト及びマウスの共通配列（図２、■ 部分）の一部又は全部を有していた。このうち、ペプチドＢ及びＣのアミノ酸配列はマウスのＴＣＴＡ遺伝子を完全に含んでおり、ペプチドＤは、ヒト細胞外ドメインを全て含んでいた。

上記、実施例１、２．と同様の評価方法を用いて、これらのペプチドＡ〜Ｄの抑制活性を調べたところ、ペプチドＡは上記実施例１及び２で得たペプチド（ＧＱＮ、ＧＱＮＧＳＴ）より強くヒト破骨細胞形成を抑制した。図３に示すように、ペプチドＡを１６０ｎＭ以上添加したところ、破骨細胞数が著しく減少した。また、図４に示すように、１６０ｎＭ以上添加した場合に破骨細胞の形成が著しく少なくなっていた。このことよりペプチドＡのＩＣ５０レベルは１６０ｎＭであることが示された。また、ペプチドＢ及びＣはペプチドＡの半分程度という弱い活性ではあったが、ヒト破骨細胞形成を抑制した。一方、ペプチドＤは全く抑制しなかった。

これらのペプチドについて、マウス骨髄細胞を用いてマウス破骨細胞形成の抑制活性も評価した。評価にあたり、ｄｄＹマウスの脛骨から採取した骨髄細胞にＭ−ＣＳＦ（５μｇ／ｍＬ）を加え、２４時間培養し、浮遊細胞を回収した。その後、細胞数を１．５Ｘ１０⁵ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように４８ウェルプレートに入れ、ペプチドをそれぞれ３２０、３２、３．２、０．３２ ｎｇ／ｍＬ添加し、２時間後さらにＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびヒトｓＲＡＮＫＬ（２０ ｎｇ／ｍｌ または１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて培養した。４日後にＴＲＡＰ染色により破骨細胞数を測定したところ、いずれも抑制活性を示さなかった。これらの結果を表１にまとめた。

ＮＦＡＴｃ１タンパクの発現の抑制を介する、ペプチドＡの破骨細胞形成抑制活性
破骨細胞におけるＮＦＡＴｃ１タンパクの発現を免疫染色法にて検討したところ図５に示すように、ペプチドＡを１６０ｎＭ以上添加した場合に破骨細胞形成抑制とともにＮＦＡＴｃ１の発現も減少した。

ＮＦＡＴｃ１のｍＲＮＡ量の定量
ペプチドＡ添加によるＮＦＡＴｃ１タンパクの発現の抑制を、ＲＴ−ＰＣＲ法によってｍＲＮＡ量を定量することにより調べた。その結果、ペプチドＡ １６０ｎＭ添加からＮＦＡＴｃ１のｍＲＮＡ量の減少が認められ、３２０ｎＭ添加でｍＲＮＡ量が８８％に減少した。これより、ペプチドＡの用量依存的に、ＮＦＡＴｃ１のｍＲＮＡ量が減少することが示された。

成熟した破骨細胞におけるペプチドＡの骨吸収抑制作用
ヒトＰＢＭＣ細胞を実施例１と同様に調節し、破骨細胞を形成した。形成された成熟した破骨細胞をトリプシンとＥＤＴＡを添加して剥離し、細胞数を２．５Ｘ１０³／ｗｅｌｌとなるように調節した後、ハイドロキシアパタイトが底面に付着している骨吸収測定用細胞培養プレートＯｓｔｅｏｌｏｇｉｃ（商品名）に添加し２週間培養した。培養後、吸収窩を調べたところ、図６、図７に示すように濃度依存的に骨吸収が減少することが示された。図７では、縦軸に１ウェルあたりの吸収窩の数を示し、平均とＳＤを示した（ｎ＝４、ａｓｔｅｒｉｓｋ：Ｐ＜０．０５）。

本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬシグナルやＮＦＡＴｃ１分子を標的として、特異的に制御することができる。このペプチドを含む組成物は、破骨細胞形成抑制組成物として、骨粗鬆症や関節リウマチ等の治療に用いることができる。

ペプチド（ＧＱＮ）の破骨細胞形成抑制活性を示した図である（実施例１）。 ＴＣＴＡタンパク質の構造と、ペプチドＡ〜Ｄのシークエンスを示した図である（実施例３）。 ペプチドＡの破骨細胞形成抑制活性を示した図である（実施例３）。 ペプチドＡの破骨細胞形成抑制活性を示した図である（実施例３）。 ペプチドＡの破骨細胞形成抑制活性を示した図である（実施例４）。 成熟した破骨細胞におけるペプチドＡの骨吸収抑制作用を示した図である（実施例６）。 成熟した破骨細胞におけるペプチドＡの骨吸収抑制作用を示した図である（実施例６）。

Claims (5)

1. ＴＣＴＡ遺伝子タンパク質由来であって、ヒト破骨細胞形成抑制活性を有するＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ＧＱＮ）からなるアミノ酸配列を含む２９ｍｅｒ以下のペプチド。
2. ヒト破骨細胞形成抑制活性を有するＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ＧＱＮ）からなるアミノ酸配列を含む配列表配列番号１及び７〜１０のいずれかに示されるペプチド。
3. 請求項２に記載のペプチドをコードする配列表配列番号２および１２〜１５のいずれかに示される塩基配列からなる核酸分子。
4. 請求項１または２に記載のペプチドを含むヒト破骨細胞形成抑制組成物。
5. 請求項４に記載のヒト破骨細胞形成抑制組成物を用いる、骨粗鬆症又は関節リウマチの治療用組成物。