JP2002121150A - 骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬 - Google Patents
骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 より高い骨形成活性を示す新規の骨形成用医
薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬を提
供する。 【解決手段】 前記骨形成用医薬は、骨形成治療におい
て、骨誘導因子との同時使用又は連続使用のためのＩＬ
−１１を有効成分として含むか、あるいは、骨形成治療
において、ＩＬ−１１との同時使用又は連続使用のため
の骨誘導因子を有効成分として含む。前記骨形成用医薬
組成物は、骨誘導因子及びＩＬ−１１を有効成分として
含む。前記骨形成用組合せ医薬は、骨誘導因子を有効成
分として含む第１の医薬と、ＩＬ−１１を有効成分とし
て含む第２の医薬との組合せを含む。
薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬を提
供する。 【解決手段】 前記骨形成用医薬は、骨形成治療におい
て、骨誘導因子との同時使用又は連続使用のためのＩＬ
−１１を有効成分として含むか、あるいは、骨形成治療
において、ＩＬ−１１との同時使用又は連続使用のため
の骨誘導因子を有効成分として含む。前記骨形成用医薬
組成物は、骨誘導因子及びＩＬ−１１を有効成分として
含む。前記骨形成用組合せ医薬は、骨誘導因子を有効成
分として含む第１の医薬と、ＩＬ−１１を有効成分とし
て含む第２の医薬との組合せを含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨形成用医薬、骨
形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬に関する。
形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９９０年にポール（Ｐａｕｌ）らによ
り、骨髄間質細胞株の培養上清から形質細胞増殖刺激因
子としてインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）がクロ
ーニングされた（Ｐａｕｌ ＳＲら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７５１２−７５
１６，１９９０）。組換えヒトＩＬ−１１は、イン・ビ
トロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において巨核球造血系を刺激
する（Ｂｒｕｎｏ Ｅら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，
１９，３７８−３８１，１９９１；Ｙｏｎｅｍｕｒａ
Ｙら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０，１０１１−１
０１６，１９９２；Ｔｅｒａｍｕｒａ Ｍら，Ｂｌｏｏ
ｄ，７９，３２７−３３１，１９９２；及びＢｕｒｓｔ
ｅｉｎ ＳＡら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１
５３，３０５−３１２，１９９２）。
り、骨髄間質細胞株の培養上清から形質細胞増殖刺激因
子としてインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）がクロ
ーニングされた（Ｐａｕｌ ＳＲら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７５１２−７５
１６，１９９０）。組換えヒトＩＬ−１１は、イン・ビ
トロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において巨核球造血系を刺激
する（Ｂｒｕｎｏ Ｅら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，
１９，３７８−３８１，１９９１；Ｙｏｎｅｍｕｒａ
Ｙら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０，１０１１−１
０１６，１９９２；Ｔｅｒａｍｕｒａ Ｍら，Ｂｌｏｏ
ｄ，７９，３２７−３３１，１９９２；及びＢｕｒｓｔ
ｅｉｎ ＳＡら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１
５３，３０５−３１２，１９９２）。
【０００３】また、組換えヒトＩＬ−１１は、イン・ビ
ボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）では、各種哺乳動物の血小板数を
増加させる。具体的には、マウス（Ｎｅｂｅｎ ＴＹ
ら，Ｂｌｏｏｄ，８１，９０１−９０８，１９９３）、
ラット（Ｙｏｎｅｍｕｒａ Ｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ
ａｔｏｌ．，８４，１６−２３，１９９３）、イヌ（Ｎ
ａｓｈ ＲＡら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２３，３
８９−３９６，１９９５）、又はサル（Ｓｃｈｌｅｒｍ
ａｎ ＦＪら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１４，５１７−
５３２，１９９６）について報告がある。従って、組換
えヒトＩＬ−１１は、その血小板増加作用に基づき、癌
化学療法後の血小板減少症を適応症として開発されてい
る。
ボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）では、各種哺乳動物の血小板数を
増加させる。具体的には、マウス（Ｎｅｂｅｎ ＴＹ
ら，Ｂｌｏｏｄ，８１，９０１−９０８，１９９３）、
ラット（Ｙｏｎｅｍｕｒａ Ｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ
ａｔｏｌ．，８４，１６−２３，１９９３）、イヌ（Ｎ
ａｓｈ ＲＡら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２３，３
８９−３９６，１９９５）、又はサル（Ｓｃｈｌｅｒｍ
ａｎ ＦＪら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１４，５１７−
５３２，１９９６）について報告がある。従って、組換
えヒトＩＬ−１１は、その血小板増加作用に基づき、癌
化学療法後の血小板減少症を適応症として開発されてい
る。
【０００４】ＩＬ−１１は、これまでに造血系、免疫
系、及び神経系細胞の分化成熟促進作用などが報告され
ており、多彩な生物活性を有することが明らかになって
きている（Ｄｕ ＸＸら，Ｂｌｏｏｄ，８３，２０２３
−２０３０，１９９４；ＤｕＸＸら，Ｃｕｒｒ．ｏｐｉ
ｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２，１８２−１８８，１９９
５；Ｄｕ ＸＸら，Ｂｌｏｏｄ，８９，３８９７−３９
０８，１９９７；Ｍｕｓａｓｈｉ Ｍら，Ｂｌｏｏｄ，
７８，１４４８−１４５１，１９９１；Ｍｕｓａｓｈｉ
Ｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８８，７６５−７６９，１９９１；Ｙｉｎ ＴＧ
ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５，２１１−２１６，
１９９２；及びＭｅｈｌｅｒ ＭＦら，Ｎａｔｕｒｅ，
３６２，６２−６５，１９９３）。
系、及び神経系細胞の分化成熟促進作用などが報告され
ており、多彩な生物活性を有することが明らかになって
きている（Ｄｕ ＸＸら，Ｂｌｏｏｄ，８３，２０２３
−２０３０，１９９４；ＤｕＸＸら，Ｃｕｒｒ．ｏｐｉ
ｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２，１８２−１８８，１９９
５；Ｄｕ ＸＸら，Ｂｌｏｏｄ，８９，３８９７−３９
０８，１９９７；Ｍｕｓａｓｈｉ Ｍら，Ｂｌｏｏｄ，
７８，１４４８−１４５１，１９９１；Ｍｕｓａｓｈｉ
Ｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８８，７６５−７６９，１９９１；Ｙｉｎ ＴＧ
ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５，２１１−２１６，
１９９２；及びＭｅｈｌｅｒ ＭＦら，Ｎａｔｕｒｅ，
３６２，６２−６５，１９９３）。
【０００５】また、ＩＬ−１１は、骨代謝において重要
な役割を担っていることが示唆されている（Ｇｉｒａｓ
ｏｌｅ Ｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３，
１５１６−１５２４，１９９４；Ｈｉｌｌ ＰＡら，Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３９，１５６４−１５７２，１
９９８；Ｇｉｍｂｌｅ ＪＭら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，１２２−１３３，１９９
４；ＶｅｒｈａｅｇｈｅＪら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１８，４９
−５３，１９９８；及びＹａｍａｇｕｃｈｉ Ａら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，６８１−６８７，
１９９１）。
な役割を担っていることが示唆されている（Ｇｉｒａｓ
ｏｌｅ Ｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３，
１５１６−１５２４，１９９４；Ｈｉｌｌ ＰＡら，Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３９，１５６４−１５７２，１
９９８；Ｇｉｍｂｌｅ ＪＭら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，１２２−１３３，１９９
４；ＶｅｒｈａｅｇｈｅＪら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１８，４９
−５３，１９９８；及びＹａｍａｇｕｃｈｉ Ａら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，６８１−６８７，
１９９１）。
【０００６】すなわち、イン・ビトロでのマウス骨髄細
胞と頭蓋冠細胞との共培養系において破骨細胞の形成を
促進する（Ｇｉｒａｓｏｌｅ Ｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．，９３，１５１６−１５２４，１９９４）
と共に、新生マウス頭蓋冠からのＣａ遊離を促進するこ
と（Ｈｉｌｌ ＰＡら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３
９，１５６４−１５７２，１９９８）が報告されてい
る。一方、マウス間質細胞株ＢＭＳ２においてはアルカ
リフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を増加させること
（Ｇｉｍｂｌｅ ＪＭら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，５４，１２２−１３３，１９９４）が報
告されているが、ＩＬ−１１のイン・ビトロでの骨形成
に関する詳細な報告は少ない。卵巣摘出ラットにおいて
は、組換えヒトＩＬ−１１は骨のリモデリングに影響を
与えないことが報告されている（Ｖｅｒｈａｅｇｈｅ
Ｊら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅＲｅｓ．，１８，４９−５３，１９９８）。
胞と頭蓋冠細胞との共培養系において破骨細胞の形成を
促進する（Ｇｉｒａｓｏｌｅ Ｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．，９３，１５１６−１５２４，１９９４）
と共に、新生マウス頭蓋冠からのＣａ遊離を促進するこ
と（Ｈｉｌｌ ＰＡら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３
９，１５６４−１５７２，１９９８）が報告されてい
る。一方、マウス間質細胞株ＢＭＳ２においてはアルカ
リフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を増加させること
（Ｇｉｍｂｌｅ ＪＭら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，５４，１２２−１３３，１９９４）が報
告されているが、ＩＬ−１１のイン・ビトロでの骨形成
に関する詳細な報告は少ない。卵巣摘出ラットにおいて
は、組換えヒトＩＬ−１１は骨のリモデリングに影響を
与えないことが報告されている（Ｖｅｒｈａｅｇｈｅ
Ｊら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅＲｅｓ．，１８，４９−５３，１９９８）。
【０００７】一方、骨誘導因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈ
ｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）は、皮下
組織又は筋組織内の未分化間葉系細胞に作用して、これ
を軟骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させて、軟骨又は骨を
形成させる活性タンパク質である。ＢＭＰは、ウシ脱灰
骨基質中に存在する異所性骨誘導活性を示す物質として
発見されたが、純粋に単離されず、具体的な構造は未解
明のままであった。
ｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）は、皮下
組織又は筋組織内の未分化間葉系細胞に作用して、これ
を軟骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させて、軟骨又は骨を
形成させる活性タンパク質である。ＢＭＰは、ウシ脱灰
骨基質中に存在する異所性骨誘導活性を示す物質として
発見されたが、純粋に単離されず、具体的な構造は未解
明のままであった。
【０００８】しかし、遺伝子工学の技術により、ヒトＢ
ＭＰをコードする遺伝子がクローニングされ、アミノ酸
配列が明らかになった。また、ヒトＢＭＰは、アミノ酸
配列が相同性を有する複数の近縁タンパク質からなる一
群のファミリーを構成することも判明し、多数の種類の
組換えヒト骨誘導因子（ｒｈＢＭＰ）が創製されてきた
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１５２８−１５３４，１９
８８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２２２０−２２２４，１９９０；Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１，２６７−２８０，１９８９；並びに特表
平２−５００２４１号，特表平３−５０３６４９号，特
表平３−５０５０９８号，ＷＯ９１／１８０９８，ＷＯ
９２／０５１９９，及びＷＯ９３／０９２２９各公
報）。また、形質転換体による生産も行われている。
ＭＰをコードする遺伝子がクローニングされ、アミノ酸
配列が明らかになった。また、ヒトＢＭＰは、アミノ酸
配列が相同性を有する複数の近縁タンパク質からなる一
群のファミリーを構成することも判明し、多数の種類の
組換えヒト骨誘導因子（ｒｈＢＭＰ）が創製されてきた
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１５２８−１５３４，１９
８８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２２２０−２２２４，１９９０；Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１，２６７−２８０，１９８９；並びに特表
平２−５００２４１号，特表平３−５０３６４９号，特
表平３−５０５０９８号，ＷＯ９１／１８０９８，ＷＯ
９２／０５１９９，及びＷＯ９３／０９２２９各公
報）。また、形質転換体による生産も行われている。
【０００９】骨形成因子であるＢＭＰ−２（ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の
マウス未分化間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の分化誘
導作用が知られている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ａら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，６８１−６８７，
１９９１；及びＫａｔａｇｉｒｉ Ｔら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１７
２，２９５−２９９，１９９０）。
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の
マウス未分化間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の分化誘
導作用が知られている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ａら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，６８１−６８７，
１９９１；及びＫａｔａｇｉｒｉ Ｔら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１７
２，２９５−２９９，１９９０）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、より高い
骨形成活性を示す物質を鋭意探索したところ、ＩＬ−１
１と骨誘導因子とを併用すると、それぞれを単独で使用
した場合に比べて、飛躍的に骨形成能が向上することを
新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくもの
である。従って、本発明の課題は、より高い骨形成活性
を示す新規の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び
骨形成用組合せ医薬を提供することにある。
骨形成活性を示す物質を鋭意探索したところ、ＩＬ−１
１と骨誘導因子とを併用すると、それぞれを単独で使用
した場合に比べて、飛躍的に骨形成能が向上することを
新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくもの
である。従って、本発明の課題は、より高い骨形成活性
を示す新規の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び
骨形成用組合せ医薬を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、骨形成治療において、骨誘導因子との同時使用又は
連続使用のためのＩＬ−１１を有効成分として含むこと
を特徴とする、骨形成用医薬（以下、ＢＭＰ併用用ＩＬ
−１１医薬と称することがある）によって解決すること
ができる。また、本発明は、骨形成治療において、ＩＬ
−１１との同時使用又は連続使用のための骨誘導因子を
有効成分として含むことを特徴とする、骨形成用医薬
（以下、ＩＬ−１１併用用ＢＭＰ医薬と称することがあ
る）に関する。また、本発明は、骨誘導因子及びＩＬ−
１１を有効成分として含むことを特徴とする、骨形成用
医薬組成物にも関する。更に、本発明は、骨誘導因子を
有効成分として含む第１の医薬と、ＩＬ−１１を有効成
分として含む第２の医薬との組合せを含むことを特徴と
する、骨形成用組合せ医薬にも関する。
る、骨形成治療において、骨誘導因子との同時使用又は
連続使用のためのＩＬ−１１を有効成分として含むこと
を特徴とする、骨形成用医薬（以下、ＢＭＰ併用用ＩＬ
−１１医薬と称することがある）によって解決すること
ができる。また、本発明は、骨形成治療において、ＩＬ
−１１との同時使用又は連続使用のための骨誘導因子を
有効成分として含むことを特徴とする、骨形成用医薬
（以下、ＩＬ−１１併用用ＢＭＰ医薬と称することがあ
る）に関する。また、本発明は、骨誘導因子及びＩＬ−
１１を有効成分として含むことを特徴とする、骨形成用
医薬組成物にも関する。更に、本発明は、骨誘導因子を
有効成分として含む第１の医薬と、ＩＬ−１１を有効成
分として含む第２の医薬との組合せを含むことを特徴と
する、骨形成用組合せ医薬にも関する。
【００１２】本発明による前記の「骨形成用医薬」、
「骨形成用医薬組成物」、及び「骨形成用組合せ医薬」
の好ましい態様においては、骨誘導因子がそれぞれＢＭ
Ｐ−２である。
「骨形成用医薬組成物」、及び「骨形成用組合せ医薬」
の好ましい態様においては、骨誘導因子がそれぞれＢＭ
Ｐ−２である。
【００１３】本明細書における「骨形成」には、骨形成
及び軟骨形成の両方が含まれ、特には、未分化の間葉系
細胞に対して、骨芽細胞及び／又は軟骨細胞の分化を誘
導することによる骨形成及び／又は軟骨形成を意味す
る。
及び軟骨形成の両方が含まれ、特には、未分化の間葉系
細胞に対して、骨芽細胞及び／又は軟骨細胞の分化を誘
導することによる骨形成及び／又は軟骨形成を意味す
る。
【００１４】また、本明細書における「骨形成治療」と
は、骨組織や軟骨組織の形成が必要な疾患の予防又は治
療、あるいは、骨組織や軟骨組織の形成又は補填が必要
な症状の改善を意味する。具体的には、例えば、（１）
事故、疾患、先天性異常、又は各種手術に伴う骨又は軟
骨の欠損部位の修復、（２）各種骨折の治癒促進、
（３）人工関節、人工骨、若しくは人工歯根等の人工イ
ンプラント周囲での骨の形成、人工インプラント使用時
の固着促進、脊椎固定促進、又は脚延長等の整形外科分
野における骨若しくは軟骨の再生若しくは補填、又は関
節の再建、（４）形成外科分野での骨又は軟骨の補填、
あるいは、（５）歯科領域での顎骨の修復、歯槽骨の再
生、セメント質の修復、又はインプラント使用のための
骨の増大等が含まれる。また、骨組織での骨吸収と骨形
成とのバランスが破綻した場合に生じる骨粗鬆症、線維
性骨炎、骨軟化症、又はページェット病等を含む代謝性
骨疾患や変形性関節炎の予防又は治療も含まれる。
は、骨組織や軟骨組織の形成が必要な疾患の予防又は治
療、あるいは、骨組織や軟骨組織の形成又は補填が必要
な症状の改善を意味する。具体的には、例えば、（１）
事故、疾患、先天性異常、又は各種手術に伴う骨又は軟
骨の欠損部位の修復、（２）各種骨折の治癒促進、
（３）人工関節、人工骨、若しくは人工歯根等の人工イ
ンプラント周囲での骨の形成、人工インプラント使用時
の固着促進、脊椎固定促進、又は脚延長等の整形外科分
野における骨若しくは軟骨の再生若しくは補填、又は関
節の再建、（４）形成外科分野での骨又は軟骨の補填、
あるいは、（５）歯科領域での顎骨の修復、歯槽骨の再
生、セメント質の修復、又はインプラント使用のための
骨の増大等が含まれる。また、骨組織での骨吸収と骨形
成とのバランスが破綻した場合に生じる骨粗鬆症、線維
性骨炎、骨軟化症、又はページェット病等を含む代謝性
骨疾患や変形性関節炎の予防又は治療も含まれる。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用する骨誘導因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒ
ｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）は、未
分化の間葉系細胞に作用して、これを軟骨細胞や骨芽細
胞へ分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性を有するタ
ンパク質であれば、特に限定されるものではなく、例え
ば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２
Ｂともいう）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、
ＢＭＰ−８、若しくはＢＭＰ−９（以上、ホモダイマ
ー）、若しくはこれらのＢＭＰのヘテロダイマー、又は
これらの機能的等価改変体［すなわち、天然に存在する
ＢＭＰのアミノ酸配列において１又はそれ以上（好まし
くは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は
付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然に存在す
るＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質］挙げることが
できる。ＢＭＰ−２が好ましく、ヒトＢＭＰ−２がより
好ましい。これらのタンパク質を単独で又は２種以上の
混合物として用いることができる。
本発明において使用する骨誘導因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒ
ｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）は、未
分化の間葉系細胞に作用して、これを軟骨細胞や骨芽細
胞へ分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性を有するタ
ンパク質であれば、特に限定されるものではなく、例え
ば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２
Ｂともいう）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、
ＢＭＰ−８、若しくはＢＭＰ−９（以上、ホモダイマ
ー）、若しくはこれらのＢＭＰのヘテロダイマー、又は
これらの機能的等価改変体［すなわち、天然に存在する
ＢＭＰのアミノ酸配列において１又はそれ以上（好まし
くは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は
付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然に存在す
るＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質］挙げることが
できる。ＢＭＰ−２が好ましく、ヒトＢＭＰ−２がより
好ましい。これらのタンパク質を単独で又は２種以上の
混合物として用いることができる。
【００１６】前記骨誘導因子の調製方法も特に限定され
るものではないが、免疫性等の臨床上の安全性及び品質
の安定した材料を大量に入手することができる点で遺伝
子組換え技術により製造されたヒトＢＭＰが好ましい。
すなわち、ヒト骨誘導因子をコードする塩基配列を含む
組換えＤＮＡを含有する形質転換体（細胞又は微生物）
を培養し、それら形質転換体によって産生された組換え
ヒト骨誘導因子を単離、精製して調製した組換えヒト骨
誘導因子（ｒｈＢＭＰ）である。これらのヒト骨誘導因
子（ｒｈＢＭＰ）としては、例えば、ｒｈＢＭＰ−２、
ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ−４（ｒｈＢＭＰ−２Ｂと
もいう）、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈＢＭＰ−６、ｒｈＢＭ
Ｐ−７、ｒｈＢＭＰ−８、若しくはｒｈＢＭＰ−９、若
しくはこれらのｒｈＢＭＰのヘテロダイマー、又はこれ
らの機能的等価改変体を挙げることができ、ｒｈＢＭＰ
−２が好ましい。
るものではないが、免疫性等の臨床上の安全性及び品質
の安定した材料を大量に入手することができる点で遺伝
子組換え技術により製造されたヒトＢＭＰが好ましい。
すなわち、ヒト骨誘導因子をコードする塩基配列を含む
組換えＤＮＡを含有する形質転換体（細胞又は微生物）
を培養し、それら形質転換体によって産生された組換え
ヒト骨誘導因子を単離、精製して調製した組換えヒト骨
誘導因子（ｒｈＢＭＰ）である。これらのヒト骨誘導因
子（ｒｈＢＭＰ）としては、例えば、ｒｈＢＭＰ−２、
ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ−４（ｒｈＢＭＰ−２Ｂと
もいう）、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈＢＭＰ−６、ｒｈＢＭ
Ｐ−７、ｒｈＢＭＰ−８、若しくはｒｈＢＭＰ−９、若
しくはこれらのｒｈＢＭＰのヘテロダイマー、又はこれ
らの機能的等価改変体を挙げることができ、ｒｈＢＭＰ
−２が好ましい。
【００１７】前記の各種ｒｈＢＭＰは、前出の公知文献
（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１５２８−１５３
４，１９８８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，２２２０−２２２４，１９９０；Ｐ
ｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２６７−２８０，１９８９；並
びに特表平２−５００２４１号，特表平３−５０３６４
９号，特表平３−５０５０９８号，ＷＯ９１／１８０９
８，ＷＯ９２／０５１９９，及びＷＯ９３／０９２２９
各公報）に記載の方法に従って、入手することができ
る。
（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１５２８−１５３
４，１９８８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，２２２０−２２２４，１９９０；Ｐ
ｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２６７−２８０，１９８９；並
びに特表平２−５００２４１号，特表平３−５０３６４
９号，特表平３−５０５０９８号，ＷＯ９１／１８０９
８，ＷＯ９２／０５１９９，及びＷＯ９３／０９２２９
各公報）に記載の方法に従って、入手することができ
る。
【００１８】より具体的には、これらのｒｈＢＭＰは、
哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、微生物（例え
ば、大腸菌）、又は酵母細胞等で発現したものであるこ
とができる。既に大量生産法及び精製法が確立している
ｒｈＢＭＰとしてはｒｈＢＭＰ−２があるが、その他の
ｒｈＢＭＰを同様に製造し、精製して用いることができ
る（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２６７−２８０，１９８
９）。既に知られている精製ｒｈＢＭＰ−２は、分子量
約３０，０００の二量体タンパク質である。それぞれの
単量体は、Ａｓｎ５６残基にハイ・マンノース型の糖鎖
を有している［Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ
ｅｒｒａｃｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆ ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，
ＣＡ（１９９２）］。
哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、微生物（例え
ば、大腸菌）、又は酵母細胞等で発現したものであるこ
とができる。既に大量生産法及び精製法が確立している
ｒｈＢＭＰとしてはｒｈＢＭＰ−２があるが、その他の
ｒｈＢＭＰを同様に製造し、精製して用いることができ
る（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２６７−２８０，１９８
９）。既に知られている精製ｒｈＢＭＰ−２は、分子量
約３０，０００の二量体タンパク質である。それぞれの
単量体は、Ａｓｎ５６残基にハイ・マンノース型の糖鎖
を有している［Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ
ｅｒｒａｃｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆ ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，
ＣＡ（１９９２）］。
【００１９】本発明において使用するインターロイキン
１１（ＩＬ−１１）としては、例えば、天然体のＩＬ−
１１、あるいは、その機能的等価改変体を用いることが
でき、ヒトＩＬ−１１が好ましい。本明細書において
「ＩＬ−１１の機能的等価改変体」とは、天然に存在す
るＩＬ−１１のアミノ酸配列において１又はそれ以上
（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及
び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然
に存在するＩＬ−１１と同じ活性を有するタンパク質を
意味する。前記改変体としては、例えば、Ｎ末端のプロ
リンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有す
る組換えヒトＩＬ−１１を挙げることができる。
１１（ＩＬ−１１）としては、例えば、天然体のＩＬ−
１１、あるいは、その機能的等価改変体を用いることが
でき、ヒトＩＬ−１１が好ましい。本明細書において
「ＩＬ−１１の機能的等価改変体」とは、天然に存在す
るＩＬ−１１のアミノ酸配列において１又はそれ以上
（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及
び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然
に存在するＩＬ−１１と同じ活性を有するタンパク質を
意味する。前記改変体としては、例えば、Ｎ末端のプロ
リンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有す
る組換えヒトＩＬ−１１を挙げることができる。
【００２０】前記ＩＬ−１１の調製方法は特に限定され
るものではないが、免疫性等の臨床上の安全性及び品質
の安定した材料を大量に入手することができる点で遺伝
子組換え技術により製造することが好ましく、例えば、
ＷＯ９１／０７４９５又はＷＯ９２／１３９５５各公報
に記載の方法により製造することができる。
るものではないが、免疫性等の臨床上の安全性及び品質
の安定した材料を大量に入手することができる点で遺伝
子組換え技術により製造することが好ましく、例えば、
ＷＯ９１／０７４９５又はＷＯ９２／１３９５５各公報
に記載の方法により製造することができる。
【００２１】本発明は、骨誘導因子とＩＬ−１１とを併
用することにより、それぞれを単独で使用した場合に比
べて、飛躍的に骨形成能が向上するとの発見に基づくも
のである。本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬は、骨誘導因子及びＩＬ−
１１の組合せを、それ単独で、あるいは、所望により薬
剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体
と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投
与することができる限り、その形態は特に限定されるも
のではない。
用することにより、それぞれを単独で使用した場合に比
べて、飛躍的に骨形成能が向上するとの発見に基づくも
のである。本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬は、骨誘導因子及びＩＬ−
１１の組合せを、それ単独で、あるいは、所望により薬
剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体
と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投
与することができる限り、その形態は特に限定されるも
のではない。
【００２２】例えば、本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１
医薬（すなわち、骨誘導因子と併用して使用するための
ＩＬ−１１医薬）は、その有効成分としてＩＬ−１１を
含有し、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容するこ
とのできる通常の担体を更に含有することができる。本
発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬は、別途準備した骨
誘導因子（本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬とは別
に調製したＢＭＰ医薬）と同時に対象個体に投与する
か、あるいは、連続して対象個体に投与することができ
る。本明細書において、「連続して投与する」とは、一
方（本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬の場合には、
例えば、本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬、あるい
は、別に調製したＢＭＰ医薬）を対象個体に投与した後
で、残る一方を対象個体に連続して投与することを意味
する。
医薬（すなわち、骨誘導因子と併用して使用するための
ＩＬ−１１医薬）は、その有効成分としてＩＬ−１１を
含有し、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容するこ
とのできる通常の担体を更に含有することができる。本
発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬は、別途準備した骨
誘導因子（本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬とは別
に調製したＢＭＰ医薬）と同時に対象個体に投与する
か、あるいは、連続して対象個体に投与することができ
る。本明細書において、「連続して投与する」とは、一
方（本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬の場合には、
例えば、本発明のＢＭＰ併用用ＩＬ−１１医薬、あるい
は、別に調製したＢＭＰ医薬）を対象個体に投与した後
で、残る一方を対象個体に連続して投与することを意味
する。
【００２３】また、本発明のＩＬ−１１併用用ＢＭＰ医
薬（すなわち、ＩＬ−１１と併用して使用するためＢＭ
Ｐ医薬）は、その有効成分として骨誘導因子を含有し、
所望により薬剤学的又は獣医学的に許容することのでき
る通常の担体を更に含有することができる。本発明のＩ
Ｌ−１１併用用ＢＭＰ医薬は、別途準備したＩＬ−１１
（本発明のＩＬ−１１併用用ＢＭＰ医薬とは別に調製し
たＩＬ−１１医薬）と同時に対象個体に投与するか、あ
るいは、連続して対象個体に投与することができる。
薬（すなわち、ＩＬ−１１と併用して使用するためＢＭ
Ｐ医薬）は、その有効成分として骨誘導因子を含有し、
所望により薬剤学的又は獣医学的に許容することのでき
る通常の担体を更に含有することができる。本発明のＩ
Ｌ−１１併用用ＢＭＰ医薬は、別途準備したＩＬ−１１
（本発明のＩＬ−１１併用用ＢＭＰ医薬とは別に調製し
たＩＬ−１１医薬）と同時に対象個体に投与するか、あ
るいは、連続して対象個体に投与することができる。
【００２４】また、本発明の骨形成用医薬組成物は、そ
の有効成分として骨誘導因子及びＩＬ−１１の両者を含
有し、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容すること
のできる通常の担体を更に含有することができる。本発
明の骨形成用医薬組成物は、それ単独で対象個体に投与
することができる。
の有効成分として骨誘導因子及びＩＬ−１１の両者を含
有し、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容すること
のできる通常の担体を更に含有することができる。本発
明の骨形成用医薬組成物は、それ単独で対象個体に投与
することができる。
【００２５】更に、本発明の骨形成用組合せ医薬は、キ
ット形態の組合せであり、骨誘導因子を有効成分として
含有する第１の医薬と、ＩＬ−１１を有効成分として含
有する第２の医薬とを含む。前記の第１医薬及び／又は
第２医薬は、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容す
ることのできる通常の担体を更に含有することができ
る。本発明の骨形成用組合せ医薬においては、前記第１
医薬及び第２医薬を同時に対象個体に投与するか、ある
いは、連続して対象個体に投与することができる。
ット形態の組合せであり、骨誘導因子を有効成分として
含有する第１の医薬と、ＩＬ−１１を有効成分として含
有する第２の医薬とを含む。前記の第１医薬及び／又は
第２医薬は、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容す
ることのできる通常の担体を更に含有することができ
る。本発明の骨形成用組合せ医薬においては、前記第１
医薬及び第２医薬を同時に対象個体に投与するか、ある
いは、連続して対象個体に投与することができる。
【００２６】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬を用いる場合の骨誘導因子
の添加量は、骨誘導作用を相乗的に発現する濃度であれ
ば特に限定されるものではない。例えば、ｒｈＢＭＰ−
２を用いる場合には、骨誘導作用を必要とする部位にお
けるｒｈＢＭＰ−２の含有量として、骨誘導部位容積当
たりの濃度として表わすと、通常、０．００１μｇ／ｍ
Ｌ以上、好ましくは０．０１〜１，０００μｇ／ｍＬ、
より好ましくは０．１〜５００μｇ／ｍＬである。
物、及び骨形成用組合せ医薬を用いる場合の骨誘導因子
の添加量は、骨誘導作用を相乗的に発現する濃度であれ
ば特に限定されるものではない。例えば、ｒｈＢＭＰ−
２を用いる場合には、骨誘導作用を必要とする部位にお
けるｒｈＢＭＰ−２の含有量として、骨誘導部位容積当
たりの濃度として表わすと、通常、０．００１μｇ／ｍ
Ｌ以上、好ましくは０．０１〜１，０００μｇ／ｍＬ、
より好ましくは０．１〜５００μｇ／ｍＬである。
【００２７】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬を用いる場合のＩＬ−１１
添加量は、骨誘導作用を相乗的に発現する濃度であれば
特に限定されるものではない。例えば、Ｎ末端のプロリ
ンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有する
組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）を用いる場合
には、骨誘導作用を必要とする部位におけるｒｈＩＬ−
１１の含有量として、骨誘導部位容積当たりの濃度とし
て表わすと、通常、１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは３０
〜１，０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１，０
００μｇ／ｍＬ、更に好ましくは１００〜３００μｇ／
ｍＬである。
物、及び骨形成用組合せ医薬を用いる場合のＩＬ−１１
添加量は、骨誘導作用を相乗的に発現する濃度であれば
特に限定されるものではない。例えば、Ｎ末端のプロリ
ンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有する
組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）を用いる場合
には、骨誘導作用を必要とする部位におけるｒｈＩＬ−
１１の含有量として、骨誘導部位容積当たりの濃度とし
て表わすと、通常、１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは３０
〜１，０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１，０
００μｇ／ｍＬ、更に好ましくは１００〜３００μｇ／
ｍＬである。
【００２８】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬を用いる場合の骨誘導因子
の添加量とＩＬ−１１添加量との比は、骨誘導作用を相
乗的に発現することができる限り、特に限定されるもの
ではないが、例えば、ｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＩＬ−１
１を用いる場合には、重量比として、通常、１，００
０：１〜１：１，０００，０００、好ましくは３０：１
〜１：１００，０００、より好ましくは１０：１〜１：
１０，０００、更に好ましくは５：１〜１：３０００で
ある。
物、及び骨形成用組合せ医薬を用いる場合の骨誘導因子
の添加量とＩＬ−１１添加量との比は、骨誘導作用を相
乗的に発現することができる限り、特に限定されるもの
ではないが、例えば、ｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＩＬ−１
１を用いる場合には、重量比として、通常、１，００
０：１〜１：１，０００，０００、好ましくは３０：１
〜１：１００，０００、より好ましくは１０：１〜１：
１０，０００、更に好ましくは５：１〜１：３０００で
ある。
【００２９】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬は、例えば、骨誘導因子及
びＩＬ−１１を含有する液剤やペースト剤等として、あ
るいは、適当な担体にこれらを担持させて、骨形成（骨
形成及び軟骨形成の両方を含む）を必要とする部位に投
与することができる。
物、及び骨形成用組合せ医薬は、例えば、骨誘導因子及
びＩＬ−１１を含有する液剤やペースト剤等として、あ
るいは、適当な担体にこれらを担持させて、骨形成（骨
形成及び軟骨形成の両方を含む）を必要とする部位に投
与することができる。
【００３０】前記担体としては、例えば、天然高分子材
料（例えば、コラーゲン、ゼラチン、若しくはヒアルロ
ン酸等）、人工高分子材料［例えば、ポリ乳酸（ＰＬ
Ａ）、ポリグリコール酸（ＰＬＧ）、又はこれらの共重
合体（ＰＬＧＡ）等］、又は天然若しくは人工の無機材
料（例えば、ヒドロキシアパタイト又はリン酸カルシウ
ムセメント等）等の生体適合性材料の１種又は２種以上
を組み合わせた、固体状、ペースト状、粘土状、又は液
状の担体を挙げることができ、コラーゲンスポンジ、あ
るいは、ＰＬＧＡでコーティングされたゼラチンスポン
ジ（ＷＯ９６／１０４２６号公報）が特に好ましい。こ
れらの担体は、既に骨誘導因子の担体として公知であ
り、本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び
骨形成用組合せ医薬においても、これらの担体に担持さ
せて、対象個体に投与することができる。
料（例えば、コラーゲン、ゼラチン、若しくはヒアルロ
ン酸等）、人工高分子材料［例えば、ポリ乳酸（ＰＬ
Ａ）、ポリグリコール酸（ＰＬＧ）、又はこれらの共重
合体（ＰＬＧＡ）等］、又は天然若しくは人工の無機材
料（例えば、ヒドロキシアパタイト又はリン酸カルシウ
ムセメント等）等の生体適合性材料の１種又は２種以上
を組み合わせた、固体状、ペースト状、粘土状、又は液
状の担体を挙げることができ、コラーゲンスポンジ、あ
るいは、ＰＬＧＡでコーティングされたゼラチンスポン
ジ（ＷＯ９６／１０４２６号公報）が特に好ましい。こ
れらの担体は、既に骨誘導因子の担体として公知であ
り、本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び
骨形成用組合せ医薬においても、これらの担体に担持さ
せて、対象個体に投与することができる。
【００３１】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬は、骨誘導因子及びＩＬ−
１１以外の成分を含有することができる。これらの所望
成分としては、具体的には、生体吸収性担体、安定化
剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、又は増粘剤等を挙
げることができる。また、骨形成に有用な追加成分、例
えば、フィブロネクチン及び／又はオステオネクチン等
を含むこともできる。これらの所望成分は、本発明の骨
形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ
医薬の製剤化の好適な段階で適宜好適な方法により添加
することができる。
物、及び骨形成用組合せ医薬は、骨誘導因子及びＩＬ−
１１以外の成分を含有することができる。これらの所望
成分としては、具体的には、生体吸収性担体、安定化
剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、又は増粘剤等を挙
げることができる。また、骨形成に有用な追加成分、例
えば、フィブロネクチン及び／又はオステオネクチン等
を含むこともできる。これらの所望成分は、本発明の骨
形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ
医薬の製剤化の好適な段階で適宜好適な方法により添加
することができる。
【００３２】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬は、各種の骨（骨及び軟骨
の両方を含む）の欠損を修復するために、あるいは、骨
の付加をするために、骨形成の期待される部位に任意の
方法で投与することができる。液剤の場合は注入によっ
て、ペースト剤又は粘土状剤の場合は埋め込みによっ
て、更には適当な担体に担持させて、所望の形状に固化
成形し固体として埋め込むこともできる。
物、及び骨形成用組合せ医薬は、各種の骨（骨及び軟骨
の両方を含む）の欠損を修復するために、あるいは、骨
の付加をするために、骨形成の期待される部位に任意の
方法で投与することができる。液剤の場合は注入によっ
て、ペースト剤又は粘土状剤の場合は埋め込みによっ
て、更には適当な担体に担持させて、所望の形状に固化
成形し固体として埋め込むこともできる。
【００３３】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬は、当該分野に知られた方
法で生体に適用することができ、その目的、用途、適応
部位、及び／又は患者の状態等に応じて、適宜適用する
ことができる。本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組
成物、及び骨形成用組合せ医薬は、それを単独で用いる
だけでなく、公知の他のインプラントと組み合わせて用
いることもできる。例えば、人工骨や人工歯根を移植す
る際に、その表面に、本発明の骨形成用医薬、骨形成用
医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬を、接着性物質
（例えば、コラーゲン又はフィブリン糊等）で被覆して
用いることができる。あるいは、これらの人工骨や人工
歯根の表面を多孔性に成形し、その部分に、本発明の骨
形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ
医薬を含浸させて用いることもできる。本発明の骨形成
用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬
を局所に固定するために、例えば、生体適合性の膜（例
えば、コラーゲン膜）、あるいは、ＧＴＲ法に用いるゴ
アテックス膜又はポリ乳酸膜等を組み合わせて用いるこ
とができる。
物、及び骨形成用組合せ医薬は、当該分野に知られた方
法で生体に適用することができ、その目的、用途、適応
部位、及び／又は患者の状態等に応じて、適宜適用する
ことができる。本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組
成物、及び骨形成用組合せ医薬は、それを単独で用いる
だけでなく、公知の他のインプラントと組み合わせて用
いることもできる。例えば、人工骨や人工歯根を移植す
る際に、その表面に、本発明の骨形成用医薬、骨形成用
医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬を、接着性物質
（例えば、コラーゲン又はフィブリン糊等）で被覆して
用いることができる。あるいは、これらの人工骨や人工
歯根の表面を多孔性に成形し、その部分に、本発明の骨
形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ
医薬を含浸させて用いることもできる。本発明の骨形成
用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬
を局所に固定するために、例えば、生体適合性の膜（例
えば、コラーゲン膜）、あるいは、ＧＴＲ法に用いるゴ
アテックス膜又はポリ乳酸膜等を組み合わせて用いるこ
とができる。
【００３４】また、本発明の骨形成用医薬、骨形成用医
薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬は、注射により投与
することができ、持続的に投与可能な点滴静注等の持続
的投与用製剤が好ましい。本発明の骨形成用医薬、骨形
成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬を注射剤とし
て用いる場合には、その添加剤として、例えば、無菌の
水溶液（例えば、生理食塩水）、等張液、又は油性液
（例えば、ゴマ油又は大豆油）を用いることができる。
また、必要により、適当な懸濁化剤（例えば、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム）、非イオン性界面活性
剤、又は溶解補助剤（例えば、安息香酸ベンジル又はベ
ンジルアルコール等）を併用することができる。
薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬は、注射により投与
することができ、持続的に投与可能な点滴静注等の持続
的投与用製剤が好ましい。本発明の骨形成用医薬、骨形
成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬を注射剤とし
て用いる場合には、その添加剤として、例えば、無菌の
水溶液（例えば、生理食塩水）、等張液、又は油性液
（例えば、ゴマ油又は大豆油）を用いることができる。
また、必要により、適当な懸濁化剤（例えば、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム）、非イオン性界面活性
剤、又は溶解補助剤（例えば、安息香酸ベンジル又はベ
ンジルアルコール等）を併用することができる。
【００３５】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成
物、及び骨形成用組合せ医薬を注射剤として使用する場
合の投与量は、骨誘導作用を相乗的に発現する濃度であ
れば特に限定されるものではない。例えば、ｒｈＢＭＰ
−２を用いる場合には、通常、０．０１μｇ／ｋｇ以
上、好ましくは０．１〜３００μｇ／ｋｇ、より好まし
くは０．１〜１００μｇ／ｋｇであり、ｒｈＩＬ−１１
を用いる場合には、通常、０．０１μｇ／ｋｇ以上、好
ましくは０．１〜１，０００μｇ／ｋｇ、より好ましく
は１〜１，０００μｇ／ｋｇである。
物、及び骨形成用組合せ医薬を注射剤として使用する場
合の投与量は、骨誘導作用を相乗的に発現する濃度であ
れば特に限定されるものではない。例えば、ｒｈＢＭＰ
−２を用いる場合には、通常、０．０１μｇ／ｋｇ以
上、好ましくは０．１〜３００μｇ／ｋｇ、より好まし
くは０．１〜１００μｇ／ｋｇであり、ｒｈＩＬ−１１
を用いる場合には、通常、０．０１μｇ／ｋｇ以上、好
ましくは０．１〜１，０００μｇ／ｋｇ、より好ましく
は１〜１，０００μｇ／ｋｇである。
【００３６】これまで述べてきたように、本発明の骨形
成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医
薬は、有効成分として骨誘導因子及び／又はＩＬ−１１
を使用すること以外は、従来公知の方法により製造する
ことができる。例えば、担体としてゼラチンスポンジを
用いる本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及
び骨形成用組合せ医薬は、例えば、ＷＯ９６／１０４２
６号公報に記載の方法により製造することができる。
成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医
薬は、有効成分として骨誘導因子及び／又はＩＬ−１１
を使用すること以外は、従来公知の方法により製造する
ことができる。例えば、担体としてゼラチンスポンジを
用いる本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及
び骨形成用組合せ医薬は、例えば、ＷＯ９６／１０４２
６号公報に記載の方法により製造することができる。
【００３７】
【作用】以下、後述の実施例及び比較例の結果から推測
される本発明の作用機序について説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。骨の形成において、培
養細胞上清中のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性
は、骨形成の程度を検討するのに有用なマーカーの１つ
である（Ｏｗｅｎ ＴＡら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，１４３，４２０−４３０，１９９０）。後述す
る比較例１に示すように、ｒｈＩＬ−１１（Ｎ末端のプ
ロリンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有
する組換えヒトＩＬ−１１）（濃度＝１ｎｇ／ｍＬ，１
０ｎｇ／ｍＬ，及び１００ｎｇ／ｍＬ）は、単独投与に
おいて、マウス胎児由来未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ
１／２において濃度依存的にＡＬＰ活性を上昇させた。
また、ｒｈＩＬ−１１は、骨芽細胞に特異的に発現して
いるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ；Ｏ
Ｃ）のｍＲＮＡ発現を増加させた。更に、ｒｈＩＬ−１
１は、骨芽細胞及び軟骨細胞に発現している骨シアロ酸
含有タンパク質（ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ；ＢＳＰ）及び副甲状腺ホルモンレセプター（ｐａｒ
ａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ；ＰＴＨＲ）の発現を著しく上昇させたが、軟骨細胞
分化マーカーであるコラーゲンIIの発現には影響を与え
なかった。これらのことから、ｒｈＩＬ−１１によるＢ
ＳＰ及びＰＴＨＲ遺伝子の発現上昇は骨芽細胞分化に由
来するものと推察された。以上の結果から、ｒｈＩＬ−
１１は単独で骨芽細胞の分化を誘導することが示され
た。
される本発明の作用機序について説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。骨の形成において、培
養細胞上清中のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性
は、骨形成の程度を検討するのに有用なマーカーの１つ
である（Ｏｗｅｎ ＴＡら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，１４３，４２０−４３０，１９９０）。後述す
る比較例１に示すように、ｒｈＩＬ−１１（Ｎ末端のプ
ロリンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有
する組換えヒトＩＬ−１１）（濃度＝１ｎｇ／ｍＬ，１
０ｎｇ／ｍＬ，及び１００ｎｇ／ｍＬ）は、単独投与に
おいて、マウス胎児由来未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ
１／２において濃度依存的にＡＬＰ活性を上昇させた。
また、ｒｈＩＬ−１１は、骨芽細胞に特異的に発現して
いるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ；Ｏ
Ｃ）のｍＲＮＡ発現を増加させた。更に、ｒｈＩＬ−１
１は、骨芽細胞及び軟骨細胞に発現している骨シアロ酸
含有タンパク質（ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ；ＢＳＰ）及び副甲状腺ホルモンレセプター（ｐａｒ
ａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ；ＰＴＨＲ）の発現を著しく上昇させたが、軟骨細胞
分化マーカーであるコラーゲンIIの発現には影響を与え
なかった。これらのことから、ｒｈＩＬ−１１によるＢ
ＳＰ及びＰＴＨＲ遺伝子の発現上昇は骨芽細胞分化に由
来するものと推察された。以上の結果から、ｒｈＩＬ−
１１は単独で骨芽細胞の分化を誘導することが示され
た。
【００３８】ｒｈＢＭＰ−２は、骨芽細胞及び軟骨細胞
の分化を誘導すること（ＷａｎｇＥＡら，Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ，９，５７−７１，１９９３；Ｋａｔ
ａｇｉｒｉ Ｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１７２，２９５−２９９，１
９９０；及びＣｈｅｎ Ｐら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅ
ｓ．，１９５，５０９−５１５，１９９１）、そして、
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を脂肪細胞へも分化させること
（Ｗａｎｇ ＥＡら，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，
９，５７−７１，１９９３）が報告されている。
の分化を誘導すること（ＷａｎｇＥＡら，Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ，９，５７−７１，１９９３；Ｋａｔ
ａｇｉｒｉ Ｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１７２，２９５−２９９，１
９９０；及びＣｈｅｎ Ｐら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅ
ｓ．，１９５，５０９−５１５，１９９１）、そして、
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を脂肪細胞へも分化させること
（Ｗａｎｇ ＥＡら，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，
９，５７−７１，１９９３）が報告されている。
【００３９】比較例１に示すように、ｒｈＢＭＰ−２は
ＡＬＰ活性を上昇させ、７日目における作用よりも１０
日目における作用の方が顕著であった。また、ｒｈＢＭ
Ｐ−２は、ＯＣ、ＢＳＰ、ＰＴＨＲ、及びコラーゲンII
の発現を上昇させると共に、脂肪細胞分化マーカーであ
るペルオキシソーム増殖薬活性化レセプターγ２（ｐｅ
ｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ２；Ｐ
ＰＡＲγ２）及び脂肪酸結合タンパク質Ｐ２（ａｄｉｐ
ｏｃｙｔｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎＰ２；ａＰ２）の発現を誘導した。これ
らの結果は、ｒｈＢＭＰ−２が骨芽細胞及び軟骨細胞並
びに脂肪細胞への分化を誘導するというこれまでの報告
を支持するものである。
ＡＬＰ活性を上昇させ、７日目における作用よりも１０
日目における作用の方が顕著であった。また、ｒｈＢＭ
Ｐ−２は、ＯＣ、ＢＳＰ、ＰＴＨＲ、及びコラーゲンII
の発現を上昇させると共に、脂肪細胞分化マーカーであ
るペルオキシソーム増殖薬活性化レセプターγ２（ｐｅ
ｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ２；Ｐ
ＰＡＲγ２）及び脂肪酸結合タンパク質Ｐ２（ａｄｉｐ
ｏｃｙｔｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎＰ２；ａＰ２）の発現を誘導した。これ
らの結果は、ｒｈＢＭＰ−２が骨芽細胞及び軟骨細胞並
びに脂肪細胞への分化を誘導するというこれまでの報告
を支持するものである。
【００４０】脂肪細胞分化マーカー遺伝子において、ｒ
ｈＢＭＰ−２によるａＰ２の発現は、ＰＰＡＲγ２より
顕著であった。ＰＰＡＲγ２は、レチノイドＸレセプタ
ーと安定なヘテロ二量体を形成してＰＰＲＥ（ｐｅｒｏ
ｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＤＮＡ塩基配列と
結合する（Ｋｌｉｅｗｅｒ ＳＡら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，７３５５−７３
５９，１９９４）。更に、脂肪分化に伴って誘導されて
くるａＰ２などの遺伝子のプロモーターにも、ＰＰＲＥ
の存在が確認されている（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ Ｐら，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，３５１−３５７，
１９９５）。これらのことから、ｒｈＢＭＰ−２は、ま
ず脂肪細胞分化誘導作用によりＰＰＡＲγ２及びａＰ２
の発現を上昇させ、続いて、上昇したＰＰＡＲγ２がａ
Ｐ２の転写を促進したために、ａＰ２の著しい発現上昇
が認められたものと推察された。
ｈＢＭＰ−２によるａＰ２の発現は、ＰＰＡＲγ２より
顕著であった。ＰＰＡＲγ２は、レチノイドＸレセプタ
ーと安定なヘテロ二量体を形成してＰＰＲＥ（ｐｅｒｏ
ｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＤＮＡ塩基配列と
結合する（Ｋｌｉｅｗｅｒ ＳＡら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，７３５５−７３
５９，１９９４）。更に、脂肪分化に伴って誘導されて
くるａＰ２などの遺伝子のプロモーターにも、ＰＰＲＥ
の存在が確認されている（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ Ｐら，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，３５１−３５７，
１９９５）。これらのことから、ｒｈＢＭＰ−２は、ま
ず脂肪細胞分化誘導作用によりＰＰＡＲγ２及びａＰ２
の発現を上昇させ、続いて、上昇したＰＰＡＲγ２がａ
Ｐ２の転写を促進したために、ａＰ２の著しい発現上昇
が認められたものと推察された。
【００４１】比較例１に示すように、ｒｈＩＬ−１１及
びｒｈＢＭＰ−２は、いずれも骨芽細胞分化刺激活性を
示したが、両者の作用には違いが認められた。ｒｈＩＬ
−１１及びｒｈＢＭＰ−２は、７日目においてＡＬＰ活
性をほぼ同程度まで上昇させたが、１０日目のＡＬＰ活
性上昇作用は、ｒｈＢＭＰ−２の方が強かった。また、
骨芽細胞の分化過程において、ｒｈＩＬ−１１は、ＢＳ
Ｐ及びＰＴＨＲの発現をｒｈＢＭＰ−２と同等以上に上
昇させたが、分化過程後期の骨細胞に発現するＯＣに対
しては著しい上昇を認めなかった。一方で、ｒｈＢＭＰ
−２は、ＢＳＰ及びＰＴＨＲの発現を上昇させると共
に、ｒｈＩＬ−１１と比較してＯＣの発現を著しく上昇
させた。これらの結果から、ｒｈＩＬ−１１は、ｒｈＢ
ＭＰ−２と比べ、比較的早期の骨芽細胞分化に関与して
いる可能性が示唆された。
びｒｈＢＭＰ−２は、いずれも骨芽細胞分化刺激活性を
示したが、両者の作用には違いが認められた。ｒｈＩＬ
−１１及びｒｈＢＭＰ−２は、７日目においてＡＬＰ活
性をほぼ同程度まで上昇させたが、１０日目のＡＬＰ活
性上昇作用は、ｒｈＢＭＰ−２の方が強かった。また、
骨芽細胞の分化過程において、ｒｈＩＬ−１１は、ＢＳ
Ｐ及びＰＴＨＲの発現をｒｈＢＭＰ−２と同等以上に上
昇させたが、分化過程後期の骨細胞に発現するＯＣに対
しては著しい上昇を認めなかった。一方で、ｒｈＢＭＰ
−２は、ＢＳＰ及びＰＴＨＲの発現を上昇させると共
に、ｒｈＩＬ−１１と比較してＯＣの発現を著しく上昇
させた。これらの結果から、ｒｈＩＬ−１１は、ｒｈＢ
ＭＰ−２と比べ、比較的早期の骨芽細胞分化に関与して
いる可能性が示唆された。
【００４２】更に、後述する実施例１に示すように、ｒ
ｈＩＬ−１１は、ｒｈＢＭＰ−２と相乗的に作用し、Ａ
ＬＰ活性を顕著に上昇させ、ＯＣの遺伝子発現も著しく
増加させた。ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の相乗
効果は、軟骨細胞の分化マーカーであるコラーゲンIIに
おいても認められた。これらの結果は、ｒｈＩＬ−１１
とｒｈＢＭＰ−２との相乗作用により、骨形成が亢進し
た結果であると考えられる。ｒｈＩＬ−１１は、実施例
及び比較例の結果から明らかなように、単独でも、ｒｈ
ＢＭＰ−２との併用においても骨芽細胞の分化誘導作用
を示した。脂肪細胞への分化に関しては、ｒｈＩＬ−１
１はｒｈＢＭＰ−２によるＰＰＡＲγ２及びａＰ２の発
現上昇を抑制した。
ｈＩＬ−１１は、ｒｈＢＭＰ−２と相乗的に作用し、Ａ
ＬＰ活性を顕著に上昇させ、ＯＣの遺伝子発現も著しく
増加させた。ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の相乗
効果は、軟骨細胞の分化マーカーであるコラーゲンIIに
おいても認められた。これらの結果は、ｒｈＩＬ−１１
とｒｈＢＭＰ−２との相乗作用により、骨形成が亢進し
た結果であると考えられる。ｒｈＩＬ−１１は、実施例
及び比較例の結果から明らかなように、単独でも、ｒｈ
ＢＭＰ−２との併用においても骨芽細胞の分化誘導作用
を示した。脂肪細胞への分化に関しては、ｒｈＩＬ−１
１はｒｈＢＭＰ−２によるＰＰＡＲγ２及びａＰ２の発
現上昇を抑制した。
【００４３】以上、述べたように、ｒｈＢＭＰ−２が骨
芽細胞及び脂肪細胞の分化を促進する一方、ｒｈＩＬ−
１１が脂肪細胞の分化を抑制するため、ｒｈＢＭＰ−２
及びｒｈＩＬ−１１を併用すると、特異的に骨芽細胞の
分化誘導が生じると考えられる。これに関連した公知事
実として、骨粗鬆症の特徴的な病態の一つとして、骨芽
細胞の減少及び脂肪細胞の増加が挙げられる。脂肪細胞
は、骨芽細胞と同様に未分化間葉系細胞がその前駆細胞
であるので、この脂肪細胞への分化が亢進されたため
に、骨芽細胞への分化が抑制されたことによると推測さ
れている。従って、後述の実施例で認められた骨芽細胞
への分化促進には、脂肪細胞への分化の抑制により、脂
肪細胞へ分化する予定の細胞が骨芽細胞の方へ分化する
という作用と共に、ｒｈＩＬ−１１とｒｈＢＭＰ−２と
の相乗作用による骨芽細胞への分化促進が大きく影響し
ているものと考えられる。
芽細胞及び脂肪細胞の分化を促進する一方、ｒｈＩＬ−
１１が脂肪細胞の分化を抑制するため、ｒｈＢＭＰ−２
及びｒｈＩＬ−１１を併用すると、特異的に骨芽細胞の
分化誘導が生じると考えられる。これに関連した公知事
実として、骨粗鬆症の特徴的な病態の一つとして、骨芽
細胞の減少及び脂肪細胞の増加が挙げられる。脂肪細胞
は、骨芽細胞と同様に未分化間葉系細胞がその前駆細胞
であるので、この脂肪細胞への分化が亢進されたため
に、骨芽細胞への分化が抑制されたことによると推測さ
れている。従って、後述の実施例で認められた骨芽細胞
への分化促進には、脂肪細胞への分化の抑制により、脂
肪細胞へ分化する予定の細胞が骨芽細胞の方へ分化する
という作用と共に、ｒｈＩＬ−１１とｒｈＢＭＰ−２と
の相乗作用による骨芽細胞への分化促進が大きく影響し
ているものと考えられる。
【００４４】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】《ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の同
時添加による骨形成作用の評価》 （１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に基づく
評価 本実施例では、ヒトＩＬ−１１として、Ｎ末端のプロリ
ンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有する
組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）を使用し、骨
誘導因子として、天然型と同じアミノ酸配列を有する組
換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）を使用し、前記
ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を、マウス胎児由来
未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−２２６）に同時に添加した場合の骨形成作用を、ア
ルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を指標として評価
した。
時添加による骨形成作用の評価》 （１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に基づく
評価 本実施例では、ヒトＩＬ−１１として、Ｎ末端のプロリ
ンを欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有する
組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）を使用し、骨
誘導因子として、天然型と同じアミノ酸配列を有する組
換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）を使用し、前記
ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を、マウス胎児由来
未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−２２６）に同時に添加した場合の骨形成作用を、ア
ルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を指標として評価
した。
【００４５】具体的には、ｒｈＩＬ−１１として、大腸
菌で製造したｒｈＩＬ−１１凍結乾燥品（５ｍｇ）を蒸
留水１ｍＬで溶解した後、０．１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）添加ダルベッコ改変リン酸緩衝溶液（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（４ｍＬ）で希
釈し、１０００μｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液を
−８０℃以下で凍結保存し、使用の際に、解凍した後、
使用培地で希釈した。また、ｒｈＢＭＰ−２として、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で製造したｒ
ｈＢＭＰ−２を希釈用緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミ
ン酸、２．５％グリシン、０．５％スクロース、０．０
１％トゥイーン８０、ｐＨ４．５）に溶解した１０００
μｇ／ｍＬ溶液を使用した。前記希釈用緩衝液で希釈
し、４０μｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液を−８０
℃以下で凍結保存し、使用の際に、解凍した後、使用培
地で希釈した。
菌で製造したｒｈＩＬ−１１凍結乾燥品（５ｍｇ）を蒸
留水１ｍＬで溶解した後、０．１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）添加ダルベッコ改変リン酸緩衝溶液（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（４ｍＬ）で希
釈し、１０００μｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液を
−８０℃以下で凍結保存し、使用の際に、解凍した後、
使用培地で希釈した。また、ｒｈＢＭＰ−２として、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で製造したｒ
ｈＢＭＰ−２を希釈用緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミ
ン酸、２．５％グリシン、０．５％スクロース、０．０
１％トゥイーン８０、ｐＨ４．５）に溶解した１０００
μｇ／ｍＬ溶液を使用した。前記希釈用緩衝液で希釈
し、４０μｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液を−８０
℃以下で凍結保存し、使用の際に、解凍した後、使用培
地で希釈した。
【００４６】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞［Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（米国）より購入］は、抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；大日本製
薬）を添加したＢＭＥアール培地（大日本製薬）を用い
て、３７℃及びＣＯ2／空気（１：１９）の条件下で継
代培養した。なお、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２
添加時には、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸（ナ
カライ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸ナト
リウム（和光純薬工業）、及び０．５％ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＢＭＥアー
ル培地を用いた。
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（米国）より購入］は、抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；大日本製
薬）を添加したＢＭＥアール培地（大日本製薬）を用い
て、３７℃及びＣＯ2／空気（１：１９）の条件下で継
代培養した。なお、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２
添加時には、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸（ナ
カライ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸ナト
リウム（和光純薬工業）、及び０．５％ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＢＭＥアー
ル培地を用いた。
【００４７】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（１．５×１０3
細胞／ｗｅｌｌ）を９６穴プレートに播種した後、種々
濃度（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ
／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１、４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭ
Ｐ−２、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコル
ビン酸、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸ナトリ
ウム、及び０．５％ＤＭＳＯを含むＢＭＥアール培地で
培養した。前記播種の翌日を０日目とし、７日目及び１
０日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；日水製薬）で
洗浄した後、ホスファターゼ基質［ＳＩＧＭＡ １０４
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ｐ−ｎ
ｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｄｉｓ
ｏｄｉｕｍ、ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）；Ｓｉｇｍａ］
とアルカリ緩衝溶液［２２１ ａｌｋａｌｉｎｅ ｂｕ
ｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．５ｍｏｌ／Ｌ ２−
ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ
ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ１０．３）；Ｓｉｇｍａ］との混
合液１００μＬを添加し、３７℃でインキュベートし
た。０．５Ｎ水酸化ナトリウム１００μＬを添加して反
応を停止し、４０５／４９２ｎｍの吸光度を測定した。
ＡＬＰ活性（ＩＵ／ｗｅｌｌ）はｐ−ニトロフェノール
（Ｓｉｇｍａ）を標準として算出した。
細胞／ｗｅｌｌ）を９６穴プレートに播種した後、種々
濃度（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ
／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１、４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭ
Ｐ−２、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコル
ビン酸、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸ナトリ
ウム、及び０．５％ＤＭＳＯを含むＢＭＥアール培地で
培養した。前記播種の翌日を０日目とし、７日目及び１
０日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；日水製薬）で
洗浄した後、ホスファターゼ基質［ＳＩＧＭＡ １０４
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ｐ−ｎ
ｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｄｉｓ
ｏｄｉｕｍ、ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）；Ｓｉｇｍａ］
とアルカリ緩衝溶液［２２１ ａｌｋａｌｉｎｅ ｂｕ
ｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．５ｍｏｌ／Ｌ ２−
ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ
ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ１０．３）；Ｓｉｇｍａ］との混
合液１００μＬを添加し、３７℃でインキュベートし
た。０．５Ｎ水酸化ナトリウム１００μＬを添加して反
応を停止し、４０５／４９２ｎｍの吸光度を測定した。
ＡＬＰ活性（ＩＵ／ｗｅｌｌ）はｐ−ニトロフェノール
（Ｓｉｇｍａ）を標準として算出した。
【００４８】比較例として、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢ
ＭＰ−２を同時に培地に添加する代わりに、種々濃度
（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍ
Ｌ）のｒｈＩＬ−１１を単独で、あるいは、４０ｎｇ／
ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地に添加したこと以
外は、前記操作を繰り返した。また、コントロールとし
て、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２のいずれも培地
に添加しなかったこと以外は、前記操作を繰り返した。
ＭＰ−２を同時に培地に添加する代わりに、種々濃度
（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は１００ｎｇ／ｍ
Ｌ）のｒｈＩＬ−１１を単独で、あるいは、４０ｎｇ／
ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地に添加したこと以
外は、前記操作を繰り返した。また、コントロールとし
て、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２のいずれも培地
に添加しなかったこと以外は、前記操作を繰り返した。
【００４９】結果を図１に示す。実験は２回行ない、図
１（ａ）及び図１（ｂ）は、第１回目の実験における第
７日目の結果及び第１０日目の結果をそれぞれ示し、図
１（ｃ）及び図１（ｄ）は、第２回目の実験における第
７日目の結果及び第１０日目の結果をそれぞれ示す。図
１における各カラムは、平均値±標準誤差（ｎ＝６）を
示す。図１において、記号「＊」は、コントロール群
（すなわち、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２無添加
群）に対する有意差が、ｐ＜０．０５（Ｄｕｎｎｅｔｔ
多重比較検定）であることを意味し、記号「＄」は、コ
ントロール群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（ｔ−検
定）であることを意味し、記号「＃」は、ｒｈＢＭＰ−
２単独添加群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（Ｄｕｎ
ｎｅｔｔ多重比較検定）であることを意味する。
１（ａ）及び図１（ｂ）は、第１回目の実験における第
７日目の結果及び第１０日目の結果をそれぞれ示し、図
１（ｃ）及び図１（ｄ）は、第２回目の実験における第
７日目の結果及び第１０日目の結果をそれぞれ示す。図
１における各カラムは、平均値±標準誤差（ｎ＝６）を
示す。図１において、記号「＊」は、コントロール群
（すなわち、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２無添加
群）に対する有意差が、ｐ＜０．０５（Ｄｕｎｎｅｔｔ
多重比較検定）であることを意味し、記号「＄」は、コ
ントロール群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（ｔ−検
定）であることを意味し、記号「＃」は、ｒｈＢＭＰ−
２単独添加群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（Ｄｕｎ
ｎｅｔｔ多重比較検定）であることを意味する。
【００５０】図１に示すように、ｒｈＩＬ−１１（１ｎ
ｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬ）
は、ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／ｍＬ）と相乗的に作用
して、ＡＬＰ活性を上昇させた。その作用は、７日目よ
りも１０日目においてより顕著であり、相乗作用を示す
ｒｈＩＬ−１１の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬでほぼ最大で
あった。
ｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬ）
は、ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／ｍＬ）と相乗的に作用
して、ＡＬＰ活性を上昇させた。その作用は、７日目よ
りも１０日目においてより顕著であり、相乗作用を示す
ｒｈＩＬ−１１の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬでほぼ最大で
あった。
【００５１】（２）分化特異的遺伝子発現に基づく評価 本実施例では、前記実施例１（１）で使用したのと同じ
ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を使用し、前記実施
例１（１）で使用したのと同じＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞
に、前記ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を同時に添
加した場合の骨形成作用を、分化特異的遺伝子発現を指
標として評価した。
ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を使用し、前記実施
例１（１）で使用したのと同じＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞
に、前記ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を同時に添
加した場合の骨形成作用を、分化特異的遺伝子発現を指
標として評価した。
【００５２】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の分化細胞特異的
遺伝子として、骨芽細胞では、オステオカルシン（ｏｓ
ｔｅｏｃａｌｃｉｎ；ＯＣ）を選択し、以下、同様に、
骨芽細胞及び軟骨細胞では、骨シアロ酸含有タンパク質
（ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＳＰ）及
び副甲状腺ホルモンレセプター（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉ
ｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＴＨＲ）
を、軟骨細胞では、II型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ
II）を、脂肪細胞では、ペルオキシソーム増殖薬活性
化レセプターγ２（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｇａｍｍａ ２；ＰＰＡＲγ２）及び脂肪酸結合タン
パク質Ｐ２（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉ
ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２；ａＰ２）
を選択した。また、常に一定レベルで発現している遺伝
子として、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ３ＰＤ
Ｈ）を選択した。後述するように、各遺伝子発現量は、
Ｇ３ＰＤＨ発現量で補正した。
遺伝子として、骨芽細胞では、オステオカルシン（ｏｓ
ｔｅｏｃａｌｃｉｎ；ＯＣ）を選択し、以下、同様に、
骨芽細胞及び軟骨細胞では、骨シアロ酸含有タンパク質
（ｂｏｎｅ ｓｉａｌｏ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＳＰ）及
び副甲状腺ホルモンレセプター（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉ
ｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＴＨＲ）
を、軟骨細胞では、II型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ
II）を、脂肪細胞では、ペルオキシソーム増殖薬活性
化レセプターγ２（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｇａｍｍａ ２；ＰＰＡＲγ２）及び脂肪酸結合タン
パク質Ｐ２（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉ
ｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２；ａＰ２）
を選択した。また、常に一定レベルで発現している遺伝
子として、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ３ＰＤ
Ｈ）を選択した。後述するように、各遺伝子発現量は、
Ｇ３ＰＤＨ発現量で補正した。
【００５３】各遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現量の測定
に使用したプローブ（ＴａｑＭａｎ−プローブ）、フォ
ーワード（Ｆ）−プライマー、及びリバース（Ｒ）−プ
ライマー［サワデー・テクノロジー又はＧＥＮＳＥＴ
ＫＫ（京都）により合成］の各塩基配列をその順序で以
下に示す： ＯＣ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＡｇＣＴＣｇｇＣＴＴＴｇｇＣＴ
ｇＣＴＣＴＣＣ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配列表
の配列番号１） ５’−ｇＣＣＣＴＡＡＡｇＣＣＡＡＡＣＴＣＴｇｇ−
３’（配列表の配列番号２） ５’−ＡｇＡｇｇＡＣＡｇｇｇＡｇｇＡＴＣＡＡｇＴＣ
−３’（配列表の配列番号３） ＢＳＰ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＴＴＡｇＣｇｇＣＡＣＴＣＣＡＡ
ＣＴｇＣＣＣＡ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配列表
の配列番号４） ５’−ＣＣＣＣＡＡｇＣＡＣＡｇＡＣＴＴＴＴｇＡ−
３’（配列表の配列番号５） ５’−ＣＴＴＴＣＴｇＣＡＴＣＴＣＣＡｇＣＣＴＴＣ−
３’（配列表の配列番号６） ＰＴＨＲ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＴｇｇＡＣＡＣＴｇｇＣＡＴＴｇ
ｇＡＣＴＴＣＡＡｇＣｇ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’
（配列表の配列番号７） ５’−ＡＣＴｇＴｇｇＣＡｇＡＴＣＣＡｇＡＴｇＣ−
３’（配列表の配列番号８） ５’−ＣＴＣｇＴｇＴｇＴｇＡＣＡＣＣＡＴＴｇｇ−
３’（配列表の配列番号９） コラーゲンII： ５’−（６ＦＡＭ）−ＣＣｇＴＣＡＴＣｇＡｇＴＡＣＣ
ｇＡＴＣＡＣＡｇＡＡｇ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’
（配列表の配列番号１０） ５’−ｇＣＡｇｇＴＴＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴｇＣＣ−
３’（配列表の配列番号１１） ５’−ＴｇＣＡｇＡＴＣＣＴｇｇＡｇＴｇＡＣＴｇ−
３’（配列表の配列番号１２） ＰＰＡＲγ２： ５’−（６ＦＡＭ）−ＣＴｇＴＴｇＡＣＣＣＡｇＡｇＣ
ＡＴｇｇＴｇＣＣ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配列
表の配列番号１３） ５’−ｇｇｇＴｇＡＡＡＣＴＣＴｇｇｇＡｇＡＴＴＣＴ
−３’（配列表の配列番号１４） ５’−ＣＡＴＡｇｇＣＡｇＴｇＣＡＴＣＡｇＣｇ−３’
（配列表の配列番号１５） ａＰ２： ５’−（６ＦＡＭ）−ＴｇｇｇＣｇＴｇｇＡＡＴＴＣｇ
ＡＴｇＡＡＡＴＣＡ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配
列表の配列番号１６） ５’−ＡＡＡＡＣＡＣＣｇＡｇＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡ
Ａ−３’（配列表の配列番号１７） ５’−ＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴｇＴＣｇＴＣＴｇ
−３’（配列表の配列番号１８） Ｇ３ＰＤＨ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＣＡＴｇＴＴＣＣＡｇＴＡＴｇＡ
ＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣｇ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’
（配列表の配列番号１９） ５’−ＡＡＡｇＴｇｇＡｇＡＴＴｇＴＴｇＣＣＡＴ−
３’（配列表の配列番号２０） ５’−ＴＴｇＡＣＴｇＴｇＣＣｇＴＴｇＡＡＴＴ−３’
（配列表の配列番号２１）。
に使用したプローブ（ＴａｑＭａｎ−プローブ）、フォ
ーワード（Ｆ）−プライマー、及びリバース（Ｒ）−プ
ライマー［サワデー・テクノロジー又はＧＥＮＳＥＴ
ＫＫ（京都）により合成］の各塩基配列をその順序で以
下に示す： ＯＣ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＡｇＣＴＣｇｇＣＴＴＴｇｇＣＴ
ｇＣＴＣＴＣＣ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配列表
の配列番号１） ５’−ｇＣＣＣＴＡＡＡｇＣＣＡＡＡＣＴＣＴｇｇ−
３’（配列表の配列番号２） ５’−ＡｇＡｇｇＡＣＡｇｇｇＡｇｇＡＴＣＡＡｇＴＣ
−３’（配列表の配列番号３） ＢＳＰ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＴＴＡｇＣｇｇＣＡＣＴＣＣＡＡ
ＣＴｇＣＣＣＡ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配列表
の配列番号４） ５’−ＣＣＣＣＡＡｇＣＡＣＡｇＡＣＴＴＴＴｇＡ−
３’（配列表の配列番号５） ５’−ＣＴＴＴＣＴｇＣＡＴＣＴＣＣＡｇＣＣＴＴＣ−
３’（配列表の配列番号６） ＰＴＨＲ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＴｇｇＡＣＡＣＴｇｇＣＡＴＴｇ
ｇＡＣＴＴＣＡＡｇＣｇ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’
（配列表の配列番号７） ５’−ＡＣＴｇＴｇｇＣＡｇＡＴＣＣＡｇＡＴｇＣ−
３’（配列表の配列番号８） ５’−ＣＴＣｇＴｇＴｇＴｇＡＣＡＣＣＡＴＴｇｇ−
３’（配列表の配列番号９） コラーゲンII： ５’−（６ＦＡＭ）−ＣＣｇＴＣＡＴＣｇＡｇＴＡＣＣ
ｇＡＴＣＡＣＡｇＡＡｇ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’
（配列表の配列番号１０） ５’−ｇＣＡｇｇＴＴＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴｇＣＣ−
３’（配列表の配列番号１１） ５’−ＴｇＣＡｇＡＴＣＣＴｇｇＡｇＴｇＡＣＴｇ−
３’（配列表の配列番号１２） ＰＰＡＲγ２： ５’−（６ＦＡＭ）−ＣＴｇＴＴｇＡＣＣＣＡｇＡｇＣ
ＡＴｇｇＴｇＣＣ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配列
表の配列番号１３） ５’−ｇｇｇＴｇＡＡＡＣＴＣＴｇｇｇＡｇＡＴＴＣＴ
−３’（配列表の配列番号１４） ５’−ＣＡＴＡｇｇＣＡｇＴｇＣＡＴＣＡｇＣｇ−３’
（配列表の配列番号１５） ａＰ２： ５’−（６ＦＡＭ）−ＴｇｇｇＣｇＴｇｇＡＡＴＴＣｇ
ＡＴｇＡＡＡＴＣＡ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’（配
列表の配列番号１６） ５’−ＡＡＡＡＣＡＣＣｇＡｇＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡ
Ａ−３’（配列表の配列番号１７） ５’−ＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴｇＴＣｇＴＣＴｇ
−３’（配列表の配列番号１８） Ｇ３ＰＤＨ： ５’−（６ＦＡＭ）−ＣＡＴｇＴＴＣＣＡｇＴＡＴｇＡ
ＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣｇ（ａＴＡＭＲＡ）（ｐ）−３’
（配列表の配列番号１９） ５’−ＡＡＡｇＴｇｇＡｇＡＴＴｇＴＴｇＣＣＡＴ−
３’（配列表の配列番号２０） ５’−ＴＴｇＡＣＴｇＴｇＣＣｇＴＴｇＡＡＴＴ−３’
（配列表の配列番号２１）。
【００５４】なお、「６ＦＡＭ」は、５’端フルオレセ
イン系リポーター蛍光色素を意味し、「ａＴＡＭＲＡ」
は、３’端ローダミン系クェンチャー蛍光色素を意味す
る。また、前記の各塩基配列は、プライマー・エクスプ
レス・ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ
Ｖｅｒ．１．０；パーキンエルマーバイオシステムズジ
ャパン）を用いて設計した。
イン系リポーター蛍光色素を意味し、「ａＴＡＭＲＡ」
は、３’端ローダミン系クェンチャー蛍光色素を意味す
る。また、前記の各塩基配列は、プライマー・エクスプ
レス・ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ
Ｖｅｒ．１．０；パーキンエルマーバイオシステムズジ
ャパン）を用いて設計した。
【００５５】直径１０ｃｍのシャーレに、Ｃ３Ｈ１０Ｔ
１／２細胞（４．５×１０4細胞／１０ｃｍ ｄｉｓ
ｈ）を播種し、その４日後に、種々濃度（１ｎｇ／ｍＬ
又は１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１及び４０ｎｇ／
ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を添加した。ｒｈＩＬ−１１及び
ｒｈＢＭＰ−２を添加した日を０日目とし、７日目及び
１０日目に細胞を回収し、市販のＲＮＡ抽出用試薬（Ｉ
ＳＯＧＥＮ；ニッポンジーン）を用いて、その使用説明
書に従って、全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を調製し
た。なお、混在する染色体ＤＮＡは、デオキシリボヌク
レアーゼ（ＲＴＧｒａｄｅ；ニッポンジーン）を用いて
除去した。得られた全ＲＮＡから、市販のｃＤＮＡ合成
キット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM ｐｒｅａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）を用いて、その使用説明書に従って、ｃＤＮＡの合
成を行なった。
１／２細胞（４．５×１０4細胞／１０ｃｍ ｄｉｓ
ｈ）を播種し、その４日後に、種々濃度（１ｎｇ／ｍＬ
又は１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１及び４０ｎｇ／
ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を添加した。ｒｈＩＬ−１１及び
ｒｈＢＭＰ−２を添加した日を０日目とし、７日目及び
１０日目に細胞を回収し、市販のＲＮＡ抽出用試薬（Ｉ
ＳＯＧＥＮ；ニッポンジーン）を用いて、その使用説明
書に従って、全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を調製し
た。なお、混在する染色体ＤＮＡは、デオキシリボヌク
レアーゼ（ＲＴＧｒａｄｅ；ニッポンジーン）を用いて
除去した。得られた全ＲＮＡから、市販のｃＤＮＡ合成
キット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM ｐｒｅａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）を用いて、その使用説明書に従って、ｃＤＮＡの合
成を行なった。
【００５６】得られたｃＤＮＡを鋳型として、先述のｍ
ＲＮＡ発現量測定用プローブ（ＴａｑＭａｎ−プロー
ブ）、フォーワード（Ｆ）−プライマー、及びリバース
（Ｒ）−プライマーと、市販のＤＮＡ検出／定量用試薬
（ＴａｑＭａｎTM ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ；パーキンエルマーバイオシステムズジャパ
ン）と、ＰＣＲプロダクト自動検出／定量システム（Ａ
ＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ；パーキンエルマーバイオシステムズジャ
パン）とを用いて、それらの各使用説明書に従って、各
ｍＲＮＡ遺伝子発現量を測定した。各遺伝子の発現量
は、各遺伝子発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で補正し
た後、０日目の発現量に対する相対値で示した。
ＲＮＡ発現量測定用プローブ（ＴａｑＭａｎ−プロー
ブ）、フォーワード（Ｆ）−プライマー、及びリバース
（Ｒ）−プライマーと、市販のＤＮＡ検出／定量用試薬
（ＴａｑＭａｎTM ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ；パーキンエルマーバイオシステムズジャパ
ン）と、ＰＣＲプロダクト自動検出／定量システム（Ａ
ＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ；パーキンエルマーバイオシステムズジャ
パン）とを用いて、それらの各使用説明書に従って、各
ｍＲＮＡ遺伝子発現量を測定した。各遺伝子の発現量
は、各遺伝子発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量で補正し
た後、０日目の発現量に対する相対値で示した。
【００５７】比較例として、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢ
ＭＰ−２を同時に培地に添加する代わりに、種々濃度
（１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１
を単独で、あるいは、４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２
を単独で、培地に添加したこと以外は、前記操作を繰り
返した。また、コントロールとして、ｒｈＩＬ−１１及
びｒｈＢＭＰ−２のいずれも培地に添加しなかったこと
以外は、前記操作を繰り返した。
ＭＰ−２を同時に培地に添加する代わりに、種々濃度
（１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１
を単独で、あるいは、４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２
を単独で、培地に添加したこと以外は、前記操作を繰り
返した。また、コントロールとして、ｒｈＩＬ−１１及
びｒｈＢＭＰ−２のいずれも培地に添加しなかったこと
以外は、前記操作を繰り返した。
【００５８】ＯＣ、コラーゲンII、ＰＰＡＲγ２、及び
ａＰ２に関するそれぞれの結果を図２に示す。図２
（ａ）は、ＯＣ（骨芽細胞に特異的な遺伝子）の結果を
示し、以下、同様に、図２（ｂ）は、コラーゲンII（軟
骨細胞に特異的な遺伝子）の結果を、図２（ｃ）は、Ｐ
ＰＡＲγ２（脂肪細胞に特異的な遺伝子）の結果を、そ
して、図２（ｄ）は、ａＰ２（脂肪細胞に特異的な遺伝
子）の結果をそれぞれ示す。各遺伝子発現量は、０日目
の発現量に対する相対値を、平均値±標準誤差（ｎ＝
４）で示す。
ａＰ２に関するそれぞれの結果を図２に示す。図２
（ａ）は、ＯＣ（骨芽細胞に特異的な遺伝子）の結果を
示し、以下、同様に、図２（ｂ）は、コラーゲンII（軟
骨細胞に特異的な遺伝子）の結果を、図２（ｃ）は、Ｐ
ＰＡＲγ２（脂肪細胞に特異的な遺伝子）の結果を、そ
して、図２（ｄ）は、ａＰ２（脂肪細胞に特異的な遺伝
子）の結果をそれぞれ示す。各遺伝子発現量は、０日目
の発現量に対する相対値を、平均値±標準誤差（ｎ＝
４）で示す。
【００５９】図２において、「黒四角」及びそれらを結
ぶ折れ線は、コントロールの結果を示し、以下、同様
に、「黒三角」及びそれらを結ぶ折れ線は、本発明によ
るｒｈＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）及びｒｈＢＭＰ−２
同時投与の結果を示し、「白三角」及びそれらを結ぶ折
れ線は、本発明によるｒｈＩＬ−１１（１０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びｒｈＢＭＰ−２同時投与の結果を示し、「黒
丸」及びそれらを結ぶ折れ線は、比較例としてのｒｈＩ
Ｌ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）単独投与の結果を示し、「白
丸」及びそれらを結ぶ折れ線は、比較例としてのｒｈＩ
Ｌ−１１（１０ｎｇ／ｍＬ）単独投与の結果を示し、
「黒菱形」及びそれらを結ぶ折れ線は、比較例としての
ｒｈＢＭＰ−２単独投与の結果を示す。
ぶ折れ線は、コントロールの結果を示し、以下、同様
に、「黒三角」及びそれらを結ぶ折れ線は、本発明によ
るｒｈＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）及びｒｈＢＭＰ−２
同時投与の結果を示し、「白三角」及びそれらを結ぶ折
れ線は、本発明によるｒｈＩＬ−１１（１０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びｒｈＢＭＰ−２同時投与の結果を示し、「黒
丸」及びそれらを結ぶ折れ線は、比較例としてのｒｈＩ
Ｌ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）単独投与の結果を示し、「白
丸」及びそれらを結ぶ折れ線は、比較例としてのｒｈＩ
Ｌ−１１（１０ｎｇ／ｍＬ）単独投与の結果を示し、
「黒菱形」及びそれらを結ぶ折れ線は、比較例としての
ｒｈＢＭＰ−２単独投与の結果を示す。
【００６０】また、図２において、記号「＊」は、コン
トロール群（すなわち、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ
−２無添加群）に対する有意差が、ｐ＜０．０５（Ｄｕ
ｎｎｅｔｔ多重比較検定）であることを意味し、記号
「＄」は、コントロール群に対する有意差が、ｐ＜０．
０５（ｔ−検定）であることを意味し、記号「＃」は、
ｒｈＢＭＰ−２単独添加群に対する有意差が、ｐ＜０．
０５（Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定）であることを意味
する。
トロール群（すなわち、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ
−２無添加群）に対する有意差が、ｐ＜０．０５（Ｄｕ
ｎｎｅｔｔ多重比較検定）であることを意味し、記号
「＄」は、コントロール群に対する有意差が、ｐ＜０．
０５（ｔ−検定）であることを意味し、記号「＃」は、
ｒｈＢＭＰ−２単独添加群に対する有意差が、ｐ＜０．
０５（Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定）であることを意味
する。
【００６１】図２（ａ）に示すように、ｒｈＩＬ−１１
（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）は、ｒｈＢＭＰ−
２（４０ｎｇ／ｍＬ）と相乗的に作用し、ＯＣ（骨芽細
胞に特異的な遺伝子）の発現を著しく増加させた。同様
な効果は、コラーゲンII（軟骨細胞に特異的な遺伝子）
においても認められた［図２（ｂ）］。このｒｈＢＭＰ
−２に対する相乗効果は、ｒｈＩＬ−１１濃度が低濃度
（１ｎｇ／ｍＬ）である場合において、より強く認めら
れる傾向を示した［図２（ａ），図２（ｂ）］。一方、
ｒｈＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）
は、ｒｈＢＭＰ−２単独添加時に認められるＰＰＡＲγ
２（脂肪細胞に特異的な遺伝子）及びａＰ２（脂肪細胞
に特異的な遺伝子）の発現上昇を抑制した［図２
（ｃ），図２（ｄ）］。
（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）は、ｒｈＢＭＰ−
２（４０ｎｇ／ｍＬ）と相乗的に作用し、ＯＣ（骨芽細
胞に特異的な遺伝子）の発現を著しく増加させた。同様
な効果は、コラーゲンII（軟骨細胞に特異的な遺伝子）
においても認められた［図２（ｂ）］。このｒｈＢＭＰ
−２に対する相乗効果は、ｒｈＩＬ−１１濃度が低濃度
（１ｎｇ／ｍＬ）である場合において、より強く認めら
れる傾向を示した［図２（ａ），図２（ｂ）］。一方、
ｒｈＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）
は、ｒｈＢＭＰ−２単独添加時に認められるＰＰＡＲγ
２（脂肪細胞に特異的な遺伝子）及びａＰ２（脂肪細胞
に特異的な遺伝子）の発現上昇を抑制した［図２
（ｃ），図２（ｄ）］。
【００６２】（３）組織染色による評価 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（１．８×１０4細胞／ｗｅｌ
ｌ）を１２穴プレートに播種した後、種々濃度（後述）
のｒｈＩＬ−１１、種々濃度（後述）のｒｈＢＭＰ−
２、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン
酸、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸ナトリウ
ム、及び０．５％ＤＭＳＯを含むＢＭＥアール培地で培
養した。前記播種の翌日を０日目とし、１４日目にＰＢ
Ｓで洗浄した後、１０％ホルマリンを用いて室温で１時
間固定した後、各細胞の染色を行なった。
ｌ）を１２穴プレートに播種した後、種々濃度（後述）
のｒｈＩＬ−１１、種々濃度（後述）のｒｈＢＭＰ−
２、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン
酸、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸ナトリウ
ム、及び０．５％ＤＭＳＯを含むＢＭＥアール培地で培
養した。前記播種の翌日を０日目とし、１４日目にＰＢ
Ｓで洗浄した後、１０％ホルマリンを用いて室温で１時
間固定した後、各細胞の染色を行なった。
【００６３】骨芽細胞のカルシウム染色は、アリザリン
レッドを用いて染色し、以下、同様に、軟骨細胞の染色
はアルシアンブルーを用いて、そして、脂肪細胞の染色
はオイルレッドＯを用いてそれぞれ染色した。なお、骨
芽細胞のカルシウム染色に供した細胞には、１ｎｇ／ｍ
Ｌ又は１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１１と１０００ｎｇ
／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２とを添加し、軟骨細胞又は脂肪
細胞の染色に供した細胞には、１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎ
ｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１１と４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭ
Ｐ−２とを添加した。
レッドを用いて染色し、以下、同様に、軟骨細胞の染色
はアルシアンブルーを用いて、そして、脂肪細胞の染色
はオイルレッドＯを用いてそれぞれ染色した。なお、骨
芽細胞のカルシウム染色に供した細胞には、１ｎｇ／ｍ
Ｌ又は１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１１と１０００ｎｇ
／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２とを添加し、軟骨細胞又は脂肪
細胞の染色に供した細胞には、１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎ
ｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１１と４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭ
Ｐ−２とを添加した。
【００６４】比較例として、ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢ
ＭＰ−２を同時に培地に添加する代わりに、種々濃度
（１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１
を単独で、あるいは、種々濃度（４０ｎｇ／ｍＬ又は１
０００ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地に
添加したこと以外は、前記操作を繰り返した。
ＭＰ−２を同時に培地に添加する代わりに、種々濃度
（１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１
を単独で、あるいは、種々濃度（４０ｎｇ／ｍＬ又は１
０００ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地に
添加したこと以外は、前記操作を繰り返した。
【００６５】ｒｈＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎ
ｇ／ｍＬ）単独投与時、あるいは、ｒｈＢＭＰ−２（１
０００ｎｇ／ｍＬ）の単独添加時においては、１４日目
においても骨芽細胞のアリザリンレッド染色が認められ
なかったのに対して、ｒｈＩＬ−１１（１０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びｒｈＢＭＰ−２（１０００ｎｇ／ｍＬ）の同時
添加した場合には、骨芽細胞の染色が認められた。ま
た、軟骨細胞のアルシアンブルー染色については、ｒｈ
ＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）単独添
加時には認められなかったが、ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎ
ｇ／ｍＬ）単独添加時には軟骨細胞染色が認められ、同
時添加により著しく増強した。一方、脂肪細胞のオイル
レッドＯ染色については、ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／
ｍＬ）単独添加時に脂肪細胞染色が認められ、ｒｈＩＬ
−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）の同時添加
により著しく抑制された。
ｇ／ｍＬ）単独投与時、あるいは、ｒｈＢＭＰ−２（１
０００ｎｇ／ｍＬ）の単独添加時においては、１４日目
においても骨芽細胞のアリザリンレッド染色が認められ
なかったのに対して、ｒｈＩＬ−１１（１０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びｒｈＢＭＰ−２（１０００ｎｇ／ｍＬ）の同時
添加した場合には、骨芽細胞の染色が認められた。ま
た、軟骨細胞のアルシアンブルー染色については、ｒｈ
ＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）単独添
加時には認められなかったが、ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎ
ｇ／ｍＬ）単独添加時には軟骨細胞染色が認められ、同
時添加により著しく増強した。一方、脂肪細胞のオイル
レッドＯ染色については、ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／
ｍＬ）単独添加時に脂肪細胞染色が認められ、ｒｈＩＬ
−１１（１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）の同時添加
により著しく抑制された。
【００６６】
【比較例１】《ｒｈＩＬ−１１又はｒｈＢＭＰ−２の単
独添加による骨形成作用の評価》 （１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に基づく
評価 ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を同時に添加する代
わりに、種々濃度（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又
は１００ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１を単独で、ある
いは、４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地
に添加したこと、そして、第７日目及び第１０日目だけ
でなく、第４日目、第７日目、及び第１０日目にＡＬＰ
活性を測定したこと以外は、前記実施例１（１）の操作
を繰り返した。
独添加による骨形成作用の評価》 （１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に基づく
評価 ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を同時に添加する代
わりに、種々濃度（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又
は１００ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＩＬ−１１を単独で、ある
いは、４０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地
に添加したこと、そして、第７日目及び第１０日目だけ
でなく、第４日目、第７日目、及び第１０日目にＡＬＰ
活性を測定したこと以外は、前記実施例１（１）の操作
を繰り返した。
【００６７】結果を図３に示す。実験は２回行ない、図
３（ａ）は、第１回目の実験における結果を示し、図３
（ｂ）は、第２回目の実験における結果を示す。図３に
おける各記号「＊」、「＄」、及び「＃」は、図１と同
じ意味である。図３に示すように、ｒｈＩＬ−１１（１
ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬ）
は、第７日目より濃度依存的にＡＬＰ活性を増加させ
た。ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／ｍＬ）は、第７日目に
おいてｒｈＩＬ−１１と同程度までＡＬＰ活性を上昇さ
せ、第１０日目においてＡＬＰ活性をｒｈＩＬ−１１よ
り著しく上昇させた。
３（ａ）は、第１回目の実験における結果を示し、図３
（ｂ）は、第２回目の実験における結果を示す。図３に
おける各記号「＊」、「＄」、及び「＃」は、図１と同
じ意味である。図３に示すように、ｒｈＩＬ−１１（１
ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬ）
は、第７日目より濃度依存的にＡＬＰ活性を増加させ
た。ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／ｍＬ）は、第７日目に
おいてｒｈＩＬ−１１と同程度までＡＬＰ活性を上昇さ
せ、第１０日目においてＡＬＰ活性をｒｈＩＬ−１１よ
り著しく上昇させた。
【００６８】（２）分化特異的遺伝子発現に基づく評価 ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２を同時に添加する代
わりに、種々濃度（１０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍ
Ｌ）のｒｈＩＬ−１１を単独で、あるいは、４０ｎｇ／
ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地に添加したこと以
外は、前記実施例１（２）の操作を繰り返した。
わりに、種々濃度（１０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍ
Ｌ）のｒｈＩＬ−１１を単独で、あるいは、４０ｎｇ／
ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を単独で、培地に添加したこと以
外は、前記実施例１（２）の操作を繰り返した。
【００６９】結果を図４に示す。図４（ａ）は、ＯＣ
（骨芽細胞に特異的な遺伝子）の結果を示し、以下、同
様に、図４（ｂ）は、ＢＳＰ（骨芽細胞及び軟骨細胞に
特異的な遺伝子）の結果を、図４（ｃ）は、ＰＴＨＲ
（骨芽細胞及び軟骨細胞に特異的な遺伝子）の結果を、
図４（ｄ）は、コラーゲンII（軟骨細胞に特異的な遺伝
子）の結果を、図４（ｅ）は、ＰＰＡＲγ２（脂肪細胞
に特異的な遺伝子）の結果を、そして、図４（ｆ）は、
ａＰ２（脂肪細胞に特異的な遺伝子）の結果をそれぞれ
示す。図４において、「黒四角」及びそれらを結ぶ折れ
線は、コントロールの結果を示し、以下、同様に、「黒
丸」及びそれらを結ぶ折れ線は、ｒｈＩＬ−１１（１０
ｎｇ／ｍＬ）単独投与の結果を示し、「白丸」及びそれ
らを結ぶ折れ線は、ｒｈＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍ
Ｌ）単独投与の結果を示し、「黒菱形」及びそれらを結
ぶ折れ線は、ｒｈＢＭＰ−２単独投与の結果を示す。
（骨芽細胞に特異的な遺伝子）の結果を示し、以下、同
様に、図４（ｂ）は、ＢＳＰ（骨芽細胞及び軟骨細胞に
特異的な遺伝子）の結果を、図４（ｃ）は、ＰＴＨＲ
（骨芽細胞及び軟骨細胞に特異的な遺伝子）の結果を、
図４（ｄ）は、コラーゲンII（軟骨細胞に特異的な遺伝
子）の結果を、図４（ｅ）は、ＰＰＡＲγ２（脂肪細胞
に特異的な遺伝子）の結果を、そして、図４（ｆ）は、
ａＰ２（脂肪細胞に特異的な遺伝子）の結果をそれぞれ
示す。図４において、「黒四角」及びそれらを結ぶ折れ
線は、コントロールの結果を示し、以下、同様に、「黒
丸」及びそれらを結ぶ折れ線は、ｒｈＩＬ−１１（１０
ｎｇ／ｍＬ）単独投与の結果を示し、「白丸」及びそれ
らを結ぶ折れ線は、ｒｈＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍ
Ｌ）単独投与の結果を示し、「黒菱形」及びそれらを結
ぶ折れ線は、ｒｈＢＭＰ−２単独投与の結果を示す。
【００７０】図４に示すように、ｒｈＩＬ−１１（１０
ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）は、７日目又は１０
日目において、ＯＣ、ＢＳＰ、及びＰＴＨＲのｍＲＮＡ
発現量を増加させた。ＯＣに対して、ｒｈＩＬ−１１
は、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬで同程度に発
現を上昇させた。ＢＳＰ及びＰＴＨＲに対しては、７日
目ではｒｈＩＬ−１１は、前記両濃度で同程度の発現上
昇作用を示したが、１０日目では１００ｎｇ／ｍＬの方
が強い上昇作用を示した。一方、ｒｈＩＬ−１１は、前
記両濃度ともに、ＰＰＡＲγ２の発現にはほとんど影響
を与えなかった。また、コラーゲンII及びａＰ２に対し
て、ｒｈＩＬ−１１単独投与群で有意差が認められた
が、意味のある変化ではなく、ｒｈＩＬ−１１は、コラ
ーゲンII及びａＰ２の発現にもほとんど影響を与えなか
った。
ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）は、７日目又は１０
日目において、ＯＣ、ＢＳＰ、及びＰＴＨＲのｍＲＮＡ
発現量を増加させた。ＯＣに対して、ｒｈＩＬ−１１
は、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬで同程度に発
現を上昇させた。ＢＳＰ及びＰＴＨＲに対しては、７日
目ではｒｈＩＬ−１１は、前記両濃度で同程度の発現上
昇作用を示したが、１０日目では１００ｎｇ／ｍＬの方
が強い上昇作用を示した。一方、ｒｈＩＬ−１１は、前
記両濃度ともに、ＰＰＡＲγ２の発現にはほとんど影響
を与えなかった。また、コラーゲンII及びａＰ２に対し
て、ｒｈＩＬ−１１単独投与群で有意差が認められた
が、意味のある変化ではなく、ｒｈＩＬ−１１は、コラ
ーゲンII及びａＰ２の発現にもほとんど影響を与えなか
った。
【００７１】ｒｈＢＭＰ−２（４０ｎｇ／ｍＬ）は、ｒ
ｈＩＬ−１１と同様に、ＯＣ、ＢＳＰ、及びＰＴＨＲの
ｍＲＮＡ発現を増加させた。ＯＣに対しては、１０日目
でｒｈＩＬ−１１より強い発現増加作用を示したのに対
し、ＢＳＰに対しては７日目及び１０日目ともに、ｒｈ
ＩＬ−１１より弱い作用を、ＰＴＨＲに対してはｒｈＩ
Ｌ−１１とほぼ同等の作用を示した。更に、ｒｈＢＭＰ
−２は、ｒｈＩＬ−１１と異なり、コラーゲンII、ＰＰ
ＡＲγ２、及びａＰ２に対してもｍＲＮＡ発現増加作用
を示した。
ｈＩＬ−１１と同様に、ＯＣ、ＢＳＰ、及びＰＴＨＲの
ｍＲＮＡ発現を増加させた。ＯＣに対しては、１０日目
でｒｈＩＬ−１１より強い発現増加作用を示したのに対
し、ＢＳＰに対しては７日目及び１０日目ともに、ｒｈ
ＩＬ−１１より弱い作用を、ＰＴＨＲに対してはｒｈＩ
Ｌ−１１とほぼ同等の作用を示した。更に、ｒｈＢＭＰ
−２は、ｒｈＩＬ−１１と異なり、コラーゲンII、ＰＰ
ＡＲγ２、及びａＰ２に対してもｍＲＮＡ発現増加作用
を示した。
【００７２】
【実施例２】《ラット異所性骨形成モデルにおけるｒｈ
ＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の併用作用の評価》本実
施例では、ヒトＩＬ−１１として、Ｎ末端のプロリンを
欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有し、大腸
菌で製造した組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）
凍結乾燥品を使用した。ｒｈＩＬ−１１（５ｍｇ）を溶
解液（０．０１％トゥイーン８０）１．２ｍＬで溶解し
た後、蒸留水で希釈し、１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。
更に、８０μＬを担体に含浸させたときの濃度が２μｇ
及び２０μｇになるように蒸留水で希釈した。また、前
記溶解液（０．０１％トゥイーン８０）で溶解して得ら
れた前記ｒｈＩＬ−１１溶液を浸透圧ミニポンプ（Ａｌ
ｚｅｔ浸透圧ミニポンプ，ｍｏｄｅｌ ２００１；Ａｌ
ｚａ）に充填した。また、ヒトＢＭＰ−２として、天然
型と同じアミノ酸配列を有するチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞で製造した組換えヒトＢＭＰ−２
（ｒｈＢＭＰ−２）を使用した。ｒｈＢＭＰ−２を希釈
用緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸、２．５％グリ
シン、０．５％スクロース、０．０１％トゥイーン８
０、ｐＨ４．５）に溶解した３．５６ｍｇ／ｍＬ溶液を
使用した。更に、８０μＬを担体に含浸させたときの濃
度が２μｇになるように希釈用緩衝液で希釈した。
ＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の併用作用の評価》本実
施例では、ヒトＩＬ−１１として、Ｎ末端のプロリンを
欠くこと以外は天然型と同じアミノ酸配列を有し、大腸
菌で製造した組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）
凍結乾燥品を使用した。ｒｈＩＬ−１１（５ｍｇ）を溶
解液（０．０１％トゥイーン８０）１．２ｍＬで溶解し
た後、蒸留水で希釈し、１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。
更に、８０μＬを担体に含浸させたときの濃度が２μｇ
及び２０μｇになるように蒸留水で希釈した。また、前
記溶解液（０．０１％トゥイーン８０）で溶解して得ら
れた前記ｒｈＩＬ−１１溶液を浸透圧ミニポンプ（Ａｌ
ｚｅｔ浸透圧ミニポンプ，ｍｏｄｅｌ ２００１；Ａｌ
ｚａ）に充填した。また、ヒトＢＭＰ−２として、天然
型と同じアミノ酸配列を有するチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞で製造した組換えヒトＢＭＰ−２
（ｒｈＢＭＰ−２）を使用した。ｒｈＢＭＰ−２を希釈
用緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン酸、２．５％グリ
シン、０．５％スクロース、０．０１％トゥイーン８
０、ｐＨ４．５）に溶解した３．５６ｍｇ／ｍＬ溶液を
使用した。更に、８０μＬを担体に含浸させたときの濃
度が２μｇになるように希釈用緩衝液で希釈した。
【００７３】本実施例では、６週齢の雄性ＬＥ（Ｌｏｎ
ｇ Ｅｖａｎｓ）ラット（体重＝１７２〜２４８ｇ；Ｃ
ｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＳＡ）を使用した。ＬＥ
ラットをエーテル軽麻酔下に胸部を剃毛し、アルコール
綿を用いて消毒した。胸部皮膚を眼下用鋏で２〜３ｃｍ
切開し、モスキート鉗子を用いて皮下を鈍性に剥離し、
ポケットを作製した。ｒｈＩＬ−１１（２０μｇ）の
み、ＢＭＰ−２（２μｇ）のみ、あるいは、ｒｈＩＬ−
１１（２０μｇ）及びＢＭＰ−２（２μｇ）をそれぞれ
含浸させた担体（ＰＬＧＡでコーティングされた８ｍｍ
×５ｍｍ×５ｍｍのゼラチンスポンジ；製造方法につい
てはＷＯ９６／１０４２６号公報を参照）をピンセット
で注意深く埋め込み、金属クリップ（Ｗｏｕｎｄ Ｃｒ
ｉｐ）を用いて術創を閉じた後に、ヨードチンキ綿にて
術部を消毒した。また、胸部皮下にＢＭＰ−２（２μ
ｇ）含浸担体と、腹部皮下に、ｒｈＩＬ−１１溶液を充
填した浸透圧ミニポンプ（１００μｇ／ｒａｔ／ｄａ
ｙ）とを埋め込んだＬＥラットを作製した。なお、浸透
圧ミニポンプは１週間毎に交換した。
ｇ Ｅｖａｎｓ）ラット（体重＝１７２〜２４８ｇ；Ｃ
ｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＳＡ）を使用した。ＬＥ
ラットをエーテル軽麻酔下に胸部を剃毛し、アルコール
綿を用いて消毒した。胸部皮膚を眼下用鋏で２〜３ｃｍ
切開し、モスキート鉗子を用いて皮下を鈍性に剥離し、
ポケットを作製した。ｒｈＩＬ−１１（２０μｇ）の
み、ＢＭＰ−２（２μｇ）のみ、あるいは、ｒｈＩＬ−
１１（２０μｇ）及びＢＭＰ−２（２μｇ）をそれぞれ
含浸させた担体（ＰＬＧＡでコーティングされた８ｍｍ
×５ｍｍ×５ｍｍのゼラチンスポンジ；製造方法につい
てはＷＯ９６／１０４２６号公報を参照）をピンセット
で注意深く埋め込み、金属クリップ（Ｗｏｕｎｄ Ｃｒ
ｉｐ）を用いて術創を閉じた後に、ヨードチンキ綿にて
術部を消毒した。また、胸部皮下にＢＭＰ−２（２μ
ｇ）含浸担体と、腹部皮下に、ｒｈＩＬ−１１溶液を充
填した浸透圧ミニポンプ（１００μｇ／ｒａｔ／ｄａ
ｙ）とを埋め込んだＬＥラットを作製した。なお、浸透
圧ミニポンプは１週間毎に交換した。
【００７４】術後３週目にエーテル麻酔下に正中切開
し、担体に形成された新生骨を周囲組織より注意深く摘
出し、生理食塩水で洗った後に、１０％中性緩衝ホルマ
リン溶液（約１５ｍＬ）中にて固定した。摘出した担体
に形成された新生骨を２ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液２ｍＬ中に
４８時間以上浸漬し、浸漬液中のＣａ濃度を、原子吸光
光度計（Ａｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅ
ｃｔｒａ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＡＮＡ−１８２；東
京光電株式会社）を用いて原子吸光法にて測定し、担体
の組織Ｃａ含量を算出した。カルシウム標準品として
は、市販のカルシウム標準液Ａ（和光純薬工業）を使用
した。
し、担体に形成された新生骨を周囲組織より注意深く摘
出し、生理食塩水で洗った後に、１０％中性緩衝ホルマ
リン溶液（約１５ｍＬ）中にて固定した。摘出した担体
に形成された新生骨を２ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液２ｍＬ中に
４８時間以上浸漬し、浸漬液中のＣａ濃度を、原子吸光
光度計（Ａｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅ
ｃｔｒａ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＡＮＡ−１８２；東
京光電株式会社）を用いて原子吸光法にて測定し、担体
の組織Ｃａ含量を算出した。カルシウム標準品として
は、市販のカルシウム標準液Ａ（和光純薬工業）を使用
した。
【００７５】ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２併用時
の作用を、ｒｈＢＭＰ−２単独作用に対するＳｔｅｅｌ
検定により評価した結果（ｎ＝１６）を、図５に示す。
実験結果は、中央値、四分位点、及びレンジで示した。
なお、測定Ｃａ濃度が測定限界（１μｇ／ｍＬ）以下の
場合、Ｃａ濃度を０とした。また、図５において、記号
「＊＊」は、ｒｈＢＭＰ−２単独群に対する有意差を示
す（ｐ＜０．０１，Ｓｔｅｅｌ検定）。
の作用を、ｒｈＢＭＰ−２単独作用に対するＳｔｅｅｌ
検定により評価した結果（ｎ＝１６）を、図５に示す。
実験結果は、中央値、四分位点、及びレンジで示した。
なお、測定Ｃａ濃度が測定限界（１μｇ／ｍＬ）以下の
場合、Ｃａ濃度を０とした。また、図５において、記号
「＊＊」は、ｒｈＢＭＰ−２単独群に対する有意差を示
す（ｐ＜０．０１，Ｓｔｅｅｌ検定）。
【００７６】図５に示すように、ｒｈＢＭＰ−２（２μ
ｇ）を含浸させた担体をラット皮下に埋入すると、３週
間経過後に骨形成が認められた。ｒｈＩＬ−１１（２０
μｇ）含浸担体単独では骨形成作用は認められなかった
が、ｒｈＢＭＰ−２（２μｇ）及びｒｈＩＬ−１１（２
０μｇ）を同時に担体に含浸すると、ｒｈＩＬ−１１は
ｒｈＢＭＰ−２による骨形成を著しく促進した。また、
ｒｈＢＭＰ−２（２μｇ）含浸担体埋入と同時にｒｈＩ
Ｌ−１１（１００μｇ／ｒａｔ／ｄａｙ）を浸透圧ミニ
ポンプにより持続皮下投与したところ、ｒｈＢＭＰ−２
による骨形成は促進され、その作用はｒｈＩＬ−１１
（２０μｇ）含浸群と同程度であった。以上の結果か
ら、ｒｈＩＬ−１１はｒｈＢＭＰ−２の骨形成作用に相
乗的に作用し、インビボにおいて異所性骨形成を著しく
促進させることが明らかとなった。
ｇ）を含浸させた担体をラット皮下に埋入すると、３週
間経過後に骨形成が認められた。ｒｈＩＬ−１１（２０
μｇ）含浸担体単独では骨形成作用は認められなかった
が、ｒｈＢＭＰ−２（２μｇ）及びｒｈＩＬ−１１（２
０μｇ）を同時に担体に含浸すると、ｒｈＩＬ−１１は
ｒｈＢＭＰ−２による骨形成を著しく促進した。また、
ｒｈＢＭＰ−２（２μｇ）含浸担体埋入と同時にｒｈＩ
Ｌ−１１（１００μｇ／ｒａｔ／ｄａｙ）を浸透圧ミニ
ポンプにより持続皮下投与したところ、ｒｈＢＭＰ−２
による骨形成は促進され、その作用はｒｈＩＬ−１１
（２０μｇ）含浸群と同程度であった。以上の結果か
ら、ｒｈＩＬ−１１はｒｈＢＭＰ−２の骨形成作用に相
乗的に作用し、インビボにおいて異所性骨形成を著しく
促進させることが明らかとなった。
【００７７】
【発明の効果】本発明の骨形成用医薬、骨形成用医薬組
成物、及び骨形成用組合せ医薬によれば、ＩＬ−１１又
は骨誘導因子をそれぞれ単独で使用した場合に比べて、
飛躍的に骨形成能が向上する。
成物、及び骨形成用組合せ医薬によれば、ＩＬ−１１又
は骨誘導因子をそれぞれ単独で使用した場合に比べて、
飛躍的に骨形成能が向上する。
【００７８】
【配列表】 <110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. <120> A medicament, pharmaceutical composition, and medicament combinati on for bone formation <130> YAM013063P <150> JP 2000-243120 <151> 2000-08-10 <160> 21 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 1 agctcggctt tggctgctct cc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 2 gccctaaagc caaactctgg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 3 agaggacagg gaggatcaag tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 4 ttagcggcac tccaactgcc ca 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 5 ccccaagcac agacttttga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 6 ctttctgcat ctccagcctt c 21 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 7 tggacactgg cattggactt caagcg 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 8 actgtggcag atccagatgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 9 ctcgtgtgtg acaccattgg 20 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 10 ccgtcatcga gtaccgatca cagaag 26 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 11 gcaggttcac atacactgcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 12 tgcagatcct ggagtgactg 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 13 ctgttgaccc agagcatggt gcc 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 14 gggtgaaact ctgggagatt ct 22 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 15 cataggcagt gcatcagcg 19 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 16 tgggcgtgga attcgatgaa atca 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 17 aaaacaccga gatttccttc aaa 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 18 ctcttcacct tcctgtcgtc tg 22 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 19 catgttccag tatgactcca ctcacg 26 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 20 aaagtggaga ttgttgccat 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 21 ttgactgtgc cgttgaatt 19
【図１】ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の同時添加
による骨形成作用を、アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）活性に基づいて評価した結果を示すグラフである。
による骨形成作用を、アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）活性に基づいて評価した結果を示すグラフである。
【図２】ｒｈＩＬ−１１及びｒｈＢＭＰ−２の同時添加
による骨形成作用を、分化特異的遺伝子発現に基づいて
評価した結果を示すグラフである。
による骨形成作用を、分化特異的遺伝子発現に基づいて
評価した結果を示すグラフである。
【図３】ｒｈＩＬ−１１又はｒｈＢＭＰ−２の単独添加
による骨形成作用を、アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）活性に基づいて評価した結果を示すグラフである。
による骨形成作用を、アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）活性に基づいて評価した結果を示すグラフである。
【図４】ｒｈＩＬ−１１又はｒｈＢＭＰ−２の単独添加
による骨形成作用を、分化特異的遺伝子発現に基づいて
評価した結果を示すグラフである。
による骨形成作用を、分化特異的遺伝子発現に基づいて
評価した結果を示すグラフである。
【図５】ラット異所性骨形成モデルにおけるｒｈＩＬ−
１１及びｒｈＢＭＰ−２の併用作用の結果を示すグラフ
である。
１１及びｒｈＢＭＰ−２の併用作用の結果を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/16 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 福島 慎二 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 (72)発明者 安田 修平 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA19 BA44 DA12 MA02 NA14 ZA96 ZB22
Claims (8)
- 【請求項１】 骨形成治療において、骨誘導因子との同
時使用又は連続使用のためのＩＬ−１１を有効成分とし
て含むことを特徴とする、骨形成用医薬。 - 【請求項２】 骨誘導因子がＢＭＰ−２である、請求項
１に記載の骨形成用医薬。 - 【請求項３】 骨形成治療において、ＩＬ−１１との同
時使用又は連続使用のための骨誘導因子を有効成分とし
て含むことを特徴とする、骨形成用医薬。 - 【請求項４】 骨誘導因子がＢＭＰ−２である、請求項
３に記載の骨形成用医薬。 - 【請求項５】 骨誘導因子及びＩＬ−１１を有効成分と
して含むことを特徴とする、骨形成用医薬組成物。 - 【請求項６】 骨誘導因子がＢＭＰ−２である、請求項
５に記載の骨形成用医薬組成物。 - 【請求項７】 骨誘導因子を有効成分として含む第１の
医薬と、ＩＬ−１１を有効成分として含む第２の医薬と
の組合せを含むことを特徴とする、骨形成用組合せ医
薬。 - 【請求項８】 骨誘導因子がＢＭＰ−２である、請求項
７に記載の骨形成用組合せ医薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001243842A JP2002121150A (ja) | 2000-08-10 | 2001-08-10 | 骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000243120 | 2000-08-10 | ||
| JP2000-243120 | 2000-08-10 | ||
| JP2001243842A JP2002121150A (ja) | 2000-08-10 | 2001-08-10 | 骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002121150A true JP2002121150A (ja) | 2002-04-23 |
Family
ID=26597753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001243842A Pending JP2002121150A (ja) | 2000-08-10 | 2001-08-10 | 骨形成用医薬、骨形成用医薬組成物、及び骨形成用組合せ医薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002121150A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005100161A (ja) * | 2003-09-25 | 2005-04-14 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 性能試験支援装置 |
| CN113350486A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-09-07 | 深圳市人民医院 | 一种具有骨缺损修复功效的药物组合物及其应用 |
-
2001
- 2001-08-10 JP JP2001243842A patent/JP2002121150A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005100161A (ja) * | 2003-09-25 | 2005-04-14 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 性能試験支援装置 |
| CN113350486A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-09-07 | 深圳市人民医院 | 一种具有骨缺损修复功效的药物组合物及其应用 |
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|---|---|---|---|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
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