JP2022522230A - 混合細胞遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、発現させるべき遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団および該遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団を提供することによって、標的部位において治療用蛋白質を生成させる混合細胞組成物であって、ここで第２の哺乳動物細胞集団に内在する形態が標的部位においては減少しており、ここで標的部位における第１の哺乳動物細胞集団による治療用蛋白質の生成が、第２の細胞集団による治療効果の誘導を刺激する、混合細胞組成物を対象とする。【選択図】なし

Description

本発明は体細胞遺伝子治療のための細胞混合物の利用に関する。本発明はまた、形質転換増殖因子βスーパーファミーの構成員をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した哺乳動物細胞および形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員をコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない結合組織細胞を含む細胞混合物に関する。本発明はまた、哺乳動物結合組織に該細胞混合物を注入することにより軟骨を再生させる方法に関する。さらに、本発明は哺乳動物結合組織に細胞混合物を注入することにより変形性関節症を治療する方法に関する。

整形外科分野において、変性性関節炎または変形性関節症は最も頻度の高い軟骨損傷関連疾患である。身体中のほとんど全ての関節が（膝、臀部、肩など、および手根さえも）罹患する。疾病の病因は関節硝子軟骨の変性である（Ｍａｎｋｉｎら、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ、５２Ａ：４６０－４６６、１９８２）。関節の硝子軟骨が変形、小線維化し、最終的には陥凹ができる。何らかの方法で変性軟骨を再生できれば、ほとんどの患者が消耗性疼痛など無縁の生活をおくることができるであろう。

薬剤を関節に運ぶための従来の薬剤送達経路（経口、静脈内または筋肉内投与など）は非効率的である。関節内注射した薬剤の半減期は一般に短い。薬剤の関節内注射のもう一つの不利な点は、慢性病態（関節炎など）の治療で関節腔に許容可能な薬剤濃度を得るために繰返し頻回に注射する必要があるということである。従来の治療薬では関節を選択的に標的化することができなかったので、持続的な関節内治療用量を達成するためには哺乳動物宿主を全身的に高濃度の薬剤に曝露する必要があった。このような非標的臓器への曝露は、哺乳動物宿主に重篤な副作用（胃腸障害および血液系、心臓血管系、肝臓系および腎臓系の変化）をもたらす抗関節炎薬の性質を深刻化させたのである。

整形外科分野において、いくつかのサイトカインは整形外科疾患治療の候補と考えられている。骨形成蛋白質は骨形成の効果的刺激因子と考えられており（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ Ｊ、９：２０８５－２０９３、１９９０；ＳａｍｐａｔｈおよびＲｕｅｇｅｒ、Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｔｈｏ、１０１－１０７、１９９４）、またＴＧＦ－βは骨形成および軟骨形成の刺激因子であることが報告されている（Ｊｏｙｃｅら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１０：２１９５－２２０７、１９９０）。

形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）は多機能性サイトカインであると考えられており（ＳｐｏｒｎおよびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３２：２１７－２１９、１９８８）、細胞増殖、分化および細胞外マトリックス蛋白質の合成において制御的役割を担う（Ｍａｄｒｉら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０６：１３７５－１３８４、１９８８）。ＴＧＦ－βはインビトロで上皮細胞および破骨細胞様細胞の増殖を阻害するが（Ｃｈｅｎｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、８５：５６８３－５６８７、１９８８）、インビボでは軟骨内骨形成および最終的には骨形成を刺激する（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗら、Ｂｏｎｅ、５２１－５２７、１９９５；Ｌｉｎｄら、Ａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ、６４（５）：５５３－５５６、１９９３；ならびにＭａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｉｎ ｖｉｖｏ、８：２１５－２２０、１９９４）。ＴＧＦ－β誘導性骨形成は骨膜下多能性細胞の刺激によって媒介され、骨膜下多能性細胞は最終的に軟骨形成細胞に分化する（Ｊｏｙｃｅら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１０：２１９５－２２０７、１９９０；ならびにＭｉｅｔｔｉｎｅｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２７－６： ２０２１－２０３６、１９９４）。

整形外科学におけるＴＧＦ－βの生物学的効果について報告がなされている（Ａｎｄｒｅｗら、Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎ．５２：７４－７８、１９９３；Ｂｏｒｑｕｅら、Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、３７：５７３－５７９、１９９３；Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０７：１９６９－１９７５、１９８８；Ｌｉｎｄら、Ａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ．６４（５）：５５３－５５６、１９９３；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｉｎ ｖｉｖｏ、８：２１５－２２０、１９９４）。マウス胚において、ＴＧＦ－βは結合組織、軟骨および骨などの間葉由来組織に密接に関係していることが染色によって明らかになっている。発生学的所見に加え、ＴＧＦ－βは骨形成部位および軟骨形成部位に存在する。ＴＧＦ－βはウサギ脛骨において骨折治癒を促進する。最近、ＴＧＦ－βの治療的価値について報告がなされた（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗら、Ｂｏｎｅ、５２１－５２７、１９９５；およびＬｉｎｄら、Ａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ、６４（５）：５５３－５５６、１９９３）が、その効果が短期的であること、およびコストが高いことによって臨床応用は限定的である。

関節炎治療のためにＴＧＦ－βを関節内注射することは望ましくない。その理由は、インビボではＴＧＦ－βが非活性型に分解するため注射したＴＧＦ－βの作用が短時間だということである。したがって、ＴＧＦ－βを長期持続放出させる新規の方法が硝子軟骨再生には必要である。

軟骨細胞の自家移植による関節軟骨再生に関する報告がある（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３１：８８９－８９５、１９９４）が、これは軟組織の広範な切除を含む２回の手術を伴う方法である。変性性関節炎治療が関節内注射だけで済むのであれば、これは患者にとって経済的にも身体的にも有利であろう。

遺伝子療法は特定蛋白質を特定部位に送達する方法であるが、この問題に対する解答になり得る（ＷｏｌｆｆおよびＬｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｅｄ．Ｊｏｎ Ａ．Ｗｏｌｆｆ、３－２５、１９９４；およびＪｅｎｋｓ、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、８９（１６）：１１８２－１１８４、１９９７）。

米国特許第５，８５８，３５５号および第５，７６６，５８５号には、ＩＲＡＰ（インターロイキン－１受容体拮抗蛋白質）遺伝子のウイルスまたはプラスミド構築物の作成；該構築物による滑膜細胞（第５，８５８，３５５号）および骨髄細胞（第５，７６６，５８５号）の形質転換；ウサギの関節への該形質導入細胞の注入について開示されているが、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する遺伝子の結合組織再生における利用についての開示はない。

米国特許第５，８４６，９３１号および第５，７００，７７４号には、軟骨組織形成維持および軟骨組織誘導を惹起させるために、ＴＧＦβ「スーパーファミリー」に属する骨形成蛋白質（ＢＭＰ）を短縮型副甲状腺ホルモン関連ペプチドと組み合わせて含む組成物を注射することについて開示されている。しかし、ＢＭＰ遺伝子を利用した遺伝子治療法についての開示はない。

米国特許第５，８４２，４７７号には、足場、骨膜／軟骨膜組織、および間質細胞の組み合わせ（軟骨細胞を含む）の軟骨欠損領域への移植が開示されている。この特許開示は移植系においてこれら３種類の要素が全て存在することを要件とするのであり、それが故に該参考文献は足場の移植も骨膜／軟骨膜組織の移植も必要としない本発明の簡単な遺伝子治療法を開示も示唆もしていないのである。

米国特許第６，３１５，９９２号は、ＴＧＦ－β１で形質転換した線維芽細胞を哺乳動物の欠損膝関節に注入することによって、欠損関節に硝子軟骨が生成することを開示している。しかし、この特許は本発明のような混合細胞組成物を利用する利点については開示していない。

Ｌｅｅら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２：１０８５－１８１３、２００１）は、ＴＧＦ－β１で形質転換した線維芽細胞を哺乳動物の欠損関節に注入することによって、欠損膝関節に硝子軟骨が生成することを開示している。しかし、Ｌｅｅらは、本発明のような混合細胞組成物を利用することについては開示していない。

これら先行技術の開示にもかかわらず、さらに効果的かつ強力な治療方法に対する非常に現実的でかつ実質的な必要性が依然として存在するのであり、それは哺乳動物宿主において結合組織を再生するのみならずより良好かつ効果的な体細胞遺伝子治療法でもある。

本発明は上記の必要性を満たすものである。

本発明は、標的部位において治療用蛋白質を生成させるために用いる混合細胞組成物であって、該混合細胞組成物が、
（ａ）発現させるべき遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｂ）該遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団；
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含み；
ここで第２の哺乳動物細胞集団に内在する形態が標的部位においては減少しており；
ここで標的部位における第１の哺乳動物細胞集団による治療用蛋白質の生成が、第２の細胞集団による治療効果の誘導を刺激する、
混合細胞組成物を対象とする。

本発明において、該混合細胞組成物は注射可能組成物であってもよい。

本発明はさらに、硝子軟骨形成有効量の：
（ａ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）または骨形成蛋白質（ＢＭＰ）をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団；
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含む混合細胞組成物を対象とする。

さらに具体的な実施態様においては、本発明は、硝子軟骨形成有効量の：
（ａ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の軟骨細胞集団；
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含む混合細胞組成物を対象とする。

上記の組成物においては、該組成物が硝子軟骨形成有効量の：
（ａ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の軟骨細胞集団；
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含んでもよい。

上記の組成物においては、該遺伝子はＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７またはＢＭＰ－９であってもよいが、これらのみに限定されるものではない。特に、該遺伝子はＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２であってもよい。

上記の組成物においては、形質転換または形質導入される該第１の哺乳動物細胞集団は、上皮細胞を含んでもよく、好ましくはヒト上皮細胞またはヒト２９３胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、または２９３細胞ともよばれる）を含んでもよい。

さらに、該組成物においては、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞または軟骨細胞集団の、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団に対する比は約１～２０対１である。特に、比は約１～１０対１であってもよく、またさらには約１～３対１であってもよい。

上記の組成物においては、遺伝子で形質転換または形質導入した第１の細胞集団は放射線照射されてもよい。また特に、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団は放射線照射される。

混合細胞集団の細胞は異なるソースの生物に由来するものであってもよい。特に、特定の実施態様において、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の哺乳動物細胞集団およびＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団は異なるソースの生物に由来する。該第１の細胞集団および該第２の細胞集団は異なるソースの哺乳動物に由来するものであってもよい。また特に、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の哺乳動物細胞集団およびＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない該第２の線維芽細胞または軟骨細胞集団は異なるソースの哺乳動物に由来する。

本発明はまた、哺乳動物の標的部位において治療用蛋白質を生成させる方法であって；該方法が：
（ａ）プロモーターに制御可能に連結されたＤＮＡ配列であって、治療蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作成すること；
（ｂ）細胞集団を該組換えベクターでインビトロ形質転換または形質導入すること；
および
（ｃ）蛋白質生成有効量の：
（ｉ）該遺伝子で形質転換または形質導入した第１の細胞集団；
（ｉｉ）該遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の細胞集団；
および
（ｉｉｉ）薬学的に許容され得るその担体、
を含む混合細胞組成物を標的部位に注入すること、
を含む方法であって、
ここで第２の哺乳動物細胞集団に内在する形態が標的部位においては減少しており、
ここで標的部位における第１の哺乳動物細胞集団による治療用蛋白質の生成が、第２の細胞集団による治療効果の誘導を刺激する、
方法を対象とする。

特に、上記の方法において、哺乳動物において硝子軟骨を生成させる方法が提供されるが、該方法は：
（ａ）プロモーターに制御可能に連結されたＤＮＡ配列であって、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）または骨形成蛋白質（ＢＭＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作成すること；
（ｂ）該組換えベクターで哺乳動物細胞集団をインビトロ形質転換または形質導入すること；
および
（ｃ）硝子軟骨形成有効量の：
（ｉ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｉｉ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団；
および
（ｉｉｉ）薬学的に許容され得るその担体、
を含む注射可能混合細胞組成物を、
哺乳動物の関節腔に注入すること、
を含む方法であって、
該注入によって、関節腔内でＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードするＤＮＡ配列の発現が起こり、その結果、関節腔で硝子軟骨形成が起こる、
方法である。

上記の方法において、該遺伝子はＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、またはＢＭＰ－７であってもよいが、これらのみに限定されるものではない。特に、該遺伝子はＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２であってもよい。

上記の方法においては、形質転換または形質導入される第１の哺乳動物細胞集団は上皮細胞を含んでもよく、好ましくはヒト上皮細胞、またはヒト２９３胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、または２９３細胞ともよばれる）である。

さらに、該方法は以下のような比で細胞を混合することを含んでもよい：ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団の、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団に対する比が約３～２０対１であってもよい。該比は約３～１０対１であってもよい。さらに、該比は約１０対１であってもよい。

本発明ではまた、上記の方法において、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団が放射線照射される。

上記の方法における細胞ソースに関しては、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団とＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団は受容宿主に対して同系、同種異系、または異種である。

上記の方法ではウイルスベクターなどの組換えベクターを用いてもよい。組換えベクターはプラスミドベクターであってもよいが、これのみに限定されるものではない。さらに、該形質転換または形質導入は、リポソームカプセル化、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン媒介またはウイルス媒介によって達成されてもよい。

本発明の実施においては、細胞は移植前に保存してもよい。さらに細胞は移植前に凍結保存剤中に保存してもよい。

別の一つの実施態様において、本発明は、変形性関節症を治療する方法であって、該方法が：
（ａ）プロモーターに制御可能に連結されたＤＮＡ配列であって、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）または骨形成蛋白質（ＢＭＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作成すること；
（ｂ）該組換えベクターで哺乳動物細胞集団をインビトロ形質転換または形質導入すること；
および
（ｃ）硝子軟骨形成有効量かつ変形性関節症治療有効量の：
（ｉ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｉｉ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団；
および
（ｉｉｉ）非生物性３次元構造物ではない薬学的に許容され得るその担体、
を含む注射可能混合細胞組成物を哺乳動物の関節腔に注入すること、
を含む方法であって、それにより関節腔内でＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードするＤＮＡ配列の発現が起こり、その結果、関節腔内において骨および軟骨組織の形成が起こる、
方法を対象とする。

上記の方法において、該遺伝子はＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、またはＢＭＰ－７であってもよいが、これらのみに限定されるものではない。特に、該遺伝子はＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２であってもよい。

上記の方法において、形質導入または形質転換される該第１の哺乳動物細胞集団は上皮細胞を含んでもよく、好ましくはヒト上皮細胞、またはヒト２９３胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、または２９３細胞ともよばれる）である。

本発明はさらに、硝子軟骨形成効果的量かつ変形性関節症治療量の：
（ａ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）または骨形成蛋白質（ＢＭＰ）をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団；
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含む注射可能混合細胞組成物を対象とする。

上記の方法において、該遺伝子はＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、またはＢＭＰ－７であってもよいが、これらのみに限定されるものではない。特に、該遺伝子はＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２であってもよい。

上記の方法において、形質導入または形質転換される該第１の哺乳動物細胞集団は上皮細胞を含んでもよく、好ましくはヒト上皮細胞、またはヒト２９３胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、または２９３細胞ともよばれる）である。

本発明の別の一つの実施態様においては、本発明は、約－７０℃～約－１９６℃の温度で細胞を保存する保存容器であって、対象部位において蛋白質を生成させるための混合細胞組成物を含む保存容器であり、該混合細胞組成物が：
（ａ）発現させるべき遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
（ｂ）該遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団、
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含み、
ここで第２の哺乳動物細胞集団に内在する形態が標的部位においては減少しており、
ここで標的部位における第１の哺乳動物細胞集団による治療用蛋白質の生成が、第２の細胞集団による治療効果の誘導を刺激する、
混合細胞組成物
を含む保存容器、
を提供する。

特に、本願は、約－７０℃～約－１９６℃の温度で細胞を保存する保存容器であって、硝子軟骨形成有効量の：
（ａ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した哺乳動物細胞集団；
（ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない線維芽細胞集団または軟骨細胞集団；
および
（ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
を含む注射可能混合細胞組成物、
を含む保存容器、
を提供する。

これらの本発明の目的およびその他の目的は、本発明に関する下記の説明、付属の参考図面および特許請求項によってさらに詳細に理解されるであろう。

本発明は、本明細書において下に記載される詳細な説明、および付図からより完全に理解されるであろう。図面は具体例を示すものとして提示されるものであり、したがって本発明を限定するものではない。

ＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現を示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＴＧＦ－β１発現ベクターであるｐｍＴβ１で安定的に形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞であって、亜鉛の存在下または非存在下で増殖させた細胞から全ＲＮＡを単離した。ＴＧＦ－β１ ｃＤＮＡまたは対照であるβアクチンｃＤＮＡをプローブとして用い、全ＲＮＡ（１５ｍｇ）を調べた。 図２Ａおよび２Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞におけるＢＭＰ２発現を示す。図２Ａおよび２Ｂは、対照であるＮＩＨ３Ｔ３－メタロチオネイン（Ａ）およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞（Ｂ）を示す。パネル（Ｂ）の青色はＢＭＰ２蛋白質の発現を示す。 図３Ａ～３Ｄは部分的欠損を有するウサギに細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞）を注入したときの軟骨再生を示す。図３Ａおよび３Ｃは、ｈＣｈｏｎ（ヒト軟骨細胞）とＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｃ）のいずれかを大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図３Ｂおよび３Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ｂ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５。 図４Ａ～４Ｅは、全層欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞）を注入したときの軟骨再生を示す。図４Ａおよび４Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを大腿顆に注入後１２週間経た時点における写真を示す。図４Ｂおよび４Ｅは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（ＢおよびＣ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｅ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示し、図４ＣはサフラニンＯ染色を示す。原拡大率：（Ｂ、ＣおよびＥ）ｘ１２．５。 図５Ａ～５Ｄは、部分的欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞）を注入したときの軟骨再生を示す。図５Ａおよび５Ｃは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｃ）のいずれかを大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図５Ｂおよび５Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（Ｂ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５。 図６Ａ～６Ｅは、全層欠損のウサギにおいて細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞）を注入したときの軟骨再生を示す。図６Ａおよび６Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを大腿顆に注入後１２週間経た時点での写真を示す。図６Ｂおよび６Ｅは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（ＢおよびＣ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｅ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示し、図６ＣはサフラニンＯ染色を示す。原拡大率：（Ｂ、ＣおよびＥ）ｘ１２．５。 図７Ａ～７Ｄは、全層欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびヒト軟骨細胞－ＴＧＦ－β１細胞）を注入したときの軟骨再生を示す。図７Ａおよび７Ｃは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｃ）のいずれかを大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図７Ｂおよび７Ｄは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ｂ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。［原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５］。 図８Ａ～８Ｄは、部分的欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびヒト２９３－ＴＧＦ－β１細胞）注入による軟骨再生を示す。図８Ａおよび８Ｃは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（３：１の比）（Ａ）またはｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（５：１の比）（Ｃ）を大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図８Ｂおよび８Ｄは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の３：１の比の混合物（Ｂ）または５：１の比の混合物（Ｄ）を注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。［原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５］。

本明細書中の用語「患者」は、ヒトを含む動物界の構成員を含むが、ヒトのみに限定されるものではない。

形質転換細胞または形質導入細胞に関する、本明細書中の用語「哺乳動物細胞集団」は全ての種類の哺乳動物細胞を含み、特にヒト細胞を含み、そのような細胞としては、線維芽細胞または軟骨細胞などの結合組織細胞、または幹細胞、および特にヒト胚性腎細胞、さらに特定すれば、ヒト２９３胚性腎細胞、または上皮細胞が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。

本明細書中の用語「哺乳動物宿主」は、ヒトを含む動物界の構成員を含むが、ヒトのみに限定されるものではない。

本明細書中の用語「結合組織」は、他の組織または臓器を繋ぐあるいは支持する組織を意味し、哺乳動物宿主の靭帯、軟骨、腱、骨、および滑膜が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。

本明細書中の用語「結合組織細胞」および「結合組織の細胞」は、結合組織に存在する細胞を含み、膠質性細胞外マトリックスを分泌する線維芽細胞、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、および骨細胞（ｂｏｎｅ ｃｅｌｌｓ［骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）／骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ）］）、ならびに脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌｓ（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ））および平滑筋細胞などが挙げられる。好ましくは、結合組織細胞は線維芽細胞、軟骨細胞、および骨細胞である。本発明が、単一種類の細胞さらには結合組織細胞の混合培養を用いても実施し得ることは理解されるであろう。宿主生物において組織細胞が目的遺伝子を安定発現するように、関節腔に組織細胞を注入する前に該細胞を化合物または放射線照射で前処理してもよいことも理解される。好ましくは、宿主生物に注入した場合に、結合組織細胞は負の免疫応答を引き起こさない。これに関連して、細胞媒介遺伝子治療または体細胞療法には、自己細胞のみならず同種異系細胞を用いてもよいことは理解されるであろう。

本明細書中に記載の「結合組織細胞株」は共通の親細胞に由来する複数の結合組織細胞を含む。

本明細書中に記載の細胞の「減少」は、該部位における通常の量と比較して細胞集団が減少することを指す。これは細胞集団の％減少を意味するものであってもよく、該位置における正常細胞集団と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％などであり、あるいは該位置における細胞の損傷または枯渇を意味するものであってもよい。

本明細書中に記載の「ヘルパー細胞」は、目的遺伝子で形質転換または形質導入されている細胞と混合したヘルパー細胞を指す。該ヘルパー細胞自体は、目的遺伝子による形質転換または形質導入はされない。特に、目的遺伝子で形質転換または形質導入した細胞は、ヘルパー細胞を活性化する蛋白質を生成する。ヘルパー細胞を内因性に産生するが、投与の時点では減少している対象部位へこの混合物を投与することは、対象部位において利点のある有効な体細胞遺伝子治療となる。

一つの実施態様においては、「ヘルパー細胞」は、細胞混合物を作成するための結合組織細胞であって、形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した結合組織細胞を意味するものであってもよい。そのようなヘルパー細胞はいずれの結合組織細胞をも含み得る。一般に、これらの細胞は形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員をコードする遺伝子で形質転換または形質導入されない。特に、これらの細胞はいかなる遺伝子でも形質転換または形質導入を行わず、またこれらの細胞は通常、軟骨領域に局在する。典型的には、該細胞は線維芽細胞または軟骨細胞である。

本明細書中に記載される、ドナー細胞および受容宿主の「組織適合性」は、移植が宿主哺乳動物において受容されかつ機能的に維持されるように充分な種類の組織適合性因子を共有することを意味する。特に、該ドナーと受容者の組み合わせがヒト白血球抗原（ＨＬＡ）（ＨＬＡ－Ａ型、Ｂ型、およびＣ型（クラスＩ）ならびにＨＬＡ－ＤＲ型（クラスＩＩ）など）に関して適合すべきである。

本明細書中に記載の「硝子軟骨」は関節面を覆う結合組織を指す。硝子軟骨は、例えば、関節軟骨、肋軟骨、および鼻軟骨を含むが、これらのみに限定されるものではない。

特に、硝子軟骨は自己複製することが知られており、変形に応答して、より摩擦の少ない安定した動きにする。厚さ、細胞密度、マトリックス組成物および機械的特性に関しては、異なる関節に存在する硝子軟骨、あるいは同一関節内に存在する硝子軟骨であっても異なるのだが、一般的構造および機能に関しては同等である。硝子軟骨の機能を幾つか挙げるならば、圧迫に対する意外なほどの剛性、復元力、および体重負荷を分散する優れた能力、軟骨下骨でのピーク応力を最小化する能力、および高耐久性などがある。

肉眼的および組織学的に見れば、硝子軟骨は変形に抵抗する平滑で堅い表面である。軟骨の細胞外マトリックスは軟骨細胞を含むが、血管、リンパ管または神経は含まない。軟骨細胞とマトリックスとの間の相互作用を維持する精緻な高秩序構造は、代謝活性レベルを低く保ちながらも、硝子軟骨の構造と機能を維持する。参考文献：Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．、８０Ａ：１７９５－１８１２、１９９８には、硝子軟骨の構造と機能に関して詳細な説明があり、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。

本明細書中に記載の「注射可能」組成物は、多様な三次元足場構造、フレームワーク構造、メッシュ構造またはフェルト構造を含まない組成物であって、ここで該構造は細胞が接着可能で２層以上で増殖可能な材料または形態でできていてもよく、該構造物が一般的には埋め込みされるものであって注入されるものではない、組成物を指す。一つの実施態様においては、本発明の注入方法は典型的には注射筒によって実施される。しかし、目的の組成物の注入にはいかなる方法を用いてもよい。例えば、カテーテル、噴霧器、または温度依存性ポリマーゲルを用いることもできる。

本明細書中に記載の「混合細胞」または「細胞の混合物」または「細胞混合物」は、複数の細胞の組み合わせを指し、ここで該組み合わせは目的遺伝子で形質転換または形質導入されている第１の細胞集団を含み、ここで該目的遺伝子の発現がヘルパー細胞にとって有益であり、該ヘルパー細胞が第２の細胞集団である、細胞の組み合わせを指す。

本発明の一つの実施態様においては、混合細胞は形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員をコードする遺伝子またはＤＮＡで形質転換または形質導入されている細胞、および形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員をコードする遺伝子で形質転換または形質導入されていないヘルパー細胞を含む複数の哺乳動物細胞の組み合わせを意味してもよい。形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員をコードする遺伝子で形質転換または形質導入されていない細胞の、ＴＧＦスーパーファミリー遺伝子で形質転換または形質導入された細胞に対する比は、典型的には、約３～２０対１の範囲であってもよい。該範囲は約３～１０対１であってもよい。特に、該範囲は細胞数に関して約１０対１であってもよい。しかし、これらの細胞の組み合わせが部分または完全欠損関節において硝子軟骨を産生することにおいて効果的である限り、これらの細胞の比を特定範囲に固定する必要があるものではないことは理解される。

本明細書中に記載の「薬学的に許容され得る担体」は、本発明の組成物の送達効率を促進し組成物の効果を持続させる、当該技術分野において公知の担体を指す。

本明細書中に記載の「体細胞」または「細胞」は一般的には、卵または精子以外の身体の細胞を指す。

本明細書中に記載の「保存した」細胞は、関節腔に投与する前に、それぞれ個別にあるいは一緒に保存した混合細胞の組成物を意味する。該細胞は冷凍装置に保存されてもよい。あるいは、該細胞は液体窒素タンクまたは同等の保存装置で約－７０℃～約－１９６℃で凍結し、後に関節腔に投与するために該細胞を保存してもよい。該細胞は既知のプロトコルを用いて解凍してもよい。該細胞の生存率と効力が最大となる限り、凍結保存および解凍は多様な方法で実施することができる。

本明細書中に記載の用語「形質転換」および「形質導入」は、宿主細胞へＤＮＡを導入する特定の方法であって、導入後に受容細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる方法を意味する。本発明の実施においては、宿主細胞に外来遺伝子が導入され、宿主細胞中で外来遺伝子が安定発現する限り、宿主細胞に外来ＤＮＡを導入するいかなる方法（非ウイルス性の遺伝子導入法またはウイルスによる遺伝子導入法を含む）を用いてもよい。したがって、本明細書中に記載の用語「形質転換した」または「形質導入した」は、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム、ウイルス媒介など、細胞に遺伝子導入する方法であればいかなる方法をも含む。

本明細書中に記載の「形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー」は、構造的に関連する蛋白質であって、広範な胚発生期の分化過程に影響する蛋白質群を含む。本ファミリーは以下を含む：雄の正常な性発達に必要なミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５：１６７、１９９０）；背腹軸形成および成虫原基の形態形成に必要なショウジョウバエのデカペンタプレジック（ＤＰＰ）遺伝子産物（Ｐａｄｇｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５：８１－８４、１９８７）；卵の植物極の位置を特定するアフリカツメガエルのＶｇ－１遺伝子産物（Ｗｅｅｋｓら、Ｃｅｌｌ、５１：８６１－８６７、１９８７）；アフリカツメガエル胚において中胚葉形成と前部構造を誘導し得る（Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、６３：４８５、１９９０）アクチビン類（Ｍａｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１３５：９５７－９６４、１９８６）；およびデノボ軟骨形成および骨形成を誘導し得る（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１３１９８、１９９０）骨形成蛋白質（ＢＭＰ－２、３、４、５、６および７、オステオゲニン、ＯＰ－１などのＢＭＰ類）。ＴＧＦ－β遺伝子産物は多様な分化過程に影響し得るが、そのような分化過程としては脂質生成、筋形成、軟骨形成、造血、および上皮細胞分化が挙げられる（総説としては、Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ、４９：４３７、１９８７を参照のこと；本参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。

ＴＧＦ－βファミリーの蛋白質は、まず大型の前駆蛋白質として合成されるが、それに続いて、Ｃ末端からおおよそ１１０～１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターの部位で分解的蛋白質切断を受ける。これら蛋白質のＣ末端領域はいずれも構造的に関連しており、それぞれのファミリー構成員を相同性の程度にもとづいて異なる亜群に分類することができる。特定亜群内においては、相同性の範囲が７０％～９０％アミノ酸配列同一性であるが、亜群間の相同性はかなり低く、一般的には２０％～５０％の範囲に過ぎない。いずれの場合にも、活性種はＣ末端断片がジスルフィド架橋で二量体形成しているようである。これまでに研究されているファミリー構成員の大部分に関して、ホモ二量体種が生物学的に活性であることが分かっているが、インヒビン類（Ｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：７７９、１９８６）およびＴＧＦ－β類（Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、Ｃｅｌｌ、４８：４０９、１９８７）などの他のファミリー構成員に関しては、ヘテロ二量体も検出されているのだが、これらは各ホモ二量体とは異なる生物学的特性を有しているようである。

ＴＧＦ－β遺伝子スーパーファミリーの構成員としては、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β４（ニワトリ）、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β５（アフリカツメガエル）、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ショウジョウバエＤＰＰ、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、Ｖｇｒ１、ＯＰ－１／ＢＭＰ－７、ショウジョウバエ６０Ａ、ＧＤＦ－１、アフリカツメガエルＶｇｆ、ＢＭＰ－３、インヒビン－βＡ、インヒビン－βＢ、インヒビン－α、およびＭＩＳが挙げられる。これらの遺伝子については、Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：７５３－７９１、１９９８に説明があり、本参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

好ましくは、ＴＧＦ－β遺伝子スーパーファミリーの構成員は、ＴＧＦ－βおよびＢＭＰである。より好ましくは、該構成員はＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、またはＢＭＰ－７である。より好ましくは、該構成員はヒトまたはブタＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２である。

本明細書中に記載の「選択可能マーカー」としては、導入ＤＮＡを安定的に維持する細胞が発現する遺伝子産物であって、細胞に形態変換などの表現型変化の発現、あるいは酵素活性の発現を惹起させる遺伝子産物が挙げられる。形質転換または形質導入した遺伝子を発現する細胞の単離は、抗生物質またはその他の薬剤に対する抵抗性を付与する酵素活性を有するなどの選択可能マーカーをコードする第２の遺伝子を同一細胞に任意に導入することによって達成できる。選択可能マーカーの例としては、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシド系抗生物質（カナマイシン、ネオマイシンおよびジェネテシンなど）に対する抵抗性を付与するアミノグリコシドリン酸転移酵素、ハイグロマイシンＢリン酸転移酵素、キサンチン－グアニン・ホスホリボシル基転移酵素、ＣＡＤ（デノボにおけるウリジン生合成の最初の３種類の酵素活性を有する単一蛋白質（すなわち、カルバミルリン酸合成酵素、アスパラギン酸カルバミル転移酵素およびジヒドロオロターゼ）、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギン合成酵素が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｈａｐｔｅｒ、１６．１９８９）；本参考文献はその全体が本明細書に参照として組み入れられる。選択可能マーカーの使用は本発明の実施の要件でないことは理解される。実際、一つの実施態様においては、本発明の遺伝的構築物に選択可能マーカーが組み込まれていない。

本明細書中に記載の「プロモーター」は、活性があり真核細胞における転写を制御するいかなる配列のＤＮＡであってもよい。該プロモーターは、真核細胞および原核細胞のいずれか、または両方で活性があってもよい。好ましくは、該プロモーターは哺乳動物細胞において活性がある。該プロモーターは、構成的に発現するもの、あるいは誘導可能なものであってもよい。好ましくは、該プロモーターは誘導可能なものである。好ましくは、該プロモーターは外部刺激によって誘導可能なものである。より好ましくは、該プロモーターはホルモンまたは金属によって誘導可能なものである。最も好ましくは、該プロモーターはメタロチオネイン遺伝子プロモーターまたはグルココルチコイド類によって誘導可能なプロモーターである。同様に、「エンハンサー要素」も転写を制御するものであるが、ＤＮＡベクター構築物中に挿入することが可能であり、目的遺伝子の発現を促進するために本発明の構築物と共に用いることができる。

本明細書中に記載の用語「ＤＣ－ｃｈｏｌ」は、カチオン性コレステロール誘導体を含むカチオン性リポソームを意味する。該「ＤＣ－ｃｈｏｌ」分子は、第３級アミノ基、中程度の長さのスペーサーアーム（２原子）およびカルバモイルリンカー結合を含む（Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ．、１７９：２８０－２８５、１９９１）。

本明細書中に記載の「ＳＦ－ｃｈｏｌ」は、カチオン性リポソームの一種であると定義される。

リポソームに関連して用いられる、本明細書中に記載の用語「生物学的に活性な」は、機能的ＤＮＡおよび／または蛋白質を標的細胞に導入する能力を意味する。

核酸、蛋白質、その蛋白質断片または誘導体に関連して用いられる、本明細書中に記載の用語「生物学的に活性な」は、核酸配列またはアミノ酸配列の能力であって、野生型核酸または野生型蛋白質が発揮する既知生物学的機能を模倣する能力とであると定義される。

リポソーム送達に関する文脈で用いられる、本明細書中に記載の用語「維持」は、導入ＤＮＡが細胞中に存在し続ける能力を意味する。他の文脈においては、「維持」は治療効果を発揮するように標的ＤＮＡが標的細胞または組織に存在し続ける能力を意味する。

本発明は、細胞混合物を哺乳動物のそれが必要な部位に投与することを含むが、ここで哺乳動物の対象部位で発現させるべき目的遺伝子により第１の細胞集団を形質転換または形質導入する。体細胞遺伝子治療を実施する場合に、本発明は、目的遺伝子で形質転換または形質導入されていない第２の細胞集団であって、損傷または罹患した、あるいは弱体化した対象部位においてはその細胞が内因性に減少しており、内因性に生成させる、あるいは外から投与する第２の細胞集団型を活性化し増殖させるには、第２の細胞集団のみならず対象部位における目的遺伝子の発現活性化をも必要とする、第２の細胞集団の利用を提供する。

特に、本発明は目的とするＤＮＡ配列を哺乳動物宿主の哺乳動物細胞にエクスビボ導入およびインビボ導入する技術を開示する。該エクスビボ技術としては、標的哺乳動物細胞の培養、ＤＮＡ配列によるインビトロ形質転換または形質導入、目的のＤＮＡベクターまたはその他の導入媒体を哺乳動物細胞へ、その後、哺乳動物宿主の標的関節に改変哺乳動物細胞を移植して目的遺伝子産物をインビボ発現させることなどが挙げられる。

本発明の遺伝子治療プロトコルにおいて、足場またはフレームワークなどの物質と共に多様な外来組織を一緒に移植してもよいが、そのような足場または組織を本発明の注入システムに含めないことも可能であることは、理解されるべきである。好ましい一つの実施態様では、本発明は、細胞媒介遺伝子治療または体細胞療法において、形質転換または形質導入した哺乳動物細胞集団を関節腔に注入して関節腔内で外因性ＴＧＦスーパーファミリー蛋白質を発現させる簡単な方法を対象とする。

本明細書中に開示の、結合組織障害を治療する一つのエクスビボ法は、蛋白質または生物学的に活性なその断片をコードするＤＮＡ配列を含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターをまず作成することを含む。次に、この組換えベクターを用いてインビトロ培養哺乳動物細胞集団に感染させる、あるいは形質転換することにより、ベクターを含む哺乳動物細胞集団を得る。次に、この哺乳動物細胞を混合物としてあるいは関節内部で混合物が生じるように個別に関節腔に注入して、哺乳動物宿主の標的関節腔に移植すれば、その後、関節腔内で蛋白質または蛋白質断片が発現する。この目的とするＤＮＡ配列の発現は、結合組織障害に伴う少なくとも１種類の有害な関節病変を実質的に軽減するために有用である。

ヒト患者を治療するための細胞のソースは、自己細胞などの患者自身の細胞であってもよいが、細胞の組織適合性にかかわらず同種異系細胞ならびに異種細胞もまた利用され得ることは、当業者であれば理解するであろう。あるいは、本発明の一実施態様では、哺乳動物宿主に対して組織適合性のある同種異系細胞を利用してもよい。さらに詳細に説明すると、ドナーと患者の組織適合性を判定し、哺乳動物宿主に組織適合性の細胞を投与する。

より好ましくは、本方法は、該遺伝子として、形質転換増殖因子βスーパーファミリーの構成員またはその生物学的に活性な誘導体またはその断片、および選択可能マーカーまたはその生物学的に活性な誘導体またはその断片をコードし得る遺伝子を用いることを含む。

本発明のさらなる実施態様は、該遺伝子として、形質転換増殖因子βスーパーファミリーの少なくとも１つの構成員またはその生物学的に活性な誘導体またはその断片をコードし得る遺伝子を用いること、および該ＤＮＡプラスミドベクターとして、利用する導入方法にかかわらず、導入された場合に標的細胞または組織内で安定維持され得る、当業者に公知の任意のＤＮＡプラスミドベクターを用いることを含む。

本発明の別の一つの実施態様では、産物をコードする少なくとも１つの遺伝子を結合組織の少なくとも１つの細胞に導入する方法であって、ここで該細胞が哺乳動物宿主の治療する用途である、方法を提供する。本方法は結合組織細胞に該産物をコードする遺伝子を導入する非ウイルス性の方法を用いることを含む。より好ましくは、本方法はリポソームカプセル化、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはＤＥＡＥデキストラン媒介を含み、該遺伝子として、形質転換増殖因子スーパーファミリーの構成員またはその生物学的に活性な誘導体またはその断片、および選択可能マーカーまたはその生物学的に活性な誘導体またはその断片をコードし得る遺伝子を用いることを含む。

本発明の別の一つの実施態様では、産物をコードする少なくとも１つの遺伝子を哺乳動物組織の少なくとも１つの細胞を導入するさらに別の方法であって、ここで該細胞が哺乳動物宿主を治療する用途である、別の方法を提供する。この別の方法は、ＤＮＡベクター分子を標的細胞または組織に導入する目的のために、ウイルスを利用する生物学的手段を用いることを含む。好ましくは、該ウイルスは擬似ウイルスであり、擬似ウイルスの導入と標的細胞内安定維持だけが可能で、標的細胞または組織内で複製する能力は保持しないように、そのゲノムが改変されている。該ウイルスゲノムが標的細胞または組織内で発現する目的の異種遺伝子を含むＤＮＡベクター分子として働くように、組換えＤＮＡ技術によって該改変ウイルスゲノムをさらに操作する。

本発明の好ましい実施態様は、本明細書中に開示のエクスビボ技術とレトロウイルスベクターを用いてＴＧＦ－β遺伝子またはＢＭＰ遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織に導入することによりＴＧＦ－βまたはＢＭＰを標的関節腔に送達する方法である。言い換えると、機能的ＴＧＦ－β蛋白質またはＢＭＰ蛋白質、または蛋白質断片をコードする目的のＤＮＡ配列を選択した導入レトロウイルスベクターに組み込む。該形質導入哺乳動物細胞、好ましくは自己移植細胞を、哺乳動物細胞の非形質転換または非形質導入試料と共に関節内注射により対象関節に移植する。

本発明の別の一つの好ましい方法は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターのいずれかを利用した、ＴＧＦ－βスーパーファミリー遺伝子の哺乳動物宿主の結合組織へのインビボ直接送達を含む。言い換えると、機能的ＴＧＦ－βまたはＢＭＰ蛋白質または蛋白質断片をコードする目的のＤＮＡ配列をそれぞれのウイルスベクターに組み込む。次に、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰを含む組換えウイルスを適切な力価で増殖させ、関節腔内に、好ましくは関節内注射により導入する。

関節の標的結合組織にＤＮＡ分子を導入する方法としては、カチオン性リポソームへのＤＮＡ分子カプセル化、目的のＤＮＡ配列のレトロウイルスまたはプラスミドベクターへの組み込み、またはＤＮＡ分子自体の関節への直接注入が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。膝関節への導入形態にかかわらず、ＤＮＡ分子は、好ましくはＤＮＡベクター分子として、すなわち組換えウイルスＤＮＡベクター分子または組換えＤＮＡプラスミドベクター分子として導入される。目的の異種遺伝子の発現は、真核細胞で活性を示すプロモーター断片を異種遺伝子のコード領域上流に直接挿入することによって実現する。当業者であれば、結合組織へのＤＮＡ分子の導入後に適切な発現レベルを達成するために、ベクター構築の既知方略および技術を利用することができる。

好ましい一つの実施態様においては、後に遺伝子治療の送達システムとして利用する目的で哺乳動物細胞をインビトロ培養する。本出願者らが、開示の特定組織の利用に制限されるのでないことは明らかであろう。インビトロ培養技術に関しては、他の組織ソースも利用可能であろう。本発明の遺伝子を用いる方法は、予防的にも、変形性関節症および創傷治癒の治療にも両方に用いることができる。本発明が膝関節治療のみの予防的または治療的用途に限定されるものではないこともまた明らかであろう。本発明は易罹患性関節の変形性関節症または軟骨の断裂または劣化で起こる傷害における損傷の予防的または治療的処置に利用することが可能であろう。

本発明の別の一つの実施態様においては、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの蛋白質をコードする遺伝子および好適な薬学的担体を含む化合物であって、治療的有効量で患者に非経口投与する化合物を提供する。

本発明の別の一つの実施態様では、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの蛋白質をコードする遺伝子および好適な薬学的担体を含む化合物であって、予防有効量で患者に非経口投与する化合物を提供する。

本発明のさらなる実施態様においては、関節腔に投与する前に該細胞を保存する。形質転換または形質導入細胞単独で保存してもよく、または非形質転換ヘルパー細胞単独で保存してもよく、あるいはそれらを混合物として保存してもよいが、必ずしも同時である必要ない。さらに、保存期間は同一期間である必要はない。したがって、個別に保存した細胞を注入前に混合してもよい。あるいは、該細胞を保存し、関節腔内で細胞混合物が形成されるように個別に注入してもよい。これらの細胞を凍結保存剤（約１０％のＤＭＳＯの組成などが挙げられるが、これのみに限定されるのもではない）または同等の保存培地に入れ液体窒素中で凍結保存してもよいことは、当業者であれば理解するであろう。

本発明の別の一つの実施態様では、産物をコードする少なくとも１つの遺伝子を哺乳動物組織の少なくとも１つの細胞に導入する方法であって、ここで該細胞が上記の哺乳動物宿主を治療する用途である、方法であって、該産物をコードする遺伝子を含むウイルスベクターを直接、哺乳動物宿主に導入することによって該細胞をインビボ感染させることを含む方法を提供する。好ましくは、本方法は関節内注射により哺乳動物宿主に直接導入することを含む。本方法は、関節炎発症に関して高度易罹患性である哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に予防する方法の利用を含む。本方法はまた、関節炎を有する哺乳動物宿主に用いる治療用途の方法の利用を含む。さらに、本方法はまた、本明細書中の上記で定義した結合組織を修復および再生する方法の利用を含む。

リポソームを利用するウイルスベクターの場合には、レトロウイルスのような感染および哺乳動物細胞への内在化の要件としての細胞分裂の制限がないことは、当業者であれば理解するであろう。上記の非ウイルス性手段を用いる本方法は、該遺伝子として、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する構成員をコードすることが可能であり、任意に選択可能マーカー遺伝子（抗生物質抵抗性遺伝子など）を含む遺伝子を用いることを含む。また、選択可能マーカー遺伝子が本発明を実施するための要件ではないことも理解される。

本発明の別の一つの実施態様は本明細書中に開示の方法による、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの構成員をコードするＤＮＡ配列の哺乳動物宿主結合組織への導入であり、それにより軟骨などの結合組織を再生するためのコラーゲンをインビボで発現させる。

結合組織は、治療標的とするには困難な臓器である。当該技術分野において公知の静脈内あるいは経口経路での薬剤送達は、これら結合組織への到達が良好ではなく、また哺乳動物宿主の身体全体を治療剤に曝露する欠点を有する。より好ましくは、公知の蛋白質関節内注射法が関節への直接到達を提供する。しかし、カプセル化蛋白質形態である注射薬剤の大部分は関節内半減期が短い。本発明は、哺乳動物宿主の治療に用いることのできる蛋白質をコードする遺伝子を、哺乳動物宿主の結合組織に導入することにより、これらの問題を解決する。より好ましくは、本発明は、哺乳動物宿主の結合組織に抗関節炎特性を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入する方法を提供する。

本明細書中に記載される実施例においては、非形質導入軟骨細胞ヘルパー細胞と共に混合したＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞によって、関節におけるコラーゲン合成を刺激した。これら実施例においては、形質導入細胞対ヘルパー細胞の比は１：１０であり、２９３－ＴＧＦ－β１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞またはＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞、および非形質導入軟骨細胞ヘルパー細胞の混合物を２ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で関節へ注入した。注射後６～１２週間経た後に該試料を回収した。該細胞は関節内で自由に動き、これらの細胞に特異的親和性を有する部位へと移動する。滑膜欠損領域、半月板欠損領域および軟骨欠損領域は、細胞接着が可能な部位であり得る。注射後６週間、あるいは１２週間経た時点で、部分的損傷あるいは完全損傷した軟骨欠損領域の両方について該再生組織を観察した。この損傷領域への特異的親和性が、混合細胞を臨床応用するもう一つの利点である。足場またはその他の３次元構造物などの各種物理的基材を含むことなく関節に細胞を注入することのみで変性性関節炎が治癒するのであれば、患者は大手術を行わない利便性の高い治療を受けることができる。

作用機序がいかなるものであっても、また作用機序に関する特定の理論に拘束されことなく、本発明の混合細胞組成物を用いた硝子軟骨形成に関する所見は、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰが持続的に長期に高濃度であることによって硝子軟骨再生を刺激し得ることを示している。新たに形成された組織の特性を組織学的方法によって判定した。新たに形成された組織は周囲の硝子軟骨と同一であることが、マッソンのトリクローム染色およびサフラニンＯ染色によって示された（図３～７）。

以下の実施例は本発明を具体的に説明する目的において示すものであり、本発明を限定するものではない。

実施例
実施例１：材料と方法
プラスミド構築
ＴＧＦ－β１コード配列を含む１．２ｋｂのＢｇｌＩ断片であって、その３’末端に成長ホルモンのポリＡ部位を含むＢｇｌＩ断片を、ｐＭＴＭＬＶのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＭＴＭＬＶβ１を作成した。ＢＭＰ２のコード配列を含む１．２ｋｂのＳａｌＩ－ＮｏｔＩ断片をｐＭＴＭＬＶのＳａｌＩ－ＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＭＴＢＭＰ２を作成した。ｐＭＴＭＬＶベクターは、レトロウイルスベクターＭＦＧからｇａｇ配列およびｅｎｖ配列の全長、ならびにΨパッケージ配列の一部を欠失させたものである。

細胞培養および形質導入
レトロウイルスベクターにクローニングしたＴＧＦ－βおよびＢＭＰ－２ ｃＤＮＡを線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ－２）および哺乳動物細胞（２９３－ＴＧＦ－β１）に個々に形質導入した。細胞を１０％濃度のウシ胎仔血清を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で培養した。

導入遺伝子配列を有する細胞を選択するため、ネオマイシン（３００μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。ＴＧＦ－β１およびＢＭＰ－２を発現する細胞を適時、液体窒素で保存し、注入の直前に培養した。

ＴＧＦ－β遺伝子による形質転換はリン酸カルシウム共沈法を用いて行った（図１）。生存コロニーの約８０％が導入遺伝子ｍＲＮＡを発現した。選択したこれらＴＧＦ－β１産生性細胞を硫酸亜鉛溶液中でインキュベートした。１００ｍＭ硫酸亜鉛溶液で培養した場合に、該細胞はｍＲＮＡを産生した。ＴＧＦ－β分泌速度は約３２ｎｇ／１０^６細胞／２４時間であった。

ＢＭＰ２のｃＤＮＡを含むレトロウイルスベクターに感染させたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞が、生物学的に活性なＢＭＰ２蛋白質を産生するか否かを試験して確認するために、対照ＮＩＨ３Ｔ３－メタロチオネイン細胞（図２Ａ）およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞（図２Ｂ）を用いてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイを行った。図２Ｂの青色はＢＭＰ２蛋白質発現を示している。

１．５ｘ１０^６個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を６穴組織培養プレートで一晩、増殖させた。表記の細胞０．５ｘ１０^５個（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１）を組織培養挿入槽（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ）に入れ、一晩、増殖させた。培養挿入槽から培地を吸引し、培養挿入槽を６穴プレートに移して４８～７２時間インキュベートした。培養挿入槽から培地を吸引した。５ｍｌの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して細胞を洗浄した。３．７％ホルムアルデヒド／１Ｘ ＰＢＳ溶液を４ｍｌそれぞれの挿入槽に加えて、細胞を４℃で２０分間固定した。細胞を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄した。３ｍｌのＡＬＰ染色溶液をそれぞれの挿入槽に加え、青色発色させるために挿入槽を暗所に置き、室温で約２０分から１時間インキュベートした。ＡＬＰ染色溶液は、０．１ｍｇ／ｍｌナフトールＡＳ－ＭＸリン酸（Ｓｉｇｍａ Ｎ５０００）、０．５％ ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ Ｄ８６５４）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ Ｆ３３７８）を含む０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）である。

実施例２：実験方法と結果
ウサギ関節軟骨欠損における再生：動物試験には体重２．０～２．５ｋｇのニュージーランドホワイトウサギを選択した。これらのウサギは成熟しており、タイドマークを有していた。膝関節を露出させて、大腿顆の硝子軟骨層に手術用メスで部分的な軟骨欠損（３ｍｍｘ６ｍｍ、深度１～２ｍｍ）または全層欠損（３ｍｍｘ６ｍｍ、深度２～３ｍｍ）を作成した。対照ヒト軟骨細胞（ｈＣｈｏｎ）、またはｈＣｈｏｎおよびＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物、またはｈＣｈｏｎおよびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物のいずれかをウサギの欠損膝関節に注入した。これらの細胞（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを１５～２０μｌ）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。全層欠損ウサギにｈＣｈｏｎおよびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物を注入した実験においては、欠損作成後３週間経た時点でこれらの混合細胞組成物を欠損部に注入した。細胞注入後６週または１２週の時点で、大腿顆を回収して調べた。

部分的欠損ウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞）注入による軟骨再生
対照ｈＣｈｏｎまたはｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物を含む組成物のいずれかを、大腿顆において部分的な軟骨欠損（３ｍｍｘ５ｍｍ、深度１～２ｍｍ）を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを１５～２０μｌ、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１の比は１０：１）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。注入後６週間経た時点で試料を回収し顕微鏡観察した。図３Ａおよび３Ｃは、ｈＣｈｏｎおよびＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｃ）のいずれかを大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図３Ｂおよび３Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ｂ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）を注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。［原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５］。

全層欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞）注入による軟骨再生
対照ｈＣｈｏｎまたはｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物のいずれかを、大腿顆において軟骨全層欠損（３ｍｍｘ５ｍｍ、深度２～３ｍｍ）を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを２０～２５μｌ、ＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１の比は１０：１）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。注入後１２週間経た時点で試料を回収し顕微鏡観察した。図４Ａおよび４Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを大腿顆に注入後１２週間経た時点における写真を示す。図４Ｂ、４Ｃおよび４Ｅは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（ＢおよびＣ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｅ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色（ＢおよびＥ）およびサフラニンＯ染色（Ｃ）したものを示す。［原拡大率：（Ｂ、ＣおよびＥ）ｘ１２．５］。

部分的欠損ウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ－２細胞）注入による軟骨再生
対照ｈＣｈｏｎまたはｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物のいずれかを、大腿顆において部分的な軟骨欠損（３ｍｍｘ５ｍｍ、深度１～２ｍｍ）を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを１５～２０μｌ、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ－２の比は１０：１）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。注入後６週間経た時点で試料を回収し顕微鏡観察した。図５Ａおよび５Ｃは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｃ）のいずれかを大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図５Ｂおよび５Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（Ｂ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。［原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５］。

全層欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ－２細胞）注入による軟骨再生
対照ｈＣｈｏｎまたはｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物のいずれかを、大腿顆において軟骨全層欠損（３ｍｍｘ５ｍｍ、深度２～３ｍｍ）を含むウサギの膝関節に注入した。この試験では、欠損作成後３週間経た時点で細胞注入を行った。細胞混合物（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを２０～２５μｌ、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ－２の比は１０：１）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。注入後６週間経た時点で試料を回収し顕微鏡観察した。図６Ａおよび６Ｄは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを大腿顆に注入後１２週間経た時点での写真を示す。図６Ｂおよび６Ｅは、ｈＣｈｏｎとＮＩＨ３Ｔ３－ＢＭＰ２細胞の混合物（ＢおよびＣ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｅ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示し、図６ＣはサフラニンＯ染色を示す。［原拡大率：（Ｂ、ＣおよびＥ）ｘ１２．５］。

全層欠損のウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびヒト２９３－ＴＧＦ－β１細胞）注入による軟骨再生
対照ヒト軟骨細胞（ｈＣｈｏｎ）またはｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物のいずれかを、大腿顆において軟骨全層欠損（３ｍｍｘ５ｍｍ、深度２～３ｍｍ）を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを２０～２５μｌ、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１の比は１：１）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。注入後６週間経た時点で試料を回収し顕微鏡観察した。図７Ａおよび７Ｃは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ａ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｃ）のいずれかを大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図７Ｂおよび７Ｄは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（Ｂ）またはｈＣｈｏｎ単独（Ｄ）のいずれかを注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。［原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５］。

部分的欠損ウサギにおける細胞混合物（ヒト軟骨細胞およびヒト２９３－ＴＧＦ－β１細胞）注入による軟骨再生
ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物を、大腿顆において部分的な軟骨欠損（３ｍｍｘ５ｍｍ、深度１～２ｍｍ）を含むウサギの膝関節に注入した。細胞混合物（２ｘ１０^６細胞／ｍｌを１５～２０μｌ、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１の比は３：１または５：１）を欠損の上部に、次に欠損の左側に注入して、縫合前に１５～２０分間、細胞を創傷部へ浸透させた。注入後６週間経た時点で試料を回収し顕微鏡観察した。図８Ａおよび８Ｃは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（３：１の比）（Ａ）またはｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の混合物（５：１の比）（Ｃ）を大腿顆に注入後６週間経た時点での写真を示す。図８Ｂおよび８Ｄは、ｈＣｈｏｎと２９３－ＴＧＦ－β１細胞の３：１の比の混合物（Ｂ）または５：１の比の混合物（Ｄ）を注入した大腿顆の切片をマッソンのトリクローム染色したものを示す。［原拡大率：（ＢおよびＤ）ｘ１２．５］。

本明細書中に引用した全ての参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。

本発明の特定の実施態様は具体的例示を目的として上記に説明されているが、付属の特許請求項によって特定される本発明から逸脱することなく本発明の細部に多数の変更がなされ得ることは、当業者にとっては明白なことであろう。

Claims (32)

1. 標的部位において硝子軟骨を生成させるための混合細胞組成物であって、該組成物が：
   （ａ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
   （ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団；
   および
   （ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
   を含み、
   ここで第２の哺乳動物細胞集団に内在する形態が標的部位においては減少しており；
   ここで標的部位における第１の哺乳動物細胞集団による治療用蛋白質の生成が、第２の細胞集団による治療効果の誘導を刺激し；
   ここでＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団の、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団に対する比が約１～２０対１である、混合細胞組成物。
2. 請求項１の混合細胞組成物であって、ここで該組成物が注射可能組成物である、混合細胞組成物。
3. 請求項１の混合細胞組成物であって、ここで（ｂ）において該第２の哺乳動物細胞集団がＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない線維芽細胞または軟骨細胞である、混合細胞組成物。
4. 請求項３の混合細胞組成物であって、ここで該第２の哺乳動物細胞集団が軟骨細胞である、混合細胞組成物。
5. 請求項４の混合細胞組成物であって、ここで（ａ）において該第１の細胞集団がヒト胚性腎細胞または上皮細胞である、混合細胞組成物。
6. 請求項５の混合細胞組成物であって、ここで該第１の細胞集団がヒト胚性腎細胞である、混合細胞組成物。
7. 請求項１の混合細胞組成物であって、ここで該遺伝子がＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２である、混合細胞組成物。
8. 請求項１の混合細胞組成物であって、ここで該比が約１～１０対１である、混合細胞組成物。
9. 請求項８の混合細胞組成物であって、ここで該比が約１～３対１である、混合細胞組成物。
10. 請求項１の混合細胞組成物であって、ここでＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の細胞集団が放射線照射される、混合細胞組成物。
11. 請求項１の混合細胞組成物であって、ここで該第１の細胞集団と該第２の細胞集団が同一のまたは異なるソースの生物に由来する、混合細胞組成物。
12. 哺乳動物の標的部位において硝子軟骨を生成させる方法であって、該方法が：
    （ａ）制御可能にプロモーターに連結されたＤＮＡ配列であって、ＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作成すること；
    （ｂ）哺乳動物細胞集団を該組換えベクターでインビトロ形質転換または形質導入すること；
    および
    （ｃ）蛋白質生成有効量の：
    （ｉ）ＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団；
    （ｉｉ）該遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団；
    および
    （ｉｉｉ）薬学的に許容され得るその担体、
    を含む混合細胞組成物を該標的部位に注入すること、
    を含み、
    ここで第２の哺乳動物細胞集団に内在する形態が標的部位においては減少しており、
    ここで標的部位における第１の哺乳動物細胞集団による治療用蛋白質の生成が、第２の細胞集団による治療効果の誘導を刺激し、
    ここでＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の哺乳動物細胞集団の、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１の哺乳動物細胞集団に対する比が、約１～２０対１である、方法。
13. 請求項１２の方法であって、ここで工程（ｃ）（ｉ）において、該第１の哺乳動物細胞集団がヒト胚性腎細胞または上皮細胞である、方法。
14. 請求項１３の方法であって、ここで該第１の哺乳動物細胞集団がヒト胚性腎細胞である、方法。
15. 請求項１２の方法であって、ここで工程（ｃ）（ｉｉ）において、該第２の哺乳動物細胞集団が軟骨細胞である、方法。
16. 請求項１２の方法であって、ここで該遺伝子がＴＧＦ－β１またはＢＭＰ－２をコードする、方法。
17. 請求項１２の方法であって、ここでＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない該第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団の、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の哺乳動物細胞集団に対する比が約３～２０対１である、方法。
18. 請求項１７の方法であって、ここで該比が約３～１０対１である、方法。
19. 請求項１８の方法であって、ここで該比が約１０対１である、方法。
20. 請求項１９の方法であって、ここでＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団が放射線照射される、方法。
21. 請求項１２の方法であって、ここでＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の哺乳動物細胞集団と、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の線維芽細胞集団または軟骨細胞集団が、受容宿主に関して同系または異種である、方法。
22. 請求項１２の方法であって、ここで該組換えベクターがウイルスベクターである、方法。
23. 請求項１２の方法であって、ここで該組換えベクターがプラスミドベクターである、方法。
24. 請求項１２の方法であって、ここで該細胞が移植前に保存される、方法。
25. 請求項２４の方法であって、ここで該細胞が移植前に凍結保存剤に保存される、方法。
26. 請求項１２の方法であって、ここで該形質転換または形質導入が、リポソームカプセル化、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン媒介またはウイルス媒介によって達成される、方法。
27. 変形性関節症を治療する方法であって、該方法が：
    （ａ）プロモーターに制御可能に連結されたＤＮＡ配列であって、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）または骨形成蛋白質（ＢＭＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを作成すること；
    （ｂ）哺乳動物細胞集団を該組換えベクターでインビトロ形質転換または形質導入すること、
    および
    （ｃ）硝子軟骨形成有効量かつ変形性関節症治療有効量の：
    （ｉ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１のヒト胚性腎細胞集団または上皮細胞集団；
    （ｉｉ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の軟骨細胞集団；
    および
    （ｉｉｉ）非生物性３次元構造物ではない薬学的に許容され得るその担体、
    を含む注射可能混合細胞組成物を哺乳動物の関節腔に注入すること、
    を含み、それにより関節腔内でＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードするＤＮＡ配列の発現が起こり、その結果、関節腔内において骨および軟骨組織の形成が起こり、
    ここでＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない該第２の哺乳動物細胞集団の、ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入した該第１の哺乳動物細胞集団に対する比が約１～２０対１である、方法。
28. 請求項２７の方法であって、ここで（ｃ）（ｉ）において、該第１の細胞集団がヒト胚性腎細胞である、方法。
29. 注射可能混合細胞組成物であって、該組成物が、硝子軟骨形成効果的量で、かつ変形性関節症治療量の：
    （ａ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）または骨形成蛋白質（ＢＭＰ）をコードする遺伝子で形質転換または形質導入した第１のヒト胚性腎細胞集団または上皮細胞集団；
    （ｂ）ＴＧＦ－βまたはＢＭＰをコードする遺伝子で形質転換または形質導入していない第２の軟骨細胞集団；
    および
    （ｃ）薬学的に許容され得るその担体、
    を含む、注射可能混合細胞組成物。
30. 請求項２９の混合細胞組成物であって、ここで該第１の細胞集団がヒト胚性腎細胞である、混合細胞組成物。
31. 約－７０℃～約－１９６℃の温度で細胞を保存する保存容器であって、請求項１の注射可能混合細胞組成物を含む、保存容器。
32. 約－７０℃～約－１９６℃の温度で細胞を保存する保存容器であって、請求項２９の注射可能混合細胞組成物を含む、保存容器。

Images