KR100702725B1

KR100702725B1 - Ｔｇｆ-베타를 사용하는 유전자 요법

Info

Publication number: KR100702725B1
Application number: KR1020017013987A
Authority: KR
Inventors: 노문종; 강경애; 이관희
Original assignee: 티슈진, 인코포레이티드
Priority date: 1999-05-03
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2007-04-03
Also published as: WO2000066177A1; CN1371289A; JP4592186B2; CA2373045A1; JP2002542801A; JP4547446B2; EP1175228A1; CN1371289B; CA2373045C; CN101972275A; JP2007008950A; JP4188986B2; JP2009019039A; AU4424200A; EP1175228A4; KR20020036943A; AU778047B2

Abstract

본 발명은 형질전환성장인자 슈퍼패밀리-β(TGF-β)에 속하는 구성원을 사용하여 정형외과적 질환용 세포-매개 유전자 요법에 관한 것이다. 퇴행성 관절염용의 새로운 치료법으로서 TGF-β유전자 요법이 증명된다. TGF-βcDNA 발현 벡터를 섬유아세포(NIH 3T3-TGF-β1)내로 형질감염시킨 후, 세포를 인공-제조된 연골 결합을 갖는 래빗의 아킬레스건 및 무릎 관절에 주사하였다. 건내 주사를 수행하여 생체내 발현을 위한 최적 농도를 측정하였다. 부분적으로 결함된 연골을 제조하여 무릎 관절의 퇴행성 관절염을 자극시켰다. 세포-매개 유전자 요법 방법으로 처리된 부분 결함 연골은 새로 형성된 유리질 연골에 의해 피막되었고, 이것은 이 부위에서 세포는 생존하고 기질 형성을 자극한다는 것을 나타낸다. 완전 노출된 연골 부위는 섬유성 연골에 의해 피막되었다.

Description

ＴＧＦ-베타를 사용하는 유전자 요법{Gene therapy using TGF-β}

본 발명은 포유류 숙주에서 결합조직을 재생시킬 때 유용한, 형질전환성장인자 β 슈퍼패밀리(transforming growth factor β)의 구성원을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 포유류의 결합조직내로 도입시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 형질전환성장인자 β 슈퍼패밀리의 구성원을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터 분자를 포함하는 결합조직 세포주에 관한 것이다.

정형외과학 분야에서, 퇴행성 관절염 또는 골관절염이 가장 빈번하게 발생하는 연골 손상과 연관된 질환이다. 신체에 거의 모든 관절, 예를 들면, 무릎, 둔부, 어깨, 및 심지어 손목이 영향을 받는다. 이 질환의 발생기전은 유리질 관절 연골(hyaline articular cartilage)의 퇴행이다(Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A: 460-466, 1982). 관절의 유리질 연골은 변성되고, 섬유성연축화되고(fibrillate), 최종적으로 함요화(excavation)된다. 퇴화된 연골을 재생시킬 수 있다면, 대부분의 환자들은 통증없이 그들의 삶을 즐길 수 있을 것이다. 현재까지 손상된 유리질 연골을 재생시키는 방법에 대하여 보고된 바 없다.

약물을 관절로 전달시키는 통상의 약물 전달 루트, 예를 들면, 경구, 정맥 또는 근육내 투여는 비효율적이다. 관절내로 주사된 약물의 반감기는 일반적으로 짧다. 관절내로의 약물 주사의 또다른 단점은 관절염과 같은 만성 이상 치료를 위해서는 관절 간극(space)에 허용가능한 약물 수준을 얻기 위하여 자주 반복적으로 주사하여야 한다는 것이다. 현재까지는 치료제를 선택적으로 관절로 표적화할 수 없었기 때문에, 지속적인 관절내 치료량을 얻기 위하여 고농도의 약물을 포유류 숙주에 전신 노출시켜야 했다. 이 방법에서 비-표적 기관의 노출은 항-관절성 약물의 소인(tendency)을 악화시켜 급성위장관연동이상항진과 같은 심각한 부작용 및 포유류 숙주의 혈액계, 심장 혈관계, 간계 및 신장계의 변화를 초래하였다.

정형외과학 분야에서, 일부의 사이토카인이 정형외과성 질환의 치료를 위한 캔디데이트(candidate)로서 주목받아 왔다. 골형성 단백질이 골형성의 유효한 촉진제로서 주목되었고(Ozkaynak et al., EMBO J, 9:2085-2093, 1990; Sampath and Rueger, Complications in ortho, 101-107, 1994), THF-β가 골형성 및 연골형성의 촉진제로서 보고되어 왔다(Joyce et al., J Cell Biology, 110:2195-2207, 1990).

형질전환성장인자-β(TGF-β)는 다기능 사이토카인으로 주목받고 있고(Sporn and Roberts, Nature(London), 332:217-219, 1998), 세포 성장, 분화 및 세포외기질 단백질 합성에서 조절 작용을 한다(Madri et al., J Cell Biology, 106: 1375-1384, 1988). TGF-β는 시험관내에서 상피세포 및 파골성 세포의 성장을 억제시키지만(Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85:5683-5687, 1988), 그것은 생체내에서 는 연골내골화 및 결과적으로 골형성을 자극시킨다(Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5):553-556, 1993; and Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994). TGF-β가 최종적으로는 연골-형성 세포로 분화되 는 골막하 다중성 세포를 자극하여 TGF-β-유도성 골형성을 조정한다(Joyce et al., J Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990, and Miettinen et al., J Cell Biology, 127-6: 2021-2036, 1994).

정형외과학에서 TGF-β의 생물학적 효능이 보고되었다(Andrew et al., Calcif Tissue In. 52:74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37:573-579, 1993; Carrington et al., J Cell Biology, 107:1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5):553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994). 마우스의 배에서 염색(staining)은 TGF-β가 간엽으로부터 유래된 조직, 예를 들면, 결합조직, 연골 및 뼈와 밀접하게 관련되어 있음을 나타낸다. 발생학적 소견외에도, TGF-β는 골형성 및 연골 형성 부위에 존재한다. 그것은 또한 래빗의 경골에서 골절 치료를 증진시킬 수 있다. 최근, TGF-β의 치료적 가치가 보고되었으나(Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; and Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993), 그것의 단기간의 효능 및 높은 비용으로 광범위한 임상 적용을 제한되었다.

주사된 TGF-β는 생체내에서 불활성 형태로 분해되어 짧은 작용지속기간을 갖기 때문에, 관절염 치료를 위해 TGF-β를 관절내로 주사하는 것은 바람직하지 못하다. 그러므로, 유리질 연골을 재생시키기 위하여 TGF-β를 장기간동안 방출하는 새로운 방법이 요구된다.

연골 세포를 자가이식시켜 관절 연골을 재생시킨 기록이 있으나(Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889-895, 1994), 이 방법은 연조직을 넓게 절제하는 두개의 수술을 포함한다. 관절내 주사가 퇴행성 관절염의 치료를 위해 충분하다면, 그것은 환자에게 있어 경제적 및 신체적으로 매우 유익할 것이다.

특정 단백질을 특정 부위로 전이시키는 방법인 유전자 요법이 이 문제점에 대한 해결책일 수 있다(Wolff and Lederberg, Gene Therapeutics ed. Jon A. Wolff, 3-25, 1994; and Jenks, J Natl Cancer Inst, 89(16): 1182-1184, 1997).

미국 특허 제 5,858,355 호 및 제 5,766,585 호에 IRAP(인터루킨-1 수용체 길항제 단백질(interleukin-1 receptor antagonist protein)) 유전자의 바이러스 또는 플라스미드 작제물을 제조하고; 활막세포(미국 특허 제 5,858,355 호) 및 골수 세포(제 5,766,585 호)를 상기 작제물로 형질감염(transfection)시키고; 형질감염된 세포를 래빗의 관절내로 주사하는 것이 공개되어 있지만, TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 유전자를 사용한 결합조직의 재생에 대한 기록은 없다.

미국 특허 제 5,846,931 호 및 제 5,700,774 호에는 TGF-β "슈퍼패밀리"에 속하는 골형성 단백질(bone morphogenesis protein(BMP))을 포함하는 조성물을 절단된 부갑상선 호르몬 연관 펩티드와 함께 주사하여 연골조직 형성을 유지시키고, 연골조직을 유도하는 것이 공개되어 있다. 그러나, BMP 유전자를 사용하는 유전자 요법에 대한 기록은 없다.

이들 선행 기술의 공개에도 불구하고, 포유류 숙주 치료시 유용한, 시험관내에서, 또는 대안으로 생체내에서 산물을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 포유류 숙주의 결합조직 세포에 도입시키는 방법이 매우 실제적이고 본질적으로 요구되고 있다. 또한, 포유류 숙주에서 결합조직을 재생시키기 위해 형질전환 성장인자 β슈퍼패밀리의 구성원을 코딩하는 유전자를 사용하는 방법도 요구된다. 더욱 특히, 생체내 숙주 결합조직 세포에서 형질전환성장인자 β슈퍼패밀리 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키는 방법이 요구된다.

발명의 요약

본 발명은 앞서 기재된 요구를 충족시킨다. 본 발명에서 포유류 숙주 치료시 유용한, 산물을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 포유류 결합조직세포에 도입시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 재조합 기술을 사용하여 산물을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터 분자를 제조하고 산물을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터 분자를 결합조직 세포내로 도입시키는 것을 포함한다. DNA 벡터 분자는 표적 세포 또는 조직내 전달되고 유지되어 관심의 대상이 되는 산물을 코딩하는 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 어느 DNA 분자일 수 있다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 DNA 벡터 분자는 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터 분자이다. 이 방법은 바람직하게 치료용으로 산물을 코딩하는 유전자를 포유류의 결합조직 세포내로 도입시키는 것을 포함한다.

본 발명은 하기를 포함하는 관절염 치료법에 관한 것이다:

a) 프로모터에 작동가능하도록 연결된, 형질전환성장인자 슈퍼패밀리 단백질의 구성원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 생성시키고;

b) 시험관내에서 배양된 결합조직 세포 군집을 상기 재조합 벡터로 형질감염시켜, 형질감염된 결합조직 세포 군집을 수득하고;

c) 관절염이 있는 관절에 대한 관절내 주사에 의해 상기 형질감염된 결합조직 세포를 포유류 숙주의 관절염이 있는 관절 간극(arthritic joint space)에 이식시킴으로써, 상기 관절 간극내에서 상기 DNA 서열을 발현시켜 결합조직을 재생시킨다.

재조합 벡터는 제한되는 것은 아니지만, 레트로바이러스 벡터, 바람직하게 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 또한 플라스미드 벡터일 수 있다.

본 발명의 방법은 형질감염된 결합조직 세포 군집을 이식시키기 전에 저장하는 것을 포함한다. 상기 세포들을 이식시키기 전에 액체 질소하의 10% DMSO내에 저장할 수 있다.

결합조직 세포는 제한되는 것은 아니지만, 섬유아세포(fibroblast cells), 간엽세포(mesenchymal cells), 조골세포(osteoblasts), 또는 연골세포 (chondrocytes)를 포함한다. 섬유아세포는 NIH 3T3 세포 또는 인간 포피(foreskin) 섬유아세포일 수 있다.

결합조직은 또한, 제한하는 것은 아니지만, 연골, 인대 또는 건(tendon)을 포함한다. 연골은 유리질 연골일 수 있다.

본 발명의 방법은 형질전환성장인자 β(TGF-β)를 포함하는 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원을 사용한다. 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7일 수 있다. 바람직하게, TGF-β는 인간 또는 돼지의 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3이다.

본 발명은 또한 하기를 포함하는 유리질 연골 재생 방법에 관한 것이다:

c) 상기 형질감염된 결합조직 세포를 관절내 주사에 의해 포유류 숙주의 관절 간극에 이식시킴으로써, 상기 관절 간극내에서 상기 DNA 서열을 발현시켜 유리질 연골을 재생시킨다.

형질감염 방법은 예를 들면 리포솜 캡슐화(encapsulation), 인산칼슘 공침 (coprecitation), 전기천공(electroporation) 및 DEAE-덱스트란 매개(DEAE-dextran mediation)와 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 방법은 바람직하게 플라스미드 pmTβ1을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 결합조직 세포주에 관한 것이다. 결합조직 세포주는 제한되는 것은 아니지만, 섬유아세포주, 간엽세포주, 연골세포주, 조골세포주, 또는 골세포주를 포함한다. 섬유아세포주는 NIH 3T3 세포주 또는 인간 포피 섬유아세포주일 수 있다.

본 발명의 따른 결합조직 세포주는 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원을 포함한다. 바람직하게, 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7이다. 더욱 바람직하게, 구성원은 인간 또는 돼지의 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3이다.

본 발명의 결합조직 세포주는 또한 재조합 백터 pmTβ1을 포함하는 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 이들 및 또다른 목적은 본 발명의 명세서, 본 명세서에 첨부된 참조 도면 및 청구범위로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 TGF-β1 mRNA의 발현을 나타낸다. 총 RNA를 아연의 존재 또는 부재에서 배양된 NIH 3T3 세포 또는 pmTβ1로 안정하게 형질감염된 NIH 3T3 세포로부터 분리하였다. 총 RNA(15mg)를 TGF-β1 cDNA 또는 대조군으로서 β액틴 cDNA으로 프로빙(probing)하였다.

도 2A-2B는 재생된 연골의 전체적인 소견을 나타낸다.

2A에서, 대퇴 관절융기(femoral condyle)상에 직사각형 모양으로 부분적으로 연골 결함시키고, TGF-β1 형질감염되지 않은 NIH 3T3 세포를 무릎 관절에 주사하였다. 결함은 피막되지 않았다.

2B에서, NIH 3T3 -TGF-β1 세포 주사 후 6주째, 상기 결함은 새로 형성된 조직에 의해 피막되었다. 재생된 조직의 색은 주위 연골의 것과 거의 동일하였다.

도 3A-3D는 재생된 연골의 현미경적 소견(x 200)을 나타낸다.

3A 및 3B에서, 대조군 세포 주사 후 4 및 6주째, 결함 부위를 헤마톡실린-에오신법(H&E)으로 분석하였다. 초기의 결함 부위는 조직으로 피막되지 않았다.

3C 및 3D에서, TGF-β1 -형질감염된 세포 주사 후 4 및 6주째, 결함 부위를 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 분석하였다. TGF-β1 -형질감염된 세포 주사 후 4주째, 부분 결함 부위가 유리질 연골에 의해 피막되었다. 주사 후 4주 및 6주째, 재생된 조직은 더욱더 비후되었고 6주째에 그의 높이는 정상 연골과 거의 동일하였다. 조직학적으로, 재생된 연골(화살표)은 주위 유리질 연골과 동일하였다.

도 4A-4B는 래빗 관절에서 TGF-β1 발현에 대한 면역조직화학적 분석을 나타낸다(x 200).

갈색의 면역과산화효소 반응 생성물은 NIH 3T3 -TGF-β1 세포에서 고수준의 재조합 TGF-β1 발현을 나타낸다(4B).

4A는 대조군 세포를 주사한 래빗 관절에서 유리질 관절을 나타낸다.

도 5A-5B는 H&E 염색(A) 및 사프라닌-O 염색(B)을 사용한 재생된 조직의 현미경적 소견(x 200)을 나타낸다.

5A에서 부분 손상된 부위에서 재생된 유리질 연골은 H&E 염색법(검은색 화살표)에 의해 표시된다.

5B에서 완전 노출된 연골 부위에서 재생된 조직(백색 화살표)은 섬유성 콜라겐이다.

도 6은 pmTβ1의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 7A-7D는 TGF-β1 형질 감염 세포로 주사한 래빗 아킬레스건의 전체 형태를 나타낸다.

7A는 대조군 세포를 주사한 건이다.

7B는 TGF-β1 형질감염된 세포 주사 후 6주째의 건이다.

7C는 7A에서 도시화된 건의 단면이다.

7D는 7B에서 도시화된 건의 단면이다.

도 8A-8F는 H&E 염색을 사용하여 래빗 아킬레스건에서 재생된 조직의 현미경적 소견을 나타낸다.

8A, 8B 및 8C는 대조군 세포 주사후 6주째 건을 나타낸다. 8A의 확대율은 x 50이다. 8B의 확대율은 x 200이다. 8C의 확대율은 x 600이다.

8D, 8E 및 8F는 TGF-β1 형질감염된 세포 주사 후 6주째의 건을 나타낸다. 8D의 확대율은 x 50이다. 8E의 확대율은 x 200이다. 8F의 확대율은 x 600이다. 건내로 주사된 TGF-β1 형질감염된 세포는 내인성 건 세포보다 더욱 원형인 것처럼 나타난다. 섬유성 콜라겐은 자가분지 및 측분비 작용모드로 제조되고, 건은 확대되었다. TGF-β1 형질감염된 세포 주사 후 6주후 건은 확대되었다.

도 9A-9B는 H&E 염색(A) 및 TGF-β1 항체를 이용한 면역조직화학적 염색(B)을 사용한 래빗 아킬레스건에서 재생된 조직의 현미경적 소견을 나타낸다. 갈색의 면역과산화효소 반응 생성물은 NIH 3T3-TGF-β1 세포에서 고수준의 재조합 TGF-β1 발현을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "환자"는 제한하는 것은 아니지만, 인간을 포함하여 동물계의 구성원들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "포유류 숙주"는 제한하는 것은 아니지만, 인간을 포함하여 동물계의 구성원들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "결합조직"은 다른 조직 또는 기관을 연결하고 지지하는 어느 조직이고, 제한하는 것은 아니지만, 포유류 숙주의 인대, 연골, 건, 골, 및 활막을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "결합조직 세포" 또는 "결합조직의 세포"는 결합조직에서 발견되는 세포, 예를 들면, 섬유아세포, 연골세포(콘드로사이트) , 및 콜라겐성 세포외기질을 분비하는 뼈세포(골아세포/골세포), 및 지방세포(아디포사이트) 및 평활근세포를 포함한다. 바람직하게, 결합조직 세포는 섬유아세포, 연골세포, 및 뼈세포이다. 더욱 바람직하게, 섬유아세포이다. 결합조직 세포는 또한 미성숙 섬유아세포로서 공지된 간엽세포를 포함한다. 본 발명은 결합조직 세포의 혼합된 배양액, 및 단일형태의 세포가 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "결합조직 세포주"는 공통(common)의 모세포로부터 기원한 다수의 결합조직 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "유리질 연골"은 관절 표면을 피막하는 결합조직을 언급한다. 단지 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 관절 연골, 늑연골, 및 코연골을 포함한다.

특히, 유리질 연골은 자가재생성(self-renewing)임이 공지되어 있고, 변화에 대하여 반응하며, 감소된 마찰력으로 안정된 운동을 제공한다. 동일한 연골 내 또는 연골중에 발견된 유리질 연골의 두께, 세포 밀도, 기질 조성 및 기계적 특성은 상이하더라도, 그의 일반적인 구조 및 작용은 동일하다. 일부의 유리질 연골의 작 용은 압박에 대한 불시의(surprising) 경직, 탄성(resilience), 및 체중부하(weight load)를 분배하는 탁월한 능력, 연골하 골에 대한 최대의 스트레스를 최소화하는 능력, 및 우수한 내구성(durability)을 포함한다.

총체적 및 조직학적으로, 유리질 연골은 변형(deformaiton)성에 대하여 내성인 매끄럽고, 딱딱한 표면처럼 보인다. 연골의 세포외기질에는 연골세포가 포함되지만, 혈관, 림프관 또는 신경이 부족하다. 연골세포 및 기질사이의 상호작용을 유지시키는 정교하고, 고도로 정열된 구조가 저수준의 대사 활동을 유지시키면서, 유리질 연골의 구조 및 작용을 유지시키는 작용을 한다. 문헌 [O'Driscoll, J. Bone Joint Surg,, 80A: 1795-1812, 1998]에 유리질 연골의 구조 및 작용에 대하여 상세히 기재되어 있고, 상기 문헌은 전체적으로 본 명세서에서 참조 문헌으로 인용된다.

본 명세서에서 사용되는 바, "형질전환성장인자-β(TGF-β) 슈퍼패밀리"는 배발생동안 광범위하게 분화 과정에 영향을 주는 구조-연관 단백질 그룹을 포함한다. 상기 패밀리는 정상 수컷의 성 발생에 필요한 물러리안 억제물질(Mullerian inhibiting substance(MIS))(Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), 등쪽-복부축(dorsal-ventral axis) 형성 및 성충판(imaginal disks)의 형태발생에 필요한 초파리 데카펜타플레직(Drosophila decapentaplegic(DPP)) 유전자 산물(Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), 난의 식물극에 위치하는 제너퍼스 Vg-1 유전자 산물(Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987), 제너퍼스 배에서 중배엽 및 앞쪽 구조의 형성을 유도할 수 있는(Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990) 액티빈(Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986) 및 새로이 연골 및 골 형성을 유도할 수 있는(Sampath, et al., J. m. Bio. Chem., 265:13198, 1990) 골 형태발생 단백질(BMP's, 예, BMP-2,3,4,5,6 및 7, 오스테오게닌, OP-1)을 포함한다. TGF-β유전자 산물은 지방세포발생(adipogenesis), 근육발생, 연골발생(chondrogenesis), 조혈, 및 상피 세포 분화를 포함하여 다양한 분화 과정에 영향을 준다(문헌[Massague, Cell 49:437, 1987] 참조, 상기 문헌은 전체적으로 본 명세서에서 참조 문헌으로 인용된다).

초기에 TGF-β패밀리 단백질은 큰 전구체 단백질로서 합성된 후, C-말단으로부터 약 110-140 아미노산의 하나의 클러스터(cluster)의 염기 잔기에서 단백질분해적으로 절단된다(proteolytic cleavage). 상기 단백질의 C-말단 영역은 모두 구조적으로 연관되어 있고 그들의 상동성의 정도에 기초하여 상이한 패밀리 구성원은 별개의 서브그룹으로 분류될 수 있다. 특정 서브그룹내 상동성은 70% 내지 90% 범위로 아미노산 서열이 일치하지만, 서브 그룹사이의 상동성은 현저하게는 더욱 낮고, 일반적으로 단지 20% 내지 50% 범위이다. 각 경우에서, 활성 종은 C-말단 단편이 디설파이드-연결된 이합체인 것처럼 보인다. 연구된 대부분의 패밀리 구성원들에 대하여, 호모다이머 종이 생물학적으로 활성이지만, 다른 패밀리 구성원, 예를 들면, 인히빈(Ung, et al., Nature, 321;779, 1986) 및 TGF-β's(Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987)들에 대하여, 헤테로다이머를 또한 검출하였고, 이들은 각각의 호모다이머보다 더욱 상이한 생물학적 특성을 갖는 것처럼 보였다.

TGF-β유전자 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(닭), TGF- β1, TGF-β5(제노퍼스(Xenopus)), BMP-2, BMP-4, 초파리 DPP(Drosophila DPP), BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, 초파리 60A, GDF-1, 제노퍼스 Vgf, BMP-3, 인히빈-β_A, 인히빈-β_B, 인히빈-α, 및 MIS를 포함한다. 이들 유전자들은 문헌[Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:763-791, 1998]에서 검토되고, 상기 문헌은 전체적으로 본 명세서에서 참조 문헌으로 인용된다.

바람직한 TGF-β유전자 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β이다. 더욱 바람직한 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7이다. 더욱 더 바람직한 구성원은 인간 또는 돼지의 TGF-β이다. 더욱 더 바람직한 구성원은 인간 또는 돼지의 TGF-β1, TGF-β2, 또는 TGF-β3이다. 가장 바람직한 구성원은 인간 또는 돼지의 TGF-β1이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "선별가능한 마커"는 도입된 DNA를 안정적으로 유지하는 세포에 의해 발현되고, 상기 세포가 형태학적 형질전환과 같은 변형된 표현형, 또는 효소 활성을 발현시킬 수 있게 하는 유전자 산물을 포함한다. 선별가능한 마커, 예를 들면 항생제 또는 다른 약물에 대한 내성을 갖는 효소 활성을 갖는 것을 코딩하는 2차 유전자를 동일한 세포내로 도입시켜 형질감염된 유전자를 발현시키는 세포를 분리한다. 선별가능한 마커의 예로는, 제한하는 것은 아니지만, 티미딘 키나제, 디하이드로폴레이트 환원효소, 카나마이신, 네오마이신 및 게네티신(geneticin)과 같은 아미노글리코시드 항생제에 대한 내성을 갖는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 크잔틴-구 아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, CAD(새로운(de novo) 유리딘 생합성의 처음 세개의 효소 활성을 갖는 단일 단백질-카바밀 포스페이트 합성 효소, 아스파테이트 트랜스카바밀라제 및 디하이드로오로타제), 아데노신 데아민나제, 및 아스파라긴 합성효소를 포함하고(Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989), 상기 문헌은 전체적으로 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된다.

본 명세서에서 사용되는 바, "프로모터"는 활성인 DNA의 어느 서열일 수 있고, 진핵세포에서 트랜스크립션(transcription)을 조정한다. 프로모터는 원핵세포 또는 진핵세포중 어느 것 또는 둘 모두에서 활성일 수 있다. 바람직하게, 프로모터는 포유류 세포에서 활성이다. 프로모터는 구성적으로 발현되거나 유도될 수 있다. 바람직하게, 프로모터는 유도될 수 있다. 바람직하게, 프로모터는 외부 자극에 의해 유도될 수 있다. 더욱 바람직하게, 프로모터는 호르몬 또는 금속에 의해 유도될 수 있다. 더욱더 바람직하게, 프로모터는 중금속에 의해 유도될 수 있다. 가장 바람직하게, 프로모터는 메탈로티오네인 유전자 프로모터이다. 또한, 트랜스크립션을 조정하는 "인핸서 원소"를 DNA 벡터 작제물내로 삽입할 수 있고, 본 발명의 작제물과 함께 사용하여 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "DC-chol"은 양이온성 콜레스테롤 유도체를 함유하는 양이온성 리포솜을 의미한다. "DC-chol" 분자는 4급 아미노 그룹, 중간 길이의 스페이서 암(spacer arm)(2개의 원자) 및 카바모일 링커 결합(linker bond)을 포함한다(Gao et al., Biochem. Biophys. Res, Commun., 179:280-285, 1991).

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "SF-chol"은 양이온성 리포솜형으로서 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 바, 리포솜과 관련하여 사용되는 용어 "생물학적 활성"은 기능성 DNA 및/또는 단백질을 표적 세포내로 도입시키는 능력을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 그의 유도체와 관련된 용어 "생물학적 활성"은 야생형(wild type)의 핵산 또는 단백질에 의해 발견된 공지된 생물학적 기능을 모방하는 핵산 또는 아미노산 서열의 능력으로서 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 바, 리포솜 전달과 관련하여 사용되는 용어 "유지" 는 도입된 DNA를 세포내에 존재하도록 하는 능력을 의미한다. 다른 것들과 관련하여 사용되는 경우, 그것은 표적 DNA를 표적 세포 또는 조직내에 존재하도록 하여 치료적 효능을 부여하는 능력을 의미한다.

본 발명은 관심의 DNA 서열을 포유류 숙주의 결합조직 세포로 전달하는 생체외 및 생체내 기술을 개시한다. 생체외 기술은 표적 결합조직 세포를 배양하고, 시험관내에서 관심의 대상이 되는 DNA 서열, DNA 벡터 또는 다른 운반체(vehicle)를 결합조직 세포내로 형질감염시킨 후, 변형된 결합조직 세포를 포유류 숙주의 표적 관절에 이식시킴으로써, 생체내에서 관심의 대상이 되는 유전자 산물이 발현되도록 하는 것을 포함한다.

섬유아세포의 시험관내 조작의 대안으로서, 관심의 대상이 되는 산물을 코딩하는 유전자를 리포솜내로 도입시키고 관절 부위내로 직접 주사하여, 거기에서 리 포좀이 결합조직 세포와 융합하도록 하여, 생체내에서 TGF-β에 속하는 유전자 산물이 발현되도록 한다.

결합조직 세포의 시험관내 조작의 또다른 대안으로서, 관심의 대상이 되는 산물을 코딩하는 유전자를 노출된(naked) DNA로서 관절 부위내로 도입시킨다. 노출된 DNA는 결합조직 세포내로 도입되어, 생체내에서 TGF-β에 속하는 유전자 산물이 발현된다.

본 명세서를 통해 개시된 결합조직 장애의 생체외 치료법은 초기에 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제조하는 것을 포함한다. 이어서, 이 재조합 벡터를 사용하여 시험관내에서 배양된 결합조직 세포 군집을 감염 또는 형질감염시킴으로써, 상기 벡터를 포함하는 결합조직 세포 군집을 수득한다. 이어서, 이들 결합조직 세포를 포유류 숙주의 표적 관절 간극에 이식시킴으로써 관절 간극내에서 단백질 또는 단백질 단편이 발현되도록 한다. 관심의 대상이 되는 이 DNA 서열의 발현은 결합조직 질환과 연관된 적어도 하나의 해로운 관절 병변을 감소시키는데 유용하다.

인간 환자 치료용의 바람직한 근원 세포는 자가 섬유아세포와 같은 환자 자신의 결합조직 세포라는 것을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다.

더욱 특히, 이 방법은 유전자로서 형질전환성장인자 β슈퍼패밀리 구성원, 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체 또는 단편을 코딩할 수 있는 유전자 및 선별가능한 마커, 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체 또는 단편을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 일례는 유전자로서 적어도 하나의 형질전환성장인자 β슈퍼패밀리 구성원 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체 또는 단편을 코딩하는 유전자를 사용하고, DNA 플라스미드 벡터로서, 사용되는 전달 방법과는 상관없이 전달시 표적 세포 또는 조직내에서 안정하게 유지될 수 있다고 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 어느 DNA 플라스미드 벡터를 사용하는 것을 포함한다.

그러한 방법 중 하나는, 그것이 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터인 것에 상관없이, DNA 벡터 분자를 직접 표적 세포 또는 조직내로 전달하는 것이다. 이 방법은 또한 유전자로서 형질전환성장인자 β슈퍼패밀리 구성원 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체 또는 단편을 코딩하는 유전자를 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 일례는 포유류 숙주의 치료시에 유용한, 산물을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 결합조직 세포내로 도입시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 산물을 코딩하는 유전자를 결합조직 세포내로 도입시키기 위해 비바이러스성 방법을 사용하는 것을 포함한다. 더욱 특히, 이 방법은 리포솜 캡슐화, 인산칼슘 공침, 전기천공, 또는 DEAE-덱트트란 매개를 포함하고, 유전자로서 형질전환성장인자 슈퍼패밀리 구성원 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체 또는 단편을 코딩할 수 있는 유전자 및 선별가능한 마커, 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체 또는 단편을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 일례는 포유류 숙주의 치료시에 유용한, 산물을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 결합조직 세포내로 도입시키는 또다른 방법 을 제공한다. 이 또다른 방법은 바이러스를 사용하여 DNA 벡터 분자를 표적 세포 또는 조직내로 전달하는 생물학적 방법을 사용하는 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 바이러스는 가바이러스(pseudovirus)이고, 그 게놈은 가바이러스가 단지 전달할 수 있고 표적 세포내에 안정하게 유지할 수 있지만, 표적 세포 또는 조직내에서 복제하지 못하도록 변경된 것이다. 변경된 바이러스 게놈을 재조합 DNA 기술에 의해 조작하여 바이러스 게놈이 관심의 대상이 되는 헤테로성 유전자를 포함하는 DNA 벡터 분자로서 작용시켜 표적 세포 또는 조직내에서 발현될 수 있게 한다.

본 발명의 바람직한 일례는 본 명세서에 공개된 생체외 기술과 함께 레트로바이러스 벡터를 사용하여 TGF-β유전자를 포유류 숙주의 결합조직으로 전달시켜 TGF-β를 표적 관절 간극에 전달하는 방법이다. 즉, 작용성 TGF-β 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 관심의 대상이 되는 DNA 서열을 특선된 레트로바이러스 벡터내로 서브클로닝시킨 후(subcloning), 재조합 바이러스 벡터를 적절한 농도(titer)에서 배양하고 이것을 사용하여 시험관내에서 배양된 결합조직세포를 감염시키고, 형질유도된 결합조직세포, 바람직하게 자가이식된 세포를 바람직하게 관절내 주사에 의해 관심의 대상이 되는 관절내로 이식시킨다.

본 발명의 또다른 바람직한 방법은 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AVV) 벡터 또는 단순-포진 바이러스(herpes-simplex virus(HSV) 벡터중 어느 하나를 사용하여 생체내에서 TGF-β슈퍼패밀리 유전자를 포유류 숙주의 결합조직으로 직접 전달하는 것을 포함한다. 즉, 작용성 TGF-β 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 관심의 대상이 되는 DNA 서열을 각각의 바이러스 벡터내로 서브클로닝한 다. 이어서, TGF-β함유 바이러스 벡터를 적절한 농도에 배양하고 바람직하게 관절내 주사에 의해 이를 직접 관절 간극내로 전달한다.

관심의 대상이 되는 유전자를 포함하는 DNA 분자를 관절내 주사에 의해 직접 관절내로 주사하여 수령의 결합조직세포를 형질감염시키고 결과적으로는 제거, 시험관내 배양, 형질감염, 선별, 및 DNA 벡터 함유-섬유아세포의 이식하는 필요 조건을 바이패스(bypass)하여 관심의 대상이 되는 헤테로성 유전자의 발현을 촉진시킨다.

DNA 분자를 관절의 표적 결합조직 세포에 위치시키는 방법은 제한하는 것은 아니지만, DNA 분자의 양이온성 리포솜내로의 캡슐화, 레트로바이러스 또는 플라시미드 벡터중에서 관심의 대상이 되는 DNA 서열의 서브클로닝, 또는 관절내로 DNA 분자 그 자체의 직접 주사를 포함한다. DNA 분자는 무릎 관절내로 전달되는 형태와는 상관없이 DNA 벡터 분자, 예로 재조합 바이러스 DNA 벡터 분자 또는 재조합 DNA 플라스미드 벡터 분자중 어느 하나로서 전달된다. 진핵세포에서 활성인 프로모터 단편을 헤테로성 유전자의 코딩 부위의 상류에 직접 삽입하여 관심의 대상이 되는 헤테로성 유전자를 확실하게 발현시킨다. 본 분야의 기술자는 벡터 작제의 공지된 전략 및 기술을 사용하여 DNA 분자를 결합조직내로 전달시킨 후 적절한 수준으로 발현시킬 것이다.

바람직한 일례에서, 연속하여 유전자 요법용 전달 시스템으로서 사용하기 위해 무릎 관절로부터 회수한 섬유아세포를 시험관내에서 배양한다. 출원인이 공개된 특정 결합조직의 용도를 제한하지 않는다는 것은 자명할 것이다. 시험관내 배양 기 술용의 또다른 조직원(tissue source)을 사용할 수 있을 것이다. 본 발명의 유전자를 사용하는 방법이 관절염의 예방 및 치료에 사용될 수 있을 것이다. 출원인은 단지 무릎 관절의 치료에서 예방용 또는 치료용으로 제한하지 않을 것이다.

본 발명의 또다른 일례에서, 치료학적 유효량으로 환자에게 비경구 투여되는 TGF-β슈퍼패밀리 단백질을 코딩하는 유전자 및 적절한 약제학적 담체를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 일례는 예방학적 유효량으로 환자에게 비경구 투여되는 TGF-β슈퍼패밀리 단백질을 코딩하는 유전자 및 적절한 약제학적 담체를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 일례는 시험관내에서 상기 유전자를 세포내로 도입시키는 것을 포함하여 상기 기재된 방법을 포함한다. 이 방법은 또한 감염된 세포를 연속하여 포유류 숙주에 이식시키는 것을 포함한다. 이 방법은 형질감염된 결합조직 세포를 저장하면서, 감염된 세포를 포유류 숙주내로 이식시키기 전이 아닌, 결합조직 세포를 형질시킨 후, 형질간염된 결합조직 세포를 저장하는 것을 포함한다. 본 분야이 기술자는 감염된 결합조직 세포를 액체 질소하의 10% DMSO내에 동결 저장할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이 방법은 관절염 발생의 높은 감수성을 갖는 포유류 숙주에서 연속적으로 관절염이 발생하는 것을 실질적으로 예방하기 위한 방법을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 일례는 산물을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 포유류 숙주에 직접 도입시켜 생체내에서 세포를 감염시키는 것을 포함하여, 상 기 기재된 바와 같이 포유류 숙주 치료시에 유용한, 산물을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포유류 숙주의 적어도 하나의 결합조직 세포내로 도입시키는 방법을 포함한다. 바람직하게, 이 방법은 관절내 주사에 의해 포유류 숙주내로 직접 도입시키는 것을 포함한다. 이 방법은 관절염 발생의 높은 감수성을 갖는 포유류 숙주에서 연속적으로 관절염이 발생하는 것을 예방하기 위한 방법을 사용하는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 치료용으로 관절염에 걸린 포유류 숙주를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 이 방법은 상기 정의된 바와 같이 결합조직을 수복하고 재생시키는 방법을 사용하는 것을 포함한다.

본 분야의 기술자는 레트로바이러스가 결합조직 세포를 감염 및 결합시키기 위해 필요한 세포 분열에 의해 리포솜을 사용하는 바이러스 벡터가 제한되는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 상기 기재된 바와 같이 비-바이러스성 방법을 사용하는 이 방법은 유전자로서 TGF-β슈퍼패밀리에 속하는 구성원을 코딩할 수 있는 유전자 및 선별가능한 유전자, 예로서 항생제 내성 유전자를 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 일례는 본 명세서에 기재된 어느 방법에 의해 TGF-β슈퍼패밀리 구성원을 코딩하는 DNA 서열을 포유류 숙주의 결합조직으로 전달시켜 생체내에서 콜라겐이 발현되도록 하여 결합조직, 예로서 연골을 재생시키는 것이다.

본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 예로서 기재된 특정 방법에서, TGF-β코딩 서열을 포함하는 DNA 플라스미드 벡터를 메탈로티오네인 프로모터의 하류에 결찰(ligate)시켰다.

결합조직은 치료학적으로 표적하기 어려운 기관이다. 본 분야에서 공지되어 있는 약물을 정맥내 및 경구로 전달하는 경로는 이들 결합조직에 접근하기 어렵게 하고 치료제를 포유류 숙주의 전신에 노출시키는 단점을 갖고 있다. 더욱 특히, 공지되어 있는 관절에 대한 관절내 단백질의 주사는 관절에 직접 접근시킨다. 그러나, 캡슐화된 단백질의 형태로 주사된 대부분의 약물은 관절내에서 짧은 반감기를 갖는다. 본 발명은 포유류 숙주를 치료하기 위해 사용될 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 포유류 숙주의 결합조직내로 도입시켜 이들 문제를 해결한다. 더욱 특히, 본 발명은 항-관절염성 특성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포유류 숙주의 결합조직내로 도입시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 유전자 요법을 적용하여 TGF-β투여와 관련된 짧은 작용지속기간 및 높은 비용의 문제를 해결하였다. 형질감염된 세포는 형태상의 변화없이 조직 배양중에서 6주 이상동안 생존할 수 있었다. 생존 가능성 및 작용지속기간을 측정하기 위해, 세포를 래빗의 아킬레스건에 주사하였다. 생체내에서 세포에 적절한 영양을 공급하면, 세포는 생존할 수 있고 장기간동안 TGF-β를 생성하여 주위의 세포를 자극할 수 있다. 상기 세포는 건내(intratendinous) 및 관절내 환경에서 작용하였다.

형질감염된 세포의 농도는 국소 작용에 대한 중요한 인자이다. 선행 시험(Joyce et al., supra, 1990)에서 TGF-β의 투여량이 형성된 조직형을 결정하였다. 특히, 막내의 뼈 형성에 대한 연골 형성의 비는 투여량을 감소시킴에 따라 감소하였다. 또한, TGF-β는 1차 조골세포 및 MC3T3 세포의 자극에서 이상성(biphasic)이다(Centrella et al., Endocrinology, 119:2306-2312, 1986). 즉, 그것은 농도에 따라 자극성 및 억제성일 수 있다(Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85:5683-5687, 1988). 본 명세서에서 제공된 실시예에서, NIH 3T3-TGF-β1 세포는 10⁴, 10⁵, 및 10⁶ 세포/㎖의 상이한 농도에서 콜라겐 합성을 자극하였다. 건은 주로 10⁶ 세포/㎖의 농도에서 확대되었다.

실시예에서 10⁶ 세포/㎖ 농도의 0.3㎖로 관절에 주사하였다. 주사 후 2주 내지 6주에 검체를 채취하였다. 관절내 환경은 건의 것과 상이하였다. 세포들은 관절내에서 자유롭게 이동할 수 있다. 그것들은 세포에 대하여 특정 결합능을 갖는 부위로 이동할 것이다. 활막, 메니스쿠스(meniscus) 및 연골 결함 부위가 세포 부착가능 영역이다. 주사후 6주째, 활막 또는 메티스쿠스를 제외한, 부분 및 완전 손상된 연골 결함 부위에서 재생된 조직이 관찰되었다. 손상 부위에 대한 특정 결합능이 임상적 사용에 대한 또다른 잇점이다. 단지 세포를 관절내로 주사하여 퇴행성 관절염을 치료할 수 있다면, 환자들을 대수술없이도 용이하게 치료할 수 있다.

주사된 세포에 의해 분비된 TGF-β는 두개의 가능한 경로에 의해 유리질 연골 재생을 자극할 수 있다. 하나는 손상 부위에 잔존하는 연골 세포가 그들의 세포 표면에 TGF-β수용체를 생성하는 것이다(Brand et al., J Biol Chem, 270:8274-8284, 1995;Cheifetz et al., Cell, 48:409-415, 1987; Dumont et al., M Cell, E ndo, 111:57-66, 1995; Lopez-Casillas et al., Cell, 67:785-795, 1991; Mietti nen et al., J cell Biology, 127:6, 2021-2036, 1994; and Wrana et al., Nature, 370:341-347, 1994). 주사된 세포에 의해 분비된 TGF-β에 의해 이들 수용체는 자극을 받을 수 있고, 이것은 손상 부위에 결합한다. TGF-β는 생체내에서 잠복(latenr) 형태로 분비되기 때문에(Wakefield et al., J Bio Chem, 263, 7646-7654, 1988), 잠복형의 TGF-β은 활성화 과정을 필요로 한다. 또다른 경로에서, 잠복형의 TGF-β 또는 형질감염된 세포로부터 분비된 TGF-β는 부분적으로 손상된 연골층의 세포외기질에 TGF-β결합 단백질(LTBT)에 결합할 수 있다(Dallas et al., J Cell Biol, 131:539-549, 1995).

작용 기작과는 상관없이, 유리질 연골의 합성 소견은 고농도 TGF-β가 장기간 지속됨으로써 유리질 연골 재생을 자극할 수 있다는 것을 암시한다. 고농도의 국소용 전달체가 국소 자극에 대하여 중요한 인자가 아닐 수 있지만, 이론적으로는 TGF-β를 손상 부위의 연골에 전달하는 가장 적절한 전달체는 연골 세포일 수 있다(Brittberg et al., New Engl J Med 331:889-895, 1994). 콜라겐 이중층의 기질이 형질감염된 세포의 국소 분배용의 또다른 적절한 전달체이다(Frenkel et al., J Bone J Surg (Br) 79-B:831-836, 1997).

새로 형성된 조직의 특성을 조직학적 방법으로 측정하였다. H & E 염색법에서, 새로 형성된 조직은 주위의 유리질 연골과 동일하였다(도 4). 새로 형성된 조직의 특성을 평가하기 위하여, 상기 조직을 사프라닌-O로 염색하였다(Rosenburg, J Bone Joint Surg 53A:69-82, 1971). 백색의 섬유성 콜라겐과 대조적으로, 새로 형성된 조직은 붉은색으로 염색되었고, 이는 그것이 유리질 연골임을 암시한다(도 5).

완전 손상 부위의 세포는 섬유성 콜라겐을 생성하였다. 주위의 조골 세포는 TGF-β자극에 대한 골양 기질 막 때문에 자극을 받지 못할 수 있다. NIH 3T3-TGF-β1 세포는 주위의 세포를 자극하는 대신, 자가분비 자극에 의해 섬유성 콜라겐을 생성하였다. 세포는 자가분비 및 측분비성(paracrine) 활성화에 의해 자극받는다는 사실이 TGF-β1 발현 작제물로 안정하게 형질감염된 연골세포를 사용하여 퇴행성 관절염을 치료할 수 있다는 가능성을 증가시킨다.

TGF-β1 발현 작제물로 안정하게 형질감염된 세포주는 건 및 무릎 관절에서 생존 가능하다. 세포주는 건 및 완전 손상 연골 부위에서 섬유성 콜라겐을 생성한다. 그러나, 세포주는 부분 손상된 관절 연골에서는 유리질 연골을 생성한다. 자가분비 및 측분비 모드의 자극 작용 기작은 TGF-β슈퍼패밀리 구성원의 유전자를 사용하는 유전자 용법이 유리질 연골 결함에 대한 신규한 치료법임을 암시한다.

본 발명자는 TGF-β1 발현 작제물을 형질감염시켜 안정의 섬유아세포(NIH 3T3-TGF-β1, 및 인간 포피 섬유아세포 TGF-β1) 세포주를 제조하였다. 이들 TGF-β-생성 세포는 생체내에서 장기간동안 고농도의 활성 TGF-β를 유지하였다.

유전자 요법, 특히, 세포-매개 유전자 요법의 가능성과 관련하여 해결된 첫번째 의문점은 생체내에서의 세포의 생존 가능성이다. TGF-β가 시험관내에서 면역세포를 억제할 지라도, 상기 세포들은 고도로 유효한 면역감시계(immuno surveillance systems)를 갖는 또다른 종의 조직에서는 생존 불가능할 수 있다. 두번째로, 생체내에서 유전자 발현에 대한 최적의 농도를 측정해야 했다. 본 발명자는 래빗의 아킬레스건에 세포를 3개의 상이한 농도로 주사하여 이 의문점을 해결하 였다. 사용된 관절내 주사 농도를 건내 주사에 대한 최적 농도로부터 측정하였다. 세번째 의문점은 세포가 관절내의 연골을 재생시키는 방법이다.

주사된 세포에 대하여 두가지의 작용 모드가 있다. 하나는 분비된 TGF-β에 의한 주위 세포의 활성(측분비 활성화)이고(Snyder, Sci Am, 253(4): 132-140, 1985), 또다른 하나는 자가-활성(자가분비 활성화)이다. 세포의 농도가 상기 경로에 영향을 주지만, 주위 환경이 작용 모드를 결정하는 가장 중요한 인자일 수 있다. 혈액 공급, 영양 공급 및 주위 세포에 기초하여, 관절내 관절액 및 인대 내부는 상이한 두개의 환경이다. 형질감염된 세포를 두개의 상이한 환경에 주사하여 세포의 작용 모드를 발견하였다. 본 연구의 전체적인 목적은 정형외과적 질환을 위한 TGF-β-매개 유전자 요법을 평가하고 생체내에서의 작용 모드를 확인하는 것이었다.

하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니며, 설명하기 위해 제공된다.

실시예 1-물질 및 방법

플라스미드 작제

메탈로티오네인 발현 작제물(pM)을 제조하기 위해, 증폭을 위해 사용되는 올리고뉴클레오타이드로 형성된, Xba I 및 Bam HI 제한 부위를 사용하여 게놈 DNA를 사용하여 중합효소연쇄 증폭에 의해 메탈로티오네인 I 프로모터(-660/+63)을 제조하였다. 증폭된 단편을 pBluesript의 Xba I-Bam HI 부위내로 서브클로닝하였다 (Stratagene, La Jolla, CA). TGF-β1 코딩 서열을 포함하는 1.2-kb Bgl II 단편 및 3' 말단에 성장 호르몬 폴리 A 부위를 pM의 Bam HI-Sal I 부위내로 서브클로닝하여 플라스미드 pmTβ1을 제조하였다.

세포 배양 및 형질감염 - TGF-β cDNA를 섬유아세포(NIH 3T3-TGF-β1) 또는 인간 포피 섬유아세포/TGF-β1내로 형질감염시켰다. 그것들을 10% 농도의 우아혈청과 함께 둘베스코 모디파이드 이글스 배지(GIBCO-BRL, Rockville, MD)중에서 배양하였다. TGF-β1 cDNA 서열을 메탈로티오네인 유전자 프로모터와 함께 pmTβ1 벡터내로 가하였다. 또한 네오마이신 내성 유전자 서열을 벡터내로 삽입하였다.

인산칼슘법을 사용하여 이 벡터를 상기 세포내로 삽입하였다. 형질감염된 유전자 서열을 갖는 세포를 선별하기 위해, 네오마이신(300μg/㎖)을 배지에 가하였다. 이어서, 생존 클로니를 선별하고 노던 분석 및 TGF-βELISA 분석(R&D 시스템)에 의해 TGF-β1 mRNA의 발현을 확인하였다. TGF-β발현을 갖는 세포를 액체 질소에 저장하고 주사하기 바로 직전에 배양하였다.

노던 블랏 분석 - 총 RAN를 구아니디움 이소티오시아네이트/페놀/클로로포름을 사용하여 세포로부터 분리하였다. 10μg의 RNA를 0.66M 포름알데히드를 포함하는 1.0% 아가로스 겔상에서 전기천공시키고, DURALON-UV 막에 이동시키고, UV STRAT-ALINKER(STRATAGENE)와 교차 결합시켰다. 블랏을 65℃에서 1% 우아혈청 알부민, 7%(w/v) SDS, 0.5M 인산나트륨, 및 1mM EDTA의 용액중에서 프리하이브리드 및 하이브리드시켰다. 하이브리드된 블랏을 필름 노출전 50℃ 내지 20분동안 0.1% SDS, 1 x SSC중에서 세척하였다. RNA 블랏을 인간 TGF-β1용 ³²P-라벨된 cDNA 프로브와 하이브리드시켰다. β-액틴용 프로브를 사용하여 샘플 로딩을 조정하였다.

래빗내로 세포 주사 - 중량 2.0-2.5kg의 뉴질랜드산 백색의 래빗을 동물 모델로서 선택하였다. 케타민(ketamine) 및 로움펀(roumpun)으로 마취시킨 후, 각 래빗을 멸균시키는 의미로 드레이핑(draping)하였다. 아킬레스건을 노출시키고, 0.2-0.3㎖의 세포를 10⁴, 10⁵및 10⁶ 세포/㎖의 농도로 건의 중앙에 주사하였다. 형질감염된 DNA를 발현시키기 위해 래빗의 식수에 황산아연을 가하였다. 아킬레스건 시험으로 최적의 농도를 측정한 후, 관절내 주사를 시행하였다. 무릎 관절을 노출시키고, 나이프로 부분적으로 및 완전히 연골을 결함시켰다. 연골하 골이 노출되지 않도록 주의하여 유리질 연골층상에서 부분 결함시켰다. 모든 유리질 연골을 제거한 후 연골하골을 노출시켜 완전 결함 시켰다. 외과적 창상을 폐쇄(closing)한 후, 10⁶ 세포/㎖의 농도의 세포를 관절내 주사하고, 황산아연을 식수에 가하였다.

조직학적 연구 - 건 및 무릎 관절을 채취한 후, 검체를 포르말린중에 고정시키고, 질산으로 탈회시켰다(decalcify). 그것들을 파라핀 블락중에 심고 0.8μm 두께의 슬라이스로 절단하였다. 헤마톡실린-에오신, 및 사프라닌-O 염색법을 사용하여 현미경적으로 재생 조직을 관찰하였다.

실시예 II-결과

안정된 세포주 - 인산칼슘 공침법을 사용하여 형질감염을 수행하였다 (도 1). 약 80%의 생존한 콜로니가 트랜스진 mRNA를 발현시켰다. 이들 선택된 TGF-β-생성 세포를 황산아연 용액중에서 인큐베이션시켰다. 세포들을 100μM 황산아연 용액중에서 배양시킬 때, 그들은 mRNA를 생성하였다. TGF-β분비 속도는 약 32ng/10⁶세포/24hr이었다.

래빗의 관절 연골 결함의 재생 - 래빗의 아킬레스건을 관찰하여 NIH 3T3-TGF-β1 세포의 생존 가능성을 체크하였다. 10⁶세포/㎖ 농도에서, 건은 10⁴및 10 ⁵의 두개의 다른 농도에서보다 전체적으로 더욱 비후되었다. 부분 및 완전 연골 결합 시킨 후, 0.3㎖의 10⁶세포/㎖ NIH 3T3-TGF-β1 세포를 무릎 관절내로 주사하였다. 주사 후 2 내지 6주에 관절을 조사하였다. 부분 손상된 연골에서, 본 발명자는 새로 형성된 유리질 연골을 발견하였다; 주사후 2주째, 유리질 연골이 나타났고 주사 후 6주째, 연골 결함은 유리질 연골에 의해 피막되었다(도 2). 재생된 연골의 두께는 시간이 경과함에 따라 더욱 비후되었다(도 3). 주사된 세포는 TGF-β1을 분비하였고, 그것은 TGF-β1 항체를 사용하여 면역조직화학염색법으로 관찰할 수 있었다(도 3). TGF-β1 으로 형질감염되지 않은 정상의 섬유아세포를 주사한 반대측 부위는 유리질 연골에 의해 피막되지 않았다. 부분 손상된 부위에서, 재생된 유리질 연골은 사프라닌-O 염색법에서 붉은색으로 염색되었다(도 4). (새로 형성된 유리질은 결함의 것과 짙기가 동일하였다). 이 소견은 주사된 세포가 측분비 작용 모드를 통해 주위의 정상 연골 세포를 활성화시킨다는 것은 암시한다.

완전 손상된 연골에서 재생된 조직은 유리질 연골이 아닌 섬유성 콜라겐이었다. 사프라닌-O 염색법에서 그들의 색은 유리질 연골에 의해 얻은 붉은색 대신 백색이었다(도 5). 연골은 섬유성 조직에 의해 피막되었고, 이것은 이들 세포가 단지 자가분비 모드에 의해 활성화된다는 것을 의미한다. TGF-β에 의해 자극을 받을 수 있는 주위의 조골세포는 비후된 칼슘화 골 기질의 존재에 의해 TGF-β에 의해 자극 받지 못하도록 차단되어 있는 것처럼 보였다. 주사된 세포는 이 막 때문에 조골세포를 자극할 수 없었다.

TGF-β1 형질감염된 세포를 래빗의 아킬레스건에 주사하였다. 그렇게 조작된 건은 대조군 건보다 전체적으로 더욱 비후된 형태를 나타내었다(도 7). 현미경 조사에서 건 단면의 H&E 염색법은 래빗의 아킬레스건에서 주사된 NIH 3T3-TGF-β1 세포가 생존하였고 섬유성 콜라겐을 생성한다는 것을 나타내었다(도 8). TGF-β1 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 염색된 재생된 건 조직을 현미경으로 조사한 결과 건에서 TGF-β1이 발현된 것이 나타났다(도 9).

본 발명의 특정 일례가 설명의 목적으로 상기와 같이 기재되었지만, 본 분야의 기술자는 본 발명은 첨부된 청구범위에서 정의된 바와 같은 발명으로부터 출발하지 않고 다수 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 전체적으로 인용된다.

참조문헌

Claims

프로모터에 작동가능하도록 연결된, 형질전환성장인자(transforming growth factor) 슈퍼패밀리 단백질의 구성원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 시험관 내에서, 배양된 섬유아세포 또는 연골 세포에 형질감염 시켜 제조된 형질감염된 섬유아세포 또는 연골세포로만 이루어지고, 관절 간극에 이식되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 주사제의 제조를 위해 상기 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 사용하는 방법.
제 1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
제 1항에 있어서, 재조합 벡터가 플라스미드 벡터인 방법.
제1항에 있어서, 상기 관절염 치료용 주사제를 구성하는 형질감염된 섬유아세포 또는 연골세포의 세포 군집은 이식 전에 저장되는 방법.
제4항에 있어서, 형질감염된 섬유아세포 또는 연골세포의 세포 군집은 이식 전에 액체 질소하의 10% DMSO 내에 저장되는 것인 방법.
삭제
제1항에 있어서, 섬유아세포가 NIH 3T3 세포 또는 인간 포피 섬유아세포인 방법.
제 1항에 있어서, 결합조직이 연골, 인대, 또는 건인 방법.
제 8항에 있어서, 연골에서, 연골이 유리질 연골인 방법.
제 1항에 있어서, 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원이 형질전환성장인자 β(TGF-β)인 방법.
제 1항에 있어서, 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원이 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7인 방법.
제 10항에 있어서, TGF-β가 인간 또는 돼지 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3인 방법.
프로모터에 작동가능하도록 연결된, 형질전환성장인자(transforming growth factor) 슈퍼패밀리 단백질의 구성원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를, 시험관 내에서, 배양된 섬유아세포 또는 연골 세포에 형질감염 시켜 제조된 형질감염된 섬유아세포 또는 연골세포로만 이루어지고, 관절 간극에 이식되는 것을 특징으로 하는 유리질 연골의 재생용 주사제의 제조를 위해 상기 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 사용하는 방법.
제1항 또는 제13항에 있어서, 형질감염을 리포솜 캡슐화, 인산칼슘 공침, 전기천공 또는 DEAE-덱스트란 매개에 의해 수행하는 방법.
제 3항에 있어서, 플라스미드가 pmTβ1인 방법.
형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 결합조직 세포주.
삭제
제16항에 있어서, 섬유아세포가 NIH 3T3 세포 또는 인간 포피 섬유아세포인 방법.
제 16항에 있어서, 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원이 형질전환성장인자 β(TGF-β)인 결합조직 세포주.
제 16항에 있어서, 형질전환성장인자 슈퍼패밀리의 구성원이 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7인 결합조직 세포주.
제 19항에 있어서, TGF-β가 인간 또는 돼지 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3인 결합조직 세포주.
제 16항에 있어서, 재조합 벡터가 pmTβ1인 결합조직 세포주.
제13항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
제13항에 있어서, 재조합 벡터가 플라스미드 벡터인 방법.
제13항에 있어서, 상기 관절염 치료용 주사제를 구성하는 형질감염된 섬유아세포 또는 연골세포의 세포 군집은 이식 전에 저장되는 방법.
제25항에 있어서, 형질감염된 섬유아세포 또는 연골세포의 세포 군집은 이식 전에 액체 질소하의 10% DMSO 내에 저장되는 것인 방법.