KR20170073614A - 추간디스크 퇴행 치료용 조성물 - Google Patents

추간디스크 퇴행 치료용 조성물 Download PDF

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배현
이관희
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티슈진, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 추간디스크 재생 기능을 가지는 단백질을 인코드하는 유전자인 TGF-β 슈퍼패밀리가 삽입된 포유동물 연결조직 세포를 유효성분으로 포함하는 추간디스크 결함 부위 내로 이식될 수 있는 추간디스크의 퇴행 방지 또는 저지용 조성물추간디스크의 퇴행 치료용 조성물을 제공한다.

Description

추간디스크 퇴행 치료용 조성물 {Composition for treatment of intervertebral disc degeneration}
본 발명은 또한 추간디스크의 퇴행 방지 또는 저지에 의한 퇴행 디스크 치료용 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 포유동물 숙주에서 손상된 추간디스크 부위 내에 TGF β1을 인코드하는 유전자를 포함하는 연골세포와 연결조직 세포의 혼합물을 사용하는 추간디스크 퇴행의 방지 또는 저지용 치료 조성물에 관한 것이다.
추간디스크는 척추 기둥 길이의 사분의 일을 차지한다. 아틀라스(Atlas) (C1), 액시스(Axis) (C2), 및 콕식스(Coccyx) 사이에는 디스크가 없다. 디스크는 혈관 구조가 아니므로, 따라서 필요한 영양분을 확산시키는 종판(end plate)에 의존한다. 종판의 연골 층(cartilaginous layer)은 디스크를 제 위치에 앵커한다.
추간디스크는 척추의 충격 흡수 시스템(shock absorbing system)으로 작용하는 섬유연골성 완충제(fibrocartilaginous cushion)로서, 척추, 뇌, 및 기타 구조들(예를 들어, 신경)을 보호한다. 디스크는 일부 척추 운동: 신장(extension) 및 굴곡(flexion)을 허용한다. 개별적인 디스크 이동은 매우 제한되어 있지만 - 상당한 운동이 몇 개의 디스크가 힘을 조합할 때 가능하다.
추간디스크는 섬유륜(annulus fibrosus) 및 속질핵(nucleus pulposus)으로 구성된다. 섬유륜은 라멜라층: 척추 종판에 연결된 콜라겐 섬유의 동심원상 시트들로 만들어진 강력한 방사상의 타이어-유사 구조이다. 이들 시트는 다양한 각도에서 배열하고 있다. 섬유륜은 속질핵을 둘어싼다.
섬유륜과 속질핵 둘 다는 물, 콜라겐, 및 프로테오글리칸 (PGs)으로 구성되어 있긴 하지만, 액체 (물과 PGs)의 양은 속질핵에서 가장 크다. PG 분자는 물은 끌어당기고 보유하기 때문에 중요하다. 속질핵은 압박에 저항하는 수화된 젤-유사 물질을 포함한다. 핵 내에서 물의 양은 낮 동안 내내 활성에 의존적으로 변화한다. 사람이 나이가 들면서, 속질핵은 탈수화되기 시작하고, 이는 충격을 흡수하는 능력을 제한한다. 섬유륜은 나이와 함께 더 약해지고 찢어지기 시작한다. 이것은 일부 사람에서는 통증을 유발하지 않지만, 다른 사람에서는 이들의 하나 또는 둘 다가 만성적 통증을 유발할 수 있다.
속질핵이 충격을 흡수하기 데 있어 탈수화되는 무능력으로 인한 통증은 축상 통증(axial pain) 또는 디스크 공간 통증(disc space pain)이라고 불린다. 일반적으로 속질핵의 점진적인 탈수화를 퇴행하는 디스크 질병이라고 말한다. 섬유륜은 손상 또는 노화 과정으로 인해 찢어질 때, 속질핵은 열상을 통해 침출되기 시작할 수 있다. 이것을 디스크 탈출(disc herniation)이라고 부른다. 모든 척추를 따라 각 디스크의 후방 측면 가까이에는, 주요 척추 신경이 서로 다른 기관, 조직, 최말단 등까지 확장되어 나간다. 탈출된 디스크가 이들 신경(죄어진 신경)에 대항하여 방사상 통증, 무감각, 저림, 및 감소된 힘 및/또는 운동 범위를 야기하면서 압박하는 것은 매우 공통적이다. 또한, 염증성 단백질을 포함하는 내부 핵 젤을 신경과 접촉시키는 것도 또한 상당한 통증을 유발할 수 있다. 신경-관련된 통증은 방사 통(radicular pain)이라고 불린다.
탈출된 디스크는 많은 명칭으로 불리고, 이들은 서로 다른 의학 전문가들에게 서로 다른 것들을 의미할 수 있다. 미끄러진 디스크(slipped disc), 파쇄된 디스크(ruptured disc), 또는 부푼 디스크(bulging disc)는 모두 동일한 의학적 조건이라고 말할 수 있다. 인접한 척추 내로의 디스크의 돌출은 쉬몰 결절(Schmorl's nodes)이라고 알려져 있다.
한편, 골다공증, 골절 치유 및 골 결함을 치유할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것으로 선출원 공개된 국제특허 제03/083079호에는 골 형성 기능(bone generating function)을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 골 결함 부위에 이식하는 것을 특징으로 하는 것으로서, 추간디스크 치료에 대한 구체적인 치료효과가 있는 조성물을 제시하지는 못하고 있다.
본 발명의 목적은 추간디스크 결함 부위에서 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시키는 효과가 있는 추간디스크 퇴행 치료용 조성물 제공하는 데 있다.
본 발명은 추간디스크 재생 기능을 가지는 단백질을 인코드하는 유전자인 TGF-β 슈퍼패밀리가 삽입된 포유동물 연결조직 세포를 유효성분으로 포함하는 추간디스크 결함 부위 내로 이식될 수 있는 추간디스크의 퇴행 방지 또는 저지용 조성물에 관한 것으로,
또 다른 관점에서, 본 발명은 추간디스크 재생 기능을 가지는 단백질을 인코드하는 TGF-β1 유전자가 삽입된 제1 포유동물 연결조직 세포, 및 변형되지 않은 제2 포유동물 연결조직 세포의 혼합물을 유효성분으로 포함하되, 스캐폴딩 또는 지지 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 추간디스크 결함 부위 내로 이식될 수 있는 추간디스크의 퇴행 방지 또는 저지용 조성물을 제공한다.
또한 상기 포유동물 연결조직 세포는 연골세포 (chondrocyte)인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한 상기 연골세포는 비-디스크 연골세포 또는 연소성 연골세포인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한 상기 제2의 포유동물 연결조직을 위한 연골세포는 프라이밍된 연골세포인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한 상기 연결조직 세포는 상기 포유동물에 대하여 동종이계인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행 또는 손상된 추간디스크 치료용 조성물을 제공 한다.
본 발명의 목적은 추간디스크 결함 부위에서 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시키는 효과가 있는 추간디스크 퇴행 치료용 조성물 제공할 수 있다.
도 1의 A ~ F는 손상된 디스크 퇴행의 지연(slowing), 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 1의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 1의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 (locus) L2/3 에서 천자 및 트리트먼트가 전혀 보이지 않고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은(untransduced) 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 1의 C는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 1의 D는 상기 도 1의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 그 모포로지, 퇴행 또는 재생의 정도를 측정하는 데 사용되는 추간디스크의 디스크 고도(disc height index)를 획득하는데 이용된다);
도 1의 E는 상기 도 1의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는데 이용된다);
도 1의 F는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 이용된, 상기 도 1의 C에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진이다. 혼합 세포 트리트먼트는 특히 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 2의 A ~ F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 2의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 2의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진(여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌(spine locus) L2/3에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.);
도 2의 C는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트가 전혀 보이지 않고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 2의 D는 상기 도 2의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그의 모양, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 2의 E는 상기 도 2의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.);
도 2의 F는 상기 도 2의 C에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 혼합 세포 트리트먼트는 특히 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 3의 A ~ D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 3의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 3의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 3의 C는 상기 도 3의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그의 모양, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 3의 D는 상기 도 3의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 혼합 세포 트리트먼트는 특히 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 4의 A~D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 4의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 4의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 4의 C는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그의 모양, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 4의 D는 상기 도 4의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 특히, TGF-β1-생산하는 연골세포 트리트먼트는 추간디스크 항-퇴행 효과를 가진다.
도 5의 A ~ D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 5의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 5의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진(여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.);
도 5의 C는 상기 도 5의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 5의 D는 상기 도 5의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. TGF-β1-생산 연골세포 트리트먼트 및 혼합 세포 트리트먼트는 특히 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 6의 A ~D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 6의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 6의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 6의 C는 상기 도 6의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 6의 D는 상기 도 6의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 형질전환되지 않은 연골세포 트리트먼트가 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 7의 A ~ F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 7의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 7의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 7의 C는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다.};
도 7의 D는 상기 도 7의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 7의 E는 상기 도 7의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.);
도 7의 F는 상기 도 7의 C에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 형질전환되지 않은 연골세포 트리트먼트는 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 8의 A~F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 8의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 8의 B는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) T12/L1 에서 디스크가 바늘 천자 (needle puncture)에 의해 손상되었고 주입은 없었으며, (ii) 척추 위치좌 L1/2 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L2/3 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다.};
도 8의 C는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) T12/L1에서 디스크가 바늘 천자에 의해 손상되었고 주입은 없었으며, (ii) 척추 위치좌 L1/2 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L2/3 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다.};
도 8의 D는 상기 도 8의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 8의 E는 상기 도 8의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.);
도 8의 F는 상기 도 8의 C에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 형질전환되지 않은 연골세포 트리트먼트는 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
도 9의 A~D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 보여주는 것으로,
도 9의 A는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진;
도 9의 B는 수술 후 8주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진{여기에서 (i) L2/3에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L3/4 에서 천자 및 트리트먼트 콘트롤이 전혀 없고, 및 (iii) L4/5 에서 디스크가 손상되었으며 프라이밍된 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L2/3 및 L4/5 디스크 부위를 가리킨다.};
도 9의 C는 상기 도 9의 A에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다.);
도 9의 D는 상기 도 9의 B에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진(이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.)이다. 프라이밍된 연골세포 트리트먼트가 추간 항-퇴행 효과를 가진다.
본 명세서에서 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 그의 유도체와 관련해서 사용되는 용어 "생물학적으로 활성이 있는 (biologically active)"는 핵산 또는 단백질의 야생형 형태(wild type form)가 나타내는 기지의 생물학적 기능을 모방할 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열의 능력으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연결조직 (connective tissue)"는 다른 조직 또는 기관을 연결하고 지지하는 임의의 조직이며, 이에 제한되는 것은 아니지만 포유동물 숙주의 인대(ligament), 연골(cartilage), 힘줄(tendon), 뼈(bone), 및 윤활막(synovium)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연결조직 세포 (connective tissue cell)" 또는 "연결조직의 세포 (cell of a connective tissue)"는 섬유아세포, 연골 세포 (cartilage cells) (chondrocyte), 및 뼈 세포[골모세포 (osteoblast)/골세포(osteocyte)](콜라겐성 세포외 매트릭스를 분비)와 같은 연결조직에서 발견되는 세포를 포함할 뿐만 아니라, 지방 세포 (fat cell) (adipocyte) 및 민무늬 근육 세포도 포함한다. 바람직하게, 상기 연결조직 세포는 섬유아세포, 연골세포, 또는 뼈 세포이다. 보다 바람직하게, 상기 연결조직 세포는 연골세포이다. 본 발명은 연결조직 세포의 단일 타입 세포뿐만 아니라 혼합 세포 배양으로 실행될 수도 있는 것임을 이해하여야 한다. 또한, 조직 세포는 컴파운드 또는 방사선 조사에 의해서와 같은 제제(agent)로 처리되어 그 세포가 관심 유전자(gene of interest), 바람직하게는 TGF-β1을 안정적으로 발현하는 것일 수도 있음을 이해하여야 한다. 바람직하게, 연결조직 세포는 숙주 생물체 내로 주입될 때 네가티브(negative) 면역 반응을 유발하지 않는다. 세포-매개성 유전자 요법(cell-mediated gene therapy) 또는 체세포 요법(somatic cell therapy)을 위한 자가유래 세포 (autologous cell)뿐만 아니라 동종이계 세포가 이 측면에서 사용될 수 있는 것임을 이해하여야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "연결조직 세포주(connective tissue cell line)"는 공통의 부모 세포로부터 유래한 다수의 연결조직 세포들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "유리질 연골(hyaline cartilage)"은 관절 표면을 둘러싸는 연결조직을 말한다. 유리질 연골은 예를 들어 관절 연골 (articular cartilage), 늑골 연골 (costal cartilage), 및 코 연골 (nose cartilage)이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 유리질 연골은 자가-재생(self-renewing)하는 것으로 알려져 있고, 변형에 반응하며, 보다 적은 마찰로 안정한 운동을 제공한다. 심지어 동일한 관절 내에 또는 관절들 중에서 발견되는 유리질 연골이라도 굵기, 세포 밀도, 기질 조성(matrix composition) 및 기계적 성질이 다양해지지만, 동일한 일반적인 구조 및 기능을 보유한다. 유리질 연골의 일부 기능들은 압박에 대한 놀라운 경직성, 복원력, 그리고 체중 부하를 분배하는 특별한 능력, 연골하 뼈 상에 피크 스트레스를 최소화하는 능력, 및 대단한 내구성을 포함한다.
전체적으로 또한 조직학적으로, 유리질 연골은 변형(deformation)에 저항하는 매끄럽고 단단한 표면으로 보인다. 연골(cartilage)의 세포외 기질은 연골세포(chondrocyte)를 포함하지만, 혈관, 림프관 또는 신경을 결여하고 있다. 연골세포들 간 상호작용을 유지하는 섬세하고 매우 조직화된 구조 및 기질이 유리질 연골의 구조 및 기능을 유지하기 위해 대사적 활성을 낮은 수준으로 유지하기 위하여 작용한다. 드리스콜의 논문(O'Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998)에는 유리질 연골의 구조 및 기능이 상세히 기술하고 있으며, 이 논문은 그 전체가 본 명세서에 레퍼런스로서 통합된다.
본 명세서에서 사용되는 "주입 가능한 (injectable)" 조성물은 다양한 삼차원 스캐폴드(scaffold), 프레임웍(framework), 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 제외한 조성물을 말한다. 상기 구조는 세포가 이에 부착되도록 허용하고 세포가 하나 이상의 층(layer)에서 자라도록 허용하는 어떠한 재질 또는 모폴로지으로도 만들어질 수 있는 것으로, 일반적으로 임플란트되며 주입되지는 않는다. 일 구현에서, 본 발명의 주입 방법은 전형적으로 주사기에 의해 수행된다. 그러나 관심 조성물(composition of interest)을 주입하는 어떠한 방식도 이용될 수 있다. 예를 들어, 카테터, 스프레이 또는 온도 의존성 폴리머 젤도 역시 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "연소성 연골세포(juvenile chondrocyte)"는 두 살 이하의 인간으로부터 구한 연골세포를 말한다. 전형적으로, 연골세포는 바람직하게는 손가락, 코, 귓불(ear lobe) 등과 같은 몸체 말단의 유리질 연골 부위로부터 획득된다. 연소성 연골세포는 결함이 있는 또는 손상된 추간디스크의 동종이계 트리트먼트를 위한 도너(donor) 연골세포로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포유동물 숙주(mammalian host)"는 인간을 포함하는 동물계의 구성원을 포함하며, 인간으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "혼합 세포(mixed cell)" 또는 "세포의 혼합물 (mixture of cells)" 또는 "세포 혼합물(cell mixture)"은 관심 유전자로 형질감염된(transfected) 또는 형질전환된(transduced) 제1 집단의 세포와 형질전환되지 않은(untransduced) 제2 집단의 세포를 포함하는 복수 세포의 조합을 말한다.
본 발명의 일 구현에서, 혼합 세포는 TGF β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자 또는 DNA로 형질감염 된(transfected) 또는 형질전환된(transduced) 세포들, 그리고 TGF β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염되지 않거나 또는 형질전환되지 않은 세포들을 포함하는 복수 연결조직 세포의 조합을 지칭할 수도 있다. 전형적으로, TGF 슈퍼패밀리 유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포에 대한 TGF β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 비율은 약 3~20 대 1의 범위, 약 3~ 10 대 1의 범위일 수 있다. 특히, 상기 범위는 세포 수의 측면에서 약 10 대 1 일 수 있다. 그러나, 세포 조합이 결함이 있는 추간디스크의 퇴행을 지연시키거나 저지시킴에 의해 손상된 추간디스크를 트리트먼트하는 데 효과가 있는 한, 세포 비율이 임의의 특정 범위에 반드시 고정되는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "비-디스크 연골세포(non-disc chondrocyte)"는 추간디스크 연골 조직을 제외한 신체의 임의 부위로부터 분리된 연골세포를 말한다. 본 발명의 비-디스크 연골세포는 결함이 있는 또는 손상된 추간디스크를 트리트먼트하기 위해 환자에게 동종이계의 이식 또는 주입하는 데 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자(patient)"는 인간을 포함하는 동물계의 구성원을 포함하며, 인간에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이밍된(primed)" 세포는 특정 유전자를 발현하기 위하여 활성화되거나 변화된 세포를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 추간디스크 퇴행의 "지연(slowing)" 또는 "방지(prevention)"는 정상적인 퇴행을 유발하는 손상 부위에서 정상적으로 발견되는 주어진 시간에 대한 디스크의 부피 또는 높이 수준에 대비한, 시간에 대한 추간디스크의 부피 또는 높이의 유지(retention)를 지칭한다. 이것은 주어진 시간에서 정상적으로 예상되는 퇴행 수준에 대비하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 과 같은 부피 또는 높이의 증가율을 의미할 수도 있고, 또는 해당 위치좌(locus)에서 추간디스크의 부피 또는 높이의 손상 또는 고갈의 저하를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "TGF-β 슈퍼패밀리"는 구조적으로 관련된 단백질의 군, 배아 발생 동안 광범위 분화 과정에 영향을 주는 단백질의 군을 포괄한다. 이 패밀리는 정상 수컷 성별 발생에 필요한 뮬러씨 억제물질 [Mullerian inhibiting substance, MIS](Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), 등-배 축 (dorsal-ventral axis) 형성 및 성숙한 디스크의 형태형성 (morphogenesis)을 위해 필요한 초파리 (Drosophila) 데카펜타플레직 유전자 (DPP gene) 산물 (Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), 제노푸스 (Xenopus) 알의 식물 극에 위치하는 Vg-I 유전자 산물 (Weeks, et al., Cell, 51 :861-867, 1987), 제노푸스 배아 (Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990)에서 중배엽 및 전방 구조의 형성을 유도할 수 있는 액티빈 (activins) (Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986), 그리고 연골 및 뼈의 새로운 (de novo) 형성을 유도할 수 있는 BMP-2, 3, 4, 5, 6 및 7, 오스티오제닌 (osteogenin), OP-I와 같은 뼈 형태형성 단백질 (bone morphogenetic proteins, BMP's)(Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990)를 포함한다. TGF-β 유전자 산물은 지질형성(adipogenesis), 근육형성(myogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 조혈(hematopoiesis), 및 상피세포 분화(epithelial cell differentiation)를 포함하는, 다양한 분화 과정에 영향을 미칠 수 있다 (검토를 위해서 Massague, Cell 49:437, 1987를 참조.). 이는 전체적으로 본 명세서에서 레퍼런스로 통합된다.
TGF-β 패밀리의 단백질은 초기에 대형 전구체 단백질로서 합성되고, 이어서 C-말단으로부터 대략 110 - 140개 아미노산 기본 잔기의 집합(cluster)에서 단백분해 절단(proteolytic cleavage)을 겪게 된다. 상기 단백질의 C-말단 부위는 모두 구조적으로 관련되어 있고 서로 다른 패밀리 구성원은 그의 상동성(homology) 정도에 기초하여 구별되는 소그룹으로 분류될 수 있다. 특정한 소그룹 내에 상동성이 70% 로부터 90% 까지의 아미노산 서열 일치도(identity) 범위로 분포할지라도, 소그룹들 간의 상동성은 상당히 더 낮아지고, 일반적으로 단지 20%로부터 50% 까지의 범위로 분포한다. 각각의 경우에서, 활성이 있는 종은 C-말단 단편의 디설파이드-연결 다이머(disulfide-linked dimer)인 것으로 나타난다. 연구되어 왔던 대부분의 패밀리 구성원의 경우, 호모다이머 종(homodimeric species)이 생물학적으로 활성이 있는 것으로 밝혀져 왔지만, 다른 패밀리 구성원의 경우에도 인히빈 (inhibins) (Ung, et al., Nature, 321:779, 1986) 및 TGF-β (Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987)와 같이, 헤테로다이머(heterodimer)도 역시 검출되어 왔다. 또한 이들은 각각의 호모다이머(homodimer)과는 서로 다른 생물학적 성질을 가지는 것을 보여준다.
TGF-β 유전자의 슈퍼패밀리 구성원은 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4 (닭), TGF-β1, TGF-β5 (제노푸스), BMP-2, BMP-4, 초파리 (Drosophila) DPP, BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, 초파리 60A, GDF-1, 제노푸스 Vgf, BMP-3, 인히빈-βA, 인히빈-βB, 인히빈-α, 및 MIS 를 포함한다. 이들 유전자는 논문 Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998 에 논의되어 있다. 이 논문은 전체적으로 본 명세서에 레퍼런스로 통합된다.
바람직하게는, TGF-β 유전자의 슈퍼패밀리 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, 또는 BMP-6이다.
프라이밍된 세포 요법 (Primed cell Therapy)
본 발명은 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시킴에 의해 손상된 추간디스크를 트리트먼트하기 위하여 포유동물에서 프라이밍된 세포를 추간디스크 부위에 투여하는 것을 포괄한다. 프라이밍된 세포는 전형적으로 연결조직 세포이고, 연골세포 또는 섬유아세포를 포함한다.
예를 들어, 일차적인 연골세포의 집단이 약 3 또는 4회 계대될 때, 그 모폴로지는 전형적으로 섬유아세포성 연골세포(fibroblastic chondrocyte)로 변화된다. 일차적인 연골세포가 계대되면서, 그들은 연골세포의 특성 일부를 상실하기 시작하고 섬유아세포성 연골세포의 특성을 획득하기 시작한다. 이들 섬유아세포성 연골세포가 배양되거나 TGF-β 슈퍼패밀리로부터 나온 단백질과 같은 사이토카인으로 "프라임"될 때, 세포는 그들의 연골세포 특성을 다시 획득하게 되고 이는 콜라겐의 생산을 포함한다.
이러한 프라이밍된 세포는 섬유아세포성 연골세포를 포함하는 데, 이는 TGFβ1과 함께 배양되었고, 그 결과 콜라겐 생산하는 연골세포로 변화되었다. 추간디스크 퇴행의 저지에 있어서 프라이밍된 세포를 사용하는 것의 장점은 콜라겐의 생산 및 달리 연골성 기질의 유지를 위하여, 추간디스크 내로 도입하는 데 유용한 연골세포를 만드는 것이 용이한 점이다.
상기 세포는 이에 제한되지는 않지만 일차적인 세포 또는 약 1 내지 20 계대를 거쳐온 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포는 연결조직 세포일 수 있다. 상기 세포는 형태발생적(morphgenic) 변화를 겪어왔던 세포를 포함할 수 있고, 여기에서 프라이밍(priming)은 원래 세포(original cell)의 특성으로 회귀를 유발한다. 상기 세포는 이에 제한되지는 않지만 연골세포, 섬유아세포 , 또는 섬유아세포성 연골세포를 포함할 수 있다. 프라이밍은 세포를 적어도 40시간의 기간, 1 부터 40시간까지, 2 부터 30시간까지, 3 부터 25시간까지, 4 부터 20시간까지, 5 부터 20시간까지, 6 부터 18시간까지, 8 부터 15시간까지, 9 부터 14시간까지의 기간 동안 사이토카인과 함께 배양하는 것에 의해 일어날 수 있고, 그 다음 선택사양으로 사이토카인을 세포로부터 분리시키고 연골, 바람직하게는 유리질 연골을 재생시키기 위하여 프라이밍된 세포를 관심있는 연골성 결함 부위 내로 주입한다. 한 가지 관점에서, 상기 사이토카인은 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원일 수 있다. 상세하게는, 상기 사이토카인은 TGF-β, 상세하게는 TGF-β1 일 수 있다.
상기 사이토카인은 추간디스크 트리트먼트 방법에서 유용하고 연골세포를 충분히 "프라임"시킬 양으로 프라이밍 배양 혼합액 (priming incubation mix)에 존재할 수 있다. 이러한 관점에서, 상기 프라이밍 배양 혼합액은 적어도 약 1 ng/ml의 사이토카인을 포함할 수 있다. 상세하게, 상기 혼합액은 약 1 부터 1000 ng/ml까지, 약 1 부터 750 ng/ml까지, 약 1 부터 500 ng/ml까지, 약 1 부터 400 ng/ml까지, 약 1 부터 300 ng/ml까지, 약 1 부터 250 ng/ml까지, 약 1 부터 200 ng/ml까지, 약 1 부터 150 ng/ml까지, 약 1 부터 100 ng/ml까지, 약 1 부터 75 ng/ml까지, 약 1 부터 50 ng/ml까지, 약 10 부터 500 ng/ml까지, 약 10 부터 400 ng/ml까지, 약 10 부터 300 ng/ml까지, 약 10 부터 250 ng/ml까지, 약 10 부터 200 ng/ml까지, 약 10 부터 150 ng/ml까지, 약 10 부터 100 ng/ml까지, 약 10 부터 75 ng/ml까지, 약 10 부터 50 ng/ml까지, 약 15 부터 500 ng/ml까지, 약 15 부터 400 ng/ml까지, 약 15 부터 300 ng/ml까지, 약 15 부터 250 ng/ml까지, 약 15 부터 200 ng/ml까지, 약 15 부터 150 ng/ml까지, 약 15 부터 100 ng/ml까지, 약 15 부터 75 ng/ml까지, 약 15 부터 50 ng/ml까지, 약 20 부터 500 ng/ml까지, 약 20 부터 400 ng/ml까지, 약 20 부터 300 ng/ml까지, 약 20 부터 300 ng/ml까지, 약 20 부터 250 ng/ml까지, 약 20 부터 200 ng/ml까지, 약 20 부터 150 ng/ml까지, 약 20 부터 100 ng/ml까지, 약 20 부터 75 ng/ml까지, 약 20 부터 50 ng/ml까지, 약 25 부터 500 ng/ml까지, 약 25 부터 400 ng/ml까지, 약 25 부터 300 ng/ml까지, 약 25 부터 250 ng/ml까지, 약 25 부터 200 ng/ml까지, 약 25 부터 150 ng/ml까지, 약 25 부터 100 ng/ml까지, 약 25 부터 75 ng/ml까지, 약 25 부터 50 ng/ml까지, 약 30 부터 500 ng/ml까지, 약 30 부터 400 ng/ml까지, 약 30 부터 300 ng/ml까지, 약 30 부터 250 ng/ml까지, 약 30 부터 200 ng/ml까지, 약 30 부터 150 ng/ml까지, 약 30 부터 100 ng/ml까지, 약 30 부터 75 ng/ml까지, 약 30 부터 50 ng/ml까지, 약 35 부터 500 ng/ml까지, 약 35 부터 400 ng/ml까지, 약 35 부터 300 ng/ml까지, 약 35 부터 250 ng/ml까지, 약 35 부터 200 ng/ml까지, 약 35 부터 150 ng/ml까지, 약 35 부터 100 ng/ml까지, 약 35 부터 75 ng/ml까지, 약 35 부터 50 ng/ml까지, 약 40 부터 500 ng/ml까지, 약 40 부터 400 ng/ml까지, 약 40 부터 300 ng/ml까지, 약 40 부터 250 ng/ml까지, 약 40 부터 200 ng/ml까지, 약 40 부터 150 ng/ml까지, 약 40 부터 100 ng/ml까지, 약 40 부터 75 ng/ml까지, 또는 약 40 부터 50 ng/ml까지 포함할 수 있다.
본 발명을 실행하는 한 가지 방법은 프라이밍된 세포를 만들기 위해 일정 시간 동안 사이토카인과 함께 세포를 배양하고, 선택사양으로 세포로부터 사이토카인을 분리시키고 상기 프라이밍된 세포를 추간디스크 또는 그 근처의 관심 부위 (site of interest) 내로 주입하는 것을 포함할 수 있다. 대체방법으로, 상기 세포는 관심 사이토카인과 함께 일정 시간 동안 배양될 수 있고 그 조합물(combination)은 사이토카인을 분리시키지 않고도 결함 부위에 투여될 수 있다.
본 발명의 프라이밍된 세포 요법 프로토콜에서 다양한 외래 조직뿐만 아니라 스캐폴딩 또는 프레임웍과 같은 물질이 함께 이식될 수 있는 것이 가능하면서, 또한 이러한 스캐폴딩 또는 조직이 본 발명의 주입 시스템에 포함되는 것이 가능하다고 이해될 것이다. 바람직한 일 구현에서, 본 체세포 요법에서는, 본 발명이 프라이밍된 연결조직 세포의 집단을 추간디스크 공간으로 주입하는 단순한 방법을 지향한다.
당업자라면 인간 환자를 트리트먼트하기 위한 세포의 출처가 자가유래 (autologous) 섬유아세포 또는 연골세포와 같은 환자 자신의 연결조직 세포일 수 있지만, 이종발생 세포(xenogeneic cell)뿐만 아니라 동종이계 세포도 또한 세포의 조직적합성(histocompatibility)을 고려하지 않고 사용될 수 있다고 이해할 것이다. 이 대체방법으로, 본 발명의 일 구현에서, 동종이계 세포는 포유동물 숙주와 조직적합성을 맞추어 사용될 수 있다. 좀 더 상세히 기술하면, 도너와 환자의 조직적합성이 결정되고 나서 그 조직적합한 세포가 포유동물 숙주에 투여된다. 또한, 연소성 연골세포도 도너와 환자의 조직적합성을 반드시 결정하지 않더라도 동종이계적으로 사용될 수 있다.
유전자 운반 (Gene Delivery)
한 가지 관점에서, 본 발명은 관심 DNA 서열을 포유동물 숙주의 연결조직 세포로 운반하기 위한 생체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo) 기법을 기재하고 있다. 상기 생체외 기법은 표적 연결조직 세포의 배양, DNA 서열의 실험관내(in vitro) 형질감염(transfection), DNA 벡터, 또는 연결조직 세포 내로의 기타 관심 운반체 (delivery vehicle)를 포함하고, 이어서 변형된 연결조직 세포를 포유동물 숙주의 표적 영역(target area)에 이식시킴에 의해 관심 유전자 산물의 생체내 발현에 효과를 미친다.
본 발명의 프로토콜에서는 다양한 외래 조직뿐만 아니라 스캐폴딩 또는 프레임웍과 같은 물질이 함께 이식될 수 있는 것이 가능하면서, 이러한 스캐폴딩 또는 조직이 본 발명의 주입 시스템에 포함되는 것이 바람직하다고 이해될 것이다. 일 구현에서, 본 발명은 TGF 슈퍼패밀리 단백질 또는 배양된, 형질감염되지 않은(untransfected)/형질전환되지 않은(untransduced) 또는 형질감염된 (transfected)/형질전환된(transduced) 연결조직 세포 또는 그의 혼합물을 추간디스크 공간에 주입시키는 단순한 방법을 지향하고 따라서 상기 외래 TGF 슈퍼패밀리 단백질은 발현되거나 상기 공간에서 활성을 가지게 된다.
당업자라면 인간 환자를 트리트먼트하기 위한 세포의 한 가지 출처가 자가유래 연골세포와 같은 환자 자신의 연결조직 세포가 될 수 있음을 이해할 것이다. 또 다른 세포의 출처는 트리트먼트되어야 할 환자에 대한 세포의 조직적합성은 고려하지 않는 동종이계 세포를 포함한다.
특별하게, 본 방법은 TGF β 슈퍼패밀리의 구성원, 또는 생물학적으로 활성이 있는 유도체 또는 그의 단편, 또는 생물학적으로 활성이 있는 유도체 또는 그의 단편인 유전자 산물을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은 또 다른 구현에서, 환자에게 치료적 유효량(therapeutically effective amount)으로 비경구투여하기 위한 컴파운드로 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질과 적합한 약제학적 담체를 포함하는 컴파운드를 제공한다.
본 발명은 또 다른 구현에서, 환자에게 예방적 유효량(prophylactically effective amount)으로 비경구 투여하기 위한 컴파운드로 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질 및 적합한 약제학적 담체를 포함하는 컴파운드를 제공한다.
치료용도로서, TGF-β 단백질은 국부적인 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로, 기법 및 제형화는 레밍턴의 제약학 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판)에서 찾아볼 수 있다. TGF 단백질인 활성 성분은 일반적으로 투여 방식 및 투약 형태(dosage form)의 특성에 따라 필러(filler), 증량제(extender), 습윤 제제, 분산제(disintegrant), 계면-활성 제제, 분해가능한 폴리머 또는 윤활제를 포함할 수 있는 부형제의 희석액과 같은 담체와 함께 조합된다. 전형적인 투약 형태로는 파우더; 현탁액, 에멀젼 및 용액을 포함하는 액체 제제; 그래뉼; 및 캡슐 등이 있다.
본 발명의 TGF 단백질은 또한 주체에게 투여하기에 약제학적으로 적합한 담체와 함께 조합될 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 N-(1-2,3-디올레일옥시)프로필)-n,n,n-트리메틸암모니움 클로라이드 (DOTMA) 및 디올레일포스포티딜 에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 다양한 양이온성 지질(lipids)을 들 수 있다. 리포좀 (liposome)도 또한 본 발명의 TGF 단백질 분자를 위한 적합한 담체이다. 또 다른 적합한 담체는 TGF 단백질 분자를 포함하는 서방성 (slow-release) 젤 또는 폴리머이다.
TGF 베타 단백질은 식염수 용액 또는 기타 적합한 액체와 같은 생리학적으로 적합한 담체 또는 희석제의 일정량과 혼합될 수 있다. TGF 단백질 분자도 또한 TGF 단백질 및 그의 생물학적으로 활성이 있는 형태를 그들이 해당 표적에 도달하고 및/또는 조직 장벽(tissue barrier)을 통해 TGF 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성이 있는 형태의 이동이 용이하게 될 때까지 분해(degradation)로부터 보호하기 위해 기타 담체 수단과 함께 조합될 수 있다.
본 발명은 다른 구현에서 세포를 전달하기 전에 연결조직 세포를 저장하는 것을 포함한다. 당업자라면 상기 연결조직 세포가 10 퍼센트 DMSO로 액체 질소에서 동결 보관될 수 있는 것을 이해할 것이다.
본 출원에서, 이에 제한되는 것은 아니지만, BMP-2 그리고 TGF-β1, 2, 및 3 를 포함하는 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염된 또는 형질전환된 적절한 포유동물 세포를 주입하는 것에 의한 추간디스크 퇴행의 저지 또는 방지 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 구현에서 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염 또는 형질전환되지 않은 또는 기타 다른 유전자로 형질감염 또는 형질전환되지 않은 적절한 포유동물 세포를 주입시키는 것에 의한 추간디스크 퇴행의 방지 또는 저지 방법을 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상술된 방법을 사용하여 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시킴에 의해 손상 또는 퇴행된 추간디스크를 트리트먼트하는 것을 지향한다.
본 발명은 또 다른 구현에서 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염 또는 형질전환된 적절한 포유동물 세포를 주입하는 것에 의한 추간디스크의 퇴행 방지 또는 저지 방법을 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상술된 방법을 사용하여 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시킴에 의해 손상된 또는 퇴행된 추간디스크를 트리트먼트하는 것을 제공한다.
본 발명은 또 다른 구현에서 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염 또는 형질전환된 적절한 포유동물 세포 및 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 인코드하는 유전자로 형질감염 또는 형질전환되지 않은 또는 기타 다른 유전자로 형질감염 또는 형질전환되지 않은 적절한 포유동물 세포의 조합(combination) 또는 혼합물(mixture)을 주입시킴에 의해 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시키는 방법을 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상술한 방법을 사용하여 추간디스크의 퇴행을 방지하거나 저지시킴에 의해 손상된 또는 퇴행된 추간디스크를 트리트먼트하는 것을 제공한다.
본 발명의 일 구현에서 상기 세포는 스캐폴딩 물질 또는 외래 세포 또는 기타 생체적합한 (biocompatible) 담체와 같은 기타 보조 물질의 존재 또는 부재하에 상술한 세포 조성물을 이용하여 추간디스크의 퇴행을 방지 또는 저지하기 위한 부위로 주입할 수도 있는 것임을 이해하여야 한다. 다시 말하면, 변형된 세포 단독, 변형되지 않은 세포 단독. 또는 그의 혼합물 또는 조합물이 추간디스크의 퇴행을 방지 또는 저지하기 위한 부위로 주입될 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명의 예시하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 I - 재료 및 방법
플라스미드 제작
플라스미드 pMTML Vβ1 는 TGF-β1 코딩 서열 및 성장호르몬 폴리 A 부위를 포함하는 그의 1.2-kb BglII 단편을 pMTMLV 의 3' 말단 BamHI 부위 내로 서브클론하여 생산되었다. pMTMLV 벡터는 ψ 패키징 서열의 일부뿐만 아니라 전체 gag 및 env 서열을 결실시킴(deleting)에 의해 레트로바이럴 벡터 MFG로부터 유래하였다.
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세포 배양 및 형질전환(transduction)
레트로바이럴 벡터 내에 클론된 TGF-β cDNA 는 개별적으로 연골세포 내로 형질전환되었다 (hChron-TGF-β1). 그들은 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) (GIBCO-BRL, 록빌, MD) 상에서 10% 농도의 우태아 혈청과 함께 배양되었다.
형질전환된 유전자 서열을 가진 세포를 선별하기 위하여, 네오마이신 (300μg/ml)이 배지 내에 첨가되었다. TGF-β1 발현을 가진 세포는 때때로 액체 질소에서 저장되었고 주입 바로 직전에 배양되었다.
pMTML Vβ1 및 pVSVG 플라스미드 DNAs 는 퓨겐 형질전환 방법 (Fugene transfection methods)에 의해 GP2-293 세포 내로 공형질전환(cotrasnfected) 되었다. 배양 48 시간 이후에, 상청액은 0.45 μm의 폴리설폰 필터를 통하여 여과되었다. 여과된 배양 상청액은 그 다음 10% FBS가 첨가된 배지를 사용하여 2배로 희석되었고 인간 연골세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 감염 18시간 전에 60 mm 배양 접시에 접종된 인간 연골세포는 폴리브렌 (polybrene)(8μg/ml, Sigma, St. Louis, MO)을 첨가한 여과물을 사용하여 감염시켰다. 배양 4시간 이후에, 배지를 새로운 것으로 갈아주었다. 24시간 뒤에 다시 거른 바이러스 상청액을 사용하여 반복하여 감염시켰다. 형질전환된 세포는 10% 우태아 혈청을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지에서 제2 감염 이후 48시간째부터 배양하였다. 선별된 콜로니는 24 또는 6 웰 플레이트로 옮기고 엘라이자 분석 키트 (Quantikine ELISA assay kit) (R&D system, Minneapolis, MN)을 사용하여 TGF-β1 생산을 측정하였다.
디스크 높이의 방사선사진 분석
케타민 하이드로클로라이드 (ketamine hydrochloride, 25 mg/kg) 및 롬펀 (Rompun, 1 mg/kg)을 천자한 후 다양한 주간 간격을 두고 투여한 이후에 방사선 사진을 촬영하였다. 각 동물의 방사선 촬영 중에는 각 시간 간격에 일정한 마취 수준을 유지하도록 극도로 주의를 기울여 유사한 근육 완화의 정도를 획득한다. 이는 디스크 높이에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 전처치 (preoperative) 방사선 사진이 항상 기선 측정 (baseline measurement)으로 사용되었다. 또한 척추를 약간 구부린 자세로 유지하도록 노력을 기울였다. 척추의 축상 회전 및 빔 분산 (beam divergence)으로부터 나온 실수를 줄이기 위하여, 방사선 사진이 각 동물 상에서 옆으로 누운 자세로 토끼 장골능선 (iliac crest)으로부터 4 cm 위치에 중심을 둔 빔을 사용하여 적어도 두 번 반복 촬영되었다. 방사선 사진은 디지탈로 스캔되고 이미지 캡쳐 소프트웨어 (Image Capture software)를 사용하여 디지탈적으로 저장되었다.
이미지 분석
디지탈화된 방사선 사진을 사용하여, 척추 높이 및 IVD 높이를 포함하는 측정값이 공개된 도메인의 이미지 분석을 사용하여 분석되었다. 데이타는 엑셀 소프트웨어로 전달되었고, IVD 높이는 루 등의 방법 (Lu et al. "Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics. An in vivo biomechanical, radiologic, and histologic canine study", Spine 1997;22:1828-34.)을 사용하는 DHI로서 표현되었다. 평균 IVD 높이 (DHI)는 IVD의 전방, 중앙, 및 후방으로부터 획득한 측정값을 평균을 내고 이를 인접한 척추 높이의 평균값으로 나누는 것이 의해 계산되었다. 주입된 디스크의 DHI 값에서의 변화는 DHI 퍼센트로서 표현되었고, 측정된 전처치 IVD 높이에 대해 정상화되었다 (퍼센트 DHI = 후처치 DHI / 전처치 DHI X 100). 주체 내의 표준 편차 (Sw)는 수학식 1을 사용하여 계산되었다.
Figure pat00001
여기에서, X1 은 제1 측정값이고, X2 는 제2 측정값이며, N = 450 이다. 분산 (CV 퍼센트)의 퍼센트 계수는 (Sw/ 모든 측정값의 평균 X 100)으로서 계산되었다. DHI 측정값의 내부 관찰자의 실수는 최소인 것으로 평가하였다 (Sw: 0.001800316; CV 퍼센트: 3.13). 내부 관찰자의 실수도 역시 작은 것으로 보고되었다 (Sw: 0.003227; CV 퍼센트: 9.6).
MRI 평가
MRI 조사는 0.3-T 이미지 기기 (imager)(Airis II, 버전 4.0 A; Hitachi Medical System America, Inc.)를 사용한 연구에서 구적 코일 수신기 (quadrature extremity coil receiver)를 사용하여 모든 토끼들 상에서 수행되었다. 동물을 희생시킨 후, 주변을 둘러싸는 부드러운 조직을 가진 척추 기둥이 분리되었고 MRI 분석기에 도입되었다. 화살 모양의 단면에서의 T2-무게를 가진 절단편이 하기 세팅으로 획득되었다: 4000 밀리초 (millisecond)의 TR (반복까지의 시간) 및 120 밀리초의 TE (에코까지의 시간)을 가진 빠른 스핀 에코 서열 (fast spin echo sequence); 256 (h) X 128 (v) 매트릭스; 260 뷰 필드 (field of view); 및 4 여기 (excitation). 제2 절단면의 두께는 간격이 0-mm 이고 2 mm 이다. 1 등급부터 4 등급까지 (1 = 정상, 2 = 신호 강도의 최소 감소이지만 높은 신호 구역의 분명한 감소, 3 = 신호 강도의 보통의 감소, 및 4 = 신호 강도의 심각한 감소) 신호 강도의 정도 및 구역에서의 변화에 기초하는 변형된 톰슨 분류를 사용하는 무작위 관찰자 (blinded observer)가 MRIs 를 평가하였다. 2가지 평가법에 기초하는 MRI 등급화의 내부 관찰자 및 상호 관찰자의 신뢰도 상관계수 (reliability correlation coefficient)는 코헨의 카파 상관계수에 의해 결정된 바와 같이 탁월하였다 (각각 K = 0.98, 0.90).
실시예 II - 실험적인 방법 및 결과
손상된 추간디스크의 퇴행 방지
뉴질랜드 흰 수컷 토끼가 사용되었다. 오픈 외과 기법이 사용되었다. 허리 척추에서 세 가지 척추 종류: L2-3, L3-4, L4-5 가 실험적으로 처리되었거나 각 동물에서 대조군으로서 관찰되었다. 처리법이 관찰된 토끼마다 다중 부위/디스크를 사용하여 보통의 방식으로 각 종류에 대해 시행되었다. 주제 설계에 따라, 전-후 외과적 비교, 디스크 종류에 따른 변화가 대조군으로서 사용되었다.
실시예 III
토끼에서 형질전환되지 않은 연골세포 단독, TGF -B1-생산하는 연골세포 단독또는 혼합된-세포와 함께 (인간 연골세포 및 TGF-B1-생산하는 연골세포) 주입하는 방법을 사용하는 손상된 추간디스크의 퇴행 방지
실시예 I-V 에서 사용되는 모든 연골세포는 두 살 이하 어린이의 손가락의 유리질 연골 부위로부터 획득된 비-디스크 연골세포 및 연소성 연골세포가다.
바늘 천자가 허리 척추의 추간디스크에서 실시되었다. 이러한 바늘 천자 이후에, TGF-β1-생산하는 연골세포, 일차적인 형질전환되지 않은 인간 연골세포, TGF-β1-생산하는 연골세포 및 일차적인 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 혼합물, 프라이밍된 형질전환되지 않은 인간 연골세포, 또는 담체/배지가 주입되었다. 몇 가지 대조군이 사용되었다. 실험적인 조건들은 표 1 에 제시된다.
수술 준비 주입 트리트먼트
바늘 천자 TGF-β1-생산하는 연골세포
(~ 5 x 106 세포)
바늘 천자 TGF-β1-생산하는 연골세포
일차적인 형질전환되지 않은 인간 연골세포
(~ 3 대 1 비율, 5 x 106 세포)
바늘 천자 일차적인 형질전환되지 않은 인간 연골세포
(~ 5 x 106 세포)
바늘 천자 일차적인 형질전환되지 않은 인간 연골세포
(~ 5 x 106 세포)
바늘 천자 DMEM
바늘 천자 천자만 있고 주입 없음
천자 없음 천자 없음, 트리트먼트 없음, 대조군
바늘 천자 상처는 토끼 또는 돼지의 허리 척추의 추간디스크에서 생성된다. 이러한 바늘 천자 이후에, 토끼들은 4주 동안 회복되도록 방치되었다. 그 다음 제2 수술 과정에서, TGF-β1-생산하는 연골세포 및/또는 일차적인 형질전환되지 않은 인간 연골세포 (~ 5 X 105 세포)를 포함하는 실험적인 트리트먼트 조성물이 주입되거나 대조군 조건이 관찰된다 (표 1).
기관내 삽관(endotrachial intubation) 이후에 일반적인 마취가 케타민 하이드로클로라이드 및 롬펀(Rompun: 상표명)의 투여에 의해서 수행되고, 동물은 반듯한 자세로 놓인다. 락트화된 링거가 약 (5 ml/kg/시간)으로 사용된다. 절단 구역은 면도되어 준비되고 베타딘 용기 및 알코올 천을 선택적으로 사용하여 특별한 무균 방식으로 덮어준다 (세 번 이상). 눈 위에는 부드러운 안과 연고가 발라진다. 왼쪽 역복강 접근법 (retroperitoneal approach)이 L2 - L5 (토끼는 6 내지 7 요추를 가진다.)로부터의 디스크의 오른쪽 전방 측면을 노출시키는 데 사용된다. 다양한 제조법이 사용되고 요법이 각 디스크 수준에 적용된다. 디스크의 '바늘 요추천공' 제조법의 경우, 18-게이지 (18-gauge) 바늘이 5 mm 깊이에 디스크 천자를 놓는데 사용된다 (Aoki et al., "Nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model: effects of depth of puncture." Spine. 2006;31(21):E774-80). 천자 이후, 표 1에 나열된 테스트 재료가 주입된다. 트리트먼트 조성물은 각 토끼의 Ll-2, L2-3, L3-4, L4-5 부위의 어느 하나에 적용된다.
디스크 변화를 감시하기 위하여 매달 방사선 사진이 촬영되었다. 동물은 외과 처치 후 2, 8, 및 24 주에 희생시켰다.
방사선 사진/MRI.
회복은 다른 수준에서의 디스크와 비교하여 기선 (prep op)에서의 동일한 디스크로부터 증가된 디스크 높이의 변화를 검출할 수 있는 방사선 사진에 의해 조사된다. 다른 디스크들은 바늘 천자만의 전후에 또한 시간에 따른 정상적인 퇴행의 지수를 만들어내는 바늘 천자를 하지 않는 전후에 비교된다.
역-전사 PCR (Retro-Transcription PCR ).
역-전사 PCR 이 생존한 형질감염된 연골세포의 상대적인 양을 분석하기 위해 수행된다.
조직학
또한 조직학이 타입 I 및 타입 II 콜라겐의 특성조사 (characterization), 새로이 합성된 (de novo) 연골세포의 전체 모양 및 수치측정값을 검증하는 데 사용된다.
웨스턴 블럿 분석 및 ELISA
타입 I 및 타입 II 콜라겐의 정량적인 발현, 및 프로테오글리칸 농도, Smads 2/3, Sox-9. 추가적으로, 엘라이자가 TGF-β1, BMP2, BMP7, GDF5 및 사용가능한 항체가 존재하는 기타 관련된 성장인자를 평가하는 데 사용된다.
세포사멸 (apoptosis)이 추간디스크의 다른 조직 구조에서 캐스파제-3 (caspase-3)의 발현을 관찰하여 조사된다.
실시예 IV
결과
결과는 본 출원서의 도면 및 도면의 기재에서 나타난 바와 같다. 형질전환되지 않은 연골세포 단독, 형질전환된 연골세포 단독, 프라이밍된 연골세포 단독 또는 형질전환된 및 형질전환되지 않은 연골세포의 혼합물로 처리된 천자된 추간디스크는, 운반체 대조군과 비교하여 디스크 퇴행을 방지하거나 저지시키는 데 유리한 효과를 나타낸다.
실시예 IV-1
토끼에서 천자된 추간디스크의 혼합된-세포 (형질전환된 및 형질전환되지 않은 연골세포) 트리트먼트
혼합된 세포 트리트먼트는 토끼에서 시험될 때 항-퇴행 효과를 가진다. 그 효과는 도 1 내지 4 에서의 다양한 실험에서 보여진다.
도 1A - 1F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트가 전혀 보이지 않고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (D)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (E)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다. (F)는 상기 (C)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
도 2A - 2F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트가 전혀 보이지 않고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (D)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (E)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다. (F)는 상기 (C)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
도 3A - 3D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트가 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (D)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
실시예 IV-2
토끼에서 천자된 추간디스크의 형질전환된 연골세포 트리트먼트
TGF-β1-생산하는 연골세포 트리트먼트는 추간디스크의 항-퇴행 효과를 가진다. 그 효과는 도 4A - 4D 에서 보여지고, 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (D)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
실시예 IV-3
토끼에서 천자된 추간디스크의 형질전환된 연골세포 및 혼합된-세포 트리트먼트
TGF-β1-생산하는 연골세포 트리트먼트 및 혼합된 세포 트리트먼트는 추간디스크의 항-퇴행 효과를 가진다. 그 효과는 도 5A - 5D 에서 보여지고, 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산하는 연골세포 및 형질전환되지 않은 인간 연골세포의 1 : 3 비율로의 혼합물이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 TGF-β1-생산하는 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (D)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
실시예 IV-4
토끼에서 천자된 추간디스크의 형질전환되지 않은 연골세포 트리트먼트
형질전환되지 않은 연골세포 트리트먼트는 추간디스크의 항-퇴행 효과를 가진다. 그 효과는 도 6 - 8 에서의 다양한 실험으로 보여진다. 도 6A - 6D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (D)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
도 7A - 7F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L1/2에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L2/3 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L3/4 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (D)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (E)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다. (F)는 상기 (C)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
도 8A - 8F는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 4주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) T12/L1 에서 디스크가 바늘 천자 (needle puncture)에 의해 손상되었고 주입은 없었으며, (ii) 척추 위치좌 L1/2 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L2/3 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 수술 후 8주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) T12/L1에서 디스크가 바늘 천자에 의해 손상되었고 주입은 없었으며, (ii) 척추 위치좌 L1/2 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L2/3 에서 디스크가 손상되었으며 형질전환되지 않은 연골세포가 주입되었다; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다. (D)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (E)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다. (F)는 상기 (C)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
실시예 IV-5
토끼에서 천자된 추간디스크의 형질전환되지 않은 프라이밍된 연골세포 트리트먼트
프라이밍된 골세포 트리트먼트는 추간디스크의 항-퇴행 효과를 가진다. 그 효과는 도 9A - 9D 에서 보여진다. 도 9A - 9D는 손상된 디스크의 퇴행의 지연, 저지 또는 방지를 나타낸 것이다. (A)는 토끼 척추 수술 전의 MRI 방사선 사진을 보여준다; (B)는 수술 후 8주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주고, 여기에서 (i) L2/3에서 디스크가 손상되었고 세포 배양배지 DMEM 이 주입되었으며, (ii) 척추 위치좌 L3/4 에서 천자 및 트리트먼트 조절이 전혀 없고, 및 (iii) L4/5 에서 디스크가 손상되었으며 프라이밍된 연골세포가 주입되었다; 화살표는 L2/3 및 L4/5 디스크 부위를 가리킨다. (C)는 상기 (A)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하여 그 모폴로지, 퇴행 또는 재생 정도를 측정하는 데 사용된다. (D)는 상기 (B)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주고, 이는 추간디스크의 디스크 고도를 획득하는 데 사용된다.
실시예 V
인간 연골세포의 출처
일차 인간 연골세포는 한 살 된 여아인 인간 도너로부터 나온 다지증 손가락을 외과적으로 절단하여 획득한 연골 조직으로부터 배양되었다. 다지증 조직은 수술실에 수집되었다. 하기 과정이 연골세포 분리를 위하여 생물안전 실험실에서 수행되었다. 연골 조직을 포함하는 플라스틱 병이 알코올로 헹구어졌고 연골 조직은 피펫을 사용하여 무균 PBS 용액 (1X)으로 세척되었다. 콜라게나제 용액은 7 mg의 콜라게나제 (Gibco BRL)를 10 mL의 DMEM (10% FBS 포함)에 녹이고 0.2 μm의 주사기 필터 (코닝)를 통해 여과하여 제조하였다. 세척된 연골 조직은 콜라게나제 용액을 사용하여 17 내지 18 시간 동안 37℃ 진탕 배양기에서 처리되었다. 그 다음 날, 병은 알코올로 위생처리되었다. 콜라게나제를 처리한 재료는 여러 번 상하로 피펫팅 처리하고 조직 덩어리로부터 느슨한 세포를 분리하였다. 피펫팅 이후에, 상청액은 70μm 나일론 세포 여과기 (strainer, Falcon)로 여과되었다. 그 본성 (integrity)을 상실하지 않은 콜라게나제를 처리한 조직 (예로, 느슨한 세포)은 필터를 통과할 수 있었다. 세포 여과물은 50 mL 튜브 (Falcon)에 수집하였고 그 다음 1,500 rpm 에서 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액의 2/3 는 제거하였고 펠렛은 10 ml의 무균 PBS (1X) 용액을 사용하여 세척하였다., 재현탁된 세포는 다시 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리되었고 상청액의 2/3 을 제거한 이후에 10 ml의 무균 PBS (1X) 용액을 사용하여 세척하였다. 세포는 다시 1,500 rpm 에서 5분 동안 원심분리시켰고 그 다음 DMEM (10% FBS 포함)으로 재현탁되었다. 재현탁된 세포는 그 다음 네 개의 코팅되지 않은 25 cm2 플라스크로 옮겨졌고, 4일 동안 37℃ 5% CO2 하에서 배양되었다. 그 다음 상기 세포는 두 개의 코팅되지 않은 185 cm2 플라스크로 옮겨졌다. 상기 세포는 2주 동안 배양된 다음 수확되고, 세척되며 DMEM, FBS 및 DMSO 가 5 : 4 : 1의 비율로 된 냉동보존 배지 (cryopreservative media)에서 재현탁되었다. 상기 세포는 1 ml의 세포 현탁액을 포함하는 냉동 바이알에 4 x 105 세포/ml 농도로 분주되었다. 세포는 증기상 액체 질소 저장고에 보관되었다.

Claims (6)

  1. 추간디스크 재생 기능을 가지는 단백질을 인코드하는 TGF-β1 유전자가 삽입된 제1 포유동물 연결조직 세포, 및 변형되지 않은 제2 포유동물 연결조직 세포의 혼합물을 유효성분으로 포함하되, 스캐폴딩 또는 지지 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 추간디스크 결함 부위 내로 이식될 수 있는 추간디스크의 퇴행 방지 또는 저지용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 포유동물 연결조직 세포는 연골세포 (chondrocyte)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 연골세포는 비-디스크 연골세포 또는 연소성 연골세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2의 포유동물 연결조직을 위한 연골세포는 프라이밍된 연골세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 연결조직 세포는 상기 포유동물에 대하여 동종이계인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항의 조성물을 포함하는 퇴행 또는 손상된 추간디스크 치료용 조성물.

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